CN1523112A - 四环素调节的转录调控物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的是用于在真核细胞及生物体中调节基因表达的核酸分子和蛋白质。本发明提供一种转录激活物融合蛋白，它当四环素(或其类似物)存在而非不存在时结合tet操纵子序列并激活tet操纵子相连的基因的转录。本发明进一步提供转录抑制物融合蛋白，它以可调节方式抑制tet操纵子相连的基因的转录。在一个实施方案中，当四环素(或类似物)不存在而非存在时，抑制物融合蛋白结合tet操纵子序列。在另一实施方案中，当四环素(或类似物)存在而非不存在时，抑制物融合蛋白结合tet操纵子产物。本发明的转录激活物和抑制物融合蛋白可组合使用来调节一个或多个tet操纵子相连的基因的表达。公开的还有本发明的转录调控物能够实现两个或多个基因表达的协同或独立四环素调节的新型含tet操纵子调节单元。本发明还涵盖包括该调节体系的组分的试剂盒。

Description

四环素调节的转录调控物
技术领域
本申请是申请日为1995年6月29日的中国专利申请95194899.7的分案申请。本发明涉及分子生物学和生物工程领域，具体是四环素调节的转录调控物。
背景技术
通过改变细胞蛋白的对应基因的表达水平，可以有力地协助细胞蛋白的功能分析及后续的相关表型的分析。为此，需要一种受外来刺激控制的可诱导表达体系。理想情况下该体系不仅能介导基因表达的“开/关”状态，而且能让基因在给定水平上表达。
已尝试采用多种可诱导真核启动子去控制基因活性，诸如对重金属离子(Mayo等人(1982)Cell  29：99-108；Brinstel等人，(1982)Nalure  296：39-42；Searle等人，(1985)分子细胞生物学， 5：1480-1489)，热激(Nouer等人(1991)《热激反应》，Nouer，L编，CRC，Boca Raton，FL.pp 167-220)或激素(Lee等人(1981)自然 294：228-232；Hynes等人(1981)美国国家科学院院刊， 78：2038-2042；Klock等(1987) Nature  329：734-736；Israal & Kaufman(1989)Res. 17：2589-2604)起反应的启动子。然而，上述体系一般均有下述问题的一种或两种：(1)诱导物(例如，重金属离子，热激或固醇类激素)引起多重效果，使分析复杂化；(2)许多启动子体系在非诱导状态下表现高水平的本底活性，不能彻底关闭被调节基因，诱导因子偏低。
一种避免这些局限的方法是把调节成分从进化远缘物种如大肠杆菌引入高等真核细胞，预期这些调控此类调节循环的效应物将对真核细胞生理不敏感，因而不会在真核细胞中引起多重效果。例如，大肠杆菌的Lac阻遏子(LacR)/操纵子/诱导物体系在真核细胞中起作用，用于从三种不同途径调节基因表达：(1)用正确定位于启动子区的Lac操纵子阻止转录起始(Hu与Davidson(1987)细胞 48：555-566；Broun等人(1987)细胞 49：603-612；Figge等人，(1988)《细胞》 52：713-722；Fuerst等人，(1989)美国国家科学院院刊 86：2549-2553；Deuschle等人(1989)美国国家科学院院刊 86：5400-5405)；(2)用LacR/操纵子复合物在延伸期封闭正在转录的DNA聚合酶II(Deuschle等人(1990)科学 248：480-483)；(3)激活对LacR与单纯疱疹病毒(HSV)病毒颗粒蛋白16(VP16)活性结构域的融合蛋白起反应的启动子(Labow等人，(1990)分子细胞生物学， 10：3343-3356；Baim等人，(1991)美国国家科学院院刊 88：5072-5076)。
在一种Lac体系中，Lac操纵子相联序列的表达由LacR-VP16融合蛋白组成性激活并且在异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)存在时被关闭(Labow等人(1990)，引文见上)。在该体系另一种形式中，用的是一种在IPTG存在时结合Lac操纵子的LacR-VP16衍生物，提高细胞温度，结合更牢(Baim等人(1991)，引文见上)。这些Lac体系在真核细胞中应用有限，部分上由于IPTG在真核细胞中作用慢且效率低而必须在接近细胞毒性水平的浓度用。另外，用温度变化来诱导基因表达可能在细胞中引起多重效果。因此需要一种更有效的可诱导调节系统，包能快而且高水平地诱导基因表达并且真核细胞能耐受其中的诱导物而没有细胞毒性或多重效果。
已发现大肠杆菌四环素(Tc)抗性体系的组分在真核细胞中起作用并已用于调节基因表达。例如，Tet阻遏子(TetR)能在四环素不存在时结合到tet操纵子序列上并阻遏基因转录，它已能在植物细胞中以足够高的浓度来阻遏从含有tet操纵子序列的启动子起始的转录(Gatz，C等人，(1992)，植物学杂志， 2：397-404)。然而，需要相当高的胞内浓度的TetR来保持基因在细胞中低度表达，这在许多情况下不可能实现，因而导致体系的“泄漏”。
在其它研究工作中，TetR与VP16的激活结构域融合，得到四环素控制的转录激活物(tTA)(Gossen，M.和Bujard.H.(1992)美国国家科学院院刊 89：5547-5551)。tTA融合蛋白受四环素调节的方式与TetR的一样，即，tTA在四环素不存在时结合到tet操纵子序列上，在四环素存在时不结合。因此，在该体系中，Tc持续存在时，基因表达关闭，而去掉Tc可诱导转录。
发明内容
本发明的一个方面涉及一种可诱导的调节体系，它利用原核生物的Tet阻遏子/操纵子/诱导物体系的组分在真核细胞中激活基因表达。在本发明的体系中，当四环素不存在时，tet操纵子相联的核苷酸序列不转录，但当四环素(或其类似物)存在时，能被快速而张力地诱导。转录受一种含有至少两段多肽的融合蛋白诱导，其中一多肽当四环素或四环素类似物存在时结合到tet操纵子序列上，另一多肽在真核细胞中直接或间接地激活转录。在优选实施方案中，融合蛋白的第一多肽是突变的Tet阻遏子，它受Tc调节，其方式与野生型阻遏子的相反，即在Tc存在而非不存在时，它结合到tet操纵子序列上。因此，当诱导剂(Tc或Tc类似物)不存在时，tet操纵子相连的核苷酸序列的转录不被诱导。当诱导剂存在时，tet操纵子相联的核苷酸序列的转录被本发明的转录激活物(transactivator)融合蛋白激活。
本发明的可诱导调节体系有下列有利的特性：基因表达的诱导快速、高效且强力(例如，典型地在1000倍与2000倍之间；观察到过高达20000倍的表达增强)并且诱导剂不需持续存在。而且，诱导剂不会在真核细胞中引起多重效果或细胞毒性。本发明的可诱导调节体系可用于细胞中基因表达的体外或体内调节，并且可能在基因治疗应用和在转基因或同源重组生物体(例如动物或植物)的基因产物的表达中特别有用。
本发明的可诱导调节体系涉及至少两种组分：一个四环素可诱导的转录激活物和被调节的靶转录单元。相反地，本发明的一个方面涉及Tc可诱导的转录激活物融合蛋白及编码融合蛋白的核苷酸(例如DNA)。优选的融合蛋白包括一种Tn10编码的Tet阻遏子，它在氨基酸位置71、95、101和/或102中任选的至少一个氨基酸位置发生突变，并经操作连接于单纯疱疹病毒颗粒蛋白16(VP16)激活结构域上(这样的融合蛋白的核苷酸和氨基酸序列由SEQ ID NO：1和2分别给出)。在一种实施方案中，融合蛋白的激活结构域含有VP16的约127个C-末端氨基酸(例如，SEQ ID NO：2的融合蛋白)。在另一实施方案中，激活结构域包括VP16的11个C-末端氨基酸的至少一个拷贝(例如，SEQ ID NO：4给出的氨基酸序列)。其它具有所需要的功能活性的突变的Tet阻遏子和转录激活结构域也在本发明范围内。另外，转录激活物融合蛋白可以包括第三种蛋白，它促进融合蛋白运输到细胞核中。例如，核定位信号(例如具有SEQ ID NO：3给出的氨基酸序列)可以加入融合蛋白中。本发明进一步提供了重组载体和包含编码本发明的转录激活物融合蛋白的核苷酸的宿主细胞。本发明进一步提供包含编码本发明转录激活物融合蛋白的核苷酸的转基因与同源重组生物。
本发明的转录激活物被用于调节靶转录单元的转录，该单元包含一段经操作连接在最小启动子序列上的待转录核苷酸序列和至少一段tet操纵子序列。待转录的核苷酸序列可能编码感兴趣的蛋白质或是活性RNA分子(例如反义RNA分子或核酸酶)并且可能是外源或内源的核苷酸序列。第一核酸编码本发明的转录激活物，含有转录激活物的靶转录单元的第二核酸能加入到核酸组合物中。该核酸组合物可被导入宿主细胞或生物体中(例如，转基因或同源重组动物或植物)，使靶核苷酸序列的四环素可诱导表达得以转录。
除了提供待转录的单个核苷酸序列的表达调节体系外，本发明还特别给出新的靶转录单元，它们能协同地或独立地调节待转录的两段或多段核苷酸序列。在一个实施方案中，利用一种转录单元实现两段待转录核苷酸序列的协同调节，该转录单元中第一待转录的核苷酸序列经操作连接到tet操纵子序列的5’端，第二待转录序列经操作连接到同一tet操纵子序列的3’端，于是第一和第二核苷酸序列以不同方式被转录。SEQ IDNO：6和7给出了适于这种双向转录单元的双向启动子。这种转录单元对同一细胞中生产异二聚体蛋白(例如抗体链)的化学计量量的两个亚基或是在同一细胞中共同表达目的基因与编码可检测标记的基因尤其有用，由此可选择表达目的基因的细胞。
在另一实施方案中，用一个转录单元实现两段核苷酸序列的独立调节，该转录单元中第一待转录的核苷酸序列经操作连接到一种类型的tet操纵子上，第二待转录的核苷酸序列经操作连接到另一种不同类型的tet操纵子上。然后用两种不同的转录激活物融合蛋白来调节两段核苷酸序列的转录：第一融合蛋白在Tc存在时结合到第一tet操纵子序列上，而另一融合蛋白在Tc不存在时结合到第二tet操纵子序列上(或者第一融合蛋白在Tc不存在时结合到第一tet操纵子序列上，而另一融合蛋白在Tc存在时结合到第二tet操纵子序列上)。该转录单元尤其适用于在宿主中独立调节治疗基因和自杀基因的表达。例如，当四环素存在时，激活治疗基因的表达，当治疗结束时，除去四环素，从而激活自杀基因的表达。
本发明另一方面涉及一种激活一段核苷酸序列的转录的方法，该核苷酸序列经操作连接到表达本发明的转录激活物融合蛋白的宿主细胞或动物中至少一段tet操纵子序列上。在宿主细胞中，使细胞接触Tc或Tc类似物来激活转录。在受试验者(例如转基因或同源重组生物)中通过对受试验者施用Tc或Tc类似物来激活转录。不同的Tc类似物以及诱导剂的不同浓度可用来细调基因表达的诱导水平。优选的高水平基因表达Tc类似物包括无水四环素和强力霉素。本发明进一步提供了用本发明的调节体系来生产和分离感兴趣的蛋白的方法。
本发明另一方面涉及四环素调节的转录抑制物，它可以高度可控地抑制连接到一个或多个tet操纵子序列上的基因的表达。本发明的转录抑制物含有一种包含至少两段多肽的融合蛋白其中第一多肽结合到操纵子序列上，异源第二多肽在真核细胞中直接或间接地抑制转录。异源第二多肽来自不同于第一多肽的蛋白。由于本发明的融合蛋白包含真核转录抑制子(silencer)结构域，预计它们在阻遏真核细胞中的转录时比只用Tet阻遏子更有效。
在本发明的一个实施方案中，抑制物融合蛋白的第一多肽当四环素(Tc)或其类似物不存在时结合于tet操纵子序列上，当Tc或其类似物存在时不结合(例如，第一多肽优选地是Tet阻遏子，诸如具有SEQ IDNO：17给出的氨基酸序列的Tn10来源的Tet阻遏子)。当四环素(或Tc类似物)不存在时，该融合蛋白结合到经操作连接到目的基因上的tet操纵子序列上，从而抑制目的基因的转录。在另一实施方案中，第一多肽在四环素存在时结合到tet操纵子序列上，当四环素不存在时不结合(例如，第一多肽优选的是突变的Tet阻遏子，例如在位点71、95、101和/或102具有氨基酸替换的Tn10来源的Tet阻遏子)。优选地，第一多肽具有SEQ ID NO：19给出的氨基酸序列，当四环素(或Tc类似物)存在时，该融合蛋白结合到经操作连接到目的基因上的tet操纵子序列上，从而抑制目的基因的转录。
第二多肽可以是一种蛋白的转录“抑制子”结构域，该蛋白例如是v-erbA致癌基因产物，果蝇Krueppel蛋白，视黄酸受体α，胸腺激素受体α，酵母Ssn6/Tupl蛋白复合物，果蝇蛋白even-skipped SIR1，NeP1，果蝇dorasal蛋白，TSF3，SF1，果蝇hunchback蛋白，果蝇knirps蛋白，WT1，Oct-2.1，果蝇engrailed蛋白，E4BP4或ZF5。优选的抑制子结构域包括Krueppel的403-466氨基酸残基(SEQ ID No：21给出)和v-erbA的364-635氨基酸残基(SEQ ID No：23给出)。
本发明的融合蛋白可能进一步包括附加的多肽，如促进融合蛋白运输到细胞核的第三多肽(即核运输氨基酸序列)。
本发明进一步提供分离到的核酸分子，它们编码本发明的转录抑制物融合蛋白，以及重组表达载体，载体中含有适于在宿主细胞中表达编码转录抑制物融合蛋白形式的上述核酸分子。本发明进一步提供宿主细胞，本发明的重组表达载体可以引入这些细胞。因此，在这些宿主细胞中转录抑制物融合蛋白得以表达。这些宿主细胞可以是，例如，哺乳动物细胞(例如人类细胞)、酵母细胞、真菌细胞或昆虫细胞。而且，该宿主细胞可以是受精的非人类卵细胞，此时该宿主细胞可用于产生转基因生物，该生物具有表达转录抑制物融合蛋白的细胞。更进一步，重组表达载体可以被设计为使在宿主细胞中编码融合蛋白的核酸和目标基因发生同源重组。这样的同源重组载体可用于产生能表达本发明的融合蛋白的同源重组动物。
在优选实施方案中，宿主细胞(或宿主生物体的细胞)还含有待转录的核苷酸序列，它经操作连接到至少一段tet操纵子序列(例如一种目的基因，其表达可受Tc或其类似物调节)上。为了在这些宿主细胞中调节tet操纵子相连的目的基因的转录，可改变与宿主细胞接触的Tc(或其类似物)的浓度，例如，若Tc不存在时，转录抑制物融合蛋白结合到tet操纵子序列上，则降低与细胞接触的Tc的浓度，从而抑制tet操纵子相连的目的基因的转录(例如，若细胞先在Tc存在时培养，然后将Tc从培养基中去除以抑制目的基因的转录)。或者，若Tc存在时转录抑制物融合蛋白结合到tet操纵子序列上，则提高与细胞接触的Tc的浓度来抑制tet操纵子相连的目的基因的转录(例如，若细胞先在Tc不存在时培养，则将Tc添加到培养基中来抑制目的基因的转录)。
如下所述，本发明的转录抑制物融合蛋白可用于在不同情况下抑制基因表达。在一具体的优选实施方案中，同一宿主细胞中四环素调节的转录抑制物和激活物融合蛋白结合起来调节tet操纵子(tetO)相连的目的基因的转录，来精确控制目的基因的表达水平。例如，一种只有在Tc存在时才结合到tetO上的激活物融合蛋白和一种只有当Tc不存在时才结合到tetO上的抑制物融合蛋白在含有tetO相连的目的基因的宿主细胞中得以表达。当Tc不存在时，目的基因转录的基底水平被抑制物融合蛋白抑制。细胞与Tc(或类似物)接触后，目的基因的转录被激活物融合蛋白激活。本发明的激活物融合蛋白和抑制物融合蛋白也可结合起来调节多个tetO相连的目的基因的表达。
调节目的基因表达的新型试剂盒也在本发明范围内。在一实施方案中，本发明的试剂盒包含至少一种编码本发明的转录激活物融合蛋白的核酸分子以及靶转录单元，目的基因可以克隆到其上，以使基因经操作连接到tet操纵子序列上。任选地或是附加地，该试剂盒可以包括编码本发明的转录抑制物融合蛋白的核酸分子。多个目的基因克隆于其上(例如，用于协同或独立调节)的靶转录单元，也可包括到本发明的试剂盒中。而且，至少一种四环素或四环素类似物可包括到试剂盒中。
附图说明
图1是一个条线图，表示HR5-C11细胞中四环素和不同的四环素类似物(1μg/ml f.c.)对荧光素酶活性的激活。细胞在所述四环素不存在(-)或存在时生长3天，然后确定荧光素酶活性。每个实心和阴影线条代表单独一个培养皿中的荧光素酶活性。
图2是一张表示HR5-C11细胞与不同浓度的强力霉素温育时相对荧光素酶活性的图，给出的是三个独立实验的结果。
图3是一张表示HR5-C11细胞的荧光素酶活性被强力霉素诱导的动力学的图。HR5-C11培养物接触1μg/ml的强力霉素，在不同的时间间隔测量荧光素酶活性；(*)培养物含有强力霉素，(o)培养物在没有抗生素情况下生长。
图4给出不同类型Tet阻遏子的氨基酸序列，表明与B类Tet阻遏子(例如，Tn10来源的)相比，不同类型的Tet阻遏子的氨基酸序列的同源性。其它类型Tet阻遏子中与B类相同的氨基酸位置用虚线显示。
图5给出不同类型tet操纵子的核苷酸序列：A类(SEQ ID NO：11)，B类(SEQ ID NO：12)，C类(SEQ ID NO：13)，D类(SEQ ID NO：14)和E类(SEQ ID NO：15)。
图6是双向启动子构建体的示意图，该启动子通过四环素调节的转录激活物协同调节两个经操作连接到同一tet操纵子上的目的基因。
图7A(SEQ ID NO：6)给出双向启动子区域的核苷酸序列，该启动子通过四环素调节的转录激活物协同调节两个目的基因。
图7B(SEQ ID NO：7)给出一种双向启动子区域的核苷酸序列，该启动子通过四环素调节的转录激活物协同调节两个目的基因。
图8是两张表现利用四环素调节的转录激活物的荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性的协同表达的图。
图9A-B是用于四环素调节的转录激活物(tTA)表达的自调节启动子的示意图。A版表示一种在Tc不存在时结合到tet操纵子上的野生型含Tet阻遏子的转录激活物融合蛋白表达的自调节，B版表示一种当Tc存在时结合到tet操纵子上的突变型含Tet阻遏子的转录激活物融合蛋白表达的自调节。
图10是一张示意图，表示当四环素类似物强力霉素浓度渐增时通过四环素调节的转录抑制物蛋白(tSD)和四环素可诱导转录激活物融合蛋白(rtTA)分别进行的tet操纵子(tetOwt)相连的目的基因的负调控和正调控。
图11是一张示意图，表示将编码Krueppel或v-erbA抑制子结构域的核酸不改变阅读框架地融合到编码Tet阻遏子的核酸(tetR基因)的3’端来构建TetR-抑制子结构域融合构建体。
图12是仅带荧光素酶报告基因的转基因小鼠(右边的格纹柱)的荧光素酶活性表达或是当强力霉素不存在时(中间的深色柱)或当强力霉素存在时(左边的浅色柱)，带有荧光素酶报告基因和tTAR转基因的双转基因小鼠的荧光素酶活性表达的图。
具体实施方案
本发明涉及可用于在真核细胞或动物中以高度可控方式调节基因表达的核酸分子和蛋白质。本发明的体系对基因表达的调节涉及至少两个组分：一个经操作连接到调节序列上的基因和一种蛋白质，该蛋白质在诱导剂存在或不存在时结合到调节序列上，激活或抑制基因转录。本发明的体系利用原核生物的Tet阻遏子/操纵子/诱导物体系的组分在真核生物中激活基因表达。
本发明的不同方面涉及一些结合到tet操纵子(tetO)序列上，能够激活或抑制基因转录的融合蛋白，不过它们只有在四环素或其类似物存在或者不存在时才结合到tet操纵子序列上。因此，在宿主细胞中，通过改变与宿主细胞接触的四环素(或类似物)的浓度，用本发明的融合蛋白激活或抑制经操作连接到tet操纵子序列上的基因的转录(例如，在培养基中加入或去除四环素，或者对宿主生物体施用四环素或停止施用四环素，等等)。
本发明进一步涉及用本发明的融合蛋白调节的靶转录单元。除了能调节单个tet-操纵子连接的目的基因，本发明还提供新的转录单元，它含有两个或多个待转录基因，可以被本发明的转录激活物融合蛋白协同地或独立地调节。用四环素(或其类似物)激活或抑制基因转录的方法，和含有这里描述的调节体系的组分的试剂盒，也包括在本发明的范围内。
在下列小节中，详细地讨论含有本发明的可诱导调节体系的组分的核酸和蛋白及其相互关系。小节如下编排：
I.四环素可诱导的转录激活物
A.转录激活物融合蛋白的第一多肽
B.转录激活物融合蛋白的第二多肽
C.转录激活物融合蛋白的第三多肽
II.转录激活物融合蛋白的表达
A.表达载体
B.宿主细胞
C.将核酸导入宿主细胞
D.转基因生物体
E.同源重组生物体
III.四环素可诱导的转录激活物调节的靶转录单元
A.tet操纵子连接的核苷酸序列的表达的调节
B.两段核苷酸序列的协同调节
C.多段核苷酸序列的独立调节
D.多段核苷酸序列的混合型协同与独立调节
IV.四环素调节的转录抑制物
A.转录抑制物融合蛋白的第一多肽
B.转录抑制物融合蛋白的第二多肽
C.转录抑制物融合蛋白的第三多肽
D.转录抑制物融合蛋白的表达
V.本发明的试剂盒
VI.用四环素或其类似物调节基因表达
A.用转录激活物融合蛋白激活基因表达
B.用转录抑制物融合蛋白抑制基因表达
C.基因表达的组合型正调控与负调控
VII.本发明的应用
A.基因治疗
B.体外生产蛋白质
C.体内生产蛋白质
D.人类疾病的动物模型
E.生产用于克隆的稳定细胞系
I.四环素可诱导的转录激活物
在本发明的可诱导调节体系中，用转录激活物蛋白，此处简称转录激活物，激活基因转录。本发明的转录激活物是融合蛋白。本发明一方面涉及融合蛋白和编码融合蛋白的核酸(例如，DNA)。术语“融合蛋白”意指经操作连接到一起的至少两段多肽，典型地具有不同来源。至于多肽，术语“经操作连接”意指两段多肽连接后每段多肽都执行其预定的功能。典型的，两段多肽通过肽键共价连接。融合蛋白优选地由标准重组DNA技术产生。例如，编码第一多肽的DNA分子连接到编码第二多肽的另一DNA分子上，得到的杂交DNA分子在宿主细胞中表达融合蛋白。DNA分子相互以5’到3’取向连接，因而连接后编码的多肽的转录框架不变(即，DNA分子在框架内连接到一起)。
A.转录激活物融合蛋白的第一多肽
本发明的转录激活物融合蛋白部分地含有第一多肽，该多肽在四环素或其类似物存在时结合到tet操纵子序列上。融合蛋白的第一多肽优选地是突变的Tet阻遏子。术语“突变的Tet阻遏子”包括这样的多肽，它们具有与野生型Tet阻遏子相似的氨基酸序列但至少有一个氨基酸与野生型Tet阻遏子的不同。术语“野生型Tet阻遏子”指自然界存在的蛋白质，它们在原核细胞中当Tc不存在时阻遏从tet操纵子序列开始的转录。突变的Tet阻遏子与野生型Tet阻遏子的氨基酸差别可能是一个或多个氨基酸的替换，一或多个氨基酸的缺失或一个或多个氨基酸的添加。本发明的突变的Tet阻遏子有下列功能特性：(1)多肽能结合tet操纵子序列，即，它保留野生型Tet阻遏子的DNA结合特异性；2)它能被四环素以与野生型Tet阻遏子相反的方式调节，即，突变的Tet阻遏子仅当Tc(或Tc类似物)存在时而不是在Tc不存在时才结合tet操纵子序列。
在优选实施方案中，有上述的功能特性的突变的Tet阻遏子是通过在野生型Tet阻遏子序列中替换氨基酸残基得到的。例如实施例1描述的，在氨基酸位置71、95、101和102有氨基酸替换的Tn10来源的Tet阻遏子具有所需的功能特性，因而可用作本发明的转录激活物融合蛋白的第一多肽。SEQ ID NO：2(位置1-207)给出该突变Tet阻遏子的氨基酸序列。在突变Tet阻遏子的一个实施方案中，位置71由谷氨酸突变为赖氨酸，位置95由天冬氨酸突变为天冬酰胺，位置101由亮氨酸突变为丝氨酸，位置102由甘氨酸突变为天冬氨酸，但本发明不限于这些特定的突变。比这全部四种氨基酸少的突变可能足以得到具有所需功能特性的Tet阻遏子。相应地，Tet阻遏子优选地在这些位置中的至少一个发生突变。在这些和其它氨基酸位置的氨基酸发生替换、缺失或添加，但仍保留所需的突变Tet阻遏子的功能特性，也在本发明的范围内。Hinrichs，W等人(1994)科学 264：418-420中描述的Tet阻遏子-四环素复合物-的晶体结构可用于合理地设计突变的Tet阻遏子。基于该结构，氨基酸位置71位于四环素结合袋(pocket)外面，表明该位点的突变对获得本发明的突变Tet阻遏子的所需功能特性不是必需的。相反，氨基酸位置95、101和102位于保守的四环素结合袋之内。因此，Tet阻遏子的四环素结合袋可被定向突变，以获得本发明的突变的Tet阻遏子。
根据本发明的方法，可产生能加入本发明的融合蛋白的其他突变型Tet阻遏子。许多不同类型的Tet阻遏子已被描述，例如A、B、C、D和E(其中Tn10编码的阻遏子是B类阻遏子)。不同类型的Tet阻遏子的氨基酸序列，包括含有上述突变的区域，有高度同源性(即占蛋白质长度的40-60％)。图4给出并比较了不同类型Tet阻遏子的氨基酸序列。Tovar，K等人在(1988)分子基因遗传学 215：76-80中也有描述。相应地，能够在其它类型的Tet阻遏子中引入与上述Tn10来源的Tet阻遏子中等价的突变，以包括到本发明的融合蛋白中。例如，在所有5种阻遏子类型中均为天冬氨酸的氨基酸位置95，可在任一类阻遏子中突变成天冬酰胺。相似地，在所有5种阻遏子类型中均为甘氨酸的位置102，可在任一类阻遏子中突变成天冬氨酸。对本领域的技术人员，其他的合适的等价突变是显而易见的，可用此处描述的方法来产生并检验其功能。Waters，S.H.等人(1983)核酸研究 11：6089-6105，Unger，B.等人(1984)基因 31：103-108，Unger，B.等人(1984)核酸研究， 12：7693-7703以及Tover，K.等人(1988)分子基因遗传学， 215.：76-80分别给出A、C、D和E类的Tet阻遏子的核苷酸与氨基酸序列。根据本发明的讲授可突变这些野生型序列，用于此处描述的可诱导调节体系。
不同于上述突变的是，如实施例1所述通过诱发野生型Tet阻遏子并筛选能产生其它合适的突变型Tet阻遏子(即，具有上述的所需功能特性)。Hillen，W.和Schollmeier，K.(1983)核酸研究11：525-539和Postle，K.等人(1984)核酸研究12：4849-4863给出野生型B类的Tet阻遏子的核苷酸和氨基酸序列。野生型A、C、D和E类阻遏子的核苷酸和氨基酸序列见上引文。突变型Tet阻遏子可如下产生和筛选：编码野生型Tet阻遏子的核酸(例如DNA)经随机诱变，得到的突变型核酸掺入表达质粒，引入宿主细胞以便筛选。筛选检测法可用于筛选仅当四环素存在时才结合到tet操纵子序列上的Tet阻遏子。例如，在表达载体中将突变核酸的文库引入大肠杆菌菌株，其中tet操纵子控制编码Lac阻遏子的基因的表达，而Lac阻遏子控制编码筛选标记(例如药物抗性)的基因的表达。Tet阻遏子结合到细菌tet操纵子序列上会抑制Lac阻遏子的表达，从而诱导选择标记基因的表达。根据可选择的表现型(例如药物抗性)来选择表达标记的细胞。对于野生型Tet阻遏子，选择标记基因的表达在Tc不存在时发生。根据只有在Tc存在时核酸诱导细菌中选择标记基因的表达的能力，用该体系选择编码突变的Tet阻遏子的核酸。
转录激活物融合蛋白的第一多肽(例如突变的Tet阻遏蛋白)能特异地结合tet操纵子序列。每种类型的Tet阻遏子均有对应的靶tet操纵子序列。相应地，术语“tet操纵子序列”将包括所有类型的tet操纵子序列，例如A、B、C、D和E类。这五种类型的tet操纵子的核苷酸序列由图5和SEQ ID NO：11-15给出，其描述见于Waters，S.H.等人(1983)引文见上，Hiuan，W.和Schollmeier.K.(1983)引文见上，Stuber，D.和Bujard，H.(1981)美国国家科学院院刊 78：167-171，Unger，B.等人(1984)引述见上和Tovar，K.等人(1988)引述见上。在优选实施方案中，突变的Tet阻遏子是Tn10编码的阻遏子(即B类)，而且tet操纵子序列是B类tet操纵子序列。可选地，突变的A类Tet阻遏子可与A类tet操纵子序列共用，其它类型的Tet阻遏子/操纵子依此类推。
制备结合A类tet操纵子的突变的Tet阻遏子的另一种方法是进一步诱变此处描述的已突变的Tn10来源的Tet阻遏子(B类阻遏子)，使它不再有效地结合到B类操纵子上而是有效地结合到A类操纵子上。已发现A类或B类操纵子的核苷酸位置6是对互补阻遏子识别操纵子至关重要的核苷酸(B类操纵子的位置6是G/C对而A类操纵子的位置6是A/T对)(见Wissman等人(1988)分子生物学杂志 202：397-406)。已发现A类或B类Tet阻遏子的氨基酸位置40是对识别操纵子的位置6至关重要的氨基酸残基(氨基酸位置40在B类阻遏子中为苏氨酸而在A类阻遏子中为丙氨酸)。进一步发现B类阻遏子的Thr 40替换为Ala可以改变其结合特性，从而使阻遏子结合A类操纵子(相似地，A类阻遏子的Ala 40替换为Thr可以改变其结合特性从而使阻遏子结合B类操纵子)(见Altschmied等人(1988)EMBO.J. 7：4011-4017)。相应地，可以用标准分子生物学技术(例如，定点诱变)进一步将氨基酸残基40从Thr变为Ala来改变此处给出的突变型Tn10来源的Tet阻遏子的结合特性。
具有特定突变(例如在位置71、95、101和/或102，如上述)的突变型Tet阻遏子可以通过用标准分子生物学技术在编码野生型阻遏子的核酸中引入核苷酸变化而制得，例如用掺入核苷酸突变的寡聚核苷酸引物的PCR介导的突变或定点诱变。另外，若从文库中筛选确定了一个突变型Tet阻遏子，可以从文库的载体中回收突变的核酸。为了制备本发明的转录激活物融合蛋白，将编码突变型Tet阻遏子的核酸在框架内连接到另一编码转录激活结构域的核酸上，融合构建体被掺入重组表达载体中。通过将重组表达载体引入宿主细胞或动物中可以表达转录激活物融合蛋白。
B.转录激活物融合蛋白的第二多肽
转录激活物融合蛋白的第一多肽经操作连接到第二多肽上，后者在真核细胞中直接或间接激活转录。为了经操作地将第一和第二多肽连接起来，典型地将编码第一和第二多肽的核苷酸序列在框架内连到一起，产生编码融合蛋白的嵌合体基因，也可用其它手段将第一和第二多肽经操作连接起来而保留每条多肽的功能(例如，化学交联)。在优选实施方案中，转录激活物的第二多肽本身具有转录激活活性(例如，第二多肽直接激活转录)。在另一实施方案中，第二种多肽通过间接的机制激活转录，通过募集转录激活蛋白与融合蛋白相互作用。相应地，术语“在真核细胞中激活转录的多肽”包括直接或间接激活转录的多肽。
在真核细胞中激活转录的多肽在本领域是已知的。特别地，已描述了许多DNA结合蛋白的转录激活结构域并且表明该结构域转移到异源蛋白质上仍保留其激活功能。用于本发明的融合蛋白的优选多肽是单纯疱疹病毒颗粒蛋白16(此处称为VP16，其氨基酸序列由Triezenberg，S.J.等人(1988)Genes Dev. 2：718-729给出)。在一个实施方案中，用了VP16的约127个C末端氨基酸。例如，具有SEQ ID NO：2(位置208-235)给出的氨基酸序列的多肽被用作融合蛋白的第二多肽。在另一实施方案中，保留转录激活能力的VP16C末端区约11个氨基酸的至少一个拷贝被用作第二多肽。优选地用该区域的二聚体(即约22个氨基酸)。合适的VP16的C末端肽部分见Seipel，K.等人(EMBO J.(1992)，13：4961-4968)的描述。例如，具有SEQ ID NO：4给出的氨基酸序列的肽二聚体(由SEQ ID NO：3给出的核苷酸序列编码)可用作融合蛋白的第二多肽。
其它的在真核细胞中具有转录激活能力的多肽可用于本发明的融合蛋白。根据相似的结构特征将不同蛋白中发现的转录激活区域分别归类。转录激活结构域的类型包括酸性转录激活结构域、富脯氨酸转录激活结构域、富丝氨酸/苏氨酸转录激活结构域和富谷氨酰胺转录激活结构域。酸性转录激活结构域的例子包括已经描述的VP16区域和GAL4的氨基酸残基753-881。富脯氨酸激活结构域的例子包括CTF/NF1的氨基酸残基399-499和AP2的氨基酸残基31-76。富丝氨酸/苏氨酸转录激活结构域的例子包括ITF1的氨基酸残基1-427和ITF2的氨基酸残基2-451。富谷氨酰胺激活结构域的例子包括Oct1的氨基酸残基175-269和Sp1的氨基酸残基132-243。每一上述区域的氨基酸序列和其它有用的转录激活结构域的描述均由Seipel，K.等人(EMBO J.(1992) 13：4961-4968)公开。
除了上述转录激活结构域，可用标准技术鉴定的新的转录激活结构域也在本发明的范围内。通过将多肽连到另一具有DNA结合活性的多肽上并确定被融合蛋白激活的靶序列转录量，可检测多肽的转录激活能力。例如，本领域的标准检测方法利用待检测转录激活结构域和GAL4DNA结合结构域(例如氨基酸残基1-93)的融合蛋白。该融合蛋白被用来激活连到GAL4结合位点的标记基因的表达(见例如，Seipel，K.等人(1992)EMBO J. 11：4961-4968及其引用文献)。
在另一实施方案中，融合蛋白的第二多肽通过募集转录激活物与融合蛋白作用来间接激活转录。例如，本发明的突变型tetR可以融合到能够介导与转录激活物蛋白进行蛋白-蛋白相互作用的多肽结构域(例如，二聚化结构域)上，比如宿主细胞的外源激活物。已表明DNA结合结构域和转录激活结构域的功能性结合不一定是共价的(见例如，Fields与Song(1989)自然 340：245-247，Chien等人(1991)美国国家科学院院刊 88：9578-9582；Gyuris等人(1993)细胞 75：791-803；和Zervos，A.S.(1993)细胞 72：223-232)。相应地，融合蛋白的第二多肽不一定直接激活转录也可能与具有相容的蛋白-蛋白相互作用结构域和转录激活结构域的外源多肽形成稳定的相互作用。适宜的相互作用(或二聚化)结构域的例子包括亮氨酸拉链(Landschulz等人(1989)科学 243：1681-1688)，螺旋-环-螺旋结构域(Murre.C.等人(1989)细胞 58：537-544)和锌指结构域(Frankel，A.D.等人(1988)科学 240：70-73)。融合蛋白中二聚化结构域与外源核因子的作用将核因子的转录激活结构域募集到融合蛋白上，进而募集到融合蛋白结合的tet操纵子序列上。
C.转录激活物融合蛋白的第三多肽
除了突变的Tet阻遏子和转录激活结构域，本发明的融合蛋白还包括经操作连接的第三多肽，它促进融合蛋白向细胞核运输。当包括到蛋白质中以后能促进蛋白质向核中运输的氨基酸序列在本领域是已知的，被称为核定位信号(NLS)。核定位信号典型地包括一段碱性氨基酸，结合到异源蛋白(例如，本发明的融合蛋白)上以后，核定位信号促进蛋白质运输到核中。核定位信号连接到异源蛋白上，暴露在蛋白的表面，并不干扰蛋白质的功能。优选地，NLS结合到蛋白质的一端，例如N末端。能包括在本发明的融合蛋白中的NLS的一个非限制性的氨基酸序列的例子由SEQ ID NO：5给出。优选地，编码核定位信号的核酸用标准DNA技术在框架内拼接到编码融合蛋白的核酸上(例如在5’端)。
包含着具有SEQ ID NO：1给出的核苷酸序列的本发明的转录激活物的质粒pUHD 17-1已根据布达佩斯协议于1994年7月8日保藏于德国布朗施威格的德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSM)保藏号是DSM 9279。
II.转录激活物融合蛋白的表达
A.表达载体
编码上述转录激活物融合蛋白的本发明的核酸，可以以一种适于在宿主细胞中表达融合蛋白的形式掺入重组表达质粒。术语“以一种适于在宿主细胞中表达融合蛋白的形式”指重组表达质粒含有一段或多段调节序列，它(们)经操作连接到编码融合蛋白的核酸上，并能使核酸转录成mRNA，mRNA翻译成融合蛋白。术语“调节序列”在本领域中含义明确，包括启动子、增强子及其它表达控制成分(例如多聚腺苷化信号)。此类调节序列在本领域广为人知，其描述见Goeddel，《基因表达技术：酶学方法》185，学术出版社，San Diego，CA(1990)。应当理解，表达质粒的设计可能依赖于将被转染的宿主细胞的选择和/或将被表达的融合蛋白的量等因素。
在哺乳动物细胞中使用时，重组表达载体的控制功能常常由病毒遗传物质提供。例如，常用的启动子来源于多瘤病毒、腺病毒2、细胞肥大病毒和猿病毒40。利用病毒调节成分指导融合蛋白的表达可使融合蛋白在许多宿主细胞中高水平组成性表达。在优选的重组表达载体中，编码融合蛋白的序列上游(即5’)是人类细胞肥大病毒IE启动子，下游(即3’)是SV40多聚(A)信号。例如，用与实施例1描述的表达质粒相似的表达质粒。人类细胞肥大病毒IE启动子的描述见Boshart等人(1985)Cell  41：521-530。其它可用的通用表达启动子包括HSV-Tk启动子(其描述见McKnight等人(1984)Cell  37：253-262)和β-肌动蛋白启动子(例如人类β-肌动蛋白启动子，其描述见Ng等人(1985)分子细胞生物学 5：2720-2732)。
另外，重组表达载体的调节序列能在特定细胞类型中指导融合蛋白的表达，即，使用组织特异性调节成分。可用的组织特异性启动子的非限制例子包括清蛋白启动子(肝特异性，Pinkert等人(1987)Genes Rev.1：268-277)，淋巴特异性启动子(Calame与Eaton(1988)Adv.Immunol.43：235-275)，特别是T细胞受体的启动子(Winoto和Baltimore(1989)EMBO J. 8：729-733)和免疫球蛋白的启动子(Banerji等人(1983)Cell  33：729-740；Queen和Baltimore(1983)Cell  33：741-748)。神经元特异性启动子(例如，神经纤维启动子，Byrne和Ruddle(1989)美国国家科学院院刊 86：5473-5477)，胰特异性启动子(Edlund等人(1985)Science  230：912-916)和哺乳动物腺特异性启动子(例如，牛乳乳清启动子，美国专利4,873,316号和欧洲申请公开264,166号)。发育调节的启动子也包括在内，例如鼠hox启动子(Kessel和Gruss(1990)Science  249：374-379)和α-胎蛋白启动子(Campes和Tilghman(1989)Genes Dev. 3：537-546)。
另外，可制得编码转录激活物融合蛋白的自调节构建体。为此，编码融合蛋白的核酸经操作连接到最小启动子序列和至少一段tet操纵子序列上。例如，SEQ ID NO：1的核酸可连到具有SEQ ID NO：8、9或10给出的核苷酸序列的启动子上(SEQ ID NO：8和9的核酸包括一个最小CMV启动子和十个tet操纵子；SEQ ID NO：10的核酸包括一个TK启动子和十个tet操纵子)。图9B给出这样的自调节构建体的示意图。当该核酸被引入细胞时(例如在重组表达载体中)，由于“泄漏”，会有转录激活物基因的少量基底转录。当Tc(或其类似物)存在时，这些少量的转录激活物融合蛋白会结合到编码转录激活物的核苷酸序列上游的tet操纵子序列上，激活编码转录激活物的核苷酸序列的进一步转录，于是引起细胞中转录激活物融合蛋白的进一步产生。本领域专业人员应当理解，这样的自调节启动子可以与其它四环素调节的转录激活物共用，例如与野生型Tet阻遏子融合蛋白(tTA)，其描述见Gossen.M.和Bujard.H.(1992)美国国家科学院院刊 89：5547-5551，后者当Tc不存在时结合到tet操纵子上(见图9A)。当与该转录激活物共用时，若Tc不存在，则编码该转录激活物的核苷酸序列的自调节转录被激活。含有编码上面引用Gossen和Bujard(1992)描述的tTA的核苷酸序列的质粒pUHD 15-3，经操作连到自调节启动子上。该质粒根据布达佩斯协议已于1994年7月8日保藏于德国布朗施威格的德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSM)，保藏号DSM 9280。
在一个实施方案中，本发明的重组表达载体是一个质粒，如实施例1所述。备选地，本发明的重组表达载体可以是病毒或其部分，使引入病毒核酸的核酸能够表达。例如可用复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒。用这些病毒生产重组逆转录病毒和在体内或体外感染细胞的操作规程见《分子生物学现代操作规程》，Ausubel，F.M.等人(编)，Greene出版社，(1989)9.10-9.14节和其它标准实验室手册，合适的逆转录病毒的例子包括pLJ，pZIP，pWE和pEM。本领域专业人员对它们都很熟悉。合适的包装病毒系的例子包括ψCrip、ψCre、ψ2和ψAm。可以操作腺病毒的基因组，使它编码并表达转录激活物融合蛋白但失去在正常裂解病毒生命周期中复制的能力。例如见Berkner等人(1988)生物技术 6：616；Rosenfeld等人(1991)Science 252：431-434；以及Rosenfeld等人(1992)Cell  68：143-155。来自腺病毒株Ad型5 d1324或其它腺病毒株(例如Ad2，Ad3，Ad7等)的合适的腺病毒载体对本领域专业人员来说都很熟悉。另外，如Tratschin等人(1985)分子细胞生物学，5：3251-3260描述的腺病毒相关病毒可用来表达转基因融合蛋白。
B.宿主细胞
通过将编码融合蛋白的核酸引入宿主细胞使本发明的融合蛋白在真核细胞中表达，其中该核酸适于在宿主细胞中表达融合蛋白。例如，可将编码融合蛋白的本发明的重组表达载体引入宿主细胞。接，编码融合蛋白的核酸经操作连接到调节序列(例如启动子序列)上但没有附加的载体序列，可以引入宿主细胞。此处，术语“宿主细胞”包括任何真核细胞或细胞系，只要这些细胞或细胞系与待表达蛋白质、所选的筛选体系或所用的发酵体系相容即可。可用的哺乳动物细胞系的非限制性的例子包括CHO dhfr-细胞(Urlaub和Chasin(1980)美国国家科学院院刊 77 4216-4220)，293细胞(Graham等人(1977)病毒遗传学杂志，86 pp 59)或骨髓瘤细胞如SP2或NSO(Galfre和Milstein(1981)酶学方法， 73(B)：3-46)。
除了这些细胞系，本发明也可应用于正常细胞，如修饰用于基因治疗目的的细胞或修饰后用于产生转基因或同源重组动物的胚胎细胞。对基因治疗目的有特殊价值的细胞类型的例子包括造血干细胞、成骨细胞、肝细胞、白细胞、神经元细胞和皮肤上皮及气管上皮。另外，对转基因或同源重组动物，胚胎干细胞和受精卵细胞经修饰可包含编码转录激活物融合蛋白的核酸。而且植物细胞可经修饰用于产生转基因植物。
本发明可广泛应用，包括非哺乳动物的真核细胞，包括昆虫(例如Sp.frugiperda)，酵母(例如酿酒酵母，裂殖酵母，P.pastoris，乳酸克雷伯氏菌，H.polymorpha；一般性综述见Fleer，R.(1992)生物技术的当代观念 3(5)：486-496)，真菌和植物细胞。在酿酒酵母中表达的载体的例子包括pYepSecl(Baldari等人(1987)Embo J. 6：229-234)，pMfa(Kurjan和Herskowitz，(1982)Cell  30：933-943)，pJRY88(Schultz等人(1987)Gene  54：113-123)和pYES2(Invitrogen公司，San Diego，CA)。融合蛋白在昆虫细胞中表达可用杆状病毒表达载体(见例如O’Reilly等人(1992)《杆状病毒表达载体：实验手册，Stockton出版社)。可供表达蛋白的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等人(1983)分子细胞生物学 3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow，V.A.和Summers，M.D.(1989)病毒学170：31-39)。
C.将核酸导入宿主细胞
可以用转染真核细胞的标准技术将编码融合蛋白的核酸导入宿主细胞中。术语“转染”包括所有将核酸导入宿主细胞的常规技术，包括磷酸钙共沉淀，DEAE-葡聚糖介导的转染，脂转染，电穿孔和微注射。转染宿主细胞的适当方法见于Sambrook等人(分子克隆实验手册，第二版，冷泉港出版社(1989))，及其它实验教材。
用本发明的核酸转化的宿主细胞的数目至少部分依赖所用重组表达载体的类型和所用转染技术的类型。核酸可瞬时地导入宿主细胞，或是典型地，为了长时间调节基因表达，核酸稳定地整合到宿主细胞的基因组中或成为宿主细胞中稳定的附加体。导入哺乳动物细胞的质粒载体典型地只以低频率整合到宿主细胞DNA中。为了鉴定这些整合部分，通常将含有选择标记(例如药物抗性)的基因同目的核酸一同引入宿主细胞。优选的选择标记包括那些对某些药物(例如G418和Hydromycin)有抗性的选择标记。选择标记可以通过与目的核酸不同的质粒引入，或是在同一质粒上引入。用本发明的核酸(例如重组表达载体)感染的宿主细胞和选择标记基因可用选择标记选择细胞来识别。例如，如果选择标记基因编码带有新霉素抗性的基因，接受核酸的宿主细胞可用G418选择。掺入选择标记基因的细胞会生存下去，而其它细胞死亡。
被编码本发明融合蛋白的核酸转染的宿主细胞可以进一步被一个或多个用作融合基因的靶的核酸转染。靶核酸含有经操作连接到至少一段tet操纵子序列的待转录核苷酸序列(由下面第III小节详细描述)。
可以用常规转染技术在体外将编码本发明的融合蛋白的核酸导入在培养基中生长的真核细胞(例如磷酸钙沉淀，DEAE-葡聚糖转染，电穿孔等)。核酸也可在体内转移到细胞中，例如应用适于在体内将核酸引入细胞的呈递机制，诸如逆转录病毒载体(见例如Ferry，N.等人(1991)美国国家科学院院刊 88：8377-8381；和Kay.M.A.等人(1992)人类基因疗法3：641-647)，腺病毒载体(见例如Rosenfeld，M.A.(1992)Cell  68：143-155；和Herz，J和Gerard，R.D.(1993)美国国家科学院院刊 90：2812-2816)。受体介导的DNA摄取(见例如，Wu，G.和Wu，C.H.(1988)生物化学杂志263：14621；Wilson等人(1992)生物化学杂志 267：963-967；和美国专利5,166,320号)，DNA直接注射(见例如Acsadi等人(1991)Nature  332：815-818；和Wolff等人(1990)Science  247：1465-1468)或粒子轰击(见例如Cheng，L.等人(1993)美国国家科学院院刊 90：4455-4459，和Zelenin，A.V.等人(1993)FEBS letters  315：29-32)。因此，对基因疗法用途，细胞或在体外修饰后给受试者施用或，任选地，细胞可直接在体内修饰。
D.转基因生物体
转录激活物融合蛋白的核酸可以转移到非人类动物的受精卵细胞中，产生能在一种或几种细胞类型中表达本发明的融合蛋白的转基因动物。转基因动物是细胞中含有转基因的动物，其中的转基因在产前，例如胚胎阶段引入动物或动物前体。转基因是整合到一个细胞的基因组中的DNA，从该细胞发育出转基因动物，并且该DNA保留在成熟的动物的基因组中，从而指导编码基因的产物在转基因动物的一种或多种细胞类型或组织中的表达，在一个实施方案中，非人类动物是小鼠，当然本发明不限于此。在其它实施方案中，转基因动物是山羊、绵羊、猪、牛或其它家畜。这些动物利于大量生产蛋白质(所谓的“基因农牧”)。
可以通过例如将编码融合蛋白的核酸(典型地连到合适的调节成分上，诸如组成性或组织特异性增强子)引入受精卵的雄性前核(pronuclei)，例如通过微注射，再让卵细胞在假孕雌性动物中发育，这样来产生转基因动物。转基因也可包括内含子序列和多核苷化信号来提高转基因表达的效率。产生转基因动物(尤其是诸如老鼠的动物)的方法在本领域已常规化，其描述见于，例如美国专利4,736,866号和4,870,009号以及Hogan，B等人(1986)《实验手册》冷泉港，纽约州，冷泉港出版社。转基因育种动物可用来生育更多的携带转基因的动物。携带编码本发明的融合蛋白的转基因的转基因动物可进一步与携带其它转基因的其它转基团动物交配，例如与含有经操作连到tet操纵子序列的基因的转基因动物交配(详细讨论见下面的III小节)。
应当理解，除了转基因动物，此处描述的调节体系也可应用于其它转基因生物体，例如转基因植物。可用本领域的常规技术得到转基因植物。相应地，本发明涵盖含有表达本发明的转录激活物融合蛋白的细胞的非人类转基因生物体，包括动物和植物(即，编码转录激活物的核酸加入到转基因生物体的细胞中的一条或多条染色体上。
E.同源重组生物体
本发明也提供表达本发明的融合蛋白的同源重组非人类生物体。术语“同源重组生物体”此处用来描述一种生物体，例如动物或植物，它含有一个基因。通过该基因与引入该动物的细胞，例如该动物的胚胎细胞，中的DNA分子同源重组而被修饰。在一个实施方案中，非人类动物是小鼠，当然本发明不限于此。可以产生一种动物，其中编码融合蛋白的核酸被引入基因组的特定位点，即该核酸与内源基因同源重组。
为了产生这样的同源重组动物，制备一载体，它含有编码融合蛋白的DNA，其5’和3’端被附加的真核基因的核酸包围，并在这里发生同源重组。包围着编码融合蛋白附加的核酸长度足以与真核基因成功地同源重组。典型地，载体中包括几千个碱基的包围DNA(在5’端和3’端)(见例如Thomas，K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell  51：503同源重组载体的描述)。载体引入胚胎干细胞系(例如通过电穿孔)再选择那些引入的DNA与内源DNA发生同源重组的细胞(见例如Li，E等人(1992)Cell  69：915)。选择到的细胞然后注射入动物(例如鼠)的胚细胞中形成集群嵌合体(见例如Bradley.A.在畸形瘤和骨髓干细胞：实用方法，E.J.Robertson编(IRL，牛津1987)113-152页)。然后将嵌合体胚胎移植到适当的假孕雌性抚养动物中让胚胎发育。在种质细胞中携带同源重组DNA的后代可用来繁殖全部细胞均含有同源重组DNA的动物。这些“种系传递”细胞可进一步与带有经操作连到至少一段tet操纵子序列上的基因的动物交配(详细讨论见下面的III小节)。
除了上述同源重组方法，酶协助的点特异性整合体系在本领域已知。可用于本发明的调节体系的组分，将一个DNA分子整合到另一靶DNA分子的特定位置上。此类酶协助的整合体系的例子包括Cre重组酶-lox靶系统(例如见Baubonis，W.和Sauer，B.(1993)核酸研究 21：2025-2029；和Fukushige，S.和Sauer，B(1992)美国国家科学院院刊89：7905-7909)以及FLP重组酶-FRT靶体系(例如见Dang，D.T.和Perrimon.N.(1992)Dev.Genet. 13：367-375；和Fiering，S.等人(1993)美国国家科学院院刊 90：8469-8473)。
III.四环素可诱导的转录激活物调节的靶转录单元
本发明的融合蛋白用于调节靶核苷酸序列的转录。该靶核苷酸序列经操作连到与融合蛋白结合的调节序列。更明确地，该融合蛋白调节经操作连到至少一段tet操纵子序列上的核苷酸序列的表达。相应地，本发明另一方面涉及靶核酸(例如DNA分子)，它含有一段经操作连接到至少一段tet操纵子序列上的待转录核苷酸序列。这种核酸此处称为tet调节的转录单元(或简称转录单元)
在转录单元中，“待转录核苷酸序列”典型地包括本身不转录但(至少部分上)将转录装置为转录定位的最小启动子序列。最小启动子序列沿5’到3’方向以磷酸二酯键连到待转录序列上(即，启动子位于待转录基因上游)形成连续核苷酸序列。相应地，术语“待转录序列”或“靶核苷酸序列”既包括将转录成mRNA的核苷酸序列又包括经操作连接的上游最小启动子序列。术语“最小启动子”指部分启动子序列，它确定待转录的连接上的序列的转录起始位点，但本身即使能够也不足以有效地起始转录。因此，这样的最小启动子的活性依赖于转录激活物(例如本发明的四环素可诱导的融合蛋白)结合到经操作连接的调节序列(例如一段或多段tet操纵子序列)上。在一个实施方案中，最小启动子来源于人类细胞肥大病毒(描述见Boshart等人(1985)Cell  41 521-530)。优选地用约+75到-53位和+75到-31的核苷酸。其它适当的最小启动子在本领域已知，可用标准技术鉴定。例如，激活连续相连的信号基因的转录的功能启动子(例如氯霉素乙酰基转移酶，β-半乳糖苷酸或荧光素酶)可被持续地缺失直到它不能独自激活信号基因的表达而必需附加调节序列存在。
转录单元中，靶核苷酸序列(包括待转录核苷酸序列及其上游最小启动子序列)经操作连到至少一段tet操纵子序列上。在典型的构型中，tet操纵子序列通过磷酸二酯键隔适当距离经操作连到最小启动子序列的上游(即5’)使调节蛋白(例如转录激活物融合蛋白)结合tet操纵子序列后靶核苷酸序列转录。亦即，转录单元从5’到3’方向包括：tet操纵子序列(一个或多个)-最小启动子-待转录核苷酸序列。本领域专业人员均应理解tet操纵子序列(一个或多个)与最小启动子之间容许的距离有一定灵活性，尽管典型地tet操纵子序列在最小启动子上游约200-400碱基对范围内。
含有连在最小启动子上的tet操纵子序列的tet调节的启动子例子的核苷酸序列由SEQ ID NO：8-10给出。SEQ ID NO：8和9的核苷酸序列含有连在10个tet操纵子序列上的细胞肥大病毒最小启动子；两段核苷酸序列的操纵子与第一个转录的核苷酸之间的距离不同。SEQ IDNO：10的核苷酸序列含有连在10个tet操纵子序列上的单纯疱疹病毒最小tk启动子。SEQ ID NO：8的启动子对应PhCMV*-1，描述见Gossen，M.和Bujard，H.(1992)美国国家科学院院刊 89：5547-5551。SEQ ID NO：9的启动子对应PhCMV*-2，描述亦见Gossen，M.和Bujard，H.引述见上。
另外，本领域已发现在待转录序列下游起作用的调节成分，因而tet操纵子序列可能经操纵连到转录核苷酸的下游(即3’)。因此，在这种构型中，转录单元从5’到3’方向包括：最小启动子-转录核苷酸序列-tet操纵子序列(一个或多个)。同样，应当理解tet操纵子序列连到下游的容许距离也可能有一定灵活性。
术语“tet操纵子序列”涵盖所有类型的tet操纵子(例如A、B、C、D和E)。待转录核苷酸序列可以经操作连到单个tet操纵子序列上，或者为了提高调控范围，它可以经操作连到多份tet操纵子序列上(例如二、三、四、五、六、七、八、九、十或更多操纵子序列)。在优选实施方案中，待转录序列经操作连到七个tet操纵子序列上。
tet调节的转录单元可进一步用标准重组DNA技术加入到重组载体(例如质粒或病毒载体)中。转录单元，或包含它的重组载体，可以如上述用标准转染技术引入宿主细胞中。应当理解，将转录单元引入宿主细胞群体中以后，可能有必要选择能表现出tet操纵子相连的核苷酸序列低水平基底表达的宿主细胞克隆(即选择宿主细胞，其中转录单元整合到某一位点，造成tet操纵子相连的核苷酸序列的低水平基底表达)。进一步，可用上述操作流程将tet调节的转录单元引入胚胎期非人类动物的基因组或引入植物细胞中，产生部分或全部细胞带有转录单元的转基因或同源重组生物体。同样应当理解可能有必要选择转基因或同源生物体，其中感兴趣的细胞中tet操纵子相连的核苷酸序列有低水平基底表达。
在一个实施方案中，tet调节的转录单元的靶核苷酸序列编码目的基因。因此，本发明的转录激活物诱导核苷酸序列表达并且得到的mRNA翻译后，在宿主细胞或动物中产生目的基因。备选地，待转录核苷酸序列可以编码活性RNA分子，例如反义RNA分子或核酸酶。宿主细胞或动物中活性RNA分子的表达可用于调节宿主内部功能(例如，通过抑制编码蛋白的mRNA的翻译，阻止感兴趣蛋白的生产)。
本发明的转录激活物可用于调节引入宿主细胞或动物的外源核苷酸序列的转录。“外源”核苷酸序列是一段引入宿主细胞的核苷酸序列，典型地是插入宿主的基因组中。外源核苷酸序列可能在宿主基因组其它部分不存在(例如异己的核苷酸序列)或可能是宿主基因组中存在的多一份的序列，它整合到基因组中另一不同位点，待转录的外源核苷酸序列和经操作连接的tet操纵子序列(一个或多个)可以存在于同一个核酸分子中，再引入宿主细胞或动物。
另外，本发明的转录激活物可用来调节与tet操纵子序列相连的内源核苷酸序列的转录。“内源”核苷酸序列是存在于宿主基因组中的核苷酸序列。内源基因可以通过含tetO重组载体和内源基因序列之间同源重组经操作连到tet操纵子序列上。例如，可制取同源重组载体，它包含至少一段tet操纵子序列和一个最小启动子，后者3’端由代表内源基因的编码区的序列包围，5’端由去除了真正启动子区域的内源基因上游区域的序列包围。包围序列的长度足以保持载体DNA与内源基因成功的同源重组。优选地，同源重组载体中包含几千碱基的包围DNA。载体DNA与宿主细胞中内源基因同源重组后，内源启动子的一个区域被含有经操作连到最小启动子上的一个或多个tet操纵子序列的载体DNA取代。因此，内源基因的表达不再受其内源启动子的控制而是受控于tet操纵子序列和最小启动子。
在另一个实施方案中，tet操纵子序列通过同源重组可以插入内源基因的其它位置，优选地在5’或3’调节区内，以产生一内源基因，其表达受这里描述的四环素调节的融合蛋白的调节。例如，一段或多段tetO序列可以插入内源基因的启动子或增强子区域，而启动子或增强子内能得以保留(即tetO序列引入到启动子/增强子区域的位点对启动子/增强子功能并不十分重要)。改变以后而并不丧失启动子/增强子功能的启动子或增强子的区域在本领域对多种基因都已知道或是可通过分析重要调节区域的标准技术来确定。含有插入非重要调节区域的tetO序列的内源基因仍将保留其以正常的组成性和/或组织特异性方式表达的能力，但也可通过四环素控制的转录抑制蛋白以可控方式减量调节。例如，这样的修饰的内源基因的组成性表达可以用抑制物融合蛋白在四环素(或类似物)存在时抑制，该抑制物融合蛋白在四环素(或类似物)存在时结合到tetO序列上(由下面的N小节和VI小节B部分继续评述)。
A.tet操纵子连接的核苷酸序列的表达调节
tet操纵子连接的核苷酸序列的表达受本发明的转录激活物融合蛋白的调节。因此，融合蛋白和靶核酸都存在于宿主细胞或生物体中。转录激活物融合蛋白与靶转录单位共存于同一宿主细胞或生物体可由许多不同方法实现。例如，用表达体系的核酸(例如编码转录激活物融合蛋白)转染宿主细胞，稳定转染的细胞选择出来然后转染的细胞可以再转染(亦称“超转染”)用的是对应于表达体系另一核酸的核酸(例如待转录的靶核酸)。可用两种不同的选择标记来选择，例如第一种核酸的摄取用G418选择而第二种核酸的摄取用潮霉素选择。备选地，单一细胞群体可用对应于体系两组分的核酸转染。相应地，本发明提供一种核酸组成，它包括：
·第一种核酸编码激活转录的融合蛋白，该融合蛋白含有第一种多肽，该多肽在四环素或四环素类似物存在时结合到tet操纵子序列上并且经操作连到激活真核细胞中转录的第二种多肽上。
·第二种核酸含有经操作连到至少一段tet操纵子序列的待转录核苷酸序列。
在一个实施方案中，两种核酸是两个不同分子(例如两种不同载体)。在此情况下，宿主细胞被两种核酸分子共转染或者先是被一种核酸分子转染然后紧接着被另一种核酸分子转染。在另一实施方案中，两种核酸分子(即共线性地)连在同一分子上(例如单个载体)。这种情况下，宿主细胞被单个核酸分子转染。
宿主细胞可以是体外培养的细胞或体内就有的细胞(例如定向用于基因疗法的细胞)。宿主细胞可进一步是受精卵细胞、胚胎干细胞或其它用于产生非人类转基因或同源重组动物的胚胎细胞。含有表达系统的两种核酸组分的转基因或同源重组动物可以通过将两种核酸导入同样的胚胎期细胞中产生，或者更优选地，在基因组中携带体系的一种核酸组分的动物同基因组中携带体系的另一核酸组分的动物交配，遗传到两种核酸组分的后代可以用标准技术鉴别。
B.两段核苷酸序列表达的协同调节
除了提供一种调节单个转录核苷酸序列的表达的系统，本发明进一步允许经操作连到同一tet操纵子序列的两段核苷酸序列表达的协同调节。相应地，本发明的另一方面涉及用于协同调节两个基因的新的tet调节的转录单元。在该转录单元中，同一tet操纵子序列调节两个经操作相连的核苷酸序列的表达，这两个核苷酸序列从共同的tet操纵子序列以相反方向转录。相应地，一段核苷酸序列经操作连到tet操纵子序列的一边(例如，DNA上链的5’端)而另一段核苷酸序列经操作连到tet操纵子序列的相反一边(例如，DNA上链的3’端)。另外，应当明白待转录的每段核苷酸序列包括一个经操作相连的最小启动子序列，它位于待转录的核苷酸序列和tet操纵子序列之间。
这样的转录单位的代表性例子由图6示意性给出。在该载体中，经操作连到同样tet操纵子序列的两段核苷酸序列，相对于tet操纵子序列的反向转录(即本发明的转录激活物融合蛋白激活后，待转录序列以趋异方式转录)。对于“相对于tet操纵子序列反向转录”指第一段核苷酸序列从DNA一条链上5’到3’转录(例如下面那条链)而第二段核苷酸序列从DNA另一条链5’到3’转录(例如上面那条链)，得到从tet操纵子序列的双向转录。
相应地，本发明提供用于两段核苷酸序列协同调节地双向转录的重组载体。在一个实施方案中，载体包含一段由磷酸二酯键连接的核苷酸序列，它从5’到3’方向包括：
·待转录的第一段核苷酸序列，经操作连接
·至少一段tet操纵子序列，经操作连接
·第二段待转录核苷酸序列其中第一段和第二段核苷酸序列从至少一段tet操纵子序列反向进行(即第一段和第二段核苷酸序列以趋异方式转录)。
在另一实施方案中，载体不包括待转录的第一段和第二段核苷酸序列，而是含有容许将感兴趣的核苷酸序列引入载体的克隆位点。相应地，在此实施方案中，载体包含一段核苷酸序列，它从5’到3’方向包括：
·用于引入待转录的第一段核苷酸序列的第一个克隆位点，经操作连接到
·至少一段tet操纵子序列，经操作连接
·用于引入待转录的第二段核苷酸序列的第二个克隆位点其中引入载体的第一段和第二段核苷酸序列的转录从至少一段tet操纵子序列反向进行。本领域专业人员应当理解这种类型的“克隆载体”也可能包括最小启动子序列，引入第一个克隆位点的第一段核苷酸序列经操作连到第一个最小启动子上而引入第二个克隆位点的第二段核苷酸序列经操作连到第二个最小启动子上。备选地，“克隆载体”可能不包括最小启动子序列，而是包含相连的最小启动子序列的核苷酸序列引入载体的克隆位点。
术语“克隆位点”涵盖至少一个限制性内切酶位点，典型地，多个不同限制性内切酶位点(例如多聚衔接物)包含于核酸中。
在另外一个实施方案中，用于协调两段核苷酸序列的双向转录的载体可以含有待转录的第一个核苷酸以编码检测标记(例如荧光素酶或β-半乳糖苷酶)以及用于引入感兴趣的第二段核苷酸序列的克隆位点。
此处描述的用于在一个载体中协同调节两段待转录的核苷酸序列的两个不同的合适双向启动子区域的核苷酸序列，由图7A和7B给出(分别为SEQ ID NO：6和7)。图7A的结构中，两个最小启动子均来源于CMV启动子。在图7B的结构中，结构上的一个最小启动子来源于CMV启动子，而另一个最小启动子来源于TK启动子。含有本发明的双向启动子的质粒pUHDG 1316-8根据布达佩斯协议于1994年7月8日保藏于德国布朗施威格的德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSM)，保藏号为DSM 9287。
本发明的转录单元用于经操作连到相同tet操纵子序列的两段核苷酸序列的双向转录，对协调两段感兴趣的核苷酸序列的表达很有用。优选地，至少一段待转录核苷酸序列是真核核苷酸序列。在一种应用中，载体用于同一细胞中生产一种异二聚体分子的化学计量量的两个亚基。例如，该载体可用于在同一细胞中生产抗体重链和轻链，或在同一细胞中生产生长因子受体亚基。在另一种应用中，载体用于表达在确立一种特定细胞表现型时相互作用的两个基因产物。在另一种应用中，该载体用来共同表达指示物功能和目的基因，其中指示物用来鉴测目的基因的表达。因此，两种协调表达的序列其一编码目的基因，另一编码检测标记，例如表面标记物或酶(例如β-半乳糖苷酶或荧光素酶)，它们用来选择表达目的基因的细胞。
可用本发明的Tc可诱导转录激活物用四环素(或其类似物)诱导两段协同调节的核苷酸序列的转录来调节两段核苷酸序列的表达。因此，在该体系中，当Tc(或类似物)不存在时两种核苷酸序列的表达都“关”，而Tc(或类似物)存在时表达又“开”。备选地，协同调节两段核苷酸序列的载体可与本领域已知的其它四环素调节的转录因子共同使用。例如，野生型tet阻遏子的转录激活物融合蛋白融合到转录激活结构域上，在Tc(或类似物)不存在时激活基因表达，例如tTA，描述见Gossen，M.和Bujard，H.(1992)美国国家科学院院刊 89：5547-5551，它也可以与该靶转录单元共同用来协同调节。
C.多种核苷酸序列表达的独立调节
本发明进一步允许两段或多段待转录核苷酸序列的独立或反向调节。相应地，本发明的另一方面涉及用于两个或多个基因的独立调节的新型tet调节的转录单元。为了独立调节两段待转录核苷酸序列的表达，一段核苷酸序列经操作连接到一种类型的tet操纵子序列上，另一核苷酸序列经操作连接到另一种类型的tet操纵子序列上。相应地，本发明提供至少一种用于独立调节两段核苷酸序列的转录的重组载体。在一个实施方案中，载体包含：
·经操作连接到至少一段第一种类型的tet操纵子序列上的待转录的第一段核苷酸序列；和
·经操作连接到至少一段第二种类型的tet操纵子序列上的待转录的第二段核苷酸序列。
(应当理解每段待转录的核苷酸序列也包含一段经操作相连的上游最小启动子序列。)两个独立调节的转录单元可能包含于单个载体上，或任选地，在两个不同载体上。含有待转录的核苷酸序列的重组载体可以依前述引入宿主细胞或动物。
在另一实施方案中，载体并不含有待转录的第一段和第二段核苷酸序列，而是含有允许将目的基因引入载体的克隆位点。相应地，在该实施方案中，载体包含：
·引入经操作连接到至少一段第一种类型的tet操纵子序列上的待转录的第一段核苷酸序列的第一克隆位点；和
·引入经操作连接到至少一段第二种类型的tet操纵子序列上的待转录的第二段核苷酸序列的第二克隆位点。该克隆载体可能已经包括经操作分别连接到第一和第二克隆位点的第一和第二最小启动子。备选地，包含着经操作连接上的最小启动子的待转录核苷酸序列可被引入克隆载体。
在另一实施方案中，用于独立调节两段核苷酸序列的载体可能含有经操作连到至少一段第一类型的tet操纵子序列的待转录第一核苷酸，例如编码检测标记或自杀基因，以及引入第二段感兴趣的核苷酸序列的克隆位点，以使其经操作连到至少一段第二种类型的tet操纵子序列。
本领域的专业人员应当理解tet操纵子序列的类型的不同组合可用于独立调节两段核苷酸序列。例如，第一段tet操纵子序列可以是A类，第二段可以是B类；或者第一段tet操纵子序列可以是B类而第二段可以是C类，等等。优选地，所用的两段tet操纵子的一段是B类操纵子。
通过进一步在宿主细胞中引入一个或多个核酸，它们编码两种独立结合不同类型的tet操纵子序列的不同转录激活物融合蛋白，可以在宿主细胞中调节第一和第二段核苷酸序列的独立转录。第一融合蛋白含有一段多肽，当四环素或四环素类似物存在时该多肽结合tet操纵子序列且该多肽经操作连到在真核细胞中激活转录的多肽上(例如，本发明的转录激活物融合蛋白，例如突变的Tn10来源Tet阻遏子连接到VP16激活区域)。第二融合蛋白含有一段当四环素或四环素类似物不存在时结合tet操纵子序列的多肽，它经操作连上一段在真核细胞中激活转录的多肽(例如野生型Tn10来源的Tet阻遏子连上VP16激活区域，诸如tTA，描述见Gossen，M.和Bujard，H.(1992)美国国家科学院院刊 89：5547-5551)。在一个实施方案中，第一融合蛋白结合转录单元中所用的第一类型的tet操纵子序列而第二融合蛋白结合转录单元中所用的第二类型的tet操纵子序列。备选地，在另一实施方案中，第一融合蛋白结合第二类tet操纵子而第二融合蛋白结合第一类tet操纵子。
例如，待转录的第一段核苷酸序列可以连上A类tet操纵子而第一融合蛋白结合A类tet操纵子，待转录的第二段核苷酸序列可以连上B类tet操纵子而第二融合蛋白结合B类tet操纵子。因此，在该实施方案中，当Tc(或其类似物)存在时，激活第一段核苷酸序列的转录而当Tc(或其类似物)不存在时激活第二段核苷酸序列的转录。备选地，在另一实施方案中，第一融合蛋白结合B类操纵子而第二融合蛋白结合A类操纵子。在这种情况下，当Tc(或其类似物)存在时激活第二段核苷酸序列的转录而当Tc(或其类似物)不存在时激活第一段核苷酸序列的转录。用于本体系的适当转录激活物蛋白可根据I小节及Gossen，M.t和Bujard，H.(1992)引述见上的描述来设计。为了抑制同一细胞中两种不同类型的Tet阻遏子融合蛋白之间异二聚化，可能有必要诱变转录激活物融合蛋白之一或二者的二聚化区域。突变可定向于已知涉及二聚化的TetR C末端区域。根据TetR的晶体结构已详细描述了该二聚化区(见Hinrichs，W.等人(1994)Science  264：418-420)。
本体系允许Tc及其类似物对二种基因表达的独立或反向调控。采用不同的Tc类似物作为诱导剂可能进一步使不同序列高水平、低水平或中等水平表达(详细讨论见下面的V小节)。上述的用于独立调节两个基因表达的本发明的新型转录单元可用于下述情况：同一细胞中表达两种基因产物，但需要表达其中一种基因产物而另一基因产物表达被“关闭”，或者反过来。例如，本体系特别适用于在同一宿主细胞中表达治疗基因或自杀基因(即一个编码一种产物的基因，该产物可用于杀灭细胞，诸如蓖麻蛋白或单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶)。在许多基因疗法条件下，需要表达在宿主细胞中用于治疗用途的基因，但当疗程结束时它有能力杀灭宿主细胞。用上述体系，通过将治疗基因连上一种类型的tet操纵子，将自杀基因连到另一种类型的tet操纵子，能实现这一目的。因此，可以用Tc激活宿主细胞中治疗基因的表达(这种情况下自杀基因不表达)。然后，一旦疗程结束，去除Tc，则关闭治疗基因的表达并开启细胞中自杀基因的表达。
D.多段核苷酸序列的混合型协同与独立调节
进一步可能通过综合IIIB小节描述的体系和IIIC小节描述的体系来调节四段核苷酸序列的表达，使两对序列协同调节而一对相对于另一对独立调节。相应地，两个靶转录单元可设计成包括：
·第一核酸从5’到3’方向包括：第一段待转录核苷酸序列，第一种类型的tet操纵子序列，和第二段待转录核苷酸序列，
·第二核酸从5’到3’方向包括：第三段待转录核苷酸序列，第二种类型的tet操纵子序列和第四段待转录核苷酸序列。
第一核酸的第一段和第二段核苷酸序列的转录从第一种类型tet操纵子序列以趋异方式进行。相似地，第二核酸的第三段和第四段核苷酸序列的转录从第二种类型tet操纵子序列以趋异方式进行。因此，第一段和第二段核苷酸序列的表达是协同调节的而且第三段和第四段核苷酸序列的表达也是协同调节的。然而，通过使用两种不同的转录激活物融合蛋白。如上所述，其中一种当Tc(或其类似物)存在时激活转录而另一种当Tc(或其类似物)不存在时激活转录，第一段和第二段序列的表达相对于第三段和第四段序列独立(或反向)调节。一种转录激活物设计成结合第一种类型的tet操纵子而另一种设计成结合第二种类型的tet操纵子。在另一实施方案中，这些转录单元不是已经包含了待转录的第一段、第二段、第三段和/或第四段核苷酸序列，而是含有可引入待转录的第一段、第二段、第三段和/或第四段核苷酸序列的克隆位点。
IV.四环素调节的转录抑制物
本发明的另一方面涉及转录抑制物融合蛋白。本发明的抑制物融合蛋白可类似本发明的转录激活物融合蛋白(见上面的I小节)来构建，不过它不包括一个在真核细胞中激活转录的多肽结构域，而包括一个在真核细胞中抑制转录的多肽结构域。该抑制物融合蛋白用于减量调节经操作连到tetO序列上的基因的表达。例如，当tetO相连的基因引入宿主细胞或动物中，该基因的基底组成性表达可能根据基因所引入的细胞或组织类型及基因整合的位点而不同。备选地，其中引入了tetO序列的内源基因的组成性表达可能令根据其周围其它内源调节序列的强度而变。此处描述的抑制物融合蛋白提供了可用于以可控方式抑制这样的tetO相连基因的表达的组成。
在一个实施方案中，本发明的抑制物融合蛋白包含第一种多肽，它当四环素(Tc)或其类似物不存在而非存在时结合tet操纵子序列并且经操作连到在真核细胞中抑制转录的异源第二种多肽上。在另一实施方案中，抑制物融合蛋白含有第一种多肽，它当四环素存在而非不存在时结合tet操纵子序列并且经操作连到在真核细胞中抑制转录的异源第二种多肽上。术语“异源的”指第二种多肽与第一种多肽来源于不同的蛋白质。与转录激活物融合蛋白相似，转录抑制融合蛋白可用此处描述的标准重组DNA技术制取。
A.转录抑制物融合蛋白的第一种多肽
本发明的转录抑制物融合蛋白部分上包括(i)当四环素(Tc)或其类似物不存在而非存在时，或备选地(ii)当四环素或其类似物存在而非不存在时结合tet操纵子序列的第一种多肽。
优选地，在前面实施方案中，第一种多肽是野生型Tet阻遏子(它当Tc不存在而非存在时结合tet操纵子序列)。任何一种类型的野生型Tet阻遏子(例如A、B、C、D或E)可用作第一种多肽。优选地，野生型Tet阻遏子是Tn10来源的Tet阻遏子。野生型Tn10来源的Tet阻遏子的核苷酸序列和氨基酸序列分别由SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17给出。
备选地，在后者实施方案中，第一种多肽是突变型Tet阻遏子，描述见I小节A部分(当Tc存在时而非不存在时它结合tet操纵子序列)。任何一种类型的突变型Tet阻遏子(例如A、B、C、D或E)可用作第一种多肽。优选地，突变型Tet阻遏子是Tn10来源的阻遏子，在位置71、95、101和/或102有一个或多个氨基酸替换。突变型Tn10来源的Tet阻遏子的核苷酸和氨基酸序列分别由SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19给出。
B.转录抑制物融合蛋白的第二多肽
转录抑制物融合蛋白的第一种多肽经操作连到在真核细胞中直接或间接抑制转录的第二种多肽上。如上面I小节所述，要经操作将融合蛋白的第一种和第二种多肽连接起来，典型的编码第一种和第二种多肽的核苷酸序列在框连接到一起生成编码融合蛋白的嵌合体基因。然而，第一种和第二种多肽可用其它方法经操作连起来仍保留各种多肽的功能(例如化学交联)。尽管此处描述的典型的融合蛋白的第一种多肽在融合蛋白的氨基端而第二种多肽在融合蛋白的羧基端，本领域的专业人员应当理解本发明也可采用相反的取向(即第二种多肽在氨基端而第一种多肽在羧基端)。
在真核细胞中抑制转录的蛋白质和蛋白质中多肽结构域在本领域已见描述(综述见例如，Renkawitz，R.(1990)遗传学动态 6：192-197；以及Herschbach，B.M.和Johnson，A.D.(1993)细胞生物学研究年鉴 9：479-509)。本领域称这样的转录抑制物结构域为“抑制结构域”或“阻遏子结构域”。尽管许多多肽结构域抑制转录的确切机制并不清楚(本发明也不受机制的限制)，阻遏子结构域可能有几种方式来抑制转录，包括：1)竞争性抑制激活物蛋白或通过转录装置的结合，2)阻止DNA结合激活物的活性3)对通用转录装置的功能性预起始复合物的装配的负干扰。因此，阻遏子基因可能对转录装置有直接抑制作用或者可能通过抑制激活物蛋白的活性来间接抑制转录。相应地，术语“在真核细胞中抑制转录的多肽”在此处的用法包括直接或间接抑制转录的多肽。此处，“抑制”转录指与转录抑制物蛋白调节以前转录水平或量相比靶基因的转录水平或量下降。转录抑制可以是部分的或完全的。术语“抑制子”，“阻遏子”和“抑制物”在此处通用，指抑制转录的调节蛋白或其结构域。
此处描述的转录“阻遏子”或“抑制子”结构域指的是一种多肽结构域，当该结构域转移到异源蛋白上仍保留其转录抑制物功能。已表明含有当转移到异源蛋白中仍起作用的阻遏子结构域的蛋白质包括v-erbA致癌基因产物(Baniahmad，A.等人(1992)EMBO J. 11：1015-1023)。胸腺激素受体(Baniahmad，引文见上)、视黄酸受体(Baniahmad，引文见上)和果蝇Krueppel(Kv)蛋白(Licht，J.D.等人(1990)Nature  346：76-79；Sauer，F.和Jackle，H.(1991)Nature  353：563-566；Licht，J.D.等人(1994)分子细胞生物学 14：4057-4066)，其它在真核细胞中具有转录抑制物活性的蛋白的非限制性例子包括果蝇homeodomain蛋白even-skipped(eve)，酿酒酵母Ssn6/Tup1蛋白复合物(见Herschbach和Johnson，引文见上)。酵母SIR1蛋白(见Chien等人(1993)Cell  75：531-541)，NeP1(见Kohne等人(1993)分子生物学杂志 232：747-755)，果蝇dorsal蛋白(见Kirov等人(1994)分子细胞生物学 14：713-722；Jiang等人(1993)EMBO  J. 12：3201-3209)，TSF3(见Chen等人(1993)分子细胞生物学13：831-840)，SF1(见Targa等人(1992)生物化学生物物理研究通讯 188：416-423)，果蝇hunchback蛋白(见Zhang等人(1992)美国国家科学院院刊 89：7511-7515)，果蝇Knirps蛋白(见Gerwin等人(1994)分子细胞生物学 14：7899-7908)，WT1蛋白(Wilm氏肿瘤基因产物)(见Anant等人(1994)Oncogene  9：3113-3126；Madden等人(1993)Oncogene  8：1713-1720)，Oct-2.1(见Lillycrop等人(1994)分子细胞生物学 14：7633-7642)，果蝇engrailed蛋白(见Bodiani等人(1994)Genes Rev  8：770-782；Han和Manley，(1993)EMBO J. 12：2723-2733)，E4BP4(见Cowell和Hurst，(1994)核酸研究 22：59-65和ZF5(见Numoto等人(1993)核酸研究 21：3767-3775)。
在优选实施方案中，本发明的转录抑制物融合蛋白的第二种多肽是果蝇Krueppel蛋白的转录抑制子结构域。可以采用具有阻遏子活性的C末端区域，诸如天然蛋白的403-466氨基酸(见Sauer，F.和Jackle，H.引文见上)。该区域称为C64KR。C64KR的核苷酸序列和氨基酸序列分别由SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21给出。实施例4描述如何构建编码TetR-C64KR融合蛋白的表达载体，备选地，可以采用具有阻遏子活性的富丙氨酸Kr氨基末端区域作融合蛋白的第二种多肽。例如，Kr的26-110氨基酸(见Licht，J.D.等人(1990)引文见上)可用作第二种多肽。备选地，涵盖了Kr抑制子结构域二者中任一个并且仍保留部分或全部抑制活性的短的或长的多肽片段也在考虑之列(例如N末端抑制子结构域的62到92氨基酸，见Licht等人(1994)引文见上)。
在另一优选实施方案中，本发明的转录抑制物融合蛋白的第二种多肽是v-erbA致癌基因产物的转录抑制子结构域。v-erbA的抑制子结构域定位约对应于天然v-erbA致癌基因产物的362-632核苷酸残基(见Baniahmad等人，引文见上)。相应地，涵盖该区域的片段用作抑制子结构域的第二种多肽，在一个实施方案中用天然v-erbA蛋白的364-635氨基酸残基。v-erbA该区域的核苷酸和氨基酸序列由SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23分别给出。实施例5描述如何构建编码TetR-v-erbA融合蛋白的表达载体。备选地，涵盖v-erbA抑制子区域仍保留全部或部分抑制活性的短的或长的多肽片段也在考虑之列。例如v-erbA的346-639，362-639，346-632，346-616和362-616氨基酸残基也可使用。另外，具有内部缺失仍保留全部或部分抑制活性的涵盖该区域的多肽片段也在本发明范围内，例如v-erbA的362-468/508-639氨基酸残基。而且，融合蛋白可包括两拷贝或更多拷贝的抑制子结构域，诸如两拷贝的v-erbA 362-616氨基酸残基。适当的v-erbA的抑制子多肽结构域由Baniahmad，A.等人进一步描述(引文见上)。
在另一实施方案中用其它的抑制子结构域，可用的多肽结构域的非限制性例子包括：胸腺激素受体α(THRα)的120-140氨基酸残基，视黄酸受体α(RARα)的143-403氨基酸残基，Knirps的186-232氨基酸残基，WT1的N末端区域(见Anant引文见上)，Oct-2.1的N末端(见Lillycrop引文见上)，E4BP4的65氨基酸结构域(见Cowall和Hurst引文见上)，和ZF5的N末端锌指结构域(见Numoto，引文见上)。另外，涵盖这些区域并仍保留全部或部分抑制物活性的短的或长的多肽片段也在考虑之列。
除了前述转录抑制物结构域，可用标准技术鉴别的新的转录抑制物结构域也在本发明的范围内。多肽的转录抑制物活性可用下述方法检测：1)构建一个表达载体，它编码的受测抑制子多肽连接到另一具有DNA结合活性的多肽上(即：构建一个DNA结合结构域-抑制子结构域融合蛋白)，2)将该表达载体同一标记基因结构共转染宿主细胞，该结构通常在宿主细胞中组成性表达并且也含有DNA结合结构域的结合位点，3)确定因为融合蛋白在宿主细胞中表达而被抑制的标记基因结构的转录量。例如，本领域的标准检测方法利用GAL4 DNA结合结构域(例如氨基酸残基1-147)和受测抑制子结构域的融合蛋白。该融合蛋白然后用来抑制含有正调控序列(正常情况下激活组成性转录)和GAL4结合位点(见例如Baniahmad，引文见上)的标记基因结构的表达。
C.转录抑制物融合蛋白的第三多肽
除了Tet阻遏子和转录抑制子结构域，本发明的转录抑制物融合蛋白可以包含经操作相连的第三种多肽，它促进融合蛋白向细胞核的转运。如同对转录激活物融合蛋白的描述(见上面的I小节C部分)，核定位信号可加入到转录抑制物融合蛋白中。
D.转录抑制物融合蛋白的表达
编码本发明的转录抑制物融合蛋白的核酸分子可以加入到重组表达载体中并引入宿主细胞，在宿主细胞中表达融合蛋白，其描述见上面的II小节A，B和C部分。优选地，表达本发明的转录抑制物融合蛋白的宿主细胞还携带tet操纵子相连的目的基因(即待转录的靶核苷酸序列)。
在其细胞中表达转录抑制物融合蛋白的转基因动物可根据上面的II小节D部分的描述来获得。另外，在其细胞中表达转录抑制物融合蛋白的同源重组生物体也被本发明涵盖并可根据上面的II小节E部分的描述获得。本发明提供适于同源重组的重组表达载体。在一个实施方案中，这样的表达载体含有编码本发明的转录抑制物融合蛋白的核酸分子，它在5’和3’端被附加的真核基因核酸包围，附加的核酸长度足够与真核基因成功地同源重组。得到表达本发明调节体系组分的同源重组生物体的载体和方法及其应用。进一步由美国专利申请系列号88/260,452详述。优选地，本发明的在其细胞中表达转录抑制物融合蛋白的转基因或同源重组生物体也在其细胞中携带tet操纵子相连的目的基因(即待转录的靶核苷酸序列)。
V.本发明的试剂盒
本发明的另一方面涉及含有本发明的可诱导调节体系组分的试剂盒。这样的试剂盒可用于调节能克隆到靶转录单元中的目的基因(即待转录的感兴趣核苷酸序列)的表达。该试剂盒可能包括编码转录激活物融合蛋白或转录抑制物融合蛋白或二者都有的核酸。另外，本试剂盒也可能提供含有编码转录激活物和/或抑制物融合蛋白的核酸的真核细胞，这些核酸稳定地掺入细胞中从而在真核细胞中表达转录激活物和/或抑制物融合蛋白。
在一个实施方案中，该试剂盒包括一种运载工具，其中紧邻地有至少两个容纳工具(container meens)：第一个容纳工具含有编码本发明的转录激活物融合蛋白的第一种核酸(例如DNA)(举例来说，编码第一种多肽的重组表达载体，当四环素存在时它结合tet操纵子序列，该多肽经操作连接到在真核细胞中激活转录的第二种多肽上)，第二个容纳工具含有转录激活物的第二种靶核酸，感兴趣的核苷酸序列可以克隆于其中。第二种核酸典型地一个用于引入待转录核苷酸序列(可选地包括一段经操作相连的最小启动子序列)的克隆位点和至少一段经操作相连的tet操纵子序列。术语“克隆位点”包括至少一个限制性内切酶位点。典型地，核酸内有多个不同的限制性内切酶位点(例如，多聚衔接物)。
为了利用本试剂盒的组分调节感兴趣的核苷酸序列的表达，用常规重组DNA技术将该核苷酸序列克隆到本试剂盒的靶载体的克隆位点上，然后第一和第二核酸引入宿主细胞或动物中。在宿主细胞或动物中表达的转录激活物融合蛋白然后当诱导剂(Tc或其类似物)存在时调节感兴趣核苷酸序列的转录。
另外，在另一实施方案中，本试剂盒包括一种真核细胞，它被编码本发明的转录激活物融合蛋白的核酸稳定地转染以使转录激活物在细胞中表达。因此，不仅只包含核酸，上述第一种容纳工具也可包括一种真核细胞系，编码转录激活物的第一种核酸被稳定地引入其中(例如用磷酸钙沉淀或电穿孔等常规方法稳定地转染)。在该实施方案中，目的核酸序列克隆到本试剂盒靶载体的克隆位点上，然后将靶载体引入表达转录激活物融合蛋白的真核细胞中。
备选地或附加地，用于协同调节两段核苷酸序列表达的本发明的重组载体也可加入到本发明的试剂盒中。试剂盒包括的载体可以容许将两段目的核苷酸序列引入载体中。因此，在另一实施方案中，本发明的试剂盒包括1)编码本发明的转录激活物融合蛋白的第一核酸(或一种真核细胞，该核酸稳定地引入其中)和2)包含一段核苷酸序列的第二核酸，该核苷酸序列从5’到3’方向包括：用于引入第一段感兴趣核苷酸序列的第一个克隆位点，经操作连到至少一段tet操纵子序列上，再经操作连到用于引入第二段感兴趣核苷酸序列的第二个克隆位点上。其中第一段和第二段核苷酸序列从至少一段tet操纵子序列以相反方向进行转录。可选地，该载体可包括经操作相连的最小启动子序列。在另一实施方案中，载体可能含有一段待转录核苷酸序列(例如编码一种检测标记，如荧光素酶，β-半乳糖苷酶或(AT)和一个用于导入待转录的第二段感兴趣核苷酸序列的克隆位点。
用于独立调节两段待转录的核苷酸序列的表达的本发明的转录单元和转录激活物也可加入本发明的试剂盒中，靶转录单元可以允许将待转录的感兴趣核苷酸序列引入靶转录单元中。因此，在另一实施方案中，本发明的试剂盒包括1)编码当Tc或其类似物存在时结合第一种类型的tet操纵子的转录激活物的第一核酸，2)含有一个用于导入待转录的第一段核苷酸序列的克隆位点的第二核酸，它经操作连到至少一段第一种类型的tet操纵子上，3)编码当Tc或其类似物不存在时结合第二种类型的tet操纵子的转录激活物的第三核酸，4)含有用于引入待转录的第二段核苷酸序列的第二个克隆位点的第四核酸(可选地，第二和第四核酸包括最小启动子序列)。在另一实施方案中，一段待转录核苷酸序列(例如编码自杀基因)已经存在于第二或第四核酸中。在另一个实施方案中，编码转录激活物的核酸(例如，上述第一和第三核酸)已经稳定地引入本试剂盒提供的真核细胞系中。
在另一实施方案中，本发明的试剂盒包含第一容纳工具，它包括编码本发明的转录抑制物融合蛋白的第一核酸(例如该融合蛋白只当Tc存在时或只当Tc不存在时抑制真核细胞中的转录)，以及第二容纳工具，它包括含有用于引入待转录核苷酸序列的克隆位点的第二核酸，经操作连接到至少一段tet操纵子序列上。本试剂盒可以进一步包括第三核酸，它编码的转录激活物融合蛋白仅当Tc存在时或仅当Tc不存在时结合tetO序列。备选地，第一和/或第三核酸(即编码抑制物或转录激活物融合蛋白)可以稳定地加入本试剂盒提供的真核宿主细胞中。
在另外一个实施方案中，本发明的试剂盒可以包括至少一个四环素或四环素类似物。例如，该试剂盒可以包括一种容纳工具，包括四环素，脱水四环素，强力霉素，环氧四环素或此处描述的其它四环素类似物。
VI.用四环素或其类似物调节基因表达
A.用转录激活物融合蛋白激活基因表达
在携带编码本发明的转录激活物融合蛋白的核酸和经操作连接到tet操纵子序列的核苷酸序列(即待转录目的基因)的宿主细胞中，当诱导剂四环素或其类似物不存在时，经操作连接到tet操纵子序列上的核苷酸序列并不高水平转录。该核苷酸序列的基底转录水平可能依据宿主细胞和序列整合位点而变，但当Tc不存在时，基底转录水平通常很低甚至检测不出来。为了诱导宿主细胞中的转录，宿主细胞与四环素或四环素类似物接触。相应地，本发明的另一方面涉及在真核细胞或动物中激活核苷酸序列转录的方法，该序列经操作连接到tet操纵子序列上并且表达本发明的转录激活物融合蛋白。该方法涉及将细胞接触四环素或四环素类似物或是将四环素或四环素类似物施用给含有该细胞的动物。
术语“四环素类似物”包括结构上与四环素有联系且与Tet阻遏子结合的Ka至少为约106M-1的化合物。优选地，四环素类似物结合的亲和性为约109M-1或更大。这样的四环素类似物的例子包括但不限于脱水四环素，强力霉素，氯四环素，土霉素及其它。描述见Hlavka和Boothe，“四环素”，《实验药理学手册78》，R.K.Blackwood等人(编者)，Springer出版社，Berlin-New York.1985；L.A.Mitscher“四环素抗生素化学”，医学研究9，Dekkcr，纽约1978；Noyee开发公司“四环素生产方法”，化学方法综述，Park Ridge，NJ，2卷，1969；R.C.Evans，“四环素技术”，生物化学参考系列1，Quadrangle Press，纽约，1968；以及H.F.Dowling，“四环素”，抗生素论文集，no.3，医学百科全书，纽约，1955。优选的高水平激活转录的Tc类似物是脱水四环素和强力霉素。可以选用比Tc抗生素活性降低的Tc类似物。这类Tc类似物的例子有脱水四环素、环氧四环素和氯四环素。
为降低体外细胞内基因表达，将细胞培养于含Tc或Tc类似物的培养基使细胞接触这些化合物。当Tc或Tc类似物存在时体外培养细胞，诱导剂优选的浓度范围是约10到约1000ng/ml。可以将Tc或Tc类似物直接加到已培养细胞的培养基，或是更优选地，为高水平诱导基因，细胞从不含Tc的培养基中收集出来再在含有Tc或其类似物的新鲜培养基中培养。
为了降低体内基因表达，通过将Tc或其类似物施用于受试者，使受试者的细胞接触这些化合物。术语“受试者”包括人和其它非人类动物，如猴、牛、山羊、绵羊、狗、猫、兔、大鼠、小鼠及其转基因或同源重组生物。并且，术语“受试者”包括植物，如转基因植物。当诱变剂施用给人或动物受试者时，剂量调节到优选地使血清浓度在约0.05到1.0μg/ml之间。可以通过任何有效地达到体内浓度足够基因诱导的手段将Tc或Tc类似物施用给受试者。适当的给药方式的例子包括口服(例如将诱导剂溶解于饮用水中)，缓慢释放片剂和植入扩散泵。为了将Tc或Tc类似物施用给转基因植物，诱导剂可以溶于水再施用给植物。
本体系可使用不同的Tc类似物作为诱导剂的能力使得可以细调tet操纵子相连的核苷酸序列的表达水平。如实施例2显示，发现脱水四环素和强力霉素是强诱导剂。典型地靶序列转录增加1000-2000倍，诱导因子也可达到20,000倍。发现四环素氯四环素和土霉素是弱诱导剂，即靶序列诱导增加约10倍左右。因此，根据所需基因表达诱导水平选合适的四环素类似物作诱导剂。也可以通过改变Tc类似物作诱导剂来随时间改变宿主细胞或动物中基因表达的水平。例如，某些情况下在开始时需要基因表达的骤增然后是持续的低水平基因表达。相应地，在开始时可以用高水平激活转录的类似物作诱导剂然后诱导剂改为低水平激活转录的类似物。而且，当调节多个核苷酸序列表达时(例如，一段序列由一种类型的tet操纵子序列调节而另一段序列由另一类型的tet操纵子序列调节，其描述见上面的III小节C部分)，可能根据用哪种转录激活物融合蛋白来调节转录和用哪种Tc类似物作诱导剂来独立改变各序列的表达水平。不同的转录激活物融合蛋白可能对Tc类似物表现不同响应水平。可以用这里描述的(见实施例2)技术来确定转录激活物融合蛋白和诱导剂(Tc或Tc类似物)的特点组合诱导基因表达的水平。另外，可以通过改变诱导剂的浓度来细调基因表达水平。因此，本发明的表达系统提供的机制不仅能开启或关闭基因表达，而且能根据所用的诱导剂的类型和浓度在中等水平上“细调”基因表达水平。
B.用转录抑制物融合蛋白抑制基因表达
本发明还提供用本发明的转录抑制物融合蛋白抑制基因表达的方法。这些方法可以用来减量调节tetO相连的目的基因的基底、组成性或组织特异性转录。例如，经操作连到tetO序列上的目的基因，和附加的正调节成分(例如组成性或组织特异性增强子序列)将以一定水平在宿主细胞中表达，该水平主要由宿主细胞中正调节成分的强度决定。另外，经操作连到tetO序列上的目的基因和仅有的一段最小启动子序列根据宿主细胞或组织和/或序列整合位点表现不同程度的基底水平转录。在含有这样的靶序列并表达本发明的抑制物融合蛋白的宿主细胞中，可以通过改变与宿主细胞接触的Tc(或类似物)的浓度以可控的方式减量调节靶序列的转录。例如，若当Tc不存在时抑制物融合蛋白结合tetO，与宿主细胞接触的Tc的浓度降低到抑制靶基因的表达。优选地，当Tc不存在时培养宿主细胞以保持靶基因表达受阻遏。相似地，不对宿主生物体施用Tc来保持靶基因表达受阻遏。备选地，若当Tc存在时抑制物融合蛋白结合tetO，增加与宿主细胞接触的Tc浓度来抑制靶基因的表达。例如，Tc加到宿主细胞的培养基中或将Tc给药给宿主生物体来抑制靶基因的表达。
此处描述的抑制物融合蛋白抑制tetO相连的目的基因，其中tetO序列定位于最小启动子序列的5’(例如，上面III小节描述的四环素调节的转录单元)。另外，可以用抑制物融合蛋白来抑制目的基因的表达，其中tetO相连序列位于启动子序列的3’端，转录起始位点的5’端。更进一步，该抑制物融合蛋白可用于抑制目的基因的表达，其中tetO相连序列位于转录起始位点的3’。
上面的VI小节A部分描述不同的Tc类似物并兼顾类似地可用来调节抑制物融合蛋白活性的转录激活物融合蛋白。另外，VI小节A部分描述的用Tc(或类似物)体外培养的方法和通过体内施用Tc(或类似物)的方法同样适用于转录抑制物融合蛋白。
C.基因表达的组合型正调控和负调控
除了单独用转录激活物或抑制物融合蛋白调节基因表达，可以组合使用两种类型的融合蛋白，使宿主细胞中一个或多个靶基因表达既有正调控又有负调控。因此，i)当Tc不存在时，或ii)当Tc存在时结合tetO的转录抑制物蛋白可与i)当Tc不存在时，或ii)当Tc存在时结合tetO的转录激活物蛋白组合使用。当Tc不存在时结合tetO的转录激活物蛋白(例如野生型TetR激活物融合蛋白)由USSN 08/076,726，USSN 08/076,327和USSN 08/260,452进一步详细描述。当Tc存在时结合tetO的转录激活物融合蛋白(例如突变型TetR激活物融合蛋白)由此处(见上面I小节)和USSN 08/270,637和USSN 08/275,876描述。转录抑制物融合蛋白在此处IV小节描述。
如同上面III小节C部分描述的，若不止一个tetR融合蛋白在宿主细胞或生物体内表达可能要采取附加步骤来抑制不同TetR融合蛋白的异二聚化。例如，含一种类型的TetR的转录激活物可以与含有不与第一种类型TetR异二聚化的另一种类型的TetR的转录抑制物混和使用。备选地，可以诱变涉及二聚化的TetR的氨基酸序列以抑制异二聚化。然而，即使在宿主细胞中转录激活物和转录抑制物融合蛋白发生一些异二聚化，也应当产生足够量的同二聚体有足够有效的正调节和负调节。
本领域的专业人员应当理解，激活物和抑制物蛋白的不同组合，根据此处的讲授，可用来既正调控又负调控单个的tetO相连的目的基因，或协同地调节多个tetO相连的目的基因或独立地调节多个tetO相连的目的基因。所用的确切调节成分依赖待转录基因和所需的转录类型。下面进一步描述怎样组合使用转录激活物和抑制物融合蛋白的几个非限制性例子。然而，根据此处的讲授本领域专业人员应知道会有许多其它的可能组合，它们也被包括在本发明的范围内。
在优选实施方案中，如图10所示，利用仅当四环素或其类似物不存在时结合tetO的抑制物融合蛋白(称为四环素控制的抑制子结构域，或tSD)和仅当四环素或其类似物存在时结合tetO的激活物融合蛋白(称为反式四环素控制的转录激活物，或rtTA)的组合在宿主细胞既正调控又负调控tetO相连的感兴趣靶基因的表达。除了tetO序列，靶基因连接到启动子上，还可能包含其它使基因在宿主细胞中以基底水平组成性转录的正调节成份(例如增强子序列)。当四环素或类似物(例如强力霉素)不存在时tSD结合tetO序列会抑制目的基因的基底组成性转录，因而保持目的基因被阻遏直到需要基因表达为止。当需要基因表达时，增大与宿主细胞接触的四环素或类似物(例如强力霉素)的浓度。加药后，tSD失去结合tetO序列的能力而先前未结合的rtTA获得了结合tetO序列的能力。结果rtTA结合连接目的基因的tetO序列因而激活目的基因的转录。如前所述，四环素或类似物的浓度，所用Tc类似物的类型，诱导的持续时间等均可控制表达水平。应当理解，也可用融合蛋白的相反组合(即当药物存在时抑制物结合，当药物不存在时激活物结合)。在此情况下，通过使宿主细胞接触药物(例如加Tc或类似物培养)保持目的基因的表达受抑制，而去除药物又激活基因表达。
在另一实施方案中，上文所述的激活物和抑制物融合蛋白组合使用以协同地正调控或负调控两个目的基因，使用的是上面III小节B部分描述的双向tetO相连的转录单元。在这种情况下，基因1和基因2连到相同的tetO序列上，但取向相反。抑制物融合蛋白用来协同地阻遏基因1和基因2的基底水平转录，而转录激活物融合蛋白用来协同地激活基因1和基因2的表达。
在另外一个实施方案中，用上面III小节C部分描述的tetO相连的转录单元用激活物和抑制物融合蛋白独立地调节两个或多个目的基因。例如，当Tc或类似物存在时结合一种类型的tetO序列(例如A类)的转录激活物融合蛋白与也是当Tc或类似物存在时结合另一种类型的tetO序列(例如B类)的抑制物融合蛋白。在宿主细胞中，基因1连着A类tetO序列而基因2连着B类tetO序列，当药物不存在时两种基因都以基底水平表达，加药物后激活基因1的表达而抑制基因2的表达。
另外，在另一实施方案中，当Tc或类似物存在时转录激活物结合一种类型的tetO序列(例如A类)。而当Tc或类似物不存在时抑制物融合蛋白结合另一种不同类型的tetO序列(例如B类)。在上段描述的宿主细胞中，当药物不存在时基因1以基底水平表达，加药后激活其表达。而基因2当药物不存在时被阻遏，加药后以基底水平表达。对专业人员来说，很明显有其它不同的可能组合。如I小节A部分所述可制取结合不同类型tetO序列的转录激活物和抑制物融合蛋白。如III小节C部分所述可以制取含有不同类型tetO序列的靶转录单元。
VII.本发明的应用
本发明可广泛应用于多种情况，这需要能够开启和关闭基因表达，或迅速、有效、可控又不会造成多重效果及细胞毒性地调节基因表达水平。因此，本发明的体系广泛应用于研究真核细胞、植物和动物中细胞发育和分化。例如，可以可控地调节细胞中致癌基因的表达来研究其功能。另外，本体系可用来调节位点特异性重组酶如CRE或FLP的表达从而在特定的发育阶段在可控条件下不可逆地修饰转基因生物体的基因型。例如，可用Tc调节的位点特异性重组酶不可逆地去除插入转基因植物基因组中用于选择特定转基因植物的药物抗性标记。本发明的调节体系的其它应用包括：
A.基因治疗
本发明特别适用于基因治疗用途，治疗遗传性或获得性疾病。基因治疗的一般方法包括将核酸导入细胞，在细胞中生产被导入的遗传物质编码的一种或几种基因产物，来恢复或增强某一功能活性。有关基因治疗方法的综述见Anderson，W.F.(1992)Science 256：808-813；Miller，A.D.(1992)Nature 357：455-460；Friedman，T.(1989)Science 244：1275-1281；以及Cournoyer，D.等人(1990)当代生物技术观念，1：196-208。不过，现今的基因疗法载体典型地利用对外源转录因子有响应的组成性调节成分。这些载体体系没有能力在受试者中细调基因表达水平。与之形成对照的是，本发明的可诱导调节体系具备这种能力。
将本发明的体系用于基因治疗用途，在一个实施方案中，要接受基因治疗的受试者细胞经修饰，包含1)编码本发明的转录激活物融合蛋白的核酸，以适于在宿主细胞中表达转录激活物，2)经操作连接到tet操纵子序列上的目的基因(例如用于治疗用途)。受试者的细胞可以在体外修饰然后引入受试者或者可直接在体内修饰细胞(细胞修饰方法的描述见上面的II小节)。通过施用Tc或Tc类似物给受试者来激活受试者细胞中目的基因的表达。依据用何种Tc类似物作诱导剂可改变基因表达的水平。通过调整给患者的四环素或其类似物的剂量从而调整循环系统及感兴趣组织中药物浓度来细调基因表达水平。
另外，在另一实施方案中用转录抑制物融合蛋白进一步调整目的基因的表达水平。例如，可修饰受试者的细胞使其含有编码当Tc不存在时结合tetO的转录抑制物融合蛋白的核酸。该核酸适于在宿主细胞中表达抑制物融合蛋白。因此，在给受试者施用Tc(或类似物)之前，目的基因的基底水平转录被抑制物融合蛋白保持抑制。加入Tc后，抑制物融合蛋白结合tetO被抑制而转录激活物蛋白的结合被诱导，从而激活目的基因的转录。图10示意地描绘了用本发明的转录激活物融合蛋白和转录抑制物蛋白对基因表达的组合型正调控与负调控。
本领域的常规检测方法，例如酶联免疫吸附检测，可用来监控宿主细胞中被调节的感兴趣蛋白质的表达并可改变Tc或Tc类似物的浓度直到感兴趣蛋白质的表达达到所需要的水平。相应地，可根据个人的医疗需要调整目的基因的表达，这种需要在个人的一生中可能变化。停止诱导剂的给药即可停止受试者细胞中目的基因的表达。因此，本发明的调节体系比组成性调节体系有一个优点，即可根据治疗条件的需要细调基因表达的水平。
用于治疗遗传性或获得性疾病而在受试者细胞中表达的特别令人感兴趣的基因，它们编码产物包括腺嘌呤脱氨酶、VIII因子、IX因子、dystrophin、β-球蛋白、LDL受体、CFTR、胰岛素、促红细胞生成素、抗血管形成因子、生长激素、葡萄糖脑苷酶、β-葡糖苷酶、α1-抗胰蛋白酶、苯丙氨酸水解酶、酪氨酸水解酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨酰琥珀酸合成酶、UDP葡糖醛酸转移酶、apoA1、TNF、可溶性TNF受体、白介素(例如IL-2)、干扰素(例如α-或γ-IFN)和其它细胞因子及生长因子。经修饰可用于基因疗法用途的细胞类型包括造血干细胞、成骨细胞、肝细胞、白细胞、皮肤上皮和气管上皮。用于基因疗法的细胞类型。基因及方法的进一步描述见例如Wilson，J.M等人(1988)美国国家科学院院刊 85：3014-3018；Armentano，D.等人(1990)美国国家科学院院刊 87：6141-6145；Wolff，J.A.等人(1990)Science  247：1465-1468；Chowdhury，J.R.等人(1991)Science  254：1802-1805；Ferry，N.等人(1991)美国国家科学院院刊 88：8377-8381；Wilson，J.M.等人(1992)生物化学杂志 267：963-967；Quantin，B.等人(1992)美国国家科学院院刊 89：2581-2584；Dai，Y等人(1992)美国国家科学院院刊 89：10892-10895；van Beusechem，V.W.等人(1992)美国国家科学院院刊 89：7640-7644；Rosenfeld，M.A.等人(1992)Cell68：143-155；Kay，M.A.等人(1992)人类基因治疗3：641-647；Cristiano，R.J.等人(1993)美国国家科学院院刊 90：2122-2126；Hwa，P.等人(1993)免疫学杂志 150：4104-4115；以及Herz，J.和Gerard，R.
D.(1993)美国国家科学院院刊 90：2812-2816。
在癌症治疗中特别令人感兴趣的基因疗法应用包括：肿瘤渗透白细胞中细胞因子基因(例如TNF-α)的过表达或肿瘤细胞中细胞激动素的异位表达来在肿瘤位置诱发抗肿瘤免疫反应。肿瘤细胞中一种能将非毒性药剂转化成毒性药剂的酶的表达，肿瘤特异性抗原的表达来诱导抗肿瘤免疫反应，肿瘤细胞中肿瘤抑制物基因(例如p53或Rb)的表达，骨髓细胞中多重抗药性基因(例如MDR1和/或MRP)的表达来保护这些细胞免受化疗毒性。
在治疗病毒引起的疾病中特别令人感兴趣的基因疗法应用包括反式显性阴性病毒转录激活蛋白的表达。例如对HIV的反式显性阴性tat和rev突变体，或对HSV的反式显性ICp4突变体(见例如Balboni，P.G.等人(1993)病毒医学杂志 41：289-295；Liem.S.E等人(1993)人类基因治疗 4：625-634；Malim，M.H.等人(1992)实验医学杂志 176：1197-1201；Daly，T.J等人(1993)生物化学 32：8945-8954；以及Smith，C.A.等人(1992)病毒学 191：581-588)，反式显性阴性外壳蛋白的表达，例如对HIV的env突变体(见例如Steffy，K.R.等人(1993)病毒学杂志 67：1854-1859)，针对病毒产物的抗体或其片段的细胞内表达(“内免疫”，见例如Marasco.W.A.等人(1993)美国国家科学院院刊 90：7889-7893)以及可溶病毒受体的表达，例如可溶性CD4。另外，本发明的体系可以在某些情况下用来在细胞中表达自杀基因，从而使细胞在完成其预定的功能后被消除。例如，可以通过对受试者给药Tc或Tc类似物诱发细胞中自杀基因的表达使受试者产生免疫反应后将免疫用的细胞从受试者中除去。
本发明的Tc控制的调节体系有许多有利的特性使其特别适用于基因疗法。例如，本体系提供基因表达的“开启/关闭”开关能调节受试者体内某一基因产物的剂量。许多情况下，需要可控地在特定水平和/或时间上提供基因产物，而不是简单地让基因产物在预定水平上组成性表达。例如，可以在固定的时间间隔(例如每目、隔日、每周等)“开启”目的基因，从而在最有效的时间提供最有效水平的目的基因产物，可用标准方法监控受试者中产生的基因产物的水平(例如，用免疫检测如ELISA或RIA直接监控或间接监控依赖目的基因产物的功能的实验参数，例如血糖水平等)。这种在受试者中按分隔的时间间隔“开启”基因表达而使基因在其它时间内保持“关闭”的能力使得不必在分隔的时间间隔中持续给药目的基因产物。这种方法使得不必重复注射基因产物，那样做可能带来痛苦和/或引起副作用以及需要医生不断来访。形成对照的是，本发明的体系避免了这些缺陷。并且，这种在受试者中按分隔的时间间隔“开启”基因表达的能力允许对某些不时表现“爆发”活性且仅当疼痛和症状明显的急性期才需治疗的疾病进行集中的治疗。当这些疾病不发作的时候，表达体系保持在“关闭”状态。
由于有这种在分隔的时间间隔细调基因表达的能力而尤其有利的基因疗法应用包括下列非限制性例子：
风湿性关节炎  受试者中可表达编码抑制炎症细胞因子(例如TNF，IL-1和IL-12)产生的基因产物的基因。此类抑制物的例子包括细胞因子受体的可溶形式，另外或备选地，可表达细胞因子IL-10和/或IL-4(它激活保护性Th2型反应)。另外，可表达拟糖皮质激素受体(GCMR)。
垂体机能减退  只需在少儿早期在受试者中表达人类生长激活基因，因为此时需要基因表达，到长成正常体格为止，此时将基因表达减量调节。
伤口愈合/组织再生  愈合过程所需因子(例如生长因子，血管形成因子等)只在需要时表达然后减量调节。
抗癌治疗  用于抗癌治疗的基因产物的表达可仅限于治疗期到完成了阻遏肿瘤生长为主，这时基因产物的表达可被减量调节。可能的全身性抗癌治疗包括使用肿瘤渗透白细胞，它表达免疫激活分子(例如IL-2，IL-12等)，血管生成抑制物(PF4，IL-12等)Herregulin，Leukoregulin(见PCT出版物WO 85/04662号)，以及用于骨髓支持疗法的生长因子，如G-CSF，GM-COF和M-CSF。对于后者，用本反应的调节体系表达用于骨髓支持疗法的因子使在有规律的时间间隔从化学疗法转到骨髓支持疗法的疗法转换简便了(相似地，同类方法也可用于爱滋病治疗，例如简化了从抗病毒治疗向骨髓支持治疗的转换)。进而也可能使抗癌治疗可控地局部定位。例如，用本发明的调节物表达自杀基因，其中调节物本身被例如肿瘤特异性启动子或辐射诱导的启动子调控。
在另一实施方案中，本发明的调节体系通过受本发明的体系调节的转基因在肿瘤中表达血管生成抑制物。用这种方式表达血管生成抑制物可能比全身给药抑制物更有效并会避免任何可能与全身给药相伴的任何有害副作用。特别地，将血管生成抑制物限制于肿瘤中对于治疗正在进行与正常细胞生长相连系的血管生成的儿童的癌症特别有用。
在另一实施方案中，细胞因子的高水平调节的表达提供了一种使患者自身免疫反应针对肿瘤细胞的方法。肿瘤细胞经转化可表达对增强个体天然免疫反应十分重要的趋化物和生长促进因子。由于肿瘤周围有高浓度的细胞因子，对肿瘤抗原发生免疫反应的可能性也增加了。这类疗法的潜在问题是产生细胞因子的肿瘤细胞也可能成分免疫反应的靶因而可能在尚未确定所有肿瘤细胞都被消除之前细胞因子的来源已被杀灭。为对付这个问题，可将能把受感染细胞从免疫系统屏蔽起来的病毒蛋白的表达连同相同细胞中的细胞因子基因置于调节下。一种这类蛋白质是腺病毒的E19蛋白(见例如Cox，Science 247：715)该蛋白阻止I类HLA抗原运输到细胞表面因而阻止细胞被宿主细胞毒性T细胞识别并裂解。相应地，当由于细胞因子表达诱发的免疫反应发作时，肿瘤细胞中E19的受调节的表达将产生细胞因子的细胞对细胞毒性T细胞屏蔽起来。过了一段足够长的时间，足以杀灭除那些表达E19的所有肿瘤细胞，可以关闭E19表达，使这些细胞受被激发的抗肿瘤免疫反应攻击杀死。
良性前列腺肥大  与上述相似，可用本发明的调节物调节自杀基因，其中调节物本身被例如前列腺特异性启动子控制。
本发明的调节体系可控地表达自杀基因(例如细胞死亡基因，TK基因等)的能力增加了本系统的普遍安全性和有用性。例如，在所需疗法结束时诱发自杀基因表达来杀死携带基因治疗载体的细胞，诸如生物惰性移植物的细胞，扩散出预定的原位置的细胞，等等。而且，一旦转植体肿瘤化或产生副作用，诱导自杀基因即可迅速杀灭这些细胞。在细胞中应用多于一种Tc控制的“开启/关闭”开关可使自杀基因的调节与有治疗价值的基因(此处详述)的调节完全独立。
本发明的调节系统进一步提供了在受试者中建立与治疗相关的目的基因产物的表达水平的能力，而不加调节的连续性表达使所能达到的基因产生表达水平没有任何灵活性。可根据受试者特定的医疗需要建立与生理相关的基因产物表达水平。例如依据监控相关基因产物水平的实验室试验(用上述方法)。除了与上述基因产物的基因剂量一起讨论的基因产物及临床样本，其它可在特定时间以特定水平表达的与治疗相关的基因产物包括：血友病患者中的XIII因子和IX因子(例如在有受伤危险的时候如运动中其表达上升)，糖尿病患者的胰岛素或糊精(根据受试者疾病状态，饮食等)，用于治疗红细胞减少症的促红细胞生成素(例如在肾衰竭末期需要)，用于动脉硬化或肝中基因疗法的低密度脂蛋白受体(LDLr)或极低密度脂蛋白受体(VLDLr)(例如用体外移植体)。治疗中央神经系统疾病的应用也包含在内。例如，在老年性痴呆中可实现对用于恢复乙酰胆碱水平的胆碱乙酰基转移酶(ChAT)，神经营养因子(例如NGF，BDNGF等)和/或补体抑制物(例如sCR1，sMCP，sDAF，sCD59等)的表达的“细调”。此类基因产物可由例如用本发明的体系可调节地表达基因产物的转植细胞提供。而且，可用能提高左旋多巴和多巴胺水平的酪氨酸水解酶(TH)的“细调”的表达来治疗帕金森氏病。
除了上述蛋白类基因产物，可以为治疗用途在受试者中可控地表达作为功能性RNA分子的基因产物(例如反义RNA和核酸酶)。例如，可设计一种核酸酶，它能区分基因的突变形式和野生形式。相应地，可将“正确”基因(例如野生型p53基因)引入细胞，同时引入对基因突变形式(例如突变型的内源p53基因)有特异性的受调节的核酸酶，来去除从内源基因表达的有缺陷的mRNA。有些情况下，缺陷型基因的基因产物会干扰外源野生型基因的作用，这时该方法特别有利。
用四环素或其类似物调节使用本发明的调节体系的受试者中基因产物表达。可用适于将药物送到所需作用处的途径给药(例如，送药到含有表达受调控的基因的细胞中)。根据涉及的具体细胞类型，优选的给药途径包括口服静脉给药和局部给药(例如透皮途径达到皮下定位的移植物的细胞，例如角质细胞，而避免任何全身治疗可能带来的副作用)。
在某些基因疗法情况下，可能有必要或很必要采取步骤来避免或抑制接受治疗的受试者中不需要的免疫反应。为避免对抗表达治疗基因产物的细胞，可能的话通常用受试者自己的细胞来表达治疗基因产物，或是体内修饰受试者细胞或是先从受试者获取细胞，在体外修饰后再送回受试者体内。在某些情况下，同种异体细胞或异种细胞用来表达目的基因的产物，本发明的调节体系除了调节治疗基因之外，也可用来调节参与细胞的免疫识别的的一种或多种基因从而抑制对外来细胞的免疫反应。例如，参与T细胞识别外来细胞的细胞表面分子可在用来运输治疗基因产物的外来细胞表面被减量调节，例如通过调节外来细胞中切割编码细胞表面分子的mRNA的核酸酶的表达。可用这种方式减量调节以抑制不需要的免疫反应的特别优选的细胞表面分子包括I类和/或II类主要组织相容性复合物(MHC)分子，共刺激分子(例如B7-1或/或B7-2)，CD40和各种“粘附”分子，如ICAM-1或ICAM-2。用此处描述的方法来独立却又协同地调节相同细胞中多种基因，宿主细胞中细胞表面分子的减量调节可与治疗基因的增量调节相协同。相应地，疗程结束而且治疗基因的表达停止以后，内源细胞表面分子的表达又可恢复正常。
而且，如同上面对抗癌治疗所述，作为避免不需要的免疫反应的一种方法，可在宿主细胞中用本发明的体系来调节那些减量调节MHC抗原表达的病毒蛋白(例如腺病毒E19蛋白)。
除了避免或抑制针对运输治疗基因产物的外来细胞的免疫反应外，在某些情况下也可能有必要避免或抑制针对在受试者中表达的本发明的调节体系的某些组分(例如此处描述的调节融合蛋白)。因为这些融合蛋白含有可能激活不需要的免疫反应的非哺乳动物多肽。有鉴于此，可以设计和/或选择在宿主中激活免疫反应的能力下降的调节融合蛋白。例如可选用具有最低免疫原性的用于调节融合蛋白的转录激活结构域。鉴于此，疱疹单组病毒蛋白VP16的野生型转录激活结构域可能不是体内应用的优选的转录激活结构域，因为它可以引起哺乳动物的免疫反应。根据此处所述依照其在宿主中降低的免疫原性可以采用其它的转录激活结构域。例如，可优选与宿主相同物种的蛋白的转录激活结构域(例如，一种人类蛋白的转录激活结构域用于人体中的调节融合蛋白)。备选地，可修饰本发明的调节融合蛋白来降低其在受试者中的免疫原性，例如通过鉴定并修饰融合蛋白-多肽中的一个或多个显性T细胞表位(例如，Tet阻遏子半体或转录调节物半体，如VP16多肽)。这些T细胞表位可用标准方法鉴定并同样用标准方法诱变修饰。然后可选择调节物融合蛋白的修饰形式，它与未修饰的融合蛋白相比保留原来的转录调节物活性但在受试者中表现降低的免疫原性。
除前述之外，在需要抑制免疫反应的情况下所有能在受试者中一般性或特异性减量调节免疫反应的常规方法均可与本发明的调节体系配合使用。可对受试者给药普通免疫抑制剂，如环孢素A和/或FK506。备选地，可用有更特异的免疫抑制的免疫调节剂。这类药剂可包括共刺激分子的抑制物(例如CTLA4Ig融合蛋白，可溶性CD4，抗CD4抗体，抗B7-1和/或抗B7-2抗体或是抗gp39抗体)。
最后，在某些情况下可选用表达治疗基因的细胞的运输载体，使移植细胞暴露给免疫系统的程度最小。例如细胞可移植到带小孔的生物惰性荚囊/生物可容性膜里，使蛋白质(例如感兴趣的治疗基因产物)扩渗出移植体，养料和氧气扩渗进移植体而免疫细胞不能进入，从而避免了将移植细胞暴露给免疫系统(已应用于岛细胞移植)。
B.体外生产蛋白质
可以用体外培养的细胞实现感兴趣蛋白质的大规模生产，这些细胞经修饰含有：1)编码本发明的转录激活物融合蛋白的核酸，它适于在细胞中表达该转录激活物和2)编码感兴趣蛋白质的基因，它经操作连到tet操纵子序列上。例如，哺乳动物、酵母或真菌细胞经修饰可包含此处描述的这些核酸组分。然后当Tc或其类似物存在时用标准发酵技术培养经修饰的哺乳动物、酵母或真菌细胞来诱导基因表达并生产感兴趣蛋白质。相应地，本发明提供一种分离目的基因的生产工艺流程。在该工艺流程中，宿主细胞(例如酵母或真菌)，其中引入了编码本发明的转录激活物融合蛋白的核酸和经操作连到至少一段tet操纵子序列上的编码感兴趣蛋白质的核酸，当四环素或四环素类似物存在时在培养基中以生产规模生长来激活编码感兴趣蛋白的核苷酸序列(即经操作连到tet操纵子上的核苷酸序列)的转录。然后从收获的宿主细胞或培养基中分离感兴趣蛋白。可用标准蛋白提纯技术从培养基或收获的细胞中分离感兴趣蛋白质。
C.体内生产蛋白质
本发明还提供在动物如转基因农场动物中感兴趣蛋白质的大规模生产。转基因技术的进步已能生产转基因家畜，例如牛、山羊、猪和绵羊(综述见Wall，R.J.等人(1992)细胞生物化学杂志， 49：113-120；和Clark，A.J.等(1987)生物技术动态 5：20-24)。相应地，可以建立在其基因组中携带本发明的可诱导调节体系的组分的转基因家畜，其中编码感兴趣蛋白的基因经操作连到至少一段tet操纵子序列上。通过对转基因动物给药Tc(或其类似物)可诱导基因表达及蛋白生产。通过将编码转录激活物融合蛋白的核酸与将转录激活物的表达限制到某些细胞中的适当的组织特异性调节成分相连接可将蛋白质生产定位于特定的组织。例如，哺乳动物腺特异性调节成分，如乳清启动子(美国专利4,873,316号和欧洲申请出版物264,166号)，可连到转录激活物转基因上将转录激活物的表达限制于乳房组织。因此，当Tc(或类似物)存在时，转基因动物的乳房组织生产感兴趣蛋白质，可设计成该蛋白分泌到转基因动物的乳汁中，如需要可从乳汁中分离该蛋白。
D.人类疾病的动物模型
本发明的转录激活物和抑制物蛋白可单独或组合起来使用来激活或抑制动物中特定基因的表达，模拟人类疾病的病理进而建立人类疾病的动物模型。例如在宿主动物中，推想参于一种疾病的目的基因可受一段或多段tet操纵子序列的转录调控(例如用此外描述的同源重组)。该动物可与携带转录激活物融合蛋白和/或抑制物融合蛋白的一个或多个转基因的另一动物交配，产生既携带四环素调节的融合蛋白又携带tet调节的靶序列的后代。可用四环素细调这些后代的目的基因的表达。例如，可用转录抑制物融合蛋白减量调节目的基因的表达来检验基因表达与疾病的关系。该方法比用同源重组“剔除”基因来建立疾病的动物模型要好得多，因为此处描述的tet调节体系既可调控目的基因表达的水平又可调控基因表达被减量或增量调节的时间。
E.生产稳定的细胞系用于基因克隆及其它用途
此处描述的转录抑制物体系可用来保持基因表达“关闭”(即表达过的)从而能产生用其它方法不能得到的稳定细胞系。例如，携带对细胞有细胞毒性的基因的稳定细胞系由于毒性基因表达的“泄漏”很难或不可能得到。通过用本发明的转录抑制物融合蛋白阻遏这样的毒性基因的表达可得到携带毒性基因的稳定细胞系。这样的稳定细胞系可用来克隆这样的毒性基因(例如用Tc或类似物在可控条件下诱导毒性基因的表达)。本发明的转录抑制物体系能够应用的基因克隆表达的一般方法在本领域已知(见例如Edwards，C.P.和Aruffo，A.(1993)当代生物技术观念，4：558-563)。另外，转录抑制物体系可应用于抑制其它细胞中基因的基底表达来得到稳定的细胞系，诸如胚胎干(ES)细胞系。引入ES细胞的某些基因的残留表达可能导致不能分离到稳定转染的克隆。用此处描述的转录抑制物体系抑制这些基因的转录可能有助于解决这个问题。
优点
利用转录激活物融合蛋白的本发明的可诱导调节体系面对并解决了本领域中许多其它可诱导调节体系的缺陷。例如，不需要很高胞内浓度的本发明的转录激活物融合蛋白即可有效调节基因表达。另外，由于是添加诱导剂而非去除诱导剂来诱导基因表达。本发明的体系的诱导动子学不受诱导剂去除速率的限制因而典型地要快些。而且，基因转录受诱导时诱导剂并不存在，从而不必以药剂的持续存在来保持基因表达关闭。
应用本发明的转录抑制物融合蛋白来抑制真核细胞中的转录也比仅用原核阻遏子(例如TetR，lacR)来抑制真核细胞中的转录要有利。由于本发明的抑制物融合蛋白含有真核转录抑制子结构域。这些融合蛋白阻遏真核细胞中转录会更有效，因而会潜在地仅需较低胞内浓度即可有效阻遏并更不容易“泄漏”。另外，通过将tetO序列插入内源基因的调节区域，可用本发明的转录抑制物融合蛋白来减量调节内源基因的组成性和/或组织特异性表达。
而且，各种形式的lac体系(例如labow等人(1990)分子细胞生物学 10：3343-3356；Baim等人(1991)美国国家科学院院刊 88：5072-5076)。受限制于诱导剂(IPTG)的不利特性和/或需要提高温度来诱导基因表达(可能会诱发多重效果)，与之相比，本发明的体系所用的诱导剂(Tc或其类似物)有许多有利的特性：1)Tc和其类似物对TetR有高亲和性对真核细胞毒性低，因而可以在不影响细胞生长或形态的浓度用来诱导基因；2)存在保留Tet结合力但抗生素活性降低的Tc类似物并可用作诱导剂，从而避免了Tc的抗生素性质可能带来的副作用；3)Tc和Tc类似物的药理动力学特性容许快速而有效的细胞摄取及穿透生理屏障，例如胎盘及血脑屏障；4)诱导能力不同的Tc类似物能够细调基因表达水平。
因此，本发明提供的可诱导调节体系能快速激活基因且没有细胞毒性及a range of induction indiccs，诱导后基因表达增强典型地是1000倍至2000倍之间并可高达20,000倍。备选地，根据所选用的诱导剂也能达到低水平的基因诱导，例如10倍。本体系有广泛的应用前景。这些应用包括基因疗法，培养细胞及转基因农场动物的大规模蛋白质生产和基因功能的研究，例如基因功能与细胞发育与分化的关系。另外，本发明的新型转录单元能够利用本发明的调节组分协同地或独立地调节多种基因的表达。
本发明进一步由下述实施例来说明但不应限制于此。本申请通篇引用的参考资料，专利及公开专利申请的内容在此引入作为参考。
实施例1：突变型Tet阻遏子的选择和四环素可诱导的转录激活物的构建
当四环素存在时而非不存在时结合其靶DNA的“反式”Tet阻遏子基本上通过化学诱变和选择来制得，描述见Hecht.B.等人(1993)细菌学杂志 175：1206-1210。用亚硝酸钠化学诱变编码野生型Tn10来源的Tet阻遏子的单链DNA(编码链和不编码链)。单链DNA(40μl Tris-EDTA缓冲液中40μg)与10μl 2.5M乙酸钠(pH 4.3)和50μl0.25M到2M的硝酸钠混合，室温温育45到60分钟。诱变后，用逆转录酶或用Taq DNA聚合酶的聚合酶链式反应扩增合成互补链。由于诱变过程中在DNA中产生多个突变，将三个基因片段每段约200碱基对，分别亚克隆到重组表达载体上的Wl(似为野生型)Tet阻遏子基因上去替换野生型基因的相应部分。这样形成一个突变型Tet阻遏子基因库，其中每个基因在基因的二百碱基对诱变片段中大多仅有一个突变。
用大肠杆菌菌株WH207(λWH25)在遗传检测中筛选突变型Tet阻遏子的库，正选择Tet阻遏子与其同源操纵子的功能相互作用(菌株的构建详述见Wissmann，A.等人(1991)Generics  128：225-232)该大肠杆菌菌株中，tet操纵子指导趋异排列的β-半乳糖苷(lacZ)和Lac阻遏子(lacI)基因的表达，lac调节区域指导半乳糖激酶(galK)基因的表达。Tet阻遏子结合tet操纵子关闭lacI和lacZ基因的转录。Lac阻遏子不存在时允许galK基因表达，则大肠杆菌能用半乳糖作唯一碳源，这可作为一个标记。lacZ表型可作为第二个标记。因此，含有结合着tet操纵子的Tet阻遏子的细菌有Gal+，lacZ-表型。当四环素不存在时含有野生型Tet阻遏子的细菌有Gal+，lacZ-表型。根据四环素存在时的Gal+，lacZ-表型可选择突变型“反式”Tet阻遏子(tTetR)。
rTetR突变体的核苷酸和氨基酸序列由SEQ ID NO：1(核苷酸位置1-621)和2(氨基酸位置1-207)分别给出。rTetR突变体的序列分析显示有下列氨基酸和核苷酸变化：
    氨基酸(位置)               受影响的密码子
野生型      突变体         野生型     突变体
glu(71)       lys            GAA           AAT
asp(95)       asn            GAT           AAT
leu(101)      ser            TTA           TCA
gly(102)      asp            GGT           GAT
另外两个突变不引起氨基酸交换
  氨基酸(位置)             受影响的密码子
野生型   突变体       野生型    突变体
leu(41)    leu           TTG        CTG
Arg(80)    Arg           CGT        CGC
为了将rTetR突变体转变成转录激活物，编码rTetR的氨基酸3到135(即涵盖突变区域)的399碱基对的XbaI/Eco47III片段与表达载体pUHD15-1的对应限制性片段交换得到pUHD17-1。pUHD15-1中，编码野生型TetR的核苷酸序列在框地连接着编码疱疹单组病毒VP16的C末端130个氨基酸的核苷酸序列。这些转录激活物序列上游由CMV启动子/增强子包围，下游由SV40多聚(A)位点包围(pUHD15-1的构建详述见USSN 08/076,726和Gossen，M.和Bujard，H.(1992)美国国家科学院院刊 89：5547-5551)，因此，pUHD17-1中，编码反式TetR突变体的核苷酸序列在框地与VP16序列相连，产生反式Tc控制的转录激活物(此处称为tTAR)。rTetR突变区对TetR野生型区域的相类的交换用质粒pUHD152-1完成，pUHD152-1除了还含有编码核定位信号的核苷酸序列在框地连接着编码Tet阻遏子的核苷酸序列的5’端之外，与pUHD15-1相同。核定位信号的氨基酸序列是MPKRPRP(SEQ IDNO：5)，它连到TetR二位氨基酸比氨酸。得到的编码反式Tc控制的转录激活物的表达载体包括一核定位信号(此处称为ntTAR)，该载体命名为pUHD172-1。
实施例2：用tTAR四环素诱导的转录激活
瞬时转染
pUHD17-1和pUHD172-1表达载体用标准磷酸钙方法瞬时转染入Hela细胞中，一同转染的标记载体pUHC13-3中七聚tet操纵子融合到最小hCMV启动子和荧光素酶标记基因的上游(标记载体详述见USSN08/076,726以及Gossen，M.和Bujard，H.(1992)美国国家科学院院刊89：5547-5551)。当四环素(或其类似物)存在或不存在时将转染的细胞37℃温育20小时，然后如下检测荧光素酶活性：在35mm小皿中Eagle’s最低基本培养基中生长至～80％连生的细胞，用2ml磷酸盐缓冲的盐水洗涤，然后室温下在25mM Tris磷酸盐，pH 7.8/2mM二硫苏糖醇/2mM二氨基己烷四乙酸/10％甘油/1％Triton-X-100裂解10分钟。裂解物从培养皿中括下，用Eppendorfy离心管离心10分钟。下一步，上清的等份(10μl)与250μl  25mM甘氨酰甘氨酸/15mM MgSO4/5mMATP混和，再用Lumat LB9501(Berthold，Wildbad，联邦德国)积分模式(10秒钟)检测荧光素酶活性。D-荧光素(L6882，Sigma)用0.5mM。不含荧光素酶基因的Hela细胞提取物中测到的背景信号与仪器背景不可区分(80-120相对光单位(rlu)/10秒)。用Bradford法(Bradford，M.M.(1976)分析生物化学 72：248-254)确定裂解物的蛋白含量。用编码tTAR或ntTAR的质粒转染的细胞当四环素存在时荧光素酶活性上升。若用脱水四环素(ATc)代替四环素，该效果持续地更加显著。
稳定转染
瞬间转染分析完成后，制备表达载体作细胞的稳定转染。将sSV2neo来源的新霉素抗性盒(描述见Southern，P.J.和Berg，P.(1982)应用分子遗传学， 1：327-341)整合到转录激活物表达载体pUHD17-1和pUHD172-1中，分别得到pUGD17-1neo，pUHD172-1neo。用标准技术将编码ntTAR的pUHD172-1neo稳定整合到Hela细胞中。用携带荧光素酶基因的pUHC13-3在最小CMV启动子和tet操纵子控制下瞬间超转染10个G418抗性细胞克隆并分析其表型。三个克隆HR4，HR5手HR10当ATc存在时表现荧光素酶活性的较强增长。从这些克隆中选HR5作进一步的实验。
为了得到ntTAR和tet操纵子相连的荧光素酶标记基因共同的稳定转染体，HR5细胞用pUH13-3和pHMR272共转染，后者编码潮霉素抗性(见Bernhard，H-U等人(1985)Exp.Cell Res. 158：237-243)，并选择hygromycin克隆。在一个同类实验中，HR5细胞用pUH13-7和pHMR272共转染。pUH13-7含有的最小启动子序列横跨与七聚体tetO序列相邻的HSVtk启动子的+19至-37，pUH13-7不含最小CMV启动子。21个潮霉素抗性克隆中，当往培养基添加Tc或强力霉素(DC)时10个克隆显示可诱导的荧光素酶活性。含有连着最小CMV启动子的荧光素酶标记基因的克隆称为HR5-C，而含有连着最小tk启动子的荧光素酶标记基因的克隆称为HR5-T。
六个被ntTAR-独立的标记单元稳定转染并且先已表现对四环素有反应的HR5克隆在1μg/ml强力霉素存在或不存在情况下平行地生长。每个35mm皿中铺约3×104个细胞(每种克隆4个皿)。生长60小时后收获细胞并确定提取物中荧光素酶活性(相对光单位(rlu)/μg提取的蛋白质)。如表1所示，6个克隆的绝对表达水平表明在几个含有ntTAR调节体系的双稳定细胞系中荧光素酶基因表达的激活可达到超过3个数量级。
应当注意，如果不是简单地往培养基中添加诱导剂而是诱导前洗涤细胞然后将细胞重铺到含有诱导剂的新鲜培养基中可达到更高的诱导因数(例如表达增加高达20,000倍)。
表1  双稳定luc+/HR5细胞克隆的Doxycycline依赖型荧光素酶活性
              荧光素酶活性，  rlu/μg蛋白
克隆       -强力霉素       +强力霉素    诱导因素
HR5-C6        65             54,911       845
              62             69,525       1120
HR5-C11       100            165,671      1660
              142            179,651      1270
HR5-C14       43             44,493       1030
              43             56,274       1310
HR5-T2        56             16,696       298
              40             16,416       410
HR5-T15       6.8            1838         270
              6.5            1688         260
HR5-T19       4.8            1135         236
              5.4            1285         237
用不同四环素诱导荧光素酶活性
检查四环素及几种不同四环素类似物在HR5-C11细胞中诱导荧光素酶表达的能力。HR5-C11细胞铺板密度约3×104细胞/35mm皿(～80％连生)。当细胞完全粘附以后，将浓度为1μg/ml的下列四环素加入培养物中：四环素-HCl(Tc)，氧四环素-HCl(OTc)，氯四环素(CTc)，脱水四环素-HCl(ATc)和强力霉素(Doxy)。这些化合物可购自Sigma化学公司，圣路易斯，MO，以浓度为1μg/ml的溶液贮存。生长时不加抗生素(-)的细胞作对照。3天后收获细胞并确定荧光素酶活性和提取物的蛋白含量。结果由图1的方块图给出。图中每个块(封闭的和打阴影线的)代表单个培养皿中相对荧光素酶活性(按提取蛋白的总量归一化)。不加四环素的两板得到的荧光素酶活性平均值定为1。Tc，CTc和OTc的荧光素酶活性激活小。与之对照，ATc和Doxy激活荧光素酶活性分别约为1000和1500倍。
HR5-C11细胞中荧光素酶活性对强力霉素的剂量反应
上述检查不同四环素诱导能力的实验显示强力霉素是所检查的四环素中最强力的效应物。于是选强力霉素作其剂量效应的定量分析。HR5-C11细胞与不同浓度的强力霉素共温育并测量荧光素酶活性。三个独立实验的数据由图2给出。若在培养基中浓度低于10ng/ml，强力霉素不能有效地诱导荧光素酶活性。然而若浓度提高至高过10ng/ml，观察到荧光素酶表达几乎是线性增长。1μg/ml时得到最大激活。浓度超过3ng/ml，用MTT检测确定强力霉素对Hela细胞有轻微的生长抑制效果。
ntTA R 体系的诱导动力学
为了检查强力霉素诱导的ntTAR介导的基因表达诱导的动力学，将强力霉素加到培养基中(终浓度1μg/ml)后监测HR5-C11细胞中荧光素酶活性诱导的时程。当强力霉素存在时培养细胞，过不同的时间间隔，收获细胞并依上述确定荧光素酶活性。如图3所示，与Doxy温育5.5小时后观察到荧光素酶活性的100倍诱导。与Doxy温育小于24时即可达到完全诱导水平。因此，这些结果表明细胞接触诱导剂后很快发生基因表达的诱导。
实施例3：用Tc控制的转录激活物协同调节两段核苷酸序列的表达
构建一个协同双向转录两段核苷酸序列的重组表达载体，它从5’到3’方向包括：荧光素酶基因，第一个最小启动子，七段tet操纵子序列，第二个最小启动子和LacZ基因。该结构由图6描述。在该结构中，荧光素酶基因和LacZ基因的取向使得它们相对于tet操纵子序列以相反方向转录，即荧光素酶基因在DNA下链以5’到3’方向转录，而LacZ基因在DNA上链以5’到3’方向转录。荧光素酶基因后接SV40多聚腺苷化信号，而LacZ基因后接β-球蛋白多聚腺苷化信号。
该结构转染至表达野生型Tet阻遏子-VP16融合蛋白的Hela细胞系HtTA-1细胞中(该蛋白称为tTA，描述见Gossen，M.和Bujard，H.(1992)美国国家科学院院刊 89：5547-5551)。当Tc(或类似物)不存在而非存在时tTA融合蛋白结合tet操纵子序列。该结构与一种赋予潮霉素抗性的质粒共转染至HtTA-1细胞中，根据其潮霉素抗性表型选择稳定转染的克隆。对选择出的潮霉素抗性(Hygrr)克隆检查其荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性。对三种标记均阳性(Hygrr，luc+，β-gal+)的克隆，通过用递增量的四环素培养克隆并测量荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性来检查荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性表达的四环素依赖型共调节。采用Htl 316-8/50克隆的此类实验的结果由图8给出。当四环素不存在时(其时tTA能结合tet操纵子并且激活基因表达)，荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性均能检测到。当存在递增量的四环素时，荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性被协同并等量地减量调节。此数据表明通过将两个基因经操作连到相同tet操纵子序列上可用四环素控制的转录激活物协同调节两个基因的表达。
实施例4：构建含有TetR和一个Krueppel抑制子结构域的四环素调节的转录抑制物融合蛋白
为了构建编码本发明的四环素调节的转录抑制物(亦称四环素控制的抑制子结构域，或tSD)的表达载体，将编码转录抑制子结构域的核酸片段连接到含有编码野生型或修饰的(即突变的)TetR的核苷酸序列的表达载体上并使抑制子结构域编码序列在框的与TetR编码序列相连。质粒pUHD141-1含有编码野生型Tn10来源的Tet阻遏子的核苷酸序列(该阻遏子的核苷酸序列与氨基酸序列分别由SEQ ID NO：16和17给出)。pUHD141sma-1中，TetR编码序列在其5’端连接CMV启动子，在其3’端连接的核苷酸序列形成多聚衔接物，附加的核苷酸片段可引入其中。该多聚衔接物区的核苷酸序列为：TCC CCG GGT AAC TAA GTAAGG ATC C(SEQ ID NO：24)(其中TCC CCG GGT ACC编码Tet的205-208氨基酸残基，即Ser-Gly-Ser-Asn)。该多聚衔接物区包括PspAI(CCC GGG)和BamHI(GGA TCC)的限制性内切酶位点。在多聚衔接物区的下游，质粒含有SV40来源的多聚腺苷化信号。pUHD141sma-1载体由图11示意地描绘。
为了构建编码TetR和来自果蝇Krueppel(Kr)蛋白的转录抑制子结构域的融合蛋白的表达载体，用Kr cDNA作模板用聚合酶链式反应(PCR)扩增编码来自Kr的抑制物结构域的核酸片段。设计的寡聚核苷酸引物扩增编码Kr的C末端64个氨基酸(称为C64KR)的核酸片段。该区域对应天然蛋白的氨基酸位置403-466。C64KR的核苷酸序列和氨基酸序列由SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：2 1分别给出。PCR引物设计成包括限制性内切酶位点使得到的扩增片段在其5’和3’端具有限制性内切酶位点。选用那些包含在pUHD141sma-1的多聚衔接物并容许扩增片段在框双向地连到多聚衔接物位点的限制性内切酶位点。例如，PCR引物设计成在编码C64KR的片段的5’端引入PspAI位点(CCC GGG)在片段3’端引入BamHI位点。标准PCR反应完成后用PspAI和BamHI消化扩增片段和pUHD141sma-1。然后在标记连接条件下将扩增片段定向连到pUHD141sma-1的多聚衔接物位点得到表达载体pUHD141Kr-1，用标准技术来分离所需质粒并确认其结构，pUHD141Kr-1的结构由图11示意地描绘。
得到的pUHD141Kr-1表达载体含有编码包含着野生型TetR的1-207氨基酸在框地连接Kr的403-466氨基酸(C64KR)的融合蛋白的核苷酸序列。融合蛋白接合处的核苷酸序列和氨基酸序列如下：AGTGGG TCC CCG GGT GAC ATG GAA(SEQ ID NO：25)和Ser-Gly-Ser-Pro-Gly-Asp-Met-Glu(SEQ ID NO：26)。Ser-Gly-Ser对应TetR的205-207氨基酸并被多聚衔接物编码，Asp-Met-Glu对应C64KR的403-405氨基酸。
相似地，可以用编码突变型TetR的核苷酸序列(其核苷酸序列和氨基酸序列分别由SEQ ID NO：18和19给出)代替pUHD141-smal中的野生型TetR序列如上述构建编码突变型TetR(只当Tc存在时结合tetO)和C64KR的融合蛋白的表达载体。
如实施例2所述将编码TetR-Kr融合蛋白的表达载体(例如pUHD141K-1)瞬时或稳定地转染进宿主细胞。在宿主细胞中表达TetR-Kr融合基因。如实施例2所述含有一段或多段tetO序列的标记基因结构，一个最小启动子和一个标记基因例如荧光素酶也转染进细胞中(标记基因结构进一步详述见USSN 08/076,726和Gossen，M.和Bujard，H(1992)美国国家科学院院刊 89：5547-5551)。如实施例2所述测量当递增浓度的Tc或类似物例如强力霉素存在或不存在时荧光素酶活性。对上述野生型TetR-Kr融合蛋白，通过比较强力霉素存在时(无阻遏)荧光素酶活性量与强力霉素不存在时(阻遏)荧光素酶活性量来确定融合蛋白的转录抑制能力。还可用表现高基底表达水平(即强力霉素存在时高表达水平)的标记基因结构利用含有附加的正调节成分(例如增强子序列)来检测融合蛋白的转录抑制能力。
实施例5：构建含有TetR和v-erbA抑制子结构域的四环素调节的转录抑制物融合蛋白
为了构建编码TetR和来自v-erbA致癌基因产物的转录抑制子结构域的融合蛋白的表达载体，如实施例4将编码来自v-erbA的抑制子结构域的核酸片段在框地连到pUHD141sma-1上。用v-erbA cDNA作模板用聚合酶链式反应(PCR)扩增编码适合连接pUHD141sma-1的v-erbA抑制子结构域的核酸片段。设计的寡聚核苷酸引物扩增编码天然v-erbA蛋白的364-635氨基酸的核酸片段。v-erbA该区域的核苷酸序列和氨基酸序列分别由SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23给出。如实施例4所述，PCR引物设计成扩增的v-erbA片段在其5’和3’端含有限制性内切酶位点，例如5’端有PspAI而3’端有BamHI。标准PCR反应完成后，用PspAI和BamHI消化扩增片段和pUHD141-sma1，然后在标准连接条件下将扩增片段定向连到pUHD141-sma1的多聚衔接物位点得到表达载体pUHD141-erb1。用标准技术来离所需质粒并确认其结构。pUHD141erb-1的结构由图11示意地描绘。
得到的pUHD141erb-1表达载体含有编码包含着野生型TetR在框地连接v-erbA的364-635氨基酸的融合蛋白的核苷酸序列。融合蛋白接合处的核苷酸序列和氨基酸序列如下：AGT GGG TCC CCG GGT CTGGAC GAC(SEQ ID NO：27)和Ser-Gly-Ser-Pro-Gly-Leu-Asp-Asp(SEQ ID NO：28)。Ser-Gly-Ser对应Tet的205-207氨基酸，Pro-Gly由多聚衔接物编码，Leu-Asp-Asp对应v-erbA抑制子结构域的364-366氨基酸。
如实施例4所述，可以用编码突变型TetR的核苷酸序列(其核苷酸序列和氨基酸序列分别由SEQ ID NO：18和19给出)代替pUHD141-sma1的野生型TetR序列如上述构建编码突变型Tet(仅当Tc存在时结合tetO)和v-erbA抑制子结构域的融合蛋白的表达载体。
如同实施例4对TetR-Kr融合蛋白那样在宿主细胞中表达TetR-v-erbA融合蛋白并检测融合蛋白的转录抑制活性。
实施例6：用tTAR在转基因动物中调节基因表达
为了检查tTAR体内调节基因表达的能力，构建小鼠的转基因株，它含有tTAR表达结构或标记基因经操作连着tet操纵子的外源染色体插入序列。含有tTAR表达结构或tetO相连的标记基因的单转基因组杂交然后鉴定双转基因后代。对tTAR以四环素依赖形式调节标记基因的转录的能力对双转基因动物确定特性。该实施例表明当对动物给药四环素(或类似物)时tTAR在动物组织内有效地激活经操作连着tet操纵子的基因的表达，而当四环素或类似物不存在时tetO相连的基因的表达保持在本底水平。这些结果表明此外描述的四环素控制的转录调节体系除了在体外细胞系中在动物体内也有效地发挥作用。
获得对PhCMV-tTA R 表达单元转基因的小鼠
通过将从质粒pUHG17-1切下的2.7kb Xhol-Pfml片段前核注射入受精卵得到表达tTA蛋白的小鼠。该DNA片段包含受人类CMV IE启动子(位置+75至-675)转录控制的tTAR基因(SEQ ID NO：1给出)和含有一个内含子的兔β-球蛋白多聚腺苷化位点。人类CMV IE启动子是组成性启动子，只要编码tTAR的DNA序列整合进染色体，该启动子就在所有细胞中表达突变型tetR-VP16融合蛋白。用标准技术将DNA注射入受精卵，浓度约为5ng每μl。用标准操作规程从受注射的受精卵得到转基因小鼠。用聚合酶链式反应(PCR)和Southern杂交分析转基因建立者小鼠来探测tTAR转基因是否存在于小鼠的染色体DNA。鉴定得到两个转基因小鼠系，CR3和CR4，它们与携带受tetO序列控制的荧光素酶标记基因的另一种转基因小鼠杂交育种(下面详述)。
获得对PhCMV * -1荧光素酶标记单元转基因的小鼠
通过将从质粒pUHC13-1切下的3.1kb XhoI-EaeI片段前核注射入受精卵得到携带PhCMV*-1luc标记基因表达单元的小鼠。该DNA片段包含受四环素响应的PhCMV*-1启动子(SEQ ID NO：8)转录控制的荧光素酶基因和含有一个内含子的SV40 t早期多聚腺苷化位点。将浓度约为5ng每μl的DNA注射入卵细胞中用标准操作规程得到转基因小鼠。用Southern杂交分析转基因建立者小鼠探测PhCMV*-1luc转基因是否存在于小鼠的染色体DNA。对tetO相连的荧光素酶标记基因转基因的小鼠系，L7，与tTAR转基因系CR3和CR4杂交育种(下面详述)。
获得对PhCMV * -1luc和PhCMVtTR R 转基因的小鼠
构建了表达tTAR或携带PhCMV*-1luc单转基因小鼠后，通过将对两种转基因之一种转基因的异源小鼠杂交育种得到携带tTAR表达载体和荧光素酶标记单元的双转基因小鼠。用标准筛选方法(例如PCR和/或Southern杂交)鉴定双转基因小鼠来探测tTAR转基因和PhCMV*-1luc转基因是存在于小鼠的染色体DNA。
在小鼠的组织样本中诱导和分析荧光素酶活性
口服时，四环素和其衍生物强力霉素溶于饮用水浓度200μg每ml，连同5％蔗糖给药以盖住抗生素的苦味。对哺乳小鼠，浓度为2mg每ml连同10％蔗糖以保证通过乳汁让幼鼠充足地摄取。
为了分析荧光素酶活性，用断颈法处死小鼠，用Ultra-Turrax在含有500μl裂解缓冲液(25mM Tris磷酸盐，pH 7.8/2mM DTT/2mMEDTA/10％甘油/10％Triton X100)的2ml试管中将组织样品匀浆。匀浆用液氮冷冻，化冻后15,000g离心5min。取2-20μl上清液，与250μl荧光素酶检测缓冲液(25mM甘氨酰甘氨酸，pH 7.5/15mM MgSO4/5mMATP)混合，待注射入100μl的125μM荧光素溶液后用Berthold LumatLB 9501测量10sec，用Bradford检测法确定匀浆中蛋白浓度，荧光素酶活性按相对光单位(rlu)每μg总蛋白计算。
结论
2个携带PhCMV-tTAR转基因的系(CR3和CR4)的小鼠与对PhCMV*-1luc转基因的L7系的小鼠交配L7系在不同器官中表现非常低但可检测到的荧光素酶活性本底，这可能是由于整合位点的位置效应。L7单转基因小鼠不同组织中本底荧光素酶活性由图12图示描绘，由每个受检组织右边的有格子花的柱代表(每个柱代表一种动物的结果)。当四环素或其类似物强力霉素不存在时(即未诱导条件下)C3/L7双转基小鼠不同组织中荧光素酶活性由图12图示描绘。由每个受检组织中间的深色柱代表。当强力霉素存在时(即诱导条件下)C3/L7双转基因小鼠不同组织中荧光素酶活性由图12图示描绘，由每个受检组织左边的浅色柱代表。
在受检的双转基因小鼠的七种组织中检测到荧光素酶活性：胰，肾，胃，肌肉，胸腺，心脏和舌。双转基因小鼠的激活荧光素酶水平的组织模式(即当强力霉素存在时)与文献报导的hCMV IE启动子的表达模式相似。这与荧光素酶标记基因的表达受tTAR调节一致(tTAR在小鼠中的表达受hCMV IE启动子控制)。标记基因诱导水平随不同受检组织不同。调节因数可高达100,000倍(即5个数量级)，例如在胰中。
等价方案
本领域的专业人员应了解或是能确定仅用例行的实验操作即可得到此处描述的本发明的特定实施方案的许多等价方案。这些等价方案将被下述权利要求包涵。
                         序列表
(1)一般资料：
(i)申请人：
(A)姓名：Hermann Bujard
(B)街道：Remler街9号
(C)城市：D-69120海德堡
(E)国家：德国
(A)姓名：Manfred Gossen
(B)街道：978 Arlington大街# B
(C)城市：E1 Cerrito
(D)州：加利福尼亚
(E)国家：美国
(F)邮政编码：94530
(ii)发明名称：四环素调节的转录调控物
(iii)序列数：28
(iv)通讯地址：
(A)收信人：LAHIVE & COCKFIELD
(B)街道：60 State Street，suite 510
(C)城市：波士顿
(D)州：马萨诸塞州
(E)国家：美国
(F)邮政编码：02109-1875
(v)计算机读取形式：
(A)介质类型：软磁盘
(B)计算机：IBM PC兼容型
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：ASCII文本
(vii)先前申请数据：
(A)申请号：待定
(B)提交日期：1995年6月7日
(C)分类：
(vii)先前申请数据：
(A)申请号：US 08/383,754
(B)提交日期：1995年2月3日
(C)分类：
(vii)先前申请数据：
(A)申请号：US 08/275,876
(B)提交日期：1994年7月15日
(C)分类：
(vii)先前申请数据：
(A)申请号：US 08/270,637
(B)提交日期：1994年7月1日
(C)分类：
(viii)律师/代理人资料：
(A)姓名：DeConti，Giulio A，Jr.
(B)登记号：31,503
(C)参考/登记号：BBI-009C2PC
(ix)远程通讯资料：
(A)电话：(617)227-7400
(B)电传：(617)227-5941
(2)SEQ ID NO：1的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：1008碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑类型：线型
(ii)分子类型：DNA
(ix)特征：
(A)名称/关键：外显子
(B)位置：1..1008
(ix)特征：
(A)名称/关键：mRNA
(B)位置：1..1008
(ix)特征：
(A)名称/关键：misc.结合
(B)位置：1..207
(ix)特征：
(A)名称/关键：misc.结合
(B)位置：208..335
(ix)特征：
(A)名称/关键：CDS
(B)位置：1..1005
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
ATG TCT AGA TTA GAT AAA AGT AAA GTG ATT AAC AGC GCA TTA GAG CTG     48
Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu
1               5                   10                  15
CTT AAT GAG GTC GGA ATC GAA GGT TTA ACA ACC CGT AAA CTC GCC CAG     96
Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln
            20                  25                  30
AAG CTA GGT GTA GAG CAG CCT ACA CTG TAT TGG CAT GTA AAA AAT AAG     144
Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys
        35                  40                  45
CGG GCT TTG CTC GAC GCC TTA GCC ATT GAG ATG TTA GAT AGG CAC CAT     192
Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His His
    50                  55                  60
ACT CAC TTT TGC CCT TTA AAA GGG GAA AGC TGG CAA GAT TTT TTA CGC     240
Thr His Phe Cys Pro Leu Lys Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg
65                  70                  75                  80
AAT AAG GCT AAA AGT TTT AGA TGT GCT TTA CTA AGT CAT CGC AAT GGA      288
Asn Lys Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asn Gly
                85                  90                  95
GCA AAA GTA CAT TCA GAT ACA CGG CCT ACA GAA AAA CAG TAT GAA ACT      336
Ala Lys Val His Ser Asp Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr
            100                 105                 110
CTC GAA AAT CAA TTA GCC TTT TTA TGC CAA CAA GGT TTT TCA CTA GAG     384
Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu
        115                 120                 125
AAT GCA TTA TAT GCA CTC AGC GCT GTG GGG CAT TTT ACT TTA GGT TGC     432
Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys
    130                 135                 140
GTA TTG GAA GAT CAA GAG CAT CAA GTC GCT AAA GAA GAA AGG GAA ACA     480
Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr
145                 150                 155                 160
CCT ACT ACT GAT AGT ATG CCG CCA TTA TTA CGA CAA GCT ATC GAA TTA     528
Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu
                165                 170                 175
TTT GAT CAC CAA GGT GCA GAG CCA GCC TTC TTA TTC GGC CTT GAA TTG     576
Phe Asp His Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu
            180                 185                 190
ATC ATA TGC GGA TTA GAA AAA CAA CTT AAA TGT GAA AGT GGG TCC GCG     624
Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Ser Ala
        195                 200                 205
TAC AGC CGC GCG CGT ACG AAA AAC AAT TAC GGG TCT ACC ATC GAG GGC     672
Tyr Ser Arg Ala Arg Thr Lys Asn Asn Tyr Gly Ser Thr Ile Glu Gly
    210                 215                 220
CTG CTC GAT CTC CCG GAC GAC GAC GCC CCC GAA GAG GCG GGG CTG GCG     720
Leu Leu Asp Leu Pro Asp Asp Asp Ala Pro Glu Glu Ala Gly Leu Ala
225                 230                 235                         240
GCT CCG CGC CTG TCC TTT CTC CCC GCG GGA CAC ACG CGC AGA CTG TCG     768
Ala Pro Arg Leu Ser Phe Leu Pro Ala Gly His Thr Arg Arg Leu Ser
                245                 250                 255
ACG GCC CCC CCG ACC GAT GTC AGC CTG GGG GAC GAG CTC CAC TTA GAC     816
Thr Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu His Leu Asp
            260                 265                 270
GGC GAG GAC GTG GCG ATG GCG CAT GCC GAC GCG CTA GAC GAT TTC GAT      864
Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp
        275                 280                 285
CTG GAC ATG TTG GGG GAC GGG GAT TCC CCG GGT CCG GGA TTT ACC CCC      912
Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro
    290                 295                 300
CAC GAC TCC GCC CCC TAC GGC GCT CTG GAT ATG GCC GAC TTC GAG TTT      960
His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe
305                 310                 315                 320
GAG CAG ATG TTT ACC GAT CCC CTT GGA ATT GAC GAG TAC GGT GGG TAG    1008
Glu Gln Met Phe Thr Asp Pro Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly Gly
                325                 330                 335
(2)SEQ ID NO：2的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：335氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑类型：线型
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu
1               5                   10                  15
Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln
            20                  25                  30
Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys
        35                  40                  45
Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His His
    50                  55                  60
Thr His Phe Cys Pro Leu Lys Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg
65                  70                  75                  80
Asn Lys Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asn Gly
                85                  90                  95
Ala Lys Val His Ser Asp Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr
            100                 105                 110
Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu
        115                 120                 125
Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys
    130                 135                 140
Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr
145                 150                 155                 160
Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu
                165                 170                 175
Phe Asp His Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu
            180                 185                 190
Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Ser Ala
        195                 200                 205
Tyr Ser Arg Ala Arg Thr Lys Asn Asn Tyr Gly Ser Thr Ile Glu Gly
    210                 215                 220
Leu Leu Asp Leu Pro Asp Asp Asp Ala Pro Glu Glu Ala Gly Leu Ala
225                 230                 235                 240
Ala Pro Arg Leu Ser Phe Leu Pro Ala Gly His Thr Arg Arg Leu Ser
                245                 250                 255
Thr Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu His Leu Asp
            260                 265                 270
Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp
        275                 280                 285
Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro
    290                 295                 300
His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe
305                 310                 315                 320
Glu Gln Met Phe Thr Asp Pro Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly Gly
                325                 330                 335
(2)SEQ ID NO：3的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：33碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑类型：线型
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：
GAC GCG CTA GAC GAT TTC GAT CTG GAC ATG TTG    33
Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu
1               5                   10
(2)SEQ ID NO：4的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：11氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑类型：线型
(ii)分子类型：肽类
(v)片段类型：内部的
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：
Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu
1               5                   10
(2)SEQ ID NO：5的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：7氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑类型：线型
(ii)分子类型：肽类
(v)片段类型：内部的
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：
Met Pro Lys Arg Pro Arg Pro
1               5
(2)SEQ ID NO：6的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：569碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑类型：线型
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：
GAATTCGGGG CCGCGGAGGC TGGATCGGTC CCGGTGTCTT CTATGGAGGT CAAAACAGCG                60
TGGATGGCGT CTCCAGGCGA TCTGACGGTT CACTAAACGA GCTCTGCTTA TATAGGTCGA               120
GTTTACCACT CCCTATCAGT GATAGAGAAA AGTGAAAGTC GAGTTTACCA CTCCCTATCA               180
GTGATAGAGA AAAGTGAAAG TCGAGTTTAC CACTCCCTAT CAGTGATAGA GAAAAGTGAA               240
AGTCGAGTTT ACCACTCCCT ACCAGTGATA GAGAAAAGTG AAAGTCGAGT TTACCACTCC               300
CTATCAGTGA TAGAGAAAAG TGAAAGTCGA GTTTACCACT CCCTATCAGT GATAGAGAAA               360
AGTGAAAGTC GAGTTTACCA CTCCCTATCA GTGATAGAGA AAAGTGAAAG TCGAGCTCGC               420
TACCCGGGTC GAGTAGGCGT GTACGGTGGG AGGCCTATAT AAGCAGAGCT CGTTTAGTGA               480
ACCGTCAGAT CGCCTGGAGA CGCCATCCAC GCTGTTTTGA CCTCCATAGA AGACACCGGG               540
ACCGATCCAG CCTCCGCGGC CCCGAATTC                                                 569
(2)SEQ ID NO：7的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：520碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑类型：线型
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：
AGATCTGCAG GGTCGCTCGG TGTTCGAGGC CACACGCGTC ACCTTAATAT GCGAAGTGGA       60
CCGGATCTCG AGTTTACCAC TCCCTATCAG TGATAGAGAA AAGTGAAAGT CGAGTTTACC      120
ACTCCCTATC AGTGATAGAG AAAAGTGAAA GTCGAGTTTA CCACTCCCTA TCAGTGATAG      180
AGAAAAGTGA AAGTCGAGTT TACCACTCCC TATCAGTGAT AGAGAAAAGT GAAAGTCGAG      240
TTTACCACTC CCTATCAGTG ATAGAGAAAA GTGAAAGTCG AGTTTACCAC TCCCTATCAG      300
TGATAGAGAA AAGTGAAAGT CGAGTTTACC ACTCCCTATC AGTGATAGAG AAAAGTGAAA      360
GTCGAGCTCG GTACCCGGGT CGAGTAGGCG TGTACGGTGG GAGGCCTATA TAAGCAGAGC      420
TCGTTTAGTG AACCGTCAGA TCGCCTGGAG ACGCCATCCA CGCTGTTTTG ACCTCCATAC      480
AAGACACCGG GACCGATCCA GCCTCCGCGG CCCCGAATTC                            520
(2)SEQ ID NO：8的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：450碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑类型：线型
(ii)分子类型：(基因组)DNA
(vi)原始来源：
(A)生物体：人类细胞肥大病毒
(B)株：K12，Towne
(ix)特征：
(A)名称/关键：mRNA
(B)位置：382..450
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：
GAATTCCTCG AGTTTACCAC TCCCTATCAG TGATAGAGAA AAGTGAAAGT CGAGTTTACC                   60
ACTCCCTATC AGTGATAGAG AAAAGTGAAA GTCGAGTTTA CCACTCCCTA TCAGTGATAG                  120
AGAAAAGTGA AAGTCGAGTT TACCACTCCC TATCAGTGAT AGAGAAAAGT GAAAGTCGAG                  180
TTTACCACTC CCTATCAGTG ATAGAGAAAA GTGAAAGTCG AGTTTACCAC TCCCTATCAG                  240
TGATAGAGAA AAGTGAAAGT CGAGTTTACC ACTCCCTATC AGTGATAGAG AAAAGTGAAA                  300
GTCGAGCTCG GTACCCGGGT CGAGTAGGCG TGTACGGTGG GAGGCCTATA TAAGCAGAGC                  360
TCGTTTAGTG AACCGTCAGA TCGCCTGGAG ACGCCATCCA CGCTGTTTTG ACCTCCATAG                  420
AAGACACCGG GACCGATCCA GCCTCCGCGG                                                   450
(2)SEQ ID NO：9的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：450碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑类型：线型
(ii)分子类型：(基因组)DNA
(vi)原始来源：
(A)生物体：人类细胞肥大病毒
(B)株：Towne
(ix)特征：
(A)名称/关键：mRNA
(B)位置：382..450
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：
GAATTCCTCG ACCCGGGTAC CGAGCTCGAC TTTCACTTTT CTCTATCACT GATAGGGAGT         60
GGTAAACTCG ACTTTCACTT TTCTCTATCA CTGATAGGGA GTGGTAAACT CGACTTTCAC        120
TTTTCTCTAT CACTGATAGG GAGTGGTAAA CTCGACTTTC ACTTTTCTCT ATCACTGATA        180
GGGAGTGGTA AACTCGACTT TCACTTTTCT CTATCACTGA TAGGGAGTGG TAAACTCGAC        240
TTTCACTTTT CTCTATCACT GATAGGGAGT GGTAAACTCG ACTTTCACTT TTCTCTATCA        300
CTGATAGGGA GTGGTAAACT CGAGTAGGCG TGTACGGTGG GAGGCCTATA TAAGCAGAGC        360
TCGTTTAGTG AACCGTCAGA TCGCCTGGAG ACGCCATCCA CGCTGTTTTG ACCTCCATAG        420
AAGACACCGG GACCGATCCA GCCTCCGCGG                                         450
(2)SEQ ID NO：10的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：398碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑类型：线型
(ii)分子类型：(基因组)DNA
(vi)原始来源：
(A)生物体：单纯疱疹病毒
(B)株：KOS
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：
GAGCTCGACT TTCACTTTTC TCTATCACTG ATAGGGAGTG GTAAACTCGA CTTTCACTTT                  60
TCTCTATCAC TGATAGGGAG TGGTAAACTC GACTTTCACT TTTCTCTATC ACTGATAGGG                 120
AGTGGTAAAC TCGACTTTCA CTTTTCTCTA TCACTGATAG GGAGTGGTAA ACTCGACTTT                 180
CACTTTTCTC TATCACTGAT AGGGAGTGGT AAACTCGACT TTCACTTTTC TCTATCACTG                 240
ATAGGGAGTG GTAAACTCGA CTTTCACTTT TCTCTATCAC TGATAGGGAG TGGTAAACTC                 300
GAGATCCGGC GAATTCGAAC ACGCAGATGC AGTCGGGGCG GCGCGGTCCG AGGTCCACTT                 360
CGCATATTAA GGTGACGCGT GTGGCCTCGA ACACCGAG                                         398
(2)SEQ ID NO：11的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：38碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑类型：线型
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：
ACTTTATCAC TGATAAACAA ACTTATCAGT GATAAAGA                      38
(2)SEQ ID NO：12的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：38碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑类型：线型
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：
ACTCTATCAT TGATAGAGTT CCCTATCAGT GATAGAGA                      38
(2)SEQ ID NO：13的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：38碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑类型：线型
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：
AGCTTATCAT CGATAAGCTA GTTTATCACA GTTAAATT                      38
(2)SEQ ID NO：14的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：38碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑类型：线型
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：
ACTCTATCAT TGATAGGGAA CTCTATCAAT GATAGGGA                         38
(2)SEQ ID NO：15的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：38碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑类型：线型
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：
AATCTATCAC TGATAGAGTA CCCTATCATC GATAGAGA                         38
(2)SEQ ID NO：16的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：621碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑类型：线型
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：
ATG TCT AGA TTA GAT AAA AGT AAA GTG ATT AAC AGC GCA TTA GAG CTG    48
Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu
1               5                   10                  15
CTT AAT GAG GTC GGA ATC GAA GGT TTA ACA ACC CGT AAA CTC GCC CAG      96
Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln
            20                  25                  30
AAG CTA GGT GTA GAG CAG CCT ACA TTG TAT TGG CAT GTA AAA AAT AAG     144
Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys
        35                  40                  45
CGG GCT TTG CTC GAC GCC TTA GCC ATT GAG ATG TTA GAT AGG CAC CAT     192
Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His His
    50                  55                  60
ACT CAC TTT TGC CCT TTA GAA GGG AGC AGC TGG CAA GAT TTT TTA CGT    240
Thr His Phe Cys Pro Leu Glu Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg
55                  70                  75                  80
AAT AAG GCT AAA AGT TTT AGA TGT GCT TTA CTA AGT CAT CGC GAT GGA     288
Asn Lys Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asp Gly
                85                  90                  95
GCA AAA GTA CAT TTA GGT ACA CGG CCT ACA GAA AAA CAG TAT GAA ACT     336
Ala Lys Val His Leu Gly Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr
            100                 105                 110
CTC GAA AAT CAA TTA GCC TTT TTA TGC CAA CAA GGT TTT TCA CTA GAG     384
Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu
        115                 120                 125
AAT GCA TTA TAT GCA CTC AGC GCT GTG GGG CAT TTT ACT TTA GGT TGC     432
Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys
    130                 135                 140
GTA TTG GAA GAT CAA GAG CAT CAA GTC GCT AAA GAA GAA AGG GAA ACA     480
Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr
145                 150                 155                 160
CCT ACT ACT GAT AGT ATG CCG CCA TTA TTA CGA CAA GCT ATC GAA TTA     528
Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu
                165                 170                 175
TTT GAT CAC CAA GGT GCA GAG CCA GCC TTC TTA TTC GGC CTT GAA TTG     576
Phe Asp His Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu
            180                 185                 190
ATC ATA TGC GGA TTA GAA AAA CAA CTT AAA TGT GAA AGT GGG TCC         621
Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Ser
        195                 200                 205
(2)SEQ ID NO：17的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：207氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑类型：线型
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：
Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu
1               5                   10                  15
Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln
            20                  25                  30
Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys
        35                  40                  45
Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His His
    50                  55                  60
Thr His Phe Cys Pro Leu Glu Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg
65                  70                  75                  80
Asn Lys Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asp Gly
                85                  90                  95
Ala Lys Val His Leu Gly Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr
            100                 105                 110
Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu
        115                 120                 125
Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys
    130                 135                 140
Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr
145                 150                 155                 160
Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu
                165                 170                 175
Phe Asp His Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu
            180                 185                 190
Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Ser
        195                 200                 205
(2)SEQ ID NO：18的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：621碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑类型：线型
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：
ATG TCT AGA TTA GAT AAA AGT AAA GTG ATT AAC AGC GCA TTA GAG CTG    48
Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu
1               5                   10                  15
CTT AAT GAG GTC GGA ATC GAA GGT TTA ACA ACC CGT AAA CTC GCC CAG    96
Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln
            20                  25                  30
AAG CTA GGT GTA GAG CAG CCT ACA CTG TAT TGG CAT GTA AAA AAT AAG     144
Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys
        35                  40                  45
CGG GCT TTG CTC GAC GCC TTA GCC ATT GAG ATG TTA GAT AGG CAC CAT     192
Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His His
    50                  55                  60
ACT CAC TTT TGC CCT TTA AAA GGG GAA AGC TGG CAA GAT TTT TTA CGC     240
Thr His Phe Cys Pro Leu Lys Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg
65                  70                  75                  80
AAT AAG GCT AAA AGT TTT AGA TGT GCT TTA CTA AGT CAT CGC AAT GGA     288
Asn Lys Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asn Gly
                85                  90                  95
GCA AAA GTA CAT TCA GAT ACA CGG CCT ACA GAA AAA CAG TAT GAA ACT     336
Ala Lys Val His Ser Asp Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr
            100                 105                 110
CTC GAA AAT CAA TTA GCC TTT TTA TGC CAA CAA GGT TTT TCA CTA GAG     384
Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu
        115                 120                 125
AAT GCA TTA TAT GCA CTC AGC GCT GTG GGG CAT TTT ACT TTA GGT TGC     432
Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys
    130                 135                 140
GTA TTG GAA GAT CAA GAG CAT CAA GTC GCT AAA GAA GAA AGG GAA ACA     480
Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr
145                 150                 155                 160
CCT ACT ACT GAT AGT ATG CCG CCA TTA TTA CGA CAA GCT ATC GAA TTA     528
Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu
                165                 170                 175
TTT GAT CAC CAA GGT GCA GAG CCA GCC TTC TTA TTC GGC CTT GAA TTG     576
Phe Asp His Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu
            180                 185                 190
ATC ATA TGC GGA TTA GAA AAA CAA CTT AAA TGT GAA AGT GGG TCC         621
Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Ser
        195                 200                 205
(2)SEQ ID NO：19的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：207碱基对
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑类型：线型
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：
Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu
1               5                   10                  15
Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln
            20                  25                  30
Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys
        35                  40                  45
Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His His
    50                  55                  60
Thr His Phe Cys Pro Leu Lys Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg
65                  70                  75                  80
Asn Lys Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asn Gly
                85                  90                  95
Ala Lys Val His Ser Asp Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr
            100                 105                 110
Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu
        115                 120                 125
Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys
    130                 135                 140
Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr
145                 150                 155                 160
Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu
                165                 170                 175
Phe Asp His Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu
            180                 185                 190
Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Ser
        195                 200                 205
(2)SEQ ID NO：20的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：192碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑类型：线型
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：
GAC ATG GAA AAA GCG ACA CCG GAG ACG ATG GTC CAT TGG ATT TGT CTG      48
Asp Met Glu Lys Ala Thr Pro Glu Thr Met Val His Trp Ile Cys Leu
1               5                   10                  15
AAG ATG GAG CCA GCT CTG TGG ATG GCC ATT ACA GCA ACA TCG CAC GGC      96
Lys Met Glu Pro Ala Leu Trp Met Ala Ile Thr Ala Thr Ser His Gly
            20                  25                  30
GCA AGG CAC AGG ACA TTC GTC GGG TTT TCC GGC TGC CTC CAC CGC AAA     144
Ala Arg His Arg Thr Phe Val Gly Phe Ser Gly Cys Leu His Arg Lys
        35                  40                  45
TCC CTC ACG TAC CCA GTG ATA TGC CTG AGC AAA CCG AGC CAG AGG ATT     192
Ser Leu Thr Tyr Pro Val Ile Cys Leu Ser Lys Pro Ser Gln Arg Ile
    50                  55                  60
(2)SEQ ID NO：21的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：64氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑类型：线型
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：
Asp Met Glu Lys Ala Thr Pro Glu Thr Met Val His Trp Ile Cys Leu
1               5                   10                  15
Lys Met Glu Pro Ala Leu Trp Met Ala Ile Thr Ala Thr Ser His Gly
            20                  25                  30
Ala Arg His Arg Thr Phe Val Gly Phe Ser Gly Cys Leu His Arg Lys
        35                  40                  45
Ser Leu Thr Tyr Pro Val Ile Cys Leu Ser Lys Pro Ser Gln Arg Ile
    50                  55                  60
(2)SEQ ID NO：22的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：816碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑类型：线型
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：
CTG GAC GAC TCG AAG CGC GTA GCC AAG CGG AAG CTG ATC GAG GAG AAC    48
Leu Asp Asp Ser Lys Arg Val Ala Lys Arg Lys Leu Ile Glu Glu Asn
1               5                   10                  15
CGG GAG CGG CGA CGC AAG GAG GAG ATG ATC AAA TCC CTG CAG CAC CGG      96
Arg Glu Arg Arg Arg Lys Glu Glu Met Ile Lys Ser Leu Gln His Arg
            20                  25                  30
CCC AGC CCC AGC GCA GAG GAG TGG GAG CTG ATC CAC GTG GTG ACC GAG     144
Pro Ser Pro Ser Ala Glu Glu Trp Glu Leu Ile His Val Val Thr Glu
        35                  40                  45
GCG CAC CGC AGC ACC AAC GCG CAG GGC AGC CAC TGG AAG CAG AGG AGG     192
Ala His Arg Ser Thr Asn Ala Gln Gly Ser His Trp Lys Gln Arg Arg
    50                  55                  60
AAA TTC CTG CTC GAA GAT ATC GGT CAG TCG CCC ATG GCC TCC ATG CTT     240
Lys Phe Leu Leu Glu Asp Ile Gly Gln Ser Pro Met Ala Ser Met Leu
65                  70                  75                  80
GAC GGG GAC AAA GTG GAC CTG GAG GCG TTC AGC GAG TTT ACA AAA ATC     288
Asp Gly Asp Lys Val Asp Leu Glu Ala Phe Ser Glu Phe Thr Lys Ile
                85                  90                  95
ATC ACG CCG GCC ATC ACC CGC GTG GTC GAC TTT GCC AAA AAC CTG CCC     336
Ile Thr Pro Ala Ile Thr Arg Val Val Asp Phe Ala Lys Asn Leu Pro
            100                 105                 110
ATG TTC TCG GAG CTG CCG TGC GAG GAT CAG ATC ATC CTG CTG AAG GGC     384
Met Phe Ser Glu Leu Pro Cys Glu Asp Gln Ile Ile Leu Leu Lys Gly
        115                 120                 125
TGC TGC ATG GAG ATC ATG TCG CTG CGC GCC GCC GTG CGC TAC GAC CCC     432
Cys Cys Met Glu Ile Met Ser Leu Arg Ala Ala Val Arg Tyr Asp Pro
    130                 135                 140
GAG AGC GAA ACG CTG ACG CTG AGC GGG GAA ATG GCC GTC AAA CGC GAG     480
Glu Ser Glu Thr Leu Thr Leu Ser Gly Glu Met Ala Val Lys Arg Glu
145                 150                 155                 160
CAG TTG AAG AAC GGA GGG CTG GGG GTC GTG TCT GAT GCC ATC TTC GAC     528
Gln Leu Lys Asn Gly Gly Leu Gly Val Val Ser Asp Ala Ile Phe Asp
                165                 170                 175
CTC GGC AAG TCG CTG TCT GCC TTC AAC CTG GAC GAC ACC GAG GTG GCC     576
Leu Gly Lys Ser Leu Ser Ala Phe Asn Leu Asp Asp Thr Glu Val Ala
            180                 185                 190
CTG CTG CAG GCC GTG CTG CTC ATG TCC TCA GAC CGG ACG GGG CTG ATC     624
Leu Leu Gln Ala Val Leu Leu Met Ser Ser Asp Arg Thr Gly Leu Ile
        195                 200                 205
TGC GTG GAT AAG ATA GAG AAG TGC CAG GAG TCG TAC CTG CTG GCG TTC     672
Cys Val Asp Lys Ile Glu Lys Cys Gln Glu Ser Tyr Leu Leu Ala Phe
    210                 215                 220
GAG CAC TAC ATC AAC TAC CGC AAA CAC AAC ATT CCC CAC TTC TGG TCC     720
Glu His Tyr Ile Asn Tyr Arg Lys His Asn Ile Pro His Phe Trp Ser
225                 230                 235                 240
AAG CTG CTG ATG AAG GTG GCG GAC CTG CGC ATG ATC GGC GCC TAC CAC     768
Lys Leu Leu Met Lys Val Ala Asp Leu Arg Met Ile Gly Ala Tyr His
                245                 250                 255
GCC AGC CGC TTC CTG CAC ATG AAG GTG GAG TGC CCC ACC GAG CTC TCC     816
Ala Ser Arg Phe Leu His Met Lys Val Glu Cys Pro Thr Glu Leu Ser
            260                 265                 270
(2)SEQ ID NO：23的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：272氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑类型：线型
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：
Leu Asp Asp Ser Lys Arg Val Ala Lys Arg Lys Leu Ile Glu Glu Asn
1               5                   10                  15
Arg Glu Arg Arg Arg Lys Glu Glu Met Ile Lys Ser Leu Gln His Arg
            20                  25                  30
Pro Ser Pro Ser Ala Glu Glu Trp Glu Leu Ile His Val Val Thr Glu
        35                  40                  45
Ala His Arg Ser Thr Asn Ala Gln Gly Ser His Trp Lys Gln Arg Arg
    50                  55                  60
Lys Phe Leu Leu Glu Asp Ile Gly Gln Ser Pro Met Ala Ser Met Leu
65                  70                  75                  80
Asp Gly Asp Lys Val Asp Leu Glu Ala Phe Ser Glu Phe Thr Lys Ile
                85                  90                  95
Ile Thr Pro Ala Ile Thr Arg Val Val Asp Phe Ala Lys Asn Leu Pro
            100                 105                 110
Met Phe Ser Glu Leu Pro Cys Glu Asp Gln Ile Ile Leu Leu Lys Gly
        115                 120                 125
Cys Cys Met Glu Ile Met Ser Leu Arg Ala Ala Val Arg Tyr Asp Pro
    130                 135                 140
Glu Ser Glu Thr Leu Thr Leu Ser Gly Glu Met Ala Val Lys Arg Glu
145                 150                 155                 160
Gln Leu Lys Asn Gly Gly Leu Gly Val Val Ser Asp Ala Ile Phe Asp
                165                 170                 175
Leu Gly Lys Ser Leu Ser Ala Phe Asn Leu Asp Asp Thr Glu Val Ala
            180                 185                 190
Leu Leu Gln Ala Val Leu Leu Met Ser Ser Asp Arg Thr Gly Leu Ile
        195                 200                 205
Cya Val Asp Lys Ile Glu Lys Cys Gln Glu Ser Tyr Leu Leu Ala Phe
    210                 215                 220
Glu His Tyr Ile Asn Tyr Arg Lys His Asn Ile Pro His Phe Trp Ser
225                 230                 235                 240
Lys Leu Leu Met Lys Val Ala Asp Leu Arg Met Ile Gly Ala Tyr His
                245                 250                 255
Ala Ser Arg Phe Leu His Met Lys Val Glu Cys Pro Thr Glu Leu Ser
            260                 265                 270
(2)SEQ ID NO：24的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：25碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑类型：线型
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：
TCCCCGGGTA ACTAAGTAAG  GATCC                                           25
(2)SEQ ID NO：25的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：24碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑类型：线型
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：
AGTGGGTCCC CGGGTGACAT GGAA                                             24
(2)SEQ ID NO：26的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：8氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑类型：线型
(ii)分子类型：多肽
(v)片段类型：内部的
(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：
Ser Gly Ser Pro Gly Asp Met Glu
1               5
(2)SEQ ID NO：27的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：24碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑类型：线型
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：
AGTGGGTCCC CGGGTCTGGA CGAC                                        24
(2)SEQ ID NO：28的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：8氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑类型：线型
(ii)分子类型：多肽
(v)片段类型：内部的
(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：
Ser Gly Ser Pro Gly Leu Asp Asp
1               5

Claims (14)

1.一种宿主细胞，其包含：
编码激活转录的第一融合蛋白的第一核酸，第一融合蛋白包含经操作连接在真核细胞中激活转录的第二多肽并结合tet操纵子序列的第一多肽；
编码抑制转录的第二融合蛋白的第二核酸，第二融合蛋白包含经操作连接在真核细胞中抑制转录的第四多肽并结合tet操纵子序列的第三多肽；
包含经操作连接到至少一段tet操纵子序列上的待转录核苷酸序列的第三核酸分子。
2.权利要求1的宿主细胞，其中当四环素或四环素类似物存在时第一多肽结合tet操纵子序列，当四环素或四环素类似物不存在时第三多肽结合tet操纵子序列。
3.权利要求1的宿主细胞，其中当四环素或四环素类似物不存在时第一多肽结合tet操纵子序列，当四环素或四环素类似物存在时第三多肽结合tet操纵子序列。
4.用于协同双向转录第一段和第二段待转录核苷酸序列的重组载体，该载体包含一段核苷酸序列，从5’到3’方向含有：
a)用于引入第一段待转录核苷酸序列的第一个克隆位点，其经操作连接于
b)至少一段tet操纵子序列，其经操作连接于
c)用于引入第二段待转录核苷酸序列的第二个克隆位点，
其中引入载体的第一段和第二段核苷酸序列的转录相对于至少一段tet操纵子序列反向进行。
5.权利要求4的重组载体，其中第一段和第二段待转录核苷酸序列已分别引入第一个和第二个克隆位点。
6.权利要求5的重组载体，其中第一段和第二段核苷酸序列编码异二聚体蛋白的多肽亚基。
7.权利要求5的重组载体，其中第一段核苷酸序列编码感兴趣蛋白，第二段核苷酸序列编码检测标记。
8.一种核酸组合物，它包含用于独立调节第一段和第二段待转录核苷酸序列转录的至少一种重组载体，该至少一种重组载体包含一段核苷酸序列，其含有：
a)用于引入第一段待转录核苷酸序列的第一个克隆位点，它经操作连接到至少一段第一种类型的tet操纵子序列上；和
b)用于引入第二段待转录核苷酸序列的第二个克隆位点，它经操作连接到至少一段第二种类型的tet操纵子序列上。
9.权利要求8的组合物，其中第一或第二种类型的tet操纵子序列是B类tet操纵子序列。
10.权利要求8的组合物，其中第一段和第二段待转录核苷酸序列已被分别引入第一个和第二个克隆位点。
11.权利要求10的组合物，其中第一段核苷酸序列含有治疗基因而第二段核苷酸序列含有自杀基因。
12.包含一种承载装置的试剂盒，所述承载装置中以紧密配合方式含有至少两个容纳装置，包括：
含有编码激活转录的融合蛋白的第一核酸的第一容纳装置，融合蛋白含有当四环素或四环素类似物存在时结合tet操纵子序列并经操作连接于在真核细胞中激活转录的第二多肽的第一多肽；和
含有第二核酸的第二容纳装置，该核酸包含用于引入经操作连接到至少一段tet操纵子序列上的待转录核苷酸序列的克隆位点。
13.权利要求12的试剂盒，其进一步包含含有编码抑制转录的融合蛋白的第三核酸的第三容纳装置，融合蛋白含有经操作连接于在真核细胞中抑制转录的异源第二多肽并结合tet操纵子序列的第一多肽。
14.权利要求13的试剂盒，其进一步包含含有四环素或四环素类似物的第四容纳装置。
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