CN1443238A - 肿瘤特异性启动子 - Google Patents

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Abstract

包含肾细胞因子基因(其为人视黄酸效应的生长/分化因子)的－559至+50的609bp碱基序列的DNA(外显子1的第一个碱基序列设为+1)；包含c－erbB－2基因(其属于EGF受体家族并具有酪氨酸激酶活性)的－213至+38的251bp碱基序列的DNA(转录起始点设为+1)。因为具有肿瘤特异性转绿活性和高启动子活性，因此这些DNA是非常有用的肿瘤特异性启动子，其用于联合使用药物代谢酶基因和癌症治疗的前药(其可通过上述酶活化)的自杀基因治疗、利用包含细胞因子编码基因的表达载体的癌症基因治疗和利用只对肿瘤细胞产生细胞毒性作用的溶瘤病毒的癌症基因治疗。

Description

肿瘤特异性启动子
技术领域
本发明涉及肿瘤特异性启动子，其能使外源基因以肿瘤特异性的方式在肿瘤细胞或肿瘤组织中表达。更具体而言，本发明涉及肿瘤特异性启动子，其以肿瘤特异性的方式在肿瘤细胞或肿瘤组织中有较高的转录活性，并且其可以广泛应用于癌症的基因治疗，例如包含药物代谢酶的编码基因和癌症治疗前药的自杀基因治疗、通过将细胞因子基因引入到癌症细胞并因此通过加强身体的免疫学功能而治疗癌症的免疫基因治疗、以及利用只杀死肿瘤细胞的溶瘤病毒的癌症基因治疗等。
背景技术
关于癌症治疗，近几年的许多注意力都放在癌症的基因治疗上，其中将外源基因引入到细胞以治疗癌症。癌症的基因治疗包括：靶向癌基因和/或肿瘤抑制基因的基因治疗(其中癌基因的作用被抑制或变性的肿瘤抑制基因被重新激活)；自杀基因治疗(其中将人类细胞中本来不存在的药物代谢酶基因引入到肿瘤细胞中，然后给予该酶激活的癌症治疗的前药来只杀死引入药物代谢酶基因的细胞)；免疫学基因治疗(其中将细胞因子基因等引入到细胞以增强人体的免疫学功能并因此来治疗癌症)；将肿瘤特异性启动子插入到腺病毒E1A或E1B基因(其为病毒早期基因并且是腺病毒增殖所必须的)的上游以构建溶瘤病毒(其特异性在整合的肿瘤细胞中增殖，肿瘤细胞被该病毒特异性的杀死)的基因治疗等。
在此类基因治疗中，目的基因在肿瘤细胞或肿瘤组织中的特异性表达对基因治疗的效率和安全性有着重要的意义，也是目前基因治疗所遇到的挑战之一。为了能进行该肿瘤特异性基因表达，开发能调节引入的基因以肿瘤特异性方式表达的启动子非常重要。
作为肿瘤特异性启动子，已知的有α-胎蛋白启动子、癌胚抗原(CEA)启动子、前列腺特异性抗原启动子等。但是，这些启动子由于其能应用的范围有限和启动子的活性不高而缺乏适应性。因此用这些启动子的基因治疗的应用范围非常有限。
另一方面，从畸胎瘤细胞中发现了新的视黄酸效应生长/分化因子肾细胞因子(midkine)(一种肝素结合蛋白质)，其基因已经被克隆(Kodomatsu，K.等，Biochem.Biophys.Res.Commun，151：1312-1318，1988)。尽管该蛋白质的生物学功能还未完全阐明，但是其在多种人胃肠癌症(结肠癌、胰腺癌、肝癌等)、肺癌、乳腺癌、成神经细胞瘤、脑瘤等中表达频率和表达水平较高(Tsutui，J.等，Cancer Res.，53：1281-1285，1993；Aridome，K.等，Jpn.J.CancerRes.，86：655-661，1995；Muramatsu，H.等，J.Biochem.，119：1171-1175，1996；O’Brien，T.等，Cancer Res.，56：2515-2518，1996)。
c-erbB-2(HER2/neu)属于EGF受体家族并具有酪氨酸激酶活性。尽管该基因在正常上皮细胞中表达较少，但其在乳腺癌和其它癌症例如食管癌、胃癌和卵巢癌中高度表达(Slamon，DJ等，Science，244：707-712，1989；Hynes，NE等，Biochim.Biophys.Acta，1198：165-184，1994)。另外，据报道其在乳腺癌中的高表达与对抗癌剂的抗性有关，并且因此是导致预后不良的因素(Hynes，NE等，Biochim.Biophys.Acta，1198：165-184，1994)。
也对肾细胞因子基因和c-erbB-2基因的启动子区进行了广泛的研究。
因此，已经证明肾细胞因子基因的5’末端上游区的2.3kb可用作在肿瘤细胞中诱导基因的转录活性的启动子，并可用作自杀基因治疗的启动子，其中联合使用了单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)(药物代谢酶基因)以及丙氧鸟苷(gancyclovir)(癌症治疗的前药)(Miyauchi，M.等，Jpn，J.Cancer Res.，90：469-475，1999；Adachi，Y.等，Mol.Ther.，1：s238，2000)。但是，肾细胞因子基因的5’末端上游区的2.3kb的肿瘤特异性和启动子活性不够高。
尽管也已经分析了c-erbB-2基因的启动子区，但是以前的研究所用的动物种类不是人，肿瘤细胞不是乳腺癌，因此，最小启动子区的鉴定不同的报道(Ishii，S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：4374-4378，1987；Hudson，LG等，J.Biol.Chem.，265：4389-4393，1990；Hollywood，DP等，EMBO J.，12：2369-2375，1993；Scott，GK等，J.Biol.Chem.，269：19848-19858，1994；Benz，CC等，Oncogene，15：1513-1525，1997；Grooteclaes，M等，Cancer Res.，59：2527-2531，1999)是不同的。但是也有许多报道描述到：当将NCBIGeneBank登记的c-erbB-2启动子基因(登录No.J 05264)的1259位的碱基作为转录起始点+1时，启动子活性定位在-700bp(-662/+38)区或-553bp(-495/+38)区，并且确定活性基本位于该范围。也有报道描述启动子活性位于-213/+38区或-87/+38区，但是没有研究其肿瘤特异性，通常的c-erbB-2基因的启动子区(而不是肿瘤特异区)只在肿瘤细胞上进行了测试。事实上，所有以前的使用c-erbB-2启动子来表达自杀基因的报道使用的都是533bp(-465/+38)或含有533bp的更长的区(Harris，JD等，Gene，Ther.，1：170-175，1994；Ring，CTA等，Gene，Ther.，3：1094-1103，1996；Takakuwa，K.等，Jpn.J.Cancer Res.，88：166-175，1997；Pandha，HS等，J.Clin.Oncol.，17：2180-2189，1999)。另外，也有报道说c-erbB-2基因的257bp(-256/+1)区具有特异性针对癌症的启动子活性(Japan Societyof Gene Therapy，Abstract，issued on July 18，1999，Page 98；Japan Society of Gene Therapy，Abstract，issued on July 28，2000，Page65)。但是，该区也不具有充分高的肿瘤特异性或高启动子活性。
因此，有必要开发肿瘤特异的启动子，其具有充分高的肿瘤特异性和高启动子活性，并能够有效的用于基因治疗。
发明内容
在为了获得具有充分高的肿瘤特异性和启动子活性的肿瘤特异的启动子的透彻和广泛的研究之后，本发明人发现使用位于肾细胞因子基因的5’末端上游区的2.3kb内的特异部分序列作为启动子或使用c-erbB-2基因的调节区的特异部分序列作为启动子可以获得具有充分高的肿瘤特异性和启动子活性的肿瘤特异的启动子，其能够有效的用于基因治疗，并因此完成本发明。
因此，本发明是肿瘤特异性启动子，其具有序列表中SEQ ID NO：1所示的碱基序列中从1-539位的任何碱基至609位碱基的碱基序列或者SEQ ID NO：9所示的碱基序列中从1-127位的任何碱基至251位碱基的碱基序列。
另外本发明是肿瘤特异性启动子，其可在严谨条件下与序列表中SEQ ID NO：1所示的碱基序列中从1-539位的任何碱基至609位碱基的碱基序列或者SEQ ID NO：9所示的碱基序列中从1-127位的任何碱基至251位碱基的碱基序列杂交，并具有与所述的碱基序列相似的启动子功能。
另外本发明是上述肿瘤特异性启动子通过表达肿瘤特异基因用于癌症基因治疗。
另外本发明是上述肿瘤特异性启动子用于自杀基因治疗，其联合使用了其中编码药物代谢酶的基因已经被连接在肿瘤特异性启动子的下游的载体和可被所述的药物代谢酶转化为活性形式的癌症治疗的前药。
另外本发明是上述肿瘤特异性启动子通过各种溶瘤病毒用于癌症基因治疗，其中使用肿瘤特异性启动子改变了病毒基因的表达，所以病毒可特异性地在肿瘤细胞或肿瘤组织中增殖。
附图简述
图1是基于CAT分析确定从肾细胞因子基因获得的启动子的启动子活性的测量结果图。
图2A是正常人成纤维细胞MRC-5(其中含有从肾细胞因子基因获得的启动子的基因与TK基因连接并被引入)和其亲系细胞对丙氧鸟苷的体外敏感性的测量结果图。
图2B是永生化人成纤维细胞MRC-5(其中含有从肾细胞因子基因获得的启动子的基因与TK基因连接并被引入)和其亲系细胞对丙氧鸟苷的体外敏感性的测量结果图。
图3A是肺癌细胞QG-56(其中含有从肾细胞因子基因获得的启动子的基因与TK基因连接并被引入)和其亲系细胞对丙氧鸟苷的体外敏感性的测量结果图。
图3B是成神经细胞瘤NGP细胞(其中含有从肾细胞因子基因获得的启动子的基因与TK基因连接并被引入)和其亲系细胞对丙氧鸟苷的体外敏感性的测量结果图。
图3C是正常成纤维细胞HEF(其中含有从肾细胞因子基因获得的启动子的基因与TK基因连接并被引入)和其亲系细胞对丙氧鸟苷的体外敏感性的测量结果图。
图4A是肺癌细胞QG-56(其中含有从肾细胞因子基因获得的启动子的基因与TK基因连接并被引入)和其亲系细胞对丙氧鸟苷的体内敏感性的测量结果图。
图4B是肺癌细胞QG-56(其中含有从肾细胞因子基因获得的启动子的基因与TK基因连接并被引入)和其亲系细胞对生理盐水注射的体内敏感性的测量结果图。
图5是测试p53肿瘤抑制基因对从肾细胞因子基因获得的0.6kb的基因组片段的启动子活性的影响测量结果图。
图6是基于萤光素酶分析确定从肾细胞因子基因获得的启动子的启动子活性的测量结果图(其中SV40启动子(pGL-Control)的启动子活性定为100％)。
图7A是基于萤光素酶分析确定从人c-erbB-2基因获得的启动子的启动子活性的测量结果图。所用的细胞都是人乳腺癌细胞，SV40启动子(pGL-Control)的启动子活性定为100％。
图7B是基于萤光素酶分析确定从人c-erbB-2基因获得的启动子的启动子活性的测量结果图。所用的细胞都是人正常成纤维细胞，SV40启动子(pGL-Control)的启动子活性定为100％。
图7C是基于萤光素酶分析确定从人c-erbB-2基因获得的启动子的启动子活性的测量结果图。所用的细胞是人恶性黑色素瘤细胞和人肺癌细胞，SV40启动子(pGL-Control)的启动子活性定为100％。
图8A是人乳腺癌细胞MCF-7(其中含有从人c-erbB-2基因获得的启动子的基因或巨细胞病毒启动子与或未与TK基因连接并被引入)和其亲系细胞对丙氧鸟苷的体外敏感性的测量结果图。在丙氧鸟苷浓度为0时的存活率设为100％。
图8B是人恶性黑色素瘤细胞A875(其中含有从人c-erbB-2基因获得的启动子的基因或巨细胞病毒启动子与或未与TK基因连接并被引入)和其亲系细胞对丙氧鸟苷的体外敏感性的测量结果图。在丙氧鸟苷浓度为0时的存活率设为100％。
图9是人乳腺癌细胞MCF-7(其中引入了含有从人c-erbB-2基因获得的启动子的基因)和其亲系细胞对丙氧鸟苷或对生理盐水的体内敏感性的测量结果图。
完成本发明的最佳方式
本发明的肿瘤特异性启动子具有序列表中SEQ ID NO：1所示的碱基序列中从1-539位的任何碱基至609位碱基的序列或者SEQ ID NO：9所示的碱基序列中从1-127位的任何碱基至251位碱基的序列。本发明还包括肿瘤特异性启动子，其可在严谨条件下与序列表中SEQ IDNO：1所示的碱基序列中从1-539位的任何碱基至609位碱基的序列或者SEQ ID NO：9所示的碱基序列中从1-127位的任何碱基至251位碱基的序列杂交、并具有与所述的碱基序列相似的启动子功能。
SEQ ID NO：1所示1-609位的碱基序列是从-559至+50的609bp的碱基序列，其中肾细胞因子基因的5’-框架区序列中的外显子1的第一个碱基序列设为+1(Uehara，K.等，J Biochem.，111：563-567，1992)。本发明肿瘤特异性启动子包含SEQ ID NO：1所示的碱基序列中从1-539位的任何碱基至609位碱基的序列。如下列所述的实施例所示，已阐明为发挥本发明肿瘤特异性启动子的作用，该碱基序列必须至少包含SEQ ID NO：1所示的碱基序列中3’末端区539-609位的碱基。因此，本发明肿瘤特异性启动子包含SEQ ID NO：1所示的碱基序列中从1-539位的任何碱基至609位碱基的碱基序列。当将肾细胞因子基因的5’-框架区的外显子1的第一个碱基序列设为+1时，此处所用的SEQ ID NO：1的位点1、539和609的碱基分别对应于位点-559、-21和+50的碱基。如SEQ ID NO：1所示的碱基序列中从1-539位的任何碱基至609位碱基的碱基序列，优选位点1-609的碱基序列(SEQ ID NO：1所示的碱基序列)、位点416-609的碱基序列(SEQ ID NO：5所示的碱基序列)或位点275-609的碱基序列(SEQ ID NO：4所示的碱基序列)。
另外，具有SEQ ID NO：9所示的碱基序列中从1-127位的任何碱基至251位碱基的碱基序列也是本发明的肿瘤特异性启动子。如下列所述的实施例所示，已阐明为发挥本发明肿瘤特异性启动子的作用，该碱基序列必须至少包含SEQ ID NO：9所示的碱基序列中3’末端区127-251位的碱基。当将在NCB I GeneBank登记的c-erbB-2启动子基因(登录No.J05264)的1259位碱基定为转录起始点+1时，包含1-251位碱基的碱基序列对应于-213至+38位的碱基序列，SEQ ID NO：9的127位碱基对应于-87位。
根据本发明，含有能在严谨条件下与任何上述碱基序列杂交、并具有与上述的碱基序列相似的启动子功能的碱基序列也是本发明的肿瘤特异性启动子。此处所用的能在严谨条件下杂交的碱基序列是指能在反应条件(例如在含有6×SSC、2×Denhardt’s溶液、0.5％SDS和0.1mg/ml鲑精DNA溶液中65℃反应12小时)下通过Southern杂交与具有任何上述碱基序列的DNA杂交的碱基序列。本发明的肿瘤特异性启动子是能在所述条件下杂交以及具有与被杂交的受试者碱基序列相似的启动子功能(即相似程度的肿瘤特异性和相似程度的启动子活性的)的碱基序列。对于此类碱基序列可涉及与受试者碱基序列具有65％或更高、优选75％或更高的同源性的碱基序列。
上述本发明的肿瘤特异性启动子可基于已经报导的肾细胞因子基因或c-erbB-2基因的序列信息利用已知的方法如PCR方法获得。本领域技术人员可根据基础教科书如Molecular Cloning 2nd Edt.，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)容易的实现这些方法。上述具有能在上述严谨条件下杂交的碱基序列的本发明的肿瘤特异性启动子可通过定点突变、PCR方法或普通的杂交方法等容易的获得，并能参考基础教科书如上述Molecular Cloning明确地实现。
如下列实施例所述，具有SEQ ID NO：1所示的碱基序列中从1-539位的任何碱基至609位碱基的碱基序列的本发明的肿瘤特异性启动子，与位于肾细胞因子基因5’-末端上游区、含有本发明的启动子的碱基序列的较长的2.3kb和1.0kb的启动子相比，具有非常高的肿瘤特异性和非常高的启动子活性。另外，本发明的肿瘤特异性启动子具有如下特性：由于其受到p53肿瘤抑制基因的影响(所述的p53基因在正常细胞中功能正常)，本发明的肿瘤特异性启动子不起作用，而随着致瘤性转化的发展p53基因的功能消失，本发明的肿瘤特异性启动子起作用。具有SEQ ID NO：9所示的上述碱基序列中从1-127位的任何碱基至251位碱基的碱基序列的本发明的肿瘤特异性启动子，与含有该碱基序列的c-erbB-2基因的较长的启动子区相比，也具有非常高的肿瘤特异性(特别是对乳腺癌)和非常高的启动子活性。
本发明的肿瘤特异性启动子可通过基因的肿瘤特异性表达用于基因治疗，例如自杀基因治疗(其联合使用编码药物代谢酶的基因和癌症治疗的前药)、免疫学基因治疗(其通过将细胞因子基因等引入肿瘤细胞并由此增强免疫学功能来治疗癌症)等。
对于自杀基因治疗，涉及的编码药物代谢酶的基因和癌症治疗的前药的组合情况有：单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因和丙氧鸟苷或无环鸟苷、胞嘧啶脱氨酶基因和5-氟胞嘧啶、水痘-带状疱疹病毒的胸苷激酶基因和6-甲氧基嘌呤阿糖苷、E.coli gpt基因和6-噻吨(thioxanthine)、细胞色素P450 2B1基因和环磷酰胺、人脱氧胞苷激酶基因和胞嘧啶阿糖苷、E.coli UPRT基因和5-氟脲嘧啶或E.colideoD基因和6-甲基嘌呤-2’-脱氧核苷等。为了实际进行自杀基因治疗，构建表达载体(其中以能够表达的方式整合了本发明的肿瘤特异性启动子以及在其下游整合了药物代谢酶基因)，将该表达载体引入肿瘤细胞，然后给予癌症基因治疗的前药以产生抗肿瘤效果。对于载体，常用于基因引入的有逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等。另外，质粒DNA(其中以能够表达的方式整合了本发明的肿瘤特异性启动子以及在其下游整合了编码药物代谢酶的基因)脂质体或与包被的脂质体或多聚赖氨酸-DNA-蛋白质复合物一起被引入到肿瘤细胞。为了引入基因，可将这些载体，脂质体包被的等静脉内或动脉内或直接注射到肿瘤细胞内部或周围。此时，通过结合电穿孔或超声处理可增加基因引入的效率。基因引入后，通过常用方法例如口服、静脉内和动脉内注射给予癌症治疗的前药。
引入的基因通过本发明的肿瘤特异性启动子转录，由此药物代谢酶在肿瘤细胞中特异性的表达，在表达的药物代谢酶的作用下，癌症治疗的前药被转化为活性治疗剂，针对癌症的该转化的治疗剂选择性的杀死癌症细胞，因此完成了自杀基因治疗。
此类自杀性基因治疗的基本过程是已知的，单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因和丙氧鸟苷的组合临床上已经应用于脑部肿瘤等(Oldfield，E.H.，Hum.Gene Ther.，4：39-69，1993)，胞嘧啶脱氨酶基因和5-氟胞嘧啶的组合也被建议潜在的临床应用于结肠癌等(Huber，B.E.等，Cancer Res.，53：4619-4626，1993)，在进行本发明的基因治疗时可参考这些方法。
对于应用本发明的肿瘤特异性启动子的免疫学基因治疗，可以使用的方法是：将编码细胞因子如干扰素、TNF-α和白细胞介素的基因与本发明的肿瘤特异性启动子一起整合(以与上述自杀基因治疗类似的方法)到表达载体中，或者包封在脂质体中，引入到肿瘤细胞中表达细胞因子，由此增强人体生物学保护机制--免疫应答。
对于使用本发明的肿瘤特异性启动子的通过溶瘤病毒的基因治疗，可以使用的方法是：将本发明的肿瘤特异性启动子插入到E1A或E1B(其为腺病毒增殖必需的早期基因之一)的上游或用E1A或E1B启动子取代，或者将本发明的肿瘤特异性启动子插入到单纯疱疹病毒相应的早期基因的上游或用早期基因启动子取代来构建在肿瘤细胞或肿瘤组织中特异性增殖的溶瘤病毒，由此来杀死肿瘤细胞，施用该病毒来治疗癌症。对于该基因治疗，可参考Heise，C.等，J.Clin.Invest.，105：847-851，2000和其它文献。
另外，使用本发明的肿瘤特异性启动子可能特异地在肿瘤中表达癌基因的反义基因或未突变形式地肿瘤抑制基因，结果，其可能诱导脱癌作用(decarcinogenesis)(恢复正常)的程序性细胞死亡(凋亡)，并可增强肿瘤细胞对抗癌剂的敏感性和增强对放射的敏感性。
使用本发明的具有SEQ ID NO：1所示的碱基序列中从1-539位的任何碱基至609位碱基的碱基序列的肿瘤特异性启动子的基因治疗对于胃肠道癌症如结肠癌、胰腺癌和肝癌、肺癌、乳腺癌、成神经细胞瘤、脑瘤等的治疗特别有效。使用本发明的具有上述SEQ ID NO：9所示的碱基序列中从1-127位的任何碱基至251位碱基的碱基序列的肿瘤特异性启动子的基因治疗对于乳腺癌、食管癌、胃癌、卵巢癌等的治疗也有效，对乳腺癌的治疗特别有效。
将参考实施例对本发明进行详细的说明，但应注意的是本发明决不受限于这些实施例。
实施例1
从肾细胞因子基因中分离肿瘤特异性启动子
以下列方式获得分析肾细胞因子转录控制区的载体系统。
用XhoI和NcoI或XhoI和Eco47III切割质粒phgMK2.3K/CAT(Pedraza，CR等，J.Biochem.，117：845-859，1995)分别获得含有1.0kb的肾细胞因子基因组基因的4.0kb的DNA片段和含有0.6kb的肾细胞因子基因组基因的3.4kb的DNA片段。利用DNA连接酶将这些片段制成环状DNA。结果获得分别含有2.3kb(MK2.3)的具有SEQ ID NO：3所示的碱基序列的人肾细胞因子基因组基因、1.0kb(MK1.0)的具有SEQ ID NO：2所示的碱基序列的人肾细胞因子基因组基因、0.6kb(MK0.6)的具有SEQ ID NO：1所示的碱基序列的人肾细胞因子基因组基因并且在它们的下游连接了CAT(氯霉素乙酰转移酶)基因的质粒。
实施例2
测定来自肾细胞因子基因的肿瘤特异性启动子的转录活性
利用上述质粒、或具有SV40病毒启动子的质粒pCAT-Control(Promega制造)以及不含有启动子的pCAT-Basic质粒(Promega制造)，将基因引入在DMEM(Sigma)(补充10％胎牛血清)中培养的肺癌细胞QG-56、成神经细胞瘤NGP和正常人成纤维细胞MRC-5中。10μg每种质粒与脂质转染试剂(Life Technologies)混合后，室温放置30分钟以形成复合物。然后将该复合物与去除胎牛血清的细胞接触。8小时后加入补充了胎牛血清的培养基，培养40小时，然后用超声破碎基因转化的细胞。离心后，上清用于采取已知的CAT分析方法(Gorman，CM等，Mol.Cell.Biol.，2；1044-1051，1982)利用[14C]-氯霉素和乙酰CoA检测其转录活性。此时，为标准化基因引入的效率，同时引入1μg的β-半乳糖苷酶基因(pCH110，Amersham制造)，并确定β-半乳糖苷酶的活性(Heromel，P.等，Cell，39：653-662，1984)。结果如图1所示。
如图1所示的结果可以看出，肾细胞因子基因组基因的转录活性如下：
(a)使用MK0.6时，在肿瘤细胞中其转录活性比MK1.0或MK2.3强，但在正常细胞中其转录活性下降。
(b)使用MK0.6时，在肿瘤细胞中其转录活性比SV40病毒启动子强，但SV40病毒启动子在正常细胞中非常强。
因此，本研究表明，MK0.6的启动子活性在肿瘤中特别强，而MK2.3或MK1.0的启动子活性的肿瘤特异性较弱。
实施例3
使用来自肾细胞因子基因的肿瘤特异性启动子的肿瘤特异性细胞 毒性作用
(1)为检测从肾细胞因子基因获得的启动子转录活性的细胞毒性作用，将单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)(自杀基因)连接到MK0.6和MK2.3的下游，将质粒引入细胞，在基因转化的细胞的培养基中加入前药丙氧鸟苷(GCV)。检测该体系的细胞毒性作用的方法如Moolten，FL.Cancer Gene Ther.，1：279-287，1994中所述。
首先，在NruI和HindIII位点去除pcDNA3(Invitrogen制造)的CMV启动子，插入MK2.3或MK0.6，然后在EcoRV位点插入用BglI和EcoRI从pMK(Brinster，RL等，Cell，27；223-231，1981)切除的HSV-TK基因。将获得的每种质粒(MK2.3-TK和MK0.6-TK)如上所述用脂质转染试剂引入到正常细胞MRC-5或通过失活p53肿瘤抑制基因的功能而被永生化的MRC-5细胞中。为使用pcDNA3中的Neo基因的表达作为药物抗性标记，将细胞用400μg/ml的G418(LifeTechnologies制造)培养10天以分别建立表达的MK2.3-TK和MK0.6-TK的细胞。然后将细胞以500细胞/孔铺于96孔培养板上，在不同浓度的GCV(F.Hoffman-La Roche制造)下培养7天。用细胞计数试剂盒-8(Dojin Kagaku制造)检测细胞的存活率。将在0μg/ml的GCV浓度下的细胞存活定为100％，每个试验组的存活百分比列于图2A和图2B。
从图2A所示的结果可以看出，在正常MRC-5细胞中，当HSV-TK基因的转录由MK2.3启动子控制时，它们对GCV的敏感性较亲代株高500倍，细胞在较低的浓度的GCV时死亡，而当HSV-TK基因的转录由MK0.6启动子控制时，它们对GCV的敏感性与亲代株相同。
从图2B所示的结果可以看出，当用HSV-TK基因转化的永生化的MRC-5细胞由MK2.3和MK0.6启动子控制时，其对GCV的敏感性较亲代株均增加1000倍。
因此，当用MK2.3启动子控制HSV-TK基因的表达时，在永生化的细胞和正常细胞中都产生细胞毒性作用，而用MK0.6启动子时，只在永生化的细胞产生细胞毒性作用，正常细胞中不产生细胞毒性作用。这些数据表明MK0.6启动子与在图1的结果中看到的一样比MK2.3启动子有更高的肿瘤特异性。
(2)然后，利用人肿瘤细胞和正常成纤维细胞检测了该MK0.6启动子的肿瘤特异性。如上所述用脂质转染试剂将MK0.6-TK引入到各种细胞中，并在400μg/ml的G418下培养10天以获得MK0.6-TK基因被表达的细胞。随后将这些引入基因的细胞以500细胞/孔铺于96孔培养板上，在不同浓度的GCV下培养7天。用细胞计数试剂盒-8检测细胞的存活率。获得的结果如图3A、图3B和图3C所示。
从图3A和图3B所示的结果可以看出，在肿瘤细胞QG-56和NGP中对GCV的敏感性较其各自的亲代株增加1000倍。相反，从图3C所示的结果可以看出，正常成纤维细胞HEF对对GCV的敏感性与亲代株保持相同。因此，这些数据表明MK0.6启动子能够肿瘤特异性基因表达，使连接的自杀基因HSV-TK与GCV产生肿瘤特异性的细胞毒性作用。另外，目前用于治疗巨细胞病毒感染的GCV的最大血液浓度为1μg/ml，因此，如该试验所示获得GCV的细胞毒性作用的浓度0.1μg/ml低于该水平，这表明由MK0.6启动子控制的TK表达具有非常安全和有效地治疗效果。
实施例4
来自肾细胞因子基因的肿瘤特异性启动子的体内抗肿瘤效果
如上所述，利用脂质转染试剂将MK0.6-TK基因引入到QG-56细胞中，在400μg/ml的G418下培养10天以获得MK0.6-TK基因被表达的细胞。将这些引入基因的细胞和亲系细胞(1×106细胞)皮下接种6周龄的雌性BALB/c裸鼠(Nippon SLC提供)以产生皮下肿瘤。当肿瘤体积达到100mm3时，腹膜内注射30mg/kg的GCV或等量的生理盐水，进行5天。测量QG-56细胞接种后的肿瘤体积的变化，获得的结果如图4A和图4B所示。
从图4A所示的结果可以看出，其中转化了MK0.6-TK的全部7个QG-56肿瘤在注射GCV之后都消失了，并没再复发，而亲代株的肿瘤没有消退，甚至再GCV存在下仍继续肿瘤的生长。从图4B所示的结果可以看出，在注射生理盐水组，MK0.6-TK基因表达的肿瘤和亲代株肿瘤的两种肿瘤的生长速率没有变化。因此，这些数据表明MK0.6-TK启动子激活了HSV-TK基因的转录，该转录活性通过给予GCV使转染的肿瘤完全消失。
实施例5
肾细胞因子启动子的生物学特性
在至少约50％的人实体瘤中观察到p53基因功能的缺失，在肿瘤中强制表达野生型p53基因在一些情况下可抑制肿瘤的生长。因此，将DNA质粒(其中在MK0.6启动子下游连接有萤光素酶基因(报告基因))引入通过破坏p53基因功能而被永生化的MRC-5细胞，检测野生型p53基因的表达下的MK0.6启动子的转录活性。
为此，用HindIII切割实施例1中制备的MK0.6-CAT质粒，将获得的MK0.6kb基因插入pGL2-Basic(Promega制造)的HindIII位点。另外，构建并使用了在巨细胞病毒启动子下游连接有野生型p53基因的质粒(Bsker，SJ等，Science，249：912-915，1990)(CMV-p53)和用BamHI切割后插入的p53cDNA连接在CMV启动子的相反方向的对照质粒(CMV-p53R)。因此，用MK0.6-萤光素酶(3μg)和一定量的CMV-p53质粒(0-1μg)或MK0.6-萤光素酶(3μg)和一定量的CMV-p53R质粒(0-1μg)通过如上所述的脂质转染试剂转染在10cm培养皿中培养的永生化的MRC-5细胞。培养48小时后，用Dual-luciferase Reporter Assay System(Promega制造)破坏细胞，用同一试剂盒中的试剂确定Firefly萤光素酶活性。为标准化转染的效率，在每一转染中包括pRL-TK质粒(Promega制造)，确定TK启动子的Renilla萤光素酶活性，据此来校正Firefly萤光素酶活性。获得的结果如图5所示。
从图5所示的结果可以看出，随着引入的CMV-p53质粒的量的增加，MK0.6启动子的活性下降，而在引入CMV-p53R质粒的对照组中MK0.6启动子的活性没有变化。因此，该数据表明MK0.6启动子受p53肿瘤抑制基因的影响。因为在正常细胞中p53基因的功能是完整的，以及致瘤作用与该基因功能的缺失相关，因此，MK0.6启动子在正常细胞中不起作用，而在转化的细胞中起作用。
实施例6
鉴定最小的肾细胞因子启动子区1
如上述的实施例所示，在人肾细胞因子基因组基因的启动子区，特别是在从-559至+50(外显子1的第一个碱基序列定义为+1)的609bp的片段中有肿瘤特异性启动子区。为进一步缩小该区，以下列方式获得分析肾细胞因子转录控制区的载体DNA。
利用基于肾细胞因子基因组DNA的信息的PCR方法，合成了对应于从-285至+50的335bp区(MK335bp)并具有SEQ ID NO：4所示的碱基序列的DNA片段，确定序列后，将其插入pCR2.1(Invitrogen制造)。从该DNA中切除MK335bp后，将其连接到pGL2-Basic(Promega制造)以构建用来检测启动子活性的质粒。另外，利用含有SV40病毒启动子的pGL2-Control(Promega制造)和含有同样构建的609bp肾细胞因子启动子(MK0.6)的pGL2-Basic，通过下列方法检测启动子活性。
转染在DMEM(Sigma)(补充10％的胎牛血清)中培养的肺癌细胞QG-56、PC-1和人乳腺癌细胞BT549。将10μg每种质粒和脂质转染试剂(Life Technologies制造)混合后室温放置30分钟以形成复合物。然后将该复合物与去除了胎牛血清的细胞接触。8小时后加入补充了胎牛血清的培养基。培养48小时后，用Dual-luciferaseReporter Assay System(Promega制造)破坏引入基因的细胞，用同一试剂盒中的试剂确定其中Firefly萤光素酶活性。为标准化基因引入的效率，在每一基因引入组中包括1μg的pRL-TK质粒(Promega制造)，确定TK启动子的Renilla萤光素酶活性，据此来校正Firefly萤光素酶活性。
获得的结果示于图6。结果表明MK335bp的启动子活性尽管随着肿瘤细胞的不同而不同，但在肿瘤细胞中与MK0.6具有相同的活性。
实施例7
鉴定最小的肾细胞因子启动子区2
将用EcoRI消化从上述pCR2.1切除的MK335bp片段插入经NruI和HindIII消化去除巨细胞病毒启动子的pcDNA3(Invitrogen制造)的EcoRI位点。利用在PCR引物上的HindIII位点和pcDNA3的XbaI位点切割上述的DNA。将用HindIII和BamHI消化从pCH110(Pharmacia制造)上去除的β-半乳糖苷酶基因连接到上述消化的DNA的平端。然后，用KpnI和BamHI消化该DNA后，接着用核酸外切酶III消化，用琼脂糖凝胶电泳确证该DNA的长度后将其用DNA连接酶形成环状DNA。然后，确定肾细胞因子基因组区的碱基序列，获得两种含有β-半乳糖苷酶基因(其或者在具有从-144至+50的区(MK194bp)并具有SEQ ID NO：5所示的碱基序列的DNA的下游或者在具有从-20至+50的区(MK70bp)并具有SEQ ID NO：6所示的碱基序列的DNA的下游)的DNA片段。
用脂质转染试剂将这些DNA引入在DMEM(Sigma)(补充了10％胎牛血清)培养的永生化的人成纤维细胞MRC-5中。48小时后，将其在400μg/ml的G418下培养10天以获得引入基因的MRC-5细胞。用已知的方法(Topf，N等，Gene Ther.，5：507-513，1998)染色该细胞，当有β-半乳糖苷酶表达时，细胞变成蓝色。结果如表1所示。
                       表1
    引入的DNA 永生化的MRC-5染色的比例
MK335bp/β-半乳糖苷酶基因     100％
MK194bp/β-半乳糖苷酶基因     100％
MK70bp/β-半乳糖苷酶基因     0
如表1所示，当具有MK335bp和MK194bp的DNA作为启动子被引入时，MRC-5细胞被染成蓝色，而当具有MK70bp的DNA作为启动子被引入时，MRC-5细胞根本不被染色。因此，该数据表明最小的肾细胞因子启动子的数据区域位于从-144至+50的194bp的片段中，更准确地讲，位于比从-20至+50长的片段中。
实施例8
检测c-erbB-2启动子的转录活性
将c-erbB-2基因的转录起始位点作为+1，通过PCR方法扩增对应基因组-495至+38区域(p533)及具有SEQ IDNO：7所示序列的DNA，然后将该DNA片段整合进pGEM-TEasy(Promega制造)，确定PCR产物的序列。因此，将该PCR产物插入到pGL2-Basic(Promega制造)的SmaI位点后，其通过c-erbB-2基因组基因上的限制性酶位点用BlnI/SmaI、PstI/SmaI和BssHII/SmaI切割来构建质粒，其中c-erbB-2基因组区、p344(-306/+38)(具有SEQ ID NO：8所示的碱基序列的DNA)、p251(-213/+38)(具有SEQ ID NO：9所示的碱基序列的DNA)和p124(-86/+38)(具有SEQ ID NO：10所示的碱基序列的DNA)分别位于Firefly萤光素酶基因的上游。利用具有SV40病毒启动子的质粒pGL2-Control(Promega制造)和不含启动子的质粒pGL2-Basic(Promega制造)将基因引入到人乳腺癌细胞OCUBM、MCF7、BT549、正常人成纤维细胞HEF、MRC-5、人恶性黑色素瘤细胞A875和人肺癌细胞QG-56，所有的细胞在DMEM(Sigma)(补充了10％的胎牛血清)中培养。首先，将10μg的各质粒与脂质转染试剂(LifeTechnologies)混合后室温放置30分钟以形成DNA和脂质体的复合物。然后将复合物与去除胎牛血清的细胞接触。8小时后加入补充了胎牛血清的培养基。培养48小时后，用Dual-luciferase Reporter AssaySystem(Promega制造)破坏引入基因的细胞，用同一试剂盒中的试剂确定其中Firefly萤光素酶活性。为标准化基因引入的效率，在每一基因引入组中包括1μg的pRL-TK质粒(Promega制造)，确定TK启动子的Renilla萤光素酶活性，据此来校正Firefly萤光素酶活性。获得的结果示于图7A-7C。
从这些结果可以看出，c-erbB-2启动子的特性如下：
(a)在人乳腺癌细胞中，p251启动子的转录活性比通常用于目前基因治疗方案的p533启动子的高，p251启动子的活性比SV40病毒启动子的强。另一方面，5’区进一步缺失的p124启动子的转录活性与p251启动子相比非常低(图7A)。这表明为具有正常的启动子功能，必须具有至少比p124启动子长的序列。
(b)在人成纤维细胞中，在某些情况，p533和p344启动子活性比SV40启动子强，但与p344和p533启动子相比，p251启动子的转录活性较低，比SV40启动子更低(图7B)。
(c)在人恶性黑色素瘤细胞和人肺癌细胞中，包括p517、p344、p251和p124的所有启动子都显示比SV40启动子低的转录活性。p251启动子的转录活性和p533启动子的大约相同(图7C)。因此，该数据表明：基于与正常细胞数据的比较，与p533启动子相比p251启动子在乳腺癌细胞中具有较高转录活性，p251启动子比常规的p533启动子更有用。
实施例9
c-erbB-2启动子的乳腺癌特异的细胞毒性作用
为检测p251启动子的细胞毒性作用，将自杀基因HSV-TK连接在该启动子区的下游(pro251-TK)，在细胞中表达该质粒，在基因引入的细胞培养物中加入前药GCV。根据Moolten，FL.Cancer Gene Ther.，1：279-287，1994描述的方法进行测量该体系的细胞毒性作用。首先，在NruI和HindIII位点去除pcDNA3(Invitrogen制造)的巨细胞病毒(CMV)启动子，在其中插入p251启动子，然后利用EcoRV位点插入用BglI和EcoRI从pMK(Brinster，BL等，Cell，27：223-231，1981)切除的HSV-TK基因(pro251-TK)。也使用了不含HSV-TK基因但整合有p251启动子的pcDNA3衍生的质粒(pro251)和具有HSV-TK基因并可使HSV-TK基因表达的pcDNA3衍生的质粒(CMV-TK)作为对照。用脂质转染试剂将每一质粒(pro251、pro251-TK、CMV-TK)引入乳腺癌细胞MCF7或非乳腺癌细胞A875。为使用pcDNA3中的Neo基因的表达作为药物抗性标记，将转化的细胞用400μg/ml的G418(Life Technologies制造)培养10天以建立表达各自基因的细胞。然后将细胞以500细胞/孔铺于96孔培养板上，在不同浓度的GCV(F.Hoffman-La Roche制造)下培养7天。用细胞计数试剂盒-8(Dojin Kagaku制造)检测细胞的存活率。将在0μg/ml的GCV浓度下的细胞存活定为100％，每个试验组的存活以百分比表示(图8A和图8B)。该结果表明：
(a)当HSV-TK基因在p251启动子的控制下表达时，MCF-7细胞显示比其亲代株和在CMV启动子控制下的用HSV-TK基因转染的细胞更大的对GCV的敏感性(图8A)。
(b)当使用CMV启动子时，转染的A875细胞与亲代株比较对GCV更敏感，但是当使用p251启动子时，转染的A875细胞的GCV敏感性与亲代株比较非常弱(图8B)。因此，当p251启动子用于乳腺癌细胞时，产生的细胞毒性作用大于使用CMV启动子所产生的细胞毒性作用，而p251启动子的作用在非乳腺癌细胞中非常低。
实施例10
c-erbB-2启动子的体内抗癌效果
以上述实施例类似的方式将1×106的用pro251或pro251-TK转染的基因引入的MCF7细胞接种BALB/c裸鼠以形成皮下肿瘤。当肿瘤体积达到150mm3，腹膜内注射30mg/kg的GCV或等量的生理盐水，持续5天。结果表明：
(a)在GCV给药组中，表达pro251-TK基因的全部7个肿瘤都消失了，并且该小鼠在其后没有复发，而作为对照的表达pro251的肿瘤没有退化，肿瘤的生长继续(图9)。
(b)表达pro251-TK基因并接受生理盐水的肿瘤生长率与用GCV给药处理的表达pro251的肿瘤的生长率相同。因此，该数据表明pro251启动子介导HSV-TK基因的转录活化并且具有经GCV给药使肿瘤完全消失的转录活性。
工业应用性
如上详述，本发明的肿瘤特异性启动子(其具有来自肾细胞因子基因5’上游区的609bp片段或c-erbB-2基因的启动子区的251bp片段)具有较高的肿瘤特异性和大的启动子活性。因此，利用本发明的肿瘤特异性启动子可实现非常安全和有效的基因治疗。
              序列表
                           序列表<110>Primmune Corporation and Chiba Prefecture<120>肿瘤特异性启动子<130>E6039-00<1 50>JP 2000-220504<151>2000-7-21<160>10<210>1<211>609<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1gcttccctgc ccacccgcgg aaaccgcccc aggtggccgc gccccctccc cagcagccag    60cagggcgcca gggctgagcc ggccgtggag gggagcgggt cccgggggtt atacaggcgc   120cgggcgtccg cggcaggcaa gagaagctga ggcctgagaa cggcccgggc cttggcgtac   180ggcaggggac gacctgggat gggggcagcg ggcggcggcg cagggagtgg gccggggccg   240gtgtgcgcgg gcgggacggg gccggggtcg ggagaccacc gctcggaaga tggggccggg   300agaggccgcc gtcgcagcgc agagggcacc ggcggggaga cgcgaggacg cggggccggg   360aacacggacg ccggagtaga agcgcggggg gggcgggctg gagcgggggc ggggacgccg   420gggtcggggg cggtgcgggt ttgaggggag ggggcggggc gggtccttcc ctgggggggt   480ggggagaggg ggcgggggcc catgtgaccg gctcagaccg gttctggaga caaaaggggc   540cgcggcggcc ggagcgggac gggcccggcg cgggagggag cgaagcagcg cgggcagcga   600gcgagtgag                                                              609<210>2<211>1041<212>DNA<213>人<400>2ggccgcgctc gtcggggccg ggcgggggcc gatccctccg gcttcccttc ccgcggagaa     60caacaatgaa agtgaaagag gggtggggcg ggggcgagcc cgggttctgt ggcccatttg    120ccctgtggcc ttgagcaagc ccctccccca ggcctcgggg gctctcccgg tttgggggaa    180ccgggcgagg caatgccaca ggcccagggt tagagggggt gggcacttgc agctgccgat    240gtggctggat ctggaacttc tcagacggct cctgtcagcg ccaagtttca ccaaatccag    300gcctgcgggc tcctccccca ggacccccac tcgcagtccc tcaagcctgt gctcccggaa    360aggcactggg cgaccgcacc cgtggctttc tctgggcgac cgggtcccag actcccccca    420gcacagcaga gcgcttccct gcccacccgc ggaaaccgcc ccaggtggcc gcgccccctc    480cccagcagcc agcagggcgc cagggctgag ccggccgtgg aggggagcgg gtcccggggg    540ttatacaggc gccgggcgtc cgcggcaggc aagagaagct gaggcctgag aacggcccgg    600gccttggcgt acggcagggg acgacctggg atgggggcag cgggcggcgg cgcagggagt    660gggccggggc cggtgtgcgc gggcgggacg gggccggggt cgggagacca ccgctcggaa    720gatggggccg ggagaggccg ccgtcgcagc gcagagggca ccggcgggga gacgcgagga    780cgcggggccg ggaacacgga cgccggagta gaagcgcggg gggggcgggc tggagcgggg    840gcggggacgc cggggtcggg ggcggtgcgg gtttgagggg agggggcggg gcgggtcctt    900ccctgggggg gtggggagag ggggcggggg cccatgtgac cggctcagac cggttctgga    960gacaaaaggg gccgcggcgg ccggagcggg acgggcccgg cgcgggaggg agcgaagcag   1020cgcgggcagc gagcgagtga g                                             1041<210>3<211>2335<212>DNA<213>人<400>3gatcagggga cgggatgggg tacacagcca gcccctgctc ccccagcggg gagacctgtt    60tgcaccaagc agcggccctg ggccagcgca ccatctgcca ctacatcgtg gaggccgggg   120cctcgctcat gaagacagac cagcaggtga gcagacggca ggcagggagc ccacgagggc   180accaaccaaa cctttcccaa ggtcctaggc gggagctggg gctgggggct gtccctggga   240agacacagtc cagaccctgg gaaacctgag ccagcagggg aggagctggt gggcagagag   300gcctccctcc ctgaccaggc cacagggagg tagagcccct gcctctcagc ctgctagggg   360ttaggcctgc ctctggcccc tgctgatcgc agctccgccc tcctccaggg cgacactccc   420cggcagcggg ctgagaaggc tcaggacacc gagctggccg cctacctgga gaaccggcag   480cactaccaga tgatccagcg ggaggaccag gagacggctg tgtagcgggc cgcccacggg   540cagcaggagg gacaatgcgg ccaggggacg agcgccttcc ttgcccacct cactgccaca   600ttccagtggg acggccacgg ggggacctag gccccaggga aagagcccca tgccgccccc   660taaggagccg cccagaccta gggctggact caggagctgg gggggcctca cctgttcccc   720tgaggacccc gccggacccg gaggctcaca gggaacaaga cacggctggg ttggatatgc   780ctttgccggg gttctggggc agggcgctcc ctggccgcag cagatgccct cccaggagtg   840ggaggggctg gagaggggga ggccttcggg aagaggcttc ctgggccccc tggtcttcgg   900ccgggtcccc agcccccgct cctgccccac cccacctcct ccgggcttcc tcccggaaac   960tcagcgcctg ctgcacttgc ctgccctgcc ttgcttggca cccgctccgg cgaccctccc  1020cgctcccctg tcatttcatc gcggactgtg cggcctgggg gtggggggcg ggactctcac  1080ggtgacatgt ttacagctgg gtgtgactca gtaaagtgga tttttttttc ttttctgctt  1140ttcttctttt gcgggggagg tctaacaacc agcgggggct gcggggttgt cctcggggtg  1200ggggactgga cgctgtcgac agcaccttcc tggggccccg gctcccgttt ggtggttggt  1260cccagggcct gcccggttcc tgacctctgc ccgcggccgc gctcgtcggg gccgggcggg  1320ggccgatccc tccggcttcc cttcccgcgg agaacaacaa tgaaagtgaa agaggggtgg  1380ggcgggggcg agcccgggtt ctgtggccca tttgccctgt ggccttgagc aagcccctcc  1440cccaggcctc gggggctctc ccggtttggg ggaaccgggc gaggcaatgc cacaggccca  1500gggttagagg gggtgggcac ttgcagctgc cgatgtggct ggatctggaa cttctcagac  1560ggctcctgtc agcgccaagt ttcaccaaat ccaggcctgc gggctcctcc cccaggaccc  1620ccactcgcag tccctcaagc ctgtgctccc ggaaaggcac tgggcgaccg cacccgtggc  1680tttctctggg cgaccgggtc ccagactccc cccagcacag cagagcgctt ccctgcccac  1740ccgcggaaac cgccccaggt ggccgcgccc cctccccagc agccagcagg gcgccagggc  1800tgagccggcc gtggagggga gcgggtcccg ggggttatac aggcgccggg cgtccgcggc  1860aggcaagaga agctgaggcc tgagaacggc ccgggccttg gcgtacggca ggggacgacc  1920tgggatgggg gcagcgggcg gcggcgcagg gagtgggccg gggccggtgt gcgcgggcgg  1980gacggggccg gggtcgggag accaccgctc ggaagatggg gccgggagag gccgccgtcg  2040cagcgcagag ggcaccggcg gggagacgcg aggacgcggg gccgggaaca cggacgccgg  2100agtagaagcg cggggggggc gggctggagc gggggcgggg acgccggggt cgggggcggt  2160gcgggtttga ggggaggggg cggggcgggt ccttccctgg gggggtgggg agagggggcg  2220ggggcccatg tgaccggctc agaccggttc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Claims (9)

1.肿瘤特异性启动子，其具有序列表中SEQ ID NO：1所示的碱基序列中从1-539位的任何碱基至609位碱基的碱基序列或者SEQ IDNO：9所示的碱基序列中从1-127位的任何碱基至251位碱基的碱基序列。
2.肿瘤特异性启动子，其可在严谨条件下与序列表中SEQ ID NO：1所示的碱基序列中从1-539位的任何碱基至609位碱基的碱基序列或者SEQ ID NO：9所示的碱基序列中从1-127位的任何碱基至251位碱基的碱基序列杂交、并具有与所述的碱基序列相似的启动子功能。
3.权利要求1或2的肿瘤特异性启动子，其中序列表中SEQ ID NO：1所示的碱基序列中从1-539位的任何碱基至609位碱基的碱基序列是位点1-609的碱基序列(SEQ ID NO：1所示的碱基序列)、位点416-609的碱基序列(SEQ ID NO：5所示的碱基序列)或位点275-609的碱基序列(SEQ ID NO：4所示的碱基序列)。
4.乳腺癌、卵巢癌、胃癌或食管癌特异的权利要求1或2的肿瘤特异性启动子，其中所述的启动子具有SEQ ID NO：9所示的碱基序列中从1-127位的任何碱基至251位碱基的碱基序列或者可在严谨条件下与它们杂交并具有与其相似的启动子活性。
5.权利要求1、2或4的肿瘤特异性启动子，其中SEQ ID NO：9所示的碱基序列中从1-127位的任何碱基至251位碱基的碱基序列是位点1-251的碱基序列(SEQ ID NO：9所示的碱基序列)。
6.权利要求1-5的任一项中的肿瘤特异性启动子，其通过肿瘤特异性基因表达用于癌症基因治疗。
7.权利要求1-5的任一项中的肿瘤特异性启动子，其用于自杀基因治疗，其联合使用其中编码药物代谢酶的基因连接在权利要求1-5的任一项中的肿瘤特异性启动子下游的载体和可被所述的药物代谢酶转化为活性形式的癌症治疗的前药。
8.权利要求7的肿瘤特异性启动子，其中药物代谢酶的基因与癌症治疗的前药的组和为单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因和丙氧鸟苷或无环鸟苷、胞嘧啶脱氨酶基因和5-氟胞嘧啶、水痘-带状疱疹病毒的胸苷激酶基因和6-甲氧基嘌呤阿糖苷、E.coli gpt基因和6-噻吨、细胞色素P450 2B1基因和环磷酰胺、人脱氧胞苷激酶基因和胞嘧啶阿糖苷、E.coli UPRT基因和5-氟脲嘧啶或E.coli deoD基因和6-甲基嘌呤-2’-脱氧核苷。
9.权利要求1-5的任一项中的肿瘤特异性启动子，其通过溶瘤病毒用于癌症基因治疗，其中利用权利要求1-5的任一项中的肿瘤特异性启动子改变病毒基因使病毒在肿瘤细胞或肿瘤组织中特异性增殖。
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Effective date of registration: 20031010

Applicant after: Shanghai Sanwei Biotech Co., Ltd.

Applicant before: Chiba Preime Corporation

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CX01 Expiry of patent term
CX01 Expiry of patent term

Granted publication date: 20060419