ES2139552T3

ES2139552T3 - Moduladores transcripcionales regulados por tetraciclina.

Info

Publication number: ES2139552T3
Application number: ES95926605T
Authority: ES
Inventors: Hermann Bujard; Manfred Gossen
Original assignee: TET Systems Holding GmbH and Co KG
Current assignee: TET Systems Holding GmbH and Co KG
Priority date: 1994-07-01
Filing date: 1995-06-29
Publication date: 2006-04-16
Anticipated expiration: 2015-06-29
Also published as: JP2007295938A; EP1092771A2; DE69534472T2; JP4054058B2; EP0804565A1; JP4682176B2; FI965287A0; DE69534472D1; JP4820344B2; EP1092771A3; DK0804565T3; ES2139552T1; AU3092395A; NO315375B1; WO1996001313A1; DE804565T1; FI965287A7; CN1523112A; CA2193122A1; US20040003417A1

Abstract

SE PRESENTAN MOLECULAS Y PROTEINAS DE ACIDOS NUCLEICOS UTILES PARA REGULAR LA EXPRESION DE GENES EN CELULAS EUCARIOTICAS Y ORGANISMOS. EN LA INVENCION SE PRESENTA UNA PROTEINA DE FUSION ACTIVADORA TRANSCRIPCIONAL QUE SE ENLAZA A SECUENCIAS OPERADORAS TET Y ESTIMULA LA TRANSCRIPCION DE UN GEN ENLAZADO A UN OPERADOR TET EN PRESENCIA, PERO NO EN AUSENCIA, DE TETRACICLINA (O ANALOGO DE LA MISMA). EN LA INVENCION TAMBIEN SE PRESENTAN PROTEINAS DE FUSION INHIBIDORAS TRANSCRIPCIONALES QUE INHIBEN LA TRANSCRIPCION DE UN GEN ENLAZADO A UN OPERADOR TET DE FORMA CONTROLADA. EN UN ASPECTO DE LA INVENCION, LA PROTEINA DE FUSION INHIBIDORA SE ENLAZA A SECUENCIAS DE OPERADORES TET EN AUSENCIA, PERO NO EN PRESENCIA, DE TETRACICLINA (O ANALOGO DE LA MISMA). EN OTRO ASPECTO DE LA INVENCION, LA PROTEINA DE FUSION INHIBIDORA SE ENLAZA A SECUENCIAS DE OPERADORES TET EN PRESENCIA, PERO NO EN AUSENCIA, DE TETRACICLINA (O ANALOGO DE LA MISMA). LAS PROTEINAS DE FUSION ACTIVADORAS E INHIBIDORAS TRANSCRIPCIONALES DELA INVENCION SE PUEDEN UTILIZAR COMBINADAS PARA REGULAR LA EXPRESION DE UNO O DE MULTIPLES GENES ENLAZADOS A OPERADORES TET. TAMBIEN SE PRESENTAN NUEVAS UNIDADES DE TRANSCRIPCION QUE CONTIENEN OPERADORES TET QUE PERMITEN LA EXPRESION REGULADA POR TETRACICLINA COORDINADA O INDEPENDIENTE DE DOS O MAS GENES MEDIANTE LOS MODULADORES TRANSCRIPCIONALES DE LA INVENCION. TAMBIEN SE PRESENTAN EN LA INVENCION LOS KITS QUE INCLUYEN LOS COMPONENTES DEL SISTEMA REGULADOR.

Description

Moduladores transcripcionales regulados por tetraciclina.

Antecedentes de la invención

El análisis funcional de proteínas celulares se facilita mucho a través de cambios en el nivel de expresión del gen correspondiente para el análisis subsiguiente del fenotipo adjunto. Para este enfoque, es deseable un sistema de expresión inducible controlado por un estímulo externo. Idealmente, tal sistema no solo mediaría en un estado de "marcha/paro" para la expresión génica sino que también permitiría la expresión limitada de un gen a un nivel definido.

Se han realizado intentos de controlar la actividad génica usando diversos promotores eucarióticos inducibles, tales como los sensibles a iones de metales pesados (Mayo y otros (1982) Cell 29:99-108; Brinster y otros (1982) Nature 296:39-42; Searle y otros (1985) Mol. Cell. Biol. 5:1480-1489), choque térmico (Nouer y otros (1991) en Heat Shock Response, e.d. Nouer, L., CRC, Boca Raton, FL, pp167-220) u hormonas (Lee y otros (1981) Nature 294:228-232; Hynes y otros (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2038-2042; Klock y otros (1987) Nature 329:734-736; Israel y Kaufman (1989) Nucl. Acids Res. 17:2589-2604). Sin embargo, estos sistemas generalmente padecen uno o ambos de los siguientes problemas: (1) el inductor (por ejemplo, iones de metales pesados, choque térmico u hormonas esteroideas) provoca efectos pleiotrópicos, que pueden complicar el análisis, y (2) muchos sistemas promotores exhiben altos niveles de actividad basal en el estado no inducido, lo que impide desconectar el gen regulado y da como resultado factores de inducción moderados.

Un enfoque para evitar estas limitaciones es introducir elementos reguladores de especies evolutivamente distintas tales como E. coli en células eucarióticas superiores con la previsión de que los efectores que modulan tales circuitos reguladores serán inertes para la fisiología celular eucariótica y, por consiguiente, no provocarán efectos pleiotrópicos en células eucarióticas. Por ejemplo, el sistema represor (lacR)/operador/inductor de Lac de E. coli funciona en células eucarióticas y se ha usado para regular la expresión génica mediante tres enfoques diferentes: (1) prevención de la iniciación de la transcripción mediante operadores lac apropiadamente situados en sitios promotores (Hu y Davidson (1987) Cell 48:555-566; Brown y otros (1987) Cell 49:603-612; Figge y otros (1988) Cell 52:713-722; Fuerst y otros (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553: Deuschle y otros (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5400-5405); (2) bloqueo de RNA polimerasa II transcriptora durante la elongación mediante un complejo LacR/operador (Deuschle y otros (1990) Science 248:480-483); y (3) activación de un promotor sensible a una fusión entre LacR y el dominio de activación de la proteína 16 del virión (VP16) del virus de herpes simple (HSV) (Labow y otros (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Baim y otros (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076).

En una versión del sistema Lac, la expresión de secuencias conectadas al operador lac se activa constitutivamente mediante una proteína de fusión LacR-VP16 y se desconecta en presencia de isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) (Labow y otros (1990), citado anteriormente). En otra versión del sistema, se usa una variante de lacR-VP16 que se une a operadores lac en presencia de IPTG, lo que puede potenciarse incrementando la temperatura de las células (Baim y otros (1991), citado anteriormente). La utilidad de estos sistemas lac en células eucarióticas está limitada en parte debido a que el IPTG actúa lentamente e ineficazmente en células eucarióticas y debe usarse a concentraciones que se aproximan a los niveles citotóxicos. Alternativamente, es probable que el uso de un cambio de temperatura para inducir la expresión génica provoque efectos pleiotrópicos en las células. Así, existe una necesidad de un sistema regulador inducible más eficaz que exhiba una inducción rápida y de alto nivel de la expresión génica y en el que el inductor sea tolerado por células eucarióticas sin efectos citotóxicos o pleiotrópicos.

También se ha encontrado que los componentes del sistema de resistencia a la tetraciclina (Tc) de E. coli funcionan en células eucarióticas y se han usado para regular la expresión génica. Por ejemplo, el represor de Tet (TetR), que se une a secuencias operadoras tet en ausencia de tetraciclina y reprime la transcripción génica, se ha expresado en células de planta en concentraciones suficientemente altas para reprimir la transcripción de un promotor que contiene secuencias operadoras tet (Gatz, C. y otros (1992) Plant J. 2:397-404). Sin embargo, son necesarias concentraciones intracelulares muy altas de TetR para mantener la expresión génica regulada a la baja en células, lo que puede no alcanzarse en muchas situaciones, conduciendo así a "falta de ajuste" en el sistema.

En otros estudios, TetR se ha fusionado al dominio de activación de VP16 para crear un activador transcripcional controlado por tetraciclina (tTA) (Gossen, M. y Bujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551). La proteína de fusión tTA se regula mediante tetraciclina de la misma manera que TetR, es decir, tTA se une a secuencias operadoras tet en ausencia de tetraciclina pero no en presencia de tetraciclina. Así, en este sistema, en presencia continua de Tc, la expresión génica se evita y, para inducir la transcripción, se retira la Tc.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la invención se refiere a un ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 1, características preferidas del ácido nucleico se especifican en las reivindicaciones 2 a 6. En otro aspecto, la invención se refiere a una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 7, características preferidas de la proteína de fusión se especifican en la reivindicación 8. En un aspecto adicional, la invención se refiere a un vector recombinante como el especificado en la reivindicación 9 ó 33, características preferidas del vector se especifican en la reivindicación 10 ó 25 a 36. En un aspecto adicional, la invención se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 11, características preferidas del ácido nucleico se especifican en las reivindicaciones 12 a 17. En un aspecto adicional, la invención se refiere a una proteína de fusión que inhibe la transcripción de acuerdo con la reivindicación 18. En un aspecto adicional, la invención se refiere a un vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 19. En un aspecto adicional, la invención se refiere a una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 20, características preferidas de la célula huésped se especifican en las reivindicaciones 21 a 23. En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método in vitro para estimular o modular la transcripción de una secuencia de nucleótidos, de acuerdo con la reivindicación 24, características preferidas del método se especifican en la reivindicación 25. En un aspecto adicional, la invención se refiere a un ratón o una planta transgénicos de acuerdo con la reivindicación 26 ó 31, características preferidas de la invención se especifican en las reivindicaciones 27, 28 y 32. En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método de acuerdo con la reivindicación 29. En un aspecto adicional, la invención se refiere a una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 30, aspectos preferidos de la invención se especifican en la reivindicación 32. En un aspecto adicional, la invención se refiere al uso de acuerdo con la reivindicación 34, características preferidas del uso se especifican en las reivindicaciones 35 a 36. En un aspecto adicional, la invención se refiere a un sistema vectorial de acuerdo con la reivindicación 37, características preferidas del sistema se especifican en las reivindicaciones 39 a 41. En un aspecto adicional, la invención se refiere al uso de acuerdo con la reivindicación 38, características preferidas del uso se especifican en las reivindicaciones 39 a 41. En un aspecto adicional, la invención se refiere a un estuche de acuerdo con la reivindicación 42, características preferidas del estuche se especifican en las reivindicaciones 43 a 44. En un aspecto adicional, la invención se refiere al producto especificado en la reivindicación 45, características adicionales del producto se especifican en la reivindicación 46. En un aspecto adicional, la invención se refiere al uso especificado en la reivindicación 47. En un aspecto adicional, la invención se refiere al uso especificado en las reivindicaciones 48, 49, 50, 51 ó 52.

Se describe aquí un sistema regulador inducible que utiliza componentes del sistema represor/operador/inductor de Tet de procariotas para estimular la expresión génica en células eucarióticas. En el sistema, la transcripción de una secuencia de nucleótidos conectada al operador tet se mantiene silenciosa en ausencia de tetraciclina pero puede inducirse rápidamente y fuertemente en presencia de tetraciclina (o un análogo de la misma). La transcripción es inducida por una proteína de fusión compuesta por al menos dos polipéptidos, un primer polipéptido que se une a secuencias operadoras tet en presencia de tetraciclina o un análogo de tetraciclina y un segundo polipéptido que activa directamente o indirectamente la transcripción en células eucarióticas. En una primera modalidad, el primer polipéptido de la proteína de fusión es un represor de Tet mutado que está regulado por Tc de una manera intensa con respecto al represor silvestre, es decir, se une a secuencias operadoras tet en presencia en vez de en ausencia de Tc. Así, en ausencia del agente inductor (Tc o un análogo de Tc), la transcripción de una secuencia de nucleótidos conectada al operador tet permanece no inducida. En presencia del agente inductor, la transcripción de la secuencia de nucleótidos conectada al operador tet es estimulada por la proteína de fusión transactivadora de la invención.

El sistema regulador inducible tiene las propiedades ventajosas de que la inducción de la expresión génica es rápida, eficaz y fuerte (por ejemplo, típicamente entre 1000 y 2000 veces; se ha observado un incremento de hasta 20.000 veces en la expresión) y el agente inductor no tiene que estar continuamente presente. Por otra parte, el agente inductor no produce efectos pleiotrópicos o citotóxicos en células eucarióticas. El sistema regulador inducible puede aplicarse a la regulación de la expresión génica en células in vitro o in vivo, y particularmente puede ser útil para aplicaciones de terapia génica y para la expresión de productos génicos en organismos (por ejemplo, animales y plantas) recombinantes transgénicos y homólogos.

El sistema regulador inducible implica al menos dos componentes: un activador transcripcional inducible por tetraciclina y una unidad de transcripción diana que ha de regularse. De acuerdo con esto, un aspecto de la invención trata de una proteína de fusión activadora transcripcional inducible por Tc ("transactivadora") y un ácido nucleico (por ejemplo, DNA) que codifica la proteína de fusión. Una proteína de fusión preferida comprende un represor de Tet codificado por Tn10 que está mutado en al menos una posición de aminoácido seleccionada de las posiciones de aminoácido 71, 95, 101 y/o 102, conectado operativamente a un dominio de activación de la proteína del virión 16 (VP16) del virus de herpes simple (las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de tal proteína de fusión se muestran en las ID SEC Nº: 1 y 2, respectivamente). En una modalidad, el dominio de activación de la proteína de fusión incluye aproximadamente 127 aminoácidos C-terminales de VP16 (por ejemplo, la proteína de fusión de la ID SEC Nº: 2). En otra modalidad, el dominio de activación incluye al menos una copia de aproximadamente 11 aminoácidos C-terminales de VP16 (por ejemplo, cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la ID SEC Nº: 4). Otros represores de Tet mutados y dominios de activación transcripcional que tienen las actividades funcionales requeridas están dentro del alcance de la invención. Adicionalmente, la proteína de fusión transactivadora puede incluir un tercer polipéptido que promueve el transporte de la proteína de fusión a un núcleo celular. Por ejemplo, una señal de localización nuclear (por ejemplo, que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº: 5) puede incorporarse a la proteína de fusión. La invención proporciona además vectores recombinantes y células huésped que comprenden ácido nucleico que codifica una proteína de fusión transactivadora de la invención. También se describen organismos recombinantes transgénicos y homólogos que comprenden ácido nucleico que codifica una proteína de fusión transactivadora.

Un transactivador se usa para regular la transcripción de una unidad de transcripción diana compuesta por una secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse operativamente conectada a una secuencia promotora mínima y al menos una secuencia operadora tet. La secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse puede codificar una proteína de interés o una molécula de RNA activa (por ejemplo, molécula de RNA antisentido o ribozima) y puede ser una secuencia de nucleótidos exógena o endógena. Un primer ácido nucleico que codifica un transactivador y un segundo ácido nucleico que comprende una unidad de transcripción diana para el transactivador pueden incorporarse en una composición de ácido nucleico. La composición de ácido nucleico puede introducirse en células u organismos huésped (por ejemplo, animales y plantas recombinantes transgénicos y homólogos) para permitir la expresión inducible por tetraciclina de la secuencia de nucleótidos diana que ha de transcribirse.

Además de proporcionar un sistema regulador para la expresión de una sola secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse, también se describen nuevas unidades de transcripción diana que permiten la regulación coordinada e independiente de dos o más secuencias de nucleótidos que han de transcribirse. En una modalidad, la regulación coordinada de dos secuencias de nucleótidos que han de transcribirse se alcanza usando una unidad de transcripción en la que una primera secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse está conectada operativamente al extremo 5' de una secuencia o secuencias operadoras tet y una segunda secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse está conectada operativamente al extremo 3' de la misma secuencia o secuencias operadoras tet de modo que las secuencias de nucleótidos primera y segunda se transcriben de una manera divergente. Promotores bidireccionales adecuados para tales unidades de transcripción bidireccionales se muestran en las ID SEC Nº: 6 y 7. Tales unidades de transcripción son particularmente útiles para producir cantidades estequiométricas de dos subunidades de una proteína heterodímera (por ejemplo, cadenas de anticuerpo) en la misma célula o para coexpresar un gen de interés y un gen que codifica un marcador detectable en la misma célula, permitiendo de ese modo la selección de células que expresan el gen de interés.

En otra modalidad, la regulación independiente de dos secuencias de nucleótidos se alcanza usando una unidad de transcripción en la que una primera secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse está conectada operativamente a un operador tet de un primer tipo de clase y una segunda secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse está conectada operativamente a un operador tet de un segundo tipo de clase diferente. Dos proteínas de fusión activadoras transcripcionales diferentes se usan a continuación para regular la transcripción de las dos secuencias de nucleótidos. Una proteína de fusión se une a la primera clase de secuencias operadoras tet en presencia de Tc, mientras que la otra proteína de fusión se une a la segunda clase de secuencias operadoras tet en ausencia de Tc (o, alternativamente, la primera proteína de fusión se une a la primera clase de secuencias operadoras tet en ausencia de Tc y la segunda proteína de fusión se une a la segunda clase de secuencias operadoras tet en presencia de Tc). Esta unidad de transcripción es particularmente útil para regular independientemente la expresión de un gen terapéutico y un gen suicida en un huésped. Por ejemplo, la expresión del gen terapéutico se estimula en presencia de tetraciclina y a continuación, cuando se completa la terapia, la expresión del gen suicida se estimula retirando la tetraciclina.

También se describen métodos para estimular la transcripción de una secuencia de nucleótidos conectada operativamente a al menos una secuencia operadora tet en una célula o animal huésped que expresa una proteína de fusión transactivadora. En una célula huésped, la transcripción se estimula poniendo en contacto la célula con Tc o un análogo de Tc. En un sujeto (por ejemplo, organismos recombinantes transgénicos u homólogos), la transcripción se estimula administrando Tc o un análogo de Tc al sujeto. Diferentes análogos de Tc, y una variación de la concentración del agente inductor, pueden usarse para modular el nivel de inducción de la expresión génica. Análogos de Tc preferidos para la expresión génica de alto nivel incluyen anhidrotetraciclina y doxiciclina. También se describe un procedimiento para producir y aislar proteínas de interés usando el sistema regulador de la invención. También se describen inhibidores transcripcionales regulados por tetraciclina que son útiles para inhibir la expresión, de una manera altamente controlada, de un gen conectado a una o más secuencias operadoras tet. Los inhibidores transcripcionales de la invención comprenden una proteína de fusión compuesta por al menos dos polipéptidos, un primer polipéptido que se une a secuencias operadoras tet y un segundo polipéptido heterólogo que inhibe directamente o indirectamente la transcripción en células eucarióticas. El segundo polipéptido heterólogo se deriva de una proteína diferente que el primer polipéptido. Debido a que las proteínas de fusión de la invención incluyen un dominio silenciador transcripcional eucariótico, se anticipa que son más eficaces para reprimir la transcripción en células eucarióticas que un represor de Tet solo.

En una modalidad de la invención, el primer polipéptido de la proteína de fusión inhibidora se une a secuencias operadoras tet en ausencia pero no en presencia de tetraciclina (Tc) o un análogo de la misma (por ejemplo, el primer polipéptido es preferiblemente un represor de Tet, tal como un represor de Tet derivado de Tn10 que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº: 17). En ausencia de tetraciclina (o análogo de Tc), esta proteína de fusión se une a secuencias operadoras tet conectadas operativamente a un gen de interés, inhibiendo de ese modo la transcripción del gen de interés. En otra modalidad, el primer polipéptido se une a secuencias operadoras tet en presencia pero no en ausencia de tetraciclina (por ejemplo, el primer polipéptido es preferiblemente un represor de Tet mutado, tal como un represor Tet derivado de Tn10 que tiene una substitución de aminoácido en la posición 71, 95, 101 y/o 102). Preferiblemente, el primer polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº: 19. En presencia de tetraciclina (o análogo de Tc), esta proteína de fusión se une a secuencias operadoras tet conectadas operativamente a un gen de interés, inhibiendo de ese modo la transcripción del gen de interés.

El segundo polipéptido puede ser un dominio "silenciador" transcripcional procedente de una proteína tal como el producto oncogénico v-erbA, la proteína Krueppel de Drosophila, el represor de ácido retinoico alfa, el receptor de hormona tiroidea alfa, el complejo proteínico de Ssn6/Tup1 de levadura, la proteína de Drosophila even-skipped, SIR1, NeP1, la proteína dorsal de Drosophila, TSF3, SFI, la proteína hunchback de Drosophila, la proteína knirps de Drosophila, WT1, Oct-2.1, la proteína engrailed de Drosophila, E4BP4 o ZF5. Dominios silenciadores preferidos incluyen residuos de aminoácidos 403-466 de Krueppel (mostrados en la ID SEC Nº: 21) y residuos de aminoácido 364-635 de v-erbA (mostrados en la ID SEC Nº: 23).

Las proteínas de fusión pueden comprender además polipéptidos adicionales, tales como un tercer polipéptido que promueve el transporte de la proteína de fusión hacia un núcleo celular (es decir, una secuencia de aminoácidos de transporte nuclear).

También se describen moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican las proteínas de fusión inhibidoras transcripcionales y los vectores de expresión recombinantes que contienen estas moléculas de ácido nucleico en una forma adecuada para la expresión de la proteína de fusión inhibidora transcripcional codificada en una célula huésped. También se describen células huésped en las que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Así, una proteína de fusión inhibidora transcripcional se expresa en estas células huésped. La célula huésped puede ser, por ejemplo, una célula de mamífero (por ejemplo, una célula de ser humano), una célula de levadura, una célula fúngica o una célula de insecto. Por otra parte, la célula huésped puede ser un oocito no humano fertilizado, en cuyo caso la célula puede usarse para crear un organismo transgénico que tiene células que expresan la proteína de fusión inhibidora transcripcional. Además, el vector de expresión recombinante puede diseñarse para permitir la recombinación homóloga entre el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión y un gen diana en una célula huésped. Tales vectores de recombinación homólogos pueden usarse para crear animales recombinantes homólogos que expresan una proteína de fusión de la invención.

En una modalidad preferida, las células huésped (o células de un organismo huésped) también contienen una secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse operativamente conectada a al menos una secuencia operadora tet (por ejemplo, un gen de interés cuya expresión puede regularse mediante Tc o un análogo de la misma). Para regular la transcripción del gen de interés conectado al operador tet en estas células huésped, la concentración de Tc (o análogo de la misma) en contacto con la célula huésped se altera. Por ejemplo, cuando la proteína de fusión inhibidora transcripcional se une a secuencias operadoras tet en ausencia de Tc, la concentración de Tc en contacto con las células se disminuye para inhibir de ese modo la transcripción del gen de interés conectado al operador tet (por ejemplo, si las células se cultivan en primer lugar en presencia de Tc, a continuación la Tc puede retirarse del medio de cultivo para inhibir la transcripción del gen de interés). Alternativamente, cuando la proteína de fusión inhibidora transcripcional se une a secuencias operadoras tet en presencia de Tc, la concentración de Tc en contacto con las células se incrementa para inhibir de ese modo la transcripción del gen de interés conectado al operador tet (por ejemplo, si las células se cultivan en primer lugar en ausencia de Tc, a continuación puede añadirse Tc al medio de cultivo para inhibir la transcripción del gen de interés).

Las proteínas de fusión inhibidoras transcripcionales son útiles para inhibir la expresión génica en una variedad de situaciones, según se describe adicionalmente aquí. En una modalidad particularmente preferida, la transcripción de un gen de interés conectado al operador tet (tetO) se regula mediante una combinación de inhibidor transcripcional regulado por tetraciclina y proteínas de fusión activadoras en la misma célula huésped para permitir el control preciso del nivel de expresión del gen de interés. Por ejemplo, una proteína de fusión activadora que se une a tetO solo en presencia de Tc y una proteína de fusión inhibidora que se une a tetO solo en ausencia de Tc se expresan en una célula huésped que contiene un gen de interés conectado a tetO. En ausencia de Tc, los niveles basales de transcripción del gen de interés son inhibidos por la proteína de fusión inhibidora. Durante el contacto de la célula con Tc (o análogo), la transcripción del gen de interés se estimula mediante la proteína de fusión activadora. Las proteínas de fusión activadora e inhibidora de la invención también pueden usarse en combinación para regular la expresión de múltiples genes de interés conectados a tetO.

También se describen nuevos estuches para regular la expresión de un gen de interés. En una modalidad, los estuches pueden incluir al menos una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión transactivadora de la invención y una unidad de transcripción diana en la que puede clonarse un gen de interés de modo que el gen esté conectado operativamente a una secuencia o secuencias operadoras tet. Alternativamente o adicionalmente, los estuches pueden incluir una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión inhibidora transcripcional de la invención. Unidades de transcripción diana en las que pueden clonarse múltiples genes de interés, por ejemplo, para la regulación coordinada o independiente, también pueden incluirse en los estuches de la invención. Por otra parte, al menos una tetraciclina o análogo de tetraciclina puede incluirse en los estuches.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un gráfico de barras que representa la estimulación de actividad de luciferasa en células HR5-C11 mediante tetraciclina y diferentes análogos de tetraciclina (1 \mug/ml de c.f.). Las células se hicieron crecer en ausencia (-) o presencia de las tetraciclinas indicadas durante 3 días antes de que se determinara la actividad de luciferasa. Cada barra sólida y sombreada representa la actividad de luciferasa de un solo plato de cultivo.

La Figura 2 es una gráfica que representa la actividad de luciferasa relativa en células HR5-C11 cuando se incuban con diferentes concentraciones de doxiciclina. Se muestran los resultados de tres experimentos independientes.

La Figura 3 es una gráfica que representa la cinética de inducción de la actividad de luciferasa en células HR5-C11 mediante doxiciclina. Los cultivos de HR5-C11 se expusieron a 1 \mug/ml de doxiciclina y la actividad de luciferasa se midió después de diferentes intervalos de tiempo; (\bullet) cultivos que contienen doxiciclina, (\circ) cultivos desarrollados en ausencia de antibiótico.

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La Figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos de diversas clases de represores de Tet, que ilustran la homología entre las secuencias de aminoácidos de diferentes clases de represores de Tet, en comparación con represores de Tet de clase B (por ejemplo, derivados de Tn10). Las posiciones de aminoácidos en otras clases de represores de Tet que son idénticas a la clase B se indican mediante un guión.

La Figura 5 muestra las secuencias de nucleótidos de operadores tet de diferentes clases: clase A (ID SEC Nº: 11), clase B (ID SEC Nº: 12), clase C (ID SEC Nº: 13), clase D (ID SEC Nº: 14) y clase E (ID SEC Nº: 15).

La Figura 6 es un diagrama esquemático de un constructo promotor bidireccional para la regulación coordinada de dos genes de interés conectados operativamente a los mismos operadores tet para la regulación mediante un activador transcripcional regulado por tetraciclina.

La Figura 7A (ID SEC Nº: 6) muestra la secuencia de nucleótidos de una región promotora bidireccional para la regulación coordinada de dos genes de interés por un activador transcripcional regulado por tetraciclina.

La Figura 7B (ID SEC Nº: 7) muestra la secuencia de nucleótidos de una región promotora bidireccional para la regulación coordinada de dos genes de interés mediante un activador transcripcional regulado por tetraciclina.

La Figura 8 es dos gráficas que representan la expresión coordinada de actividad de luciferasa y \beta-galactosidasa mediante un activador transcripcional regulado por tetraciclina.

Las Figuras 9A-B son diagramas esquemáticos de promotores autorreguladores para la expresión de activadores transcripcionales (tTA) regulados por tetraciclina. El cuadro A ilustra la autorregulación de la expresión de una proteína de fusión transactivadora que contiene represor de Tet silvestre que se une a operadores tet en ausencia de Tc. El cuadro B ilustra la autorregulación de la expresión de una proteína de fusión transactivadora que contiene represor de Tet mutado que se une a operadores tet en presencia de Tc.

La Figura 10 es un diagrama esquemático de la regulación positiva y negativa de un gen de interés conectado a operador tet (tetOwt) mediante una proteína inhibidora transcripcional (tSD) regulada por tetraciclina y una proteína de fusión activadora transcripcional (rtTA) inducible por tetraciclina, respectivamente, en presencia de concentraciones crecientes del análogo de tetraciclina doxiciclina.

La Figura 11 es un diagrama esquemático de la construcción de constructos de fusión de TetR-dominio silenciador mediante fusión en el marco de ácido nucleico que codifica un dominio silenciador de Krueppel o v-erbA al extremo 3' del ácido nucleico que codifica un represor de Tet (gen tetR).

La Figura 12 es una representación gráfica de la expresión de la actividad de luciferasa en ratones transgénicos para el gen informador de luciferasa solo (columnas a cuadros a la derecha) o animales transgénicos dobles que portan el gen informador de luciferasa y un transgén tTA^{R}, en ausencia de doxiciclina (columnas oscuras en el medio) o en presencia de doxiciclina (columnas claras a la izquierda).

Descripción detallada de la invención

Esta invención trata de moléculas de ácido nucleico y proteínas que pueden usarse para regular la expresión de genes en células eucarióticas o animales de una manera altamente controlada. La regulación de la expresión génica mediante el sistema de la invención implica al menos dos componentes: un gen que está conectado operativamente a una secuencia reguladora y una proteína que, en presencia o ausencia de un agente inducible, se une a la secuencia reguladora y activa o inhibe la transcripción del gen. El sistema de la invención utiliza componentes del sistema represor/operador/inductor de Tet de procariotas para estimular la expresión génica en células eucarióticas.

Diversos aspectos de la invención tratan de proteínas de fusión que son capaces de activar o inhibir la transcripción génica cuando se unen a secuencias operadoras tet (tetO), pero que se unen a secuencias operadoras tet solo en presencia o, alternativamente, en ausencia de tetraciclina o un análogo de la misma. Así, en una célula huésped, la transcripción de un gen conectado operativamente a una secuencia o secuencias operadoras tet se estimula o inhibe mediante una proteína de fusión de la invención alterando la concentración de tetraciclina (o análogo) en contacto con la célula huésped (por ejemplo, añadiendo o retirando tetraciclina de un medio de cultivo o administrando o dejando de administrar tetraciclina a un organismo huésped, etc.).

La invención trata además de unidades de transcripción diana para la regulación mediante la proteína de fusión de la invención. Además de permitir la regulación de un solo gen de interés conectado al operador tet, la invención también proporciona nuevas unidades de transcripción que contienen dos o más genes que han de transcribirse que pueden regularse de una manera coordinada o independiente mediante una proteína de fusión transactivadora de la invención. También son abarcados por la presente invención métodos para estimular o inhibir la transcripción de un gen usando tetraciclina (o análogos de la misma) y estuches que contienen los componentes del sistema regulador descrito aquí.

En las siguientes subsecciones, los ácidos nucleicos y las proteínas que comprenden los componentes del sistema regulador de la invención, y su interrelación, se analizan con mayor detalle. Las subsecciones son como sigue:

I. Activadores Transcripcionales Inducibles por Tetraciclina

A.: El primer polipéptido de la proteína de fusión transactivadora

B.: El segundo polipéptido de la proteína de fusión transactivadora

C.: Un tercer polipéptido de la proteína de fusión transactivadora

II. Expresión de una Proteína de Fusión Transactivadora

A.: Vectores de expresión

B.: Células huésped

C.: Introducción de ácido nucleico en células huésped

D.: Organismos transgénicos

E.: Organismos recombinantes homólogos

III. Unidades de Transcripción Diana Reguladas por un Transactivador Inducible con Tetraciclina

A.: Regulación de la expresión de secuencias de nucleótidos conectadas al operador tet

B.: Regulación coordinada de dos secuencias de nucleótidos

C.: Regulación independiente de múltiples secuencias de nucleótidos

D.: Regulación coordinada e independiente combinada de múltiples secuencias de nucleótidos

IV. Inhibidores Transcripcionales Regulados por Tetraciclina

A.: El primer polipéptido de la proteína de fusión inhibidora transcripcional

B.: El segundo polipéptido de la proteína de fusión inhibidora transcripcional

C.: Un tercer polipéptido de la proteína de fusión inhibidora transcripcional

D.: Expresión de la proteína de fusión inhibidora transcripcional

V. Estuches de la Invención

VI. Regulación de la Expresión Génica por Tetraciclina o Análogos de la Misma

A.: Estimulación de la expresión génica por proteínas de fusión transactivadoras

B.: Inhibición de la expresión génica por proteínas de fusión inhibidoras transcripcionales

C.: Regulación positiva y negativa combinada de la expresión génica

VII. Aplicaciones de la Invención

A.: Terapia génica

B.: Producción de proteínas in vitro

C.: Producción de proteínas in vivo

D.: Modelos animales de enfermedad humana

E.: Producción de líneas celulares estables para clonación

I. Activadores Transcripcionales Inducibles por Tetraciclina

En el sistema regulador de la invención, la transcripción de un gen es activada por una proteína activadora transcripcional, también denominada aquí simplemente un transactivador. El transactivador de la invención es una proteína de fusión. Un aspecto de la invención trata así de proteínas de fusión y ácidos nucleicos (por ejemplo, DNA) que codifican proteínas de fusión. El término "proteína de fusión" pretende describir al menos dos polipéptidos, típicamente de fuentes diferentes, que están conectados operativamente. Con respecto a los polipéptidos, el término "conectados operativamente" pretende significar que los dos polipéptidos están acoplados de una manera tal que cada polipéptido puede servir a su función pretendida. Típicamente, los dos polipéptidos están enlazados covalentemente a través de enlaces peptídicos. La proteína de fusión se produce preferiblemente mediante técnicas de DNA recombinante estándar. Por ejemplo, una molécula de DNA que codifica el primer polipéptido se liga a otra molécula de DNA que codifica el segundo polipéptido y la molécula de DNA híbrida resultante se expresa en una célula huésped para producir la proteína de fusión. Las moléculas de DNA se ligan entre sí en una orientación 5' a 3' de modo que, después de la ligación, el marco traduccional de los polipéptidos codificados no se altere (es decir, las moléculas de DNA se ligan entre sí en el marco).

A. El primer polipéptido de la proteína de fusión transactivadora

La proteína de fusión transactivadora de la invención está compuesta, en parte, por un primer polipéptido que se une a una secuencia operadora tet en presencia de tetraciclina (Tc) o un análogo de la misma. El primer polipéptido de la proteína de fusión es preferiblemente un represor de Tet mutado. El término "represor de Tet mutado" pretende incluir polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es similar a un represor de Tet silvestre pero que tiene al menos una diferencia de aminoácido con respecto al represor de Tet silvestre. El término "represor de Tet silvestre" pretende describir una proteína presente en la naturaleza que reprime la transcripción de secuencias operadoras tet en células procarióticas en ausencia de Tc. La diferencia o diferencias de aminoácidos entre un represor de Tet mutado y un represor de Tet silvestre puede ser la substitución de uno o más aminoácidos, la deleción de uno o más aminoácidos o la adición de uno o más aminoácidos. El represor de Tet mutado de la invención tiene las siguientes propiedades funcionales: 1) el polipéptido puede unirse a una secuencia operadora tet, es decir, retiene la especificidad de unión a DNA de un represor de tet silvestre; y 2) es regulado de una manera inversa por la tetraciclina que un represor de Tet silvestre, es decir, el represor de Tet mutado se une a una secuencia operadora tet solo en presencia de Tc (o un análogo de Tc) en vez de en ausencia de Tc.

En una modalidad preferida, un represor de Tet mutado que tiene las propiedades funcionales descritas anteriormente se crea mediante la substitución de residuos de aminoácido en la secuencia de un represor de Tet silvestre. Por ejemplo, según se describe en el Ejemplo 1, un represor de Tet derivado de Tn10 que tiene substituciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácido 71, 95, 101 y 102 tiene las propiedades funcionales deseadas y así puede usarse como el primer polipéptido en la proteína de fusión transactivadora de la invención. La secuencia de aminoácidos de este represor de Tet mutado se muestra en la ID SEC Nº: 2 (posiciones 1-207). En una modalidad del represor de Tet mutado, la posición 71 se muta desde ácido glutámico en lisina, la posición 95 se muta desde ácido aspártico en asparagina, la posición 101 se muta desde leucina en serina y la posición 102 se muta desde glicina en ácido aspártico, aunque la invención no está limitada a estas mutaciones particulares. La mutación de menos de estas cuatro posiciones de aminoácido puede ser suficiente para alcanzar un represor de Tet con las propiedades funcionales deseadas. De acuerdo con esto, un represor de Tet se muta preferiblemente en al menos una de estas posiciones. Otras substituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en estas u otras posiciones de aminoácido que retienen las propiedades funcionales del represor de Tet mutado están dentro del alcance de la invención. La estructura cristalina de un complejo de represor de Tet-tetraciclina, según se describe en Hinrichs, W. y otros (1994) Science 264:418-420, puede usarse para el diseño racional de represores de Tet mutados. Basándose en esta estructura, la posición de aminoácido 71 se sitúa fuera del bolsillo de unión a tetraciclina, sugiriendo que la mutación en este sitio puede no ser necesaria para alcanzar las propiedades funcionales de un represor de Tet mutado de la invención. En contraste, las posiciones de aminoácido 95, 101 y 102 están situadas dentro del bolsillo de unión a tetraciclina conservada. Así, el bolsillo de unión a tetraciclina de un represor de Tet puede orientarse para la mutación para crear un represor de Tet mutado de la invención.

Represores de Tet mutados adicionales para la incorporación en una proteína de fusión de la invención pueden crearse de acuerdo con las enseñanzas de la invención. Se ha descrito un número de clases diferentes de represores de Tet, por ejemplo A, B, C, D y E (de las cuales, el represor codificado por Tn10 es un represor de clase B). Las secuencias de aminoácidos de las diferentes clases de represores de Tet comparten un alto grado de homología (es decir, 40-60% a lo largo de la longitud de las proteínas), incluyendo en la región que abarca las mutaciones descritas anteriormente. Las secuencias de aminoácidos de diversas clases de represores de Tet se muestran y se comparan en la Figura 4 y también se describen en Tovar, K. y otros (1988) Mol. Gen. Genet. 215:76-80. De acuerdo con esto, pueden realizarse mutaciones equivalentes a las descritas anteriormente para el represor de Tet derivado de Tn10 en otras clases de represores de Tet para la inclusión en una proteína de fusión de la invención. Por ejemplo, la posición de aminoácido 95, que es un ácido aspártico en las cinco clases de represores, puede mutarse en asparagina en cualquier clase de represor. De forma similar, la posición 102, que es glicina en las cinco clases de represores, puede mutarse en ácido aspártico en cualquier clase de represor. Mutaciones equivalentes adecuadas adicionales serán evidentes para los expertos en la especialidad y pueden crearse y probarse con respecto a la funcionalidad mediante procedimientos descritos aquí. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de represores de Tet de las clases A, C, D y E se describen en Waters, S.H. y otros (1983) Nucl. Acids Res 11:6089-6105, Unger, B. y otros (1984) Gene 31: 103-108, Unger, B. y otros (1984) Nucl Acids Res. 12:7693-7703 y Tovar, K. y otros (1988) Mol. Gen. Genet. 215:76-80, respectivamente. Estas secuencias silvestres pueden mutarse de acuerdo con las enseñanzas de la invención para el uso en el sistema regulador inducible descrito aquí.

Alternativamente a las mutaciones descritas anteriormente, pueden crearse represores de Tet adecuados adicionales (es decir, que tienen las propiedades funcionales deseadas descritas anteriormente) mediante mutagénesis de un represor de Tet silvestre y selección según se describe en el Ejemplo 1. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de represores de Tet de clase B silvestres se describen en Hillen, W. y Schollmeier, K. (1983) Nucl. Acids Res. 11:525-539 y Postle, K. y otros (1984) Nucl. Acids Res. 12:4849-4863. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de represores de tipo clase A, C, D y E silvestres se citan anteriormente. Un represor de Tet mutado puede crearse y seleccionarse, por ejemplo, como sigue: un ácido nucleico (por ejemplo, DNA) que codifica un represor de Tet silvestre se somete a mutagénesis aleatoria y los ácidos nucleicos mutados resultantes se incorporan en un vector de expresión y se introducen en una célula huésped para el rastreo. Se usa un ensayo de rastreo que permite la selección de un represor de Tet que se une a una secuencia operadora Tet solo en presencia de tetraciclina. Por ejemplo, una biblioteca de ácidos nucleicos mutados en un vector de expresión puede introducirse en una cepa de E. coli en la que secuencias operadoras tet controlan la expresión de un gen que codifica un represor de Lac y el represor de Lac controla la expresión de un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a fármacos). La unión de un represor de Tet a secuencias operadoras tet en la bacteria inhibirá la expresión del represor de Lac, induciendo de ese modo la expresión del gen marcador seleccionado. Se seleccionan células que expresan el gen marcador basándose en el fenotipo seleccionable (por ejemplo, resistencia a fármacos). Para represores de Tet silvestres, la expresión del gen marcador seleccionable se producirá en ausencia de Tc. Un ácido nucleico que codifica un represor de Tet mutado se selecciona usando este sistema basándose en la capacidad del ácido nucleico para inducir la expresión del gen marcador seleccionable en la bacteria solo en presencia de Tc.

Un primer polipéptido de la proteína de fusión transactivadora (por ejemplo, el represor de Tet mutado) tiene la propiedad de unirse específicamente a una secuencia operadora tet. Cada clase de represor de Tet tiene una secuencia operadora tet diana correspondiente. De acuerdo con esto, el término "secuencia operadora tet" pretende abarcar todas las clases de secuencias operadoras tet, por ejemplo la clase A, B, C, D y E. Secuencias de nucleótidos de estas cinco clases de operadores tet se muestran en la Figura 5 y las ID SEC Nº: 11-15, y se describen en Waters, S.H. y otros (1983), citado anteriormente, Hillen, W. y Schollenmeier, K. (1983) citado anteriormente, Stüber, D. y Bujard, H. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:167-171, Unger, B. y otros (1984), citado anteriormente, y Tovar, K. y otros (1988), citado anteriormente. En una modalidad preferida, el represor de Tet mutado es un represor codificado por Tn10 (es decir, clase B) y la secuencia operadora tet es una secuencia operadora tet de clase B. Alternativamente, un represor de Tet de clase A mutado puede usarse con una secuencia operadora tet de clase A, etc., para las otras clases de represor/operadores de Tet.

Otro enfoque para crear un represor de Tet mutado que se une a un operador tet de clase A es mutar adicionalmente el represor de Tet derivado de Tn10 descrito aquí (un represor de clase B) ya mutado de modo que ya no se una eficazmente a un operador de tipo clase B pero en cambio se una eficazmente a un operador de tipo clase A. Se ha encontrado que la posición del nucleótido 6 de operadores tipo clase A o B es el nucleótido crítico para el reconocimiento del operador por su represor complementario (la posición 6 es un par G/C en operadores de clase B y un par A/T en operadores de clase A) (véase Wissman y otros (1988) J. Mol. Biol. 202:397-406). También se ha encontrado que la posición de aminoácido 40 de un represor de Tet de clase A o clase B es el residuo de aminoácido crítico para el reconocimiento de la posición 6 del operador (la posición de aminoácido 40 es una treonina en represores de clase B pero es una alanina en represores de clase A). Se ha encontrado además que la substitución de Thr40 de un represor de clase B por Ala altera su especificidad de unión de modo que el represor puede unirse ahora a un operador de clase A (de forma similar, la substitución de Ala40 de un represor de clase A por Thr altera su especificidad de unión de modo que el represor puede unirse ahora a un operador de clase B) (véase Altschmied y otros (1988) EMBO J. 7:4011-4017). De acuerdo con esto, puede alterarse la especificidad de unión del represor de Tet derivado de Tn10 mutado descrito aquí cambiando adicionalmente el residuo de aminoácido 40 de Thr por Ala mediante técnicas de biología molecular estándar (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio).

Un represor de Tet mutado que tiene mutaciones específicas (por ejemplo, en las posiciones 71, 95, 101 y/o 102, según se describe anteriormente) puede crearse introduciendo cambios de nucleótidos en un ácido nucleico que codifica un represor silvestre mediante técnicas de biología molecular estándar, por ejemplo mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por PCR usando cebadores oligonucleotídicos que incorporan las mutaciones de nucleótidos. Alternativamente, cuando un represor de Tet mutado se identifica mediante selección a partir de una biblioteca, el ácido nucleico mutado puede recuperarse del vector de la biblioteca. Para crear una proteína de fusión transactivadora de la invención, un ácido nucleico que codifica un represor de Tet mutado se liga a continuación en el marco a otro ácido nucleico que codifica un dominio de activación transcripcional y el constructo de fusión se incorpora en un vector de expresión recombinante. La proteína de fusión transactivadora puede expresarse introduciendo el vector de expresión recombinante en una célula o animal huésped.

B. El segundo polipéptido de la proteína de fusión transactivadora

El primer polipéptido de la proteína de fusión transactivadora está conectado operativamente a un segundo polipéptido que activa directamente o indirectamente la transcripción en células eucarióticas. Para conectar operativamente los polipéptidos primero y segundo, típicamente, secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos primero y segundo se ligan entre sí en el marco para crear un gen quimérico que codifica una proteína de fusión, aunque los polipéptidos primero y segundo pueden conectarse operativamente por otros medios que conservan la función de cada polipéptido (por ejemplo, reticularse químicamente). En una modalidad preferida, el segundo polipéptido del propio transactivador posee actividad de activación transcripcional (es decir, el segundo polipéptido activa directamente la transcripción). En otra modalidad, el segundo polipéptido activa la transcripción mediante un mecanismo indirecto, a través del reclutamiento de una proteína de activación transcripcional para interactuar con la proteína de fusión. De acuerdo con esto, el término "un polipéptido que activa la transcripción en células eucarióticas", según se usa aquí, pretende incluir polipéptidos que activan directamente o indirectamente la transcripción.

Polipéptidos que pueden funcionar para activar la transcripción en células eucarióticas son bien conocidos en la especialidad. En particular, se han descrito dominios de activación transcripcional de muchas proteínas de unión a DNA y se ha mostrado que retienen su función de activación cuando el dominio se transfiere a una proteína heteróloga. Un polipéptido preferido para usar en la proteína de fusión de la invención es la proteína del virión 16 del virus del herpes simple (denominada aquí VP16, cuya secuencia de aminoácidos se describe en Triezenberg, S.J. y otros (1988) Genes Dev. 2:718-729). En una modalidad, se usan aproximadamente 127 de los aminoácidos C-terminales de VP16. Por ejemplo, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº: 2 (posiciones 208-335) puede usarse como el segundo polipéptido en la proteína de fusión. En otra modalidad, al menos una copia de aproximadamente 11 aminoácidos de la región C-terminal de VP16 que retiene la capacidad de activación transcripcional se usa como el segundo polipéptido. Preferiblemente, se usa un dímero de esta región (es decir, aproximadamente 22 aminoácidos). Porciones peptídicas C-terminales adecuadas de VP16 se describen en Seipel, K. y otros (EMBO J. (1992) 13:4961-4968). Por ejemplo, un dímero de un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº: 4 (codificada con una secuencia de nucleótidos mostrada en la ID SEC Nº: 3) puede usarse como el segundo polipéptido en la proteína de fusión.

Otros polipéptidos con capacidad de activación transcripcional en células eucarióticas pueden usarse en la proteína de fusión de la invención. Los dominios de activación transcripcional encontrados dentro de diversas proteínas se han agrupado en categorías basándose en características estructurales similares. Tipos de dominios de activación transcripcional incluyen dominios de activación de la transcripción ácidos, dominios de activación de la transcripción ricos en prolina, dominios de activación de la transcripción ricos en serina/treonina y dominios de activación de la transcripción ricos en glutamina. Ejemplos de dominios de activación transcripcional ácidos incluyen las regiones de VP16 ya descritas y los residuos de aminoácido 753-881 de GAL4. Ejemplos de dominios de activación ricos en prolina incluyen los residuos de aminoácido 399-499 de CTF/NF1 y los residuos de aminoácido 31-76 de AP2. Ejemplos de dominios de activación de la transcripción ricos en serina/treonina incluyen los residuos de aminoácido 1-427 de ITF1 y los residuos de aminoácido 2-451 de ITF2. Ejemplos de dominios de activación ricos en glutamina incluyen los residuos de aminoácido 175-269 de Oct1 y los residuos de aminoácido 132-243 de Sp1. Las secuencias de aminoácido de cada una de las regiones descritas anteriormente, y de otros dominios de activación transcripcional útiles, se describen en Seipel, K. y otros (EMBO J. (1992) 13:4961-4968).

Además de dominios de activación transcripcional descritos previamente, nuevos dominios de activación transcripcional, que pueden identificarse mediante técnicas estándar, están dentro del alcance de la invención. La capacidad de activación transcripcional de un polipéptido puede ensayarse conectando el polipéptido a otro polipéptido que tiene actividad de unión a DNA y determinando la cantidad de transcripción de una secuencia diana que se estimula mediante la proteína de fusión. Por ejemplo, un ensayo estándar usado en la especialidad utiliza una proteína de fusión y un dominio de activación transcripcional putativo y un dominio de unión a DNA de GAL4 (por ejemplo, residuos de aminoácido 1-93). Esta proteína de fusión se usa a continuación para estimular la expresión de un gen informador conectado a sitios de unión a GAL4 (véase, por ejemplo, Seipel, K. y otros (EMBO J. (1992) 11:4961-4968 y las referencias citadas allí).

En otra modalidad, el segundo polipéptido de la proteína de fusión activa indirectamente la transcripción reclutando un activador transcripcional para interactuar con la proteína de fusión. Por ejemplo, un tetR mutado de la invención puede fusionarse a un dominio polipeptídico (por ejemplo, un dominio de dimerización) capaz de mediar en una interacción proteína-proteína con una proteína activadora transcripcional, tal como un activador endógeno presente en una célula huésped. Se ha demostrado que las asociaciones funcionales entre dominios que se unen a DNA y dominios de transactivación no necesitan ser covalentes (véanse, por ejemplo, Fields y Song (1989) Nature 340:245-247; Chien y otros (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578-9582; Gyuris y otros (1993) Cell 75:791-803 y Zervos, A.S. (1993) Cell 72:223-232). De acuerdo con esto, el segundo polipéptido de la proteína de fusión puede no activar directamente la transcripción sino que en cambio puede formar una interacción estable con un polipéptido endógeno que tiene un dominio de interacción proteína-proteína y un dominio de transactivación compatibles. Ejemplos de dominios de interacción (o dimerización) adecuados incluyen cremalleras de leucina (Landschulz y otros (1989) Science 243:1681-1688), dominios hélice-bucle-hélice (Murre, C. y otros (1989) Cell 58:537-544) y dominios de dedo de zinc (Frankel, A.D. y otros (1988) Science 240:70-73). La interacción de un dominio de dimerización presente en la proteína de fusión con un factor nuclear endógeno da como resultado el reclutamiento del dominio de transactivación del factor nuclear hacia la proteína de fusión y de ese modo hacia una secuencia operadora tet a la que está unida la proteína de fusión.

C. Un tercer polipéptido de la proteína de fusión transactivadora

Además de un represor de Tet mutado y un dominio de activación transcripcional, una proteína de fusión de la invención puede contener un tercer polipéptido conectado operativamente que promueve el transporte de la proteína de fusión a un núcleo celular. Secuencias de aminoácidos que, cuando se incluyen en una proteína, funcionan para promover el transporte de la proteína al núcleo se conocen en la especialidad y se denominan señales de localización nuclear (NLS). Las señales de localización nuclear típicamente están compuestas por una extensión de aminoácidos básicos. Cuando está enlazada a una proteína heteróloga (por ejemplo, una proteína de fusión de la invención), la señal de localización nuclear promueve el transporte de la proteína a un núcleo celular. La señal de localización nuclear está enlazada a una proteína heteróloga de modo que está expuesta a la superficie de la proteína y no interfiere con la función de la proteína. Preferiblemente, la NLS está enlazada a un extremo de la proteína, por ejemplo el término N. La secuencia de aminoácidos de un ejemplo no limitativo de una NLS que puede incluirse en una proteína de fusión de la invención se muestra en la ID SEC Nº: 5. Preferiblemente, un ácido nucleico que codifica la señal de localización nuclear se empalma mediante técnicas de DNA recombinante estándar en el marco al ácido nucleico que codifica la proteína de fusión (por ejemplo, en el extremo 5').

El plásmido pUHD17-1 (descrito con mayor detalle en el Ejemplo 1), que comprende un transactivador de la invención que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID SEC Nº: 1, se ha depositado el 8 de Julio de 1994 bajo las condiciones del Tratado de Budapest en el Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und ZellKulturen GmbH (DSM) en Braunschweig, Alemania, y se le asignó el número de depósito DSM 9279.

II. Expresión de una Proteína de Fusión Transactivadora A. Vectores de Expresión

Un ácido nucleico de la invención que codifica una proteína de fusión transactivadora, según se describe anteriormente, puede incorporarse en un vector de expresión recombinante en una forma adecuada para la expresión de la proteína de fusión en una célula huésped. El término "en una forma adecuada para la expresión de la proteína de fusión en una célula huésped" pretende significar que el vector de expresión recombinante incluye una o más secuencias reguladoras conectadas operativamente al ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de una manera que permite la transcripción del ácido nucleico en mRNA y la traducción del mRNA en la proteína de fusión. El término "secuencia reguladora" es conocido en la especialidad y pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras son conocidas por los expertos en la especialidad y se describen en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Se entenderá que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que ha de transfectarse y/o la cantidad de proteína de fusión que ha de expresarse.

Cuando se usa en células de mamífero, funciones de control del vector de expresión recombinante a menudo son proporcionadas por material genético viral. Por ejemplo, promotores usados comúnmente se derivan de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y virus simiesco 40. El uso de elementos reguladores virales para dirigir la expresión de la proteína de fusión puede permitir la expresión constitutiva de alto nivel de la proteína de fusión en una variedad de células huésped. En un vector de expresión recombinante preferido, las secuencias que codifican la proteína de fusión están flanqueadas aguas arriba (es decir, 5') por el promotor de IE de citomegalovirus humano y aguas abajo (es decir, 3') por una señal de poli(A) de SV40. Por ejemplo, puede usarse un vector de expresión similar al descrito en el Ejemplo 1. El promotor de IE de citomegalovirus humano se describe en Boshart y otros (1985) Cell 41:521-530. Otros promotores que se expresan ubicuamente que pueden usarse incluyen el promotor de HSV-Tk (descrito en McKnight y otros (1984) Cell 37:253-262) y promotores de \beta-actina (por ejemplo, el promotor de \beta-actina humano que es descrito por Ng y otros (1985) Mol. Cell. Biol. 5:2720-2732).

Alternativamente, las secuencias reguladoras del vector de expresión recombinante pueden dirigir la expresión de la proteína de fusión preferentemente en un tipo de célula particular, es decir, pueden usarse elementos reguladores específicos para tejidos. Ejemplos no limitativos de promotores específicos para tejidos que pueden usarse incluyen el promotor de albúmina (específico para el hígado; Pinkert y otros (1987) Genes Dev. 1:268-277), promotores específicos para el tejido linfático (Calame y Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275), en particular, promotores de receptores de células T (Winoto y Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) e inmunoglobulinas (Banerji y otros (1983) Cell 33:729-740; Queen y Baltimore (1983) Cell 33:741-748), promotores específicos para neuronas (por ejemplo, el promotor de neurofilamentos; Byrne y Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477), promotores específicos para el páncreas (Edlund y otros (1985) Science 230:912-916) y promotores específicos para la glándula mamaria (por ejemplo, promotor del suero de la leche, Patente de EE.UU. Nº 4.873.316 y Publicación de Solicitud Europea Nº 264.166). También se abarcan promotores regulados por el desarrollo, por ejemplo los promotores de hox murinos (Kessel y Gruss (1990) Science 249:374-379) y el promotor de \alpha-fetoproteína (Campes y Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546).

Alternativamente, puede crearse un constructo autorregulador que codifica una proteína de fusión transactivadora. Para efectuar esto, ácido nucleico que codifica la proteína de fusión se conecta operativamente a una secuencia promotora mínima y al menos una secuencia operadora tet. Por ejemplo, el ácido nucleico de la ID SEC Nº: 1 puede conectarse a un promotor que tiene una secuencia de nucleótidos mostrada en las ID SEC Nº: 8, 9 ó 10 (los ácidos nucleicos de las ID SEC Nº: 8 y 9 comprenden un promotor de CMV mínimo y 10 operadores tet; los ácidos nucleicos de la ID SEC Nº: 10 comprenden un promotor de TK y diez operadores tet). Un diagrama esquemático de tal constructo autorregulador se muestra en la Figura 9B. Cuando este ácido nucleico se introduce en una célula (por ejemplo, en un vector de expresión recombinante), es probable que se produzca una pequeña cantidad de transcripción basal del gen transactivador debido a "falta de ajuste". En presencia de Tc (o un análogo de la misma) esta pequeña cantidad de la proteína de fusión transactivadora se unirá a la secuencia o secuencias operadoras tet aguas arriba de la secuencia de nucleótidos que codifica el transactivador y estimulará la transcripción adicional de la secuencia de nucleótidos que codifica el transactivador, conduciendo de ese modo a una producción adicional de la proteína de fusión transactivadora en la célula. Será apreciado por los expertos en la especialidad que tal promotor autorregulador también puede usarse junto con otros transactivadores regulados por tetraciclina, tales como la proteína de fusión de represor de Tet silvestre (tTA) descrita en Gossen, M. y Bujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551, que se une a operadores tet en ausencia de Tc (según se ilustra en la Figura 9A). Cuando se usa junto con este transactivador, la transcripción autorregulada de la secuencia de nucleótidos que codifica este transactivador se estimula en ausencia de Tc. El plásmido pUHD15-3, que comprende secuencias de nucleótidos que codifican la tTA descrita en Gossen y Bujard (1992), citado anteriormente, conectado operativamente a un promotor autorregulador, se ha depositado el 8 de Julio de 1994 bajo las condiciones del Tratado de Budapest en el Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und ZellKulturen GmbH (DSM) en Braunschweig, Alemania y se le asignó el número de depósito DSM 9280.

En una modalidad, el vector de expresión recombinante de la invención es un plásmido, tal como el que se describe en el Ejemplo 1. Alternativamente, un vector de expresión recombinante de la invención puede ser un virus, o una porción del mismo, que permite la expresión de un ácido nucleico introducido en el ácido nucleico viral. Por ejemplo, pueden usarse retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados defectuosos en la replicación. Los procedimientos para producir retrovirus recombinantes y para infectar células in vitro o in vivo con tales virus pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. y otros (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Secciones 9.10-9.14 y otros manuales de laboratorio estándar. Ejemplos de retrovirus adecuados incluyen pLJ, pZIP, pWE y pEM, que son bien conocidos por los expertos en la especialidad. Ejemplos de líneas de virus de empaquetamiento adecuadas incluyen \PsiCrip, \PsiCre, \Psi2 y \PsiAm. El genoma del adenovirus puede manipulase de modo que codifique y exprese una proteína de fusión transactivadora pero sea inactivo en términos de su capacidad para replicarse en un ciclo de vida viral lítico normal. Véanse, por ejemplo, Berkner y otros (1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld y otros (1991) Science 252:431-434 y Rosenfeld y otros (1992) Cell 68:143-155. Vectores adenovirales adecuados derivados de la cepa de adenovirus Ad tipo 5 dl324 u otras cepas de adenovirus (por ejemplo, Ad2, Ad3, Ad7, etc.) son bien conocidos por los expertos en la especialidad. Alternativamente, un vector de virus adenoasociado tal como el descrito en Tratschin y otros (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 puede usarse para expresar una proteína de fusión transactivadora.

B. Células Huésped

Una proteína de fusión de la invención se expresa en una célula eucariótica introduciendo ácido nucleico que codifica la proteína de fusión en una célula huésped, en donde el ácido nucleico está en una forma adecuada para la expresión de la proteína de fusión en la célula huésped. Por ejemplo, un vector de expresión recombinante de la invención, que codifica la proteína de fusión, se introduce en una célula huésped. Alternativamente, ácido nucleico que codifica la proteína de fusión que está conectada operativamente a secuencias reguladoras (por ejemplo, secuencias promotoras) pero sin secuencias vectoriales adicionales puede introducirse en una célula huésped. Según se usa aquí, el término "célula huésped" pretende incluir cualquier célula o línea celular eucariótica con tal de que la célula o línea celular no sea incompatible con la proteína que ha de expresarse, el sistema de selección elegido o el sistema de fermentación empleado. Ejemplos no limitativos de líneas celulares de mamífero que pueden usarse incluyen células CHO dhfr^{-} (Urlaub y Chasin (1980) Proc. NaIl. Acad Sci. USA 77:4216-4220), células 293 (Graham y otros (1977) J. Gen. Virol. 36: pp59) o células de mieloma como SP2 o NS0 (Galfre y Milstein (1981) Meth. Enzymol.
73(B):3-46).

Además de las líneas celulares, la invención es aplicable a células normales, tales como células que han de modificarse con propósitos de terapia génica o células embrionarias modificadas para crear un animal recombinante transgénico u homólogo. Ejemplos de tipos de células de particular interés con propósitos de terapia génica incluyen células pluripotenciales hematopoyéticas, mioblastos, hepatocitos, linfocitos, células neuronales y epitelio de la piel y epitelio de las vías respiratorias. Adicionalmente, para animales recombinantes transgénicos u homólogos, pueden modificarse células pluripotenciales embrionarias u oocitos fertilizados para contener ácido nucleico que codifica una proteína de fusión transactivadora. Por otra parte, las células de planta pueden modificarse para crear plantas transgénicas.

La invención es ampliamente aplicable y abarca además células eucarióticas no mamíferas, incluyendo células de insecto (por ejemplo, Sp. frugiperda), levadura (por ejemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, K. lactis, H. polymorpha; según se revisa generalmente por Fleer, R. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3(5):486-496)), fúngicas y de planta. Ejemplos de vectores para la expresión en la levadura S. cerevisiae incluyen pYepSecl (Baldari y otros (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz y otros (1987) Gene 54:113-123), y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). La proteína de fusión puede expresarse en células de insecto usando vectores de expresión de baculovirus (por ejemplo, según se describe en O'Reilly y otros (1992) Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Stockton Press). Vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (por ejemplo, células SF9) incluyen la serie pAc (Smith y otros, (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y las serie pVL (Lucklow, V.A. y Summers, M.D., (1989) Virology 170:31-39).

C. Introducción de Ácido Nucleico en una Célula Huésped

Ácido nucleico que codifica la proteína de fusión puede introducirse en una célula huésped mediante técnicas estándar para transfectar células eucarióticas. El término "transfectar" o "transfección" pretende abarcar todas las técnicas convencionales para introducir ácido nucleico en células huésped, incluyendo coprecipitación con fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, electroporación y microinyección. Métodos adecuados para transfectar células huésped pueden encontrarse en Sambrook y otros (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)), y otros libros de texto de laboratorio.

El número de células huésped transformadas con un ácido nucleico de la invención dependerá, al menos en parte, del tipo de vector de expresión recombinante usado y del tipo de técnica de transfección usada. El ácido nucleico puede introducirse en una célula huésped transitoriamente o, más típicamente, para la regulación a largo plazo de la expresión génica, el ácido nucleico se integra establemente en el genoma de la célula huésped o permanece como un episoma estable en la célula huésped. Los vectores plasmídicos introducidos en células de mamífero se integran típicamente en DNA de la célula huésped solo a baja frecuencia. Para identificar estos integrantes, un gen que contiene un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a un fármaco) se introduce generalmente en las células huésped junto con el ácido nucleico de interés. Marcadores seleccionables preferidos incluyen los que confieren resistencia a ciertos fármacos, tales como G418 e higromicina. Los marcadores seleccionables pueden introducirse sobre un plásmido separado a partir del ácido nucleico de interés o se introducen sobre el mismo plásmido. Las células huésped transfectadas con un ácido nucleico de la invención (por ejemplo, un vector de expresión recombinante) y un gen para un marcador seleccionable pueden identificarse seleccionando las células usando el marcador seleccionable. Por ejemplo, si el marcador seleccionable codifica un gen que confiere resistencia a neomicina, células huésped que han recogido ácido nucleico pueden seleccionarse con G418. Las células que han incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán.

Una célula huésped transfectada con un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de la invención puede transfectarse adicionalmente con uno o más ácidos nucleicos que sirven como la diana para la proteína de fusión. El ácido nucleico diana comprende la secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse, conectada operativamente a al menos una secuencia operadora tet (descrito con más detalle en la Sección III posteriormente).

El ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la invención puede introducirse en células eucarióticas que crecen en cultivo in vitro mediante técnicas de transfección convencionales (por ejemplo, precipitación con fosfato cálcico, tranfección con DEAE-dextrano, electroporación, etc.). El ácido nucleico también puede transferirse a las células in vivo, por ejemplo mediante la aplicación de un mecanismo de aporte adecuado para la introducción de ácido nucleico en células in vivo, tal como vectores retrovirales (véanse, por ejemplo, Ferry, N. y otros (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381 y Kay, M.A. y otros (1992) Human Gene Therapy 3:641-647), vectores adenovirales (véanse, por ejemplo, Rosenfeld, M.A. (1992) Cell 68:143-155 y Herz, J. y Gerard, R.D. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2812-2816), captación de DNA mediada por receptores (véanse, por ejemplo, Wu, G. y Wu, C.H. (1988) J. Biol. Chem. 263:14621; Wilson y otros (1992) J. Biol. Chem. 267:963-967; y la Patente de EE.UU. Nº 5.166.320), inyección directa de DNA (véanse, por ejemplo, Acsadi y otros (1991) Nature 332:815-818 y Wolff y otros (1990) Science 247:1465-1468) o bombardeo de partículas (véanse, por ejemplo, Cheng, L. y otros (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4455-4459 y Zelenin, A.V. y otros (1993) FEBS Letters 315:29-32). Así, con propósitos de terapia génica, las células pueden modificarse in vitro y administrarse a un sujeto o, alternativamente, las células pueden modificarse directamente in vivo.

D. Organismos Transgénicos

Un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión transactivadora puede transferirse a un oocito fertilizado de un animal no humano para crear un animal transgénico que exprese la proteína de fusión de la invención en uno o más tipos de células. Un animal transgénico es un animal que tiene células que contienen un transgén, en donde el transgén fue introducido en el animal o un antecesor del animal en una fase prenatal, por ejemplo, embrionaria. Un transgén es un DNA que está integrado en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico y que permanece en el genoma del animal maduro, dirigiendo de ese modo la expresión de un producto génico codificado en uno o más tipos de células o tejidos del animal transgénico. En una modalidad, el animal no humano es un ratón, aunque la invención no se limita al mismo. En otras modalidades, el animal transgénico es una cabra, una oveja, un cerdo, una vaca u otro animal de granja doméstico. Tales animales transgénicos son útiles para la producción de proteínas a gran escala (el llamado "pharming génico").

Un animal transgénico puede crearse, por ejemplo, introduciendo un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión (típicamente conectado a elementos reguladores apropiados, tales como un potenciador constitutivo o específico para tejidos) en los pronúcleos macho de un oocito fertilizado, por ejemplo mediante microinyección, y dejando que el oocito se desarrolle en un animal de cría hembra pseudopreñado. Secuencias intrónicas y señales de poliadenilación también pueden incluirse en el transgén para incrementar la eficacia de la expresión del transgén. Métodos para generar animales transgénicos, particularmente animales tales como ratones, se han hecho convencionales en la especialidad y se describen, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. Nº 4.736.866 y 4.870.009 y Hogan, B. y otros, (1986) A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York, Cold Spring Harbor Laboratory. Un animal fundador transgénico puede usarse para reproducir animales adicionales que tienen el transgén. Los animales transgénicos que tienen un transgén que codifica la proteína de fusión de la invención pueden reproducirse adicionalmente en otros animales transgénicos que tienen otros transgenes, por ejemplo, en un animal transgénico que contiene un gen conectado operativamente a una secuencia operadora tet (analizado con más detalle en la Sección III posteriormente).

Se apreciará que, además de a animales trasngénicos, el sistema regulador descrito aquí puede aplicarse a otros organismos transgénicos, tales como plantas transgénicas. Las plantas transgénicas pueden formarse mediante técnicas convencionales conocidas en la especialidad. De acuerdo con esto, la invención abarca organismos transgénicos no humanos, incluyendo animales y plantas, que contienen células que expresan la proteína de fusión activadora de la invención (es decir, un ácido nucleico que codifica el transactivador se incorpora en uno o más cromosomas en células del organismo transgénico).

E. Organismos Recombinantes Homólogos

La invención también proporciona un organismo no humano recombinante homólogo que expresa la proteína de fusión de la invención. El término "organismo recombinante homólogo", según se usa aquí, pretende describir un organismo, por ejemplo un animal o una planta, que contiene un gen que se ha modificado mediante recombinación homóloga entre el gen y una molécula de DNA introducida en una célula del animal, por ejemplo una célula embrionaria del animal. En una modalidad, el animal no humano es un ratón, aunque la invención no se limita al mismo. Puede crearse un animal en el que el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión se ha introducido en un sitio específico del genoma, es decir, el ácido nucleico se ha recombinado homólogamente con un gen endógeno.

Para crear tal animal recombinante homólogo, se prepara un vector que contiene DNA que codifica la proteína de fusión flanqueada en sus extremos 5' y 3' por ácido nucleico adicional de un gen eucariótico en el que ha de producirse la recombinación homóloga. El ácido nucleico adicional que flanquea el que codifica la proteína de fusión es de una longitud suficiente para la recombinación homóloga satisfactoria con el gen eucariótico. Típicamente, varias kilobases de DNA de flanqueo (en los extremos tanto 5' como 3') se incluyen en el vector (véase, por ejemplo, Thomas, K.R. y Capecchi, M. R. (1987) Cell 51:503 para una descripción de vectores de recombinación homólogos). El vector se introduce en una línea de células pluripotenciales embrionarias (por ejemplo, mediante electroporación) y se seleccionan células en las que el DNA introducido se ha recombinado homólogamente con el DNA endógeno (véase, por ejemplo, Li, E. y otros (1992) Cell 69:915). Las células seleccionadas se inyectan a continuación en un blastocisto de un animal (por ejemplo, un ratón) para formar quimeras de agregación (véase, por ejemplo, Bradley, A. en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987) pp. 113-152). Un embrión quimérico puede implantarse a continuación en un animal de cría hembra pseudopreñado adecuado y el embrión llevarse hasta el parto. La progenie que aloja el DNA recombinado homólogamente en sus células germinales puede usarse para reproducir animales en los que todas las células del animal contienen el DNA homólogamente recombinado. Estos animales "de transmisión de líneas germinales" pueden aparearse adicionalmente con animales que tienen un gen conectado operativamente a al menos una secuencia operadora tet (analizado con más detalle en la Sección III posteriormente).

Además de los enfoques de recombinación homóloga descritos anteriormente, sistemas de integración específicos para el sitio ayudados por enzimas son conocidos en la especialidad y pueden aplicarse a los componentes del sistema regulador de la invención para integrar una molécula de DNA en una posición predeterminada en una segunda molécula de DNA diana. Ejemplos de tales sistemas de integración ayudados por enzimas incluyen el sistema diana Cre recombinasa-lox (por ejemplo, según se describe en Baubonis, W. y Sander, B. (1993) Nucl. Acids Res. 21:2025-2029 y Fukushige, S. y Sander, B. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7905-7909) y el sistema diana FLP recombinasa-FRT (por ejemplo, según se describe en Dang, D.T. y Perrimon, N. (1992) Dev. Genet. 13:367-375 y Fiering, S. y otros (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8469-8473).

III. Unidades de Transcripción Diana Reguladas por un Transactivador Inducible por Tetraciclina

Una proteína de fusión de la invención se usa para regular la transcripción de una secuencia de nucleótidos diana. Esta secuencia de nucleótidos diana está conectada operativamente a una secuencia reguladora a la que se une la proteína de fusión. Más específicamente, la proteína de fusión regula la expresión de una secuencia de nucleótidos conectada operativamente a al menos una secuencia operadora tet. De acuerdo con esto, otro aspecto de la invención se refiere a ácidos nucleicos diana (por ejemplo, moléculas de DNA) que comprenden una secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse, conectada operativamente a al menos una secuencia operadora tet. Tales ácidos nucleicos también se denominan aquí unidades de transcripción reguladas por tet (o simplemente unidades de transcripción).

Dentro de una unidad de transcripción, la "secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse" incluye típicamente una secuencia promotora mínima que no se transcribe ella misma sino que sirve (al menos en parte) para situar la maquinaria transcripcional para la transcripción. La secuencia promotora mínima está conectada a la secuencia transcrita en una dirección 5' a 3' mediante enlaces fosfodiéster (es decir, el promotor está situado aguas arriba de la secuencia transcrita) para formar una secuencia de nucleótidos contigua. De acuerdo con esto, según se usa aquí, los términos "secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse" o "secuencia de nucleótidos diana" pretenden incluir tanto la secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse en mRNA como una secuencia promotora mínima aguas arriba conectada operativamente. El término "promotor mínimo" pretende describir una secuencia promotora parcial que define el sitio de iniciación de la transcripción para la secuencia conectada que ha de transcribirse pero que por ella misma no es capaz de iniciar la transcripción eficazmente, si es que puede hacerlo. Así, la actividad de tal promotor mínimo depende de la unión de un activador transcripcional (tal como la proteína de fusión inducible por tetraciclina de la invención) a una secuencia reguladora conectada operativamente (tal como una o más secuencias operadoras tet). En una modalidad, el promotor mínimo es del citomegalovirus humano (según se describe en Boshart y otros (1985) Cell 41:521-530). Preferiblemente, se usan las posiciones de nucleósidos entre aproximadamente +75 y -53 y +75 y -31. Otros promotores mínimos adecuados son conocidos en la especialidad o pueden identificarse mediante técnicas estándar. Por ejemplo, un promotor funcional que activa la transcripción de un gen formador conectado contiguamente (por ejemplo, cloranfenicol acetil transferasa, \beta-galactosidasa o luciferasa) puede suprimirse progresivamente hasta que ya no active la expresión del gen informador solo pero sin embargo requiera la presencia de una secuencia o secuencias reguladoras adicionales.

Dentro de una unidad de transcripción, la secuencia de nucleótidos diana (incluyendo la secuencia de nucleótidos transcrita y su secuencia promotor mínima aguas arriba) está conectada operativamente a al menos una secuencia operadora tet. En una configuración típica, la secuencia o secuencias operadoras tet están conectadas operativamente aguas arriba (es decir, 5') de la secuencia promotora mínima a través de un enlace fosfodiéster a una distancia adecuada para permitir la transcripción de la secuencia de nucleótidos diana al unirse una proteína reguladora (por ejemplo, la proteína de fusión transactivadora) a la secuencia operadora tet. Esto es, la unidad de transcripción está comprendida por, en una dirección 5' a 3': una secuencia o secuencias operadoras tet - un promotor mínimo - una secuencia de nucleótidos transcrita. Se apreciará por los expertos en la especialidad que existe alguna flexibilidad en la distancia permisible entre la secuencia o secuencias operadoras tet y el promotor mínimo, aunque típicamente las secuencias operadoras tet estarán situadas dentro de aproximadamente 200-400 pares de bases aguas arriba del promotor mínimo.

Las secuencias de nucleótidos de ejemplos de promotores regulados por tet, que contienen secuencias operadoras tet conectadas a un promotor mínimo, que pueden usarse en la invención se muestran en las ID SEC Nº: 8-10. Las secuencias de nucleótidos de las ID SEC Nº: 8 y 9 comprenden un promotor mínimo de citomegalovirus conectado a diez secuencias operadoras tet; las dos secuencias de nucleótidos difieren en la distancia entre los operadores y el primer nucleótido transcrito. La secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº: 10 comprende un promotor tk mínimo de virus de herpes simple conectado a diez secuencias operadoras tet. El promotor de la ID SEC Nº: 8 corresponde a P_{h}CMV*-1, descrito en Gossen, M. y Bujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551. El promotor de la ID SEC Nº: 9 corresponde a P_{h}CMV*-2, también descrito en Gossen, M. y Bujard, H, citado anteriormente.

Alternativamente, puesto que se ha observado en la especialidad que los elementos reguladores funcionan aguas abajo de las secuencias que han de transcribirse, es probable que la secuencia o secuencias operadoras tet puedan conectarse operativamente aguas abajo (es decir, 3') de la secuencia de nucleótidos transcrita. Así, en esta configuración, la unidad de transcripción está comprendida por, en una dirección 5' a 3': un promotor mínimo - una secuencia de nucleótidos transcrita - una secuencia o secuencias operadoras tet. De nuevo, se apreciará que es probable que haya alguna flexibilidad en la distancia permisible aguas abajo a la que pueden conectarse la secuencia o secuencias operadoras tet.

El término "secuencia operadora tet" pretende abarcar todas las clases de operadores tet (por ejemplo, A, B, C, D y E). Una secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse puede estar conectada operativamente a una sola secuencia operadora tet, o para un intervalo potenciado de regulación, puede estar conectada operativamente a múltiples secuencias operadores tet (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más secuencias operadoras). En una modalidad preferida, la secuencia que ha de transcribirse está conectada operativamente a siete secuencias operadoras tet.

Una unidad de transcripción regulada por tet puede incorporarse adicionalmente a un vector recombinante (por ejemplo, un vector plasmídico o viral) mediante técnicas de DNA recombinante estándar. La unidad de transcripción, o el vector recombinante en el que está contenida, puede introducirse en una célula huésped mediante técnicas de transfección estándar, tales como las descritas anteriormente. Debe apreciarse que, después de la introducción de la unidad de transcripción en una población de células huésped, puede ser necesario seleccionar un clon de célula huésped que exhiba una baja expresión basal de la secuencia de nucleótidos conectada al operador tet (es decir, la selección de una célula huésped en la que la unidad de transcripción se ha integrado en un sitio que da como resultado la expresión basal baja de la secuencia de nucleótidos conectada al operador tet). Por otra parte, puede introducirse una unidad de transcripción regulada por tet mediante procedimientos descritos anteriormente, en el genoma de un animal no humano en una fase embrionaria o en células de planta para crear un organismo recombinante transgénico u homólogo que tiene la unidad de transcripción en alguna o la totalidad de sus células. De nuevo, debe apreciarse que puede ser necesario seleccionar un organismo transgénico u homólogo en el que exista una expresión basal baja de la secuencia de nucleótidos conectada al operador tet en células de interés.

En una modalidad, la secuencia de nucleótidos diana de la unidad de transcripción regulada por tet codifica una proteína de interés. Así, al inducir la transcripción de la secuencia de nucleótidos mediante el transactivador de la invención y la traducción del mRNA resultante, la proteína de interés se produce en una célula o animal huésped. Alternativamente, la secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse puede codificar una molécula de RNA activa, por ejemplo una molécula de RNA antisentido o una ribozima. La expresión de moléculas de RNA activa en una célula o animal huésped puede usarse para regular funciones dentro del huésped (por ejemplo, evitar la producción de una proteína de interés inhibiendo la traducción del mRNA que codifica la proteína).

Un transactivador de la invención puede usarse para regular la transcripción de una secuencia de nucleótidos exógena introducida en la célula o el animal huésped. Una secuencia de nucleótidos "exógena" es una secuencia de nucleótidos que se introduce en la célula huésped y típicamente se inserta en el genoma del huésped. La secuencia de nucleótidos exógena puede no estar presente en ninguna parte del genoma del huésped (por ejemplo, una secuencia de nucleótidos extraña) o puede ser una copia adicional de una secuencia que está presente dentro del genoma del huésped pero está integrada en un sitio diferente del genoma. Una secuencia de nucleótidos exógena que ha de transcribirse y una secuencia o secuencias operadoras tet conectadas operativamente pueden estar contenidas dentro de una sola molécula de ácido nucleico que se introduce en la célula o el animal huésped.

Alternativamente, un transactivador de la invención puede usarse para regular la transcripción de una secuencia de nucleótidos endógena a la que se ha conectado una secuencia o secuencias operadoras tet. Una secuencia de nucleótidos "endógena" es una secuencia de nucleótidos que está presente dentro del genoma del huésped. Un gen endógeno puede estar conectado operativamente a una secuencia o secuencias operadoras tet mediante recombinación homóloga entre un vector de recombinación que contiene tetO y secuencias del gen endógeno. Por ejemplo, puede prepararse un vector de recombinación homólogo que incluya al menos una secuencia operadora tet y una secuencia promotora mínima flanqueada en su extremo 3' por secuencias que representan la región de codificación del gen endógeno y flanqueada en su extremo 5' por secuencias de la región aguas arriba del gen endógeno excluyendo la región promotora real del gen endógeno. Las secuencias de flanqueo son de suficiente longitud para la recombinación homóloga satisfactoria del DNA vectorial con el gen endógeno. Preferiblemente, varias kilobases de DNA de flanqueo se incluyen en el vector de recombinación homólogo. Durante la recombinación homóloga entre el DNA vectorial y el gen endógeno en una célula huésped, una región del promotor endógeno se reemplaza por el DNA vectorial que contiene una o más secuencias operadoras tet conectadas operablemente a un promotor mínimo. Así, la expresión del gen endógeno ya no está bajo el control de su promotor endógeno sino que en cambio se sitúa bajo el control de la secuencia o secuencias operadoras tet y el promotor mínimo.

En otra modalidad, secuencias operadoras tet pueden insertarse en cualquier parte dentro de un gen endógeno, preferiblemente dentro de una región reguladora 5' o 3', a través de recombinación homóloga para crear un gen endógeno cuya expresión puede regularse mediante una proteína de fusión regulada por tetraciclina descrita aquí. Por ejemplo, una o más secuencias tetO pueden insertarse en una región promotora o potenciadora de un gen endógeno de modo que la función promotora o potenciadora se mantenga (es decir, las secuencias tetO se introducen en un sitio de la región promotora/potenciadora que no es crítico para la función promotora/potenciadora). Regiones dentro de los promotores o potenciadores que pueden alterarse sin pérdida de función promotora/potenciadora son conocidas en la especialidad para muchos genes o pueden determinarse mediante técnicas estándar para analizar regiones reguladores críticas. Un gen endógeno que tiene secuencias tetO insertadas en una región reguladora no crítica retendrá la capacidad para expresarse en su manera constitutiva y/o específica para tejidos normal, pero, adicionalmente, puede regularse a la baja mediante una proteína inhibidora transcripcional controlada por tetraciclina de una manera controlada. Por ejemplo, la expresión constitutiva de tal gen endógeno modificado puede inhibirse mediante la presencia de tetraciclina (o un análogo) usando una proteína de fusión inhibidora que se une a secuencias tetO en presencia de tetraciclina (o un análogo) (según se describe con más detalle en la Sección IV y la Sección VI, Parte B, posteriormente).

A. Regulación de la Expresión de Secuencias de Nucleótidos Conectadas a Operadores tet

La expresión de secuencias de nucleótidos conectadas a operadores tet se regula mediante una proteína de fusión transactivadora de la invención. Así, la proteína de fusión y el ácido nucleico diana están ambos presentes en una célula u organismo huésped. La presencia tanto de la proteína de fusión transactivadora como de la unidad de transcripción diana en la misma célula u organismo huésped puede alcanzarse de un número de modos diferente. Por ejemplo, una célula huésped puede transfectarse con un ácido nucleico del sistema de expresión (por ejemplo, que codifica la proteína de fusión transactivadora), pueden seleccionarse células establemente transfectadas y a continuación las células transfectadas pueden retransfectarse (también denominado "supertransfectarse") con ácido nucleico correspondiente al otro ácido nucleico del sistema de expresión (por ejemplo, el ácido nucleico diana que ha de transcribirse). Dos marcadores seleccionables diferentes pueden usarse para la selección, por ejemplo, la captación del primer ácido nucleico puede seleccionarse con G418 y la captación del segundo ácido nucleico puede seleccionarse con higromicina. Alternativamente, una sola población de células puede transfectarse con ácido nucleico correspondiente a ambos componentes del sistema. De acuerdo con esto, la invención proporciona una composición de ácido nucleico que comprende:

\bullet: un primer ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que activa la transcripción, comprendiendo la proteína de fusión un primer polipéptido que se une a una secuencia operadora tet en presencia de tetraciclina o un análogo de tetraciclina conectado operativamente a un segundo polipéptido que activa la transcripción en células eucarióticas; y

\bullet: un segundo ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse, conectada operativamente a al menos una secuencia operadora tet.

En una modalidad, los dos ácidos nucleicos son dos moléculas separadas (por ejemplo, dos vectores diferentes). En este caso, una célula huésped se cotransfecta con las dos moléculas de ácido nucleico o se transfecta sucesivamente en primer lugar con una molécula de ácido nucleico y a continuación la otra molécula de ácido nucleico. En otra modalidad, los dos ácidos nucleicos están conectados (es decir, son colineales) en la misma molécula (por ejemplo, un solo vector). En este caso, una célula huésped se transfecta con la única molécula de ácido nucleico.

La célula huésped puede ser una célula cultivada in vitro o una célula presente in vivo (por ejemplo, una célula orientada para la terapia génica). La célula huésped puede ser además un oocito fertilizado, una célula pluripotencial embrionaria o cualquier otra célula embrionaria usada en la creación de animales recombinantes transgénicos u homólogos no humanos. Los animales recombinantes transgénicos u homólogos que comprenden ambos componentes de ácido nucleico del sistema de expresión pueden crearse introduciendo ambos ácidos nucleicos en las mismas células en una fase embrionaria, o, más preferiblemente, un animal que tiene un componente de ácido nucleico del sistema en su genoma se aparea con un animal que tiene el otro componente de ácido nucleico del sistema en su genoma. Camadas que han heredado ambos componentes de ácido nucleico pueden identificarse a continuación mediante técnicas estándar.

B. Regulación Coordinada de la Expresión de Dos Secuencias de Nucleótidos

Además de proporcionar un sistema para la expresión regulada de una sola secuencia de nucleótidos transcrita, la invención permite además la regulación coordinada de la expresión de dos secuencias de nucleótidos conectadas operativamente a la misma secuencia o secuencias operadoras tet. De acuerdo con esto, otro aspecto de la invención trata de una nueva unidad de transcripción regulada por tet para la regulación coordinada de dos genes. En esta unidad de transcripción, la misma secuencia o secuencias operadoras tet regulan la expresión de dos secuencias de nucleótidos conectadas operativamente que se transcriben en direcciones opuestas desde la secuencia o secuencias operadoras tet comunes. De acuerdo con esto, una secuencia de nucleótidos está conectada operativamente a un lado de la secuencia operadora tet (por ejemplo, el extremo 3' en la hebra superior de DNA) y la otra secuencia de nucleótidos está conectada operativamente al lado opuesto de la secuencia operadora tet (por ejemplo, el extremo 3' en la hebra superior de DNA). Adicionalmente, debe entenderse que cada secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse incluye una secuencia promotora mínima conectada operativamente que está situada entre la secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse y la secuencia o secuencias operadoras tet.

Un ejemplo representativo de tal unidad de transcripción se representa esquemáticamente en la Figura 6. En estos vectores, las dos secuencias de nucleótidos, conectadas operativamente a la misma secuencia o secuencias operadoras tet, se transcriben en direcciones opuestas con relación a la secuencia o secuencias operadoras tet (es decir, las secuencias se transcriben de una manera divergente durante la activación mediante una proteína de fusión transactivadora de la invención). Por "transcrito en direcciones opuestas con relación a la secuencia o secuencias operadoras tet", se entiende que la primera secuencia de nucleótidos se transcribe 5' a 3' desde una hebra del DNA (por ejemplo, la hebra inferior) y la segunda secuencia de nucleótidos se transcribe 5' a 3' desde la otra hebra del DNA (por ejemplo, la hebra superior, dando como resultado una transcripción bidireccional más allá de la secuencia o secuencias operadoras tet.

De acuerdo con esto, la invención proporciona un vector recombinante para la transcripción bidireccional regulada coordinadamente de dos secuencias de nucleótidos. En una modalidad, el vector comprende una secuencia de nucleótidos conectada mediante enlaces fosfodiéster que comprende, en una dirección 5' a 3':

\bullet: una primera secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse, conectada operativamente a

\bullet: al menos una secuencia operadora tet, conectada operativamente a

\bullet: una segunda secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse,

en donde la transcripción de las secuencias de nucleótidos primera y segunda avanza en direcciones opuestas desde la al menos una secuencia o secuencias operadoras tet (es decir, las secuencias de nucleótidos primera y segunda se transcriben de una manera divergente).

En otra modalidad, el vector no incluye la secuencia de nucleótidos primera y segunda que ha de transcribirse sino en cambio contiene sitios de clonación que permiten la introducción en el vector de secuencias de nucleótidos de interés. De acuerdo con esto, en esta modalidad, el vector comprende una secuencia de nucleótidos que comprende en una dirección 5' a 3':

\bullet: un primer sitio de clonación para la introducción de una primera secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse, conectado operativamente a

\bullet: al menos una secuencia operadora tet, conectada operativamente a

\bullet: un segundo sitio de clonación para la introducción de una segunda secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse,

en donde la transcripción de una secuencia de nucleótidos primera y segunda introducida en el vector avanza en direcciones opuestas desde la al menos una secuencia o secuencias operadoras tet. Se apreciará por los expertos en la especialidad que este tipo de "vector de clonación" puede estar en una forma que también incluye secuencias promotoras mínimas de modo que una primera secuencia de nucleótidos introducida en el primer sitio de clonación está conectada operativamente a un primer promotor mínimo y una segunda secuencia de nucleótidos introducida en el segundo sitio de clonación está conectado operativamente a un segundo promotor mínimo. Alternativamente, el "vector de clonación" puede estar en una forma que no incluya secuencias promotoras mínimas y, en cambio, las secuencias de nucleótidos que incluyen secuencias promotoras mínimas se introducen en los sitios de clonación del vector.

El término "sitio de clonación" pretende abarcar al menos un sitio de endonucleasa de restricción. Típicamente, múltiples sitios de endonucleasas de restricción diferentes (por ejemplo, un policonector) están contenidos dentro del ácido nucleico.

En otra modalidad más, el vector para la transcripción bidireccional coordinada de dos secuencias de nucleótidos puede contener un primer nucleótido que ha de transcribirse, de modo que codifique un marcador detectable (por ejemplo, luciferasa o \beta-galactosidasa), y un sitio de clonación para la introducción de una segunda secuencia de nucleótidos de interés.

Las secuencias de nucleótidos de dos regiones promotoras bidireccionales adecuadas diferentes para usar un vector para la regulación coordinada de dos secuencias de nucleótidos que han de transcribirse, según se describe aquí, se muestran en las Figuras 7A y 7B (ID SEC Nº: 6 y 7, respectivamente). En el constructo de la Figura 7, ambos promotores mínimos presentes en el constructo se derivan de un promotor de CMV. En el constructo de la Figura 7B, un promotor mínimo presente en el constructo se deriva de un promotor de CMV, mientras que el segundo promotor mínimo se deriva de un promotor de TK. Un plásmido pUHDG1316-8, que comprende un promotor bidireccional de la invención, ha sido depositado el 8 de Julio de 1994 bajo las condiciones del Tratado de Budapest en el Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und ZellKulturen GmbH (DSM) en Braunschweig, Alemania, y se le asignó el número de depósito DSM 9281.

La unidad de transcripción de la invención para la transcripción bidireccional de dos secuencias de nucleótidos conectadas operativamente a la misma secuencia o secuencias operadoras tet es útil para coordinar la expresión de dos secuencias de nucleótidos de interés. Preferiblemente, al menos una de las secuencias de nucleótidos que ha de transcribirse es una secuencia de nucleótidos eucariótica. En una aplicación, el vector se usa para producir cantidades estequiométricas de dos subunidades de una molécula heterodímera en la misma célula. Por ejemplo, el vector puede usarse para producir cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo en la misma célula o para producir subunidades receptoras de factor de crecimiento en las mismas células. En otra aplicación, el vector se usa para expresar dos productos génicos que cooperan para establecer un fenotipo celular particular. En otra aplicación más, el vector se usa para coexpresar una función indicadora y un gen de interés, en donde el indicador se utiliza para controlar la expresión del gen de interés. Así, una de las dos secuencias expresadas coordinadamente puede codificar un gen de interés y la otra puede codificar un marcador detectable, tal como un marcador o enzima superficial (por ejemplo, \beta-galactosidasa o luciferasa) que se usa para la selección de células que expresan el gen de interés.

La transcripción de las dos secuencias de nucleótidos reguladas coordinadamente puede ser inducida por tetraciclina (o un análogo de la misma) mediante el uso del activador transcripcional inducible por Tc de la invención para regular la expresión de las dos secuencias de nucleótidos. Así, en este sistema, la expresión de ambas secuencias de nucleótidos está "en paro" en ausencia de Tc (o un análogo), mientras que la expresión se pone "en marcha" mediante la presencia de Tc (o un análogo). Alternativamente, el vector para la regulación coordinada de dos secuencias de nucleótidos puede usarse junto con otros factores de transcripción regulados por tetraciclina conocidos en la especialidad. Por ejemplo, una proteína de fusión transactivadora de un represor de Tet silvestre fusionado a un dominio de activación transcripcional, que activa la expresión génica en ausencia de Tc (o un análogo), tal como el tTA descrito en Gossen, M. y Bujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551, también puede usarse junto con esta unidad de transcripción diana para la regulación coordinada.

C. Regulación Independiente de la Expresión de Múltiples Secuencias de Nucleótidos

La invención permite además la regulación independiente y opuesta de dos o más secuencias de nucleótidos que han de transcribirse. De acuerdo con esto, otro aspecto de la invención trata de una nueva unidad de transcripción regulada por tet para la regulación independiente de dos o más genes. Para regular independientemente la expresión de dos secuencias de nucleótidos que han de transcribirse, una secuencia de nucleótidos se conecta operativamente a una secuencia o secuencias operadoras tet de un tipo de clase y la otra secuencia de nucleótidos se conecta operativamente a una secuencia o secuencias operadoras tet de otro tipo de clase. De acuerdo con esto, la invención proporciona al menos un vector recombinante para la regulación independiente de la transcripción de dos secuencias de nucleótidos. En una modalidad, el vector o los vectores comprenden:

\bullet: una primera secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse, conectada operativamente a al menos una secuencia operadora tet de un primer tipo de clase; y

\bullet: una segunda secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse, conectada operativamente a al menos una secuencia operadora tet de un segundo tipo de clase.

(Debe entenderse que cada secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse también incluye una secuencia promotora mínima aguas arriba conectada operativamente). Las dos unidades de transcripción reguladas independientemente pueden incluirse en un solo vector o, alternativamente, en dos vectores separados. El vector o los vectores recombinantes que contienen las secuencias de nucleótidos que han de transcribirse pueden introducirse en una célula o animal huésped según se describe previamente.

En otra modalidad, el vector o los vectores no incluyen la secuencia de nucleótidos primera y segunda que ha de transcribirse sino que en cambio contienen sitios de clonación que permiten la introducción en el vector de secuencias de nucleótidos de interés. De acuerdo con esto, en esta modalidad, el vector o los vectores comprenden:

\bullet: un primer sitio de clonación para la introducción de una primera secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse, conectado operativamente a al menos una secuencia operadora tet de un primer tipo de clase; y

\bullet: un segundo sitio de clonación para la introducción de una segunda secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse, conectado operativamente a al menos una secuencia operadora tet de un segundo tipo de clase.

Este vector o vectores de clonación pueden estar en una forma que ya incluya promotores mínimos primero y segundo conectados operativamente, respectivamente, a los sitios de clonación primero y segundo. Alternativamente, las secuencias de nucleótidos que han de transcribirse que incluyen un promotor mínimo conectado operativamente pueden introducirse en el vector de clonación.

En otra modalidad más, el vector para la regulación independiente de dos secuencias de nucleótidos puede contener un primer nucleótido que ha de transcribirse, tal como el que codifica un marcador detectable o un gen suicida, conectado operativamente a al menos una secuencia operadora tet de un primer tipo de clase y un sitio de clonación para la introducción de una segunda secuencia de nucleótidos de interés de modo que esté conectada operativamente a al menos una secuencia operadora tet de un segundo tipo de clase.

Se apreciará por los expertos en la especialidad que pueden usarse diversas combinaciones de clases de secuencias operadoras tet para la regulación independiente de dos secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, la primera secuencia o secuencias operadoras tet pueden ser del tipo de clase A y las segundas ser del tipo de clase B, o la primera secuencia operadora tet puede ser del tipo de clase B y la segunda puede ser del tipo de clase C, etc. Preferiblemente, uno o los dos operadores tet usados son un operador de tipo clase B.

La transcripción independiente de las secuencias de nucleótidos primera y segunda se regula en una célula huésped introduciendo adicionalmente en la célula huésped uno o más ácidos nucleicos que codifican dos proteínas de fusión transactivadoras diferentes que se unen independientemente a secuencias operadoras tet de diferentes tipos de clases. La primera proteína de fusión comprende un polipéptido que se une a una secuencia operadora tet en presencia de tetraciclina o un análogo de tetraciclina, conectado operativamente a un polipéptido que activa la transcripción en células eucarióticas (por ejemplo, una proteína de fusión transactivadora de la invención, tal como un represor de Tet derivado de Tn10 mutado conectado a una región de activación de VP16). La segunda proteína de fusión comprende un polipéptido que se une a una secuencia operadora tet en ausencia de tetraciclina o un análogo de tetraciclina, conectado operativamente a un polipéptido que activa la transcripción en células eucarióticas (por ejemplo, un represeor de Tet derivado de Tn10 silvestre conectado a una región de activación de VP16, tal como el tTA descrito en Gossen, M. y Bujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551). En una modalidad, la primera proteína de fusión se une a la secuencia operadora tet del primer tipo de clase usado en la unidad de transcripción y la segunda proteína de fusión se une a la secuencia operadora tet del segundo tipo de clase usado en la unidad de transcripción. Alternativamente, en otra modalidad, la primera proteína de fusión se une al segundo tipo de clase del operador tet y la segunda proteína de fusión se une al primer tipo de clase del operador tet.

Por ejemplo, la primera secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse puede conectarse a un operador tet de clase A y la primera proteína de fusión puede unirse a operadores de clase A, mientras que la segunda secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse puede conectarse a un operador tet de clase B y la segunda proteína de fusión puede unirse a operadores de clase B. Así, en esta modalidad, la transcripción de la primera secuencia de nucleótidos se activa en presencia de Tc (o un análogo de la misma) mientras que la transcripción de la segunda secuencia de nucleótidos se activa en ausencia de Tc (o un análogo de la misma). Alternativamente, en otra modalidad, la primera proteína de fusión se une a operadores de clase B y la segunda proteína de fusión se une a operadores de clase A. En este caso, la transcripción de la segunda secuencia de nucleótidos se activa en presencia de Tc (o un análogo de la misma) mientras que la transcripción de la primera secuencia de nucleótidos se activa en ausencia de Tc (o un análogo de la misma). Proteínas transactivadoras apropiadas para usar en este sistema pueden diseñarse según se describe anteriormente en la Sección I y en Gossen y Bujard (1992) citado anteriormente. Para inhibir la heterodimerización entre los dos tipos diferentes de proteínas de fusión represoras de Tet presentes en la misma célula, puede ser necesario mutar la región de dimerización de una o ambas de las proteínas de fusión transactivadoras. Las mutaciones pueden orientarse a la región C-terminal de TetR que se sabe que está implicada en la dimerización. La región de dimerización se ha descrito con detalle basándose en la estructura cristalina de TetR (véase Hinrichs, W. y otros (1994) Science 264:418-420).

Este sistema permite la regulación independiente y opuesta de la expresión de dos genes mediante Tc y análogos de la misma. El uso de diferentes análogos de Tc como agentes inductores puede permitir además niveles altos, bajos o intermedios de expresión de las diferentes secuencias (analizado con mayor detalle en la Sección V posteriormente). La nueva unidad de transcripción de la invención para regular independientemente la expresión de dos genes, descrita anteriormente, puede usarse en situaciones en las que los dos genes han de expresarse en la misma célula pero donde es deseable expresar un producto génico mientras la expresión del otro producto génico está "en paro", y viceversa. Por ejemplo, este sistema es particularmente útil para expresar en la misma célula huésped un gen terapéutico o un gen suicida (es decir, un gen que codifica un producto que puede usarse para destruir la célula, tal como ricina o timidina quinasa de virus de herpes simple). En muchas situaciones de terapia, es deseable poder expresar un gen con propósitos terapéuticos en una célula huésped pero también tener la capacidad de destruir la célula huésped una vez que se completa la terapia. Esto puede efectuarse usando el sistema descrito anteriormente conectando el gen terapéutico a una clase de operador tet y el gen suicida a otra clase de operador tet. Así, la expresión del gen terapéutico en una célula huésped puede estimularse mediante Tc (en cuyo caso la expresión del gen suicida está ausente). A continuación, una vez que se completa la terapia, la Tc se retira, lo que pone en paro la expresión del gen terapéutico y pone en marcha la expresión del gen suicida en la célula.

D. Regulación Coordinada e Independiente Combinada de Múltiples Secuencias de Nucleótidos

También es posible regular la expresión de las cuatro secuencias de nucleótidos combinando el sistema descrito en la Sección IIIB con el sistema descrito en la Sección IIIC, de modo que dos pares de secuencias se regulen coordinadamente mientras que un par se regule independientemente del otro par. De acuerdo con esto, pueden diseñarse dos unidades de transcripción diana que comprenden:

\bullet: un primer ácido nucleico que comprende en una dirección 5' a 3': una primera secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse, una secuencia o secuencias operadoras tet de un tipo de primera clase y una segunda secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse,

\bullet: un segundo ácido nucleico que comprende en una dirección 5' a 3': una tercera secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse, una secuencia o secuencias operadoras tet de un tipo de segunda clase y una cuarta secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse.

La transcripción de las secuencias de nucleótidos primera y segunda en el primer ácido nucleico avanza de una manera divergente de la primera clase de secuencia o secuencias operadoras tet. Asimismo, la transcripción de las secuencias de nucleótidos tercera y cuarta en el segundo ácido nucleico avanza de una manera divergente de la segunda clase de secuencia o secuencias operadoras tet. Así, la expresión de las secuencias de nucleótidos primera y segunda está regulada coordinadamente y la expresión de las secuencias de nucleótidos tercera y cuarta está regulada coordinadamente. Sin embargo, la expresión de las secuencias primera y segunda está regulada independientemente (y opuestamente) en comparación con las secuencias tercera y cuarta a través del uso de dos proteínas de fusión transactivadoras diferentes, según se describe anteriormente, una que activa la transcripción en presencia de Tc (o un análogo de la misma) y la otra que activa la transcripción en ausencia de Tc (o un análogo de la misma). Se diseña un transactivador para unirse a operadores tet del tipo de primera clase y el otro se diseña para unirse a operadores tet del tipo de segunda clase. En otras modalidades, en vez de contener ya las secuencias de nucleótidos primera, segunda, tercera y/o cuarta que han de transcribirse, estas unidades de transcripción pueden contener sitios de clonación que permiten la introducción de secuencias de nucleótidos primera, segunda, tercera y/o cuarta que han de transcribirse.

IV. Inhibidores Transcripcionales Regulados por Tetraciclina

Otro aspecto de la invención trata de proteínas de fusión inhibidoras transcripcionales. Las proteínas de fusión inhibidoras de la invención se construyen de forma similar a las proteínas de fusión transactivadoras de la invención (véase la Sección I anteriormente) pero en vez de contener un dominio polipeptídico que estimula la transcripción en células eucarióticas, las proteínas de fusión inhibidoras contienen un dominio polipeptídico que inhibe la transcripción en células eucarióticas. Las proteínas de fusión inhibidoras se usan para regular a la baja la expresión de genes conectados operablemente a secuencias tetO. Por ejemplo, cuando un gen conectado a tetO se introduce en una célula o animal huésped, el nivel de expresión constitutiva basal del gen puede variar dependiendo del tipo de célula o tejido en el que se introduce el gen y del sitio de integración del gen. Alternativamente, la expresión constitutiva de genes endógenos en los que se han introducido secuencias tetO puede variar dependiendo de la fuerza de secuencias reguladoras endógenas adicionales en la vecindad. Las proteínas de fusión e inhibidoras descritas aquí proporcionan composiciones que pueden usarse para inhibir la expresión de tales genes conectados a tetO de una manera controlada.

En una modalidad, la proteína de fusión inhibidora de la invención comprende un primer polipéptido que se une a secuencias operadoras tet en ausencia, pero no en presencia, de tetraciclina (Tc) o un análogo de la misma, conectado operativamente a un segundo polipéptido heterólogo que inhibe la transcripción en células eucarióticas. En otra modalidad, la proteína de fusión inhibidora comprende un primer polipéptido que se une a secuencias operadoras tet en presencia, pero no en ausencia, de tetraciclina, conectado operativamente a un segundo polipéptido heterólogo que inhibe la transcripción en células eucarióticas. El término "heterólogo" pretende significar que el segundo polipéptido se deriva de una proteína diferente que el primer polipéptido. Como las proteínas de fusión transactivadoras, las proteínas de fusión inhibidoras transcripcionales pueden prepararse usando técnicas de DNA recombinante estándar según se describe aquí.

A. El primer polipéptido de la proteína de fusión inhibidora transcripcional

La proteína de fusión inhibidora transcripcional de la invención está compuesta, en parte, por un primer polipéptido que se une a una secuencia operadora tet (i) en ausencia, pero no en presencia, de tetraciclina (Tc), o un análogo de la misma, o, alternativamente, (ii) en presencia, pero no en ausencia, de Tc o un análogo de la misma.

Preferiblemente, en la primera modalidad, el primer polipéptido es un represor de Tet silvestre (que se une a secuencias operadoras tet en ausencia pero no en presencia de Tc). Un represor de Tet silvestre de cualquier clase (por ejemplo, A, B, C, D o E) puede usarse como el primer polipéptido. Preferiblemente, el represor de Tet silvestre es un represor de Tet derivado de Tn10. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de un represor de Tet derivado de Tn10 silvestre se muestran en las ID SEC Nº: 16 e ID SEC Nº: 17, respectivamente.

Alternativamente, en la última modalidad, el primer polipéptido es un represor de Tet mutado como el descrito en la Sección I, parte A, anteriormente (que se une a secuencias operadoras tet en presencia pero no en ausencia de Tc). Un represor de Tet mutado de cualquier clase (por ejemplo, A, B, C, D o E) puede usarse como el primer polipéptido. Preferiblemente, el represor de Tet mutado es un represor de Tet derivado de Tn10 que tiene una o más substituciones de aminoácidos en las posiciones 71, 95, 101 y/o 102. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de tal represor de Tet derivado de Tn10 mutado se muestran en las ID SEC Nº: 18 e ID SEC Nº: 19, respectivamente.

B. El segundo polipéptido de la proteína de fusión inhibidora transcripcional

El primer polipéptido de la proteína de fusión inhibidora transcripcional está conectado operativamente a un segundo polipéptido que inhibe directamente o indirectamente la transcripción en células eucarióticas. Según se describe en la Sección I, anteriormente, para conectar operativamente los polipéptidos primero y segundo de una proteína de fusión, típicamente, las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos primero y segundo se ligan entre sí en el marco para crear un gen quimérico que codifica la proteína de fusión. Sin embargo, los polipéptidos primero y segundo pueden conectarse operativamente mediante otros medios que conservan la función de cada polipéptido (por ejemplo, reticularse químicamente). Aunque se describe aquí típicamente que las proteínas de fusión tienen el primer polipéptido en el extremo amino-terminal de la proteína de fusión y el segundo polipéptido en el extremo carboxi-terminal de la proteína de fusión, será apreciado por los expertos en la especialidad que la orientación opuesta (es decir, el segundo polipéptido en el extremo amino-terminal y el primer polipéptido en el extremo carboxi-terminal) también está contemplada por la invención.

Proteínas y dominios polipeptídicos dentro de proteínas que pueden funcionar para inhibir la transcripción en células eucarióticas se han descrito en la especialidad (para las revisiones, véanse, por ejemplo, Renkawitz, R. (1990) Trends in Genetics 6:192-197 y Herschbach, B.M. y Johnson, A.D. (1993) Annu. Rev. Cell. Biol. 9:479-509). Tales dominios inhibidores transcripcionales se han denominado en la especialidad "dominios silenciadores" o "dominios represores". Aunque no se conoce el mecanismo preciso por el que muchos de estos dominios polipeptídicos inhiben la transcripción (y la invención no pretende estar limitada por el mecanismo), existen varios medios posibles por los que los dominios represores pueden inhibir la transcripción, incluyendo: 1) inhibición competitiva de la unión de proteínas activadoras o la maquinaria transcripcional general, 2) prevención de la actividad de un activador unido a DNA y 3) interferencia negativa con el ensamblaje de un complejo de preiniciación funcional de la maquinaria de transcripción general. Así, un dominio represor puede tener un efecto inhibidor directo sobre la maquinaria transcripcional o puede inhibir la transcripción indirectamente inhibiendo la actividad de proteínas activadoras. De acuerdo con esto, el término "un polipéptido que inhibe la transcripción en células eucarióticas", según se usa aquí, pretende incluir polipéptidos que actúan directamente o indirectamente para inhibir la transcripción. Según se usa aquí "inhibición" de la transcripción pretende significar una disminución en el nivel o la cantidad de transcripción de un gen diana en comparación con el nivel o la cantidad de transcripción antes de la regulación por la proteína inhibidora transcripcional. La inhibición transcripcional puede ser parcial o completa. Los términos "silenciador", "represor" e "inhibidor" se usan intercambiablemente aquí para describir una proteína reguladora, o dominios de la misma, que puede inhibir la transcripción.

Un dominio "represor" o "silenciador" transcripcional, según se describe aquí, es un dominio polipeptídico que retiene su función represora transcripcional cuando el dominio se transfiere a una proteína heteróloga. Proteínas que se ha demostrado que tienen dominios represores que pueden funcionar cuando se transfieren a una proteína heteróloga incluyen el producto oncogénico v-erbA (Baniahmad, A. y otros (1992) EMBO J. 11:1015-1023), el receptor de hormona tiroidea (Baniahmad, anteriormente), el receptor de ácido retinoico (Baniahmad, anteriormente) y la proteína Krueppel (Kr) de Drosophila (Licht, J.D. y otros (1990) Nature 346:76-79; Sauer, F. y Jackee, H. (1991) Nature 353:563-566; Licht, J.D. y otros (1994) Mol. Cell. Biol. 14:4057-4066). Ejemplos no limitativos de otras proteínas que tienen actividad represora transcripcional en células eucarióticas incluyen la proteína de homeodominio de gen de Drosophila even-skipped (eve), el complejo proteínico Ssn6/Tup1 de S. cerevisiae (véase Herschbach y Johnson, anteriormente), la proteína SIR1 de levadura (véase Chien, y otros (1993) Cell 75:531-541), NeP1 (véase Kohne y otros (1993) J. Mol. Biol. 232:747-755), la proteína dorsal de Drosophila (véase Kirov, y otros (1994) Mol. Cell. Biol. 14:713-722; Jiang, y otros (1993) EMBO J. 12:3201-3209), TSF3 (véase Chen y otros (1993) Mol. Cell. Biol. 13:831-840), SF1 (véase Targa, y otros (1992) Biochem. Biophys. Res. Comm. 188:416-423), la proteína hunchback de Drosophila (véase Zhang, y otros (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7511-7515), la proteína knirps de Drosophila (véase Gerwin y otros (1994) Mol. Cell. Biol. 14:7899-7908), la proteína WT1 (producto génico tumoral de Wilm) (véase Anant y otros (1994) Oncogene 9:3113-3126; Madden y otros, (1993) Oncogene 8:1713-1720), Oct-2.1 (véase Lillycrop y otros (1994) Mol. Cell. Biol. 14:7633-7642), la proteína engrailed de Drosophila (véase Badiani y otros, (1994) Genes Dev. 8:770-782; Han y Manley, (1993) EMBO J. 12:2723-2733), E4BP4 (véase Cowell y Hurst, (1994) Nucleic Acids Res. 22:59-65) y ZF5 (véase Numoto y otros (1993) Nucleic Acids Res. 21:3767-3775).

En una modalidad preferida, el segundo polipéptido de la proteína de fusión inhibidora transcripcional de la invención es un dominio silenciador transcripcional de la proteína Krueppel de Drosophila. Puede usarse una región C-terminal que tiene actividad represora, tal como los aminoácidos 403-466 de la proteína natural (véase Sauer, F. y Jäckie, H., anteriormente). Esta región se denomina C64KR. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de C64KR se muestran en las ID SEC Nº: 20 e ID SEC Nº: 21, respectivamente. La construcción de un vector de expresión que codifica una proteína de fusión TetR-C64KR se describe en el Ejemplo 4. Alternativamente, una región aminoterminal rica en alanina de Kr que también tiene actividad represora puede usarse como el segundo polipéptido de la proteína de fusión. Por ejemplo, los aminoácidos 26-110 de Kr (véase Licht, J.D. y otros (1990), anteriormente) pueden usarse como el segundo polipéptido. Alternativamente, también se contemplan fragmentos polipeptídicos más cortos o más largos que abarcan los dominios silenciadores de Kr que todavía retienen actividad inhibidora total o parcial (por ejemplo, los aminoácidos 62 a 92 del dominio silenciador N-terminal; véase Licht y otros (1994), anteriormente).

En otra modalidad preferida, el segundo polipéptido de la proteína de fusión inhibidora transcripcional de la invención es un dominio silenciador transcripcional del producto oncogénico v-erbA. El dominio silenciador de v-erbA se ha cartografiado hasta aproximadamente los residuos de aminoácido 362-632 del producto oncogénico v-erbA natural (véase Baniahmad y otros, anteriormente). De acuerdo con esto, un fragmento que abarca esta región se usa como el segundo polipéptido del dominio silenciador. En una modalidad, se usan los residuos de aminoácido 364-635 de la proteína v-erbA natural. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de esta región de v-erbA se muestran en las ID SEC Nº: 22 e ID SEC Nº: 23, respectivamente. La construcción de un vector de expresión que codifica una proteína de fusión TetR-v-erbA se describe en el Ejemplo 5. Alternativamente, también se contemplan fragmentos polipeptídicos más cortos o más largos que abarcan la región silenciadora de v-erbA que todavía retienen actividad inhibidora total o parcial. Por ejemplo, pueden usarse los residuos de aminoácido 346-639, 362-639, 346-632, 346-616 y 362-616 de v-erbA. Adicionalmente, fragmentos polipeptídicos que abarcan estas regiones que tienen deleciones internas y sin embargo todavía retienen actividad inhibidora total o parcial son contemplados por la invención, tales como los residuos de aminoácido 362-468/508-639 de v-erbA. Por otra parte, pueden incluirse en la proteína de fusión dos o más copias del dominio silenciador, tal como dos copias de los residuos de aminoácido 362-616 de v-erbA. Dominios polipeptídicos silenciadores adecuados de v-erbA se describen adicionalmente en Baniahmad, A. y otros (anteriormente).

En otras modalidades, se usan otros dominios silenciadores. Ejemplos no limitativos de dominios polipeptídicos que pueden usarse incluyen: los residuos de aminoácido 120-410 del receptor de hormona tiroidea alfa (THR\alpha), los residuos de aminoácido 143-403 del receptor de ácido retinoico alfa (RAR\alpha), los residuos de aminoácido 186-232 de knirps, la región N-terminal de WT1 (véase Anant, anteriormente), la región N-terminal de Oct-2.1 (véase Lillycrop, anteriormente), un residuo de 65 aminoácidos de E4BP4 (véase Cowell y Hurst, anteriormente) y el dominio dedo de zinc N-terminal de ZF5 (véase Numoto, anteriormente). Por otra parte, también se contemplan fragmentos polipeptídicos más cortos o más largos que abarcan estas regiones que todavía retienen actividad inhibidora total o parcial.

Además de los dominios inhibidores transcripcionales descritos previamente, nuevos dominios inhibidores transcripcionales, que pueden identificarse mediante técnicas estándar, están dentro del alcance de la invención. La capacidad inhibidora transcripcional de un polipéptido puede ensayarse: 1) construyendo un vector de expresión que codifica el polipéptido silenciador de prueba conectado a otro polipéptido que tiene actividad de unión a DNA (es decir, construyendo una proteína de fusión de dominio de unión a DNA-dominio silenciador), 2) cotransfectando este vector de expresión en células huésped junto con un constructo génico informador que normalmente se expresa constitutivamente en la célula huésped y también contiene sitios de unión para el dominio de unión a DNA y 3) determinando la cantidad de transcripción del constructo génico informador que es inhibida por la expresión de la proteína de fusión en la célula huésped. Por ejemplo, un ensayo estándar usado en la especialidad utiliza una proteína de fusión de un dominio de unión a DNA de GAL4 (por ejemplo, los residuos de aminoácido 1-147) y un dominio silenciador de prueba. Esta proteína de fusión se usa a continuación para inhibir la expresión de un constructo génico informador que contiene secuencias reguladoras positivas (que normalmente estimulan la transcripción constitutiva) y sitios de unión a GAL4 (véase, por ejemplo, Baniahmad, anteriormente).

C. Un tercer polipéptido de la proteína de fusión inhibidora transcripcional

Además de un represor de Tet y un dominio silenciador transcripcional, una proteína de fusión inhibidora transcripcional de la invención puede contener un tercer polipéptido conectado operativamente que promueve el transporte de la proteína de fusión a un núcleo celular. Según se describe para las proteínas de fusión transactivadoras (véase la Sección I, Parte C, anteriormente), una señal de localización nuclear puede incorporarse en la proteína de fusión inhibidora transcripcional.

D. Expresión de la proteína de fusión inhibidora transcripcional

Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión inhibidora transcripcional de la invención puede incorporarse en un vector de expresión recombinante e introducirse en una célula huésped para expresar la proteína de fusión en una célula huésped según se describe en la Sección II, Parte A, B y C, anteriormente. Preferiblemente, una célula huésped que expresa una proteína de fusión inhibidora transcripcional de la invención también tiene un gen de interés conectado al operador tet (es decir, una secuencia de nucleótidos diana que ha de transcribirse).

Organismos transgénicos que expresan una proteína de fusión inhibidora transcripcional en células de los mismos pueden prepararse según se describe en la Sección II, Parte D, anteriormente. Por otra parte, organismos recombinantes homólogos que expresan una proteína de fusión inhibidora transcripcional en células de los mismos también son abarcados por la invención y pueden prepararse según se describe en la Sección II, Parte E, anteriormente. La invención proporciona vectores de expresión recombinantes adecuados para la recombinación homóloga. En una modalidad, tal vector de expresión comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión inhibidora transcripcional de la invención que está flanqueada en sus extremos 5' y 3' por ácido nucleico adicional de un gen ecuariótico, siendo el ácido nucleico adicional de una longitud suficiente para la recombinación homóloga satisfactoria con el gen eucariótico. Vectores y métodos para crear organismos recombinantes homólogos que expresan los componentes del sistema regulador de la invención, y usos para los mismos, se describen con mayor detalle en la Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 08/260.452. Preferiblemente, un organismo recombinante transgénico u homólogo de la invención que expresa una proteína de fusión inhibidora transcripcional en células del mismo también tiene un gen de interés conectado al operador tet (es decir, una secuencia de nucleótidos diana que ha de transcribirse) en células del mismo.

V. Estuches de la Invención

Otro aspecto de la invención trata de estuches que incluyen los componentes del sistema regulador inducible de la invención. Tal estuche puede usarse para regular la expresión de un gen de interés (es decir, una secuencia de nucleótidos de interés que ha de transcribirse) que puede clonarse en una unidad de transcripción diana. El estuche puede incluir un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión activadora transcripcional o una proteína de fusión inhibidora transcripcional o ambas. Alternativamente, pueden proporcionarse en el estuche células eucarióticas que tienen ácido nucleico que codifica una proteína de fusión transactivadora y/o inhibidora incorporada establemente en las mismas, de modo que las proteínas de fusión transactivadoras y/o inhibidoras se expresen en la célula eucariótica.

En una modalidad, el estuche incluye un medio portador que tiene en estrecho confinamiento en el mismo al menos dos medios de contención: un primer medio de contención que contiene un primer ácido nucleico (por ejemplo, DNA) que codifica una proteína de fusión transactivadora de la invención (por ejemplo, un vector de expresión recombinante que codifica un primer polipéptido que se une a una secuencia operadora tet en presencia de tetraciclina, conectado operativamente a un segundo polipéptido que activa la transcripción en células eucarióticas) y un segundo medio de contención que contiene un segundo ácido nucleico diana (por ejemplo, DNA) para el transactivador en el que puede clonarse una secuencia de nucleótidos de interés. El segundo ácido nucleico comprende típicamente un sitio de clonación para la introducción de una secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse (incluyendo opcionalmente una secuencia promotora mínima conectada operativamente) y al menos una secuencia operadora tet conectada operativamente. El término "sitio de clonación" pretende abarcar al menos un sitio de endonucleasa de restricción. Típicamente, múltiples sitios de endonucleasas de restricción diferentes (por ejemplo, un policonector) están contenidos dentro del ácido nucleico.

Para regular la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés usando los componentes del estuche, la secuencia de nucleótidos se clona en el sitio de clonación del vector diana del estuche mediante técnicas de DNA recombinantes convencionales y a continuación los ácidos nucleicos primero y segundo se introducen en una célula o animal huésped. La proteína de fusión transactivadora expresada en la célula o el animal huésped regula a continuación la transcripción de la secuencia de nucleótidos de interés en presencia del agente inductor (Tc o un análogo de la misma).

Alternativamente, en otra modalidad, el estuche incluye una célula eucariótica que se transfecta establemente con un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión transactivadora de la invención de modo que el transactivador se expresa en la célula. Así, en vez de contener ácido nucleico solo, el primer medio de contención descrito anteriormente puede contener una línea celular eucariótica en la que se ha introducido establemente el primer ácido nucleico que codifica el transactivador (por ejemplo, por transfección estable mediante un método convencional tal como precipitación con fosfato cálcico o electroporación, etc.). En esta modalidad, una secuencia de nucleótidos de interés se clona en el sitio de clonación del vector diana del estuche y a continuación el vector diana se introduce en la célula eucariótica que expresa la proteína de fusión transactivadora.

Alternativamente o adicionalmente, un vector recombinante de la invención para la regulación coordinada de la expresión de dos secuencias de nucleótidos también puede incorporarse en un estuche de la invención. El vector puede incluirse en el estuche en una forma que permite la introducción en el vector de dos secuencias de nucleótidos de interés. Así, en otra modalidad, un estuche de la invención incluye 1) un primer ácido nucleico que codifica una proteína de fusión transactivadora de la invención (o una célula eucariótica en la que el ácido nucleico que se ha introducido establemente) y 2) un segundo ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende en una dirección 5' a 3': un primer sitio de clonación para la introducción de una primera secuencia de nucleótidos de interés conectada operativamente a al menos una secuencia operadora tet conectada operativamente a un segundo sitio de clonación para la introducción de una segunda secuencia de nucleótidos de interés, en donde la transcripción de las secuencias de nucleótidos primera y segunda avanza en direcciones opuestas desde la al menos una secuencia operadora tet. Opcionalmente, el vector puede incluir secuencias promotoras mínimas conectadas operativamente. En otra modalidad, el vector puede estar en una forma que ya contiene una secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse (por ejemplo, que codifica un marcador detectable tal como luciferasa, \beta-galactosidasa o CAT) y un sitio de clonación para la introducción de una segunda secuencia de nucleótidos de interés que ha de transcribirse.

Las unidades de transcripción y los transactivadores de la invención para la regulación independiente de la expresión de dos secuencias de nucleótidos que han de transcribirse también pueden incorporarse en un estuche de la invención. Las unidades de transcripción diana pueden estar en una forma que permite la introducción en las unidades de transcripción de secuencias de nucleótidos de interés que han de transcribirse. Así, en otra modalidad, un estuche de la invención incluye 1) un primer ácido nucleico que codifica un transactivador que se une a un operador tet de un tipo de primera clase en presencia de Tc o un análogo de la misma, 2) un segundo ácido nucleico que comprende un primer sitio de clonación para la introducción de una primera secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse, conectado operativamente a al menos un operador tet de un tipo de primera clase, 3) un tercer ácido nucleico que codifica un transactivador que se une a un operador tet de un tipo de segunda clase en ausencia de Tc o un análogo de la misma y 4) un cuarto ácido nucleico que comprende un segundo sitio de clonación para la introducción de una segunda secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse, conectado operativamente a al menos un operador tet de un tipo de segunda clase. (Opcionalmente, secuencias promotoras mínimas se incluyen en los ácidos nucleicos segundo y cuarto). En otra modalidad, una secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse (por ejemplo, que codifica un gen suicida) está ya contenida en el ácido nucleico segundo o cuarto. En otra modalidad más, los ácidos nucleicos que codifican los transactivadores (por ejemplo, los ácidos nucleicos primero y tercero descritos anteriormente) pueden introducirse establemente en una línea celular eucariótica que se proporciona en el estuche.

En otra modalidad más, un estuche de la invención incluye primeros medios de contención que contienen un primer ácido nucleico que codifica una proteína de fusión inhibidora transcripcional de la invención (por ejemplo, la proteína de fusión inhibe la transcripción en células eucarióticas solo en presencia de Tc o solo en ausencia de Tc) y segundos medios de contención que contienen un segundo ácido nucleico que comprende un sitio de clonación para la introducción de una secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse, conectado operativamente a al menos una secuencia operadora tet. El estuche puede incluir además un tercer ácido nucleico que codifica una proteína de fusión transactivadora que se une a secuencias tetO solo en presencia de Tc o solo en ausencia de Tc. Alternativamente, los ácidos nucleicos primero y/o tercero (es decir, que codifican las proteínas de fusión inhibidoras o transactivadoras) pueden incorporarse establemente en una célula huésped eucariótica que se proporciona en el estuche.

En otra modalidad más, un estuche de la invención puede incluir al menos una tetraciclina o análogo de tetraciclina. Por ejemplo, el estuche puede incluir medios de contención que contienen tetraciclina, anhidrotetraciclina, doxiciclina, epoxitetraciclina u otro análogo de tetraciclina descrito aquí.

VI. Regulación de la Expresión Génica por Tetraciclina o Análogos de la Misma A. Estimulación de la Expresión Génica por Proteínas de Fusión Transactivadoras

En una célula huésped que tiene ácido nucleico que codifica una proteína de fusión transactivadora de la invención y una secuencia de nucleótidos conectada operativamente a la secuencia operadora tet (es decir, gen de interés que ha de transcribirse), la transcripción de alto nivel de la secuencia de nucleótidos conectada operativamente a la secuencia o secuencias operadoras tet no se produce en ausencia del agente inductor, tetraciclina o análogos de la misma. El nivel de transcripción basal de la secuencia de nucleótidos puede variar dependiendo de la célula huésped y el sitio de integración de la secuencia, pero generalmente es bastante bajo o incluso indetectable en ausencia de Tc. Para inducir la transcripción en una célula huésped, la célula huésped se pone en contacto con tetraciclina o un análogo de tetraciclina. De acuerdo con esto, otro aspecto de la invención trata de métodos para estimular la transcripción de una secuencia de nucleótidos conectada operativamente a una secuencia operadora tet en una célula o animal huésped que expresa una proteína de fusión transactivadora de la invención. Los métodos implican poner en contacto la célula con tetraciclina o un análogo de tetraciclina o administrar tetraciclina o un análogo de tetraciclina a un sujeto que contiene la célula.

El término "análogo de tetraciclina" pretende incluir compuestos que están relacionados estructuralmente con tetraciclina y que se unen al represor de Tet con una K_{a} de al menos aproximadamente 10^{6} M^{-1}. Preferiblemente, el análogo de tetraciclina se une con una afinidad de aproximadamente 10^{9} M^{-1} o mayor. Ejemplos de tales análogos de tetraciclina incluyen, pero no se limitan a, anhidrotetraciclina, doxiciclina, clorotetraciclina, oxitetraciclina y otros descritos por Hlavka y Boothe, "The Tetracyclines", en Handbook of Experimental Pharmacology 78, R.K. Blackwood y otros (eds.), Springer-Verlag, Berlín-Nueva York, 1985; L.A. Mitscher, "The Chemistry of the Tetracycline Antibiotics", Medicinal Research 9, Dekker, Nueva York, 1978; Noyee Development Corporation, "Tetracycline Manufacturing Processes" Chemical Process Reviews, Park Ridge, NJ, volumen 2, 1969; R.C. Evans, "The Technology of the Tetracyclines", Biochemical Reference Series 1, Quadrangle Press, Nueva York, 1968 y H.F. Dowling, "Tetracycline", Antibiotic Monographs, Nº 3, Medical Encyclopedia, Nueva York, 1955. Análogos de Tc preferidos para la estimulación de alto nivel de la transcripción son anhidrotetraciclina y doxiciclina. Puede elegirse un análogo de Tc que tenga actividad antibiótica reducida en comparación con la Tc. Ejemplos de tales análogos de Tc son anhidrotetraciclina, epoxitetraciclina y cianotetraciclina.

Para inducir la expresión génica en una célula in vitro, la célula se pone en contacto con Tc o un análogo de Tc cultivando la célula en un medio que contiene el compuesto. Cuando se cultivan células in vitro en presencia de Tc o análogo de Tc, un intervalo de concentración preferido para el agente inductor está entre aproximadamente 10 y aproximadamente 1000 ng/ml. La Tc o un análogo de Tc puede añadirse directamente al medio en el que las células ya se están cultivando, o, más preferiblemente, para altos niveles de inducción génica, las células se recogen de medio libre de Tc y se cultivan en medio reciente que contiene Tc o un análogo de la misma.

Para inducir la expresión génica in vivo, las células dentro de un sujeto se ponen en contacto con Tc o un análogo de Tc administrando el compuesto al sujeto. El término "sujeto" pretende incluir seres humanos y otros mamíferos no humanos incluyendo monos, vacas, cabras, ovejas, perros, gatos, conejos, ratas, ratones y especies recombinantes transgénicas y homólogas de los mismos. Por otra parte, el término "sujeto" pretende incluir plantas, tales como plantas transgénicas. Cuando el agente inductor se administra a un sujeto humano o animal, la dosificación se ajusta para alcanzar preferiblemente una concentración en suero entre aproximadamente 0,05 y 1,0 \mug/ml. La Tc o un análogo de Tc puede administrarse a un sujeto mediante cualquier medio eficaz para alcanzar una concentración in vivo suficiente para la inducción génica. Ejemplos de modos adecuados de administración incluyen administración oral (por ejemplo, disolviendo el agente inductor en el agua de bebida), nódulos de liberación lenta y la implantación de una bomba de difusión. Para administrar Tc o un análogo de Tc a una planta transgénica, el agente inductor puede disolverse en el agua administrada a la planta.

La capacidad para usar diferentes análogos de Tc como agentes inductores en este sistema permite modular el nivel de expresión de una secuencia de nucleótidos conectada a un operador tet. Según se demuestra en el Ejemplo 2, se ha encontrado que la anhidrotetraciclina y la doxiciclina son agentes inductores fuertes. El incremento en la transcripción de la secuencia diana es típicamente tan alto como de 1000 a 2000 veces y pueden alcanzarse factores de inducción tan altos como 20.000 veces. Se ha encontrado que la tetraciclina, la clorotetraciclina y la oxitetraciclina son agentes inductores más débiles, es decir, el incremento en la transcripción de una secuencia diana está en el intervalo de aproximadamente 10 veces. Así, un análogo de tetraciclina apropiado se elige como un agente inductor basándose en el nivel deseado de inducción de la expresión génica. También es posible cambiar el nivel de la expresión génica en una célula o animal huésped a lo largo del tiempo cambiando el análogo de Tc usado como el agente inductor. Por ejemplo, puede haber situaciones en las que sea deseable tener un fuerte estallido de expresión génica inicialmente y a continuación tener un nivel inferior sostenido de expresión génica. De acuerdo con esto, un análogo que estimula altos niveles de transcripción puede usarse inicialmente como el agente inductor y a continuación el agente inductor puede cambiarse por un análogo que estimule un nivel inferior de transcripción. Por otra parte, cuando se regula la expresión de múltiples secuencias de nucleótidos (por ejemplo, cuando una secuencia es regulada por una clase de secuencia o secuencias operadoras tet y la otra es regulada por otra clase de secuencia o secuencias operadoras tet, según se describe anteriormente en la Sección III, Parte C, anteriormente), es posible variar independientemente el nivel de expresión de cada secuencia dependiendo de qué proteína de fusión transactivadora se use para regular la transcripción y qué análogo o análogos de Tc se usen como el agente inductor. Es probable que diferentes proteínas de fusión transactivadoras exhiban diferentes niveles de sensibilidad a análogos de Tc. El nivel de inducción de la expresión génica con una combinación particular de proteína de fusión transactivadora y agente inductor (Tc o análogo de Tc) puede determinarse mediante técnicas descritas aquí (por ejemplo, véase el Ejemplo 2). Adicionalmente, el nivel de expresión génica puede modularse variando la concentración del agente inductor. Así, el sistema de expresión de la invención proporciona un mecanismo no solo para poner en marcha o en paro la expresión génica, sino también para "ajustar finamente" el nivel de expresión génica a niveles intermedios dependiendo del tipo y la concentración de agente inductor usado.

B. Inhibición de la Expresión Génica por Proteínas de Fusión Inhibidoras Transcripcionales

La invención también proporciona métodos para inhibir la expresión génica usando las proteínas de fusión inhibidoras transcripcionales de la invención. Estos métodos pueden usarse para regular a la baja la transcripción basal, constitutiva o específica para tejidos de un gen de interés conectado a tetO. Por ejemplo, un gen de interés que está conectado operativamente a secuencias tetO y elementos reguladores positivos adicionales (por ejemplo, secuencias potenciadoras constitutivas o específicas para tejidos) se transcribirá en células huésped a un nivel que está determinado principalmente por la fuerza de los elementos reguladores positivos en la célula huésped. Por otra parte, el gen de interés que está conectado operativamente a secuencias tetO y solo una secuencia promotora mínima puede exhibir grados variables de transcripción de nivel basal dependiendo de la célula o tejido huésped y/o del sitio de integración de las secuencias. En una célula huésped que contienen tal secuencia diana y que expresa una proteína de fusión inhibidora de la invención, la transcripción de la secuencia diana puede regularse a la baja de una manera controlada alterando la concentración de Tc (o análogo) en contacto con la célula huésped. Por ejemplo, cuando la proteína de fusión inhibidora se une a tetO en ausencia de Tc, la concentración de Tc en contacto con la célula huésped se reduce para inhibir la expresión del gen diana. Preferiblemente, una célula huésped se cultiva en ausencia de Tc para mantener la expresión del gen diana reprimida. Asimismo, la Tc no se administra a un organismo huésped para mantener la expresión del gen diana reprimida. Alternativamente, cuando la proteína de fusión inhibidora se une a tetO en presencia de Tc, la concentración de Tc en contacto con la célula huésped se incrementa para inhibir la expresión del gen diana. Por ejemplo, se añade Tc al medio de cultivo de una célula huésped o se administra Tc a un organismo huésped para reprimir la expresión del gen diana.

Las proteínas de fusión inhibidoras descritas aquí pueden inhibir un gen de interés conectado a tetO en el que las secuencias tetO están situadas 5' de una secuencia promotora mínima (por ejemplo, unidades de transcripción reguladas por tetraciclina como las descritas en la Sección III, anteriormente). Por otra parte, la proteína de fusión inhibidora puede usarse para inhibir la expresión de un gen de interés en el que secuencias conectadas a tetO están situadas 3' de la secuencia promotora pero 5' del sitio de iniciación de la transcripción. Por otra parte, la proteína de fusión inhibidora puede usarse para inhibir la expresión de un gen de interés en el que las secuencias conectadas a tetO están situadas 3' del sitio de iniciación de la transcripción.

Diversos análogos de Tc como los descritos en la Sección VI, Parte A, anteriormente, con respecto a las proteínas de fusión transactivadoras pueden usarse de forma similar para regular la actividad de las proteínas de fusión inhibidoras. Por otra parte, los métodos de cultivo in vitro con Tc (o análogo) y administración in vivo de Tc (o análogo) descritos en la Sección VI, Parte A, son aplicables igualmente a las proteínas de fusión inhibidoras transcripcionales.

C. Regulación Positiva y Negativa Combinada de la Expresión Génica

Además de regular la expresión génica usando una proteína de fusión activadora o inhibidora transcripcional sola, los dos tipos de proteínas de fusión pueden usarse en combinación para permitir la regulación tanto positiva como negativa de la expresión de uno o más genes diana en una célula huésped. Así, una proteína inhibidora transcripcional que se une a tetO (i) en ausencia, pero no en presencia, de Tc, o (ii) en presencia, pero no en ausencia, de Tc, puede usarse en combinación con una proteína transactivadora que se une a tetO (i) en ausencia, pero no en presencia, de Tc o (ii) en presencia, pero no en ausencia, de Tc. Proteínas transactivadoras que se unen a tetO en ausencia, pero no en presencia, de Tc (por ejemplo, proteínas de fusión de TetR silvestre-activador) se describen con más detalle en USSN 08/076.726, USSN 08/076.327 y USSN 08/260.452. Proteínas de fusión transactivadoras que se unen a tetO en presencia, pero no en ausencia, de Tc (por ejemplo, proteínas de fusión de TetR mutado-activador) se describen aquí (véase la Sección I anteriormente) y en USSN 08/270.637 y USSN 08/275.876. Proteínas de fusión inhibidoras transcripcionales de describen aquí en la Sección IV.

Según se describe anteriormente en la Sección III, Parte C, cuando se expresa más de una proteína de fusión de TetR en una célula u organismo huésped, pueden efectuarse etapas adicionales para inhibir la heterodimerización entre las diferentes proteínas de fusión de TetR. Por ejemplo, un transactivador compuesto por un TetR de una clase puede usarse en combinación con un inhibidor transcripcional compuesto por un Tet de una segunda clase diferente que no se heterodimeriza con la primera clase de TetR. Alternativamente, los residuos de aminoácido de TetR implicados en la dimerización pueden mutarse para inhibir la heterodimerización. Sin embargo, incluso si se produce algo de heterodimerización entre las proteínas de fusión transactivadora e inhibidora en una célula huésped, deben producirse suficientes cantidades de homodímeros para permitir la regulación positiva y negativa eficaz según se describe aquí.

Se apreciará por los expertos en la especialidad que pueden usarse diversas combinaciones de proteínas activadoras e inhibidoras para regular un solo gen de interés conectado a tetO de una manera tanto positiva como negativa o para regular múltiples genes de interés conectados a tetO de una manera coordinada o de una manera independiente usando las enseñanzas descritas aquí. Los componentes reguladores precisos utilizados dependerán de los genes que han de regularse y el tipo de regulación deseado. Varios ejemplos no limitativos de cómo pueden usarse en combinación las proteínas de fusión transactivadora e inhibidora se describen más adelante. Sin embargo, muchas otras posibles combinaciones serán evidentes para el experto en vista de las presentes enseñanzas y se pretende que sean abarcadas por la invención.

En una modalidad preferida, ilustrada esquemáticamente en la Figura 10, la expresión de un gen de interés diana conectado a tetO en una célula huésped se regula tanto de manera negativa como positiva mediante la combinación de una proteína de fusión inhibidora que se une a tetO en ausencia, pero no en presencia, de tetraciclina o un análogo de la misma (denominada un dominio silenciador controlado por tetraciclina, o tSD) y una proteína de fusión activadora que se une a tetO en presencia, pero no en ausencia, de tetraciclina o un análogo de la misma (denominada un transactivador controlado por tetraciclina inverso, o rtTA). Además de secuencias de tetO, el gen diana está conectado a un promotor y puede contener otros elementos reguladores positivos (por ejemplo, secuencias potenciadoras) que contribuyen a la transcripción constitutiva de nivel basal del gen en la célula huésped. La unión de tSD a las secuencias tetO en ausencia de tetraciclina o análogo (por ejemplo, doxiciclina) inhibe la transcripción constitutiva basal del gen de interés, manteniendo así el gen de interés en un estado reprimido hasta que se desee la expresión génica. Cuando se desea la expresión génica, la concentración de tetraciclina o análogo (por ejemplo, doxiciclina) en contacto con la célula huésped se incrementará. Durante la adición del fármaco, el tSD pierde la capacidad para unirse a secuencias tetO mientras que el rtTA previamente no unido adquiere la capacidad de unirse a secuencias tetO. La unión resultante de rtTA a las secuencias tetO conectadas al gen de interés estimula así la transcripción del gen de interés. El nivel de expresión puede controlarse mediante la concentración de tetraciclina o análogo, el tipo de análogo de Tc usado, la duración de la inducción, etc., según se describe previamente aquí. Se apreciará que también puede usarse la combinación inversa de proteínas de fusión (es decir, el inhibidor se une en presencia pero no en ausencia del fármaco y el activador se une en ausencia pero no en presencia del fármaco). En este caso, la expresión del gen de interés se mantiene reprimida poniendo en contacto la célula huésped con el fármaco (por ejemplo, cultivo con Tc o análogo) y la expresión génica se activa mediante la retirada del fármaco.

En otra modalidad, las proteínas de fusión activadora e inhibidora, que se describen en el párrafo previo, se usan en combinación para regular coordinadamente, de una manera tanto positiva como negativa, dos genes de interés usando la unidad de transcripción conectada a tetO bidireccional descrita en la Sección III, Parte B, anteriormente. En este caso, el Gen 1 y el Gen 2 están conectados a la misma secuencia o secuencias tetO, pero en orientaciones opuestas. La proteína de fusión inhibidora se usa para reprimir niveles basales de transcripción tanto de Gen 1 como de Gen 2 de una manera coordinada, mientras que la proteína de fusión transactivadora se usa para estimular la expresión del Gen 1 y el Gen 2 de una manera coordinada.

En otra modalidad más, las proteínas de fusión activadora e inhibidora se usan para regular independientemente dos o más genes de interés usando las unidades de transcripción conectadas a tetO que se describen en la Sección III, Parte C, anteriormente. Por ejemplo, en una modalidad, una proteína de fusión transactivadora que se une a una clase de secuencias tetO (por ejemplo, la clase A) en presencia, pero no en ausencia, de Tc o análogo se usa en combinación con una proteína de fusión inhibidora que se une a una segunda clase diferente de secuencias tetO (por ejemplo, la clase B) también en presencia, pero no en ausencia, de Tc o análogo. En una célula huésped que contiene Gen 1 conectado a secuencias tetO de clase A y Gen 2 conectado a secuencias tetO de clase B, ambos genes se expresarán a niveles basales en ausencia del fármaco, mientras que la expresión del Gen 1 se estimulará con la adición del fármaco y la expresión del Gen 2 se reprimirá con la adición del fármaco.

Alternativamente, en otra modalidad, el transactivador se une a una clase de secuencias tetO (por ejemplo, la clase A) en presencia, pero no en ausencia, de Tc o análogo y la proteína de fusión inhibidora se une a una segunda clase diferente de secuencias tetO (por ejemplo, la clase B) en ausencia, pero no en presencia, de Tc o análogo. En la célula huésped que se describe en el párrafo previo, el Gen 1 se expresará a niveles basales en ausencia del fármaco y se estimulará con la adición del fármaco, mientras que el Gen 2 se reprimirá en ausencia del fármaco pero tendrá niveles basales de expresión con la adición del fármaco. Varias otras combinaciones posibles serán evidentes para el experto. Las proteínas de fusión transactivadora e inhibidora que se unen a diferentes clases de secuencias tetO pueden prepararse según se describe en la Sección I, Parte A. Unidades de transcripción diana que comprenden secuencias tetO de diferentes clases pueden prepararse según se describe en la Sección III, Parte C.

VII. Aplicaciones de la Invención

La invención es ampliamente aplicable a una variedad de situaciones en las que es deseable poder poner en marcha y en paro la expresión génica o regular el nivel de expresión génica, de una manera rápida, eficaz y controlada sin provocar efectos pleiotrópicos o citotoxicidad. Así, el sistema de la invención tiene amplia aplicabilidad al estudio del desarrollo y la diferenciación celular en células eucarióticas, plantas y animales. Por ejemplo, la expresión de oncogenes puede regularse de una manera controlada en células para estudiar su función. Adicionalmente, el sistema puede usarse para regular la expresión de recombinasas específicas para un sitio, tales como CRE o FLP, para permitir de ese modo la modificación irreversible del fenotipo de un organismo transgénico bajo condiciones controladas en una fase particular de desarrollo. Por ejemplo, marcadores de resistencia a fármacos insertados en el genoma de plantas transgénicas que permiten la selección de una planta transgénica particular podrían retirarse irreversiblemente a través de recombinasa específica para el sitio regulada por Tc. Otras aplicaciones del sistema regulador de la invención incluyen:

A. Terapia Génica

La invención puede ser particularmente útil con propósitos de terapia génica, en tratamientos para enfermedades genéticas o adquiridas. El enfoque general de la terapia génica implica la introducción de ácido nucleico en células de modo que uno o más productos génicos codificados por el material genético introducido se produzcan en las células para restaurar o potenciar una actividad funcional. Para revisiones de enfoques de terapia génica, véanse Anderson, W.F. (1992) Science 256:808-813; Miller, A.D. (1992) Nature 357:455-460; Friedmann, T. (1989) Science 244:1275-1281 y Cournoyer, D. y otros (1990) Curr. Opin. Biotech. 1:196-208. Sin embargo, los vectores de terapia génica actuales utilizan típicamente elementos reguladores constitutivos que son sensibles a factores de transcripción endógenos. Estos sistemas vectoriales no permiten la capacidad de modular el nivel de expresión génica en un sujeto. En contraste, el sistema regulador inducible de la invención proporciona esta capacidad.

Para usar el sistema de la invención con propósitos de terapia génica, en una modalidad, las células de un sujeto que necesita terapia génica se modifican para contener 1) ácido nucleico que codifica una proteína de fusión transactivadora de la invención en una forma adecuada para la expresión del transactivador en las células huésped y 2) un gen de interés (por ejemplo, con propósitos terapéuticos) conectado operativamente a una secuencia o secuencias operadoras tet. Las células del sujeto pueden modificarse ex vivo y a continuación introducirse en el sujeto o las células pueden modificarse directamente in vivo (métodos para la modificación de las células se describen anteriormente en la Sección II). La expresión del gen de interés en las células del sujeto se estimula a continuación administrando Tc o un análogo de Tc al paciente. El nivel de expresión génica puede variarse dependiendo de qué análogo de Tc particular se use como el agente inductor. El nivel de expresión génica también puede modularse ajustando la dosis de la tetraciclina, o análogo de la misma, administrada al paciente para ajustar de ese modo la concentración alcanzada en la circulación y los tejidos de interés.

Por otra parte, en otra modalidad, una proteína de fusión inhibidora transcripcional se usa para controlar adicionalmente el nivel de expresión del gen de interés. Por ejemplo, las células del sujeto pueden modificarse para contener también un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión inhibidora transcripcional que se une a tetO en ausencia de Tc. El ácido nucleico está en una forma adecuada para la expresión de la proteína de fusión inhibidora en las células huésped. Así, antes de la administración de Tc (o análogo) al sujeto, el nivel basal de transcripción del gen de interés se mantendrá silencioso mediante la proteína de fusión inhibidora. Durante la administración de Tc, la unión de la proteína de fusión inhibidora a tetO será inhibida mientras que la unión de la proteína de fusión transactivadora será inducida, estimulando de ese modo la transcripción del gen de interés. Tal regulación positiva y negativa combinada de la expresión génica usando tanto una proteína de fusión transactivadora como una proteína de fusión inhibidora transcripcional de la invención se ilustra esquemáticamente en la Figura 10.

Métodos de detección convencionales conocidos en la especialidad, tales como un ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas, pueden usarse para controlar la expresión de la proteína de interés regulada en las células huésped y la concentración de Tc o análogo de Tc puede variarse hasta que se alcanza el nivel de expresión deseado de la proteína de interés. De acuerdo con esto, la expresión de una proteína de interés puede ajustarse de acuerdo con las necesidades médicas de un individuo, que pueden variar a través de la vida del individuo. Para detener la expresión del gen de interés en células del sujeto, la administración del agente inductor se detiene. Así, el sistema regulador de la invención ofrece la ventaja sobre sistemas reguladores constitutivos de permitir la modulación del nivel de expresión génica dependiendo de los requerimientos de la situación terapéutica.

Genes de particular interés que han de expresarse en células de un sujeto para el tratamiento de enfermedades genéticas o adquiridas incluyen los que codifican adenosina desaminasa, Factor VIII, Factor IX, distrofina, \beta-globina, receptor de LDL, CFTR, insulina, eritropoyetina, factores antiangiogénicos, hormona del crecimiento, glucocerebrosidasa, \beta-glucouronidasa, \alpha1-antitripsina, fenilalanina hidroxilaa, tirosina hidroxilasa, ornitina transcarbamilasa, arginosuccinato sintetasa, UDP-glucuronisil transferasa, apoA1, TNF, receptor de TNF soluble, interleuquinas (por ejemplo, IL-2), interferones (por ejemplo, \alpha- o \gamma-IFN) y otras citoquinas y factores del crecimiento. Tipos de células que pueden modificarse con propósitos de terapia génica incluyen células pluripotenciales hematopoyéticas, mioblastos, hepatocitos, linfocitos, epitelio cutáneo y epitelio de las vías respiratorias. Para descripciones adicionales de los tipos de células, los genes y los métodos para la terapia génica, véanse, por ejemplo, Wilson, J.M y otros (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano, D. y otros (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145; Wolff, J.A. y otros (1990) Science 247:1465-1468; Chowdhury, J.R. y otros (1991) Science 254:1802-1805; Ferry, N. y otros (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Wilson, J.M. y otros (1992) J. Biol. Chem. 267:963-967; Quantin, B. y otros (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2581-2584; Dai, Y. y otros (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; van Beusechem, V.W. y otros (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-7644; Rosenfeld, M.A. y otros (1992) Cell 68:143-155; Kay, M.A. y otros (1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Cristiano, R.J. y otros (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2122-2126; Hwu, P. y otros (1993) J. Immunol. 150:4104-4115 y Herz, J. y Gerard, R.D. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2812-2816.

Aplicaciones de terapia génica de particular interés en el tratamiento del cáncer incluyen la sobreexpresión de un gen de citoquina (por ejemplo, TNF-\alpha) en linfocitos que se infiltran en tumores o la expresión ectópica de citoquinas en células tumorales para inducir una respuesta inmunitaria antitumoral en el sitio del tumor, la expresión de una enzima en células tumorales que puede convertir un agente atóxico en un agente tóxico, la expresión de agentes específicos para tumores para inducir una respuesta inmunitaria antitumoral, la expresión de genes supresores de tumores (por ejemplo, p53 o Rb) en células tumorales, la expresión de un gen de resistencia a múltiples fármacos (por ejemplo, MDR1 y/o MRP) en células de la médula ósea para protegerlas de la toxicidad de la quimioterapia.

Aplicaciones de terapia génica de particular interés en el tratamiento de enfermedades virales incluyen la expresión de proteínas de transactivación virales negativas trans-dominantes, tales como mutantes tat y rev negativos trans-dominantes para HIV o mutantes ICp4 trans-dominantes para HSV (véase, por ejemplo, Balboni, P.G. y otros (1993) J. Med. Virol. 41:289-295; Liem, S.E. y otros (1993) Hum. Gene Ther. 4:625-634; Malim, M.H. y otros (1992) J. Exp. Med. 176:1197-1201; Daly, T.J. y otros (1993) Biochemistry 32:8945-8954 y Smith, C.A. y otros (1992) Virology 191:581-588), la expresión de proteínas de envuelta negativas transdominantes, tales como mutantes env para HIV (véase, por ejemplo, Steffy, K.R. y otros (1993) J. Virol. 67:1854-1859), la expresión intracelular de anticuerpos, o fragmentos de los mismos, dirigidos a productos virales ("inmunización interna", véase, por ejemplo, Marasco, W.A. y otros (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893) y la expresión de receptores virales solubles, tales como CD4 soluble. Adicionalmente, el sistema de la invención puede usarse para expresar condicionalmente un gen suicida en células, permitiendo de ese modo la eliminación de las células después de que hayan servido para una función pretendida. Por ejemplo, células usadas para la mutación pueden eliminarse en un sujeto después de que haya sido generada una respuesta inmunitaria por el sujeto induciendo la expresión de un gen suicida en las células al administrar Tc o un análogo de Tc al sujeto.

El sistema regulador controlado por Tc de la invención tiene numerosas propiedades ventajosas que son particularmente adecuadas para la aplicación a la terapia génica. Por ejemplo, el sistema proporciona un conmutador de "marcha"/"paro" para la expresión génica que permite la dosificación regulada de un producto génico en un sujeto. Existen varias situaciones en las que puede ser deseable poder proporcionar un producto génico a niveles y/o en momentos específicos de una manera regulada, en vez de simplemente expresar el producto génico constitutivamente a un nivel fijo. Por ejemplo, un gen de interés puede conmutarse "en marcha" a intervalos fijados (por ejemplo, diariamente, días alternos, semanalmente, etc.) para proporcionar el nivel más eficaz de un producto génico de interés en el momento más eficaz. El nivel de producto génico producido en un sujeto puede controlarse mediante métodos estándar (por ejemplo, control directo usando un ensayo inmunológico tal como ELISA o RIA o indirectamente mediante el control de un parámetro de laboratorio dependiente de la función del producto génico de interés, por ejemplo, niveles de glucosa en sangre y similares). Esta capacidad para poner "en marcha" la expresión de un gen a intervalos de tiempo discretos en un sujeto mientras que también se permite que el gen se mantenga "en paro" en otros momentos evita la necesidad de la administración continuada de un producto génico de interés a intervalos intermitentes. Este enfoque evita la necesidad de inyecciones repetidas de un producto génico, que pueden ser dolorosas y/o provocar efectos secundarios y probablemente requerirían las visitas continuas a un médico. En contraste, el sistema de la invención evita estas desventajas. Por otra parte, la capacidad para poner "en marcha" la expresión de un gen a intervalos de tiempo discretos en un sujeto permite el tratamiento dirigido de enfermedades que implican "estallidos" de actividad (por ejemplo, muchas enfermedades autoinmunes) solo en momentos en los que el tratamiento es necesario durante la fase aguda cuando el dolor y los síntomas son evidentes. En momentos en los que tales enfermedades están en remisión, el sistema de expresión puede mantenerse en el estado "en paro".

Aplicaciones de terapia génica que pueden beneficiarse particularmente de esta capacidad para modular la expresión génica durante intervalos de tiempo discretos incluyen los siguientes ejemplos no limitativos:

Artritis reumatoide - genes que codifican productos génicos que inhiben la producción de citoquinas inflamatorias (por ejemplo, TNF, IL-1 e IL-12) pueden expresarse en sujetos. Ejemplos de tales inhibidores incluyen formas solubles de un receptor para la citoquina. Adicionalmente o alternativamente, las citoquinas IL-10 y/o IL-4 (que estimulan una respuesta de tipo Th2 protectora) pueden expresarse. Por otra parte, puede expresarse un receptor glucocorticomimético (GCMR).

Hipopituitarismo - el gen para la hormona del crecimiento humana puede expresarse en tales sujetos solo en la primera infancia, cuando la expresión génica es necesaria, hasta que se alcanza la estatura normal, momento en el cual la expresión génica puede regularse a la baja.

Curación de heridas/regeneración de tejidos - Factores (por ejemplo, factores de crecimiento, factores angiogénicos, etc.) necesarios para el proceso de curación pueden expresarse solo cuando es necesario y a continuación regularse a la baja.

Tratamientos anticancerosos - La expresión de productos génicos útiles en el tratamiento anticanceroso puede limitarse a una fase terapéutica hasta que se alcanza el retardo del crecimiento tumoral, momento en el cual la expresión del producto génico puede regularse a la baja. Posibles tratamientos anticancerosos sistémicos incluyen el uso de linfocitos que se infiltran en tumores, que expresan moléculas inmunoestimulantes (por ejemplo, IL-2, IL-12 y similares), inhibidores de la angiogénesis (PF4, IL-12, etc.), herregulina, leucorregulina (véase la Publicación PCT Nº WO 85/04662) y factores de crecimiento para terapia de apoyo de la médula ósea, tales como G-CSF, GM-CSF y M-CSF. En cuanto a lo último, el uso del sistema regulador de la invención para expresar factores para terapia de apoyo de la médula ósea permite la conmutación terapéutica simplificada a intervalos regulares desde quimioterapia hasta terapia de apoyo de la médula ósea (de forma similar, tal enfoque también puede aplicarse al tratamiento del SIDA, por ejemplo, conmutación simplificada desde tratamientos antivirales hasta tratamiento de apoyo de la médula ósea). Por otra parte, también es posible la orientación local controlada de tratamientos anticancerosos, por ejemplo, la expresión de un gen suicida mediante un regulador de la invención, en donde el propio regulador es controlado por, por ejemplo, un promotor específico para tumores o un promotor inducido por radiación.

En otra modalidad, el sistema regulador de la invención se usa para expresar inhibidor o inhibidores de la angiogénesis desde dentro de un tumor a través de un transgén regulado por el sistema de la invención. La expresión de inhibidores de la angiogénesis de esta manera puede ser más eficaz que la administración sistémica del inhibidor y evitaría cualesquiera efectos secundarios perjudiciales que pudieran acompañar a la administración sistémica. En particular, restringir la expresión de inhibidores de la angiogénesis a dentro de los tumores podría ser particularmente útil para tratar el cáncer en niños que todavía sufren angiogénesis asociada con el crecimiento celular normal.

En otra modalidad, la expresión de citoquinas regulada de alto nivel puede representar un método para enfocar la propia respuesta inmunitaria de los pacientes a células tumorales. Las células tumorales pueden transducirse para expresar citoquinas quimioatrayentes y que promueven el crecimiento importantes para incrementar la respuesta inmunitaria natural de un individuo. Debido a que las concentraciones más altas de citoquinas estarán en la proximidad del tumor, la probabilidad de provocar una respuesta inmunológica a antígenos tumorales se incrementa. Un problema potencial con este tipo de terapia es que las células tumorales que producen las citoquinas también serán dianas de la respuesta inmunitaria y por lo tanto la fuente de las citoquinas se eliminará antes de que pueda ser cierta la erradicación de todas las células tumorales. Para combatir esto, la expresión de proteínas virales que se sabe que enmascaran células infectadas del sistema inmunitario puede someterse a regulación, junto con el gen o los genes de citoquinas, en las mismas células. Una de tales proteínas es la proteína E19 de adenovirus (véase, por ejemplo, Cox, Science 247:715). Esta proteína evita el transporte de antígenos de HLA clase I a la superficie de la célula y de ahí que evite el reconocimiento y la lisis de la célula por las células T citotóxicas del huésped. De acuerdo con esto, la expresión regulada de E19 en células tumorales podría proteger a células productoras de citoquinas de células T citotóxicas durante el comienzo de una respuesta inmunitaria provocada por la expresión de citoquinas. Después de que haya transcurrido un período suficiente de tiempo para erradicar todas las células tumorales menos las que expresan E19, la expresión de E19 puede ponerse en paro, haciendo que estas células sean a continuación víctimas de la respuesta inmunitaria antitumoral provocada.

Hipertrofia prostática benigna - De forma similar a lo anterior, un gen suicida puede ser regulado por un regulador de la invención, en donde el propio regulador es controlado, por ejemplo, por un promotor específico de la próstata.

La capacidad para expresar un gen suicida (por ejemplo, un gen de apoptosis, un gen TK, etc) de una manera controlada usando el sistema regulador de la invención se suma a la seguridad y utilidad generales del sistema. Por ejemplo, al final de una terapia deseada, la expresión de un gen suicida puede activarse para eliminar células que tienen el vector de terapia génica, tales como células en un implante bioinerte, células que se han diseminado más allá de la localización original pretendida, etc. Por otra parte, si un trasplante se vuelve tumoral o tiene efectos secundarios, las células pueden eliminarse rápidamente mediante la inducción del gen suicida. El uso de más de una conmutación de "marcha"/"paro" controlada por Tc en una célula permite la regulación completamente independiente de un gen suicida en comparación con la regulación de un gen de interés terapéutico (según se describe con detalle aquí).

El sistema regulador de la invención ofrece además la capacidad de establecer un nivel de expresión terapéuticamente relevante para un producto génico de interés en un sujeto, en contraste con la expresión constitutiva no regulada que no ofrece flexibilidad en el nivel de expresión de producto génico que puede alcanzarse. Puede establecerse un nivel fisiológicamente relevante de expresión de producto génico basándose en la necesidad médica particular del sujeto, por ejemplo, basándose en pruebas de laboratorio que controlan niveles de producto génico pertinentes (usando métodos como los descritos anteriormente). Además de los ejemplos clínicos y los productos génicos ya analizados anteriormente con genes para la dosificación del producto génico, otros productos génicos terapéuticamente pertinentes que pueden expresarse a un nivel deseado en un momento deseado incluyen: Factor XIII y IX en hemofílicos (por ejemplo, la expresión puede elevarse durante momentos de riesgo de lesión, tales como durante deportes); insulina o amilina en diabéticos (según se necesite, dependiendo del estado de la enfermedad en el sujeto, la dieta, etc.); eritropoyetina para tratar la eritrocitopenia (según se necesite, por ejemplo, en el fallo renal en fase terminal); receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLr) o receptor de lipoproteína de muy baja densidad (VLDLr) para la arterosclerosis o terapia génica en el hígado (por ejemplo, usando implantes ex vivo). También se abarcan las aplicaciones al tratamiento de trastornos del sistema nervioso central. Por ejemplo, en la enfermedad de Alzheimer, puede efectuarse la expresión "finamente ajustada" de colina acetil transferasa (ChAT) para restaurar niveles de acetilcolina, factores neurotróficos (por ejemplo, NGF, BDNGF y similares) y/o inhibidores del complemento (por ejemplo, sCR1, sMCP, sDAF, sCD59, etc.). Tales productos génicos pueden proporcionarse, por ejemplo, mediante células trasplantadas que expresan los productos génicos de una manera regulada usando el sistema de la invención. Por otra parte, la enfermedad de Parkinson puede tratarse mediante expresión "finamente ajustada" de tirosina hidroxilasa (TH) para incrementar los niveles de levodopa y dopamina.

Además de los productos génicos proteínicos analizados anteriormente, productos génicos que son moléculas de RNA funcionales (tales como RNAs antisentido y ribozimas) pueden expresarse de una manera controlada en un sujeto con propósitos terapéuticos. Por ejemplo, puede diseñarse una ribozima que discrimina entre una forma mutada de un gen y un gen silvestre. De acuerdo con esto, un gen "correcto" (por ejemplo, un gen p53 silvestre) puede introducirse en una célula en paralelo con la introducción de una ribozima regulada específica para la forma mutada del gen (por ejemplo, un gen p53 endógeno mutado) para retirar el mRNA defectuoso expresado a partir del gen endógeno. Este enfoque es particularmente ventajoso en situaciones en las que un producto génico del gen defectuoso interferiría con la acción del gen silvestre endógeno.

La expresión de un producto génico en un sujeto usando el sistema regulador de la invención se modula usando tetraciclina o análogos de la misma. Tales fármacos pueden administrarse mediante cualquier ruta apropiada para el aporte del fármaco a su sitio de acción deseado (por ejemplo, aporte a células que contienen un gen cuya expresión ha de regularse). Dependiendo de los tipos de células particulares implicados, rutas preferidas de administración pueden incluir la administración oral, la administración intravenosa y la administración tópica (por ejemplo, usando un parche transdérmico para alcanzar a las células de un trasplante localizado bajo la piel, tales como queratinocitos, mientras que se evitan cualesquiera posibles efectos secundarios del tratamiento sistémico).

En ciertas situaciones de terapia génica, puede ser necesario o deseable adoptar etapas para evitar o inhibir reacciones inmunitarias no deseadas en un sujeto que recibe tratamiento. Para evitar una reacción contra las células que expresan el producto génico terapéutico, las propias células de un sujeto se usan generalmente, cuando es posible, para expresar el producto génico terapéutico, mediante modificación in vivo de las células del sujeto u obteniendo células del sujeto, modificándolas ex vivo y devolviéndolas al sujeto. En situaciones en las que se usan células alogeneicas o xenogeneicas para expresar un producto génico de interés, el sistema regulador de la invención, además de regular un gen terapéutico, también puede usarse para regular uno o más genes implicados en el reconocimiento inmunitario de las células para inhibir una reacción inmunitaria contra las células extrañas. Por ejemplo, moléculas de la superficie celular implicadas en el reconocimiento de una célula extraña por linfocitos T pueden modularse a la baja sobre la superficie de una célula extraña usada para el aporte de un producto génico terapéutico, tal como mediante la expresión regulada en la célula extraña de una ribozima que segmenta el mRNA que codifica la molécula de la superficie celular. Moléculas de la superficie celular particularmente preferidas que pueden modularse a la baja de esta manera para inhibir una respuesta inmunitaria no deseada incluyen moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I y/o clase II, moléculas coestimulantes (por ejemplo, B7-1 y/o B7-2), CD40 y diversas moléculas de "adhesión", tales como ICAM-1 o ICAM-2. Usando enfoques descritos aquí para la regulación independiente pero coordinada de múltiples genes en la misma célula, la regulación a la baja de la expresión de una molécula o moléculas de la superficie celular en una célula huésped puede coordinarse con la regulación al alza de la expresión de un gen terapéutico. De acuerdo con esto, después de la que terapia se complete y la expresión del gen terapéutico se interrumpa, la expresión de la molécula o moléculas endógenas de la superficie celular puede restaurarse hasta la normal.

Por otra parte, según se describe anteriormente en cuanto a los tratamientos anticancerosos, una proteína viral (por ejemplo, proteína E19 de adenovirus) que modula a la baja la expresión de antígenos del MHC puede regularse en células huésped usando el sistema de la invención como un medio para evitar reacciones inmunológicas no deseadas.

Además de evitar o inhibir una respuesta inmunitaria contra una célula extraña que aporta un producto génico terapéutico, también puede ser necesario, en ciertas situaciones, evitar o inhibir una respuesta inmunitaria contra ciertos componentes del sistema regulador de la invención (por ejemplo, las proteínas de fusión reguladoras descritas aquí) que se expresan en un sujeto, puesto que estas proteínas de fusión contienen polipéptidos que no son de mamífero que pueden estimular una reacción inmunitaria no deseada. A este respecto, las proteínas de fusión reguladoras pueden diseñarse y/o seleccionarse con respecto a una capacidad disminuida para estimular una respuesta inmunitaria en un huésped. Por ejemplo, puede elegirse un dominio activador transcripcional para usar en la proteína de fusión reguladora que tenga inmunogenicidad mínima. A este respecto, un dominio de activación transcripcional silvestre de la proteína VP16 del virus de herpes simple puede no ser un dominio de activación transcripcional preferido para usar in vivo, ya que puede estimular una respuesta inmunitaria en mamíferos. Pueden usarse dominios de activación transcripcional alternativos, como los descritos aquí, basándose en su inmunogenicidad reducida en un sujeto. Por ejemplo, puede preferirse un dominio de activación transcripcional de una proteína de la misma especie que el huésped (por ejemplo, un dominio de activación transcripcional de una proteína humana para el uso de una proteína de fusión reguladora en seres humanos). Alternativamente, una proteína de fusión reguladora de la invención puede modificarse para reducir su inmunogenicidad en sujetos, por ejemplo, identificando y modificando uno o más epítopos de células T dominantes dentro de un polipéptido de la proteína de fusión (por ejemplo, el resto represor de Tet o el resto modulador transcripcional, tal como un polipéptido de VP16). Tales epítopos de células T pueden identificarse mediante métodos estándar y alterarse mediante mutagénesis, de nuevo mediante métodos estándar. Puede seleccionarse a continuación una forma modificada de una proteína de fusión reguladora que retiene su capacidad reguladora transcripcional original y sin embargo que exhibe inmunogenicidad reducida en un sujeto en comparación con una proteína de fusión no modificada.

Además de lo precedente, todos los métodos convencionales para modular a la baja generalmente o específicamente respuestas inmunitarias en sujetos pueden combinarse con el uso del sistema regulador de la invención en situaciones en las que se desea la inhibición de respuestas inmunitarias. Agentes inmunosupresores generales, tales como ciclosporina A y/o FK506, pueden administrarse al sujeto. Alternativamente, pueden usarse agentes inmunomoduladores que pueden permitir una inmunosupresión más específica. Tales agentes pueden incluir inhibidores de moléculas coestimulantes (por ejemplo, una proteína de fusión CTLA4Ig, CD4 soluble, anticuerpos anti-CD4, anticuerpos anti-B7-1 y/o anti-B7-2 o anticuerpos anti-gp39).

Finalmente, en ciertas situaciones, puede elegirse un vehículo de aporte para células que expresan un gen terapéutico, que minimiza la exposición de células trasplantadas al sistema inmunitario. Por ejemplo, las células pueden implantarse en cápsulas bioinertes/membranas biocompatibles con poros que permiten la difusión de proteínas (por ejemplo, un producto génico terapéutico de interés) fuera del implante y la difusión de nutrientes y oxígeno al implante pero que evitan la entrada de células inmunitarias, evitando de ese modo la exposición de las células trasplantadas al sistema inmunitario (como se ha aplicado al trasplante de células de los islotes).

B. Producción de Proteínas in Vitro

La producción a gran escala de una proteína de interés puede efectuarse usando células cultivadas in vitro que se han modificado para contener 1) un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión transactivadora de la invención en una forma adecuada para la expresión del transactivador en las células y 2) un gen que codifica la proteína de interés conectado operativamente a una secuencia o secuencias operadoras tet. Por ejemplo, las células de mamífero, levadura u hongo pueden modificarse para contener estos componentes de ácido nucleico según se describe aquí. Las células de mamífero, levadura u hongo modificadas pueden cultivarse a continuación mediante técnicas de fermentación estándar en presencia de Tc o un análogo de la misma para inducir la expresión del gen y producir la proteína de interés. De acuerdo con esto, la invención proporciona un procedimiento de producción para aislar una proteína de interés. En el procedimiento, una célula huésped (por ejemplo, una levadura u hongo), en la que se ha introducido tanto un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión transactivadora de la invención como un ácido nucleico que codifica la proteína de interés conectado a al menos una secuencia operadora tet, se hace crecer a escala de producción en un medio de cultivo en presencia de tetraciclina o un análogo de tetraciclina para estimular la transcripción de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de interés (es decir, la secuencia de nucleótidos conectada operativamente a la secuencia o secuencias operadoras tet) y la proteína de interés se aísla de células huésped recogidas o del medio de cultivo. Pueden usarse técnicas de purificación de proteínas estándar para aislar la proteína de interés del medio o de las células recogidas.

C. Producción de Proteínas in Vivo

La invención también proporciona la producción a gran escala de una proteína de interés en animales, tal como en animales de granja transgénicos. Los avances en la tecnología transgénica han hecho posible producir ganado transgénico, tal como caballos, cabras, cerdos y ovejas (revisado en Wall, R.J. y otros (1992) J. Cell. Biochem. 49:113-120 y Clark, A.J. y otros (1987) Trends in Biotechnology 5:20-24). De acuerdo con esto, puede construirse ganado transgénico que porta en su genoma los componentes del sistema regulador inducible de la invención, en donde un gen que codifica una proteína de interés está conectado operativamente a al menos una secuencia operadora tet. La expresión génica, y así la expresión proteínica, se induce administrando Tc (o un análogo de la misma) al animal transgénico. La producción de proteínas puede orientarse a un tejido particular conectando el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión transactivadora a un elemento o elementos reguladores específicos para tejidos que limitan la expresión del transactivador a ciertas células. Por ejemplo, un elemento regulador específico de las glándulas mamarias, tal como el promotor del suero de la leche (Patente de EE.UU. Nº 4.873.316 y Publicación de Solicitud Europea Nº 264.166), puede conectarse al transgén transactivador para limitar la expresión del transactivador al tejido mamario. Así, en presencia de Tc (o un análogo), la proteína de interés se producirá en el tejido mamario del animal transgénico. La proteína puede diseñarse para ser secretada en la leche del animal transgénico y, si se desea, la proteína puede aislarse a continuación de la leche.

D. Modelos Animales de Enfermedad Humana

Las proteínas activadoras e inhibidoras transcripcionales de la invención pueden usarse solas o en combinación para estimular o inhibir la expresión de genes específicos en animales para imitar la patofisiología de la enfermedad humana para crear de ese modo modelos animales de enfermedad humana. Por ejemplo, en un animal huésped, un gen de interés que se cree que está implicado en una enfermedad puede ponerse bajo el control transcripcional de una o más secuencias operadoras tet (por ejemplo, mediante recombinación homóloga, según se describe aquí). Tal animal puede aparearse con un segundo animal que tiene uno o más transgenes para una proteína de fusión transactivadora y/o una proteína de fusión inhibidora para crear progenie que puede tener tanto un gen de proteína o proteínas de fusión regulado por tetraciclina como una secuencia diana regulada por tet. La expresión del gen de interés en esta progenie puede modularse usando tetraciclina (o un análogo). Por ejemplo, la expresión del gen de interés puede modularse a la baja usando una proteína de fusión inhibidora transcripcional para examinar la relación entre la expresión génica y la enfermedad. Tal enfoque puede ser ventajoso sobre la inactivación total de expresión ("knock out") génica mediante recombinación homóloga para crear modelos animales de enfermedad, puesto que el sistema regulado por tet descrito aquí permite el control tanto sobre los niveles de expresión del gen de interés como la cronología de cuándo se regula a la baja o al alza la expresión génica.

E. Producción de Líneas Celulares Estables para Clonación Génica y Otros Usos

El sistema inhibidor transcripcional descrito aquí puede usarse para mantener la expresión génica "en paro" (es decir, expresada) para permitir de ese modo la producción de líneas celulares estables que de otro modo no pueden producirse. Por ejemplo, líneas celulares estables que tienen genes que son citotóxicos para las células pueden ser difíciles o imposibles de crear debido a "falta de ajuste" en la expresión de los genes tóxicos. Reprimiendo la expresión génica de tales genes tóxicos usando las proteínas de fusión inhibidoras transcripcionales de la invención, pueden crearse líneas celulares estables que tienen genes tóxicos. Tales líneas celulares estables pueden usarse a continuación para clonar tales genes tóxicos (por ejemplo, induciendo la expresión de los genes tóxicos bajo condiciones controladas usando Tc o un análogo). Métodos generales para la clonación por expresión de genes, a los que puede aplicarse el sistema inhibidor transcripcional de la invención, se conocen en la especialidad (véase, por ejemplo, Edwards, C.P. y Aruffo, A. (1993) Curr. Opin. Biotech. 4:558-563). Por otra parte, el sistema inhibidor transcripcional puede aplicarse para inhibir la expresión basal de genes en otras células para crear líneas celulares estables, tal como en células pluripotenciales embrionarias (ES). La expresión residual de ciertos genes introducidos en células ES puede dar como resultado una incapacidad para aislar clones transfectados establemente. La inhibición de la transcripción de tales genes usando el sistema inhibidor transcripcional descrito aquí puede ser útil para vencer este problema.

Ventajas

El sistema regulador inducible de la invención que utiliza una proteína de fusión transactivadora trata y vence muchas de las limitaciones de otros sistemas reguladores inducibles de la especialidad. Por ejemplo, no se requieren concentraciones intracelulares muy altas de la proteína de fusión activadora transcripcional de la invención para la regulación eficaz de la expresión génica. Adicionalmente, puesto que la expresión génica se induce añadiendo en vez de retirando el agente inductor, la cinética de inducción en el sistema de la invención no está limitada por la velocidad de retirada del agente inductor y así es típicamente más rápida. Por otra parte, el agente inductor sólo está presente cuando se induce la transcripción génica, evitando de ese modo la necesidad de la presencia continua de un agente para mantener la expresión génica en paro.

El uso de las proteínas de fusión inhibidoras transcripcionales de la invención para inhibir la transcripción en células eucarióticas también proporciona ventajas sobre el uso de represores procarióticos solos (por ejemplo, TetR, lacR) para inhibir la transcripción en células eucarióticas. Puesto que las proteínas de fusión inhibidoras de la invención contienen un dominio silenciador transcripcional eucariótico, estas proteínas de fusión deben ser más eficaces para reprimir la transcripción en células eucarióticas, y así pueden requerir potencialmente concentraciones intracelulares inferiores para la represión eficaz con menos probabilidad de "falta de ajuste". Adicionalmente, mediante la inserción de secuencias tetO en la región reguladora de un gen endógeno, las proteínas de fusión inhibidoras transcripcionales de la invención pueden usarse para regular a la baja la expresión de genes endógenos constitutiva y/o específica de tejidos.

Por otra parte, en contraste con diversas versiones del sistema lac (por ejemplo, Labow y otros (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Baim y otros (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076), que están limitadas por las propiedades negativas del agente inductor (IPTG) y/o por la necesidad de incrementar la temperatura para inducir la expresión génica (lo que puede provocar efectos pleiotrópicos), el agente inductor usado en el sistema de la invención (Tc o un análogo de la misma) tiene muchas propiedades ventajosas: 1) la Tc y los análogos de la misma exhiben alta afinidad para TetR y baja afinidad para células eucarióticas, y así pueden usarse para la inducción génica a concentraciones que no afectan al crecimiento o la morfología celular; 2) existen análogos de Tc que retienen la unión a TetR pero que tienen actividad antibiótica reducida y pueden usarse como agentes inductores, evitando de ese modo posibles efectos secundarios procedentes de la propiedad antibiótica de la Tc; 3) las propiedades farmacocinéticas de la Tc y los análogos de Tc permiten una absorción y penetración celulares rápidas y eficaces de las barreras fisiológicas, tales como la placenta o la barrera sangre-cerebro; y 4) análogos de Tc con diferentes capacidades de inducción permiten la modulación del nivel de expresión génica.

Así, la invención proporciona un sistema regulador inducible que permite la activación rápida de la transcripción génica sin toxicidad celular y un intervalo de índices de inducción. El incremento en la expresión génica durante la inducción está típicamente entre 1000 y 2000 veces y puede ser tan alto como aproximadamente 20.000 veces. Alternativamente, pueden alcanzarse niveles inferiores de inducción génica, por ejemplo, diez veces, dependiendo de qué agente inductor se use. Este sistema puede utilizarse en una amplia gama de aplicaciones. Estas aplicaciones incluyen terapia génica, producción a gran escala de proteínas en células cultivadas o en animales de granja transgénicos y el estudio de la función génica. Por ejemplo en relación con el desarrollo y la diferenciación celulares. Por otra parte, las nuevas unidades de transcripción de la invención permiten la regulación coordinada e independiente de la expresión de múltiples genes utilizando los componentes reguladores de la invención.

La invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos que no deben considerarse limitativos. Los contenidos de todas las referencias, patentes y solicitudes de patente publicadas citados a lo largo de esta solicitud se incorporan por la presente mediante referencia.

Ejemplo 1 Selección de un Represor de Tet Mutado y Construcción de un Activador Transcripcional Inducible por Tetraciclina

Un represor de Tet "inverso", que se une a su DNA diana en presencia en vez de en ausencia de tetraciclina, se generó mediante mutagénesis química y selección esencialmente como se describe en Hecht, B. y otros (1993) J. Bacteriology 175:1206-1210. DNA de una sola hebra (hebras de codificación y no codificación) que codifica el represor de Tet derivado de Tn10 silvestre se mutagenizó químicamente con nitrito sódico. DNAs de una sola hebra (40 \mug en 40 \mul en tampón de Tris-EDTA) se mezclaron con 10 \mul de acetato sódico 2,5 M (pH 4,3) y 50 \mul de nitrato sódico que variaba entre 0,25 M y 2 M y se incubaron durante de 45 a 60 minutos a temperatura ambiente. Después de la mutagénesis, la hebra complementaria se sintetizó usando transcriptasa inversa o mediante amplificación usando la reacción en cadena de la polimerasa con DNA polimerasa de Taq. Puesto que el procedimiento de mutagénesis da mutaciones múltiples en el DNA, tres fragmentos del gen, de aproximadamente 200 pares de bases cada uno, se subclonaron individualmente en un gen represor de Tet silvestre en un vector de expresión recombinante para reemplazar la porción correspondiente del gen silvestre. Esto creaba un conjunto de genes represores de Tet mutados en donde cada gen tenía principalmente mutaciones simples en el fragmento mutagenizado de 200 pares de bases del gen.

El conjunto de represores de Tet mutados se rastreó en un ensayo genético con selecciones positivas para una interacción funcional entre un represor de Tet y su operador cognado usando cepa WH207(\lambdaWH25) de E. coli (la construcción de esta cepa se describe con detalle en Wissmann, A. y otros (1991) Genetics 128:225-232). En esta cepa de E. coli, operadores tet dirigen la expresión de genes de \beta-galactosidasa (lacZ) y represor Lac (lacI) dispuestos divergentemente y la región reguladora lac dirige la expresión de un gen de galactoquinasa (galK). La unión de represores de Tet a operadores tet pone en paro la transcripción de los genes lacI y lacZ. La ausencia de represor Lac permite la expresión del gen galK, que permite que la cepa de E. coli use galactosa como única fuente de carbono, que sirve como un marcador. El fenotipo lacZ^{-} sirve como un segundo marcador. Así, las bacterias que contienen represores de Tet que se unen a operadores tet tienen un fenotipo Gal^{+}, lacZ^{-}. Las bacterias que contienen represores de Tet silvestres tienen un fenotipo Gal^{+}, lacZ^{-} en ausencia de tetraciclina. Un represor de Tet "inverso" (rTetR) mutado se seleccionó basándose en el fenotipo Gal^{+}, lacZ^{-} en presencia de tetraciclina.

La secuencia de nucleótidos y aminoácidos del mutante de rTetR se muestra en las ID SEC Nº: 1 (posiciones de nucleótidos 1-621) y 2 (posiciones de aminoácidos 1-207), respectivamente. El análisis de la secuencia del mutante de rTetR mostraba los siguientes cambios de aminoácidos y nucleótidos:

aa (posición)	codón afectado
Silvestre	mutante	silvestre	mutante
glu (71)	lys	GAA	AAA
asp (95)	asn	GAT	AAT
leu (101)	ser	TTA	TCA
gly (102)	asp	GGT	GAT

Dos mutaciones adicionales no daban como resultado un intercambio de aminoácidos:

aa (posición)	codón afectado
Silvestre	mutante	silvestre	mutante
leu (41)	leu	TTG	CTG
arg (80)	arg	CGT	CGC

Para convertir el mutante de rTetR en un activador transcripcional, un fragmento XbaI/Eco47III de 399 pares de bases que codifica los aminoácidos 3 a 135 de rTetR (es decir, que abarca la región mutada) se intercambió por el correspondiente fragmento de restricción del vector de expresión pUHD15-1 para crear pUHD17-1. En pUHD15-1, las secuencias de nucleótidos que codifican TetR silvestre se conectan en el marco a las secuencias de nucleótidos que codifican los 130 aminoácidos C-terminales de VP16 de virus de herpes simple. Estas secuencias transactivadoras están flanqueadas aguas arriba por un promotor/potenciador de CMV y aguas abajo por un sitio de poli(A) de SV40 (la construcción de pUHD15-1 se describe con más detalle en USSN 08/076.726 y Gossen, M. y Bujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 89:5547-5551). Así, en pUHD17-1, las secuencias de nucleótidos que codifican el mutante de TetR inverso se conectan en el marco a secuencias de VP16 para crear un transactivador controlado por Tc inverso (denominado aquí tTA^{R}). El intercambio análogo de la región mutada de rTetR por la región silvestre de TetR se realizó con el plásmido pUHD152-1, que es el mismo que pUHD15-1, excepto que contiene adicionalmente secuencias de nucleótidos que codifican una señal de localización nuclear conectada en el marco al extremo 5' de las secuencias de nucleótidos que codifican el represor de Tet. La secuencia de aminoácidos de la señal de localización nuclear es MPKRPRP (ID SEC Nº: 5), que está conectada a la serina en la posición de aminoácido 2 de TetR. El vector de expresión resultante que codifica el transactivador controlado por Tc inverso que incluye una señal de localización nuclear (denominado aquí ntTA^{R}) se denominó pUHD172-1.

Ejemplo 2 Estimulación inducida por tetraciclina de la transcripción por tTA^{R} Transfección Transitoria

Los vectores de expresión pUHD17-1 y pUHD172-1 se transfectaron transitoriamente mediante un método de fosfato cálcico estándar en células HeLa junto con un plásmido informador, pUHC13.3, en el que operadores tet heptámeros se fusionan aguas arriba de un promotor de hCMV mínimo y un gen informador de luciferasa (el plásmido informador se describe con detalle en USSN 08/076.726 y Gossen, M. y Bujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:5547-5551). Después de la incubación de las células transfectadas a 37ºC durante 20 horas en presencia o ausencia de tetraciclina (o un análogo de la misma), la actividad de luciferasa se ensayó como sigue: células desarrolladas hasta \sim80% de confluencia en platos de 35 mm en medio esencial mínimo de Eagle se lavaron con 2 ml de solución salina tamponada con fosfato antes de que se sometieran a lisis en fosfato Tris 25 mM, pH 7,8/ditiotreitol 2 mM/ácido diaminociclohexanotetraacético 2 mM/glicerol al 10%/Triton-X-100 al 1% durante 10 minutos a temperatura ambiente. El lisado se rascó de los platos de cultivo y se centrifugó durante 10 segundos en una centrífuga de Eppendorf. A continuación, partes alícuotas (10 \mul) del sobrenadante se mezclaron con 250 \mul de glicilglicina 25 mM/MgSO_{4} 15 mM/ATP 5 mM y se ensayaron con respecto a la actividad de luciferasa en Lumat LB9501 (Berthold, Wildbad, F.R.G.) usando el modo integral (10 segundos). Se usó D-luciferina (L6882, Sigma) a 0,5 mM. La señal de fondo medida en extractos de células HeLa que no contenían un gen de luciferasa era indistinguible del fondo del instrumento (80-120 unidades de luz relativas (rlu)/10 s). El contenido de proteína del lisado se determinó de acuerdo con Bradford (Bradford, M.M. (1976) Anal. Biochem. 72:248-254). Las células transfectadas con plásmidos que codificaban tTA^{R} o ntTA^{R} mostraban un nivel incrementado de actividad de luciferasa en presencia de tetraciclinas. Este efecto era consecuentemente más pronunciado cuando se usaba anhidrotetraciclina (ATc) en lugar de tetraciclina.

Transfección Estable

Después de este análisis de transfección transitoria, se prepararon vectores de expresión para la transfección estable de células. Un casete de resistencia a la neomicina derivado de pSV2neo (descrito en Southern, P.J. y Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:327-341) se integró en los vectores de expresión transactivadores pUHD17-1 y pUHD172-1, dando como resultado pUHD17-1neo y pUHD172-1neo, respectivamente. pUHD172-1neo, que codifica para ntTA^{R}, se integró establemente en células HeLa mediante técnicas estándar. Diez clones celulares resistentes a G418 se analizaron con respecto a su fenotipo mediante supertransfección transitoria con pUHC13-3 que tenía el gen de luciferasa bajo el control de un promotor de CMV mínimo y operadores tet. Tres clones, HR4, HR5 y HR10, mostraban un fuerte incremento de actividad de luciferasa en presencia de ATc. A partir de estos clones, se seleccionó HR5 para experimentos adicionales.

Para crear transfectantes estables tanto para ntTA^{R} como para un gen informador de luciferasa conectado al operador tet, células HR5 se cotransfectaron con pUH13-3 y pHMR272, que codifica para la resistencia a la higromicina (véase Bernhard, H-U. y otros (1985) Exp. Cell Res. 158:237-243), y se seleccionaron clones resistentes a higromicina. En un experimento análogo, células HR5 se cotransfectaron con pUH13-7 y pHMR272. pUH13-7 contiene una secuencia promotora mínima que abarca la posición +19 a -37 del promotor HSVtk adyacente a las secuencias tetO heptámeras, en vez de un promotor de CMV mínimo. A partir de 21 clones resistentes a higromicina, 10 mostraban actividad de luciferasa inducible durante la adición de Tc o doxiciclina (Dc) al medio de cultivo. Los clones que contenían el gen informador de luciferasa conectado a un promotor de CMV mínimo se denominan HR5-C, mientras que los que contienen el gen informador de luciferasa conectado a un promotor tk mínimo se denominan HR5-T.

Seis de los clones HR5 establemente transfectados con una unidad informadora dependiente de ntTA^{R} y que previamente se mostraba que eran sensibles a tetraciclinas se desarrollaron en paralelo en ausencia o presencia de 1 \mug/ml de doxiciclina. Aproximadamente 3 x 10^{4} células se cultivaron en placa en cada plato de 35 mm (4 platos para cada clon). Después de un desarrollo durante 60 horas, las células se recogieron y se determinó la actividad de luciferasa de los extractos (en unidades de luz relativas (rlu)/\mug de proteína extraída). Según se muestra en la Tabla 1, los niveles de expresión absolutos de seis clones demuestran que la activación de la expresión del gen de luciferasa por encima de 3 órdenes de magnitud se alcanza en varias de las líneas celulares estables dobles que contienen el sistema regulador de ntTA^{R}.

Se apreciará que incluso podrían alcanzarse factores de inducción superiores (por ejemplo, tan altos como un incremento de 20.000 veces en la expresión) si, en lugar de añadir simplemente el agente inductor al medio de cultivo, las células se lavaban antes de la inducción y a continuación se volvían a cultivar en placa en medio de cultivo reciente que contenía el agente inductor.

TABLA 1 Actividad de luciferasa dependiente de doxiciclina de clones celulares luc+/HR5 estables dobles

Actividad de luciferasa, rlu/\mug de proteína
Clon	-Doxiciclina	+Doxiciclina	Factor de Inducción
HR5-C6	65	54.911	845
	62	69.525	1120
HR5-C11	100	165.671	1660
	142	179.651	1270
HR5-C14	43	44.493	1030
	43	56.274	1310
HR5-T2	56	16.696	298
	40	16.416	410
HR5-T15	6,8	1838	270
	6,5	1688	260
HR5-T19	4,8	1135	236
	5,4	1285	237

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Inducción de la actividad de luciferasa por diferentes tetraciclinas

Se examinó la capacidad de la tetraciclina y varios análogos de tetraciclina diferentes para inducir la expresión de luciferasa en células HR5-C11. Células HR5-C11 se cultivaron en placas de una densidad de aproximadamente 3 x 10^{4} células/plato de 35 mm (\sim80% de confluencia). Después de la ligazón completa de las células, las siguientes tetraciclinas se añadieron a los cultivos en una concentración de 1 \mug/ml: tetraciclina-HCl (Tc), oxitetraciclina-HCl (OTc), clorotetraciclina (CTc), anhidrotetraciclina-HCl (ATc) y doxiciclina-HCl (Doxi). Estos compuestos estaban disponibles comercialmente de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, y se mantuvieron en solución acuosa a una concentración de 1 \mug/ml. Células desarrolladas en ausencia de antibiótico (-) servían como un control. Después de 3 días, las células se recogieron y la actividad de luciferasa y el contenido de proteína de los extractos se determinaron. Los resultados se muestran en el gráfico de barras de la Figura 1. Cada barra de la figura (cerrada y sombreada) representa la actividad de luciferasa relativa (normalizada para la cantidad de proteína extraída) de un solo plato de cultivo. La media de las actividades de luciferasa obtenidas a partir de dos placas desarrolladas sin tetraciclinas se definió como 1. Tc, CTc y OTc mostraban una estimulación moderada de la actividad de luciferasa. En contraste, ATc y Doxi estimulaban la actividad de luciferasa aproximadamente 1000 y 1500 veces, respectivamente.

Respuesta con la dosis de la actividad de luciferasa a doxiciclina en células HR5-C11

El experimento descrito anteriormente que examina la capacidad de inducción de diferentes tetraciclinas revelaba que la doxiciclina era el efector más potente de las tetraciclinas examinadas. Por lo tanto, la doxiciclina se seleccionó para analizar cuantitativamente su respuesta con la dosis. Células HR5-C11 se incubaron con diferentes concentraciones de doxiciclina y se midió la actividad de luciferasa. Los datos de tres experimentos independientes se muestran en la Figura 2. A menos de 10 ng/ml del medio de cultivo, la doxiciclina es ineficaz para inducir la actividad de luciferasa. Sin embargo, cuando la concentración se elevaba por encima de 10 mg/ml, se observó un incremento casi lineal en la expresión de luciferasa. La activación máxima se alcanzaba a 1 \mug/ml. A concentraciones por encima de 3 \mug/ml, la doxiciclina mostraba un ligero efecto inhibidor del crecimiento sobre células HeLa según se determinaba en un ensayo de MTT.

Cinética de inducción del sistema de ntTA^{R}

Para examinar la cinética de la inducción mediada por ntTA^{R} inducida por doxiciclina de la expresión génica, el transcurso de tiempo de inducción de actividad de luciferasa en células HT5-C11 se controló después de la adición de doxiciclina al medio (concentración final 1 \mug/ml). Las células se cultivaron en presencia de doxiciclina y, después de diversos intervalos de tiempo, las células se recogieron y la actividad de luciferasa se determinó como se describe anteriormente. Según se muestra en la Figura 3, se observó una inducción de 100 veces de actividad de luciferasa después de 5,5 horas de incubación con Doxi. Se alcanzaban niveles completamente inducidos en menos de 24 horas de incubación con Doxi. Así, estos resultados indican que la inducción de la expresión génica se produce rápidamente después de la exposición de las células al agente inductor.

Ejemplo 3 Regulación Coordinada de la Expresión de Dos Secuencias de Nucleótidos Mediante un Activador Transcripcional Controlado por Tc

Se construyó un vector de expresión recombinante para la transcripción bidireccional coordinada de dos secuencias de nucleótidos que comprendía, en una dirección 5' a 3': un gen de luciferasa, un primer promotor mínimo, siete secuencias operadoras tet, un segundo promotor mínimo y un gen LacZ. El constructo se ilustra en la Figura 6. En este constructo, los genes de luciferasa y LacZ están orientados de modo que se transcriban en orientaciones opuestas con relación a las secuencias operadoras tet, es decir, el gen de luciferasa se transcribe en una dirección 5' a 3' desde la cadena inferior de DNA, mientras que el gen LacZ se transcribe en una dirección 5' a 3' desde la cadena superior de DNA. El gen de luciferasa está seguido por una señal de poliadenilación de SV40, mientras que el gen LacZ está seguido por una señal de poliadenilación de \beta-globina.

El constructo se transfirió a las células HtTA-1 de la línea celular HeLa, que expresan una proteína de fusión de represor de Tet silvestre-VP16 (denominada tTA y descrita en Gossen, M. y Bujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551). La proteína de fusión tTA se une a secuencias operadoras tet en ausencia de Tc (o análogo) pero no en presencia de Tc (o análogo). El constructo se cotransfectó a células HtTA-1 con un plásmido que confiere resistencia a higromicina y se seleccionaron clones establemente transfectados basándose en su fenotipo de resistencia a higromicina. Los clones resistentes a higromicina (Hygr^{r}) seleccionados se examinaron con respecto a actividad de luciferasa y \beta-galactosa. Los clones positivos para los tres marcadores (Hygr^{r}, luc^{+}, \beta-gal^{+}) se examinaron a continuación con respecto a la corregulación dependiente de tetraciclina de la expresión de actividad de luciferasa y \beta-galactosidasa cultivando los clones en cantidades crecientes de tetraciclina y midiendo la actividad de luciferasa y \beta-galactosidasa. Los resultados de tal experimento usando el clon Ht1316-8/50 se muestran en la Figura 8. En ausencia de tetraciclina (en cuyo caso tTA puede unirse a operadores tet y activar la expresión génica), se detecta actividad tanto de luciferasa como de \beta-galactosidasa. En presencia de cantidades crecientes de tetraciclina, la actividad de luciferasa y \beta-galactosidasa están reguladas a la baja coordinadamente y equivalentemente. Estos datos demuestran que la expresión de dos genes puede regularse coordinadamente mediante un transactivador controlado por tetraciclina conectando operativamente los dos genes a la misma secuencia o secuencias operadoras tet.

Ejemplo 4 Construcción de una Proteína de Fusión Inhibidora Transcripcional Regulada por Tetraciclina que Comprende TetR y un Dominio Silenciador de Krueppel

Para construir un vector de expresión que codifica un inhibidor transcripcional regulado por tetraciclina de la invención (también denominado un dominio silenciador controlado por tetraciclina o tSD), un fragmento de ácido nucleico que codifica un dominio silenciador transcripcional se liga a un vector de expresión que contiene secuencias de nucleótidos que codifican un TetR silvestre o modificado (es decir, mutado) de modo que las secuencias que codifican el dominio silenciador estén ligadas en el marco con las secuencias que codifican TetR. El plásmido pUHD141sma-1 contiene secuencias de nucleótidos que codifican un represor de Tet derivado de Tn10 silvestre (las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del cual se muestran en las ID SEC Nº: 16 y 17, respectivamente). En pUHD141sma-1, la secuencia que codifica TetR está conectada en su extremo 5' al promotor de CMV y en su extremo 3' inmediato a una secuencia de nucleótidos que crea un policonector en el que pueden introducirse fragmentos de ácido nucleico adicionales. La secuencia de nucleótidos a través de esta región policonectora es: TCC CCG GGT AAC TAA GTA AGG ATC C (ID SEC Nº: 24) (en donde TCC CCG GGT ACC codifican los residuos de aminoácido 205-208 de TetR, a saber Ser-Gly-Ser-Asn). Esta región policonectora incluye sitios de endonucleasa de restricción para PspAI (CCC GGG) y BamHI (GGA TCC). Aguas abajo de la región policonectora, el plásmido contiene una señal de poliadenilación derivada de SV40. El vector pUHD141sma-1 se ilustra esquemáticamente en la Figura 11.

Para construir un vector de expresión que codifica una proteína de fusión entre TetR y un dominio silenciador transcripcional de la proteína Krueppel (Kr) de Drosophila, un fragmento de ácido nucleico que codifica un dominio silenciador de Kr se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cDNA de Kr como una plantilla. Se diseñan cebadores oligonucleotídicos que amplifican un fragmento de ácido nucleico que codifica los 64 aminoácidos C-terminales de Kr (denominados C64KR). Esta región corresponde a las posiciones de aminoácidos 403-466 de la proteína natural. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de C64KR se muestran en la ID SEC Nº: 20 y la ID SEC Nº: 21, respectivamente. Los cebadores de PCR se diseñan para incluir sitios de endonuclesas de restricción de modo que el fragmento amplificado resultante contiene sitios de endonucleasas de restricción en sus extremos 5' y 3'. Se eligen sitios de endonucleasas de restricción que estén contenidos dentro del policonector de pUHD141sma-1 que permiten la ligación direccional en el marco del fragmento amplificado al sitio policonector. Por ejemplo, se diseñan cebadores de PCR que incorporan un sitio PspAI (CCC GGG) en el extremo 5' del fragmento que codifica C64KR y un sitio BamHI en el extremo 3' del fragmento. Después de una reacción de PCR estándar, el fragmento amplificado y pUHD141-sma1 se digieren con PspAI y BamHI. El fragmento amplificado se liga a continuación direccionalmente en el sitio policonector de pUHD141-sma1 usando condiciones de ligación estándar para crear el vector de expresión pUHD141kr-1. Se usan técnicas estándar para aislar el plásmido deseado y confirmar su construcción. La construcción de pUHD141kr-1 se ilustra esquemáticamente en la Figura 11.

\newpage

El vector de expresión pUHD141kr-1 resultante contiene secuencias de nucleótidos que codifican una proteína de fusión que comprende los aminoácidos 1-207 del TetR silvestre conectados en el marco a los aminoácidos 403-466 de Kr (C64KR). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos a través de la unión de la proteína de fusión son como sigue: AGT GGG TCC CCG GGT GAC ATG GAA (ID SEC Nº: 25) y Ser-Gly-Ser-Pro-Gly-Asp-Met-Glu (ID SEC Nº: 26). Ser-Gly-Ser corresponde a los aminoácidos 205-207 de TetR, Pro-Gly son codificados por el policonector y Asp-Met-Glu corresponden a los aminoácidos 403-405 de C64KR.

De forma similar, un vector de expresión que codifica una proteína de fusión de un TetR mutado (que se une a tetO solo en presencia de Tc) y C64KR puede construirse como se describe anteriormente usando secuencias de nucleótidos que codifican un TetR mutante (cuyas secuencias de nucleótidos y aminoácidos se muestran en las ID SEC Nº: 18 y 19, respectivamente) en lugar de las secuencias de TetR silvestre en pUHD141-sma1.

Un vector de expresión que codifica una proteína de fusión TetR-Kr (por ejemplo, pUHD141kr-1) se transfecta transitoriamente o establemente en células huésped según se describe en el Ejemplo 2 par expresar la proteína de fusión TetR-Kr en la célula huésped. Un constructo de gen informador que contiene una o más secuencias tetO, un promotor mínimo y un gen informador, tal como luciferasa, también se transfecta a las células según se describe en el Ejemplo 2. (Constructos de genes informadores se describen con más detalle en USSN 08/076.726 y Gossen, M. y Bujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551). La actividad de luciferasa en presencia y ausencia de concentraciones crecientes de Tc o un análogo, por ejemplo doxiciclina, se mide como se describe en el Ejemplo 2. Para la proteína de fusión TetR silvestre-Kr descrita anteriormente, la capacidad inhibidora transcripcional de la proteína de fusión se determina comparando la cantidad de actividad de luciferasa en presencia de doxiciclina (sin represión) con la cantidad de actividad de luciferasa en ausencia de doxiciclina (represión). La actividad inhibidora transcripcional de la proteína de fusión también puede probarse usando constructos de genes informadores que exhiben niveles basales superiores de expresión (es decir, niveles superiores de expresión en presencia de doxiciclina) usando un constructo de gen informador que contiene elementos reguladores positivos adicionales (por ejemplo, secuencias potenciadoras).

Ejemplo 5 Construcción de una Proteína de Fusión Inhibidora Transcripcional Regulada por Tetraciclina que Comprende TetR y un Dominio Silenciador de v-erbA

Para construir un vector de expresión que codifica una proteína de fusión entre TetR y un dominio silenciador transcripcional a partir del producto oncogénico v-erbA, un fragmento de ácido nucleico que codifica un dominio silenciador de v-erbA se liga en el marco en pUHD141sam-1 como se describe en el Ejemplo 4. Un fragmento de ácido nucleico que codifica un dominio silenciador de v-erbA adecuado para la ligación en pUHD141sma-1 se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando un cDNA de v-erbA como una plantilla. Se diseñan cebadores oligonucleotídicos que amplifican un fragmento de ácido nucleico que codifica los aminoácidos 364-635 de la proteína v-erbA natural. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de esta región de v-erbA se muestran en las ID SEC Nº: 22 e ID SEC Nº: 23, respectivamente. Según se describe en el Ejemplo4, se diseñan cebadores de PCR de modo que el fragmento de v-erbA amplificado contenga sitios de endonucleasas de restricción en sus extremos 5' y 3', tal como PspAI en el extremo 5' y BamHI en el extremo 3'. Después de una reacción de PCR estándar, el fragmento amplificado y pUHD141-sma1 se digieren con PspAI y BamHI. El fragmento amplificado se liga a continuación direccionalmente en el sitio policonector de pUHD141-sma1 usando condiciones de ligación estándar para crear el vector de expresión pUHD141kr-1. También pueden usarse técnicas estándar para aislar el plásmido deseado y confirmar su construcción. La construcción de pUHD141erb-1 se ilustra esquemáticamente en la Figura 11.

El vector de expresión pUHD141erb-1 resultante contiene secuencias de nucleótidos que codifican una proteína de fusión que comprende un TetR silvestre conectado en el marco a los aminoácidos de 365-635 de v-erbA. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos a través de la unión de la proteína de fusión son como sigue: AGT GGG TCC CCG GGT CTG GAC GAC (ID SEC Nº: 27) y Ser-Gly-Ser-Pro-Gly-Leu-Asp-Asp (ID SEC Nº: 28). Ser-Gly-Ser corresponde a los aminoácidos 205-207 de TetR, Pro-Gly están codificados por el policonector y Leu-Asp corresponden a los aminoácidos 364-366 del dominio silenciador de v-erbA.

Como se describe en el Ejemplo 4, un vector de expresión que codifica una proteína de expresión de un TetR mutado (que se une a tetO solo en presencia de Tc) y un dominio silenciador de v-erbA pueden construirse como se describe anteriormente usando secuencias de nucleótidos que codifican un TetR mutante (cuyas secuencias de nucleótidos y aminoácidos se muestran en las ID SEC Nº: 18 y 19, respectivamente) en lugar de las secuencias de TetR silvestre en pUHD141-sma1.

La expresión de la proteína de fusión TetR-v-erbA en las células huésped y el ensayo de la actividad inhibidora transcripcional de la proteína de fusión son como se describen en el Ejemplo 4 para la proteína de fusión TetR-Kr.

Ejemplo 6 Regulación de la Expresión Génica en Animales Transgénicos Mediante tTA^{R}

Para examinar la capacidad de tTA^{R} para regular la expresión génica in vivo, se construyeron cepas transgénicas de ratones que contenían inserciones cromosómicas heterólogas de un constructo de expresión de tTA^{R} o un gen informador conectado operablemente a operadores tet. Cepas transgénicas simples que contenían un constructo de expresión de tTA^{R} o el gen informador conectado a tetO se cruzaron a continuación y se identificó una progenie transgénica doble. Los animales transgénicos dobles se caracterizaron a continuación en cuanto a la capacidad de tTA^{R}, de una manera dependiente de tetraciclina, para regular la expresión del gen informador. Este ejemplo demuestra que tTA^{R} estimula eficazmente la expresión de un gen conectado operablemente a operadores tet en tejidos de los animales in vivo durante la administración de tetraciclina (o un análogo) a los animales, mientras que la expresión del gen conectado a tetO permanece a niveles de fondo en ausencia de tetraciclina o un análogo. Estos resultados demuestran que el sistema regulador transcripcional controlado por tetraciclina descrito aquí funciona eficazmente en animales, además de líneas celulares in vitro.

Generación de ratones transgénicos para una unidad de expresión P_{hCMV}-tTA^{R}

Se obtuvieron ratones que expresan proteínas tTA mediante inyección pronuclear en oocitos fertilizados de un fragmento XhoI-PfmI de 2,7 kb cortado del plásmido pUHG17-1. Este fragmento de DNA contenía el gen tTA^{R} (mostrado en la ID SEC Nº: 1) bajo el control transcripcional del promotor IE de CMV humano (posición +75 a -675) junto con un sitio de poliadenilación de \beta-globina de conejo que incluye un intrón. El promotor IE de CMV humano es un promotor constitutivo que permite la expresión de la proteína de fusión de tetR mutado-VP16 en todas las células en las que se ha producido la integración cromosómica de la secuencia de DNA que codifica tTA^{R}. Se inyectó DNA en oocitos fertilizados en una concentración de aproximadamente 5 ng por \mul mediante técnicas estándar. Se generaron ratones transgénicos a partir de los oocitos fertilizados inyectados de acuerdo con procedimientos estándar. Se analizaron ratones fundadores transgénicos usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) e hibridación Southern para detectar la presencia del transgén tTA^{R} en DNA cromosómico de los ratones. Dos líneas de ratones transgénicos, CR3 y CR4, se identificaron y se cruzaron con otra línea de ratones transgénicos que tenía un gen informador de luciferasa bajo el control de secuencias tetO (descrito adicionalmente más adelante).

Generación de ratones transgénicos para la unidad informadora de luciferasa P_{hCMV\text{*}-1}

Ratones que tenían una unidad de expresión del gen informador de luc P_{hCMV\text{*}-1} se generaron mediante inyección pronuclear en oocitos fertilizados de un fragmento XhoI-EaeI de 3,1 kb cortado del plásmido pUHC13-3. Este fragmento de DNA contiene el gen de luciferasa bajo el control transcripcional del promotor de P_{hCMV\text{*}-1} sensible a tetraciclina (ID SEC Nº: 8), junto con un sitio de poliadenilación temprano de SV40t que incluye un intrón. Se inyectó DNA en oocitos en una concentración de aproximadamente 5 ng por \mul y se generaron ratones transgénicos de acuerdo con procedimientos estándar. Se analizaron ratones fundadores transgénicos usando hibridación Southern para detectar la presencia del transgén de luc P_{hCMV\text{*}-1} en DNA cromosómico de los ratones. Una línea de ratones transgénica para el gen informador de luciferasa conectado a tetO, L7, se cruzó con las líneas transgénicas tTA^{R}, CR3 y CR4 (descritas adicionalmente más adelante).

Generación de ratones transgénicos para P_{hCMV\text{*}-1} luc y P_{hCMV}-tTA^{R}

Habiendo construido ratones transgénicos simples que expresan tTA^{R} o que tienen P_{hCMV\text{*}-1} luc, se obtuvieron ratones transgénicos dobles que tenían tanto el vector de expresión de tTA como las unidades informadoras de luciferasa a través de cruce de ratones heterocigóticos transgénicos para uno de los dos transgenes. Se identificaron animales trasngénicos dobles mediante rastreos estándar (por ejemplo, PCR y/o hibridación Southern) para detectar la presencia tanto del transgén tTA^{R} como del transgén P_{hCMV\text{*}-1} luc en DNA cromosómico de los ratones.

Inducción y análisis de actividad de luciferasa en muestras de tejido procedentes de ratones

Para una administración oral, tetraciclina o su derivado doxiciclina se administraron en el agua de bebida en una concentración de 200 \mug por ml con 5% de sacarosa para ocultar el sabor amargo de los antibióticos. Para ratones lactantes, la concentración era 2 mg por ml con 10% de sacarosa para asegurar una absorción suficiente a través de la leche por el animal joven.

Para analizar la actividad de luciferasa, los ratones se sacrificaron mediante dislocación cervical y muestras de tejido se homogeneizaron en tubos de 2 ml que contenían 500 \mul de tampón de lisis (fosfato Tris 25 mM, pH 7,8/DTT 2 mM/EDTA 2 mM/glicerol al 10%/Triton X-100 al 1%) usando un Ultra-Turrax. El homogenado se congeló en nitrógeno líquido y se centrifugó después de congelar durante 5 minutos a 15.000 g. Se mezclaron 2-20 \mul del sobrenadante con 250 \mul de tampón de ensayo de luciferasa (glicilglicina 25 mM, pH 7,5/MgSO_{4} 15 mM/ATP 5 mM) y la actividad de luciferasa se midió durante 10 segundos después de la inyección de 100 \mul de una solución de luciferina 125 \muM usando Berthold Lumat LB 9501. La concentración de proteína del homogenado se determinó usando el ensayo de Bradford y la actividad de luciferasa se calculó como unidades de luz relativas (rlu) por \mug de proteína total.

Resultados

Ratones de 2 líneas que tenían el transgén P_{hCMV}-tTA^{R} (CR3 y CR4) se aparearon con ratones de la línea L7, transgénicos para P_{hCMV\text{*}-1} luc. La línea L7 muestra un fondo muy bajo pero detectable de actividad de luciferasa en diferentes órganos que se debe probablemente a efectos de posición en el lado de integración. La actividad de luciferasa de fondo en diferentes tejidos de los ratones transgénicos simples L7 se ilustra gráficamente en la Figura 12, representada por las columnas cuadriculadas a la derecha para cada tejido examinado (cada columna representa los resultados de un animal). La actividad de luciferasa en diferentes tejidos de los ratones transgénicos dobles C3/L7 en ausencia del análogo de tetraciclina doxiciclina (es decir, condiciones no inducidas) se ilustra gráficamente en la Figura 12, representada por las columnas oscuras en el medio para cada tejido examinado. La actividad de luciferasa en diferentes tejidos de los ratones transgénicos dobles C3/L7 en presencia de doxiciclina (es decir, condiciones inducidas) se ilustra gráficamente en la Figura 12, representada por las columnas claras a la izquierda para cada tejido examinado.

La actividad de luciferasa era detectable en los siete tejidos de los ratones transgénicos dobles examinados: páncreas, riñón, estómago, músculo, timo, corazón y lengua. El patrón tisular de niveles de luciferasa activados (es decir, en presencia de doxiciclina) en los ratones transgénicos dobles era similar a los patrones de expresión del promotor IE de hCMV presentado en la literatura. Esto está de acuerdo con la expresión del gen informador de luciferasa que es regulado por tTA^{R} (que se expresa en los ratones bajo el control del promotor IE de hCMV). El nivel de inducción del gen informador variaba entre los diferentes tejidos examinados. Se alcanzaban factores de regulación de hasta 100.000 veces (es decir, 5 órdenes de magnitud), por ejemplo en el páncreas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: Hermann Bujard

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(B): CALLE: Remler Str. 9

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(C): CIUDAD: D-69120 Heidelberg

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(E): PAIS: Alemania

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(A): NOMBRE: Manfred Gossen

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(B): CALLE: 978 Arlington Boulevard Nº B

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(C): CIUDAD: El Cerrito

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(D): ESTADO: California

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(E): PAÍS: EE.UU. de A.

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(F): CODIGO POSTAL (ZIP): 94530

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(ii): TITULO DE LA INVENCIÓN: Moduladores Transcripcionales Regulados por Tetraciclina

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(iii): NUMERO DE SECUENCIAS: 28

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(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A): DESTINATARIO: LAHIVE & COCKFIELD

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(B): CALLE: 60 State Street, vivienda 510

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(C): CIUDAD: Boston

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(D): ESTADO: Massachusetts

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(E): PAÍS: EE.UU. de A.

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(F): ZIP: 02109-1875

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(v): FORMA LEIBLE POR COMPUTADORA:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible

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(B): ORDENADOR: PC Compatible con IBM

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOPORTE LÓGICO: Texto ASCII

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(vi): DATOS DE SOLICITUD PREVIOS:

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(A): NUMERO DE SOLICITUD: A asignar

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 07-JUN-1995

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(vii): DATOS DE SOLICITUD PREVIOS:

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(A): NUMERO DE SOLICITUD: US 08/383.754

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 03-FEB-1995

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(vii): DATOS DE SOLICITUD PREVIOS:

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(A): NUMERO DE SOLICITUD: US 08/275.876

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 15-JULIO-1994

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(vii): DATOS DE SOLICITUD PREVIOS:

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(A): NUMERO DE SOLICITUD: US 08/270.637

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 01-JULIO-1994

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(viii): INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE

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(A): NOMBRE: DeConti, Giulio A. Jr.

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(B): NUMERO DE REGISTRO: 31.503

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(C): REFERENCIA/NUMERO DE EXPEDIENTE: BBI-009C2PC

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(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

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(A): TELÉFONO: (617)227-7400

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(B): TELEFAX: (617)227-5941

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 1008 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE HEBRA: doble

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

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(ix): RASGO:

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(A): NOMBRE/CLAVE: exón

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(B): SITUACIÓN: 1..1008

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(ix): RASGO:

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(A): NOMBRE/CLAVE: mRNA

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(B): SITUACIÓN: 1..1008

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(ix): RASGO:

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(A): NOMBRE/CLAVE: unión mixta

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(B): SITUACIÓN: 1..207

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(ix): RASGO:

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(A): NOMBRE/CLAVE: unión mixta

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(B): SITUACIÓN: 208..335

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(ix): RASGO:

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(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): SITUACIÓN: 1..1005

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 1:

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1

2

3

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 315 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 2:

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4

5

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 33 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE HEBRA: doble

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 3:

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36

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 4:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 11 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 4:

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\sa{Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu}

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 5:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 7 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Pro Lys Arg Pro Arg Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 569 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 520 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 7:

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 450 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Citomegalovirus humano

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: K12, Towne

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: mRNA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 382..450

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 450 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Citomegalovirus humano

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Towne

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: mRNA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 382..450

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 398 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Virus de Herpes Simple

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: KOS

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTTTATCAC TGATAAACAA ACTTATCAGT GATAAAGA

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTCTATCAT TGATAGAGTT CCCTATCAGT GATAGAGA

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTTATCAT CGATAAGCTA GTTTATCACA GTTAAATT

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTCTATCAT TGATAGGGAA CTCTATCAAT GATAGGGA

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATCTATCAC TGATAGAGTA CCCTATCATC GATAGAGA

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 621 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

11

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 207 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 17:

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 621 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 18:

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 207 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 19:

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 192 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 20:

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 64 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 816 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

17

18

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 272 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 23:

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCCCGGGTA ACTAAGTAAG GATCC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTGGGTCCC CGGGTGACAT GGAA

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: polipéptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Gly Ser Pro Gly Asp Met Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTGGGTCCC CGGGTCTGGA CGAC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: polipéptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Gly Ser Pro Gly Leu Asp Asp}

Claims

1. Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína de fusión que activa la transcripción, comprendiendo la proteína de fusión un primer polipéptido que es un represor de Tet mutado y tiene al menos una substitución, adición o deleción de aminoácido en comparación con un represor de Tet silvestre, de modo que el represeor de Tet mutado se une a una secuencia operadora tet en presencia, pero no en ausencia, de tetraciclina o un análogo de tetraciclina, conectado operativamente a un segundo polipéptido que activa la transcripción en células eucarióticas.

2. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la proteína de fusión comprende además un tercer polipéptido conectado operativamente que promueve el transporte de la proteína de fusión a un núcleo celular.

3. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que (a) el represor de Tet mutado es un represor de Tet derivado de Tn10 mutado que tiene una substitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en la posición 71, la posición 95, la posición 101 y la posición 102 de una secuencia de aminoácidos de represor de Tet derivado de Tn10 silvestre; o (b) el represor de Tet mutado es un represor de Tet derivado de Tn10 mutado que comprende la secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 1 a 207 de la ID SEC Nº: 2.

4. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el segundo polipéptido comprende un dominio de activación de la transcripción de proteína 16 del virión del herpes simple.

5. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, en el que (a) el dominio de activación de la transcripción comprende una región de aminoácidos C-terminal de la proteína 16 del virión del virus del herpes simple que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 208 a 335 de la ID SEC Nº: 2; o (b) el dominio de activación de la transcripción comprende al menos una copia de una región C-terminal de la proteína 16 del virión del virus del herpes simple que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº: 4.

6. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el segundo polipéptido comprende un dominio de activación de la transcripción seleccionado del grupo que consiste en: un dominio de activación de la transcripción ácido, un dominio de activación de la transcripción rico en prolina, un dominio de activación de la transcripción rico en serina/treonina y un dominio de activación de la transcripción rico en glutamina.

7. Una proteína de fusión codificada por un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

8. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº: 2.

9. Un vector recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en una forma adecuada para la expresión de la proteína de fusión en una célula huésped.

10. El vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 9, en el que (a) al menos un elemento regulador viral se usa para dirigir la expresión constitutiva de la proteína de fusión; o (b) la expresión de la proteína de fusión se regula mediante al menos un elemento regulador específico para tejido; o (c) la expresión de la proteína de fusión se regula mediante al menos una secuencia operadora tet.

11. Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína de fusión que inhibe la transcripción en células eucarióticas, comprendiendo la proteína de fusión un primer polipéptido que es un represor de Tet mutado que tiene al menos una substitución, adición o deleción de aminoácido en comparación con un represor de Tet silvestre, conectado operativamente a un segundo polipéptido heterólogo que inhibe la transcripción en células eucarióticas; y en donde el primer polipéptido es un represor de Tet mutado que se une a una secuencia operadora tet en presencia pero no en ausencia de tetraciclina o un análogo de tetraciclina.

12. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11, en el que (a) el segundo polipéptido comprende un dominio silenciador de la transcripción de un producto del oncogén v-erbA; o (b) el segundo polipéptido comprende un dominio silenciador de la transcripción de una proteína Krueppel de Drosophila; o (c) el segundo polipéptido comprende un dominio silenciador de la transcripción de una proteína seleccionada del grupo que consiste en el receptor de ácido retinoico alfa, el receptor de hormona tiroidea alfa, el complejo proteínico Ssn6/Tup1 de levadura, la proteína del gen de Drosophila even-skipped, SIR1, NeP1, la proteína dorsal de Drosophila, TSF3, SFI, la proteína hunchback de Drosophila, la proteína knirps de Drosophila, WT1, Oct-2.1, la proteína engrailed de Drosophila, E4BP4 y ZF5.

13. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el dominio silenciador de la transcripción de un producto del oncogén v-erbA comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº: 23.

14. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el dominio silenciador de la transcripción de una proteína Krueppel de Drosophila comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº: 21.

15. El ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en el que la proteína de fusión comprende además un tercer polipéptido conectado operativamente que promueve el transporte de la proteína de fusión a un núcleo celular.

16. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el represor de Tet mutado tiene una substitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido correspondiente a una posición de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en la posición 71, la posición 95, la posición 101 y la posición 102 de una secuencia de aminoácidos del represor de Tet derivado de Tn10 silvestre.

17. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el represor de Tet mutado comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº: 19.

18. Una proteína de fusión que inhibe la transcripción en células eucarióticas, en donde la proteína de fusión está codificada por un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17.

19. Un vector recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17 en una forma adecuada para la expresión de la proteína de fusión en una célula huésped.

20. Una célula huésped que comprende el vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 19.

21. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 20, que comprende además una secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse, conectada operativamente a al menos una secuencia operadora tet.

22. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 21, en la que (a) la secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse es una secuencia de nucleótidos exógena introducida en la célula huésped; o (b) la secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse es una secuencia de nucleótidos endógena a la que se ha conectado operativamente al menos una secuencia operadora tet.

23. la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 20 o la reivindicación 22, que es una célula de mamífero o una célula de levadura, insecto, planta u hongo.

24. Un método in vitro para estimular o modular la transcripción de la secuencia de nucleótidos conectada operativamente a la al menos una secuencia operadora tet en la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 21, que comprende poner en contacto la célula huésped con (o modular la concentración en contacto con la célula huésped de) tetraciclina o un análogo de tetraciclina.

25. El método de acuerdo con la reivindicación 24, que comprende además aislar una proteína codificada por la secuencia de nucleótidos conectada operativamente a la al menos una secuencia operadora tet de las células huésped o de un medio de cultivo en el que se desarrollan las células huésped.

26. Un ratón o una planta transgénicos que comprenden un transgén que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 11, en una forma adecuada para la expresión de la proteína de fusión en células del organismo transgénico no humano.

27. El ratón o la planta transgénicos de acuerdo con la reivindicación 26, en los que el transgén está integrado en una posición predeterminada dentro del genoma del organismo.

28. El ratón o la planta transgénicos de acuerdo con la reivindicación 26, que comprenden además una secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse, conectada operativamente a al menos una secuencia operadora tet.

29. Un método para estimular o modular la transcripción de la secuencia de nucleótidos conectada operativamente a la al menos una secuencia operadora tet en el ratón o la planta transgénicos de acuerdo con la reivindicación 28, que comprende administrar al organismo, o modular la concentración presente en el organismo de, tetraciclina o un análogo de tetraciclina; excluyendo métodos para el tratamiento del cuerpo de un ser humano o un animal mediante terapia.

30. Una célula huésped que comprende:

un primer ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6;

un segundo ácido nucleico que codifica una segunda proteína de fusión que inhibe la transcripción, comprendiendo la segunda proteína de fusión un tercer polipéptido que es un represor de Tet que se une a una secuencia operadora tet en ausencia, pero no en presencia, de tetraciclina o un análogo de tetraciclina, conectado operativamente a un cuarto polipéptido que inhibe la transcripción en células eucarióticas; y

una tercera molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse, conectada operativamente a al menos una secuencia operadora tet.

31. Un ratón o una planta transgénicos que comprenden:

un primer transgén que codifica una proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6;

un segundo transgén que codifica una segunda proteína de fusión que inhibe la transcripción, comprendiendo la segunda proteína de fusión un tercer polipéptido que es un represor de Tet que se une a una secuencia operadora tet en ausencia, pero no en presencia, de tetraciclina o un análogo de tetraciclina, conectado operativamente a un cuarto polipéptido que inhibe la transcripción en células eucarióticas; y

un tercer transgén que comprende una secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse, conectada operativamente a al menos una secuencia operadora tet.

32. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 30 o el ratón o la planta transgénicos de acuerdo con la reivindicación 31, en los que el tercer polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº: 17.

33. Un vector recombinante para la transcripción bidireccional coordinada de una primera y una segunda secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse, (a) comprendiendo el vector una molécula de ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6 u 11 a 17 en una forma adecuada para la expresión de una proteína de fusión de acuerdo con las reivindicaciones 7 a 8 y 18, que comprende un primer polipéptido que es un represor de Tet mutado y tiene al menos una substitución, adición o deleción de aminoácido en comparación con un represor de Tet silvestre, de modo que el represeor de Tet mutado se une a una secuencia operadora tet en presencia, pero no en ausencia, de tetraciclina o un análogo de tetraciclina, conectado operativamente a un segundo polipéptido que activa la transcripción en células eucarióticas, en donde la proteína de fusión regula dicha transcripción bidireccional coordinada de dicha primera y dicha segunda secuencia de nucleótidos; (b) comprendiendo el vector una secuencia de nucleótidos que comprende en una dirección 5' a 3':

un primer sitio de clonación para la introducción de una primera secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse, que está conectado operativamente a

al menos una secuencia operadora tet, que está conectada operativamente a

un segundo sitio de clonación para la introducción de una segunda secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse, y (c) incluyendo el vector dichas secuencias promotoras mínimas primera y segunda, en donde la primera secuencia de nucleótidos cuando se introduce en el primer sitio de clonación se conecta operativamente al primer promotor mínimo y la segunda secuencia de nucleótidos cuando se introduce en el segundo sitio de clonación se conecta operativamente al segundo promotor mínimo y la transcripción de las secuencias de nucleótidos primera y segunda introducidas en el vector avanza en direcciones opuestas con relación a la al menos una secuencia operadora tet.

34. Uso in vitro de una proteína de fusión de acuerdo con las reivindicaciones 7, 8 ó 18, que comprende un primer polipéptido que es un represor de Tet mutado y tiene al menos una substitución, adición o deleción de aminoácido en comparación con un represor de Tet silvestre, de modo que el represor de Tet mutado se une a una secuencia operadora tet en presencia, pero no en ausencia, de tetraciclina o un análogo de tetraciclina, conectado operativamente a un segundo polipéptido que activa la transcripción en células eucarióticas para regular la transcripción bidireccional coordinada de una primera y una segunda secuencia de nucleótidos en un vector recombinante, (a) comprendiendo el vector una secuencia de nucleótidos que comprende en una dirección 5' a 3': un primer sitio de clonación para la introducción de una primera secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse, que está conectado operativamente a un segundo sitio de clonación para la introducción de una segunda secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse; y (b) incluyendo el vector secuencias promotoras mínimas primera y segunda, en donde la primera secuencia de nucleótidos cuando se introduce en el primer sitio de clonación se conecta operativamente al primer promotor mínimo y la segunda secuencia de nucleótidos cuando se introduce en el segundo sitio de clonación se conecta operativamente al segundo promotor mínimo y la transcripción de las secuencias de nucleótidos primera y segunda introducidas en el vector avanza en direcciones opuestas con relación a la al menos una secuencia operadora tet.

35. El vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 33 o el uso de acuerdo con la reivindicación 34, en los que las secuencias de nucleótidos primera y segunda que han de transcribirse se han introducido en los sitios de clonación primero y segundo, respectivamente.

36. El vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 33 o el uso de acuerdo con la reivindicación 34, en los que (a) las secuencias de nucleótidos primera y segunda codifican subunidades polipeptídicas de una proteína heterodímera; o (b) la primera secuencia de nucleótidos codifica una proteína de interés y la segunda secuencia de nucleótidos codifica un marcador detectable.

37. Un sistema vectorial recombinante que comprende al menos un vector recombinante que tiene una secuencia de nucleótidos para la regulación independiente de la transcripción de una primera y una segunda secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse, (a) comprendiendo el sistema vectorial:

un primer sitio de clonación para la introducción de una primera secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse, conectado operativamente a al menos una secuencia operadora tet de un tipo de primera clase;

un segundo sitio de clonación para la introducción de una segunda secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse, conectado operativamente a al menos una secuencia operadora tet de un tipo de segunda clase y (b) incluyendo el sistema vectorial secuencias promotoras mínimas primera y segunda, en donde la primera secuencia de nucleótidos cuando se introduce en el primer sitio de clonación se conecta operativamente al primer promotor mínimo y la segunda secuencia de nucleótidos cuando se introduce en el segundo sitio de clonación se conecta operativamente al segundo promotor mínimo; comprendiendo además el sistema vectorial recombinante la molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 u 11 a 17 en una forma adecuada para la expresión de una proteína de fusión de acuerdo con las reivindicaciones 7 a 8 y 18, que comprende un primer polipéptido que es un represor de Tet mutado y tiene al menos una substitución, adición o deleción de aminoácido en comparación con un represor de Tet silvestre, de modo que el represeor de Tet mutado se une a una secuencia operadora tet en presencia, pero no en ausencia, de tetraciclina o un análogo de tetraciclina, conectado operativamente a un segundo polipéptido que activa la transcripción en células eucarióticas.

38. Uso in vitro de una proteína de fusión de acuerdo con las reivindicaciones 7, 8 ó 18, que comprende un primer polipéptido que es un represor de Tet mutado y tiene al menos una substitución, adición o deleción de aminoácido en comparación con un represor de Tet silvestre, de modo que el represor de Tet mutado se une a una secuencia operadora tet en presencia, pero no en ausencia, de tetraciclina o un análogo de tetraciclina, conectado operativamente a un segundo polipéptido que activa la transcripción en células eucarióticas, para regular un sistema vectorial recombinante que comprende al menos un vector recombinante que tiene una secuencia de nucleótidos para la regulación independiente de la transcripción de una primera y una segunda secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse, (a) comprendiendo el sistema vectorial: un primer sitio de clonación para la introducción de una primera secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse, conectado operativamente a al menos una secuencia operadora tet de un tipo de primera clase; un segundo sitio de clonación para la introducción de una segunda secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse, conectado operativamente a al menos una secuencia operadora tet de un tipo de segunda clase y (b) incluyendo el sistema vectorial secuencias promotoras mínimas primera y segunda, en donde la primera secuencia de nucleótidos cuando se introduce en el primer sitio de clonación se conecta operativamente al primer promotor mínimo y la segunda secuencia de nucleótidos cuando se introduce en el segundo sitio de clonación se conecta operativamente al segundo promotor mínimo.

39. El sistema vectorial de acuerdo con la reivindicación 37 o el uso de acuerdo con la reivindicación 38, en los que el tipo de primera o segunda clase de la secuencia operadora tet es una secuencia operadora tet de clase B.

40. El sistema vectorial de acuerdo con la reivindicación 37 o el uso de acuerdo con la reivindicación 38, en los que las secuencias de nucleótidos primera y segunda que han de transcribirse se han introducido en los sitios de clonación primero y segundo, respectivamente.

41. El sistema vectorial o el uso de acuerdo con la reivindicación 40, en los que la primera secuencia de nucleótidos comprende un gen terapéutico y la segunda secuencia de nucleótidos comprende un gen suicida.

42. Un estuche que comprende un medio portador que tiene en estrecho confinamiento en el mismo al menos dos medios de contención que comprenden:

un primer medio de contención que contiene un primer ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y

un segundo medio de contención que contiene un segundo ácido nucleico que comprende un sitio de clonación para la introducción de una secuencia de nucleótidos que ha de transcribirse, conectado operativamente a al menos una secuencia operadora tet.

43. El estuche de acuerdo con la reivindicación 42, que comprende además un tercer medio de contención que contiene un tercer ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que inhibe la transcripción, comprendiendo la proteína de fusión un primer polipéptido que es un represor de Tet que se une a una secuencia operadora tet en ausencia, pero no en presencia, de tetraciclina o un análogo de tetraciclina, conectado operativamente a un segundo polipéptido heterólogo que inhibe la transcripción en células eucarióticas.

44. El estuche de acuerdo con la reivindicación 42, que comprende además un cuarto medio de contención que contiene tetraciclina o un análogo de tetraciclina.

45. Un producto para usar en terapia que comprende (a) un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y 11 a 17; o (b) un vector recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9, 10, 33, 35 y 36; o (c) una célula huésped de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23 o la reivindicación 30; o (d) un sistema vectorial recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 37 ó 39 a 41.

46. Un producto de acuerdo con la reivindicación 45, en el que la terapia es terapia génica.

47. Uso de (a) un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y 11 a 17; o (b) un vector recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9, 10, 33, 35 y 36; o (c) una célula huésped de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23 o la reivindicación 30; o (d) un sistema vectorial recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 39 a 41; para la fabricación de un medicamento para uso en terapia en el que la expresión in vivo de un gen de interés para propósitos terapéuticos se controla mediante la administración de tetraciclina o un análogo de tetraciclina, y en donde la terapia comprende el tratamiento de cualquiera de artritis reumatoide, hipopituitarismo, curación de heridas/regeneración de tejidos, cáncer, SIDA, hipertrofia prostática benigna, enfermedades virales, hemofilia, diabetes, eritrocitopenia, arterosclerosis, trastornos del sistema nervioso central, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y reacciones inmunológicas no deseadas; o la estimulación de una respuesta inmunitaria.

48. Uso de un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que activa la transcripción, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para la producción in vitro de proteínas de interés mediante la acción de tetraciclina o un análogo de tetraciclina.

49. Uso de un ratón o una planta transgénicos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 26, 27, 28 y 31, para la fabricación de proteínas de interés mediante la administración de tetraciclina o un análogo de tetraciclina, excluyendo métodos para el tratamiento del cuerpo de un ser humano o un animal mediante terapia.

50. Uso de (a) una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 7 o la reivindicación 8 que activa la transcripción, (b) una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 18 que inhibe la transcripción o (c) una combinación de dichas proteínas de fusión (a) y (b) para inducir la patofisiología de una enfermedad humana estimulando y/o inhibiendo la expresión de genes específicos en animales experimentales no humanos a través de la administración de tetraciclina o un análogo de tetraciclina, excluyendo métodos para el tratamiento del cuerpo de un ser humano o un animal mediante terapia.

51. Uso de una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 18 que inhibe la transcripción, para reprimir la expresión de genes tóxicos mediante la acción de tetraciclina o un análogo de tetraciclina, en la producción de líneas celulares estables.

52. Uso de un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 33, 35 y 36, en combinación con un sistema vectorial de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 37 ó 39 a 41, para la regulación coordinada e independiente combinada de múltiples secuencias de nucleótidos mediante la acción de tetraciclina o un análogo de tetraciclina, excluyendo métodos para el tratamiento del cuerpo de un ser humano o un animal mediante terapia.