KR20220031070A - Lexa-rad51 융합 단백질을 통한 증가된 핵산-가이드된 세포 편집 - Google Patents

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티안 티안
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Abstract

본 발명의 개시는 핵산-가이드된 편집을 이용하는 경우 세포 집단에서 편집된 효모 세포의 백분율을 증가시키기 위한 조성물 및 방법, 및 이들 방법을 수행하기 위한 자동화된 다중-모듈 기기를 제공한다. 따라서, 일 구현예에서, 가이드 핵산 및 공여자 DNA 서열을 포함하는 편집 카세트의 전사를 유도하는 프로모터; 효모 복제 기점; 박테리아 복제 기점; 뉴클레아제에 대한 코딩 서열의 전사를 유도하는 프로모터; 선택 마커의 전사를 유도하는 프로모터; 하나 이상의 LexA DNA 결합 부위; 및 LexA-링커-Rad51 융합 단백질의 전사를 유도하는 프로모터를 포함하는, 효모에서 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집을 위한 편집 벡터가 제공된다.

Description

LEXA-RAD51 융합 단백질을 통한 증가된 핵산-가이드된 세포 편집
관련 사례
본 국제 PCT 출원은 "Increased Nucleic Acid-Guided Cell Editing in Yeast via a LexA-Rad51 Fusion Protein"을 제목으로 하는 2019년 7월 8일에 출원된 USSN 62/871,325에 대한 우선권을 주장한다.
발명의 분야
본 발명의 개시는 핵산-가이드된 편집을 사용하는 경우 세포 집단에서 편집된 효모 세포의 백분율을 증가시키기 위한 방법 및 조성물뿐만 아니라 이들 방법을 수행하고 이들 조성물을 사용하기 위한 자동화된 다중-모듈 기기에 관한 것이다.
하기 논의에서, 배경 및 도입 목적으로 특정 물품 및 방법이 설명될 것이다. 본원에 포함된 어떤 것도 선행 기술의 "인정"으로 해석되어선 안 된다. 출원인은 적절한 경우 본원에 언급된 물품 및 방법이 적용 가능한 법적 조항에 따라 선행 기술을 구성하지 않음을 입증할 권리를 명시적으로 보유한다.
살아 있는 세포의 유전체에 정확하고 표적화된 변화를 만드는 능력은 생물의학 연구 및 개발에서 오랜 목표였다. 최근에, 유전자 서열 및 이에 따른 유전자 기능의 조작을 허용하는 다양한 뉴클레아제가 확인되었다. 뉴클레아제는 핵산-가이드된 뉴클레아제를 포함하며, 이는 연구원이 살아 있는 세포에서 영구적인 편집을 생성하는 것을 가능하게 한다. 물론, 세포 집단에서 가능한 가장 높은 편집률을 달성하는 것이 바람직하나; 많은 경우에 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집으로 인한 편집된 세포의 백분율은 한 자리수일 수 있다.
따라서, 편집 효율을 증가시키기 위한 개선된 방법, 조성물, 모듈 및 기기를 위한 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 기술이 필요하다. 본 발명의 개시는 이러한 요구를 다룬다.
본 개요는 하기의 상세한 설명에서 추가로 설명되는 단순화된 형태의 개념의 선택을 소개하기 위해 제공된다. 본 개요는 청구된 주제의 핵심 또는 필수 특징을 확인하기 위한 것이 아니며, 청구된 주제의 범위를 제한하기 위해 사용되는 것도 아니다. 청구된 주제의 다른 특징, 세부사항, 유용성 및 이점은 첨부된 도면에 예시되고 첨부된 청구범위에 정의된 양태를 포함하는 하기 설명되는 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
따라서, 일 구현예에서, 가이드 핵산 및 공여자 DNA 서열을 포함하는 편집 카세트의 전사를 유도하는 프로모터; 효모 복제 기점; 박테리아 복제 기점; 뉴클레아제에 대한 코딩 서열의 전사를 유도하는 프로모터; 선택 마커의 전사를 유도하는 프로모터; 하나 이상의 LexA DNA 결합 부위; 및 LexA-링커-Rad51 융합 단백질의 전사를 유도하는 프로모터를 포함하는 효모에서 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집을 위한 편집 벡터가 제공된다.
일부 양태에서, LexA-링커-Rad51 융합 단백질은 LexA 단백질의 일부 및 Rad51 단백질의 일부를 포함하고, 일부 양태에서, LexA 단백질의 일부는 SEQ ID No.1을 포함하고, Rad51 단백질의 일부는 SEQ ID No.2를 포함한다.
일부 양태에서, LexA-링커-Rad51 융합 단백질의 링커는 폴리글리신 링커 또는 글리신-세린 링커를 포함한다. 또한, 일부 양태에서, 하나 이상의 LexA DNA 결합 부위는 SEQ ID No. 3을 포함한다.
일부 양태에서, 융합 단백질의 LexA 부분은 LexA 결합 부위가 징크핑거 결합 부위로 대체된 징크핑거 결합 단백질; LexA 결합 부위가 TALE 결합 부위로 대체된 전사 활성제-유사 효과기(TALE) 결합 단백질; LexA 결합 부위가 TetO 결합 부위로 대체된 TetR 결합 단백질; LexA 결합 부위가 UAS 결합 부위로 대체된 Gal4 결합 단백질; 또는 LexA 결합 부위가 LacO 결합 부위로 대체된 LacI 결합 단백질로 대체된다.
일부 양태에서, LexA-링커-Rad51 융합 단백질의 전사를 유도하는 프로모터는 효모 알콜 탈수소효소 1 프로모터, pGPD 프로모터, pTEF1 프로모터, pACT1 프로모터, pRNR2 프로모터, pCYC1 프로모터, pTEF2 프로모터, pHXT7 프로모터, pYEF3 프로모터, pRPL3 프로모터, pRPL4 프로모터 또는 pGAL1 프로모터이다. 또한, 일부 양태에서, 편집 벡터는 LexA-링커-Rad51 융합 단백질에 대해 3'에 ADH1 종료자 요소, GDP 종료자 요소, TEF1 종료자 요소, ACT1 종료자 요소, RNR2 종료자 요소, CYC1 종료자 요소, TEF2 종료자 요소, HXT7 종료자 요소, YEF3 종료자 요소, RPL3 종료자 요소, RPL4 종료자 요소 또는 GAL1 종료자 요소를 포함하는 종료자 요소를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 뉴클레아제에 대한 코딩 서열은 Cas 9 뉴클레아제, Cas 12/CpfI 뉴클레아제, MAD2 뉴클레아제 또는 MAD7 뉴클레아제를 코딩한다.
다른 구현예는 제1 세트의 편집 카세트를 설계하고 합성하는 단계로서, 상기 제1 세트의 편집 카세트의 각각의 편집 카세트가 가이드 핵산 및 공여자 DNA 서열을 포함하는, 단계; 제1 플라스미드 백본을 설계하는 단계로서, 상기 제1 플라스미드 백본이 제1 세트의 편집 카세트의 편집 카세트의 전사를 유도하기 위한 프로모터, 효모 복제 기점, 박테리아 복제 기점, 뉴클레아제에 대한 코딩 서열의 전사를 유도하는 프로모터, 선택 마커의 전사를 유도하는 프로모터, 하나 이상의 LexA DNA 결합 부위 및 LexA-링커-Rad51 융합 단백질의 전사를 유도하는 프로모터를 포함하는, 단계; 선택한 효모 세포를 전기적격으로 만드는 단계; 선택한 효모 세포를 제1 세트의 편집 카세트 및 제1 플라스미드 백본으로 형질전환시켜 형질전환된 효모 세포 집단을 생성시키는 단계; 형질전환된 효모 세포 집단을 회복하도록 하는 단계; 형질전환된 효모 세포 집단에서 형질전환된 효모 세포를 선택하여 선택된 효모 세포를 생성시키는 단계; 선택된 효모 세포에서 핵산-가이드된 편집을 허용하여 편집된 효모 세포를 생성시키는 조건을 제공하는 단계; 및 편집된 효모 세포를 성장시키는 단계를 포함하는 효모 세포에서 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집을 수행하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 편집된 효모 세포는 고정 성장기로 성장되고, 일부 양태에서, 편집된 효모 세포를 고정 성장기로 성장시킨 후, 편집된 효모 세포는 전기적격이 된다. 추가 양태에서, 상기 방법은 편집된 효모 세포를 전기적격으로 만든 후 제2 세트의 편집 카세트를 설계하고 합성하는 단계로서, 상기 제2 세트의 편집 카세트의 각각의 편집 카세트가 가이드 핵산 및 공여자 DNA 서열을 포함하는, 단계; 제2 플라스미드 백본을 설계하는 단계로서, 상기 제2 플라스미드 백본이 제2 세트의 편집 카세트의 편집 카세트의 전사를 유도하기 위한 프로모터, 효모 복제 기점, 박테리아 복제 기점, 뉴클레아제에 대한 코딩 서열의 전사를 유도하는 프로모터, 선택 마커의 전사를 유도하는 프로모터, 하나 이상의 LexA DNA 결합 부위 및 LexA-링커-Rad51 융합 단백질의 전사를 유도하는 프로모터를 포함하는, 단계; 편집된 효모 세포를 제2 세트의 편집 카세트 및 제2 플라스미드 백본으로 형질전환시켜 형질전환된 편집된 효모 세포 집단을 생성시키는 단계; 형질전환된 편집된 효모 세포 집단을 회복하도록 하는 단계; 형질전환된 편집된 효모 세포 집단에서 형질전환된 편집된 효모 세포를 선택하여 선택된 편집된 효모 세포를 생성시키는 단계; 선택된 편집된 효모 세포에서 핵산-가이드된 편집을 허용하여 2회 편집된 효모 세포를 생성시키는 조건을 제공하는 단계; 및 2회 편집된 효모 세포를 성장시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 제1 및 제2 플라스미드 백본은 상이한 선택 마커를 포함하고, 일부 양태에서, 제1 및 제2 플라스미드 백본은 편집 카세트의 전사를 유도하기 위한 동일한 프로모터; 동일한 효모 복제 기점; 및 동일한 박테리아 복제 기점을 포함한다. 일부 양태에서, 뉴클레아제에 대한 코딩 서열은 MAD7 뉴클레아제에 대한 코딩 서열이다.
일부 양태에서, 상기 방법은 3회 편집된 세포를 생성하기 위해 2회 편집된 세포에 대해 반복되고, 일부 양태에서, 상기 방법은 원하는 수의 편집을 갖는 편집된 세포를 생성시키기 위해 여러 번 편집된 세포에 대해 반복된다.
본 발명의 이들 양태 및 다른 특징 및 이점은 하기에 보다 상세히 설명된다.
본 발명의 상기 및 다른 특징 및 이점은 첨부된 도면과 함께 취해진 예시적인 구현예의 하기 상세한 설명으로부터 보다 완전히 이해될 것이다:
도 1a는 효모 세포에서의 편집을 위한 간단한 공정 다이어그램이다. 도 1b는 LexA-Rad51 융합 단백질에 대한 코딩 서열의 단순화된 구조이다. 도 1c는 LexA-Rad51 융합 단백질을 사용하여 상동성 재조합을 향상시키고 따라서 편집 효율을 증가시키는 단순화된 그래픽이다. 도 1d는 LexA-Rad51 융합 단백질에 대한 코딩 서열, 편집 또는 "CREATE" 카세트, 및 뉴클레아제 MAD7에 대한 코딩 서열을 포함하는 예시적 벡터 맵이다.
도 2a-2c는 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집을 수행하기 위한 예시적인 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기의 3개의 상이한 도면을 도시한다.
도 3a는 본원에 설명된 세포 성장 모듈과 함께 그리고 도 3b-3d와 관련하여 사용하기 위한 회전 성장 바이알의 일 구현예를 도시한다. 도 3b는 세포 성장 모듈 하우징 내의 회전 성장 바이알의 일 구현예의 사시도를 예시한다. 도 3c는 도 3b로부터의 세포 성장 모듈의 단면도를 도시한다. 도 3d는 LED, 검출기 및 온도 조절 구성요소에 결합된 도 3b의 세포 성장 모듈을 예시한다.
도 4a는 접선 유동 여과 모듈(예를 들어, 세포 성장 및/또는 농축 모듈)에 사용하기 위한 보유물(상단) 및 투과물(중간) 부재뿐만 아니라 접선 유동 조립체로 조립된 보유물 및 투과물 부재(하단)를 도시한다. 도 4b는 접선 유동 여과 모듈의 저장소 조립체의 2개의 측면 사시도를 도시한다. 도 4c-4e는 도 4b에 제시된 저장소 조립체에 적합한 유체 및 공압 포트 및 개스킷을 갖는 예시적인 상부를 도시한다.
도 5a 및 5b는 시약 카트리지의 일 구현예의 구조 및 구성요소를 도시한다. 도 5c는 시약 카트리지의 일부일 수 있는 예시적인 관통형(flow-through) 전기천공 장치의 일 구현예의 상부 사시도이다. 도 5d는 시약 카트리지의 일부일 수 있는 예시적인 관통형 전기천공 장치의 일 구현예의 하부 사시도를 도시한다. 도 5e-5g는 도 2a-2c에 제시된 것과 같은 다중-모듈 자동화 세포 처리 기기에 유용한 FTEP 장치의 상부 사시도, 횡단면의 평면도 및 횡단면의 측면 사시도를 도시한다.
도 6a는 고체 벽 장치에서 세포를 단일화하고, 편집하고, 정상화하기 위한 워크플로우의 단순화된 그래픽을 도시한다. 도 6b는 효모 세포가 단일화되고 클론 콜로니로 성장하는 아가(agar) 상에 투과성 바닥을 갖는 고체 벽 장치의 사진이다. 도 6c는 다양한 시점에서의 효모 콜로니 성장의 사진을 제시한다. 도 6d-6f는 고체 벽 분리 인큐베이션 및 정상화(SWIIN) 모듈의 구현예를 도시한다. 도 6g는 히터 및 가열된 커버를 추가로 포함하는 도 6d-6f의 SWIIN 모듈의 구현예를 도시한다.
도 7은 재귀적 효모 세포 편집을 위한 고체 벽 단일화/성장/편집/정상화 모듈을 포함하는 예시적인 자동화 다중-모듈 세포 처리 기기의 일 구현예의 단순화된 블록 다이어그램이다.
도 8은 2-패들 회전 성장 바이알이 사용된 도 3a-3d와 관련하여 설명된 바와 같은 세포 성장 장치를 사용하는 s288c 효모 세포 배양물 성장 OD600의 실시간 모니터링을 나타내는 그래프이다.
도 9는 도 4a-4e와 관련하여 설명된 세포 농축 장치/모듈에서 처리된 효모 배양물에 대한 필터 처리 시간에 대한 여과액 전도도를 플로팅하는 그래프이다.
도 10은 도 5c-5g 및 비교기 전기천공 방법과 관련하여 설명된 바와 같은 FTEP 장치를 사용한 S. 세레비지에(S. cerevisiae)의 전기천공 결과를 제시하는 막대 그래프이다.
도 11은 대조군 및 상이한 LexA 융합 단백질에 대한 편집 분획을 제시하는 일련의 3개의 막대 그래프이다.
도 12는 LexA-Rad51 융합 단백질을 사용하여 효모에서 향상된 편집을 입증하는 데이터를 제시한다.
도면은 반드시 축척일 필요는 없으며, 유사한 참조번호는 유사한 특징을 지칭한다는 것이 이해되어야 한다.
본원에 설명된 방법, 장치 또는 기기의 일 구현예와 관련하여 설명된 모든 기능은 명시적으로 언급되거나 특징 또는 기능이 추가 구현예와 양립되지 않는 경우를 제외하고는 본원에 설명된 방법, 장치 및 기기의 추가 구현예에 적용 가능하도록 의도된다. 예를 들어, 제공된 특징 또는 기능이 일 구현예와 관련하여 명시적으로 설명되지만 대안적인 구현예와 관련하여 명시적으로 언급되지 않은 경우, 상기 특징 또는 기능은 이러한 특징 또는 기능이 대안적인 구현예와 비양립되지 않는 한 대안적인 구현예와 관련하여 배치되거나, 이용되거나, 구현될 수 있음이 이해되어야 한다.
본원에 설명된 기술의 실시는 달리 명시하지 않는 한 분자생물학(재조합 기술을 포함함), 세포생물학, 생화학, 및 유전 공학 기술의 통상적인 기술 및 설명을 이용할 수 있으며, 이는 당업자의 기술 범위 내이다. 상기 통상적인 기술 및 설명은 문헌[Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 4th, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (2014); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al. eds., (2017); Neumann, et al., Electroporation and Electrofusion in Cell Biology, Plenum Press, New York, 1989; Botstein and Fink, "Yeast: An Experimental Organism for 21st Century Biology," Genetics, 189(3):695-704 (2011); Chang, et al., Guide to Electroporation and Electrofusion, Academic Press, California (1992); Yeast Systems Biology, Castrillo and Oliver, eds., Springer Press (2011)]과 같은 표준 실험실 메뉴얼에서 찾을 수 있으며, 이들 모두는 전체내용이 모든 목적상 참조로서 본원에 포함된다. 핵산-가이드된 뉴클레아제 기술은, 예를 들어, 문헌[Genome Editing and Engineering from TALENs and CRISPRs to Molecular Surgery, Appasani and Church (2018); 및 CRISPR: Methods and Protocols, Lindgren and Charpentier (2015)]에서 발견될 수 있으며, 이들 둘 모두는 전체내용이 모든 목적상 참조로서 본원에 포함된다.
본원 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같은 단수 형태는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함하는 것을 유의한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 하나 이상의 세포를 지칭하고, "시스템"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 동등한 단계, 방법 및 장치에 대한 언급을 포함하고, 그 밖에도 마찬가지이다. 또한, 본원에서 사용될 수 있는 "좌측", "우측", "상부", "하부", "전면", "후면", "측면", "높이", "길이", "폭", "상단", "하단", "내부", "외부", "내면", "외면"과 같은 용어는 단지 참조 포인트를 설명하고, 본 발명의 개시의 구현예를 임의의 특정 배향 또는 구성으로 반드시 제한하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 더욱이, "제1", "제2", "제3" 등과 같은 용어는 단지 본원에 개시된 바와 같은 다수의 부분, 구성요소, 단계, 작업, 기능 및/또는 참조 포인트 중 하나를 식별하고, 마찬가지로 본 발명의 개시의 구현예를 임의의 특정 구성 또는 배향으로 반드시 제한하는 것은 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 언급된 모든 간행물은 이전에 설명된 발명과 관련하여 사용될 수 있는 장치, 제형 및 방법을 설명하고 개시하기 위한 목적으로 참조로서 포함된다.
값의 범위가 제공되는 경우, 상기 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 사이에 존재하는 값 및 상기 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급되거나 사이에 존재하는 값이 본 발명에 포함되는 것이 이해된다. 언급된 범위 내의 임의의 특별히 배제되는 한계를 조건으로 하여, 상기 더 작은 범위의 상한 및 하한이 더 작은 범위 내에 독립적으로 포함될 수 있고, 본 발명에 또한 포함된다. 언급된 범위가 하나 또는 둘 모두의 한계를 포함하는 경우, 상기 포함된 한계 중 어느 하나 또는 둘 모두를 배제한 범위가 또한 본 발명에 포함된다.
하기 설명에서, 본 발명의 더욱 충분한 이해를 제공하기 위해 다수의 특정 세부사항이 설명된다. 그러나, 본 발명은 이들 특정 세부사항 중 하나 이상 없이 실시될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 다른 예에서, 본 발명을 불명료하게 하는 것을 피하기 위해 당업자에게 널리 공지된 특징 및 절차는 설명되지 않았다. 본원에서 사용되는 용어는 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 평범하고 일반적인 의미를 갖는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 용어 "상보적"은 뉴클레오티드 사이의 왓슨-크릭 염기쌍을 지칭하며, 구체적으로 2개의 수소 결합에 의해 아데닌 잔기에 연결된 티민 또는 우라실 잔기 및 3개의 수소 결합에 의해 연결된 시토신 및 구아닌 잔기와 함께 서로 수소 결합된 뉴클레오티드를 지칭한다. 일반적으로, 핵산은 특정 제2 뉴클레오티드 서열에 대해 "상보성 백분율" 또는 "상동성 백분율"을 갖는 것으로 설명된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 특정 제2 뉴클레오티드 서열에 대해 80%, 90% 또는 100% 상보성을 가질 수 있으며, 이는 서열의 10개의 뉴클레오티드 중 8개, 10개 중 9개 또는 10개 중 10개가 특정된 제2 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적임을 나타낸다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열 3'-TCGA-5'는 뉴클레오티드 서열 5'-AGCT-3'에 대해 100% 상보적이며; 뉴클레오티드 서열 3'-TCGA-5'는 뉴클레오티드 서열 5'-TAGCTG-3'의 영역에 100% 상보적이다.
용어 DNA "조절 서열"은 수용자 세포에서 코딩 서열의 복제, 전사 및 번역을 집합적으로 제공하는 프로모터 서열, 아데닐중합체형성 신호, 전사 종료 서열, 업스트림 조절 도메인, 복제 기점, 내부 리보솜 진입 부위, 핵 국소화 서열, 인핸서 등을 집합적으로 지칭한다. 선택된 코딩 서열이 적절한 숙주 세포에서 복제되고, 전사되고, (일부 구성요소의 경우) 번역될 수 있는 한 이들 유형의 조절 서열 모두가 존재할 필요는 없다.
본원에서 사용되는 용어 "공여자 DNA" 또는 "공여자 핵산"은 핵산 가이드된 뉴클레아제를 사용한 상동성 재조합에 의해 DNA 서열 변형(삽입, 결실, 치환)을 유전자좌(예를 들어, 표적 유전체 DNA 서열 또는 세포 표적 서열)에 도입하도록 설계된 핵산을 지칭한다. 상동성 지시된 복구를 위해, 공여자 DNA는 "절단 부위" 또는 유전체 표적 서열에서 편집될 부위에 측접한 영역에 대해 충분한 상동성을 가져야 한다. 상동성 아암(들)의 길이는, 예를 들어, 이루어질 변형의 유형 및 크기에 좌우될 것이다. 공여자 DNA는 유전체 표적 유전자좌에 대해 서열 상동성의 2개의 영역(예를 들어, 2개의 상동성 아암)을 가질 것이다. 바람직하게는, "삽입" 영역 또는 "DNA 서열 변형" 영역(세포에서 유전체 표적 유전자좌로 도입되기를 원하는 핵산 변형)은 상동성의 두 영역 사이에 위치될 것이다. DNA 서열 변형은 하나의 특정 부위 또는 다수의 특정 부위에서 표적 유전체 DNA 서열의 하나 이상의 염기를 변경할 수 있다. 변경은 유전체 표적 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 또는 500개 이상의 염기쌍을 변경하는 것을 포함할 수 있다. 결실 또는 삽입은 유전체 표적 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 또는 500개 이상의 염기쌍의 결실 또는 삽입일 수 있다.
용어 "가이드 핵산" 또는 "가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 1) 유전체 표적 유전자좌에 하이브리드화될 수 있는 가이드 서열, 및 2) 핵산-가이드된 뉴클레아제와 상호작용하거나 이와 복합체화될 수 있는 스캐폴드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 2개의 펩티드 사이, 또는 본 발명의 개시의 맥락에서 더욱 흔히 2개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 용어 "상동성 영역" 또는 "상동성 아암"은 표적 유전체 DNA 서열과 어느 정도의 상동성을 갖는 공여자 DNA 상의 영역을 지칭한다. 상동성은 비교의 목적을 위해 정렬될 수 있는 각각의 서열 내의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열 내의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유된 경우, 상기 분자는 상기 위치에서 상동성이다. 서열 사이의 상동성 정도는 서열에 의해 공유되는 일치 또는 상동성 위치의 수의 함수이다.
"작동 가능하게 연결된"은 이렇게 설명된 구성요소가 이들의 일반적인 기능을 수행하도록 구성된 요소의 배열을 지칭한다. 따라서, 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 서열은 코딩 서열의 전사, 및 일부 경우에는 번역에 영향을 미칠 수 있다. 조절 서열은 코딩 서열의 발현을 지시하는 기능을 하는 한 코딩 서열과 인접할 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 사이에 존재하는 번역되지 않았지만 전사된 서열이 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재할 수 있고, 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동 가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다. 사실, 상기 서열은 동일한 연속 DNA 분자(즉, 염색체)에 존재할 필요가 없으며, 여전히 상호작용을 가질 수 있어 변경된 조절을 발생시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 상호 교환적으로 사용된다. 단백질은 전적으로 아미노산으로 구성되거나 구성되지 않을 수 있다.
"프로모터" 또는 "프로모터 서열"은 RNA 중합효소에 결합하고, 메신저 RNA, 리보솜 RNA, 작은 핵 또는 핵소체 RNA, 가이드 RNA, 또는 임의의 부류의 임의의 RNA 중합효소 I, II 또는 III에 의해 전사되는 임의의 종류의 RNA와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 프로모터는 항시성이거나 유도성일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "선택 가능한 마커"는 인공 선택에 적합한 형질을 부여하는 세포로 도입된 유전자를 지칭한다. 일반적으로 사용되는 선택 가능한 마커는 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 암피실린/카르베니실린, 카나마이신, 클로람페니콜, 노르세오트리신 N-아세틸 트랜스페라제, 에리트로마이신, 테트라사이클린, 겐타마이신, 블레오마이신, 스트렙토마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신, 블라스티시딘을 포함하고, G418 또는 다른 선택 가능한 마커가 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "특이적으로 결합한다"는 약 10-7 M, 약 10-8 M, 약 10-9 M, 약 10-10 M, 약 10-11 M, 약 10-12 M, 약 10-13 M, 약 10-14 M 또는 약 10-15 M의 해리 상수로 표현되는 결합 친화성을 갖는 2개의 분자, 예를 들어, 조작된 펩티드 항원 및 결합 표적 사이의 상호작용을 포함한다.
용어 "표적 유전체 DNA 서열", "세포 표적 서열", "표적 서열" 또는 "유전체 표적 유전자좌"는 핵산 가이드된 뉴클레아제 편집 시스템을 사용하여 적어도 하나의 뉴클레오티드의 변화가 요구되는 세포 또는 세포 집단의 시험관 내 또는 생체 내 또는 핵산(예를 들어, 유전체 또는 에피솜) 내의 임의의 유전자좌를 지칭한다. 표적 서열은 유전체 유전자좌 또는 염색체 외 유전자좌일 수 있다.
용어 "변이체"는 참조 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 상이하지만 필수적인 특성을 보유하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭할 수 있다. 폴리펩티드의 전형적인 변이체는 또 다른 참조 폴리펩티드와 아미노산 서열에서 상이하다. 일반적으로, 참조 폴리펩티드 및 변이체의 서열이 전체적으로 매우 유사하고 많은 영역에서 동일하도록 차이가 제한된다. 변이체 및 참조 폴리펩티드는 하나 이상의 변형(예를 들어, 치환, 첨가 및/또는 결실)에 의해 아미노산 서열이 상이할 수 있다. 폴리펩티드의 변이체는 보존적으로 변형된 변이체일 수 있다. 치환되거나 삽입된 아미노산 잔기는 유전 코드(예를 들어, 비-천연 아미노산)에 의해 인코딩된 것이거나 아닐 수 있다. 폴리펩티드의 변이체는 대립유전자 변이체와 같이 천연 발생일 수 있거나, 이는 천연 발생하는 것으로 공지되지 않은 변이체일 수 있다.
"벡터"는 세포로 전달되고/되거나 세포에서 발현될 원하는 서열 또는 서열들을 포함하는 임의의 다양한 핵산이다. 벡터는 전형적으로 DNA로 구성되지만, RNA 벡터도 또한 이용 가능하다. 벡터는 플라스미드, 포스미드, 파지미드, 바이러스 유전체, 합성 염색체 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 개시에서, 용어 "편집 벡터"는 뉴클레아제에 대한 코딩 서열, 전사될 gRNA 서열, 및 공여자 DNA 서열을 포함한다. 그러나, 다른 구현예에서, 2개의 벡터(뉴클레아제에 대한 코딩 서열을 포함하는 엔진 벡터, 및 전사될 gRNA 서열 및 공여자 DNA 서열을 포함하는 편집 벡터)가 사용될 수 있다.
일반적으로 뉴클레아제-지시된 유전체 편집
본원에 설명된 조성물 및 방법은 효모 세포의 집단에 원하는 편집을 도입하기 위해 뉴클레아제-지시된 유전체 편집을 수행하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 편집이 연속적인 편집 라운드로 도입되는 재귀적 세포 편집이 수행된다. 세포에서 적절한 합성 가이드 핵산과 복합체화된 핵산-가이드된 뉴클레아제는 원하는 위치에서 세포의 유전체를 절단할 수 있다. 가이드 핵산은 핵산-가이드된 뉴클레아제가 특정 표적 서열(세포 표적 서열 또는 치유 표적 서열)에서 DNA를 인식하고 절단하는 것을 돕는다. 가이드 핵산의 뉴클레오티드 서열을 조작함으로써, 핵산-가이드된 뉴클레아제는 적절한 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)가 근처에 있는 한 절단을 위해 임의의 DNA 서열을 표적화하도록 프로그래밍될 수 있다. 특정 양태에서, 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템은 가이드 핵산으로서 기능하도록 조합되는 2개의 개별 가이드 핵산 분자, 예를 들어, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 CRISPR RNA(tracrRNA)를 사용할 수 있다. 다른 양태에서, 바람직하게는, 가이드 핵산은 1) 유전체 표적 유전자좌에 하이브리드화될 수 있는 가이드 서열, 및 2) 핵산-가이드된 뉴클레아제와 상호작용하거나 복합체화될 수 있는 스캐폴드 서열 둘 모두를 포함하는 단일한 가이드 핵산 작제물이다(예를 들어, 도 1d 참조).
일반적으로, 가이드 핵산(예를 들어, gRNA)은 양립되는 핵산-가이드된 뉴클레아제와 복합체화될 수 있고, 이후 표적 서열과 하이브리드화될 수 있고, 이에 의해 뉴클레아제를 표적 서열로 향하게 할 수 있다. 가이드 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있으며; 대안적으로, 가이드 핵산은 DNA 및 RNA 둘 모두를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 핵산은 변형된 또는 비-천연 발생 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 가이드 핵산이 RNA를 포함하는 경우, gRNA는 플라스미드, 선형 작제물과 같은 폴리뉴클레오티드 분자 상의 DNA 서열에 의해 인코딩될 수 있거나, 코딩 서열은 편집 카세트 내에 존재할 수 있고 바람직하게는 존재한다. 편집 카세트를 설계하고 합성하기 위한 방법 및 조성물은 2019년 8월 23일에 출원된 USPNs 10,240,167; 10,266,849; 9,982,278; 10,351,877; 10,364,442; 10,435,715; 10,465,207 및 USSNs 16/550,092; 2019년 8월 26일에 출원된 16/551,517; 2020년 1월 20일에 출원된 16/773,618; 및 2020년 1월 20일에 출원된 16/773,712에 설명되어 있으며, 이들 모두는 본원에 참조로서 포함된다.
가이드 핵산은 가이드 서열을 포함하며, 상기 가이드 서열은 표적 서열과 하이브리드화되고, 표적 서열에 대한 복합체화된 핵산-가이드된 뉴클레아제의 서열 특이적 결합을 지시하도록 하기 위해 표적 서열과 충분한 상보성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열이다. 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬된 경우, 가이드 서열과 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 정도는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상 또는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 초과이다. 최적 정렬은 정렬 서열에 대한 임의의 적합한 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75개 이상 또는 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75개 초과의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20개 미만의 뉴클레오티드 길이이다. 바람직하게는, 가이드 서열은 10-30 또는 15-20개의 뉴클레오티드 길이, 또는 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 길이이다.
일반적으로, 표적 서열에서 편집을 생성시키기 위해, gRNA/뉴클레아제 복합체는 가이드 RNA에 의해 결정된 바와 같이 표적 서열에 결합하고, 뉴클레아제는 표적 서열에 인접한 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열을 인지한다. 표적 서열은 효모 세포에 대해 내인성 또는 외인성이거나, 시험관 내에 존재하는 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, 표적 서열은 효모 세포의 핵에 존재하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 표적 서열은 유전자 생성물(예를 들어, 단백질)을 인코딩하는 서열 또는 비-코딩 서열(예를 들어, 조절 폴리뉴클레오티드, 인트론, PAM, 조절 서열, 또는 정크 DNA)일 수 있다.
가이드 핵산은 세포 표적 서열을 표적화하는 공여자 핵산을 인코딩하는 편집 카세트의 일부일 수 있고, 바람직하게는 일부이다. 대안적으로, 가이드 핵산은 편집 카세트의 일부가 아닐 수 있고, 대신 편집 벡터 백본 상에서 인코딩될 수 있다. 예를 들어, 가이드 핵산을 코딩하는 서열은 먼저 벡터 백본에 조립되거나 삽입된 후, 예를 들어, 편집 카세트에 공여자 핵산이 삽입될 수 있다. 다른 경우에, 예를 들어, 편집 카세트 내의 공여자 핵산은 먼저 벡터 백본에 삽입되거나 조립된 후, 가이드 핵산을 코딩하는 서열이 삽입될 수 있다. 바람직하게는, 가이드 핵산 및 공여자 핵산을 인코딩하는 서열은 합리적으로 설계된 편집 카세트에 함께 위치하고, 갭 복구를 통해 선형 플라스미드 또는 벡터 백본에 동시에 삽입되거나 조립되어 편집 벡터를 생성한다.
표적 서열은 gRNA/뉴클레아제 복합체에 의해 인식되는 짧은 뉴클레오티드 서열인 프로토-스페이서 돌연변이(PAM)와 관련된다. 상이한 핵산-가이드된 뉴클레아제에 대한 정확한 바람직한 PAM 서열 및 길이 요건은 다양하나; PAM은 전형적으로 표적 서열에 인접하거나 근접한 2-7개의 염기쌍 서열이고, 뉴클레아제에 따라 표적 서열에 대해 5' 또는 3'에 존재할 수 있다. 핵산-가이드된 뉴클레아제의 PAM-상호작용 도메인의 조작은 PAM 특이성의 변경을 가능하게 하거나, 표적 부위 인식 충실도를 개선시키거나, 표적 부위 인식 충실도를 감소시키거나, 핵산-가이드된 뉴클레아제의 다능성을 증가시킬 수 있다.
모든 구현예는 아니지만 대부분의 구현예에서, 세포 표적 서열의 유전체 편집은 세포의 세포 표적 서열, 예를 들어, 유전체 DNA에 원하는 DNA 변경을 도입하고, 세포 표적 서열에서 프로토-스페이서 돌연변이(PAM) 영역을 제거하거나, 돌연변이시키거나, 불활성화시킨다. 세포 표적 서열에서 PAM을 불활성화시키는 것은, 예를 들어, 후속 편집 라운드에서 합성 가이드 핵산과 복합체화된 핵산-가이드된 뉴클레아제에 대한 후속 노출시 상기 세포 표적 서열에서 세포 유전체의 추가적인 편집을 배제한다. 따라서, 원하는 세포 표적 서열 편집 및 변경된 PAM을 갖는 세포는 세포 표적 서열에 상보적인 합성 가이드 핵산과 복합체화된 핵산-가이드된 뉴클레아제를 사용함으로써 선택될 수 있다. 첫 번째 편집 사건을 겪지 않은 세포는 절단되어 이중 가닥 DNA 파손을 일으키므로, 계속하여 생존하지 않을 것이다. 원하는 세포 표적 서열 편집 및 PAM 변경을 함유하는 세포는 절단되지 않을 것이며, 이들 편집된 세포는 더 이상 필요한 PAM 부위를 함유하지 않고 계속하여 성장하고 증식할 것이다.
핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템의 뉴클레아제 구성요소에 대해서는, 핵산-가이드된 뉴클레아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 효모 세포와 같은 특정 세포 유형에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 사용된 핵산-가이드된 뉴클레아제의 선택은 표적 서열에서 어떠한 유형의 편집이 이루어져야 하고 적절한 PAM이 원하는 표적 서열에 가깝게 위치하는지와 같은 많은 요인에 좌우된다. 본원에 설명된 방법에 사용되는 뉴클레아제는 Cas 9, Cas 12/CpfI, MAD2 또는 MAD7, 또는 다른 MADzymes를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 가이드 핵산과 마찬가지로, 뉴클레아제는 벡터 상의 DNA 서열에 의해 인코딩되고, 선택적으로 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 가이드 핵산의 전사를 제어하는 프로모터와 별개일 수 있지만 동일할 수 있고; 즉, 별도의 프로모터는 뉴클레아제 및 가이드 핵산 서열의 전사를 유도하지만 두 프로모터는 동일한 유형의 프로모터일 수 있다. 대안적으로, 뉴클레아제의 발현을 제어하는 프로모터는 가이드 핵산의 전사를 제어하는 프로모터와 상이할 수 있으며; 즉, 예를 들어, 뉴클레아제는, 예를 들어, pTEF 프로모터의 제어 하에 있을 수 있고, 가이드 핵산은, 예를 들어, pCYC1 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.
핵산-가이드된 뉴클레아제 시스템의 또 다른 구성요소는 세포 표적 서열에 대한 상동성을 포함하는 공여자 핵산이다. 공여자 핵산은 가이드 핵산과 동일한 벡터 및 심지어는 동일한 편집 카세트에 존재하고, 바람직하게는 편집 gRNA와 동일한 프로모터(즉, 편집 gRNA 및 공여자 핵산 둘 모두의 전사를 유도하는 단일 프로모터)의 제어 하에 있다(그러나 반드시 그러한 것은 아니다). 공여자 핵산은 gRNA/뉴클레아제 복합체의 일부로서 핵산-가이드된 뉴클레아제에 의해 닉킹(nicking)되거나 절단된 세포 표적 서열과의 상동성 재조합을 위한 주형으로 작용하도록 설계된다. 공여자 핵산 폴리뉴클레오티드는 약 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500 또는 1000개 또는 약 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500 또는 1000개 초과의 뉴클레오티드 길이, 및 USPN 10,465,207에 설명된 바와 같이 이중 gRNA 아키텍쳐와 조합되는 경우 최대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 및 최대 20 kb의 길이와 같은 임의의 적합한 길이의 공여자 핵산 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 특정한 바람직한 양태에서, 공여자 핵산은 20-300개의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 50-250개의 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드로서 제공될 수 있다. 공여자 핵산은 세포 표적 서열의 일부에 상보적인 영역(예를 들어, 상동성 아암)을 포함한다. 최적으로 정렬되는 경우, 공여자 핵산은, 예를 들어, 약 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90개 이상의 뉴클레오티드에 의해 세포 표적 서열과 중첩(이와 상보적)된다. 많은 구현예에서, 공여자 핵산은 공여자 핵산과 세포 표적 서열 사이의 돌연변이 또는 차이에 측접한 2개의 상동성 아암(세포 표적 서열에 상보적인 영역)을 포함한다. 공여자 핵산은 세포 표적 서열과 비교하여 적어도 하나의 돌연변이 또는 변경, 예를 들어, 세포 표적 서열과 비교하여 삽입, 결실, 변형 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
gRNA와 관련하여 설명된 바와 같이, 공여자 핵산은 바람직하게는 편집 플라스미드 백본(효모, 바람직하게는 선형 플라스미드 백본)에 삽입되는 합리적으로 설계된 편집 카세트의 일부로서 제공되며, 상기 편집 플라스미드 백본은 편집 카세트가 편집 플라스미드 백본에 삽입되는 경우 편집 gRNA 및 공여자 DNA의 전사를 유도하는 프로모터를 포함할 수 있다. 더욱이, 편집 벡터에 삽입된 합리적으로 설계된 편집 카세트에 하나 초과, 예를 들어, 2, 3, 4개 이상의 편집 gRNA/공여자 핵산이 존재할 수 있고; 대안적으로, 단일한 합리적으로 설계된 편집 카세트는 2개 내지 여러 개의 편집 gRNA/공여자 DNA 쌍을 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 편집 gRNA는 별개의 상이한 프로모터, 별개의 유사한 프로모터의 제어 하에 있거나, 모든 gRNA/공여자 핵산 쌍은 단일 프로모터의 제어 하에 있는다. 일부 구현예에서, 편집 gRNA 및 공여자 핵산의 전사를 유도하는(또는 하나 초과의 편집 gRNA/공여자 핵산 쌍을 유도하는) 프로모터는 선택적으로 유도성 프로모터이다.
공여자 핵산에 더하여, 편집 카세트는 하나 이상의 프라이머 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 프라이머 부위가 편집 카세트의 다른 구성요소 중 하나 이상에 측접하는 경우 프라이머 부위는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 편집 카세트를 증폭시키는 데 사용될 수 있다. 또한, 편집 카세트는 바코드를 포함할 수 있다. 바코드는 이러한 바코드가 상응하는 세포 표적 서열에 대해 이루어진 편집을 확인할 수 있도록 하는 공여자 DNA 서열에 상응하는 고유한 DNA 서열이다. 바코드는 전형적으로 4개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 편집 카세트는, 예를 들어, 편집 gRNA 및 공여자 핵산의 유전자-전체 또는 유전체-전체 라이브러리를 나타내는 편집 gRNA 및 공여자 핵산의 콜렉션 또는 라이브러리를 포함한다. 편집 카세트의 라이브러리는, 예를 들어, 각각의 상이한 공여자 핵산이 상이한 바코드와 연관된 벡터 백본으로 클로닝된다. 또한, 바람직한 구현예에서, 핵산-가이드된 뉴클레아제 시스템의 구성요소를 인코딩하는 편집 벡터 또는 플라스미드는 특히 뉴클레아제 서열의 요소로서 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 초과의 핵 국소화 서열(NLS)과 같은 하나 이상의 NLS를 포함하는 핵산-가이드된 뉴클레아제를 추가로 인코딩한다. 일부 구현예에서, 조작된 뉴클레아제는 아미노-말단에 또는 그 근처에 NLS, 카르복시-말단에 또는 그 근처에 NLS, 또는 이들의 조합을 포함한다.
효모에서의 편집 효율 증가
본 발명의 개시는 효모에서 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집의 효율을 증가시키기 위한 것이다. 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 기술을 사용한 유전체 편집은 편집(예를 들어, 공여자) 플라스미드와의 상동성 재조합을 통해 뉴클레아제-유도된 이중 가닥 파손의 정확한 복구를 필요로 한다. 핵산-가이드된 뉴클레아제에 의해 야기된 세포의 이중 가닥 파괴는 1) 파괴가 복구되지 않는 경우 세포 사멸; 2) 상동성 복구 주형 없이 파괴를 복구하는 비-상동성 말단 결합(NHEJ); 및 3) 파괴를 복구하는 보조(여기서, 외인성) 상동성 DNA(예를 들어, 편집 플라스미드에 삽입된 편집 카세트로부터의 공여자 DNA 서열)를 사용하는 상동성 재조합(HR)의 3개의 주요 결과를 갖는다.
핵산-가이드된 뉴클레아제 편집에서 HR을 증가시키기 위해, DNA 결합 도메인인 LexA 및 이중 가닥 파괴에 국소화되는 DNA 손상 복구 단백질인 RAD51로 구성된 융합 단백질은 편집 또는 공여자 플라스미드로부터 발현된 융합 단백질에서 조합된다. LexA-Rad51 융합 단백질은 편집 플라스미드 상의 LexA DNA 결합 도메인에 대한 DNA 결합 서열을 포함시킴으로써 뉴클레아제-유도된 이중 가닥 파괴에 카세트(예를 들어, CREATE 카세트 또는 편집 카세트) 내에 gRNA 및 공여자 DNA를 함유하는 편집 플라스미드를 국소화시키거나 동원하는 데 사용된다. E. 콜리에서, LexA는 DNA 손상 반응에 관여하는 다수의 유전자를 억제하는 역할을 한다. E. 콜리에서, DNA 손상이 발생하면, LexA는 이들 유전자로부터 결합되지 않아 이들이 억제될 수 있도록 한다. 그러나, 효모에서 본원에서 사용되는 바와 같이, LexA는 DNA 결합 도메인으로만 작용하고, 다른 고유 효모 유전자 또는 기기와 상호작용하지 않는다. 따라서, 편집 플라스미드의 동원은 Rad51의 작동에 의해 매개된다. 고유 형태의 Rad51은 이중 가닥 DNA 파괴 근처에서 나선형 다량체를 형성하고, HR 과정에서 다른 복구 단백질과 상호작용한다. 따라서, Rad51은 자연적으로 이중 가닥 파괴에 국소화된다. Rad51의 많은 카피가 이중 가닥 파괴에서 나선형으로 다량체화되기 때문에, 나선형으로 다량체화된 Rad51 단백질 중 적어도 하나의 Rad51이 LexA-Rad51 융합 단백질일 가능성이 높다. 융합 단백질의 Rad51 부분이 이중 가닥 파괴 부위에서 표적 DNA에 국소화되고 융합 단백질의 LexA 부분이 편집 플라스미드에 포함된 LexA DNA 결합 부위에 결합하는 경우, 편집 플라스미드는 이중 가닥 파괴 부위에 동원된다.
LexA-Rad51 융합 단백질을 통한 이중 가닥 파괴 부위로의 편집 플라스미드의 동원은 다중 라이브러리 형식에서 편집률을 유의하게 증가시키는 것으로 나타났다. Rad51은 포유류 세포를 포함하는 많은 상이한 유기체 및 E. 콜리(이의 동족체는 RecA로 지칭됨)에서 동족체를 갖기 때문에, LexA-Rad51 융합 단백질은 또한 E. 콜리 및 포유류 세포를 포함하는 진핵생물 세포에서 HR 비율 및 이에 따른 편집을 증가시킬 것으로 예상된다.
도 1a는 본 발명의 개시에 따른 핵산 가이드된-뉴클레아제 편집 방법에 대한 일반적인 흐름도이다. 방법(100)의 첫 번째 단계에서, 합리적으로 설계된 편집 카세트의 라이브러리가 합성된다(102). 편집 카세트를 설계하고 합성하는 데 특히 선호되는 방법 및 조성물은 2019년 8월 23일에 출원된 USPNs 10,240,167; 10,266,849; 9,982,278; 10,351,877; 10,364,442; 10,435,715; 10,465,207 및 USSNs 16/550,092; 2019년 8월 26일에 출원된 16/551,517; 2020년 1월 20일에 출원된 16/773,618; 및 2020년 1월 20일에 출원된 16/773,712에 설명되어 있으며, 이들 모두는 본원에 참조로서 포함된다. USPN 10,465,207에는 본원에 설명된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서 사용되는 화합물 편집 카세트가 설명되어 있다. 화합물 편집 카세트는 하나 초과의 gRNA 및 하나 초과의 공여자 DNA를 포함하는 편집 카세트이다. 일단 설계되고 합성되면, 편집 카세트는 증폭되고 정제된다.
다음으로 또는 동시에, 단계(114)에서, 플라스미드 백본이 설계된다. 도 1d와 관련하여 하기에 설명되는 바와 같이, 플라스미드 백본은 뉴클레아제에 대한 코딩 서열, 적어도 2개의 상이한 선택 마커가 있는 선택 마커(예를 들어, 항생제 내성 유전자); LexA-Rad51 융합 단백질에 대한 코딩 서열; 2μ 복제 기점; 및 다른 유전적 요소를 포함한다.
편집 카세트 및 플라스미드 백분을 제조하는 것 외에, 선택한 효모 세포는 형질전환을 위해 전기적격이 된다(120). 이러한 특정 개시는 효모 세포에 초점을 맞추고 있으나; 편집될 수 있는 세포는 LexA 또는 LexA 동족체가 존재하는 임의의 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 포함하나; 다른 결합 단백질 및 이들의 인지체 결합 부위가 편집되는 세포 기원에 따라 LexA 결합 단백질 및 LexA 결합 부위를 대체할 수 있다. 예를 들어, 징크핑거 결합 단백질은 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질의 한 부류이며, 여기서 징크 핑거의 단백질 서열은 특정 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 징크핑거 단백질은 합성 생물학 전반에 걸쳐 전사 인자를 위한 빌딩 블록으로서 그리고 징크핑거 단백질을 FoKI와 같은 뉴클레아제에 융합시킴으로써 초기 유전체 편집에서 사용되어 왔다. 본 발명의 조성물 및 방법의 맥락에서, 징크핑거 단백질 또는 결합 도메인은 LexA 결합 도메인 대신에 Rad51에 융합된다. 이러한 경우, 징크핑거는 LexA 결합 부위를 대체할 플라스미드 상의 정의된 서열에 결합할 것이다.
또한, 전사 활성제-유사 효과기(TALE)는 거의 모든 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있는 또 다른 부류의 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질이다. 징크핑거 단백질과 유사하게, TALE는 전사 조절을 위한 결합 도메인 및 뉴클레아제에 융합되는 경우 유전체 편집을 위한 결합 도메인으로 사용되었다. 본 발명의 조성물 및 방법의 맥락에서, TALE 단백질은 LexA 대신에 Rad51에 융합되며, 여기서 TALE는 LexA 결합 부위를 대체하는 플라스미드 상의 정의된 서열에 결합한다.
TetR 및 TetO는 각각 DNA 결합 단백질 및 결합 서열의 박테리아 패밀리이다. TetR 및 TetO는 E. 콜리로부터의 잘 특성규명된 테트라사이클린-조절된 전사 활성화 시스템에서 비롯된다. 결합 단백질 TetR 및 인지체 TetO 결합 서열은 많은 유기체에 걸쳐 많은 합성 생물학 DNA 결합 적용을 위해 공동 선택되었다. E. 콜리, 효모, 포유류 세포 및 드로소필라(Drosophila)를 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법에서, TetR 단백질은 융합 단백질에서 LexA를 대체하고, TetO는 플라스미드 상의 LexA 결합 부위를 대체한다.
징크핑거, TALE 및 TetR 결합 단백질 및 인지체 결합 부위에 더하여, GAL4 결합 도메인은 고유한 효모 전사 인자이다. 이의 고유 형태에서, GAL4 유전자는 갈락토스 대사에 관여하는 유전자의 전사 활성제 역할을 한다. GAL4 유전자는 UAS(업스트림 활성화 서열)에 결합한다. GAL4 결합 단백질 및 UAS 결합 서열 쌍은 효모 및 포유류 세포에서 이종성 전사 인자를 형성하는 데 사용되었다. GAL4 결합 단백질의 DNA 결합 도메인은 이의 전사 활성화 도메인으로부터 물리적으로 분리될 수 있으며; 따라서, 이들 도메인은 전사 조절 및 단백질-단백질 상호작용의 연구를 위한 2-하이브리드 검정과 같은 유전적 도구의 개발에 사용되었다. 본 발명의 조성물 및 방법에서, GAL4 결합 도메인은 융합 단백질에서 LexA 결합 도메인을 대체하고, UAS 결합 부위는 LexA 결합 부위를 대체한다.
최종적으로, LacI 결합 단백질 및 LacO 결합 부위는 박테리아에서 유래하고, 락토스의 대사에 관여한다. LacI 단백질은 LacO 작동자에 결합하여 특정 유전자의 발현을 억제한다. 합성 생물학에서 LacI 결합 단백질은 일부 유전자 회로에서 전사 인자이다. 본 발명의 조성물 및 방법에서, LacI는 LexA 결합 도메인을 대체하고, LacO 결합 부위는 플라스미드 상의 LexA 결합 부위를 대체한다. LexA의 결합 도메인 및 인지체 결합 서열에 대한 대안으로 사용될 수 있는 예시적인 결합 단백질은 표 1에 제시되어 있다.
표 1
Figure pct00001
세포가 전기적격성이 되면(120), 세포, 편집 카세트 및 선형화된 플라스미드 백본은 조합되고, 편집 카세트 및 선형화된 플라스미드 백본은 세포로 형질전환(예를 들어, 이에 전기천공)된다(106). 본 발명의 방법의 구현예에서, 뉴클레아제, gRNA 및 공여자 DNA에 대한 코딩 서열을 포함하는 단일 벡터는 단일 플라스미드 상에 함유되나(도 1d 참조, 상기); 다른 구현예에서, 세포는 편집 뉴클레아제를 발현하는 별도의 엔진 벡터와 동시에 형질전환될 수 있고; 대안적으로, 세포는 뉴클레아제를 발현하도록 구성된 엔진 벡터로 이미 형질전환되었을 수 있다. 형질전환은 외인성 핵산 서열(예를 들어, DNA)을 표적 세포로 도입하기 위한 다양한 당 분야에 인정된 기술을 포함하는 것으로 의도되며, 본원에서 사용되는 용어 "형질전환"은 모든 형질전환 및 형질감염 기술을 포함한다. 상기 방법은 전기천공, 리포펙션, 옵토포레이션(optoporation), 주입, 미세침전, 미세주입, 리포솜, 입자 봄바드먼트(particle bombardment), 소노포레이션(sonoporation), 레이저-유도 천공, 비드 형질감염, 인산칼슘 또는 염화칼슘 공동-침전, 또는 DEAE-덱스트란-매개 형질감염을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 수크로스, 소르비톨 또는 글리세롤 세척을 사용한 벡터 흡수를 위해 세포가 또한 제조될 수 있다. 또한, 기계적 및 화학적 형질감염 방법의 능력을 이용하는 하이브리드 기술, 예를 들어, 화학적 형질감염과 기계적 방법을 조합하는 형질감염 방법인 마그네토펙션(magnetofection)이 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 양이온성 지질은 유전자 총 또는 전기천공기와 조합하여 배치될 수 있다. 표적 세포를 형질전환시키거나 형질감염시키기 위한 적합한 물질 및 방법은, 예를 들어, 문헌[Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2014]에서 찾을 수 있다. 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기를 사용하는 본 발명의 자동화된 방법은 도 5c 내지 5g에 제시된 예시적인 장치와 같은 관통형 전기천공을 이용한다.
일단 형질전환되면, 세포는 회복될 수 있고, 편집 카세트에 더하여 적절한 선택 가능한 마커를 포함하는 편집 벡터로 형질전환된 세포를 선택하기 위해 선택이 수행된다(108). 상기 설명된 바와 같이, 암피실린/카르베니실린, 카나마이신, 클로람페니콜, 노르세오트리신 N-아세틸 트랜스페라제, 에리트로마이신, 테트라사이클린, 겐타마이신, 블레오마이신, 스트렙토마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신, 블라스티시딘과 같은 약물 선택 가능 마커, 및 G418 또는 다른 선택 가능한 마커가 사용될 수 있다.
다음 단계에서, 편집이 발생하도록 하는 조건이 제공되고(110), 세포가 고정 성장기에 진입할 때까지(또는 진입에 가까워질 때까지) 세포가 성장된다(112). 일단 세포가 고정기에 진입하면, 세포는 상이한 용기 및 신선한 배지로 옮겨진 후, 원하는 ID로 성장하여 다시 전기적격이 될 수 있고(114), 이어서 또 다른 라운드의 편집(116)이 이어질 수 있다.
도 1b는 편집 벡터(도 1d 참조)의 일부를 형성하는 LexA-Rad51 융합 단백질 및 LexA DNA 결합 도메인에 대한 코딩 서열의 단순화된 구조(120)이다. 구성요소는 5'에서 3' 방향으로 pADH1(효모 알콜 탈수소효소 1) 프로모터(121); LexA-Rad51 융합 단백질의 LexA 부분(123); 링커(125); LexA-Rad51 융합 단백질의 Rad51 부분(127); ADH1 종료자(129); 및 LexA DNA 결합 부위(131)를 포함한다.
효모 알콜 탈수소효소 1 프로모터에 대한 대안으로서, Zev 시스템에서 pGPD, pTEF1, pACT1, pRNR2, pCYC1, pTEF2, pHXT7, pYEF3, pRPL3, pRPL4 또는 pGAL1과 같은 다른 프로모터가 사용될 수 있다. LexA-Rad51 융합 단백질의 LexA 부분은, 예를 들어, LexA 단백질의 1 내지 202 아미노산 잔기에 대한 코딩 서열을 포함한다. LexA 및 Rad51 단백질을 분리하는 링커는 폴리글리신 링커뿐만 아니라 글리신-세린 링커와 같은 당 분야에 공지된 임의의 링커일 수 있다. LexA-Rad51 융합 단백질의 Rad51 부분은, 예를 들어, Rad51 단백질의 210 내지 611 아미노산 잔기에 대한 코딩 서열을 포함한다. ADH1 종료자는 융합 단백질 작제물에 사용될 수 있는 하나의 종료자일 뿐이고, 다른 종료자는 CYC1, GPD, ACT1, TEF1, RNR2, CYC1, TEF2, HXT7, YEF3, RPL3 또는 RPL4를 포함한다. LexA 결합 도메인은 하나 이상의 LexA 결합 도메인을 포함할 수 있다. LexA 결합 도메인은 16 bp 뉴클레오티드 트랙, 즉, CTGTATATATATACAG를 포함한다.
도 1c는 효모 유전체에서 LexA-Rad51 융합 단백질을 사용하여 상동성 재조합을 향상시키고 따라서 편집을 증가시키는 단순화된 그래픽이다. 도 2b의 그래픽 공정(140)에서, 핵산-가이드된 뉴클레아제는 표적 유전체 서열에 결합하고, 표적 유전체 서열에서 이중 가닥 파괴(143)를 생성한다. 이중 가닥 파괴는 세 가지 방법 중 하나로 해결될 수 있다. 첫째, 이중 가닥 파괴는 복구되지 않을 수 있고, 복구되지 않으면, 세포는 사멸한다(145). 대안적으로, 이중 가닥 파괴는 상동성-지시 복구 없이 파괴의 말단을 연결을 발생시키는 비-상동성 말단 결합(147)에 의해 복구될 수 있으며, 이는 본질적으로 돌연변이유발성이다. 마지막으로, 복구는 상동성 서열(예를 들어, 공여자 DNA)을 통한 상동성 복구(149)에 의해 이루어질 수 있으며, 이는 원하는 서열 복구(예를 들어, 편집)를 유도한다. 본 발명의 개시에서, 상동성 복구는 LexA-Rad51 융합 단백질을 통해 이중 가닥 파괴 부위에 공여자 DNA를 포함하는 편집 플라스미드를 동원함으로써 최적화된다.
도 1c에서 상동성 재조합에 대한 화살표 다음에, 편집 플라스미드는 (150)에서 제시되고; 표적 유전체 서열은 (160)에서 제시되고; 공여자 DNA(상동성 영역)는 (152)에서 제시되고; LexA-Rad51 융합체는 일반적으로 (158)에서 제시되며, 구성요소 LexA(164)는 편집 플라스미드(150) 상의 LexA DNA 결합 도메인에 결합되고, 구성요소 Rad51(166)은 표적 유전체 서열(160) 상의 절단 부위에 근접한 Rad51 나선형 다량체(156)의 일부로서 제시된다. 일단 상동성 재조합이 발생하면, 표적 유전체 서열(160)에 대한 정확한 편집(162)이 있어야 한다.
도 1d는 LexA-Rad51 융합 단백질에 대한 코딩 서열, CREATE 카세트, 및 뉴클레아제 MAD7에 대한 코딩 서열을 포함하는 예시적 편집 벡터 맵이다. 11시 55분에 시작하여, gRNA의 전사를 유도하는 pSNR52 프로모터, 펜타-T 모티프, 및 공여자 DNA 서열에 이어 SUP4 종료자; 카나마이신 내성 유전자의 전사를 유도하는 pTEF 프로모터에 이어 TEF 종료자; LexA-링커-Rad51 융합 단백질 코딩 서열의 전사를 유도하는 pADH1 프로모터에 이어 ADH1 종료자; 하나 이상의 LexA DNA 결합 서열; SV40 핵 국소화 서열 및 MAD7 뉴클레아제 코딩 서열의 전사를 유도하는 또 다른 프로모터에 이어 CYC1 종료자; 암피실린 내성 유전자를 유도하는 프로모터(다른 요소의 전사에 대해 역 배향임); 박테리아에서 편집 벡터의 증식을 위한 pUC 복제 기점; 및 효모에서 편집 벡터의 증식을 위한 2-μ 복제 기점이 존재한다.
효모 세포에서 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집을 수행하기 위한 자동화된 세포 편집 기기 및 모듈
자동화된 세포 편집 기기
도 2a는, 예를 들어, 살아 있는 효모 세포의 표적화된 유전자 편집을 위한 예시적인 워크플로우 중 하나를 수행하기 위한 예시적인 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기(200)를 도시한다. 예를 들어, 기기(200)는 실험실 환경 내에서 사용하기 위한 독립형 데스크톱 기기로서 설계될 수 있으며, 바람직하게는 설계된다. 기기(200)는 인간 개입 없이 세포에서 자동화된 유전체 절단 및/또는 편집을 수행하는 데 있어서 다양한 통합 공정을 수행하기 위한 재사용 가능 및 일회용 구성요소의 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 개입 없이 다수의 모듈 사이의 세포 처리를 허용하는 공기 변위 피펫터(232)를 포함하는, 예를 들어, 자동화된(즉, 로봇식) 액체 핸들링 시스템(258)에 XYZ 축 모션 제어를 공급하는 자동화된 기계적 모션 시스템(액추에이터)(제시되지 않음)을 제공하는 갠트리(202)가 예시된다. 일부 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기에서, 공기 변위 피펫터(232)는 갠트리(202)에 의해 이동되고, 다양한 모듈 및 시약 카트리지(예를 들어, 도 5a 및 5b에 제시된 것들)는 정지 상태로 남아 있으나; 다른 구현예에서, 액체 핸들링 시스템(258)은 다양한 모듈 및 시약 카트리지가 이동되는 동안 정지 상태를 유지할 수 있다. 또한, 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기(200)에는 저장소(212) 및 형질전환 모듈(230)(예를 들어, 도 5c-5g와 관련하여 상세히 설명된 바와 같은 관통형 전기천공 장치)뿐만 아니라 세척 저장소(206), 세포 투입 저장소(251) 및 세포 산출 저장소(253)를 포함하는 시약 카트리지(210)가 포함된다. 세척 저장소(206)는 큰 튜브, 예를 들어, 세척 용액 또는 반복적인 공정 전체에 걸쳐 자주 사용되는 용액을 수용하도록 구성될 수 있다. 2개의 시약 카트리지(210)가 도 2a에서 세척 저장소(206)를 포함하지만, 세척 저장소가 대신 세척 카트리지에 포함될 수 있으며, 여기서 시약 및 세척 카트리지는 별도의 카트리지이다. 그러한 경우에, 시약 카트리지(210) 및 세척 카트리지(204)는 그 안에 삽입된 소모품(시약 또는 다양한 삽입물 내에 함유된 다른 구성요소)을 제외하고는 동일할 수 있다. 대안적으로, 시약 카트리지 프레임은 키트에 제공된 튜브, 스트립 튜브 및 기타 삽입물과 함께 자동화된 기기의 영구적인 부분일 수 있다.
일부 구현에서, 시약 카트리지(210)는 자동화된 다중-모듈 세포 처리/편집 기기(200)에서 사용하기 위한 시약 및 세포를 포함하는 일회용 키트이다. 예를 들어, 사용자는 세포 처리를 활성화하기 전에 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기(200)의 섀시 내에 다양한 원하는 삽입물 및 시약을 포함하는 시약 카트리지(210)의 각각을 개방하고 위치시킬 수 있다. 또한, 각각의 시약 카트리지(210)는 그 안에 함유된 시약에 적절한 상이한 온도 구역을 갖는 섀시의 리셉터클에 삽입될 수 있다.
또한, 갠트리(202) 및 공기 변위 피펫터(232)를 포함하는 로봇식 액체 핸들링 시스템(258)이 도 2a에 예시된다. 일부 예에서, 로봇식 핸들링 시스템(258)은 Mannedorf, Switzerland의 Tecan Group Ltd., Reno, NV의 Hamilton Company(예를 들어, WO2018015544A1 참조) 또는 Fort Collins, CO의 Beckman Coulter, Inc.(예를 들어, US20160018427A1 참조)에 의해 제조된 것들과 같은 자동화된 액체 핸들링 시스템을 포함할 수 있다. 피펫 팁(215)은 공기 변위 피펫터(232)와 함께 사용하기 위해 피펫 이송 팁 공급부(214)에 제공될 수 있다.
일부 구현에서, 시약 카트리지(210)의 삽입물 또는 구성요소는 로봇식 핸들링 시스템(258)에 의한 인식을 위해 바코드와 같은 기계 판독가능 표시(제시되지 않음)로 표시된다. 예를 들어, 로봇식 액체 핸들링 시스템(258)은 내용물을 확인하기 위해 각각의 시약 카트리지(210) 내의 하나 이상의 삽입물을 스캔할 수 있다. 다른 구현에서, 기계-판독가능 표시는 각각의 시약 카트리지(210)에 표시될 수 있고, 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기(200)의 처리 시스템(제시되지 않았지만, 도 2b의 요소(237) 참조)은 기계-판독 가능 표시를 기반으로 저장된 물질 맵을 확인할 수 있다. 도 2a에 예시된 구현예에서, 세포 성장 모듈은 세포 성장 바이알(218)을 포함한다(도 3a-3d와 관련하여 하기에 더 상세히 설명됨). TFF 모듈(222)이 추가로 관찰된다(도 4a-4e와 관련하여 상기에서 상세히 설명됨). 또한, 도 2a의 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기(200)의 일부로서도, 예를 들어, 로봇식 액체 핸들링 시스템(258) 및 공기 변위 피펫터(232)에 의해 제공되는 도 6d-6g와 관련하여 본원에 설명된 단일화 모듈(240)(예를 들어, 고체 벽 분리, 인큐베이션 및 정상화 장치(SWIIN 장치)가 여기에 제시됨)이 예시된다. 추가로, 선택 모듈(220)이 관찰된다. 또한, 3개의 히트싱크(heatsink)(255)의 배치에 유의한다.
도 2b는 도 2a에 도시된 예시적인 다중-모듈 세포 처리 기기(200)의 내용물의 단순화된 표현이다. 예를 들어, 카트리지-기반 소스 물질(예를 들어, 시약 카트리지(210)에서)은 공기 변위 피펫터(232)에 의한 접근을 위해 기기(200)의 데크 상의 지정된 영역에 위치될 수 있다. 다중-모듈 세포 처리 기기(200)의 데크는 기기(200)의 임의의 모듈로부터 흘러 내리거나, 떨어지거나, 넘쳐나는 오염물이 보호 싱크의 립 내에 포함되도록 보호 싱크를 포함할 수 있다. 또한, 상이한 영역에 적절한 온도 구역을 생성할 수 있는 열 조립체(211)와 함께 배치된 것으로 제시된 시약 카트리지(210)가 관찰된다. 시약 카트리지 중 하나는 또한 FTEP 인터페이스(예를 들어, 매니폴드 아암) 및 작동기(231)에 의헤 제공되는 관통형 전기천공 장치(230)(FTEP)를 포함한다는 점에 유의한다. 또한, 인접한 열 조립체(225)를 갖는 TFF 모듈(222)이 관찰되며, 여기서 TFF 모듈은 TFF 인터페이스(예를 들어, 매니폴드 아암) 및 작동기(233)에 의해 제공된다. 열 조립체(225, 235 및 245)는 펠티에 장치뿐만 아니라 히트싱크, 팬 및 냉각기와 같은 열 전기 장치를 포함한다. 회전 성장 바이알(218)은 성장 모듈(234) 내에 있으며, 여기서 성장 모듈은 2개의 열 조립체(235)에 의해 제공된다. 선택 모듈은 (220)에서 관찰된다. 또한, SWIIN 카트리지(241)를 포함하는 SWIIN 모듈(240)이 관찰되며, 여기서 SWIIN 모듈은 또한 열 조립체(245), 조명(243)(본 구현예에서, 백라이팅), 증발 및 응축 제어장치(249)를 포함하고, 여기서 SWIIN 모듈은 SWIIN 인터페이스(예를 들어, 매니폴드 아암) 및 작동기(247)에 의해 제공된다. 또한, 터치 스크린 디스플레이(201), 디스플레이 작동기(203), 조명(205)(다중-모듈 세포 처리 기기(200)의 양측에 하나) 및 카메라(239)(다중-모듈 세포 처리 기기(200)의 양측에 하나의 조명 장치)가 본 도면에서 관찰된다. 마지막으로, 요소(237)는 회로 제어 보드, 고-전압 증폭기, 전원 공급장치 및 전원 입력과 같은 전자 장치뿐만 아니라 펌프, 밸브 및 센서와 같은 공압장치를 포함한다.
도 2c는 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기(200)의 데스크탑 버전으로 사용하기 위한 다중-모듈 세포 처리 기기(200)의 전방 사시도를 예시한다. 예를 들어, 섀시(290)는 약 24-48 인치의 폭, 약 24-48 인치의 높이 및 약 24-48 인치의 깊이를 가질 수 있다. 섀시(290)는 자동화된 세포 처리에 사용되는 모든 모듈 및 일회용 소모품을 보유하고, 인간 개입 없이 필요한 모든 공정을 수행하도록 설계될 수 있고 바람직하게는 설계되고; 즉, 섀시(290)는 통합된 독립형 자동화 다중-모듈 세포 처리 기기를 제공하도록 구성된다. 도 2c에 예시된 바와 같이, 섀시(290)는 내부 팬(제시되지 않음)을 통한 공기 흐름을 허용하는 터치 스크린 디스플레이(201), 냉각 화격자(264)를 포함한다. 터치 스크린 디스플레이는 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기(200)의 처리 상태에 관한 정보를 사용자에게 제공하고, 세포 처리를 수행하기 위해 사용자로부터의 입력을 수용한다. 이러한 구현예에서, 섀시(290)는 조정 가능한 피트(270a, 270b, 270c 및 270d)에 의해 들어 올려진다(피트(270a-270c)는 이러한 도 2c에 제시되어 있다). 예를 들어, 조정 가능한 피트(270a-270d)는 섀시(290) 아래에 추가 공기 흐름을 허용한다.
일부 구현에서, 섀시(290) 내부에 도 2a 및 2b와 관련하여 설명된 구성요소의 대부분 또는 전부가 존재할 것이며, 이는 갠트리를 따라 배치된 로봇식 액체 핸들링 시스템, 관통형 전기천공 장치를 포함하는 시약 카트리지(210), 세포 성장 모듈(234) 내의 회전 성장 바이알(218), 접선 유동 여과 모듈(222), SWIIN 모듈(240)뿐만 아니라 다양한 모듈을 위한 인터페이스 및 작동기를 포함한다. 또한, 섀시(290)는 제어 회로, 액체 핸들링 튜브, 공기 펌프 제어, 밸브, 센서, 열 조립체(예를 들어, 가열 및 냉각 유닛) 및 다른 제어 메커니즘을 수용한다. 다중-모듈 세포 편집 기기의 예에 대해서는 2020년 1월 23일에 출원된 USPNs 10,253,316; 10,329,559; 10,323,242; 10,421,959; 10,465,185; 10,519,437; 10,584,333; 및 10,584,334 및 USSNs 16/750,369; 2020년 3월 18일에 출원된 16/822,249; 및 2020년 4월 1일에 출원된 16/837,985를 참조하며, 이들 모두의 전체내용은 참조로서 본원에 포함된다.
회전 세포 성장 모듈
도 3a는 본원에 설명된 세포 성장 장치와 함께 그리고 자동화 다중-모듈 세포 처리 기기에서 사용하기 위한 회전 성장 바이알(300)의 일 구현예를 제시한다. 회전 성장 바이알(300)은 액체 배지 및 세포를 수용하기 위한 개방 단부(304), 세포 성장을 위한 1차 용기를 정의하는 중앙 바이알 영역(306), 적어도 하나의 광 경로(310)를 정의하는 테이퍼-수축 영역(tapered-to-constricted region)(318), 폐쇄 단부(316), 및 구동 결합 메커니즘(312)을 갖는 광학적으로 투명한 용기이다. 회전 성장 바이알(300)은 바이알이 회전하는 중심 종축(320)을 가지며, 광 경로(310)는 일반적으로 바이알의 종축에 수직이다. 제1 광 경로(310)는 테이퍼-수축 영역(318)의 하부 수축 부분에 위치한다.
선택적으로, 회전 성장 바이알(300)의 일부 구현예는 테이퍼-수축 영역(318)의 테이퍼 영역에 제2 광 경로(308)를 갖는다. 본 구현예에서 둘 모두의 광 경로는 세포 배양물(세포 + 성장 배지)로 지속적으로 채워지고 성장 바이알의 회전 속도에 의해 영향을 받지 않는 회전 성장 바이알의 영역에 위치한다. 제1 광 경로(310)는 제2 광 경로(308)보다 짧아서 바이알 내의 세포 배양물의 OD 값이 높은 수준인 경우(예를 들어, 세포 성장 공정에서 이후) OD 값의 민감한 측정을 가능하게 하는 반면, 제2 광 경로(308)는 바이알 내의 세포 배양물의 OD 값이 낮은 수준인 경우(예를 들어, 세포 성장 공정에서 더 이전) OD 값의 민감한 측정을 가능하게 한다.
구동 결합 메커니즘(312)은 바이알을 회전시키기 위해 모터(제시되지 않음)와 결합한다. 일부 구현예에서, 모터는 회전 성장 바이알(300)이 한 방향으로만 회전하도록 구동 결합 메커니즘(312)을 구동하고, 다른 구현예에서, 회전 성장 바이알(300)은 제1 시간 또는 주기성 동안 제1 "방향으로" 회전되고, 제2 시간 또는 주기성 동안 제2 방향(즉, 반대 방향)으로 회전되고, 이러한 공정은 회전 성장 바이알(300)(및 세포 배양 내용물)이 진동 운동에 적용되도록 반복될 수 있다. 또한, 배양물이 진동에 적용되는지의 여부 및 이에 따른 주기성의 선택은 사용자에 의해 선택될 수 있다. 제1 시간 및 제2 시간은 동일할 수 있거나 상이할 수 있다. 시간의 양은 1초, 2초, 3초, 4초, 5초 이상이거나, 1분, 2분, 3분, 4분 이상일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 세포 성장의 초기 단계에서, 회전 성장 바이알(400)은 제1 주기성(예를 들어, 60초마다)으로 진동될 수 있고, 이후 세포 성장의 후기 단계에서 회전 성장 바이알(300)은 제1 주기성과 상이한 제2 주기성(예를 들어, 1초마다)으로 진동될 수 있다.
회전 성장 바이알(300)은 재사용 가능할 수 있거나, 바람직하게는, 회전 성장 바이알은 소모품이다. 일부 구현예에서, 회전 성장 바이알은 소모품이고, 성장 배지로 미리 채워진 채로 사용자에게 제공되며, 여기서 바이알은 호일 밀봉으로 개방 단부(304)에서 기밀적으로 밀봉된다. 이러한 방식으로 패키징된 배지-충전된 회전 성장 바이알은 독립형 세포 성장 장치 또는 자동화된 다중-모듈 세포 처리 시스템의 일부인 세포 성장 모듈과 함께 사용하기 위한 키트의 일부일 수 있다. 바이알에 세포를 도입하기 위해, 사용자는 원하는 부피의 세포를 피펫팅하고, 바이알의 호일 밀봉을 천공하기 위해 페펫 팁을 사용하기만 하면 된다. 개방 단부(304)는 세포 성장 장치와 중첩하고 결합하기 위해 연장된 립(302)을 선택적으로 포함할 수 있다. 자동화 시스템에서, 회전 성장 바이알(300)은 자동화 시스템의 일부인 스캐너 또는 카메라(제시되지 않음)에 의해 판독될 수 있는 바코드 또는 다른 식별 수단으로 태깅될 수 있다.
회전 성장 바이알(300)의 부피 및 세포 배양물의 부피(성장 배지 포함)는 크게 변할 수 있지만, 회전 성장 바이알(300)의 부피는 특정된 총 세포 수를 생성하기에 충분히 커야 한다. 실제로, 회전 성장 바이알(300)의 부피는 1-250 mL, 2-100 mL, 5-80 mL, 10-50 mL 또는 12-35 mL 범위일 수 있다. 마찬가지로, 세포 배양물(세포 + 성장 배지)의 부피는 회전 성장 바이알(300)에서 적절한 통기 및 혼합을 허용하기에 적절해야 한다. 적절한 통기는 성장 배지 내에서 균일한 세포 호흡을 촉진한다. 따라서, 세포 배양물의 부피는 성장 바이알 부피의 대략 5-85% 또는 성장 바이알 부피의 20-60%이어야 한다. 예를 들어, 30 mL 성장 바이알의 경우, 세포 배양물의 부피는 약 1.5 mL 내지 약 26 mL, 또는 6 mL 내지 약 18 mL일 것이다.
회전 성장 바이알(300)은 바람직하게는 생체-적합성의 광학적으로 투명한 물질로 제조되거나, 광 경로(들)을 포함하는 바이알의 적어도 일부가 투명하다. 추가로, 회전 성장 바이알이 제조되는 물질은 온도 기반 세포 검정 및 저온에서의 장기 저장 둘 모두를 수용하기 위해 약 4℃ 이하로 냉각되고 약 55℃ 이상으로 가열될 수 있어야 한다. 또한, 바이알을 제조하는 데 사용되는 물질은 회전하는 동안 변형 없이 최대 55℃의 온도를 견딜 수 있어야 한다. 적합한 물질은 사이클릭 올레핀 공중합체(COC), 유리, 폴리비닐 클로라이드, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 폴리프로필렌, 폴리카르보네이트, 폴리(메틸 메타크릴레이트(PMMA), 폴리설폰, 폴리우레탄, 및 이들 및 다른 중합체의 공중합체를 포함한다. 바람직한 물질은 폴리프로필렌, 폴리카르보네이트 또는 폴리스티렌을 포함한다. 일부 구현예에서, 회전 성장 바이알은, 예를 들어, 사출 성형 또는 압출에 의해 저렴하게 제조된다.
도 3b는 세포 성장 장치(330)의 일 구현예의 사시도이다. 도 3c는 도 3b로부터의 세포 성장 장치(330)의 단면도를 도시한다. 둘 모두의 도면에서, 회전 성장 바이알(300)은 메인 하우징(336) 내부에 위치하는 것으로 관찰되며, 회전 성장 바이알(300)의 연장된 립(302)은 메인 하우징(336) 위로 연장된다. 추가로, 단부 하우징(352), 하부 하우징(332) 및 플랜지(334)는 둘 모두의 도면에 표시된다. 플랜지(334)는 세포 성장 장치(330)를 가열/냉각 수단 또는 다른 구조(제시되지 않음)에 부착하는 데 사용된다. 도 3c는 추가 세부사항을 도시한다. 도 3c에서, 상부 베어링(342) 및 하부 베어링(340)은 메인 하우징(336) 내에 위치하는 것으로 제시된다. 상부 베어링(342) 및 하부 베어링(340)은 회전 성장 바이알(300)의 수직 하중을 지지한다. 하부 하우징(332)은 구동 모터(338)를 포함한다. 도 3c의 세포 성장 장치(330)는 제1 광 경로(344) 및 제2 광 경로(350)의 2개의 광 경로를 포함한다. 광 경로(344)는 회전 성장 바이알(300)의 테이퍼-수축 부분의 수축된 부분에 위치된 경 경로(310)에 해당하고, 광 경로(350)는 회전 성장 바이알(316)의 테이퍼-수축 부분의 테이퍼 부분 내의 광 경로(308)에 해당한다. 광 경로(310 및 308)는 도 3c에 제시되지 않았지만 도 3a에서 관찰될 수 있다. 광 경로(344 및 340)에 더하여, 광 경로(들)를 조명하기 위한 방출 보드(348), 및 회전 성장 바이알(300)에서 세포 배양 액체를 통해 광이 이동한 후 광을 검출하기 위한 검출기 보드(346)가 있다.
모터(338)는 구동 메커니즘(312)과 결합되고, 회전 성장 바이알(300)을 회전시키는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 모터(338)는 0 내지 약 3000 RPM의 일정한 분 당 회전수(RPM)를 유지하도록 설정될 수 있는 내장 구동 제어장치를 갖는 브러시리스(brushless) DC 유형 구동 모터이다. 대안적으로, 스테퍼(stepper), 서보(servo), 브러시 DC 등과 같은 다른 모터 유형이 사용될 수 있다. 선택적으로, 모터(338)는 또한 회전 방향의 반전을 허용하는 방향 제어장치, 및 실제 RPM을 감지하고 보고하는 타코미터를 가질 수 있다. 모터는, 예를 들어, 프로세서 및/또는 사용자 입력에 프로그래밍된 표준 프로토콜에 따라 프로세서(제시되지 않음)에 의해 제어되고, 모터는 세포 배양물의 축방향 전진을 유발하여 혼합을 향상시키고, 예를 들어, 세포 응집을 방지하고, 통기를 증가시키고, 세포 호흡을 최적화시키기 위해 RPM을 변화시키도록 구성될 수 있다.
세포 성장 장치(330)의 메인 하우징(336), 단부 하우징(352) 및 하부 하우징(332)은 임의의 적합한 알루미늄, 스테인리스 강철을 포함하는 견고한 물질, 및 플라스틱을 포함하는 다른 열 전도성 물질로 제조될 수 있다. 이들 구조 또는 이의 부분은 다양한 기술, 예를 들어, 금속 제조, 사출 성형, 융합되는 구조 층의 생성 등을 통해 생성될 수 있다. 회전 성장 바이알(300)이 일부 구현예에서 재사용 가능하지만 바람직하게는 소모품인 것으로 구상되는 반면, 세포 성장 장치(330)의 다른 구성요소는 바람직하게는 재사용 가능하고 독립형 벤치탑 장치로서 또는 다중-모듈 세포 처리 시스템에서 모듈로서 기능한다.
세포 성장 장치(330)의 프로세서(제시되지 않음)는 성장 세포 배양물에 대한 "블랭크" 또는 대조군으로서 사용될 정보로 프로그래밍될 수 있다. "블랭크" 또는 대조군은 세포 성장 배지만을 함유하는 용기이며, 이는 100% 투과율 및 0 OD를 생성하는 반면, 세포 샘플은 광선을 편향시키고 더 낮은 투과율 및 더 높은 OD를 가질 것이다. 세포가 배지에서 성장하고 밀도가 높아짐에 따라, 투과율이 감소하고 OD가 증가할 것이다. 세포 성장 장치(330)의 프로세서(제시되지 않음)는 세포 배양(예를 들어, 포유류 세포, 박테리아 세포, 동물 세포, 효모 세포 등)에서 전형적으로 사용되는 성장 배지에 상응하는 블랭크에 대한 파장 값을 사용하도록 프로그래밍될 수 있다. 대안적으로, 제2 분광광도계 및 용기가 세포 성장 장치(330)에 포함될 수 있으며, 여기서 제2 분광광도계는 지정된 간격으로 블랭크를 판독하는 데 사용된다.
도 3d는 광원(390), 검출기(392) 및 열 구성요소(394)에 결합된 도 3b의 세포 성장 장치(330)를 포함하는 조립체의 일부로서 세포 성장 장치(330)를 예시한다. 회전 성장 바이알(300)은 세포 성장 장치에 삽입된다. 광원(390) 및 검출기(392)의 구성요소(예를 들어, 5-로그를 커버하는 획득 제어를 갖는 포토다이오드)는 세포 성장 장치의 메인 하우징에 결합된다. 회전 성장 바이알(300)을 회전시키는 모터를 수용하는 하부 하우징(332)이 예시되며, 이는 세포 성장 장치(330)를 조립체에 고정시키는 플랜지(334) 중 하나이다. 또한, 예시된 열 구성요소(394)는 펠티에 장치 또는 열전기 냉각기이다. 이러한 구현예에서, 열 제어는 하부 하우징(332)의 베이스 상의 플랜지(334)를 통해 열 구성요소(394)에 대한 세포 성장 장치(330)의 부착 및 전기적 통합에 의해 달성된다. 열전기 냉각기는 전류 흐름의 방향에 따라 표면을 냉각시키거나 표면을 가열하여 접합의 양측으로 열을 "펌핑"할 수 있다. 일 구현예에서, 서미스터(thermistor)가 사용되어 메인 하우징의 온도를 측정한 후, 표준 전자 비례-적분-미분(PID) 제어기 루프를 통해, 회전 성장 바이알(300)은 대략 +/- 0.5℃로 제어된다.
사용시, 세포는 호일 밀봉 또는 필름을 관통함으로써 회전 성장 바이알(300)의 사전 충전된 성장 배지에 접종된다(예를 들어, 세포는 자동화된 액체 핸들링 시스템으로부터 또는 사용자에 의해 피펫팅될 수 있다). 세포 성장 장치(330)의 프로그래밍된 소프트웨어는 성장을 위한 제어 온도, 전형적으로 30℃를 설정한 후, 회전 성장 바이알(300)의 회전을 천천히 시작한다. 세포/성장 배지 혼합물은 회전 성장 바이알(300)이 혼합물의 넓은 표면적을 정상적인 산소 환경에 노출시키는 것을 가능하게 하는 원심력으로 인해 벽 위로 천천히 수직으로 이동한다. 성장 모니터링 시스템은 사전 설정된 또는 사전 프로그래밍된 시간 간격으로 OD 또는 OD 측정값을 연속적으로 판독한다. 이들 측정은 내부 메모리에 저장되며, 요청시 소프트웨어는 시간 대비 측정을 플롯팅하여 성장 곡선을 표시한다. 예를 들어, 성장 조건을 최적화하기 위해 향상된 혼합이 요구되는 경우, 바이알 회전 속도는 액체의 축방향 전진을 야기하도록 변경될 수 있고/있거나 완전한 방향 변화가 프로그래밍된 간격으로 수행될 수 있다. 성장 모니터링은 사전 결정된 OD에서 성장 단계를 자동으로 종결시킨 후, 혼합물을 더 낮은 온도로 신속하게 냉각시켜 추가 성장을 억제하도록 프로그래밍될 수 있다.
세포 성장 장치(330)에 대한 한 가지 응용은 성장 세포 배양물의 광학 밀도를 지속적으로 측정하는 것이다. 설명된 세포 성장 장치의 한 가지 이점은 광학 밀도가 연속적으로(동역학적 모니터링) 또는 특정 시간 간격, 예를 들어, 5, 10, 15, 20, 30, 45 또는 60초마다, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10분마다 측정될 수 있다는 점이다. 세포 성장 장치(330)가 성장 세포 배양물의 광학 밀도(OD)를 측정하는 맥락에서 설명되었지만, 본 발명의 명세서의 교시내용을 고려할 때 다른 세포 성장 파라미터가 세포 배양 OD에 더하여 또는 이를 대신하여 측정될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 상기 설명된 고체 벽 장치 또는 모듈과 관련된 세포 성장의 선택적 측정과 마찬가지로, 가시 광선, UV 또는 근적외선(NIR) 광을 사용하는 분광법은 세포 배양물 내의 영양소 및/또는 폐기물의 농도를 모니터링하는 것을 가능하게 하고, 다른 분광 측정이 이루어질 수 있고, 즉, 다른 스펙트럼 특성이, 예를 들어, 유전 임피던스 분광법, 가시 형광, 형광 분극 또는 발광을 통해 측정될 수 있다. 또한, 세포 성장 장치(330)는, 예를 들어, 용존 산소, 이산화탄소, pH, 전도도 등을 측정하기 위한 추가 센서를 포함할 수 있다. 회전 성장 바이알 및 세포 성장 장치에 관한 추가 세부사항에 대해서는, 2020년 2월 3일에 출원된 USPNs 10,435,662; 10,443,031; 10,590,375; 및 10,590,375 및 USSN 16/780,640을 참조한다.
세포 농축 모듈
회전 성장 바이알 및 세포 성장 모듈과 관련하여 상기 설명된 바와 같이, 형질전환 또는 형질감염을 위한 적절한 수의 세포를 획득하기 위해, 세포는 전형적으로 관심 세포의 성장에 적절한 배지에서 특정 광학 밀도로 성장되나; 효과적인 형질전환 또는 형질감염을 위해, 세포의 부피를 감소시킬뿐만 아니라 완충액 또는 배지 교환을 통해 세포를 적격으로 만드는 것이 바람직하다. 따라서, 상기 열거된 공정을 위한 세포 처리 시스템에서 요구되는 하나의 하위-구성요소 또는 모듈은 세포를 성장시키고/시키거나, 완충액 교환을 수행하고/하거나, 세포를 농축시킬 수 있고, 이들이 세포의 유전체를 조작하거나 편집하는 데 필요한 핵산으로 형질전환되거나 형질감염될 수 있도록 이들을 적격으로 만드는 모듈 또는 구성요소이다.
도 4a는 보유물 부재(422)(상단), 투과물 부재(420)(중간) 및 보유물 부재(422), 막(424)(도 4a에서 제시되지 않음) 및 투과물 부재(420)(또한 제시되지 않음)를 포함하는 접선 유동 조립체(410)(하단)를 제시한다. 도 4a에서, 보유물 부재(422)는 보유물 부재(422)의 하나의 하부 코너에서(특히, 보유물 포트(428)에서) 시작하고, 보유물 부재(422)를 가로질러 횡단하고 이의 위 및 이후 아래로 가로질러 제2 보유물 포트(428)에서 보유물 부재(422)의 다른 하부 코너에서 종료하는 구불구불한 구성을 갖는 접선 유동 채널(402)을 포함한다. 또한, 보유물 부재(422)에는 막 또는 필터(이러한 도 4a에 제시되지 않음)가 안착되는 영역의 경계를 제한할 뿐만 아니라 채널(402)의 영역 사이에 맞물리는 에너지 디렉터(491)가 관찰된다. 이러한 구현예에서, 에너지 디렉터(491)는 투과물/여과물 부재(420)(우측) 상의 에너지 디렉터 구성요소(491)를 통해 투과물/여과물 부재(420)와 보유물 부재(422)의 초음파 용접 또는 결합과 짝을 이루고 이를 촉진하는 역할을 한다. 추가로, 카운터싱크(423)가 관찰될 수 있는데, 2개는 보유물 부재(422)의 하부에, 1개는 상부 중간에 존재한다. 카운터싱크(423)는 접선 유동 조립체(410)를 저장소 조립체(이러한 도 4a에는 제시되지 않지만 도 4b 참조)에 결합시키는 데 사용된다.
투과물/여과물 부재(420)는 도 4a의 중간에서 관찰되며, 에너지 디렉터(491)에 더하여 각각의 하단 코너에서 보유물 포트(428)에 대한 관통-홀(이는 보유물 부재(422)의 하단 코너에서 보유물 포트(428)에 대한 관통-홀과 짝을 이룸)뿐만 아니라 접선 유동 채널(402) 및 투과물 부재(420)의 상부 및 중간에 위치된 2개의 투과물/여과물 포트(426)를 포함한다. 본 구현예에서 접선 유동 채널(402) 구조는 구불구불한 구성 및 물결 모양의 기하학적 구조를 갖지만, 다른 기하학적 구조가 사용될 수 있다. 투과물 부재(420)는 또한 보유물 부재(420) 상의 카운터싱크(423)와 일치하는 카운터싱크(423)를 포함한다.
도 4a의 하단에는 도 4a에서 관찰되는 보유물 부재(422) 및 투과물 부재(420)를 포함하는 접선 유동 조립체(410)가 있다. 이러한 도면에서, 보유물 부재(422)는 도면의 "상단"에 있고, 막(조립체의 이러한 도면에서 제시되지 않음)은 보유물 부재(422)에 인접하고 그 아래에 있을 것이며, 투과물 부재(420)(또한 조립체의 이러한 도면에서 제시되지 않음)는 막에 인접하고 그 아래에 있다. 다시, 카운터싱크(423)가 관찰되며, 여기서 보유물 부재(422) 및 투과물 부재(420)의 카운터싱크는 일치하고 저장소 조립체에 배치된 카운터싱크에 대한 스레드(thread) 또는 짝지음(mating) 요소와 짝을 이루도록 구성된다(도 4a에 제시되지 않았지만 도 4b 참조).
막 또는 필터는 보유물 및 투과물 부재 사이에 배치되며, 여기서 유체는 막을 통해 유동할 수 있지만, 세포는 유동할 수 없고, 따라서 보유물 부재에 배치된 유동 채널에 보유된다. TFF 장치/모듈에 사용하기에 적절한 필터 또는 막은 용매 내성이고, 여과 동안 오염되지 않으며, 관심 세포의 유형 및 크기를 유지할 수 있는 것들이다. 예를 들어, 박테리아 세포와 같은 작은 세포 유형을 유지하기 위해, 포어 크기는 0.2 μm만큼 작을 수 있지만, 다른 세포 유형의 경우, 포어 크기는 20 μm만큼 클 수 있다. 실제로, TFF 장치/모듈에 유용한 포어 크기는 0.20 μm, 0.21 μm, 0.22 μm, 0.23 μm, 0.24 μm, 0.25 μm, 0.26 μm, 0.27 μm, 0.28 μm, 0.29 μm, 0.30 μm, 0.31 μm, 0.32 μm, 0.33 μm, 0.34 μm, 0.35 μm, 0.36 μm, 0.37 μm, 0.38 μm, 0.39 μm, 0.40 μm, 0.41 μm, 0.42 μμm, 0.43 μm, 0.44 μm, 0.45 μm, 0.46 μm, 0.47 μm, 0.48 μm, 0.49 μm, 0.50 μm 이상의 크기를 갖는 필터를 포함한다. 필터는 셀룰로스 혼합 에스테르(셀룰로스 니트레이트 및 아세테이트)(CME), 폴리카르보네이트(PC), 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF), 폴리에테르설폰(PES), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 나일론, 유리 섬유, 또는 레이저 또는 전기화학 에칭의 경우에서와 같이 금속 기판을 포함하는 임의의 적합한 비-반응성 물질로 제조될 수 있다.
채널 구조(402)의 길이는 성장될 세포 배양물의 부피 및 농축될 세포 배양물의 광학 밀도에 따라 달라질 수 있다. 채널 구조의 길이는 전형적으로 60 mm 내지 300 mm, 또는 70 mm 내지 200 mm, 또는 80 mm 내지 100 mm이다. 유동 채널(402)의 횡단면 구성은 원형, 타원형, 난형, 정사각형, 직사각형, 사다리꼴 또는 불규칙할 수 있다. 정사각형, 직사각형 또는 일반적으로 직선인 변을 갖는 또 다른 형상인 경우, 횡단면은 약 10 μm 내지 1000 μm 폭, 또는 200 μm 내지 800 μm 폭, 또는 300 μm 내지 700 μm 폭, 또는 400 μm 내지 600 μm 폭; 약 10 μm 내지 1000 μm 높이, 또는 200 μm 내지 800 μm 높이, 또는 300 μm 내지 700 μm 높이, 또는 400 μm 내지 600 μm 높이일 수 있다. 유동 채널(102)의 횡단면이 일반적으로 원형, 난형 또는 타원형인 경우, 채널의 반경은 약 50 μm 내지 1000 μm 수력 반경, 또는 5 μm 내지 800 μm 수력 반경, 또는 200 μm 내지 700 μm 수력 반경, 또는 300 μm 내지 600 μm 수력 반경, 또는 약 200 내지 500 μm 수력 반경일 수 있다. 또한, 보유물(422) 및 투과물(420) 부재의 채널의 부피는 각각의 부재의 채널의 깊이에 따라 상이할 수 있다.
도 4b는 도 4a에 제시된 접선 유동 조립체(410)와 함께 사용되도록 구성된 저장소 조립체(450)의 전방 사시도(상단) 및 후방 사시도(하단)를 제시한다. 전방 사시도(예를 들어, 도 4a에 제시된 접선 유동 조립체(410)에 결합된 저장소 조립체(450) 측면인 "전방")에서 투과물 저장소(454)의 양 측에 있는 보유물 저장소(452)가 관찰된다. 투과물 포트(426), 보유물 포트(428), 및 카운터싱크(423)(카운터싱크(423)는 이러한 도 4b에 제시되지 않음)에 대한 3개의 스레드 또는 짝지음 요소(425)가 또한 관찰된다. 카운터싱크(423)에 대한 스레드 또는 짝지음 요소(425)는 접선 유동 조립체(410)(도 4a에 제시됨)를 저장소 조립체(450)에 짝을 이루거나 결합시키도록 구성된다. 대안적으로 또는 추가로, 패스너, 음파 용접 또는 열 스테이크가 접선 유동 조립체(410)를 저장소 조립체(450)에 짝을 이루거나 결합시키기 위해 사용될 수 있다. 또한, 저장소 조립체(450)의 상부를 덮는 개스킷(445)이 관찰된다. 개스킷(445)은 도 4e와 관련하여 상세히 설명된다. 도 4b의 좌측은 저장소 조립체(450)의 후방 사시도이고, 여기서 "후방"은 접선 유동 조립체에 결합되지 않은 저장소 조립체(450)의 측면이다. 보유물 저장소(452), 투과물 저장소(454) 및 개스킷(445)이 관찰된다.
TFF 장치는 스테인리그 강철, 실리콘, 유리, 알루미늄, 또는 플라스틱, 예를 들어, 사이클릭-올레핀 공중합체(COC), 사이클로-올레핀 중합체(COP), 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 아크릴로니트릴 부타디엔, 폴리카르보네이트, 폴리에테르에테르케톤(PEEK), 폴리(메틸 메틸아크릴레이트)(PMMA), 폴리설폰, 및 폴리우레탄, 및 이들 및 다른 중합체의 공중합체를 포함하는 채널(및 채널 분지)이 밀링될 수 있는 임의의 견고한 물질로 제조될 수 있다. TFF 장치/모듈이 일회용인 경우, 바람직하게는 이는 플라스틱으로 제조된다. 일부 구현예에서, TFF 장치/모듈을 제조하는 데 사용되는 물질은 열 전도성이어서 세포 배양물이 원하는 온도로 가열되거나 냉각될 수 있다. 특정 구현예에서, TFF 장치는 정밀 기계 가공, 레이저 가공, 전기 방전 가공(금속 장치의 경우); 습식 또는 건식 에칭(실리콘 장치의 경우); 건식 또는 습식 에칭, 분말 또는 샌드블라스팅(sandblasting), 광구조화(유리 장치의 경우); 또는 이러한 대량 생산 기술에 적합한 상기 언급된 물질을 사용한 열성형, 사출 성형, 고온 엠보싱 또는 레이저 가공(플라스틱 장치의 경우)에 의해 형성된다.
도 4c는 도 4b에 제시된 저장소 조립체(450)의 상부 평면도를 도시한다. 도 4d는 도 4b에 제시된 저장소 조립체(450)에 대한 커버(444)를 도시하고, 4e는 작동 중에 도 4b에 제시된 저장소 조립체(450)의 커버(444) 상에 배치되는 개스킷(445)을 도시한다. 도 4c는 투과물 저장소(454)의 양측에 하나씩 있는 2개의 보유물 조장소(452)의 상부를 제시하는 저장소 조립체(450)의 상부 평면도이다. 또한, 공압 포트(제시되지 않음)와 짝을 이룰 그루브(432), 및 투과물 부재(420) 및 막(424)(제시되지 않음) 내의 보유물 포트에 대한 관통-홀을 통해 보유물 저장소(452)와 보유물 포트(428)(제시되지 않음)를 유체적으로 결합시키는 보유물 저장소(452)의 하부에 존재하는 유체 채널(434)이 관찰된다. 도 4d는 저장소 조립체(450)의 상부에 배치되도록 구성된 커버(444)를 도시한다. 커버(444)는 보유물 저장소(452) 및 투과물/여과물 저장소(454)의 상부에 둥근 컷-아웃(cut-out)을 갖는다. 다시, 보유물 저장소(452)의 하부에서, 유체 채널(434)이 관찰될 수 있으며, 여기서 유체 채널(434)은 보유물 저장소(452)를 보유물 포트(428)(제시되지 않음)와 유체적으로 결합시킨다. 또한, 각각의 보유물 저장소(452) 및 투과물/여과물 저장소(454)에 대한 3개의 공압 포트(430)가 제시된다. 도 4e는 저장소 조립체(450)의 커버(444) 위에 배치되도록 구성된 개스킷(445)을 도시한다. 각각의 보유물 저장소(452) 및 투과물/여과물 저장소(454)에 대한 3개의 유체 전달 포트(442)가 관찰된다. 다시, 각각의 보유물 저장소(452) 및 투과물/여과물 저장소(454)에 대한 3개의 공압 포트(430)가 제시된다.
세포 성장을 위한 전체 작업 흐름은 성장될 세포 배양물을 제1 보유물 저장소에 로딩하고, 선택적으로 세포 배양물을 통해 공기 또는 적절한 기체를 버블링하고, 투과물 포트(406) 중 하나 또는 둘 모두를 통해 배지 또는 완충액을 수집하는 동안 세포 배양물을 제1 보유물 포트를 통해 그리고 이후 TFF 채널 구조를 통해 접선으로 통과시키거나 유동시키고, 제2 보유물 포트(404)를 통해 세포 배양물을 제2 보유물 저장소로 수집하고, 선택적으로 세포 배양물에 추가의 또는 상이한 배지를 첨가하고, 선택적으로 세포 배양물을 통해 공기 또는 기체를 버블링시키고, 이후 모두, 예를 들어, 보유물 저장소에서 연속적으로 또는 원하는 간격으로 세포 배양물의 광학 밀도를 측정하는 한편 상기 과정을 반복하는 것을 포함한다. 프로그래밍된 시간 간격에서 광학 밀도(OD)의 측정은 성장하는 세포를 함유하는 보유물 저장소(들)로 광학계를 통해 컬럼화된 600 nm 발광 다이오드(LED)를 사용하여 달성된다. 광은 수집 광학계를 통해 (디지털) 이득-제어 실리콘 포토다이오드로 구성된 검출 시스템으로 계속된다. 일반적으로, 광학 밀도는 광학 감쇠기의 전력 전송 계수의 밑이 10인 로그의 절대값으로 제시된다: OD = -log10 (파워 아웃(Power out)/파워 인(Power in)). OD는 광 감쇠(즉, 흡수, 산란 및 반사의 합)의 척도이기 때문에, TFF 장치 OD 측정은 전체 전력 전송을 기록하므로, 세포가 성장하고 집단의 밀도가 높아짐에 따라 OD(신호 손실)가 증가한다. OD 시스템은 측정 프로그램에 의해 접근할 수 있는 온-보드(on-board) 메모리에 저장된 이들 값으로 OD 표준에 대해 사전 보정된다.
채널 구조에서, 유동 채널을 분기시키는 막은 막의 한면(보유물 측면(422))에 세포를 보유하고, 원하지 않는 배지 또는 완충액이 막을 가로질러 장치의 여과물 또는 투과물 측면(예를 들어, 투과물 부재(420))으로 유동하도록 한다. 세포 배양을 통한 버블링 공기 또는 다른 적절한 기체는 둘 모두가 세포 성장을 향상시키기 위해 배양물을 통기시키고 혼합한다. 공정 동안, 채널 구조를 통한 유동 동안 제거되는 배지는 투과물/여과물 포트(406)를 통해 제거된다. 대안적으로, 세포는 한 저장소에서 다른 저장소로 TFF 채널을 통해 세포를 통과시키지 않고 버블링 또는 교반과 함께 한 저장소에서 성장될 수 있다.
TFF 장치/모듈을 사용하는 세포 농축에 대한 전체 작업 흐름은 채널 구조를 통해 접선 방향으로 세포 배양물 또는 세포 샘플을 유동시키는 것을 포함한다. 세포 성장 공정에서와 같이, 유동 채널을 분기시키는 막은 막의 한면에 세포를 보유하고, 원하지 않는 배지 또는 완충액이 막을 가로질러 장치의 투과물/여과물 측면(예를 들어, 투과물 부재(420))으로 유동하도록 한다. 이러한 공정에서, 세포 샘플이 보유물 포트(404) 중 하나에 수집될 때까지 배지 또는 완충액 내의 세포의 고정된 부피가 장치를 통해 구동되고, 막을 통과한 배지/완충액은 투과물/여과물 포트(406) 중 하나 또는 둘 모두를 통해 수집된다. 모든 유형의 원핵생물 및 진핵생물 세포(부착성 및 비-부착성 세포 둘 모두)는 TFF 장치에서 성장될 수 있다. 부착성 세포는 TFF 장치를 통해 유동하는 배지에 현탁된 비드 또는 다른 세포 스캐폴드에서 성장될 수 있다.
세포 농축 장치/모듈에서 세포를 현탁시키는 데 사용되는 배지 또는 완충액은 LB, SOC, TPD, YPG, YPAD, MEM, DMEM, IMDM, RPMI, 행크액(Hank), PBS 및 링거액과 같은 형질전환되거나 형질감염되는 세포의 유형에 대한 임의의 적합한 배지 또는 완충액일 수 있으며, 여기서 배지는 키트의 일부로서 시약 카트리지에 제공될 수 있다.
세포 성장 및 농축 공정 둘 모두에서, 세포 샘플을 TFF 장치를 통해 통과시키고 보유물 포트(404) 중 하나에서 세포를 수집하는 한편 투과물/여과물 포트(406) 중 하나에서 배지를 수집하는 것은 세포 샘플의 "1회 통과"로 간주된다. 보유물 저장소 사이의 이동은 배양물을 "플립(flip)"시킨다. 제공된 통과에 대해 각각 세포 및 배지를 수집하는 보유물 및 투과물 포트는 보유물 및 투과물/여과물 면에 대해 2개의 별개의 별개의 유동 층이 존재하도록 배열된 유체 연결이 있는 TFF 장치/모듈의 동일한 말단에 존재하나, 보유물 포트(404)가 장치/모듈의 보유물 부재에 존재하는 경우(즉, 세포가 막 위의 채널을 통해 구동되고, 여과물(배지)이 막 아래의 채널 부분으로 통과함), 투과물/여과물 포트(406)는 장치/모듈의 투과물 부재에 존재하거나 그 반대일 것이다(즉, 세포 샘플이 막 아래의 채널을 통해 구동되는 경우, 여과물(배지)은 막 상의 채널 부분으로 통과함). TFF 장치의 유동 채널을 통해 세포 배양물 및 유체를 전달하는 데 사용되는 고압으로 인해, 중력의 영향은 무시할 수 있다.
성장 및 농축 공정 중 어느 하나에서 "통과"의 종료시, 세포 샘플은 보유물 포트(404)를 통해 보유물 저장소(제시되지 않음)로 통과함으로써 수집된다. 또 다른 "통과"를 개시하기 위해, 세포 샘플은 TFF 장치를 통해 다시 통과되며, 이번에는 첫 번째 통과와 반대되는 유동 방향으로 통과된다. 세포 샘플은 보유물 포트(404)를 통해 첫 번째 통과 동안 세포를 수집하기 위해 사용된 보유물 포트(404)로부터 장치/모듈의 반대쪽 단부 상의 보유물 저장소(제시되지 않음)로 통과함으로써 수집된다. 마찬가지로, 제2 통과에서 막을 통과하는 배지/완충액은 제1 통과 동안 여과물을 수집하는 데 사용된 투과물 포트(406)로부터 장치/모듈의 반대쪽 단부 상의 투과물 포트(406)를 통해 또는 둘 모두의 포트를 통해 수집된다. 보유물(농축된 세포 샘플)을 장치/모듈을 통해 통과시키는 이러한 교대 공정은 세포가 원하는 광학 밀도로 성장되고/되거나 원하는 부피로 농축될 때까지 반복되며, 둘 모두의 투과물 포트(즉, 하나 초과가 존재하는 경우)는 작업 시간을 감소시키기 위해 통과 동안 개방될 수 있다. 또한, 완충액 교환은 또 다른 "통과"를 개시하기 전에 원하는 완충액(또는 신선한 배지)을 보유물 저장소의 세포 샘플에 첨가하고, 오래된 배지 또는 완충액이 희석되고 여과될 때까지 이러한 과정을 반복함으로써 수행될 수 있으며, 세포는 신선한 배지 또는 완충액에 존재한다. 완충액 교환 및 세포 성장은 동시에 발생할 수 있고(전형적으로 동시에 발생하고), 완충액 교환 및 세포 농축은 동시에 발생할 수 있음(전형적으로 동시에 발생함)을 유의한다. TFF에 대한 추가 정보 및 대안적 구현예에 대해서는, 예를 들어, 2020년 9월 22일에 출원된 USSN 16/798,302를 참조한다.
세포 형질전환 모듈
도 5a 및 5b는 여기에 설명된 자동화된 다중-모듈 기기에 유용한 예시적 시약 카트리지의 구현예의 구조 및 구성요소를 도시한다. 도 5a에서, 시약 카트리지(500)는 저장소(504)를 갖는 본체(502)를 포함한다. 하나의 저장소(504)는 비어 있는 것으로 제시되고, 저장소 중 2개는 개별 튜브 커버(505)와 함께 거기에 삽입된 개별 튜브(제시되지 않음)를 갖는다. 추가로, 큰 튜브(503a)의 공동 연결된 행 및 작은 튜브(503b)의 공동 연결된 행이 삽입된 저장소의 행이 제시된다. 공동 연결된 튜브의 행은 외부 블랜지의 후면(제시되지 않음)에서 본체(502)의 만입부(509)와 짝을 이루는 외부 플랜지(507)와 함께 스트립에 제공되어, 공동 연결된 튜브의 행(503a 및 503b)을 시약 카트리지(500)에 고정시킨다. 또한, 시약 카트리지 본체(502)의 베이스(511)가 제시된다. 본체(502)의 저장소(504)는 일반적으로 이들 저장소(504)에 삽입되는 공동 연결된 튜브의 튜브와 같은 형상임을 유의한다.
도 5b는 한 행의 공동 연결된 큰 튜브(503a), 한 행의 공동 연결된 작은 튜브(503b), 및 시약 카트리지(500)의 저장소(504)로부터 제거된(즉, 위에 도시된) 커버(505)를 갖는 하나의 큰 튜브(560)를 갖는 도 5a의 시약 카트리지(500)를 도시한다. 다시, 공동 연결된 튜브의 행이 스트립에 제공되며, 개별적인 큰 튜브(561)가 제시되고, 개별적인 작은 튜브(555)가 제시된다. 다시, 공동 연결된 튜브의 각각의 스트립은 외부 플랜지의 후면(제시되지 않음)에서 본체(502)의 만입부(509)와 함께 짝을 이루는 외부 플랜지(507)를 포함하여 공동 연결된 튜브의 행(503a 및 503b)을 시약 카트리지(500)에 고정시킨다. 도 5a에서와 같이, 시약 카트리지 본체(502)는 베이스(511)를 포함한다. 시약 카트리지(500)는 스테인리스 강철, 알루미늄, 또는 플라스틱, 예를 들어, 폴리비닐 클로라이드, 사이클릭 올레핀 공중합체(COC), 폴리에틸렌, 폴리아미드, 폴리프로필렌, 아크릴로니트릴 부타디엔, 폴리카르보네이트, 폴리에테르에테르케톤(PEEK), 폴리(메틸 메틸아크릴레이트)(PMMA), 폴리설폰, 및 폴리우레탄, 및 이들 및 다른 중합체의 공중합체를 포함하는 임의의 적합한 물질로 제조될 수 있다. 다시, 시약 카트리지(500)가 일회용인 경우, 이는 바람직하게는 플라스틱으로 제조된다. 또한, 많은 구현예에서, 시약 카트리지(500)는 공동 연결된 튜브 내의 시약을 포함하여 시약 저장소(504)의 시약을 가열하거나 냉각시키는 열 장치(제시되지 않음)와 접촉할 수 있으므로 카트리지를 제조하는 데 사용되는 물질은 열 전도성이다. 일 구현예에서, 열 장치는 펠티에 장치 또는 열전기 냉각기이다.
도 5c 및 5d는 각각 도 5a 및 5b의 시약 카트리지(500)의 일부(예를 들어, 이의 구성요소)일 수 있거나 독립형 모듈, 즉, 시약 카트리지 또는 기타 모듈의 일부가 아닐 수 있는 예시적 FTEP 장치(550)의 상부 사시도 및 하부 사시도이다. 도 5c는 FTEP 장치(550)를 도시한다. FTEP 장치(550)는 세포 샘플 입구(552) 및 세포 샘플 출구(554)를 정의하는 웰을 갖는다. 도 5d는 도 5c의 FTEP 장치(550)의 하부 사시도이다. 이러한 도면에서 입구 웰(552) 및 출구 웰(554)이 관찰될 수 있다. 또한, 도 5d에는 웰(552)에 상응하는 입구(562)의 하부, 출구 웰(554)에 상응하는 출구(564)의 하부, 정의된 유동 채널(566)의 하부 및 유동 채널(566)의 양측면 상의 2개의 전극(568)의 하부가 관찰된다. FTEP 장치는 다중-통과 전기천공 절차를 허용하는 푸쉬-풀(push-pull) 공압 수단을 포함할 수 있고; 즉, 전기천공될 세포는 전기천공의 1회 통과를 위해 입구로부터 출구를 향해 "당겨질" 수 있고, 이후 FTEP 장치의 출구 단부로부터 입구 단부로 "밀어"져서 전기천공의 또 다른 통과에 대해 다시 전극 사이를 통과할 수 있다. 또한, 이러한 공정은 1회 내지 여러 번 반복될 수 있다. FTEP 장치에 관한 추가 정보에 대해서는, 예를 들어, USPNs 10,435,713; 10,443,074; 10,323,258; 및 10,508,288을 참조한다. 또한, 시약 카트리지의 다른 구현예는 2018년 8월 22일에 출원된 USSN 16/109,156에 설명된 것과 같은 FTEP 장치로 구성되지 않은 전기천공 장치를 제공하거나 수용할 수 있다. 본 발명의 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기에 유용한 시약 카트리지에 대해서는, 예를 들어, 2020년 1월 22일에 출원된 USPNs 10,376,889; 10,406,525; 10,576,474; 및 USSNs 16/749,757; 및 2020년 3월 23일에 출원된 16/827,222를 참조한다.
FTEP 장치의 추가 세부사항은 도 5e-5g에 예시된다. 도 5e-5g의 FTEP 장치에서 전극은 제1 전극이 유동 채널의 입구와 좁아진 영역 사이에 배치되고, 제2 전극이 유동 채널의 좁아진 영역과 출구 사이에 배치되도록 배치된다. 도 5e는 세포 및 외인성 물질을 함유하는 유체를 FTEP 장치(550)에 도입하기 위한 입구(552) 및 천기천공 후 FTEP로부터 형질전환된 세포를 제거하기 위한 출구(554)를 갖는 FTEP 장치(550)의 상부 평면도를 제시한다. 전극(568)은 장치의 채널(제시되지 않음)을 통해 도입된다. 도 5f는 입구(552), 출구(554), 및 유동 채널(566)과 관련하여 위치된 전극(568)을 갖는 FTEP 장치(550)의 상부로부터의 단면도를 제시한다. 도 5g는 입구(552) 및 입구 채널(572), 및 출구(554) 및 출구 채널(574)을 갖는 FTEP 장치(550)의 측단면도를 제시한다. 전극(568)은 유동 채널(566)과 유체 연통하지만, 유동 채널(566)을 통해 이동하는 세포의 경로에 직접적으로 있지 않도록 전극 채널(576)에 위치된다. 제1 전극은 유동 채널의 입구와 좁아진 영역 사이에 배치되고, 제2 전극은 유동 채널의 좁아진 영역과 출구 사이에 배치된다는 점에 유의한다. 장치의 이러한 양태에서 전극(568)은 일반적으로 유동 채널(566)에 수직인 전극 채널(576)에 위치하여 세포 및 외인성 물질을 함유하는 유체가 유동 채널(566)을 통해 입구 채널(572)로부터 출구 채널(574)로 유동하고, 상기 공정에서 유체는 전극 채널(576)로 유동하여 전극(568)과 접촉된다. 이러한 양태에서, 입구 채널, 출구 채널 및 전극 채널은 모두 장치의 동일한 평면 측으로부터 유래한다. 그러나, 특정 양태에서, 전극은 입구 및 출구 채널과는 상이한 FTEP 장치의 평면 측으로부터 도입될 수 있다.
본 발명의 개시의 FTEP 장치에서, 형질전환의 독성 수준은 세포 유형 및 세포에 도입되는 핵산에 따라 전기천공 후 30% 초과의 살아 있는 세포, 바람직하게는 형질전환 후 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 99% 초과의 살아 있는 세포를 발생시킨다.
FTEP 장치의 하우징은 FTEP 장치가 재사용되는지, 오토클레이브되는지 또는 일회용인지에 따라 스테인리스 강철, 실리콘, 유리, 수지, 폴리비닐 클로라이드, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 아크릴로니트릴 부타디엔, 폴리카르보네이트, 폴리에테르에테르케톤(PEEK), 폴리설폰 및 폴리우레탄, 이들 및 다른 중합체의 공중합체를 포함하는 많은 물질로 제조될 수 있다. 유사하게, 장치 내의 채널의 벽은 실리콘, 수지, 유리, 유리 섬유, 폴리비닐 클로라이드, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 아크릴로니트릴 부타디엔, 폴리카르보네이트, 폴리에테르에테르케톤(PEEK), 폴리설폰 및 폴리우레탄, 이들 및 다른 중합체의 공중합체를 포함하는 임의의 적합한 물질로 제조될 수 있다. 바람직한 물질은 결정 스티렌, 사이클로-올레핀 중합체(COP) 및 사이클릭 올레핀 공중합체(COC)를 포함하며, 이는 전극 및, 예를 들어, 존재시 하부 밀봉 필름을 제외하고는 한 조각으로 사출 성형함으로써 장치가 완전히 형성될 수 있도록 한다.
본원에 설명된 FTEP 장치(또는 FTEP 장치의 일부)는, 예를 들어, 전체 장치로서 또는 융합되거나 달리 결합되는 구조적 층의 생성에 의해 다양한 기술을 통해 생성되거나 제조될 수 있다. 예를 들어, 금속 FTEP 장치의 경우, 제조는 정밀 기계 가공 또는 레이저 가공을 포함할 수 있으며; 실리콘 FTEP 장치의 경우, 제조는 건식 또는 습식 에칭을 포함할 수 있고; 유리 FTEP 장치의 경우, 제조는 건식 또는 습식 에칭, 파우더블라스팅(powderblasting), 샌드블라스팅(sandblasting) 또는 광구조화를 포함할 수 있고; 플라스틱 FTEP 장치의 경우, 제조는 열성형, 사출 성형, 고온 엠보싱 또는 레이저 가공을 포함할 수 있다. FTEP 장치의 구성요소는 별도로 제조된 후 조립될 수 있거나, FTEP 장치의 특정한 구성요소(또는 심지어 전극을 제외한 전체 FTEP 장치)는 단일한 존재물로서 제조(예를 들어, CD 프린팅 사용) 또는 성형(예를 들어, 사출 성형 사용)될 수 있고, 다른 구성요소는 성형 후에 추가된다. 예를 들어, 하우징 및 채널은 FTEP 유닛을 형성시키기 위해 나중에 추가되는 전극과 함께 단일 존재물로서 제조되거나 성형될 수 있다. 대안적으로, FTEP 장치는 또한 개별적으로 제조되고/되거나 성형되고 제조 후에 조립되는 2개 이상의 평행한 층, 예를 들어, 수평 채널 및 필터를 갖는 층, 수직 채널을 갖는 층, 및 입구 및 출구 포트를 갖는 층으로 형성될 수 있다.
특정 양태에서, FTEP 장치는 회로 기판 상에 원하는 구성으로 형성된 전극, 필터 및/또는 유동 채널을 갖는 베이스로서의 회로 기판, 및, 예를 들어, 이후에 회로 기판상에 밀봉되는 별도 층으로서 형성되는 하나 이상의 입구 및 출구 채널 및/또는 유동 채널을 포함하는 장치의 나머지 하우징을 사용하여 제조될 수 있다. 회로 기판 상으로의 하우징의 상부의 밀봉은 본 발명의 개시의 FTEP 장치의 상이한 요소의 원하는 구성을 제공한다. 또한, 2개 내지 다수의 FTEP 장치가 단일 기판 상에 제조된 후, 이후 서로 분리되거나 병렬로 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, FTEP 장치는 재사용 가능하고, 일부 구현예에서, FTEP 장치는 일회용이다. 추가 구현예에서, FTEP 장치는 오토클레이브 가능할 수 있다.
전극(508)은 구리, 스테인리스 강철, 티타늄, 알루미늄, 황동, 은, 로듐, 금 또는 백금, 또는 흑연과 같은 임의의 적합한 금속으로 형성될 수 있다. 하나의 바람직한 전극 물질은 합금 303 (UNS330300) 오스테나이트계 스테인리스 강철이다. 적용된 전기장은 알루미늄과 같음 금속으로 제조된 전극을 파괴할 수 있다. 일회용, 1회-사용 관통형 FTEP 장치와 반대로 다중-사용(즉, 비-일회용) 관통형 FTEP 장치가 바람직한 경우, 전극 판은 전기화학적 부식에 내성이 있는 금속으로 코팅될 수 있다. 예를 들어, 금과 같은 귀금속과 같은 전도성 코팅이 전극 판을 보호하기 위해 사용될 수 있다.
언급된 바와 같이, FTEP 장치는 다중-통과 전기천공 절차를 허용하는 푸쉬-풀 공압 수단을 포함할 수 있고; 즉, 전기천공될 세포는 전기천공의 1회 통과를 위해 입구로부터 출구를 향해 "당겨질" 수 있고, 이후 관통형 FTEP 장치의 출구 단부로부터 입구 단부로 "밀어"져서 전기천공의 또 다른 통과에 대해 다시 전극 사이를 통과할 수 있다. 이러한 공정은 1회 내지 여러 번 반복될 수 있다.
전기천공될 세포의 유형(예를 들어, 박테리아, 효모, 포유류) 및 전극의 구성에 따라, 유동 채널 내의 전극 사이의 거리는 광범위하게 변할 수 있다. 예를 들어, 유동 채널의 폭이 감소하는 경우, 유동 채널은 10 μm 내지 5 mm, 또는 25 μm 내지 3 mm, 또는 50 μm 내지 2 mm, 또는 75 μm 내지 1 mm로 좁아질 수 있다. 유동 채널에서 전극 사이의 거리는 1 mm 내지 10 mm, 또는 2 mm 내지 8 mm, 또는 3 mm 내지 7 mm, 또는 4 mm 내지 6 mm일 수 있다. FTEP 장치의 전체 크기는 3 cm 내지 15 cm 길이, 또는 4 cm 내지 12 cm 길이, 또는 4.5 cm 내지 10 cm 길이일 수 있다. FTEP 장치의 전체 폭은 0.5 cm 내지 5 cm, 또는 0.75 cm 내지 3 cm, 또는 1 cm 내지 2.5 cm, 또는 1 cm 내지 1.5 cm일 수 있다.
좁아진 유동 채널의 영역은 적어도 2개의 세포가 좁아진 부분에 나란히 끼워질 수 있도록 충분히 넓다. 예를 들어, 전형적인 박테리아 세포는 직경이 1 μm이고; 따라서, 상기 박테리아 세포를 형질전환시키는 데 사용되는 FTEP 장치의 유동 채널의 좁아진 부분은 적어도 2 μm 폭일 것이다. 또 다른 예에서, 포유류 세포의 직경이 대략 50 μm인 경우, 상기 포유류 세포를 형질전환시키는 데 사용되는 FTEP 장치의 유동 채널의 좁아진 부분은 적어도 100 μm 폭일 것이다. 즉, FTEP 장치의 좁아진 부분은 형질전환될 세포를 물리적으로 뒤틀거나 "압착"하지 않을 것이다.
저장소가 세포 및 외인성 물질을 FTEP 장치에 도입하기 위해 사용되는 FTEP 장치의 구현예에서, 저장소는 100 μL 내지 10 mL, 또는 500 μL 내지 75 mL, 또는 1 mL 내지 5 mL의 부피 범위이다. FTEP의 유량은 분 당 0.1 mL 내지 5 mL, 또는 분 당 0.5 mL 내지 3 mL, 또는 분 당 1.0 mL 내지 2.5 mL 범위이다. FTEP 장치의 압력은 1-30 psi, 또는 2-10 psi, 또는 3-5 psi 범위이다.
전극 사이의 상이한 전계 강도를 피하기 위해, 전극은 병렬로 배열되어야 한다. 또한, 전극의 표면은 핀 홀 또는 피크 없이 가능한 한 평탄해야 한다. 1 내지 10 μm의 거칠기 Rz를 갖는 전극이 바람직하다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 관통형 전기천공 장치는 FTEP 장치에 접지 전위를 적용하는 적어도 하나의 추가 전극을 포함한다. 관통형 전기천공 장치(독립형 기기로서 또는 자동화된 다중-모듈 시스템에서 모듈로서)는, 예를 들어, USPNs USPNs 10,435,713; 10,443,074; 10,323,258; 및 10,508,288에 설명되어 있다.
세포 단일화 및 풍부화 장치
도 6a는 고체 벽 장치(6050) 및 고체 벽 장치의 마이크로웰에서 세포를 단일화하거나 실질적으로 단일화하기 위한 워크플로우를 도시한다. 도 (i)의 좌측 상단에는, 마이크로웰(6052)을 갖는 고체 벽 장치(6050)가 도시된다. 기판(6050)의 섹션(6054)은 (ii)에 제시되어 있으며, 또한 마이크로웰(6052)을 도시한다. (iii)에서, 고체 벽 장치(6050)의 횡단면이 제시되고, 마이크로웰(6052)이 로딩되었으며, 여기서, 본 구현예에서, 포아송 또는 실질적인 포아송 로딩이 발생하였고; 즉, 각각의 마이크로웰은 하나의 세포를 갖거나 갖지 않으며, 어느 하나의 마이크로웰이 하나 초과의 세포를 가질 가능성이 낮다. (iv)에서, 워크플로우(6040)가 예시되며, 여기서 마이크로웰(6052)을 갖는 기판(6050)은 마이크로웰 당 하나의 세포를 갖는 마이크로웰(6056), 마이크로웰에 세포가 없는 마이크로웰(6057), 및 마이크로웰에 2개의 세포가 있는 하나의 마이크로웰(6060)을 나타낸다. 단계(6051)에서, 마이크로웰의 세포는 클론 콜로니(v)를 형성시키기 위해 대략 2-150배로 배가되도록 허용된 후, 편집이 발생하도록 허용된다(6053).
편집(6053) 후, 편집된 세포의 콜로니의 많은 세포가 활성 편집에 의해 유발된 이중 가닥 절단의 결과로서 사멸하고, 생존하지만 편집 후 복구 및 회복되어야 하는 편집된 세포의 성장 지연이 있으며(마이크로웰(6058)), 여기서 편집을 겪지 않은 세포가 번성한다(마이크로웰(6059))(vi). 모든 세포는 계속해서 성장하여 콜로니를 확립하고 정상화될 수 있으며, 여기서 마이크로웰(6058)의 편집된 세포의 콜로니는 크기 및/또는 세포 수에 있어서 편집을 겪지 않은 마이크로웰(6059)의 세포를 따라 잡는다(vii). 일단 세포 콜로니가 정상화되면, 마이크로웰 내의 모든 세포의 푸울링(pooling)(6060)이 발생할 수 있으며, 이 경우 비-편집 세포로부터의 편향 및 편집으로부터의 적합화 효과를 제거함으로써 세포는 편집된 세포에 대해 풍부화되고; 대안적으로, 마이크로웰에서의 콜로니 성장은 편집 후에 모니터링되고, 느리게 성장하는 콜로니(예를 들어, 마이크로웰(6058) 내의 세포)가 확인되고 선택되어(6061)(예를 들어, "체리 피킹(cherry picked)") 편집된 세포의 훨씬 더 큰 풍부화를 발생시킨다.
세포 성장에서, 사용되는 배지는 물론 편집되는 세포의 유형(예를 들어, 박테리아, 효모 또는 포유류)에 좌우될 것이다. 예를 들어, 효소 세포 성장을 위한 배지는 LB, SOC, TPD, YPG, YPAD, MEM 및 DMEM을 포함한다.
도 6b는 SWIIN의 일 구현예의 사진이다. 도 6b는 효모 세포가 단일화되고 클론 콜로니로 성장하는 아가(agar)에 투과성 바닥을 갖는 SWIIN 장치의 사진이다. 도 6c는 다양한 시점(0, 6, 11 및 32시간)에서 SWIIN에서의 효모 콜로니 성장의 사진을 제공한다.
도 6a에 도시된 방법을 수행하는 데 유용한 모듈은 고체 벽 분리, 인큐베이션 및 정상화(SWIIN) 모듈이다. 도 6d는 분해된 상부 사시도로부터의 SWIIN 모듈(650)의 구현예를 도시한다. SWIIN 모듈(650)에서, 보유물 부재는 SWIIN 모듈 구성요소의 상부의 하부에 형성되고, 투과물 부재는 SWIIN 모듈 구성요소의 하부의 상부에 형성된다.
도 6d의 SWIIN 모듈(650)은 위에서 아래로 저장소 개스킷 또는 커버(658), 보유물 부재(604)(여기서, 보유물 유동 채널은 이러한 도 6d에서 관찰될 수 없음), 필터로 스웨이징(swaged)된 천공된 부재(601)(필터는 도 6d에서 관찰될 수 없음), 통합된 저장소(투과물 저장소(652) 및 보유물 저장소(654))를 포함하는 투과물 부재(608), 및 투과물 저장소(652) 및 보유물 저장소(654)의 하부를 밀봉하는 2개의 저장소 밀봉(662)을 포함한다. 투과물 채널(660a)은 구불구불한 채널(660a)의 융기 부분(676)에 의해 정의되는 투과물 부재(608)의 상부에 배치된 것이 관찰될 수 있고, 초음파 탭(664)이 또한 투과물 부재(608)의 상부에 배치된 것이 관찰될 수 있다. 천공된 부재(601) 상의 웰을 형성하는 천공은 이러한 도 6d에서 관찰되지 않지만; 초음파 탭(664)을 수용하기 위한 관통-홀(666)이 관찰된다. 또한, SWIIN 모듈(650)을 지지하고, 투과물 저장소로부터 구불구불한 채널(660a)로의 유체 경로 또는 보유물 저장소로부터 구불구불한 채널(660b)로의 유체 경로(어느 유체 경로도 이러한 도 6d에서 관찰되지 않음)로의 기포 또는 공기 진입을 최소화하기 위해 저장소(652 및 654) 위로 투과물 부재(608) 및 보유물 부재(604)를 상승시키기 위해 SWIIN 모듈(650)의 어느 한 단부에 지지체(670)가 배치된다.
이러한 도 6d에서, 투과물 부재(608)의 상부에 배치되는 구불구불한 채널(660a)은 투과물 저장소(652) 및 보유물 저장소(654)를 포함하는 투과물 부재(608)의 일부를 제외하고 투과물 부재(608)의 대부분의 길이 및 투과물 부재(608)의 대부분의 폭에 대해 투과물 부재(608)를 횡단하는 것이 관찰될 수 있다. 보유물 부재 또는 투과물 부재의 분배 채널과 관련하여 본원에서 사용되는 "대부분의 길이"는 보유물 부재 또는 투과물 부재의 길이의 약 95%, 또는 보유물 부재 또는 투과물 부재의 길이의 약 90%, 85%, 80%, 75% 또는 70%를 의미한다. 보유물 부재 또는 투과물 부재의 분배 채널과 관련하여 본원에서 사용되는 "대부분의 폭"은 보유물 부재 또는 투과물 부재의 폭의 약 95%, 또는 보유물 부재 또는 투과물 부재의 폭의 약 90%, 85%, 80%, 75% 또는 70%를 의미한다.
SWIIN 모듈의 이러한 구현예에서, 천공된 부재는 투과물 부재 상에 배치된 초음파 탭을 수용하기 위한 관통-홀을 포함한다. 따라서, 이러한 구현예에서, 천공된 부재는 스테인리스 강철로 제조되고(316), 천공은 마이크로웰의 벽을 형성하는 반면, 필터 또는 막은 마이크로웰의 하부를 형성하는 데 사용된다. 전형적으로, 천공(마이크로웰)은 대략 150 μm-200 μm 직경이고, 천공된 부재는 대략 125 μm 깊이이며, 그 결과 대략 총 200,000 마이크로웰을 갖는 대략 2.5 nl의 부피를 갖는 마이크로웰이 생성된다. 마이크로웰 사이의 거리는 중심에서 중심까지 대략 279 μm이다. 여기서, 마이크로웰은 대략 2.5 nl의 부피를 갖지만, 마이크로웰의 부피는 1 내지 25 nl, 또는 바람직하게는 2 내지 10 nl, 더욱 더 바람직하게는 2 내지 4 nl일 수 있다. 필터 또는 막의 경우, 이전에 설명된 필터와 마찬가지로, 사용하기에 적절한 필터는 용매 내성이고, 여과 동안 오염되지 않으며, 관심 세포의 유형 및 크기를 유지할 수 있다. 예를 들어, 박테리아 세포와 같은 작은 세포 유형을 유지하기 위해, 포어 크기는 0.10 μm만큼 작을 수 있지만, 다른 세포 유형(예를 들어, 포유류 세포의 경우)의 경우, 포어 크기는 10.0 μm - 20 μm 이상만큼 클 수 있다. 실제로, 세포 농축 장치/모듈에 유용한 포어 크기는 0.10 μm, 0.11 μm, 0.12 μm, 0.13 μm, 0.14 μm, 0.15 μm, 0.16 μm, 0.17 μm, 0.18 μm, 0.19 μm, 0.20 μm, 0.21 μm, 0.22 μm, 0.23 μm, 0.24 μm, 0.25 μm, 0.26 μm, 0.27 μm, 0.28 μm, 0.29 μm, 0.30 μm, 0.31 μm, 0.32 μm, 0.33 μm, 0.34 μm, 0.35 μμm, 0.36 μm, 0.37 μm, 0.38 μm, 0.39 μm, 0.40 μm, 0.41 μm, 0.42 μm, 0.43 μm, 0.44 μm, 0.45 μm, 0.46 μm, 0.47 μm, 0.48 μm, 0.49 μm, 0.50 μm 이상의 크기를 갖는 필터를 포함한다. 필터는 셀룰로스 혼합 에스테르(셀룰로스 니트레이트 및 아세테이트)(CME), 폴리카르보네이트(PC), 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF), 폴리에테르설폰(PES), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 나일론 또는 유리 섬유를 포함하는 임의의 적합한 물질로 제조될 수 있다.
짝을 이룬 구불구불한 채널의 횡단면 구성은 원형, 타원형, 난형, 정사각형, 직사각형, 사다리꼴 또는 불규칙할 수 있다. 정사각형, 직사각형 또는 일반적으로 직선인 측면을 갖는 또 다른 형상인 경우, 횡단면은 약 2 mm 내지 15 mm 폭, 또는 3 mm 내지 12 mm 폭, 또는 5 mm 내지 10 mm 폭일 수 있다. 짝을 이룬 구불구불한 채널의 횡단면이 일반적으로 원형, 난형 또는 타원형인 경우, 채널의 반경은 약 3 mm 내지 20 mm 수력 반경, 또는 5 mm 내지 15 mm 수력 반경, 또는 8 mm 내지 12 mm 수력 반경일 수 있다.
구불구불한 채널(660a 및 660b)은 대략 동일한 부피 또는 상이한 부피를 가질 수 있다. 예를 들어, 구불구불한 채널의 각각의 "측면" 또는 부분(660a, 660b)은, 예를 들어, 2 mL의 부피를 가질 수 있거나, 투과물 부재(608)의 구불구불한 채널(660a)은 2 mL의 부피를 가질 수 있고, 보유물 부재(604)의 구불구불한 채널(660b)은, 예를 들어, 3 mL의 부피를 가질 수 있다. 구불구불한 채널의 유체 부피는 약 2 mL 내지 약 80 mL, 또는 약 4 mL 내지 60 mL, 또는 5 mL 내지 40 mL, 또는 6 mL 내지 20 mL의 범위일 수 있다(이들 부피는, 예를 들어, 50-500K 천공 부재를 포함하는 SWIIN 모듈에 적용됨을 유의). 저장소의 부피는 5 mL 내지 50 mL, 또는 7 mL 내지 40 mL, 또는 8 mL 내지 30 mL 또는 10 mL 내지 20 mL의 범위일 수 있고, 모든 저장소의 부피는 동일할 수 있거나, 저장소의 부피는 상이할 수 있다(예를 들어, 투과물 저장소의 부피는 보유물 저장소의 것보다 크다).
투과물 부재(608) 및 보유물 부재(604)의 구불구불한 채널 부분(660a 및 660b)은 각각 대략 200 mm 길이, 130 mm 폭 및 4 mm 두께이지만, 다른 구현예에서, 보유물 및 투과물 부재는 75 mm 내지 400 mm 길이, 또는 100 mm 내지 300 mm 길이, 또는 150 mm 내지 250 mm 길이; 50 mm 내지 250 mm 폭, 또는 75 mm 내지 200 mm 폭, 또는 100 mm 내지 150 mm 폭; 및 2 mm 내지 15 mm 두께, 또는 4 mm 내지 10 mm 두께, 또는 5 mm 내지 8 mm 두께일 수 있다. 구현예: 보유물(및 투과물) 부재는 PMMA(폴리(메틸 메타크릴레이트)로 제조될 수 있거나, 폴리카르보네이트, 사이클릭 올레핀 공중합체(COC), 유리, 폴리비닐 클로라이드, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 폴리프로필렌, 폴리설폰, 폴리우레탄, 및 이들 및 다른 중합체의 공중합체를 포함하는 다른 물질이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 적어도 보유물 부재는 세포가 시각화될 수 있도록 투명한 물질로 제조된다(예를 들어, 도 6g 및 이의 설명 참조). 예를 들어, 비디오 카메라는, 예를 들어, 위상차를 갖는 빈 웰의 이미지에 기초한 밀도 변화 측정에 의해, 또는, 예를 들어, 발색성 단백질과 같은 발색성 마커가 세포에 구별 가능한 색상을 추가하기 위해 사용되는 경우에 세포 성장을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 블리첸 블루(blitzen blue), 드레이델 틸(dreidel teal), 버지니아 바이올렛(virginia violet), 빅센 퍼플(vixen purple), 프란서 퍼플(prancer purple), 틴셀 퍼플(tinsel purple), 마카비 퍼플(maccabee purple), 도너 마젠타(donner magenta), 큐피드 핑크(cupid pink), 세라피나 핑크(seraphina pink), 스쿠루지 오렌지(scrooge orange), 및 레오르 오렌지(and leor orange)(Chromogenic Protein Paintbox, 모두 ATUM(Newark, CA)로부터 이용 가능함)와 같은 발색성 마커는 형광을 사용할 필요성을 제거하지만, 형광 세포 마커, 형광 단백질 및 화학발광 세포 마커가 또한 사용될 수 있다.
보유물 부재가 바람직하게는 투명하기 때문에, SWIIN 모듈에서의 콜로니 성장은 JoVE(ScanLag™ system, Cambridge, MA)에 의해 판매되는 것과 같은 자동화 장치에 의해 모니터링될 수 있다(또한 문헌[Levin-Reisman, et al., Nature Methods, 7:737-39 (2010)] 참조). 예를 들어, TECAN(Pickolo™ system, Mannedorf, Switzerland); Hudson Inc.(RapidPick™, Springfield, NJ); Molecular Devices(QPix 400 ™ system, San Jose, CA); 및 Singer Instruments(PIXL™ system, Somerset, UK)에 의해 판매되는 것과 같은 자동화 콜로니 피커(picker)가 사용될 수 있다.
SWIIN 모듈의 가열 및 냉각으로 인해, 응축물이 보유물 부재에 축적되어 성장하는 세포 콜로니의 정확한 시각화를 방해할 수 있다. SWIIN 모듈(650)의 응축은, 예를 들어, SWIIN 모듈(650)의 상부(예를 들어, 보유물 부재) 위로 가열된 공기를 이동시키거나, 보유물 부재(604)의 적어도 구불구불한 채널 부분(660b) 위에 투명한 가열된 뚜껑을 적용함으로써 제어될 수 있다. 예를 들어, 도 6g 및 이의 설명을 하기에서 참조한다.
SWIIN 모듈(650)에서, 세포 및 배지(천공된 부재의 마이크로웰에서 세포의 포아송 또는 실질적인 포아송 분포에 적절한 희석에서)는 보유물 부재(604)의 포트로부터 구불구불한 채널(660b)로 유동하고, 배지가 필터를 통해 투과물 부재(608)의 구불구불한 채널(660a)로 통과하는 동안 세포는 마이크로웰에 침전된다. 세포는 필터(603)를 통해 이동할 수 없기 때문에 천공된 부재(601)의 마이크로웰에 세포가 유지된다. 적절한 배지가 투과물 포트(611)를 통해 투과물 부재(608)에 도입될 수 있다. 배지는 천공된 부재(601)의 마이크로웰(천공) 내의 세포에 영양을 공급하기 위해 필터(603)를 통해 위쪽으로 유동한다. 추가로, 완충액 교환은 보유물 및 투과물 부재를 통해 배지를 순환시킴으로써 수행될 수 있다. 작업시, 세포는 마이크로웰에 침착되고, 초기, 예를 들어, 2-100배가 동안 성장되고, 편집은, 예를 들어, 온도-유도성 프로모터를 유도하기 위해 SWIIN의 온도를 42℃로 상승시키거나, 투과물 부재로부터 성장 배지를 제거하고, 성장 배지를 유도성 프로모터를 유도하는 화학적 성분을 포함하는 배지로 대체함으로써 유도될 수 있다.
일단 편집이 발생하면, SWIIN의 온도는 감소될 수 있거나, 유도 배지가 제거되고, 화학적 성분이 없는 신선한 배지로 대체되어 유도성 프로모터를 비활성화시킬 수 있다. 이후, 마이크로웰에서 세포 콜로니의 성장이 정상화될 때까지 세포는 SWIIN 모듈(650)에서 계속 성장한다. 정상화 프로토콜의 경우, 일단 콜로니가 정상화되면, 콜로니는 유체 또는 공기 압력(또는 둘 모두)을 투과물 부재의 구불구불한 채널(660g) 및 이에 따라 필터(603)에 적용하여 마이클로웰로부터 플러싱되고, 푸울링된다. 대안적으로, 체리 피킹이 필요한 경우, 마이크로웰에서 세포 콜로니의 성장이 모니터링되고, 느리게 성장하는 콜로니가 직접 선택되거나; 빠르게 성장하는 콜로니가 제거된다.
도 6e는 부분 횡단면에서 보유물 및 천공된 부재를 갖는 SWIIN 모듈의 상부 사시도이다. 이러한 도 6e에서, 구불구불한 채널(660a)이 투과물 부재(608)의 상부에 배치되고, 상승된 부분(676)에 의해 정의되고, 투과물 및 보유물 저장소(단지 하나의 보유물 저장소(652)가 관찰될 수 있음에 유의)를 포함하는 투과물 부재(608)의 부분을 제외하고는 투과물 부재(608)의 길이 및 폭 대부분에 대해 투과물 부재(608)를 횡단하는 것이 관찰될 수 있다. 좌측에서 우측으로 이동하면, 저장소 개스킷(658)은 보유물 부재(604)의 통합된 저장소 커버(678)(커버는 이러한 도 6e에서 관찰되지 않음) 상에 배치된다. 개스킷(658)은 저장소 접근 구멍(632a, 632b, 632c 및 632d)뿐만 아니라 공압 포트(633a, 633b, 633c 및 633d)를 포함한다. 또한, 맨 좌측 끝에는 지지물(670)이 있다. 투과물 저장소(652) 하에 배치된 것으로 2개의 저장소 밀봉부(662) 중 하나가 관찰될 수 있다. 보유물 부재가 횡단면에 있는 것에 추가하여, 천공된 부재(601) 및 필터(603)(필터(603)는 이러한 도 6e에서 관찰되지 않음)가 횡단면에 있다. 천공된 부재(601)의 관통-홀(666)을 통해 연장되는 초음파 탭(664)을 포함하는 SWIIN 모듈(650)의 우측 단부 및 구불구불한 채널(660a)의 채널 턴을 정의하는 상승된 부분(676) 상에 배치된 다수의 초음파 탭(664)이 존재하는 것을 유의한다. 투과물 부재(608)의 말단 원위 저장소(652, 654)에 지지체(670)가 또한 존재한다.
도 6f는 우측으로부터 좌측으로 보유물 부재(604)의 통합된 저장소 커버(678)(관찰되지 않음) 상에 배치된 저장소 개스킷(658)을 포함하는 조립된 SWIIIN 모듈(650)의 측면 사시도이다. 개스킷(658)은 고무, 실리콘, 니트릴 고무, 폴리테트라플루오로에틸렌, 플라스틱 중합체, 예를 들어, 폴리클로로트리플루오로에틸렌, 또는 다른 유연한, 압축성 물질로 제조될 수 있다. 개스킷(658)은 저장소 접근 구멍(632a, 632b, 632c 및 632d)뿐만 아니라 공압 포트(633a, 633b, 633c 및 633d)를 포함한다. 또한, 맨 좌측에 단부에는 투과물 부재(608)의 지지체(670)가 있다. 또한, 투과물 저장소(652)뿐만 아니라 하나의 저장소 밀봉부(662)가 관찰될 수 있다. 맨 우측 단부에는 제2 지지체(670)가 있다.
SWIIN의 웰에서 성장하는 세포 콜로니의 영상화는, 예를 들어, 세포 성장 및 장치 성능 둘 모두를 모니터링하기 위한 대부분의 구현에서 바람직하며, 체리-피킹 구현을 위해 영상화가 필요하다. SWIIN에서 세포 성장을 실시간으로 모니터링하는 것은 백라이팅, 보유물 플레이트(상부 플레이트) 응축 관리 및 온도 제어, 기류 및 열 관리에 대한 시스템-수준 접근법을 필요로 한다. 일부 구현에서, 영상화는 개별 웰을 영상화시킬 수 있을만큼 충분한 해상도를 갖는 카메라 또는 CCD 장치를 사용한다. 예를 들어, 일부 구성에서, 9-픽셀 피치를 갖는 카메라가 사용된다(즉, 각각의 웰에 대해 중심에서 중심으로 9 픽셀이 존재함). 일부 구현에서, 이미지를 처리하는 것은 그레이스케일로 이미지를 판독하여 각 픽셀을 낮음에서 높음으로 평가하는 것을 활용할 수 있으며, 여기서 세포가 없는 웰은 가장 밝아질 것이고(백라이트로부터 전체 또는 거의 전체 광 투과로 인함), 세포를 갖는 웰은 어두워질 것이다(백라이트로부터 광 투과를 차단하는 세포로 인함). 이미지를 처리한 후, 어느 픽셀이 "밝음" 또는 "어두움"으로 언급될 지 결정하기 위해 스레시홀딩(thresholding)이 수행되고, 밝은 픽셀을 찾아서 블록으로 이들을 배열하기 위해 스폿 찾기가 수행된 후, 스폿이 스폿에 해당하는 픽셀의 육각 격자에 배열된다. 일단 배열되면, 각각의 웰의 강도 측정은, 예를 들어, 스폿의 중간에 있는 하나 이상의 픽셀을 보고, 무작위 또는 사전 설정된 위치에서 여러 픽셀 내지 많은 픽셀을 보거나, 스폿에서 X개의 픽셀을 평균화함으로써 추출된다. 또한, 배경 강도가 공제될 수 있다. 스레시홀딩은 다시 각각의 웰을 양성(예를 들어, 세포 함유) 또는 음성(예를 들어, 웰에 세포가 없음)으로 호출하는 데 사용된다. 영상화 정보는 세포 성장을 모니터링하기 위한 시점에서 이미지를 찍는 것을 포함하여 여러 방식으로 사용될 수 있다. 세포 성장 모니터링은, 예를 들어, 빠르게 성장하는 세포의 "머핀 상부(muffin top)"를 제거한 후 모든 세포를 제거하거나 상기 설명된 바와 같이 "원형" 세포를 제거하거나, 특정 웰로부터 세포(예를 들어, 느리게 성장하는 세포 콜로니)를 회수하는 데 사용될 수 있고; 대안적으로, 빠르게 성장하는 세포를 함유하는 웰은 확인될 수 있고, 빠르게 성장하는 세포 콜로니를 커버하는 UV 광 영역은 SWIIN에 투사(또는 셔터로 래스터링(rastered))되어 이들 세포를 조사하거나 이의 성장을 억제할 수 있다. 영상화는 또한 구불구불한 채널(660)에서 적절한 유체 유동을 보장하기 위해 사용될 수 있다.
도 6g는 히터 및 가열된 커버를 포함하는 열 관리 시스템을 추가로 포함하는 도 6d-6f의 SWIIN 모듈의 구현예를 도시한다. 히터 커버는 영상화에 필요한 응축 관리를 촉진한다. 조립체(698)는 횡단면이 길이 방향으로 관찰되는 SWIIN 모듈(650)을 포함하며, 여기서 하나의 투과물 저장소(652)가 관찰된다. SWIIN 모듈(650) 바로 위에는 커버(694)가 배치되고, SWIIN 모듈(650) 바로 아래에는 영상화를 가능하게 하는 백라이트(680)가 배치된다. 백라이트 및 SWIIN 모듈 아래에 인접하게 절연체(682)가 존재하며, 이는 히트싱크(684) 위에 배치된다. 이러한 도 6g에서, 히트싱크의 핀은 페이지의 내외부(in-out)에 존재할 것이다. 또한, 축류 팬(686) 및 히트싱크(688)뿐만 아니라 2개의 열전기 냉각기(692), 및 공압, 열전기 냉각기, 팬, 솔레노이드 밸브 등을 제어하기 위한 제어기(690)가 또한 존재한다. 화살표는 유닛으로 들어오는 냉각 공기 및 유닛에서 제거되는 고온의 공기를 나타낸다. 가열의 제어는 많은 상이한 유형의 세포뿐만 아니라, 예를 들어, 온도에 민감한 세포의 균주 등의 성장을 허용하고, 온도에 민감한 프로모터의 사용을 허용한다는 점에 유의해야 한다. 온도 제어는 형질전환 효율, 세포 성장 및 생존력의 차이를 고려하여 프로토콜이 조정되는 것을 허용한다. 고체 벽 분리 인큐베이션 및 정상화 장치에 대한 보다 상세한 설명은 2019년 10월 19일에 출원된 USPNs 10,533,152; 10,550,363; 10,532,324; 10,625,212; 및 USSNs 16/597,826; 2019년 10월 9일에 출원된 16/597,831; 2019년 11월 25일에 출원된 16/693,630; 및 2019년 11월 15일에 출원된 16/686,066을 참조한다.
자동화된 다중-모듈 효모 세포 처리 기기의 사용
도 7은 다중-모듈 세포 처리 기기의 구현예를 예시한다. 본 구현예는 효모 세포 집단에서 재귀적 유전자 편집을 수행하는 예시적인 시스템을 도시한다. 세포 처리 기기(700)는 하우징(726), 형질전환되거나 형질감염될 세포를 저장하기 위한 저장소(712) 및 세포 성장 모듈(예를 들어, 회전 성장 바이알을 포함함)(704)을 포함할 수 있다. 형질전환될 세포는 세포가 표적 OD를 적중할 때까지 저장소로부터 배양될 세포 성장 모듈로 이동된다. 세포가 표적 OD를 적중하면, 성장 모듈은 추후 처리를 위해 세포를 냉각시키거나 동결시킬 수 있거나, 세포를 세포 농축 모듈(706)로 옮기고, 여기서 세포는 완충액 교환에 적용되고 전기적격이 되고, 세포의 부피는 실질적으로 감소될 수 있다. 세포가 적절한 부피로 농축되면, 세포는 전기천공 장치(708)로 옮겨진다. 세포를 저장하기 위한 저장소(712)에 더하여, 다중-모듈 세포 처리 기기는 편집 카세트(722)와 사전 조립된 벡터를 저장하기 위한 저장소를 포함한다. 사전 조립된 핵산 벡터는 표적 OD로 성장된 세포 배양물을 이미 함유하는 전기천공 장치(708)로 전달된다. 전기천공 장치(708)에서, 핵산은 세포 내로 전기천공된다. 전기천공 후, 세포는 선택적 회복 모듈(710)로 옮겨지고, 여기서 세포는 형질전환 후 간단히 회복된다.
회복 후, 세포는 저장 모듈(712)로 옮겨질 수 있고, 여기서 세포는, 예를 들어, 추후 처리를 위해 4℃에서 저장될 수 있거나, 세포는 희석되고 선택/단일화/성장/인큐베이션/편집/정상화(SWIIN) 모듈(720)로 옮겨질 수 있다. SWIIN(720)에서, 세포는 마이크로웰 당 평균 하나의 세포가 있도록 배열된다. 배열된 세포는 편집 벡터(들)로 형질전환되거나 형질감염된 세포를 선택하기 위해 선택 배지에 있을 수 있다. 일단 단일화되면, 세포는 2-50 배가를 통해 성장하고 콜로니를 확립한다. 이후, 편집이 개시되고 진행되도록 허용되고, 세포는 마이크로웰에서 말단 크기(예를 들어, 콜로니의 정상화)로 성장하도록 허용된 후, 예를 들어, 이러한 라운드로부터 편집 벡터를 치유하는 조건으로 처리된다. 일단 치유되면, 세포는 마이크로웰로부터 플러싱되고 푸울링될 수 있고, 이후 저장(또는 회복) 유닛(712)으로 옮겨지거나, 또 다른 편집 라운드를 위해 성장 모듈(704)로 다시 옮겨질 수 있다. 푸울링과 성장 모듈로의 전달 사이에, 전형적으로 하나 이상의 추가 단계, 예를 들어, 세포 회복, 배지 교환(세포를 전기적격으로 만듦), 세포 농축(전형적으로, 예를 들어, 여과에 의한 배지 교환과 동시에)이 존재한다. 선택/단일화/성장/인큐베이션/편집/정상화 및 치유 모듈은 동일한 모듈일 수 잇으며, 여기서 모든 공정은, 예를 들어, 고체 벽 장치에서 수행되거나, 선택 및/또는 희석은 세포가 고체 벽 단일화/성장/인큐베이션/편집/정상화/편집 모듈(SWIIN)로 전달되기 전에 별도의 용기에서 발생할 수 있음을 유의한다. 유사하게, 세포는 정상화 후 푸울링되고, 별도의 용기로 전달되고, 별도의 용기에서 치유될 수 있다. 예를 들어, 고체 벽 장치에서의 단일화에 대한 대안으로서, 형질전환된 세포는 2019년 1월 23일에 출원된 USSN 68/795,739에 상기 설명된 바와 같이 대량 액체에서 성장될 수 있고 여기서 편집이 진행될 수 있다. 추정적으로 편집된 세포가 푸울링되면, 이들은 전기천공 모듈(708)을 통해 또 다른 편집 카세트에서 성장, 세포 농축 및 전기적격이 되도록 하는 처리 및 또 다른 공여자 핵산에 의한 형질전환으로 시작하는 또 다른 편집 라운드에 적용될 수 있다.
전기천공 장치(708)에서, 제1 라운드의 편집으로부터 선택된 효모 세포는 제2 세트의 편집 올리고(또는 또 다른 유형의 올리고)에 의해 형질전환되고, 세포가 원하는 수의, 예를 들어, 편집 카세트에 의해 형질전환되고 편집될 때까지 주기가 반복된다. 도 7에 예시된 다중-모듈 세포 처리 기기는 사용자 입력에 기초하여 기기를 작동시키도록 구성된 프로세서(724)에 의해 제어되거나, 시약 카트리지와 관련된 적어도 하나의 스크립트를 포함하는 하나 이상의 스크립트에 의해 제어된다. 프로세서(724)는 다양한 공정의 타이밍, 지속기간 및 온도, 시약의 분배, 및 기기(700)의 다양한 모듈의 다른 작업을 제어할 수 있다. 예를 들어, 스크립트 또는 프로세서는 세포, 시약, 벡터 및 편집 올리고뉴클레오티드(여기서, 편집 올리고뉴클레오티드는 세포 편집 및 그 순서에 사용됨)의 분배; 시간, 온도 및 회복 및 발현 모듈에 사용되는 다른 조건, OD가 세포 성장 모듈에서 판독되는 파장, 세포가 성장되는 표적 OD, 및 세포가 표적 OD에 도달하는 표적 시간을 제어할 수 있다. 또한, 프로세서는 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기에서 세포의 진행에 대해 사용자에게 통지(예를 들어, 애플리케이션을 통해)하도록 프로그래밍될 수 있다.
설명된 공정은 재귀적이고 다중화될 수 있다는 것이 본 발명의 개시를 고려하여 당업자에게 명백해야 하며; 즉, 세포는 도 7과 관련하여 설명된 워크플로우를 거칠 수 있고, 이후 생성된 편집된 배양물은 상이한 편집 벡터를 사용하여 또 다른(또는 여러번 또는 더 많은) 라운드의 추가 편집(예를 들어, 재귀적 편집)을 거칠 수 있다. 예를 들어, 1라운드 편집으로부터의 세포가 희석될 수 있고, 편집 벡터 A에 의해 편집된 편집된 세포의 분취량은 편집 벡터 B와 조합될 수 있고, 편집 벡터 A에 의해 편집된 편집된 세포의 분취량은 편집 벡터 C와 조합될 수 있고, 편집 벡터 A에 의해 편집된 편집된 세포의 분취량은 편집 벡터 D와 조합될 수 있고, 제2 라운드의 편집에 대해 마찬가지이다. 2라운드 후, 각각의 이중 편집된 세포의 분취량은 제3 라운드의 편집에 적용될 수 있으며, 여기서, 예를 들어, AB-, AC-, AD-편집된 세포 각각의 분취량은 추가 편집 벡터, 예를 들어, 편집 벡터 X, Y 및 Z와 조합된다. 즉, 이중 편집된 세포 AB는 벡터 X, Y 및 Z와 조합되고 편집되어 삼중 편집된 편집된 세포 ABX, ABY 및 ABZ를 생성할 수 있고; 이중 편집된 세포 AC는 벡터 X, Y 및 Z와 조합되고 편집되어 삼중 편집된 세포 ACX, ACY 및 ACZ를 생성할 수 있고; 이중 편집된 세포 AD는 벡터 X, Y 및 Z와 조합되고 편집되어 삼중 편집된 세포 ADX, ADY 및 ADZ를 생성할 수 있고, 그 밖에도 마찬가지이다. 이러한 과정에서, 편집의 많은 순열 및 조합이 실행될 수 있으며, 이는 매우 다양한 세포 집단 및 세포 라이브러리로 이어진다. 임의의 재귀적 공정에서, 이전 편집 벡터(또는 단일 벡터 시스템에서 단일 엔진 + 편집 벡터)를 "치유"시키는 것이 유리하다. "치유"는 이전 라운드의 편집에서 사용된 하나 이상의 벡터가 형질전환된 세포로부터 제거되는 공정이다.
치유는, 예를 들어, 치유 플라스미드를 사용하여 벡터(들)를 절단하여 이에 의해 편집 및/또는 엔진 벡터(또는 단일, 조합된 엔진/편집 벡터)가 비기능성이 되도록 하고; 세포 성장을 통해 세포 집단에서 벡터(들)을 희석시키거나(즉, 세포가 더 많은 성장 주기를 거칠수록, 더 적은 딸 세포가 편집 또는 엔진 벡터(들)를 보유할 것임), 예를 들어, 편집 또는 엔진 벡터(또는 조합된 엔진 + 편집 벡터)에서 열-민감성 복제 기점을 사용함으로써 달성될 수 있다. 치유 조건은 치유에 사용되는 메커니즘, 즉, 이러한 예에서, 치유 플라스미드가 편집 및/또는 엔진 벡터를 절단하는 방법에 좌우될 것이다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 제조하고 사용하기 위한 방법의 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시되며, 본 발명자가 이들의 발명으로 간주하는 범위를 제한하거나 이들이 하기 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 나타내거나 암시하고자 함이 아니다. 광범위하게 설명된 바와 같이 본 발명의 사상 또는 범위로부터 벗어나지 않고 특정 양태에 제시된 바와 같이 본 발명에 대해 다수의 변화 및/또는 변형이 이루어질 수 있음이 당업자에 의해 인지될 것이다. 따라서, 본 발명의 양태는 모든 점에서 예시적이고 제한적이지 않은 것으로 간주되어야 한다.
실시예 I: 세포 성장 모듈에서의 성장
본원에 설명된 바와 같은 세포 성장 장치의 일 구현예(예를 들어, 도 3a-3d 참조)를 사용하여 효모 세포 배양물을 성장시켰고 이를 본원에 설명된 세포 성장 장치의 구현예를 사용하여 실시간으로 모니터링하였다. 회전 성장 바이알/세포 성장 장치를 사용하여 YPAD 배지에서 효모 s288c 세포의 OD600을 실시간으로 측정하였다. 세포를 진동 회전을 사용하고 2-패들 회전 성장 바이알을 사용하여 30℃에서 성장시켰다. 도 8은 결과를 제시하는 그래프이다. 14시간에서 OD600 6.0에 도달한 것을 유의한다.
실시예 II: 세포 농축
도 4a-4e와 관련하여 상기 설명된 바와 같은 TFF 모듈은 효모 배양물에 대한 완충액 교환을 성공적으로 처리하고 수행하는 데 사용되었다. 효모 배양물을 처음에 TFF 장치를 반대 방향으로 2회 통과시켜 대략 5 ml로 농축시켰다. 세포를 50 ml의 1M 소르비톨로 3회 세척하였고, 각각의 세척 후 TFF 장치를 통해 3회 통과시켰다. 1M 소르비톨을 이용한 마지막 세척 후 세포의 세 번째 통과 후, 세포를 TFF 장치를 통해 2회 통과시켰으며, 여기서 효모 세포 배양물은 대략 525 μl로 농축되었다. 도 9는 여과액 전도도 및 필터 처리 시간을 측정하여 결정된 효모 세포에 대한 필터 완충액 교환 성능을 나타낸다. 표적 전도도(약 10μS/cm)는 3회의 50 ml 1M 소르비톨 세척 및 각각의 세척에 대한 TFF 장치를 통한 3회 통과를 이용하여 대략 23분 내에 달성되었다. 세포의 부피는 20 ml에서 525 μl로 감소되었다. 세포의 대략 90%의 회복이 달성되었다.
실시예 III: 전기적격 S. 세레비지에(S. cerevisiae)의 생성 및 형질전환
효모에서 FTEP 장치의 형질전환을 시험하기 위해, 일반적으로 문헌[Bergkessel and Guthrie, Methods Enzymol., 529:311-20 (2013)]에 설명된 바와 같은 방법을 사용하여 S. 세레비지에를 생성시켰다. 간단히 말해서, YFAP 배지를 밤새 성장을 위해 3 ml 접종물로 접종하여 100 ml의 세포를 생성시켰다. 처리된 배양물 100 ml 마다 대략 1 ml의 적격 세포가 생성되었다. 세포를 1.5 +/- 0.1의 OD600에 도달할 때까지 진탕 인큐베이터에서 30℃에서 인큐베이션하였다.
실온에서 성장되고 유지된 100 mL의 세포마다 100 mM 리튬 아세테이트, 10 mM 디티오트레이톨 및 50 mL의 완충액을 사용하여 컨디셔닝 완충액을 제조하였다. 세포를 3분 동안 4300 rpm에서 250 ml 병에서 수확하고, 상층액을 제거하였다. 세포 펠렛을 100 ml의 저온 1 M 소르비톨에 현탁시키고, 3분 동안 4300 rpm에서 회전시키고, 상층액을 다시 한번 제거하였다. 세포를 컨디셔닝 완충액에 현탁시킨 후, 현탁액을 적절한 플라스크로 옮기고, 30분 동안 200 RPM 및 30℃에서 진탕시켰다. 현탁액을 50 ml 원뿔형 바이알로 옮기고, 3분 동안 4300 rpm에서 회전시켰다. 상층액을 제거하고, 펠렛을 저온 1 M 소르비톨에 재현탁시켰다. 이들 단계는 총 3개의 세척-회전-디캔트 단계를 위해 3회 반복되었다. 펠렛을 150 +/- 20의 최종 OD로 소르비톨에 현탁시켰다.
FTEP 장치를 사용하여 전기적격 S. 세레비지에의 형질전환 효율을 결정하기 위해 비교 전기천공 실험을 수행하였다. 유량은 주사기 펌프(Harvard apparatus PHD ULTRA™ 4400)로 제어되었다. DNA를 갖는 세포의 현탁액을 펌프에 장착하기 전에 1 mL 유리 주사기(Hamilton 81320 Syringe, PTFE Luer Lock)에 로딩하였다. 함수 발생기로부터의 출력은 유동을 시작한 직후에 켜졌다. 처리된 세포는 카르베니실린과 함께 1M 소르비톨이 있는 튜브로 직접 유동하였다. NEPAGENE™에서 전기천공된 동일한 부피가 처리될 때까지 세포를 수집하였고, 이 때 함수 발생기로부터의 유동 및 산출이 중단되었다. 30℃ 및 250 rpm에서 인큐베이터 진탕기에서 3시간 회복 후, 세포를 플레이팅하여 전기천공에서 생존하고 플라스미드를 흡수하지 못한 콜로니 형성 단위(CFU) 및 전기천공에서 생존하고 플라스미드를 흡수한 CFU를 결정하였다. 플레이트를 30℃에서 인큐베이션하였다. 효모 콜로니는 48-76시간 후에 계수된다.
관통형 전기천공 실험은 시험관 내 고전압 전기천공기(NEPAGENE™ELEPO21)를 사용하여 2 mm 전기천공 큐벳(Bull dog Bio)에 대해 벤치마킹되었다. DNA를 갖는 세포 현탁액의 스톡 튜브를 제조하고, NEPAGENE™ 및 관통형 전기천공을 사용한 사이드-투-사이드(side-to-side) 실험에 사용하였다. 결과는 도 10에 제시된다. 장치는 NEPAGENE™ 방법과 비교하여 2.5 kV 전압에서 전기적격 S. 세레비지에의 더 나은 형질전환 및 생존을 나타내었다. 투입은 처리된 세포의 총 수이다.
실시예 IV: 고체 벽 장치에서의 효모 콜로니의 단일화
전기적격 효모 세포를 클로닝된 라이브러리, 등온 조립된 라이브러리, 또는 공정 제어 sgRNA 플라스미드(탈출 대리물(escapee surrogate))로 형질전환시켰다. 전기적격 사카로마이세스 세레비지에 세포를 다음과 같이 제조하였다: 형질전환이 발생하기 전 오후, 10 mL의 YPAD에 선택된 사카로마이세스 세레비지에 균주를 접종하였다. 배양물을 밤새 250 RPM 및 30℃에서 진탕시켰다. 다음날, 100 mL의 YPAD를 250-mL 배플드 플라스크(baffled flask)에 첨가하고, OD600 판독이 0.3 +/- 0.05에 도달할 때까지 밤새 배양물(약 2 mL의 밤새 배양물)로 접종하였다. 배양물을 250 RPM에서 진탕하는 30℃ 인큐베이터에 배치하고, 매시간 OD를 확인하면서 4-5시간 동안 성장시켰다. 배양물이 대략 1.5의 OD600에 도달한 경우, 50 mL 부피를 2개의 50-mL 원뿔형 바이알에 부은 후, 실온에서 2분 동안 4300 RPM에서 원심분리하였다. 세포 펠렛을 방해하는 것을 피하면서 모든 50 ml 원뿔형 튜브로부터 상층액을 제거하였다. 50 mL의 리?Z 아세테이트/디티오트레이톨 용액을 각각의 원뿔형 튜브에 첨가하고, 펠렛을 가볍게 재현탁시켰다. 둘 모두의 현탁액을 250 mL 플라스크로 옮기고, 진탕기에 배치한 후, 30분 동안 30℃ 및 200 RPM에서 진탕시켰다.
인큐베이션이 완료된 후, 현탁액을 2개의 50-mL 원뿔형 바이알로 옮겼다. 이후, 현탁액을 3분 동안 4300 RPM에서 원심분리한 후, 상층액을 폐기하였다. 리튬 아세테이트/디티오트레이톨 처리 단계 후, 저온 액체를 사용하고, 세포를 전기천공될 때까지 얼음 상에서 유지시켰다. 50 mL의 1 M 소르비톨을 첨가하고, 펠렛을 재현탁시킨 후, 4300 RPM, 3분, 4℃에서 원심분리하였고, 그 후 상층액을 폐기하였다. 총 3회 세척을 위해 1M 소르비톨 세척을 2회 반복하였다. 50 uL의 1M 소르비톨을 하나의 펠렛에 첨가하고, 세포를 재현탁시킨 후, 다른 튜브로 옮겨 두 번째 펠렛을 현탁시켰다. 세포 현탁액의 부피를 측정하고, 저온 1 M 소르비톨을 사용하여 1 mL로 만들었다. 이 시점에서 세포는 전기적격이었고, 클로닝된 라이브러리, 등온 조립된 라이브러리 또는 공정 제어 sgRNA 플라스미드로 형질전환될 수 있었다.
간단히 말해서, 큐벳을 표지한 후, 얼음 상에서 냉각시킴으로써 필요한 수의 2-mm 갭 전기천공 큐벳을 제조하였다. 적절한 플라스미드(또는 DNA 혼합물)를 각각의 상응하는 큐벳에 첨가하고, 얼음 상에 다시 배치하였다. 100 uL의 전기적격 세포를 각각의 표지된 큐벳으로 옮기고, 각각의 샘플을 적절한 전기천공기 조건을 사용하여 전기천공시켰다. 900 uL의 실온 YPAD 소르비톨 배지를 이후 각각의 큐벳에 첨가하였다. 세포 현탁액을 14 ml 배양 튜브로 옮긴 후, 3시간 동안 30℃, 250 RPM에서 진탕하였다. 3시간 회복 후, 적절한 항생제, 예를 들어, 제네티신 또는 하이그로마이신 B를 함유하는 9 ml의 YPAD를 첨가하였다. 이 시점에서, 고체 벽 장치의 "정상화"를 표준 벤치탑 공정과 비교하기 위해 형질전환된 세포를 고체 벽 장치 및 표준 플레이팅 프로토콜에서 병행하여 처리하였다. 세포가 투과성-바닥 고체 벽 장치에 도입되기 직전에, 마이크로웰의 바닥을 형성하는 0.45 μM 필터를 0.1% TWEEN 용액으로 처리하여 고체 벽 장치의 마이크로웰로의 세포의 적절한 확산/분포를 수행하였다. 필터를 Swinnex Filter Holder(47 mm, Millipore®, SX0004700)에 배치하고, 0.85% NaCl 및 0.1% TWEEN을 갖는 용액 3 ml를 고체 벽 장치를 통해 끌어당기고 진공을 사용하여 여과하였다. 상이한 TWEEN 농도를 평가하였고, 마이크로웰의 바닥을 형성하는 0.45 μM 필터를 갖는 47 mm 직경의 고체 벽 장치의 경우, 0.1% TWEEN을 이용한 고체 벽 장치 + 필터의 사전 처리가 바람직하다는 것이 결정되었다(데이터는 제시되지 않음).
YPAD에서 3시간 회복 후, 형질전환된 세포를 희석시키고, 다시 진공을 사용하여 TWEEN-처리된 고체 벽 장치 및 필터를 통해 3 ml 부피의 희석된 세포를 처리하였다. 성공적으로 형질전환된 세포의 수는 대략 10,000개의 형질전환된 세포를 현재의 47 mm 투과성-바닥 고체 벽 장치(약 30,000개의 웰을 가짐)에 로딩하는 것을 목표로 대략 1.0E+06 내지 1.0E+08일 것으로 예상되었다. 10-1, 10-2 및 10-3의 연속 희석액을 제조한 후, 이들 각각의 희석액 100 μL 부피를 3 ml 0.85% NaCl과 조합하고, 샘플을 고체 벽 장치에 로딩하였다. 이후, 각각의 투과성-바닥 고체 벽 장치를 Swinnex 필터 홀더로부터 제거하고, 카르베니실린(100 μg/ml), 클로람페니콜(25 μg/ml) 및 아라비노스(1% 최종 농도)를 함유하는 LB 아가 플레이트로 옮겼다. 고체 벽 장치를 금속면 "상부"에 배치하여, 투과성-바닥 막을 아가의 표면에 닿도록 하여 플레이트로부터의 영양분이 웰의 필터 "하부"를 통해 위로 이동할 수 있도록 하였다. YPD 아가 플레이트 상의 고체 벽 장치를 30℃에서 2-3일 동안 인큐베이션하였다.
인큐베이션 종료 시, 천공된 디스크 및 필터(여전히 조립됨)를 지지 영양 공급원(이 경우, 아가 플레이트)에서 제거하고, 집중된 "투과조명(transilluminating)" 광원으로 촬영하여 고체 벽 장치 상의 로딩된 마이크로웰의 수 및 분포가 평가될 수 있었다(데이터는 제시되지 않음). 투과성-바닥 고체 벽 장치로부터 세포를 회수하기 위해, 필터를 15 ml의 멸균 0.85% NaCl을 함유한 표지된 멸균 100 mm 페트리 접시로 옮긴 후, 페트리 접시를 30℃/80RPM으로 설정된 진탕 인큐베이터에 배치하여 필터로부터 세포를 가볍게 제거하고, 0.85% NaCl에서 세포를 재현탁시켰다. 세포를 15분 동안 진탕시킨 후, 멸균 튜브, 예를 들어, 50 ml 원뿔형 원심분리 튜브로 옮겼다. 세포 현탁액의 OD600을 측정하였고; 이 시점에서, 세포는 연구의 목적에 따라 상이한 방식으로 처리될 수 있다. 예를 들어, ADE2 정지 코돈 돌연변이유발 라이브러리가 사용되는 경우, 성공적으로 편집된 세포는 재현탁된 세포가 YPD 아가 플레이트에 스프레딩되고 4-7일 동안 성장되도록 한 경우 적색 색상 표현형을 갖는 콜로니를 생성해야 한다. 이러한 표현형 차이는 편집된 세포의 백분율 및 편집된 세포 및 편집되지 않은 세포의 정상화 정도의 정량화를 허용한다.
실시예 V: 편집 효율을 증가시키기 위한 LexA-Rad51 융합 단백질의 사용
형질전환이 발생하기 전 오후, 10 mL의 YPAD를 S. 세레비지에 세포에 첨가하고, 배양물을 밤새 30℃에서 250 rpm에서 진탕시켰다. 다음 날, 대략 2 mL의 밤새 배양물을 250-mL 배플드 플라스크에서 100 mL의 신선한 YPAD에 첨가하고, OD600 판독값이 0.3 +/- 0.05에 도달할 때까지 성장시켰다. 이후, 배양물을 250 rpm에서 진탕하는 30℃ 인큐베이터에 배치하고, 매시간 OD를 확인하면서 4-5시간 동안 성장시켰다. 배양물이 약 1.5의 OD600에 도달한 경우, 2개의 50 mL 분취량의 배양물을 2개의 50-mL 원뿔형 바이알에 붓고, 실온에서 2분 동안 4300 rpm에서 원심분리하였다. 세포 펠렛을 방해하는 것을 피하면서 50 ml 원뿔형 튜브로부터 상층액을 제거하였다. 25 mL의 리튬 아세테이트/DTT 용액을 각각의 원뿔형 튜브에 첨가하고, 펠렛을 접종 루프, 바늘 또는 긴 이쑤시개를 사용하여 가볍게 재현탁시켰다.
재현탁 후, 둘 모두의 세포 현탁액을 250-mL 플라스크로 옮기고, 진탕기에 넣어 30분 동안 30℃ 및 200 rpm에서 진탕하였다. 인큐베이션이 완료된 후, 현탁액을 1개의 50-mL 원뿔형 바이알로 옮기고, 3분 동안 4300 RPM에서 원심분리하였다. 이후, 상층액을 폐기하였다.
이 시점으로부터, 저온 액체를 사용하고, 전기천공이 완료될 때까지 얼음 상에서 유지시켰다. 50 mL의 1 M 소르비톨을 세포에 첨가하고, 펠렛을 재현탁시켰다. 세포를 4℃에서 3분 동안 4300 rpm에서 원심분리하고, 상층액을 폐기하였다. 총 3회 세척을 위해 원심분리 및 재현탁 단계를 반복하였다. 이후, 50 μL의 1 M 소르비톨을 하나의 펠렛에 첨가하고, 세포를 재현탁시킨 후, 이러한 분취량의 세포를 다른 튜브로 옮기고, 제2 펠렛을 재현탁시켰다. 세포 현탁액의 대략적인 부피를 측정한 후, 저온 1 M 소르비톨을 사용하여 1 mL 부피로 만들었다. 세포/소르비톨 혼합물을 2-mm 큐벳으로 옮겼다. 세포의 임피던스 측정은 큐벳에서 측정되었다. 이 시점에서, KΩ은 ≥ 20이어야 한다. 그렇지 않은 경우, 세포를 저온의 소르비톨에서 2 내지 3회 추가로 세척해야 한다.
이후, 50 ng ADE2 편집 카세트와 함께 500 ng의 선형 백본을 사용하여 적격 S. 세레비지에 세포로 형질전환을 수행하였다. 2 mm 전기천공 큐벳을 얼음 위에 놓고, 플라스미드/카세트 믹스를 각각의 상응하는 큐벳에 첨가하였다. 100 μL의 전기적격 세포를 각각의 큐벳 및 선형 백본 및 ADE2 카세트에 첨가하였다. 3개의 ade2 카세트인 ADE2-70, ADE2-80 및 ADE2-90을 사용하였다. 각각의 샘플을 다음 조건을 사용하여 전기천공하였다: 천공 펄스: 1800V, 5.0초 펄스 길이, 50.0 msec 펄스 간격, 1 펄스; 전송 펄스: 100 V, 50.0 msec 펄스 길이, 50.0 msec 펄스 간격, 3 펄스 포함. 형질전환 공정이 완료되면, 900 μL의 실온 YPAD 소르비톨 배지를 각각의 큐벳에 첨가하였다.
이후, 세포를 옮기고, 15 mL 튜브에 현탁시키고, 3시간 동안 30℃에서 250 RPM에서 진탕 인큐베이션하였다. 9 mL의 YPAD 및 10 μL의 G418 1000x 스톡을 15 mL 튜브에 첨가하였다. 10 μL의 각각의 형질전환 희석액을 2개의 2xYPD - Kan 플레이트에 스프레딩한 후, 30℃의 인큐베이터에 배치하였다. 콜로니가 3일 내에 형성되었다. 각각의 플레이트 상의 콜로니의 총 수에 1000을 곱하여 각각의 형질전환에 대한 총 형질전환체 수율을 획득하였다. 적색, 백색 및 부분적 적색 콜로니를 계수하여 편집 비율을 정량화하였다. 적색 및 부분적 적색 콜로니는 편집을 나타내는 반면, 백색 콜로니는 편집이 없음을 나타낸다. 도 11은 각각의 ade2 카세트에 대한 결과를 제시한다: ADE2-70 (i), ADE2-80 (iii) 및 ADE2-90 (ii). LexA-Rad51 융합은 LexA-Ku70, LexA-XRS 및 LexA-Fkh1 융합 작제물과 동등하거나 더 나은 편집으로 3개의 카세트 모두에서 잘 수행되었음을 유의한다. 특히, ADE2-80 카세트의 경우, LexA-Rad51 융합 단백질은 시험된 다른 작제물에 비해 편집을 극적으로 증가시켰다. 도 12는 ade2 카세트를 갖는 S. 세레비지에 세포의 편집된 분획을 제시한다. 도 12의 좌측에 있는 막대 그래프는 편집 플라스미드를 주형 유전체 서열의 이중 가닥 절단에 동원하는 LexA-Rad51 융합 단백질을 사용하여 편집이 50% 편집에서 대략 85% 편집으로 개선됨을 제시한다. 도 12의 중간 및 우측에 있는 그래프는 콜로니 편집 백분율의 보다 세부적인 도면으로 동일한 정보를 제시한다.
실시예 VI: 완전 자동화된 싱글플렉스 RGN-지시된 편집 실행
MAD7 뉴클레아제를 사용한 싱글플렉스 자동화 유전체 편집은 본 발명의 개시의 자동화 다중-모듈 기기로 성공적으로 수행되었다. 다중-모듈 세포 편집 기기의 예에 대해서는 2020년 1월 23일에 출원된 USPNs 10,253,316; 10,329,559; 10,323,242; 10,421,959; 10,465,185; 10,519,437; 10,584,333; 및 10,584,334 및 USSNs 16/750,369; 2020년 3월 18일에 출원된 16/822,249; 및 2020년 4월 1일에 출원된 16/837,985를 참조하며, 이들 모두의 전체내용은 참조로서 본원에 포함된다.
ampR 플라스미드 백본 및 lacZ_F172* 편집 카세트를 Gibson Assembly®을 통해 자동화 기기에 포함된 등온 핵산 조립 모듈 내의 "편집 벡터"로 조립하였다. lacZ_F172는 lacZ 유전자를 기능적으로 넉아웃시킨다. "lacZ_F172*"는 편집이 lacZ 아미노산 서열의 172번째 잔기에서 발생함을 나타낸다. 조립 후, 생성물을 AMPure 비드를 사용하여 등온 핵산 조립 모듈에서 탈염시키고, 80% 에탄올로 세척하고, 완충액에서 용리시켰다. 조립된 편집 벡터 및 재조합 준비가 된 전기적격 E. 콜리 세포를 전기천공을 위한 형질전환 모듈로 옮겼다. 세포 및 핵산을 조합하고, 1분 동안 혼합하고, 전기천공을 30초 동안 수행하였다. 천공 펄스에 대한 파라미터는 전압, 2400 V; 길이, 5 ms; 간격, 50 ms; 펄스 수, 1; 극성, +였다. 전달 펄스에 대한 파라미터는 전압, 150 V; 길이, 50 ms; 간격, 50 ms; 펄스 수, 20; 극성, +/-였다. 전기천공 후, 세포를 회복 모듈(또 다른 성장 모듈)로 옮기고, 클로람페니콜을 함유하는 SOC 배지에서 회복되도록 하였다. 카르베니실린을 1시간 후에 배지에 첨가하고, 세포를 또 다른 2시간 동안 회복시켰다. 회복 후, 세포를 사용자에 의해 회수될 때까지 4℃에서 유지하였다.
자동화된 공정 및 회수 후, 세포의 분취량을 락토스(당 기질로서), 클로람페니콜 및 카르베니실린으로 보충된 MacConkey 아가 베이스에 플레이팅하고, 콜로니가 나타날 때까지 성장시켰다. 백색 콜로니는 기능적으로 편집된 세포를 나타내고, 자주색 콜로니는 편집되지 않은 세포를 나타냈다. 모든 액체 이동은 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기의 자동화된 액체 핸들링 장치에 의해 수행되었다.
자동화된 처리의 결과는 대략 1.0E-03개의 총 세포가 형질전환되었고(전통적인 벤치탑 결과와 동등함), 편집 효율은 83.5%였다. 백색 콜로니에서의 lacZ_172 편집은 세포 유전체의 편집된 영역의 시퀀싱에 의해 확인되었다. 또한, 자동화된 세포 처리 단계는 웹캠에 의해 원격으로 관찰되었고, 자동화된 처리 절차의 상태를 업데이트하기 위해 문자 메세지가 전송되었다.
실시예 VII: 완전 자동화된 재귀적 편집 실행
재귀적 편집은 자동화된 다중-모듈 세포 처리 시스템을 사용하여 성공적으로 달성되었다. ampR 플라스미드 백본 및 lacZ_V10* 편집 카세트를 Gibson Assembly®을 통해 자동화 시스템에 포함된 등온 핵산 조립 모듈에서 "편집 벡터"로 조립하였다. lacZ_F172 편집과 유사하게, lacZ_V10 편집은 기능적으로 lacZ 유전자를 넉아웃시킨다. "lacZ_V10"은 편집이 lacZ 아미노산 서열의 아미노산 위치 10에서 발생함을 나타낸다. 조립 후, 생성물을 AMPure 비드를 사용하여 등온 핵산 조립 모듈에서 탈염시키고, 80% 에탄올로 세척하고, 완충액에서 용리시켰다. 첫 번째 조립된 편집 벡터 및 재조합 준비가 된 전기적격 E. 콜리 세포를 전기천공을 위한 형질전환 모듈로 옮겼다. 세포 및 핵산을 조합하고, 1분 동안 혼합하고, 전기천공을 30초 동안 수행하였다. 천공 펄스에 대한 파라미터는 전압, 2400 V; 길이, 5 ms; 간격, 50 ms; 펄스 수, 1; 극성, +였다. 전달 펄스에 대한 파라미터는 전압, 150 V; 길이, 50 ms; 간격, 50 ms; 펄스 수, 20; 극성, +/-였다. 전기천공 후, 세포를 회복 모듈(또 다른 성장 모듈)로 옮기고, 클로람페니콜을 함유하는 SOC 배지에서 회복되도록 하였다. 카르베니실린을 1시간 후에 배지에 첨가하고, 세포를 또 다른 2시간 동안 성장시켰다. 이후, 세포를 원심분리기 모듈로 옮긴 후, 배지 교환을 수행하였다. 세포를 클로람페니콜 및 카르베니실린을 함유하는 TB에 재현탁시키고, 여기서 세포를 2.7의 OD600으로 성장시킨 후, 농축시키고, 전기적격이 되도록 하였다.
세포 성장 동안, 등온 핵산 조립 모듈에서 제2 편집 벡터를 제조하였다. 제2 편집 벡터는 카나마이신 내성 유전자를 포함하였고, 편집 카세트는 galK Y145* 편집을 포함하였다. 성공적인 경우, galK Y145* 편집은 세포에 갈락토스를 흡수하고 대사하는 능력을 부여한다. galK Y154* 카세트에 의해 생성된 편집은 154번째 아미노산 잔기에서 정지 코돈을 도입하여 티로신 아미노산을 정지 코돈으로 변경한다. 이러한 편집은 galK 유전자 생성물을 비-기능성으로 만들고, 세포가 갈락토스를 대사할 수 있는 것을 억제한다. 조립 후, 제2 편집 벡터 생성물을 AMPure 비드를 사용하여 등온 핵산 조립 모듈에서 탈염시키고, 80% 에탄올로 세척하고, 완충액에서 용리시켰다. 조립된 제2 편집 벡터 및 전기적격 E. 콜리 세포(제1 편집 벡터로 형질전환되고 선택됨)를 상기 상세히 설명된 바와 같이 동일한 파라미터를 사용하여 전기천공을 위한 형질전환 모듈로 옮겼다. 전기천공 후, 세포를 회복 모듈(또 다른 성장 모듈)로 옮기고, 카르베니실린을 함유하는 SOC 배지에서 회복되도록 하였다. 회복 후, 세포를 회수할 때까지 4℃에서 유지시킨 후, 세포 분취량을 클로람페니콜 및 카나마이신이 보충된 LB 아가에 플레이팅하였다. lacZ 및 galK 편집 둘 모두를 정량화하기 위해, 복제 패치 플레이트를 1) 락토스(당 기질로서), 클로람페니콜 및 카나마이신이 보충된 MacConkey 아가 베이스, 및 2) 갈락토스(당 기질로서), 클로람페니콜 및 카나마이신이 보충된 MacConkey 아가 베이스의 2개의 배지 유형에서 생성시켰다. 모든 액체 이동은 자동화된 다중-모듈 세포 처리 시스템의 자동화된 액체 핸들링 장치에 의해 수행되었다.
이러한 재귀적 편집 실험에서, 스크리닝된 콜로니의 41%는 lacZ 및 galK 편집 둘 모두를 가졌고, 그 결과는 "벤치탑" 또는 수동 접근법을 사용하여 획득된 이중 편집 효율과 동등하였다.
본 발명은 본 발명의 바람직한 구현예와 관련하여 상세히 설명된 바와 같이 많은 상이한 형태의 구현예에 의해 만족되지만, 본 발명의 개시는 본 발명의 원리의 예시로서 간주되어야 하고, 본 발명을 본원에 예시되고 설명된 특정 구현예로 제한하고자 하는 것이 아님이 이해된다. 본 발명의 사상을 벗어나지 않고 당업자에 의해 다수의 변화가 이루어질 수 있다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구항 및 이의 등가물에 의해 측정될 것이다. 초록 및 표제는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어선 안되며, 이의 목적은 적절한 권위자뿐만 아니라 일반 대중이 본 발명의 일반적인 특성을 신속하게 결정할 수 있도록 하기 위한 것이다. 하기의 청구범위에서, 용어 "수단"이 사용되지 않는 한, 여기에 언급된 특징 또는 요소는 35 U.S.C. §112,¶6에 따라 수단 및 기능 제한으로 해석되어선 안 된다.
SEQUENCE LISTING <110> Inscripta, Inc. <120> INCREASED NUCLEIC ACID-GUIDED CELL EDITING VIA A LEXA-RAD51 FUSION PROTEIN <130> INSC045PCT <140> PCT/US20/40389 <141> 2020-07-01 <150> 62/871,325 <151> 2019-07-08 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 202 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> isolated protein domain <400> 1 Met Lys Ala Leu Thr Ala Arg Gln Gln Glu Val Phe Asp Leu Ile Arg 1 5 10 15 Asp His Ile Ser Gln Thr Gly Met Pro Pro Thr Arg Ala Glu Ile Ala 20 25 30 Gln Arg Leu Gly Phe Arg Ser Pro Asn Ala Ala Glu Glu His Leu Lys 35 40 45 Ala Leu Ala Arg Lys Gly Val Ile Glu Ile Val Ser Gly Ala Ser Arg 50 55 60 Gly Ile Arg Leu Leu Gln Glu Glu Glu Glu Gly Leu Pro Leu Val Gly 65 70 75 80 Arg Val Ala Ala Gly Glu Pro Leu Leu Ala Gln Gln His Ile Glu Gly 85 90 95 His Tyr Gln Val Asp Pro Ser Leu Phe Lys Pro Asn Ala Asp Phe Leu 100 105 110 Leu Arg Val Ser Gly Met Ser Met Lys Asp Ile Gly Ile Met Asp Gly 115 120 125 Asp Leu Leu Ala Val His Lys Thr Gln Asp Val Arg Asn Gly Gln Val 130 135 140 Val Val Ala Arg Ile Asp Asp Glu Val Thr Val Lys Arg Leu Lys Lys 145 150 155 160 Gln Gly Asn Lys Val Glu Leu Leu Pro Glu Asn Ser Glu Phe Lys Pro 165 170 175 Ile Val Val Asp Leu Arg Gln Gln Ser Phe Thr Ile Glu Gly Leu Ala 180 185 190 Val Gly Val Ile Arg Asn Gly Asp Trp Leu 195 200 <210> 2 <211> 400 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Isolated protein domain <400> 2 Met Ser Gln Val Gln Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Gln Leu Gln Tyr 1 5 10 15 Gly Asn Gly Ser Leu Met Ser Thr Val Pro Ala Asp Leu Ser Gln Ser 20 25 30 Val Val Asp Gly Asn Gly Asn Gly Ser Ser Glu Asp Ile Glu Ala Thr 35 40 45 Asn Gly Ser Gly Asp Gly Gly Gly Leu Gln Glu Gln Ala Glu Ala Gln 50 55 60 Gly Glu Met Glu Asp Glu Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Leu Gly Ser Phe 65 70 75 80 Val Pro Ile Glu Lys Leu Gln Val Asn Gly Ile Thr Met Ala Asp Val 85 90 95 Lys Lys Leu Arg Glu Ser Gly Leu His Thr Ala Glu Ala Val Ala Tyr 100 105 110 Ala Pro Arg Lys Asp Leu Leu Glu Ile Lys Gly Ile Ser Glu Ala Lys 115 120 125 Ala Asp Lys Leu Leu Asn Glu Ala Ala Arg Leu Val Pro Met Gly Phe 130 135 140 Val Thr Ala Ala Asp Phe His Met Arg Arg Ser Glu Leu Ile Cys Leu 145 150 155 160 Thr Thr Gly Ser Lys Asn Leu Asp Thr Leu Leu Gly Gly Gly Val Glu 165 170 175 Thr Gly Ser Ile Thr Glu Leu Phe Gly Glu Phe Arg Thr Gly Lys Ser 180 185 190 Gln Leu Cys His Thr Leu Ala Val Thr Cys Gln Ile Pro Leu Asp Ile 195 200 205 Gly Gly Gly Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ile Asp Thr Glu Gly Thr Phe 210 215 220 Arg Pro Val Arg Leu Val Ser Ile Ala Gln Arg Phe Gly Leu Asp Pro 225 230 235 240 Asp Asp Ala Leu Asn Asn Val Ala Tyr Ala Arg Ala Tyr Asn Ala Asp 245 250 255 His Gln Leu Arg Leu Leu Asp Ala Ala Ala Gln Met Met Ser Glu Ser 260 265 270 Arg Phe Ser Leu Ile Val Val Asp Ser Val Met Ala Leu Tyr Arg Thr 275 280 285 Asp Phe Ser Gly Arg Gly Glu Leu Ser Ala Arg Gln Met His Leu Ala 290 295 300 Lys Phe Met Arg Ala Leu Gln Arg Leu Ala Asp Gln Phe Gly Val Ala 305 310 315 320 Val Val Val Thr Asn Gln Val Val Ala Gln Val Asp Gly Gly Met Ala 325 330 335 Phe Asn Pro Asp Pro Lys Lys Pro Ile Gly Gly Asn Ile Met Ala His 340 345 350 Ser Ser Thr Thr Arg Leu Gly Phe Lys Lys Gly Lys Gly Cys Gln Arg 355 360 365 Leu Cys Lys Val Val Asp Ser Pro Cys Leu Pro Glu Ala Glu Cys Val 370 375 380 Phe Ala Ile Tyr Glu Asp Gly Val Gly Asp Pro Arg Glu Glu Asp Glu 385 390 395 400 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> engineered protein binding sequence <400> 3 ctgtatatat atacag 16 <210> 4 <211> 208 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> isolated protein domain <400> 4 Met Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu 1 5 10 15 Leu Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala 20 25 30 Gln Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn 35 40 45 Lys Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His 50 55 60 His Thr His Phe Cys Pro Leu Glu Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu 65 70 75 80 Arg Asn Asn Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asp 85 90 95 Gly Ala Lys Val His Leu Gly Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu 100 105 110 Thr Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu 115 120 125 Glu Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly 130 135 140 Cys Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu 145 150 155 160 Thr Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu 165 170 175 Leu Phe Asp His Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu 180 185 190 Leu Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Ser 195 200 205 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> engineered protein binding sequence <400> 5 tccctatcag tgatagaga 19 <210> 6 <211> 400 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> isolated protein domain <400> 6 Met Ser Gln Val Gln Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Gln Leu Gln Tyr 1 5 10 15 Gly Asn Gly Ser Leu Met Ser Thr Val Pro Ala Asp Leu Ser Gln Ser 20 25 30 Val Val Asp Gly Asn Gly Asn Gly Ser Ser Glu Asp Ile Glu Ala Thr 35 40 45 Asn Gly Ser Gly Asp Gly Gly Gly Leu Gln Glu Gln Ala Glu Ala Gln 50 55 60 Gly Glu Met Glu Asp Glu Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Leu Gly Ser Phe 65 70 75 80 Val Pro Ile Glu Lys Leu Gln Val Asn Gly Ile Thr Met Ala Asp Val 85 90 95 Lys Lys Leu Arg Glu Ser Gly Leu His Thr Ala Glu Ala Val Ala Tyr 100 105 110 Ala Pro Arg Lys Asp Leu Leu Glu Ile Lys Gly Ile Ser Glu Ala Lys 115 120 125 Ala Asp Lys Leu Leu Asn Glu Ala Ala Arg Leu Val Pro Met Gly Phe 130 135 140 Val Thr Ala Ala Asp Phe His Met Arg Arg Ser Glu Leu Ile Cys Leu 145 150 155 160 Thr Thr Gly Ser Lys Asn Leu Asp Thr Leu Leu Gly Gly Gly Val Glu 165 170 175 Thr Gly Ser Ile Thr Glu Leu Phe Gly Glu Phe Arg Thr Gly Lys Ser 180 185 190 Gln Leu Cys His Thr Leu Ala Val Thr Cys Gln Ile Pro Leu Asp Ile 195 200 205 Gly Gly Gly Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ile Asp Thr Glu Gly Thr Phe 210 215 220 Arg Pro Val Arg Leu Val Ser Ile Ala Gln Arg Phe Gly Leu Asp Pro 225 230 235 240 Asp Asp Ala Leu Asn Asn Val Ala Tyr Ala Arg Ala Tyr Asn Ala Asp 245 250 255 His Gln Leu Arg Leu Leu Asp Ala Ala Ala Gln Met Met Ser Glu Ser 260 265 270 Arg Phe Ser Leu Ile Val Val Asp Ser Val Met Ala Leu Tyr Arg Thr 275 280 285 Asp Phe Ser Gly Arg Gly Glu Leu Ser Ala Arg Gln Met His Leu Ala 290 295 300 Lys Phe Met Arg Ala Leu Gln Arg Leu Ala Asp Gln Phe Gly Val Ala 305 310 315 320 Val Val Val Thr Asn Gln Val Val Ala Gln Val Asp Gly Gly Met Ala 325 330 335 Phe Asn Pro Asp Pro Lys Lys Pro Ile Gly Gly Asn Ile Met Ala His 340 345 350 Ser Ser Thr Thr Arg Leu Gly Phe Lys Lys Gly Lys Gly Cys Gln Arg 355 360 365 Leu Cys Lys Val Val Asp Ser Pro Cys Leu Pro Glu Ala Glu Cys Val 370 375 380 Phe Ala Ile Tyr Glu Asp Gly Val Gly Asp Pro Arg Glu Glu Asp Glu 385 390 395 400 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> engineered protein binding sequence <220> <221> N <222> (4)..(14) <223> N = any nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(14) <220> <221> misc_feature <222> (4)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 7 cggnnnnnnn nnnnccg 17 <210> 8 <211> 359 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> isolated protein binding domain <400> 8 Met Lys Pro Val Thr Leu Tyr Asp Val Ala Glu Tyr Ala Gly Val Ser 1 5 10 15 Tyr Gln Thr Val Ser Arg Val Val Asn Gln Ala Ser His Val Ser Ala 20 25 30 Lys Thr Arg Glu Lys Val Glu Ala Ala Met Ala Glu Leu Asn Tyr Ile 35 40 45 Pro Asn Arg Val Ala Gln Gln Leu Ala Gly Lys Gln Ser Leu Leu Ile 50 55 60 Gly Val Ala Thr Ser Ser Ala Leu His Ala Pro Ser Gln Ile Val Ala 65 70 75 80 Ala Ile Lys Ser Arg Ala Asp Gln Leu Gly Ala Ser Val Val Val Ser 85 90 95 Met Val Glu Arg Ser Gly Val Glu Ala Cys Lys Ala Ala Val His Asn 100 105 110 Leu Leu Ala Gln Arg Val Ser Gly Leu Ile Ile Asn Tyr Pro Leu Asp 115 120 125 Asp Gln Asp Ala Ile Ala Val Glu Ala Ala Cys Thr Asn Val Pro Ala 130 135 140 Leu Phe Leu Asp Val Ser Asp Gln Thr Pro Ile Asn Ser Ile Ile Phe 145 150 155 160 Ser His Glu Asp Gly Thr Arg Leu Gly Val Glu His Leu Val Ala Leu 165 170 175 Gly His Gln Gln Ile Ala Leu Leu Ala Gly Pro Leu Ser Ser Val Ser 180 185 190 Ala Arg Leu Arg Leu Ala Gly Trp His Lys Tyr Leu Thr Arg Asn Gln 195 200 205 Ile Gln Pro Ile Ala Glu Arg Glu Gly Asp Trp Ser Ala Met Ser Gly 210 215 220 Phe Gln Gln Thr Met Gln Met Leu Asn Glu Gly Ile Val Pro Thr Ala 225 230 235 240 Met Leu Val Ala Asn Asp Gln Met Ala Leu Gly Ala Met Arg Ala Ile 245 250 255 Thr Glu Ser Gly Leu Arg Val Gly Ala Asp Ile Ser Val Val Gly Tyr 260 265 270 Asp Asp Thr Glu Asp Ser Ser Cys Tyr Ile Pro Pro Leu Thr Thr Ile 275 280 285 Lys Gln Asp Phe Arg Leu Leu Gly Gln Thr Ser Val Asp Arg Leu Leu 290 295 300 Gln Leu Ser Gln Gly Gln Ala Val Lys Gly Asn Gln Leu Leu Pro Val 305 310 315 320 Ser Leu Val Lys Arg Lys Thr Thr Leu Ala Pro Asn Thr Gln Thr Ala 325 330 335 Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asp Ser Leu Met Gln Leu Ala Arg Gln Val 340 345 350 Ser Arg Leu Glu Ser Gly Gln 355 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> engineered protein binding sequence <400> 9 aattgtgagc ggataacaat t 21

Claims (20)

  1. 가이드 핵산 및 공여자 DNA 서열을 포함하는 편집 카세트의 전사를 유도하는 프로모터; 효모 복제 기점; 박테리아 복제 기점; 뉴클레아제에 대한 코딩 서열의 전사를 유도하는 프로모터; 선택 마커의 전사를 유도하는 프로모터; 하나 이상의 LexA DNA 결합 부위; 및 LexA-링커-Rad51 융합 단백질의 전사를 유도하는 프로모터를 포함하는, 효모에서 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집을 위한 편집 벡터.
  2. 제1항에 있어서, LexA-링커-Rad51 융합 단백질이 LexA 단백질의 일부 및 Rad51 단백질의 일부를 포함하는 편집 벡터.
  3. 제2항에 있어서, LexA 단백질의 일부가 SEQ ID No.1을 포함하는 편집 벡터.
  4. 제2항에 있어서, Rad51 단백질의 일부가 SEQ ID No.2를 포함하는 편집 벡터.
  5. 제1항에 있어서, LexA-링커-Rad51 융합 단백질의 링커가 폴리글리신 링커 또는 글리신-세린 링커를 포함하는 편집 벡터.
  6. 제1항에 있어서, 하나 이상의 LexA DNA 결합 부위가 SEQ ID No. 3을 포함하는 편집 벡터.
  7. 제1항에 있어서, LexA-링커-Rad51 융합 단백질의 전사를 유도하는 프로모터가 효모 알콜 탈수소효소 1 프로모터, pGPD 프로모터, pTEF1 프로모터, pACT1 프로모터, pRNR2 프로모터, pCYC1 프로모터, pTEF2 프로모터, pHXT7 프로모터, pYEF3 프로모터, pRPL3 프로모터, pRPL4 프로모터 또는 pGAL1 프로모터인 편집 벡터.
  8. 제7항에 있어서, LexA-링커-Rad51 융합 단백질의 전사를 유도하는 프로모터가 효모 알콜 탈수소효소 1 프로모터이고, 편집 벡터가 LexA-링커-Rad51 융합 단백질에 대해 3'에 ADH1 종료자 요소를 추가로 포함하는 편집 벡터.
  9. 제7항에 있어서, LexA-링커-Rad51 융합 단백질의 전사를 유도하는 프로모터가 pGDP 프로모터이고, 편집 벡터가 LexA-링커-Rad51 융합 단백질에 대해 3'에 GDP 종료자 요소를 추가로 포함하는 편집 벡터.
  10. 제7항에 있어서, LexA-링커-Rad51 융합 단백질의 전사를 유도하는 프로모터가 pGDP 프로모터이고, 편집 벡터가 LexA-링커-Rad51 융합 단백질에 대해 3'에 GDP 종료자 요소를 추가로 포함하는 편집 벡터.
  11. 제7항에 있어서, LexA-링커-Rad51 융합 단백질의 전사를 유도하는 프로모터가 pTEF1 프로모터이고, 편집 벡터가 LexA-링커-Rad51 융합 단백질에 대해 3'에 TEF1 종료자 요소를 추가로 포함하는 편집 벡터.
  12. 제7항에 있어서, LexA-링커-Rad51 융합 단백질의 전사를 유도하는 프로모터가 pTEF2 프로모터이고, 편집 벡터가 LexA-링커-Rad51 융합 단백질에 대해 3'에 TEF2 종료자 요소를 추가로 포함하는 편집 벡터.
  13. 제7항에 있어서, LexA-링커-Rad51 융합 단백질의 전사를 유도하는 프로모터가 pACT1 프로모터이고, 편집 벡터가 LexA-링커-Rad51 융합 단백질에 대해 3'에 ACT1 종료자 요소를 추가로 포함하는 편집 벡터.
  14. 제7항에 있어서, LexA-링커-Rad51 융합 단백질의 전사를 유도하는 프로모터가 pRNR2 프로모터이고, 편집 벡터가 LexA-링커-Rad51 융합 단백질에 대해 3'에 RNR2 종료자 요소를 추가로 포함하는 편집 벡터.
  15. 제7항에 있어서, LexA-링커-Rad51 융합 단백질의 전사를 유도하는 프로모터가 pCYC1 프로모터이고, 편집 벡터가 LexA-링커-Rad51 융합 단백질에 대해 3'에 CYC1 종료자 요소를 추가로 포함하는 편집 벡터.
  16. 제7항에 있어서, LexA-링커-Rad51 융합 단백질의 전사를 유도하는 프로모터가 pHXT7 프로모터이고, 편집 벡터가 LexA-링커-Rad51 융합 단백질에 대해 3'에 HXT7 종료자 요소를 추가로 포함하는 편집 벡터.
  17. 제7항에 있어서, LexA-링커-Rad51 융합 단백질의 전사를 유도하는 프로모터가 pYEF3 프로모터이고, 편집 벡터가 LexA-링커-Rad51 융합 단백질에 대해 3'에 YEF3 종료자 요소를 추가로 포함하는 편집 벡터.
  18. 제7항에 있어서, LexA-링커-Rad51 융합 단백질의 전사를 유도하는 프로모터가 pRPL3 프로모터이고, 편집 벡터가 LexA-링커-Rad51 융합 단백질에 대해 3'에 RPL3 종료자 요소를 추가로 포함하는 편집 벡터.
  19. 제7항에 있어서, LexA-링커-Rad51 융합 단백질의 전사를 유도하는 프로모터가 pRPL4 프로모터이고, 편집 벡터가 LexA-링커-Rad51 융합 단백질에 대해 3'에 RPL4 종료자 요소를 추가로 포함하는 편집 벡터.
  20. 제7항에 있어서, LexA-링커-Rad51 융합 단백질의 전사를 유도하는 프로모터가 pGAL1 프로모터이고, 편집 벡터가 LexA-링커-Rad51 융합 단백질에 대해 3'에 GAL1 종료자 요소를 추가로 포함하는 편집 벡터.
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