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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kontrolle der Qualität
eines mit einer Flüssigkeit befüllbaren Behältnisses,
welches mindestens zwei zumindest annähernd planparallel
angeordnete Elektroden zur Erzeugung eines elektrischen Feldes in
mindestens einem Reaktionsraum des Behältnisses aufweist.
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Behältnisse
der eingangs genannten Art werden vor allem bei der Elektroporation
oder Elektrofusion, beispielsweise in Form von Küvetten
mit eingelegten Elektroden aus Metall, eingesetzt. Die für
diesen Zweck verwendeten Behältnisse sind meist schmale,
nach unten geschlossene und nach oben offene Gefäße,
deren Innenraum aus jeweils zwei Paaren parallel und gegenüberliegend
angeordneter Seitenwände gebildet wird. Der Innenraum dient
dabei der Aufnahme der Zellsuspension, d. h. in der Regel einer
wässrigen Pufferlösung oder eines Zellkulturmediums,
in dem die zu behandelnden Zellen suspendiert sind. Für
besondere Anwendungen können mehrere solcher Behältnisse
auch in Form einer „multiwell"-Platte, beispielsweise einer
Mikrotiterplatte mit 96 oder mehr Reaktionsräumen, miteinander
zu einer Einheit verbunden sein. Zum Anlegen einer elektrischen
Spannung weisen solche Behältnisse zumeist im unteren Bereich
eines Paares gegenüberliegender Seitenwände ein
Elektrodenpaar auf. Bei einer elektrischen Entladung fließt
zwischen den beiden Elektroden ein elektrischer Strom durch die
Zellsuspension, der einen Transport der Nukleinsäuren oder
anderer Moleküle in die Zellen bewirkt oder je nach den
gewählten Bedingungen zur Zellfusion führt. Die
Elektroden können dabei aus Metall, z. B. Aluminium, Graphit
oder einem leitfähigen Polymer bestehen.
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Bei
der Herstellung solcher Behältnissen oder einem Einzelgefäß innerhalb
eines 96-well-Systems (Mikrotiterplatte) ist eine Qualitätsüberprüfung
wünschenswert, die Aussagen über die Funktionalität
des Reaktionsgefäßes erlaubt. Zur Qualitäts ermittlung
von Reaktionsgefäßen, z. B. mit zwei Elektrodenflächen
oder – bereichen, können verschiedene Methoden
verwendet werden, die Aussagen über kritische Eigenschaften, wie
z. B. die innere Geometrie der Elektroden oder Abweichungen hiervon,
erlauben. Abweichungen in den Kontaktbereichen der Elektroden sind
insbesondere kritisch, da sie die Stärke und räumliche
Verteilung des elektrischen Feldes innerhalb des Reaktionsraumes
beeinträchtigen können. Ferner können
Sie die Gefahr von unerwünschten Blitzentladungen zwischen
den Elektrodenbereichen heraufsetzen, falls z. B. der Abstand von
bestimmten Bereichen der beiden Elektroden einen kritischen Wert
unterschreitet. Die "klassischen" Methoden zur Qualtitätskontrolle
umfassen:
- 1. Geometrische Messungen, z. B.
mittels Messfühler oder optischem Messgerät.
- 2. Optische Kontrolle durch Mitarbeiter.
- 3. Hochspannungs-Widerstandmessung zwischen den Elektroden bei
trockenem Reaktionsraum.
- 4. Widerstandmessung, entweder Niederspannung oder Hochspannung,
bei nassem Reaktionsraum.
- 5. Ausführen korrekter Pulsprogramme, welche dem Verwendungsprozess
selber entsprechen.
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Die
Methoden 1, 2, 4 und 5 wurden bereits vereinzelt eingesetzt zur
Qualitätsüberprüfung von einzelnen Musterteilen.
Diese Methoden lassen sich allerdings nicht in einen zuverlässigen
und insbesondere Zeit sparenden Prozess implementieren, wie er z.
B. bei einer 100%-igen Überprüfung von Bauteilen
nötig wäre, die in einem laufenden Produktionsprozess
hergestellt werden.
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Aus
der
WO-A-2001/081533 und
der
WO-A-2001/080946 sowie
von dem Gerät und Verfahren zu dem „Easyject"-Elektroporator
der Fa. Equibio/Geneflow ist eine Messung der Impedanz (scheinbarer
Wechselstromwiderstand) vor Durchführung der Elektroporation
bekannt. Diese wird mit gefülltem Reaktionsgefäß durchgeführt,
um insbesondere den Füllstand zu überprüfen,
wobei ein Abbruch des Ver suchs möglich ist, wenn die Impedanz
außerhalb von gegebenen Grenzen liegt, und die Startspannung
oder die Anzahl der Impulsentladungen der elektrischen Impulsentladung
entsprechend der gemessenen Impedanz anzupassen.
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Die
WO-A-2001/081532 beschreibt
den Einsatz einer Impedanzmessung im Wechselfeld während des
Vorgangs der Elektropermeabilisierung von Zellen, um dessen Amplitude
zu variieren.
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Die
WO-A-2002/086129 ,
WO-A-2002/000871 und
WO-A-2003/050546 beschrieben
Schaltungsaufbauten und Verfahren zur Transfektion mittels elektrischem
Strom, wobei eine Widerstandsmessung mittels Gleichspannung vor
der Transfektion durchgeführt wird. Diese dient im Falle
der
WO-A-2002/000871 der Überprüfung
des Füllstandes und von etwaigen Kurzschlüssen
im gefüllten Zustand und unmittelbar vor Verwendung. Bei
der
WO-A-2003/050546 dient
diese der automatischen Wahl von Impulseinstellungen, wie z. B.
der für die Entladung benutzten Kapazitäten. Diese
Methode lässt sich daher ebenfalls nicht von dem Vorgang
der Verwendung selber trennen.
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Es
ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Kontrolle der Qualität
von Behältnissen für die Elektroporation bereitzustellen,
das unabhängig von der Verwendung des Behältnisses
in ungefülltem Zustand durchgeführt werden kann.
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Erfindungsgemäß wird
die Aufgabe durch ein Verfahren der eingangs genannten Art gelöst,
bei dem der Reaktionsraum mit den Elektroden als Kondensator betrachtet
wird und die Unterscheidung zwischen einem fehlerhaften und einem
fehlerfreien Behältnis durch die Bestimmung der Kapazität
dieses Kondensators erfolgt. Im Grunde stellt die Einheit aus sich
planparallel gegenüberstehenden Elektroden in einem Reaktionsraum
einen elektrischen Kondensator dar, die sich in einem Verfahren
zur Bestimmung der Kapazität dieses Kondensators messen
lässt. Verformungen der Elektrodeninnenseite der Reaktionsgefäße
haben entsprechend Einfluss auf die Messgröße
der Kapazität, nach: C ≈ A/d, wobei C die Kapazität eines
Plattenkondensators ist, A die Fläche der Platten und d
der Abstand der Platten. Mit dem erfindungsgemäßen
Verfahren kann die Qualität von mit Elektroden versehenen
Behältnissen unabhängig von der Verwendung der
Behältnisse in ungefülltem Zustand kontrolliert
werden, da Fehler in oder an den Elektroden als Änderung
der Kapazität auf einfache und kostengünstige
Weise detektiert werden können. Das Verfahren ist dabei „nicht-invasiv",
so dass die getesteten Behältnisse nach der Kontrolle noch
verwendet werden können und somit eine vollständige Kontrolle
anstelle einer stichprobenartigen Prüfung ermöglicht
wird.
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In
vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen
Verfahrens ist vorgesehen, dass die Bestimmung der Kapazität
durchgeführt wird, während der Reaktionsraum trocken
ist.
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In
vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen
Verfahrens ist ferner vorgesehen, dass die Kapazität durch
die Auswertung von U/I-Profilen bei Lade-/Entladeprozessen bestimmt
wird.
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In
vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen
Verfahrens ist ferner vorgesehen, dass die Kapazität unter
Verwendung bzw. als Bestandteil eines Schwingkreises bestimmt wird.
Dabei kann eine Änderung der Kapazität mittels
einer Verstimmung des Schwingkreises detektiert werden, wobei vorzugsweise
die Verstimmung des Schwingkreises unter Anlegen eines Wechselfeldes
durch das Zählen der Schwingungsdurchgänge, beispielsweise
mittels eines Torzählers, ermittelt wird.
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Erfindungsgemäß ist
die Verwendung von Schwingkreisen oder einfache Lade-/Entladeprozesse (U/I-Profile
bzw. U/I-Steigung) geeignet, um eine Kapazität zu messen.
Die Integration in einen Schwingkreis (s. u.) stellt ein genaues,
gebräuchliches Verfahren zur Bestimmung von C dar, das
seit vielen Jahrzehnten z. B. bei der Qualitätsüberprüfung
von elektrischen Kondensatoren Verwendung findet. Der hier beschriebene Einsatz
zur Überprüfung von trockenen Reaktionsräumen
stellt eine neue Möglichkeit dar, die Verwendbarkeit solcher
Reaktionsräume losgelöst von der zweckmäßigen
Verwendung zu überprüfen. Prinzipiell lässt
sich diese Methode für die Überprüfung
aller Reaktionsräume, Kammern oder Aufbauten mit mindestens
zwei Elektroden in Plattenkondensator – ähnlicher
Ausformung einsetzen.
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In
vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen
Verfahrens ist ferner vorgesehen, dass Elektroden aus Metall, Graphit
und/oder einem leitfähigen Polymer verwendet werden. Insbesondere
können Polymerelektroden verwendet werden, auf die Kontaktflächen
aufgebracht wurden, beispielsweise in Form einer heißgeprägten
Folie. In einem solchen Fall können durch die Bestimmung
der Kapazität in besonders vorteilhafter Weise fehlerhafte
Behältnisse ohne Folie auf mindestens einer Elektrode und/oder
mit unzureichend aufgebrachter Folie auf mindestens einer Elektrode
detektiert werden.
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In
vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen
Verfahrens ist ferner vorgesehen, dass durch die Bestimmung der
Kapazität fehlerhafte Behältnisse detektiert werden,
bei denen mindestens eine Elektrode Deformationen und/oder überstehende
oder zurücktretende Bereiche aufweist.
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In
vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen
Verfahrens ist ferner vorgesehen, dass durch die Bestimmung der
Kapazität fehlerhafte Behältnisse detektiert werden,
bei denen mindestens eine Elektrode fehlerhaft ausgerichtet ist.
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In
vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen
Verfahrens ist ferner vorgesehen, dass durch die Bestimmung der
Kapazität fehlerhafte Behältnisse detektiert werden,
bei denen mindestens zwei Elektroden gegeneinander abgewinkelt sind.
Solche Fehler können insbesondere bei Metallelektroden
auftreten, die in vorgefertigte Behältnisse eingesetzt
werden.
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In
vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen
Verfahrens ist ferner vorgesehen, dass die Unterscheidung zwischen
einem fehlerhaften und einem fehlerfreien Behältnis unabhängig
bzw. losgelöst von der eigentlichen Verwendung des Behältnisses
erfolgt.
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Als
Fehler bei mit Elektroden versehenen Behältnissen können
also mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens
beispielsweise erkannt werden:
- a) fehlende
Kontaktierung (z. B. durch fehlendes Heißprägefolienstück
an einer Elektrode),
- b) über die normale Fläche überstehende
Folienreste,
- c) ausgebeulte Elektrodeninnenseiten durch überzähliges
leitfähiges Material,
- d) ausgepresstes leitfähiges Elektrodenmaterial am
Elektrodenspalt oder an der Außenseite des Reaktionsbehältnisses,
z. B. verursacht durch das Heißprägen.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren hat unter anderem die
folgenden Vorteile:
- a) Das Verfahren wird trocken
durchgeführt, d. h. es muss keine Flüssigkeit
in das Behältnis bzw. den Reaktionsraum eingefüllt
werden, so dass kein Waschen nötig ist, Kontaminationen
vermieden werden, das Handling verbessert wird und Varianzen im
Versuch vermindert werden;
- b) Es kann auf hochstromige Pulsentladungen verzichtet werden,
so dass die elektrischen Eigenschaften des Behältnisses
und/oder die Oberflächen der Elektroden durch die Kontrolle
nicht verändert werden;
- c) Auch optisch schwer erkennbare Fehler im Inneren des Behältnisses
bzw. Reaktionsraums können detektiert werden, so dass aufwendige
geometrische Messungen vermieden werden können;
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Die
Erfindung wird im Folgenden anhand der Abbildungen und der folgenden
Versuche beispielhaft näher erläutert. Es zeigt
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1 schematische
Darstellungen eines Kondensators und eines Querschnitts durch einen
Reaktionsraum eines mit Elektroden versehenen Behältnisses,
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2 eine
schematische Darstellung eines Messaufbaus zur Erkennung eines mit
Elektroden versehenen Behältnisses („Reaktionswell"),
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3 eine
schematische Darstellung einzelner Varianten von Reaktionsräumen
(„wells") eines mit Elektroden versehenen Behältnisses
und
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4 eine
schematische Darstellung eines Schwingkreises zur Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens.
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1 zeigt,
dass eine Einheit aus sich planparallel gegenüberstehenden
Elektroden in einem Reaktionsraum eines Behältnisses praktisch
einen elektrischen Kondensator darstellt, so dass sich die Kapazität
dieses Kondensators messen lässt. Verformungen der Elektrodeninnenseite
der Behältnisse haben entsprechend Einfluss auf die Messgröße
der Kapazität, nach: C ≈ A/d, wobei C die Kapazität
eines Plattenkondensators ist, A die Fläche der Platten
und d der Abstand der Platten.
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1. Versuch zur Erkennung des Behältnisses
(analog):
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In
dem Messaufbau gemäß
2 wurden
unter Anlegen eines Wechselfeldes Verschiebeströme gemessen
und folgende Messergebnisse erhalten:
| Eingesetzte
Wells/Kondensatoren | Gemessene
Verschiebeströme |
| 1:
Well 1, 2: Well 2 | 860–870
mV |
| 1:
Well 1, 2: 1 pF Kondensator | 880–890
mV |
| 1:
Wellt, 2: leer | 970–980
mV |
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Folglich
ergibt sich durch Einsetzen eines Reaktionswells an Position 2 ein
Spannungshub von ca. 100 mV gegenüber der leeren Position.
An "Prüfposition" 2 verhält sich das Reaktionswell
wie ein Kondensator (entspricht ungefähr 0,8 pF). Damit
lässt sich ein Reaktionswell als Kondensator betrachten.
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2. Versuch zur Erkennung fehlerhafter,
trockener Behältnisse:
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Unter
Verwendung eines klassischen Schwingkreisaufbaus sollte nun ermittelt
werden, ob zwischen den Kapazitäten von fehlerfreien und
fehlerbehafteten Behältnissen gemäß
3 unterschieden
werden kann. In dem Messaufbau gemäß
4 wurden
unter Anlegen eines Wechselfeldes Frequenzzählungen mit
Hilfe eines Torzählers durchgeführt. Die Anzahl
gezählter Schwingungsdurchgänge pro Zeiteinheit,
also eine Verstimmung des Schwingkreises durch die geänderte
Kapazität, wurde dabei gemessen. Somit ist der Messaufbau
geeignet, Änderungen der Kapazitäten zu detektieren.
Unter Verwendung von reellen fehlerfreien und fehlerhaften Mustern
von mit Elektroden versehenen Behältnissen sowie eines
konstanten Kondensators von 1 F als Referenz wurden folgende Messergebnisse
erhalten:
| Reaktionswellmuster | Versuch | Frequenzzählungen,
mit Ref.-Kap. (1 pF) | Frequenzzählungen,
mit Reaktionswell |
| Fehlerfreies Muster | 1 | 152 | 109 |
| 2 | 151 | 104 |
| Muster mit Fehler 7 gemäß Figur
3 | 1 | 151 | 149 |
| 2 | 149 | 145 |
| 3 | 151 | 147 |
| 4 | 150 | 146 |
| 5 | 150 | 149 |
| Muster
mit Fehler 2 gemäß Figur 3 | | 150 | 105 |
| Keine
Kontaktierung | | 150 | 180 |
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Die
Ergebnisse zeigen, dass sowohl Muster mit fehlerhafter Ausprägung
7 nach 3 als auch keine erfolgreiche Kontaktierung (z.
B. Ausprägung 3 nach 3) eindeutig
mit dem Messaufbau erkannt werden können (durch Frequenzverstimmungen,
die durch Änderung der gezählten Schwingungsdurchgänge
erkannt werden können). Muster mit fehlerhaftem Aufdruck
einer Folie nach 2 in 3 konnten allerdings nicht erkannt werden.
Dies ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass
zwar der Abstand d der Kapazität des Reaktionswells bei
diesen partiellen Folienbrücken stark vermindert ist, aber
der Flächenanteil an der Gesamtfläche der Elektroden
nur äußerst gering ist.
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Dieser
Aufbau kann beispielsweise auch als Grundlage für einen
produktionsbegleitenden Tester verwendet werden, um Einzelteile
von Aufbauten mit Reaktionsräumen, z. B. mit mindestens
zwei Elektrodenflächen oder -bereichen, wie sie z. B. in
zu mehreren Reaktionsräumen zusammengefassten Bauteilen
im Mikrotiterplattenformat oder auch bei Einzelküvetten
vorkommen, mit den in genannten Vorteilen des erfindungsgemäßen
Verfahrens einer nicht-invasiven Qualitätsüberprüfung
zu unterziehen.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Zitierte Patentliteratur
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- - WO 2001/081533
A [0005]
- - WO 2001/080946 A [0005]
- - WO 2001/081532 A [0006]
- - WO 2002/086129 A [0007]
- - WO 2002/000871 A [0007, 0007]
- - WO 2003/050546 A [0007, 0007]