JPWO2003025190A1 - 腫瘍特異的プロモーターおよびその用途 - Google Patents
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Abstract
ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子のエクソン１Ｂの上流側の１８１６ｂｐまたは４４１ｂｐのプロモーター領域は、卵巣癌細胞において特異的に高いプロモーター活性を有し、このプロモーター領域をＥ１領域に挿入したアデノウイルスは、卵巣癌細胞に対して特異的に高い細胞増殖抑制効果を発揮し、卵巣癌の遺伝子治療に有効である。
Description
技術分野
本発明は、卵巣癌などの腫瘍細胞もしくは腫瘍組織において特異的な遺伝子の発現を可能にする腫瘍特異的プロモーターおよびその用途に関する。更に詳細には、本発明は、腫瘍細胞もしくは腫瘍組織、特に卵巣癌細胞もしくは卵巣癌組織において特異的に高いプロモーター活性を発揮し、腫瘍特異的な遺伝子発現による癌、特に卵巣癌の遺伝子治療を可能にする腫瘍特異的プロモーターおよび該腫瘍特異的プロモーターを用いてウイルスを腫瘍細胞あるいは腫瘍組織、特に卵巣癌細胞もしくは卵巣癌組織で特異的に増殖するようにウイルス遺伝子を改変した細胞障害性腫瘍特異的ウイルスに関する。更に本発明は、この細胞障害性腫瘍特異的ウイルスを用いた腫瘍の治療方法に関する。
背景技術
卵巣癌は、欧米において五大癌の一つとされ、日本においては年間約４０００人の人が卵巣癌によって死亡しており、４０年間でその死亡数が約３０倍に急速に増加し、肺癌、膵臓癌とともに最も増加している癌の一つである。卵巣癌は腹腔内に存在し、早期診断が困難であること、卵巣の被膜が容易に破綻し早期において腹腔内に転移しやすいことなどから、その６０％の人が死に至るとされ、膵臓癌とともに最も予後不良な癌の一つである。手術方法の開発、シスプラチン、タキソールなどの抗癌剤の開発により治療成績の改善が認められるものの、それ以降の治療法の改善において有効なものがなく、新たな治療法の開発が望まれている。
最近、癌抑制遺伝子、サイトカイン遺伝子などを癌細胞に導入して癌を治療する遺伝子治療が各種の癌において試みられ、臨床的有効性が確認されるに至っている。卵巣癌においてもアデノウイルスベクターを用いた癌抑制遺伝子ｐ５３による遺伝子治療が、シスプラチンおよびタキソールによる治療に反応しなかった再発性卵巣癌において２０％以上の臨床的有効性（５０％以上の腫瘍の縮小）を示すことが明らかになった（Ｊ．Ｋ．Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９，Ｍａｙ ２００１，３８２）。また、アデノウイルスの腫瘍細胞に対する細胞溶解（ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ）の効果を期待したオンコリティック（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ）アデノウイルスが開発され各種癌において有効性が確認されるに至っている（Ｃａｒｌａ Ｈｅｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，Ａｐｒｉｌ ２０００，Ｖｏｌ．１０５，Ｎｏ．７，８４７−８５１；Ｊａｍｅｓ Ｒ．Ｂｉｓｃｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２７４，１８ Ｏｃｔｏｂｅｒ １９９６，３７３−３７６；Ｊ．Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒａｎｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．２，２００１，２８９−２９８）。また、ヘルペスウイルスを利用したオンコリティックヘルペスウイルスの細胞溶解効果も報告されている（Ｍｉｙａｔａｋｅ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９９，Ｖｏｌ．６，５６４−５７２）。しかしながら、このような遺伝子治療に用いられるウイルスベクターにおいては、従来よりＣＭＶ、ＲＳＶ等のウイルスプロモーターが使用され、組織特異性がないため肝臓への毒性等により、投与量が制限されていたため効果の改善が期待できない面を有していた。
臓器特異的プロモーターを用いたベクターによる遺伝子治療の開発も行われている。即ち、例えばオステオカルシンプロモーターを用いたベクターによる前立腺癌の骨転移の遺伝子治療（Ｓｈｉｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９８ Ｓｅｐ−Ｏｃｔ．，５（５），２７４−２８０，１９９８）、アルブミンプロモーターを用いたベクターによる血友病の遺伝子治療（Ａｌｅｍａｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９７ Ｎｏｖ；６８（２）：１４７−１５９）、ＰＳＡプロモーターを用いたベクターによる前立腺癌の遺伝子治療（Ｇｏｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１９９８ Ｊｕｌ．１６０（１）：２２０−２２９）による臨床試験が既に始まろうとしている。しかしながら、卵巣癌特異的遺伝子プロモーターを用いた遺伝子治療に関する報告はなされていない。
他方、転移性卵巣癌の胸水中の卵巣癌に特異的な蛋白分画を多く含む高分子量領域の蛋白を抗原として、ウサギに免疫して作成した抗体を用いて、卵巣癌細胞株ＯＶＣＡ４３２のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによりプラーク精製されクローニングされた遺伝子としてＩＡＩ．３Ｂ遺伝子が報告されている（Ｃａｍｂｅｌｌ Ｉ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９４，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．４，５８９−５９４）。ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子のオープン・リーディング・フレームは２９９０ｂｐでそれによってコードされる蛋白のアミノ酸配列は９６６個よりなりその分子量１０８ｋｄであり、また、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子によってコードされる蛋白はトランスフォーメーションポテンシャルを有するＢ−ボックス蛋白であり、そのゲノム遺伝子は、染色体１７ｑ２１．１に位置する卵巣癌および乳癌の癌抑制遺伝子であるＢＲＣＡ１遺伝子の近傍のテロメアに位置することも報告されている（Ｃａｍｂｅｌｌ Ｉ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９４，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．４，５８９−５９４）。また、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子とＢＲＣＡ１遺伝子とは、プロモーターとエンハンサー領域とを共有していることも示唆され（Ｍｅｌｉｓｓａ Ａ．Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３７２，２２／２９ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９４，７３３）、それぞれの遺伝子発現調節機構が卵巣癌の発癌および増殖に重要な役割を果たしている可能性も示唆されている（Ｍｅｌｉｓｓａ Ａ．Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９６，１２，２５０７−２５１３）。ＢＲＣＡ１遺伝子のプロモーター領域の活性については既に明らかにされているが（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９６ Ｎｏｖ．；６（１１）：１０２９−１０４９）、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子のプロモーター活性に関する報告はなされていない。
発明の開示
卵巣癌細胞もしくは卵巣癌組織において特異的にそのプロモーター機能を発揮する腫瘍特異的プロモーターを用いて各種ウイルスベクターを構築し、このウイルスベクターによる遺伝子治療を行えば、特に卵巣癌においてのみ目的遺伝子を発現させることが可能となり、従来の遺伝子治療で課題とされていた副作用の軽減および臨床効果の改善が達成できる。
従って、本発明の目的は、卵巣癌などの腫瘍細胞もしくは腫瘍組織、特に卵巣癌細胞もしくは卵巣癌組織において特異的に高いプロモーター活性を発揮し、腫瘍特異的な遺伝子発現による癌、特に卵巣癌の遺伝子治療を可能にする腫瘍特異的プロモーターを提供することにある。
更に本発明の他の目的は、該腫瘍特異的プロモーターを用いてウイルスを腫瘍細胞あるいは腫瘍組織、特に卵巣癌細胞もしくは卵巣癌組織で特異的に増殖するようにウイルス遺伝子を改変した細胞障害性腫瘍特異的ウイルスを提供することにある。
更に本発明の他の目的は、該細胞障害性腫瘍特異的ウイルスを用いた腫瘍の治療方法を提供することにある。
本発明者は、卵巣癌において遺伝子の活性が更新していることが期待されるＩＡＩ．３Ｂ遺伝子のプロモーター領域のクローニングを試み、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子のエクソン１Ｂの上流域の特に１８１６ｂｐまたは４４１ｂｐからなる遺伝子であって配列表の配列番号１に示す１１２６〜２９４１番目の塩基配列または２５０１〜２９４１番目の塩基配列を有する遺伝子が特に卵巣癌において特異的に高いプロモーター活性を発揮し得ること、そして細胞障害性腫瘍特異的ウイルスを構築するためのプロモーターとして有用であることを見出し、本発明を完成させた。
即ち、本発明は、配列表の配列番号１に示す１１２６〜２９４１番目または２５０１〜２９４１番目の塩基配列を有する腫瘍特異的プロモーターに関する。
更に本発明は、配列表の配列番号１に示す１１２６〜２９４１番目または２５０１〜２９４１番目の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、それらの塩基配列と同様のプロモーター機能を有する腫瘍特異的プロモーターに関する。このような腫瘍特異的プロモーターは、好ましくは配列表の配列番号１に示す２６２６〜２９４１番目、２３７６〜２９４１番目、１２５１〜２９４１番目または１００１〜２９４１番目の塩基配列を有するものである。好ましくは、本発明の上記腫瘍特異的プロモーターは卵巣癌に特異的なプロモーターである。
更に本発明は、上記腫瘍特異的プロモーターを用いてウイルスを腫瘍細胞あるいは腫瘍組織で特異的に増殖するようにウイルス遺伝子を改変した細胞障害性腫瘍特異的ウイルスに関する。好ましくは、本発明の上記細胞障害性腫瘍特異的ウイルスは卵巣癌に特異的なものである。更に好ましくは、本発明の上記細胞障害性腫瘍特異的ウイルスはアデノウイルスである。
更に本発明は、上記細胞障害性腫瘍特異的ウイルスをヒトに投与することからなる腫瘍の治療方法に関する。好ましくは、上記細胞障害性腫瘍特異的ウイルスとともに抗癌化学療法剤を投与する治療方法である。
発明を実施するための最良の形態
本発明の腫瘍特異的プロモーターは、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子におけるプロモーター領域についての詳細な研究により初めて得られたものである。前記した通り、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子は、転移性卵巣卵の胸水中に存在する高分子量領域の蛋白に対して作成した抗体を用いた卵巣癌細胞株ＯＶＣＡ４３２のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによりクローニングされた遺伝子である。図１に示すように、ＩＡＩ．３Ｂゲノム遺伝子は、染色体１７ｑ２１．１に存在する卵巣癌および乳癌の癌抑制遺伝子であるＢＲＣＡ１遺伝子の近傍のテロメアにアンチセンスに位置し、両者のゲノム遺伝子の間には、それぞれの遺伝子の偽遺伝子（ｐｓｅｕｄｏ ｇｅｎｅ）がアンチセンスに配列してプロモーターとして存在している。即ち、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子のプロモーターは、ＢＣＲＡ１遺伝子の偽遺伝子のエクソン２、エクソン１Ｂ、エクソン１Ａがアンチセンスに配列したものである。
本発明の腫瘍特異的プロモーターは、配列表の配列番号１に示す塩基配列において１１２６〜２９４１番目または２５０１〜２９４１番目の塩基配列からなるものである。配列番号１の２９４１番目の塩基は、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子のエクソン１Ｂの５’末端から１ｂｐ上流に位置する塩基に相当する。従って、配列番号１に示す塩基配列において１１２６〜２９４１番目または２５０１〜２９４１番目の塩基配列からなる本発明の腫瘍特異的プロモーターは、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子のエクソン１Ｂの上流側に位置するそれぞれ１８１６ｂｐまたは４４１ｂｐの塩基配列に相当する。
本発明の腫瘍特異的プロモーターは、上記した配列表の配列番号１に示す１１２６〜２９４１番目または２５０１〜２９４１番目の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、それらの塩基配列と同様のプロモーター機能を有する塩基配列からなるプロモーターであってもよい。ここでいうストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列とは、例えば、６×ＳＳＰＥ、２×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌサケ精巣ＤＮＡを含む溶液中で６５℃、１２時間反応させる、という条件下でサザンハイブリダイゼーションを行うことにより、上記したいずれかの塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズする塩基配列である。本発明の腫瘍特異的プロモーターは、このような条件でハイブリダイズする塩基配列であって、ハイブリダイズした対象の塩基配列と同様のプロモーター機能、即ち、同程度の腫瘍特異性と同程度のプロモーター活性を有するものである。このような塩基配列としては、ハイブリダイズの対象となる塩基配列と、例えば６０％以上、好ましくは６５％以上の相同性を有するものが挙げられる。このような本発明の腫瘍特異的プロモーターとしては、配列表の配列番号１に示す１１２６〜２９４１番目の塩基配列からなる腫瘍特異的プロモーターとハイブリダイズするものとしては、例えば配列番号１の１２５１〜２９４１番目（１６９１ｂｐ）または１００１〜２９４１番目（１９４１ｂｐ）の塩基配列からなる腫瘍特異的プロモーターが挙げられる。配列表の配列番号１に示す２５０１〜２９４１番目の塩基配列からなる腫瘍特異的プロモーターとハイブリダイズするものとしては、例えば配列番号１の２６２６〜２９４１番目（３１６ｂｐ）または２３７６〜２９４１番目（５６６ｂｐ）の塩基配列からなる腫瘍特異的プロモーターが挙げられる。
上記した本発明の腫瘍特異的プロモーターは、既に報告されているＩＡＩ．３Ｂゲノム遺伝子の配列情報（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ Ｈｕｍａｎ １Ａ．３Ｂ ｇｅｎｅ，ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ．ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｕ７２４８３）に基づきＰＣＲ法を利用する周知の方法により得ることができる。これらの方法は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に従い、当業者ならば容易に行うことができる。また、上記したストリジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有する本発明の腫瘍特異的なプロモーターは、上記した方法、あるいは例えば部位特異的突然変異誘発法、通常のハイブリダイゼーション法などにより容易に得ることができ、具体的には前記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ等の基本書を参考にして行うことができる。
上記した本発明の腫瘍特異的プロモーターは、高いプロモーター活性を有し、卵巣癌などの腫瘍細胞もしくは腫瘍組織、特に卵巣癌細胞もしくは卵巣癌組織において特異的に高いプロモーター活性を有する。後述する実施例に明らかにされている通り、例えば配列番号１の１１２６〜２９４１番目の塩基配列（１８１６ｂｐ）からなる本発明の腫瘍特異的プロモーターは、卵巣癌細胞株ＨＥＹにおいてＳＶ４０プロモーターに比べ約３０倍のプロモーター活性を示し、同様に配列番号１の２５０１〜２９４１番目の塩基配列（４４１ｂｐ）からなる本発明の腫瘍特異的プロモーターは、１５倍のプロモーター活性を示す。また、本発明の配列番号１の１１２６〜２９４１番目の塩基配列（１８１６ｂｐ）からなる腫瘍特異的プロモーターは、卵巣癌細胞株ＰＡ−１においてＳＶ４０プロモーターの約２０００倍、他の卵巣癌細胞株ＨＲＡにおいてＳＶ４０プロモーターの約７０倍のプロモーター活性を発揮し、他方、正常卵巣細胞のＮＯＥ１、ＮＯＥ２、ＮＯＥ３においてはＳＶ４０プロモーターの約２５％、正常ヒトケラチノサイト細胞株Ｋ４２においてもＳＶ４０プロモーターの約２０％のプロモーター活性しか示さず、従って、特に卵巣癌において特異的に高いプローモーター活性を発揮する。本発明の配列番号１の２５０１〜２９４１番目の塩基配列（４４１ｂｐ）からなる腫瘍特異的プロモーターも同様に卵巣癌において特異的に高いプロモーター活性を発揮する。
本発明の腫瘍特異的プロモーターは、腫瘍特異的な遺伝子発現による癌の遺伝子治療、例えば、ウイルスを腫瘍細胞あるいは腫瘍組織で特異的に増殖するようにウイルス遺伝子を改変した細胞障害性腫瘍特異的ウイルスを構築するためのプロモーターとして利用できる。
このような細胞障害性腫瘍特異的ウイルスは、いわゆるオンコリティックウイルス（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｕｓ）と呼ばれるものである。このようなウイルスは、例えばアデノウイルスの増殖に必須の遺伝子である初期遺伝子Ｅ１ＡまたはＥ１Ｂの上流に本発明の腫瘍特異的プロモーターを挿入するかあるいは初期遺伝子Ｅ１ＡまたはＥ１Ｂプロモーターと置換することにより、あるいはヘルペスウイルスの対応する初期遺伝子の上流に本発明の腫瘍特異的プロモーターを挿入するかあるいは初期遺伝子プロモーターと置換することにより構築することができる。また、レトロウイルス、レオウイルスなどのその他のウイルスについても、本発明の腫瘍特異的プロモーターの挿入または置換により細胞障害性腫瘍特異的ウイルスを構築することができる。このようにして構築された細胞障害性腫瘍特異的ウイルスは、腫瘍細胞あるいは腫瘍組織で特異的に増殖し腫瘍細胞を殺傷する作用を発揮することができる。従って、このウイルスを投与することにより特に卵巣癌を有効にかつ副作用を軽減して治療することができる。このような細胞障害性腫瘍特異的ウイルスの構築方法、利用方法等については、Ｃａｒｌａ Ｈｅｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，Ａｐｒｉｌ ２０００，Ｖｏｌ．１０５，Ｎｏ．７，８４７−８５１；Ｊａｍｅｓ Ｒ．Ｂｉｓｃｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２７４，１８ Ｏｃｔｏｂｅｒ １９９６，３７３−３７６；Ｊ．Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒａｎｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．２，２００１，２８９−２９８などの文献が参照される。
本発明の細胞障害性腫瘍特異的ウイルスをヒトへ投与する方法としては、該ウイルスを直接体内に導入するｉｎ ｖｉｖｏ法やヒトからある種の細胞や組織を取り出して体外で該ウイルスを該細胞や組織に導入しその細胞や組織を体内に戻すｅｘ ｖｉｖｏ法などがある。ｉｎ ｖｉｖｏ法としては、例えば本発明の細胞障害性腫瘍特異的ウイルスを適当な溶剤（ＰＢＳ等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水等）に溶解した後、必要に応じてフィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填して注射剤を調製して、ヒトへ注射することにより投与される。注射剤には必要に応じて慣用の担体等を加えてもよい。本発明の細胞障害性腫瘍特異的ウイルスは、静脈、筋肉、腹腔、皮膚等に投与することができ、また腫瘍組織内へ直接投与することもできる。ｅｘ ｖｉｖｏ法としては、上記したと同様の注射剤などで本発明の細胞障害性腫瘍特異的ウイルスを組織に直接注入してそれを体内に戻す方法などが挙げられる（日本遺伝子治療学会編、遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス、１９９９）。
本発明の細胞障害性腫瘍特異的ウイルスの投与量は、投与する対象、投与方法、投与形態等によって異なるが、通常成人１人当たり１×１０９〜１×１０１４ウイルス粒子数の範囲、好ましくは１×１０１０〜１×１０１３ウイルス粒子数の範囲である。
本発明の細胞障害性腫瘍特異的ウイルスは、通常臨床的に使用されている抗癌化学療法剤と併用することもできる。併用することにより抗腫瘍活性において相乗効果を発揮することができ、従って両者の投与量を低用量として副作用を軽減しかつ抗腫瘍効果を高めることができる。抗癌化学療法剤としては、シスプラチン、シクロホスファミドなどのアルキル化剤；メトトレキセート、メルカプトプリン、シトシンアラビノシドなどの代謝拮抗剤；アクチノマイシン、アドリアマイシンなどの抗癌抗生物質；エトポシド、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチンなどの植物アルカロイド；ピシバニール、クレスチンなどの免疫系薬剤；イリノテカン、トポテカンなどのＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤等が挙げられる。これらのなかでも、シスプラチン、シクロホスファミド、アドリアマイシン、エトポシド、タキソールなどが好ましい。
更に本発明の腫瘍特異的プロモーターは、薬剤代謝酵素遺伝子と癌治療用プロドラッグとを組み合わせた自殺遺伝子治療、サイトカイン遺伝子などを癌細胞に導入して免疫機能を高めて癌を治療する免疫遺伝子治療などに利用することもできる。
自殺遺伝子治療としては、薬剤代謝酵素遺伝子と癌治療用プロドラッグとの組み合わせが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子とガンシクロビルもしくはアシクロビル、シトシンデアミナーゼ遺伝子と５−フルオロシトシン、水痘帯状疱疹ウイルスシミジンキナーゼ遺伝子と６−メトキシプリアラビノシド、Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｐｔ遺伝子と６−チオキサンチン、チトクロームＰ４５０ ２Ｂ１遺伝子とサイクロフォスファミド、ヒトデオキシシチジンキナーゼ遺伝子とサイトシンアラビノシド、Ｅ．ｃｏｌｉ ＵＰＲＴ遺伝子と５−フルオロウラシル、またはＥ．ｃｏｌｉ ｄｅｏＤ遺伝子と６−メチルプリン−２’−デオキシリボヌクレオシドの組み合わせなどの例が挙げられる。自殺遺伝子治療を実際に行うには、本発明の腫瘍特異的プロモーター及びその下流に薬剤代謝酵素遺伝子を発現可能なように組み込んだ発現ベクターを構築して、その発現ベクターを癌細胞に導入し、次いで癌治療用プロドラッグを投与することによって実施できる。ベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどの遺伝子導入に通常用いられるベクターが挙げられる。あるいは、本発明の腫瘍特異的プロモーター及びその下流に薬剤代謝酵素遺伝子を発現可能なように組み込んだプラスミドＤＮＡを、リポソームに封入して、あるいはポリリジン−ＤＮＡ−タンパク質複合体として、癌細胞に導入することもできる。また、ネイキッドプラスミド（ｎａｋｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ）の形態で癌細胞に導入することもできる。遺伝子を導入するには、これらのベクター、リポソーム封入体等を静脈あるいは動脈内にあるいは直接腫瘍内部や腫瘍周囲に注入することによって行われる。この際、エレクトロポレーション法や超音波を併用することにより遺伝子導入効率を高めることも可能である。遺伝子導入後、癌治療用プロドラッグは、経口、静脈、動脈内投与等の通常の方法により投与される。
導入された遺伝子は、本発明の腫瘍特異的プロモーターの作用によって癌細胞内で特異的に薬剤代謝酵素が発現され、発現された薬剤代謝酵素により、癌細胞内において癌治療用プロドラッグは活性型の癌治療剤へ変換され、この変換された癌治療剤により癌細胞が選択的に死滅して自殺遺伝子治療が完了する。
このような自殺遺伝子治療の手法自体は既に公知であり、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子とガンシクロビルとの組み合わせは、脳腫瘍等で臨床応用されており（Ｏｌｄｆｉｅｌｄ，Ｅ Ｈ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４，３９−６９，１９９３）、またシトシンデアミナーゼ遺伝子と５−フルオロシトシンとの組み合わせも、大腸癌などに臨床応用の可能性が示唆されており（Ｈｕｂｅｒ，Ｂ Ｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５３，４６１９−４６２６，１９９３）、これらの例が、本発明の遺伝子治療を実施する際に参照される。
本発明の腫瘍特異的プロモーターを利用した免疫遺伝子治療としては、インターフェロン、ＴＮＦα、インターロイキンなどのサイトカインをコードする遺伝子を、上記の自殺遺伝子治療と同様の方法で、本発明の腫瘍特異的プロモーターと共に発現ベクターに組み込み、あるいはリポソームに封入して、あるいはネイキッドプラスミド（ｎａｋｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ）の形態で癌細胞に導入することができる。癌細胞に導入してサイトカインを発現させて、それによりヒトが本来有する生体防御機構である免疫応答を高めて癌を治療する方法が採用される。
また、本発明の腫瘍特異的プロモーターを利用して、癌遺伝子のアンチセンス遺伝子や正常型の癌抑制遺伝子を、腫瘍において特異的に発現させ、その結果、腫瘍の脱癌化（正常復帰）や細胞死（アポトーシス）、更には腫瘍細胞の抗癌剤感受性、放射線感受性の亢進を惹起することもできる。また、本発明の腫瘍特異的プロモーターは、Ｅ１欠失部位に前記したサイトカインなどをコードする遺伝子とともに挿入してＥ１欠失、Ｅ１／Ｅ３欠失アデノウイルスベクターを構築して、通常行なわれている遺伝子治療に用いることもできる。
本発明の腫瘍特異的プロモーターを利用した遺伝子治療は、特に卵巣癌の治療に有効である。
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例の範囲に何ら限定されるものではない。
実施例１
ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子における腫瘍特異的プロモーターのクローニング
（１）実験方法
ＩＡＩ．３Ｂのエクソン１およびその上流域１６０ｂｐに基いてＰＣＲ法によりＤＮＡテンプレートを作成し、これを基にしてＣｌｏｎｔｅｃｈのＥＭＢＬ３ ＳＰ６／Ｔ７ファージ・ライブラリーよりシングルクローン（ｐＣＡ１）を分離し、ＰＣＲによりＩＡＩ．３Ｂのエクソン１およびその上流部分１ｋｂが含有されている事を確認した。実験には、卵巣癌細胞株ＰＡ−１、ＨＲＡ、ＨＥＹ、正常ヒト卵巣細胞ＮＯＥ１、ＮＯＥ２、ＮＯＥ３、子宮頚癌細胞株ＳＫＧＩＩＩＡ、正常ヒトケラチノサイト細胞株Ｋ４２を用いた。具体的には以下のようにして実験を行った。
１．ＳＭＡＲＴ ＰＣＲ ｃＤＮＡ合成キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により転写開始点（Ｃａｐ ｓｉｔｅ）を決定した。
２．アンチセンスプライマーをエクソン１Ｂに設定し、センスプライマーを５０〜５００ｂｐ毎に設定することにより、エクソン１Ｂの上流側のＰＣＲ生成物を作成し、これらをルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）ベクター（ＰｉｃａＧｅｎｅ ｖｅｃｔｏｒ、東洋インキ）のＭｌｕ ＩおよびＢｇｌ ＩＩの制限酵素部位に組み込んだ。さらに、二重ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＰＣＲ生成物である欠失変異体（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ）のルシフェラーゼスアッセイをおこない、プロモーター活性の特定を行った。各欠失変異体と、それを組み込んで得られたルシフェラーゼベクターとの関係を図２に示した。図２において、例えばルシフェラーゼベクターｐＧＶ−２９４１は、配列番号１の１〜２９４１番目の２９４１ｂｐの塩基配列からなる欠失変異体が組み込まれたものである。同様に例えばｐＧＶ−１９４１、ｐＧＶ−１８１６、ｐＧＶ−１６９１、ｐＧＶ−５６６、ｐＧＶ−４４１およびｐＧＶ−３１６は、配列番号１のそれぞれ１００１〜２９４１番目の１９４１ｂｐの塩基配列、１１２６〜２９４１番目の１８１６ｂｐの塩基配列、１２５１〜２９４１番目の１６９１ｂｐの塩基配列、２３７６〜２９４１番目の５６６ｂｐの塩基配列、２５０１〜２９４１番目の４４１ｂｐの塩基配列および２６２６〜２９４１番目の３１６ｂｐの塩基配列からなる欠失変異体が組み込まれたものである。
３．ＰＣＲにより得られ、各ルシフェラーゼベクターに挿入した各欠失変異体については、突然変異のないことを確認するため、配列分析を自動ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ３１０；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により行った。
４．上記の実験によって決定された各プロモーター領域を含むルシフェラーゼベクターにより、卵巣癌に対する臓器特異的遺伝子発現について、従来のプロモーター（ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター）と比較した。
（２）結果
転写開始点は、エクソン１Ｂであることが明かとなりさらに従来から報告されていた（Ｂｒｏｗｎ，ＭＡ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１２：２５０７−２５１３，１９９６）エクソン１Ｂはさらに上流３ｂｐから開始することが明かとなった。また、従来より報告されていた（Ｂｒｏｗｎ，ＭＡ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１２：２５０７−２５１３，１９９６）エクソン１Ａは転写されていないことも明かとなった。
エクソン１Ｂの５’上流域の１９１ｂｐから２９４１ｂｐまで各欠失変異体を組み込んで作成したルシフェラーゼベクター（図２）について、二重ルシフェラーゼアッセイによりプロモーター活性を測定した結果、図３に示すように、最も高いプロモーター活性は１８１６ｂｐ上流域にあることが明かとなった。下流域の欠失変異体のプロモーター活性は徐々に減少しはじめ、ｐＧＶ−９４１で最も低下し、１６９１ｂｐから９４１ｂｐの間にポジティブエレメントのあることが明かとなった。さらに、下流域の欠失変異体のプロモーター活性を比較すると、各活性は上昇しはじめ、ｐＧＶ−４４１で最も高い価を示した。このため、８１６ｂｐから４４１ｂｐまでにネガティブエレメントのあることが明かとなった。さらに、下流域の欠失変異体を検討すると、プロモーターは低下しはじめ、３１６ｂｐより下流域にポジティブエレメントのあることが明かとなった。
さらに、図３に示すように、卵巣癌細胞株ＨＥＹにおいてｐＧＶ−１８１６のプロモーター活性はＳＶ４０プロモーターであるｐＧＶ−コントロールに比べ約３０倍の活性を示し、ＣＭＶプロモーターであるｐＧＶ−ＣＭＶに比べ約８０％程度の非常に高い活性を示すことが明かとなった。
また、図４に示すように、他の卵巣癌細胞株ＰＡ−１においては、最も高い活性がｐＧＶ−１８１６にありその値はＳＶ４０プロモーターの約２０００倍で、ＣＭＶプロモーターの約２倍であった。さらに、他の卵巣癌細胞株ＨＲＡにおいては、最も高い活性がｐＧＶ−１８１６にありその値はＳＶ４０プロモーターの約７０倍で、ＣＭＶプロモーターの約２倍であった。子宮頚癌細胞株ＳＫＧＩＩＩＡにおいては、ｐＧＶ−１８１６のプロモーター活性は、ＳＶ４０プロモーターの５倍でＣＭＶプロモーターの１３％であった。他の子宮頚癌細胞株ＨＴ３においてもｐＧＶ−１８１６のプロモーター活性は、ＳＶ４０プモーターの３倍でＣＭＶプロモーターの５％であった。一方、正常卵巣細胞のＮＯＥ１、ＮＯＥ２、ＭＯＥ３においてはｐＧＶ−１８１６のプロモーター活性は、ＳＶ４０プロモーターの約２５％であり、ＣＭＶプロモーターの０．２５％であった。さらに正常ヒトケラチノサイト細胞株Ｋ４２においてもｐＧＶ−１８１６のプロモーター活性は、ＳＶ４０プロモーターの約２０％であり、ＣＭＶプロモーターの０．７％であった。
以上により、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子プロモーターは卵巣癌に特異性が高くＣＭＶプロモーターの８０％から２倍であった。さらに、子宮頚癌細胞株においても高い活性は認められ、ＳＶ４０プロモーターの約２倍から３倍程度であった。一方、正常卵巣細胞およびケラチノサイト細胞においては、活性は低くＳＶ４０プロモーターの約２０％から３０％程度であった。
実施例２
ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子プロモーターの転写活性
実施例１の（１）の２．に記載した方法とほぼ同様にして、二重ルシフェラーゼ法により、樹立化卵巣癌細胞株（ＯＣ）、初代培養卵巣癌細胞株（ｐＯＣ）におけるＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６の転写活性を測定した。対照として子宮頚癌（ＣＣ）と正常ヒト卵巣細胞株（ＮＯＥ）を用いた。具体的には、実施例１の（１）の２．で構築された配列番号１の１１２６〜２９４１番目の１８１６ｂｐの塩基配列からなるプロモーターＩＡＩ．３Ｂ−１８１６を含むルシフェラーゼベクターｐＧＶ−１８１６とコントロールとしてＲＬ−ＴＫベクターを１０：１の比率で混合し、ＤＯＴＡＰリポソーム試薬に結合した後各細胞を播いた細胞培養用の１２ウエルプレートの各ウェルに、胎児牛血清を添加しない培養液とともに追加し、２日間培養して、ルミカウンターによりホタルルシフェラーゼ、つぎにウミシイタケルシフェラーゼの測定を行った。転写活性はＳＶ４０のプロモーター活性を１とした時の値で示した。得られた結果は図５、６および７に示した。図５および６は、樹立化卵巣癌細胞株（ＯＣ）におけるＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６の転写活性を子宮頚癌（ＣＣ）と正常ヒト卵巣細胞株（ＮＯＥ）における転写活性と比較したものであり、図７は、初代培養卵巣癌細胞株（ｐＯＣ）におけるＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６の転写活性を子宮頚癌（ＣＣ）と正常ヒト卵巣細胞株（ＮＯＥ）における転写活性を比較したものである。図５、６および７から分かるように、Ａｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６の樹立化卵巣癌細胞株（ＯＣ）および初代培養卵巣癌細胞株（ｐＯＣ）における転写活性は、子宮頚癌（ＣＣ）と正常ヒト卵巣細胞株（ＮＯＥ）におけるそれに比べて顕著に高いことが分かる。
実施例３
細胞障害性腫瘍特異的アデノウイルスの構築および効果
（１）細胞障害性腫瘍特異的アデノウイルスの構築
ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子プロモーターによるオンコリティックアデノウイルスを作成するため、図８に示すようにシャトルベクターｐＸＣ１（Ｇｒａｈａｍ，ＦＬ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．３：２９１７−２９２２，１９８４）の５５２ｂｐの位置にＴを挿入し、この部位にＡｇｅＩ部位を導入し、クレノーフラグメントにより平滑末端にし、この部位にさらにクレノーフラグメントにより平滑末端にしたＩＡＩ．３Ｂ−１８１６（配列番号１の１１２６〜２９４１番目の１８１６ｂｐの塩基配列）を挿入した。このシャトルベクターを２９３細胞においてｐＢＨＧＥ３（Ｇｒａｈａｍ，ＦＬ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．３：２９１７−２９２２，１９８４）と相同組換えし、配列番号１の１１２６〜２９４１番目の１８１６ｂｐの塩基配列がアデノウイルスのＥ１Ａプロモーター領域に挿入されたオンコリティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６を作成した。
（２）細胞障害性腫瘍特異的アデノウイルスの効果
ａ）各種細胞株に対する増殖抑制効果
オンコリティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６の卵巣癌細胞株ＰＡ−１、子宮頚癌細胞株ＳＫＧＩＩＩＡ、正常ヒト卵巣細胞株ＮＯＥ１および正常ヒトケラチノサイト細胞株に対する増殖抑性効果を検討した。培養条件は、卵巣癌細胞株、子宮頚癌細胞株は、ＲＰＭＩに１０％ＦＣＳを加えたものを３７℃、５％ＣＯ２にて行った。正常ヒト卵巣細胞および正常ヒトケラチノサイト細胞株に関しては、ＭＣＤＢ液（ニッスイ）に５％ＦＣＳを加えて培養を行った。
得られたＩＣ５０値を図９に示した。卵巣癌細胞株ＰＡ−１においてＩＣ５０は０．０１ＭＯＩであり、これは正常ヒト卵巣細胞株ＮＯＥ１の２００００倍であり、子宮頚癌細胞株ＳＫＧＩＩＩＡの１００００倍であった。
以上により、配列番号１の１１２６〜２９４１番目の１８１６ｂｐの塩基配列からなるプロモーターを導入したオンコリィティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６は卵巣癌に特異的に抗腫瘍効果を有することが明かとなった。
ｂ）ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性
オンコリティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を調べた。即ち、６週令のヌードマウス１０匹の背部に１ｘ１０７個の卵巣癌細胞株ＰＡ−１を皮下に接種し、腫瘍の大きさを観察し、腫瘍の直径が約５ｍｍに到達した時点で２群に分けた。１群のみにオンコリティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６の１ｘ１０１０個のウイルス粒子を、３回（１、３および５日）腫瘍内部に注入した。その後腫瘍塊の大きさをノギスで測定してその体積を求めた。得られた結果を図１０に示した。図１０のグラフから明らかなように、オンコリティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６を腫瘍内に投与した群（Ａｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６投与群）では腫瘍は投与直後から退縮し始め、投与２０日目以降完全に消失した。これに対して、Ａｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６の非投与群（コントロール群）では、ＰＡ−１接種後に日数の経過とともに腫瘍の体積が増加した。
また、図１１にオンコリティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６投与群のヌードマウスの５０日後の写真（左）およびコントロール群のヌードマスウスの５０日後の写真（右）を示した。コントロール群の腫瘍の大きさに対し、Ａｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６投与群のヌードマウスの投与部位では（左側のヌードマウスの右背部）癌は完全に消失した。
ｃ）各種細胞株に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ抗腫瘍活性
上記ａ）と同様にして、オンコリティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６の卵巣癌細胞株、子宮頚癌細胞株、正常ヒト卵巣細胞株および正常ヒトケラチノサイト細胞株に対する増殖抑制効果を検討した。卵巣癌細胞株、子宮頚癌細胞株はＲＰＭＩに１０％ＦＣＳを加えたものを３７℃、５％ＣＯ２にて行った。正常ヒト卵巣細胞株、正常ヒトケラチノサイト細胞株に関しては、ＭＣＤＢ液（ニッスイ）に５％ＦＣＳを加えて培養した。培養は３０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（ｎ＝３）で開始し各ＭＯＩで感染後ＩＣ５０値を測定した。得られた結果を表１に示した。表１の結果から明らかなように、卵巣癌細胞株（ＰＡ−１、ＲＭＧ−１、４２０、ＯＣＣ−１、ＯＶＣＡＲ３、ＫＫ、ＫＦ、４２９、ＤＯＶ１３およびＭＨ）においてのみオンコリティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６の高い細胞障害活性が認められた。
ｄ）シスプラチンとの相乗効果
オンコリティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６とシスプラティン（ＣＤＤＰ）との抗癌相乗効果を卵巣癌細胞株ＰＡ−１で検討した。即ち、１２ウエルプレートに３００個／ウエルのＰＡ−１細胞を播き、翌日オンコリティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６あるいはシスプラチンを添加し、９日間培養を行った。培養液はＲＰＭＩ培養液で１０％胎児牛血清添加し、３７℃、５％ＣＯ２の状態で行った。培養終了後トリバンブルー染色を行い生存している細胞数を測定することにより、それぞれの増殖抑性効果をＩＣ５０を計算することにより相乗効果を検討した。得られた結果を図１２に示した。図１２の結果から分かるように、ＰＡ−１はＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６のＭＯＩ ０．００１及びＣＤＤＰの０．０１μｇ／ｍｌをそれぞれ単独で９日間作用させた時には細胞障害を受けなかった。しかしこの条件下で両者を併用するとＰＡ−１の細胞数は９日間の培養で半分以下に減じ、Ａｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６とシスプラティンの間に相乗効果が確認された。
産業上の利用の可能性
以上から明らかな通り、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子のプロモーター活性は、転写開始点より１８１６ｂｐ上流側に最も高い活性があり、卵巣癌細胞株においてＣＭＶプロモーターとほぼ同様の転写活性があり、子宮頚癌細胞株においてはＳＶ４０プロモーターの２倍から３倍の活性を示し、正常卵巣細胞およびケラチノサイトでは活性が低くＳＶ４０プロモーターの２０から３０％程度の極めて低い活性値であった。従って、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子プロモーターは特に卵巣癌に特異性が高く、他の癌細胞においても正常細胞に比べ高い活性が認められた。また、本発明により作成されたオンコリティックアデノウイルスにより非常に高い抗腫瘍効果が卵巣癌細胞株において認められ、卵巣癌の治療剤として十分に期待できるものである。この本発明プロモーターは、通常のＥ１欠失あるいはＥ１／Ｅ３欠失のアデノウイルスベクターにも使用できるものであり、さらに最近行われているネイキッド（ｎａｋｅｄ）プラスミドベクターによる遺伝子治療あるいはリボソームを用いた遺伝子治療にも使用可能である。本発明の腫瘍特異的プロモーターによる卵巣癌特異的遺伝子発現により副作用を軽減せしめ、大量投与が可能となり遺伝子治療の臨床的有用性がさらに高めることができる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、ＩＡＩ．３Ｂゲノム遺伝子とＢＲＣＡ１ゲノム遺伝子との関係を示した図である。
図２は、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子のプロモーター領域の各欠失変異体と、それらを挿入したルシフェラーゼベクターとの関係を示した図である。
図３は、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子のプロモーター領域の各欠失変異体を挿入したルシフェラーゼベクターにおけるプロモーター活性を示したグラフである。
図４は、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子のプロモーター領域の１８１６ｂｐおよび４４１ｂｐ欠失変異体を挿入したルシフェラーゼベクターにおける各種細胞株でのプロモーター活性を示したグラフである。
図５は、樹立化卵巣癌細胞株（ＯＣ）におけるプロモーターＩＡＩ．３Ｂ−１８１６の転写活性を子宮頚癌（ＣＣ）と正常ヒト卵巣細胞株（ＮＯＥ）における転写活性と比較したグラフである。
図６は、樹立化卵巣癌細胞株（ＯＣ）におけるプロモーターＩＡＩ．３Ｂ−１８１６の転写活性を子宮頚癌（ＣＣ）と正常ヒト卵巣細胞株（ＮＯＥ）における転写活性と比較したグラフである。
図７は、初代培養卵巣癌細胞株（ｐＯＣ）におけるプロモーターＩＡＩ．３Ｂ−１８１６の転写活性を子宮頚癌（ＣＣ）と正常ヒト卵巣細胞株（ＮＯＥ）における転写活性と比較したものである。
図８は、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子のプロモーター領域の１８１６ｂｐ欠失変異体がＥ１Ａ遺伝子のプロモータ領域に挿入されたオンコリティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６の構築過程を示した図である。
図９は、オンコリティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６の各種細胞株に対する増殖抑制効果を示したグラフである。
図１０は、オンコリティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示したグラフである。
図１１は、ヌードマウスにおけるオンコリティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示した写真である。
図１２は、オンコリティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６とシスプラティン（ＣＤＤＰ）との抗癌活性相乗効果を示すグラフである。
本発明は、卵巣癌などの腫瘍細胞もしくは腫瘍組織において特異的な遺伝子の発現を可能にする腫瘍特異的プロモーターおよびその用途に関する。更に詳細には、本発明は、腫瘍細胞もしくは腫瘍組織、特に卵巣癌細胞もしくは卵巣癌組織において特異的に高いプロモーター活性を発揮し、腫瘍特異的な遺伝子発現による癌、特に卵巣癌の遺伝子治療を可能にする腫瘍特異的プロモーターおよび該腫瘍特異的プロモーターを用いてウイルスを腫瘍細胞あるいは腫瘍組織、特に卵巣癌細胞もしくは卵巣癌組織で特異的に増殖するようにウイルス遺伝子を改変した細胞障害性腫瘍特異的ウイルスに関する。更に本発明は、この細胞障害性腫瘍特異的ウイルスを用いた腫瘍の治療方法に関する。
背景技術
卵巣癌は、欧米において五大癌の一つとされ、日本においては年間約４０００人の人が卵巣癌によって死亡しており、４０年間でその死亡数が約３０倍に急速に増加し、肺癌、膵臓癌とともに最も増加している癌の一つである。卵巣癌は腹腔内に存在し、早期診断が困難であること、卵巣の被膜が容易に破綻し早期において腹腔内に転移しやすいことなどから、その６０％の人が死に至るとされ、膵臓癌とともに最も予後不良な癌の一つである。手術方法の開発、シスプラチン、タキソールなどの抗癌剤の開発により治療成績の改善が認められるものの、それ以降の治療法の改善において有効なものがなく、新たな治療法の開発が望まれている。
最近、癌抑制遺伝子、サイトカイン遺伝子などを癌細胞に導入して癌を治療する遺伝子治療が各種の癌において試みられ、臨床的有効性が確認されるに至っている。卵巣癌においてもアデノウイルスベクターを用いた癌抑制遺伝子ｐ５３による遺伝子治療が、シスプラチンおよびタキソールによる治療に反応しなかった再発性卵巣癌において２０％以上の臨床的有効性（５０％以上の腫瘍の縮小）を示すことが明らかになった（Ｊ．Ｋ．Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９，Ｍａｙ ２００１，３８２）。また、アデノウイルスの腫瘍細胞に対する細胞溶解（ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ）の効果を期待したオンコリティック（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ）アデノウイルスが開発され各種癌において有効性が確認されるに至っている（Ｃａｒｌａ Ｈｅｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，Ａｐｒｉｌ ２０００，Ｖｏｌ．１０５，Ｎｏ．７，８４７−８５１；Ｊａｍｅｓ Ｒ．Ｂｉｓｃｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２７４，１８ Ｏｃｔｏｂｅｒ １９９６，３７３−３７６；Ｊ．Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒａｎｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．２，２００１，２８９−２９８）。また、ヘルペスウイルスを利用したオンコリティックヘルペスウイルスの細胞溶解効果も報告されている（Ｍｉｙａｔａｋｅ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９９，Ｖｏｌ．６，５６４−５７２）。しかしながら、このような遺伝子治療に用いられるウイルスベクターにおいては、従来よりＣＭＶ、ＲＳＶ等のウイルスプロモーターが使用され、組織特異性がないため肝臓への毒性等により、投与量が制限されていたため効果の改善が期待できない面を有していた。
臓器特異的プロモーターを用いたベクターによる遺伝子治療の開発も行われている。即ち、例えばオステオカルシンプロモーターを用いたベクターによる前立腺癌の骨転移の遺伝子治療（Ｓｈｉｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９８ Ｓｅｐ−Ｏｃｔ．，５（５），２７４−２８０，１９９８）、アルブミンプロモーターを用いたベクターによる血友病の遺伝子治療（Ａｌｅｍａｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９７ Ｎｏｖ；６８（２）：１４７−１５９）、ＰＳＡプロモーターを用いたベクターによる前立腺癌の遺伝子治療（Ｇｏｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１９９８ Ｊｕｌ．１６０（１）：２２０−２２９）による臨床試験が既に始まろうとしている。しかしながら、卵巣癌特異的遺伝子プロモーターを用いた遺伝子治療に関する報告はなされていない。
他方、転移性卵巣癌の胸水中の卵巣癌に特異的な蛋白分画を多く含む高分子量領域の蛋白を抗原として、ウサギに免疫して作成した抗体を用いて、卵巣癌細胞株ＯＶＣＡ４３２のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによりプラーク精製されクローニングされた遺伝子としてＩＡＩ．３Ｂ遺伝子が報告されている（Ｃａｍｂｅｌｌ Ｉ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９４，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．４，５８９−５９４）。ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子のオープン・リーディング・フレームは２９９０ｂｐでそれによってコードされる蛋白のアミノ酸配列は９６６個よりなりその分子量１０８ｋｄであり、また、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子によってコードされる蛋白はトランスフォーメーションポテンシャルを有するＢ−ボックス蛋白であり、そのゲノム遺伝子は、染色体１７ｑ２１．１に位置する卵巣癌および乳癌の癌抑制遺伝子であるＢＲＣＡ１遺伝子の近傍のテロメアに位置することも報告されている（Ｃａｍｂｅｌｌ Ｉ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９４，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．４，５８９−５９４）。また、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子とＢＲＣＡ１遺伝子とは、プロモーターとエンハンサー領域とを共有していることも示唆され（Ｍｅｌｉｓｓａ Ａ．Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３７２，２２／２９ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９４，７３３）、それぞれの遺伝子発現調節機構が卵巣癌の発癌および増殖に重要な役割を果たしている可能性も示唆されている（Ｍｅｌｉｓｓａ Ａ．Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９６，１２，２５０７−２５１３）。ＢＲＣＡ１遺伝子のプロモーター領域の活性については既に明らかにされているが（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９６ Ｎｏｖ．；６（１１）：１０２９−１０４９）、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子のプロモーター活性に関する報告はなされていない。
発明の開示
卵巣癌細胞もしくは卵巣癌組織において特異的にそのプロモーター機能を発揮する腫瘍特異的プロモーターを用いて各種ウイルスベクターを構築し、このウイルスベクターによる遺伝子治療を行えば、特に卵巣癌においてのみ目的遺伝子を発現させることが可能となり、従来の遺伝子治療で課題とされていた副作用の軽減および臨床効果の改善が達成できる。
従って、本発明の目的は、卵巣癌などの腫瘍細胞もしくは腫瘍組織、特に卵巣癌細胞もしくは卵巣癌組織において特異的に高いプロモーター活性を発揮し、腫瘍特異的な遺伝子発現による癌、特に卵巣癌の遺伝子治療を可能にする腫瘍特異的プロモーターを提供することにある。
更に本発明の他の目的は、該腫瘍特異的プロモーターを用いてウイルスを腫瘍細胞あるいは腫瘍組織、特に卵巣癌細胞もしくは卵巣癌組織で特異的に増殖するようにウイルス遺伝子を改変した細胞障害性腫瘍特異的ウイルスを提供することにある。
更に本発明の他の目的は、該細胞障害性腫瘍特異的ウイルスを用いた腫瘍の治療方法を提供することにある。
本発明者は、卵巣癌において遺伝子の活性が更新していることが期待されるＩＡＩ．３Ｂ遺伝子のプロモーター領域のクローニングを試み、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子のエクソン１Ｂの上流域の特に１８１６ｂｐまたは４４１ｂｐからなる遺伝子であって配列表の配列番号１に示す１１２６〜２９４１番目の塩基配列または２５０１〜２９４１番目の塩基配列を有する遺伝子が特に卵巣癌において特異的に高いプロモーター活性を発揮し得ること、そして細胞障害性腫瘍特異的ウイルスを構築するためのプロモーターとして有用であることを見出し、本発明を完成させた。
即ち、本発明は、配列表の配列番号１に示す１１２６〜２９４１番目または２５０１〜２９４１番目の塩基配列を有する腫瘍特異的プロモーターに関する。
更に本発明は、配列表の配列番号１に示す１１２６〜２９４１番目または２５０１〜２９４１番目の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、それらの塩基配列と同様のプロモーター機能を有する腫瘍特異的プロモーターに関する。このような腫瘍特異的プロモーターは、好ましくは配列表の配列番号１に示す２６２６〜２９４１番目、２３７６〜２９４１番目、１２５１〜２９４１番目または１００１〜２９４１番目の塩基配列を有するものである。好ましくは、本発明の上記腫瘍特異的プロモーターは卵巣癌に特異的なプロモーターである。
更に本発明は、上記腫瘍特異的プロモーターを用いてウイルスを腫瘍細胞あるいは腫瘍組織で特異的に増殖するようにウイルス遺伝子を改変した細胞障害性腫瘍特異的ウイルスに関する。好ましくは、本発明の上記細胞障害性腫瘍特異的ウイルスは卵巣癌に特異的なものである。更に好ましくは、本発明の上記細胞障害性腫瘍特異的ウイルスはアデノウイルスである。
更に本発明は、上記細胞障害性腫瘍特異的ウイルスをヒトに投与することからなる腫瘍の治療方法に関する。好ましくは、上記細胞障害性腫瘍特異的ウイルスとともに抗癌化学療法剤を投与する治療方法である。
発明を実施するための最良の形態
本発明の腫瘍特異的プロモーターは、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子におけるプロモーター領域についての詳細な研究により初めて得られたものである。前記した通り、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子は、転移性卵巣卵の胸水中に存在する高分子量領域の蛋白に対して作成した抗体を用いた卵巣癌細胞株ＯＶＣＡ４３２のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによりクローニングされた遺伝子である。図１に示すように、ＩＡＩ．３Ｂゲノム遺伝子は、染色体１７ｑ２１．１に存在する卵巣癌および乳癌の癌抑制遺伝子であるＢＲＣＡ１遺伝子の近傍のテロメアにアンチセンスに位置し、両者のゲノム遺伝子の間には、それぞれの遺伝子の偽遺伝子（ｐｓｅｕｄｏ ｇｅｎｅ）がアンチセンスに配列してプロモーターとして存在している。即ち、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子のプロモーターは、ＢＣＲＡ１遺伝子の偽遺伝子のエクソン２、エクソン１Ｂ、エクソン１Ａがアンチセンスに配列したものである。
本発明の腫瘍特異的プロモーターは、配列表の配列番号１に示す塩基配列において１１２６〜２９４１番目または２５０１〜２９４１番目の塩基配列からなるものである。配列番号１の２９４１番目の塩基は、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子のエクソン１Ｂの５’末端から１ｂｐ上流に位置する塩基に相当する。従って、配列番号１に示す塩基配列において１１２６〜２９４１番目または２５０１〜２９４１番目の塩基配列からなる本発明の腫瘍特異的プロモーターは、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子のエクソン１Ｂの上流側に位置するそれぞれ１８１６ｂｐまたは４４１ｂｐの塩基配列に相当する。
本発明の腫瘍特異的プロモーターは、上記した配列表の配列番号１に示す１１２６〜２９４１番目または２５０１〜２９４１番目の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、それらの塩基配列と同様のプロモーター機能を有する塩基配列からなるプロモーターであってもよい。ここでいうストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列とは、例えば、６×ＳＳＰＥ、２×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌサケ精巣ＤＮＡを含む溶液中で６５℃、１２時間反応させる、という条件下でサザンハイブリダイゼーションを行うことにより、上記したいずれかの塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズする塩基配列である。本発明の腫瘍特異的プロモーターは、このような条件でハイブリダイズする塩基配列であって、ハイブリダイズした対象の塩基配列と同様のプロモーター機能、即ち、同程度の腫瘍特異性と同程度のプロモーター活性を有するものである。このような塩基配列としては、ハイブリダイズの対象となる塩基配列と、例えば６０％以上、好ましくは６５％以上の相同性を有するものが挙げられる。このような本発明の腫瘍特異的プロモーターとしては、配列表の配列番号１に示す１１２６〜２９４１番目の塩基配列からなる腫瘍特異的プロモーターとハイブリダイズするものとしては、例えば配列番号１の１２５１〜２９４１番目（１６９１ｂｐ）または１００１〜２９４１番目（１９４１ｂｐ）の塩基配列からなる腫瘍特異的プロモーターが挙げられる。配列表の配列番号１に示す２５０１〜２９４１番目の塩基配列からなる腫瘍特異的プロモーターとハイブリダイズするものとしては、例えば配列番号１の２６２６〜２９４１番目（３１６ｂｐ）または２３７６〜２９４１番目（５６６ｂｐ）の塩基配列からなる腫瘍特異的プロモーターが挙げられる。
上記した本発明の腫瘍特異的プロモーターは、既に報告されているＩＡＩ．３Ｂゲノム遺伝子の配列情報（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ Ｈｕｍａｎ １Ａ．３Ｂ ｇｅｎｅ，ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ．ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｕ７２４８３）に基づきＰＣＲ法を利用する周知の方法により得ることができる。これらの方法は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に従い、当業者ならば容易に行うことができる。また、上記したストリジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有する本発明の腫瘍特異的なプロモーターは、上記した方法、あるいは例えば部位特異的突然変異誘発法、通常のハイブリダイゼーション法などにより容易に得ることができ、具体的には前記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ等の基本書を参考にして行うことができる。
上記した本発明の腫瘍特異的プロモーターは、高いプロモーター活性を有し、卵巣癌などの腫瘍細胞もしくは腫瘍組織、特に卵巣癌細胞もしくは卵巣癌組織において特異的に高いプロモーター活性を有する。後述する実施例に明らかにされている通り、例えば配列番号１の１１２６〜２９４１番目の塩基配列（１８１６ｂｐ）からなる本発明の腫瘍特異的プロモーターは、卵巣癌細胞株ＨＥＹにおいてＳＶ４０プロモーターに比べ約３０倍のプロモーター活性を示し、同様に配列番号１の２５０１〜２９４１番目の塩基配列（４４１ｂｐ）からなる本発明の腫瘍特異的プロモーターは、１５倍のプロモーター活性を示す。また、本発明の配列番号１の１１２６〜２９４１番目の塩基配列（１８１６ｂｐ）からなる腫瘍特異的プロモーターは、卵巣癌細胞株ＰＡ−１においてＳＶ４０プロモーターの約２０００倍、他の卵巣癌細胞株ＨＲＡにおいてＳＶ４０プロモーターの約７０倍のプロモーター活性を発揮し、他方、正常卵巣細胞のＮＯＥ１、ＮＯＥ２、ＮＯＥ３においてはＳＶ４０プロモーターの約２５％、正常ヒトケラチノサイト細胞株Ｋ４２においてもＳＶ４０プロモーターの約２０％のプロモーター活性しか示さず、従って、特に卵巣癌において特異的に高いプローモーター活性を発揮する。本発明の配列番号１の２５０１〜２９４１番目の塩基配列（４４１ｂｐ）からなる腫瘍特異的プロモーターも同様に卵巣癌において特異的に高いプロモーター活性を発揮する。
本発明の腫瘍特異的プロモーターは、腫瘍特異的な遺伝子発現による癌の遺伝子治療、例えば、ウイルスを腫瘍細胞あるいは腫瘍組織で特異的に増殖するようにウイルス遺伝子を改変した細胞障害性腫瘍特異的ウイルスを構築するためのプロモーターとして利用できる。
このような細胞障害性腫瘍特異的ウイルスは、いわゆるオンコリティックウイルス（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｕｓ）と呼ばれるものである。このようなウイルスは、例えばアデノウイルスの増殖に必須の遺伝子である初期遺伝子Ｅ１ＡまたはＥ１Ｂの上流に本発明の腫瘍特異的プロモーターを挿入するかあるいは初期遺伝子Ｅ１ＡまたはＥ１Ｂプロモーターと置換することにより、あるいはヘルペスウイルスの対応する初期遺伝子の上流に本発明の腫瘍特異的プロモーターを挿入するかあるいは初期遺伝子プロモーターと置換することにより構築することができる。また、レトロウイルス、レオウイルスなどのその他のウイルスについても、本発明の腫瘍特異的プロモーターの挿入または置換により細胞障害性腫瘍特異的ウイルスを構築することができる。このようにして構築された細胞障害性腫瘍特異的ウイルスは、腫瘍細胞あるいは腫瘍組織で特異的に増殖し腫瘍細胞を殺傷する作用を発揮することができる。従って、このウイルスを投与することにより特に卵巣癌を有効にかつ副作用を軽減して治療することができる。このような細胞障害性腫瘍特異的ウイルスの構築方法、利用方法等については、Ｃａｒｌａ Ｈｅｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，Ａｐｒｉｌ ２０００，Ｖｏｌ．１０５，Ｎｏ．７，８４７−８５１；Ｊａｍｅｓ Ｒ．Ｂｉｓｃｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２７４，１８ Ｏｃｔｏｂｅｒ １９９６，３７３−３７６；Ｊ．Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒａｎｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．２，２００１，２８９−２９８などの文献が参照される。
本発明の細胞障害性腫瘍特異的ウイルスをヒトへ投与する方法としては、該ウイルスを直接体内に導入するｉｎ ｖｉｖｏ法やヒトからある種の細胞や組織を取り出して体外で該ウイルスを該細胞や組織に導入しその細胞や組織を体内に戻すｅｘ ｖｉｖｏ法などがある。ｉｎ ｖｉｖｏ法としては、例えば本発明の細胞障害性腫瘍特異的ウイルスを適当な溶剤（ＰＢＳ等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水等）に溶解した後、必要に応じてフィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填して注射剤を調製して、ヒトへ注射することにより投与される。注射剤には必要に応じて慣用の担体等を加えてもよい。本発明の細胞障害性腫瘍特異的ウイルスは、静脈、筋肉、腹腔、皮膚等に投与することができ、また腫瘍組織内へ直接投与することもできる。ｅｘ ｖｉｖｏ法としては、上記したと同様の注射剤などで本発明の細胞障害性腫瘍特異的ウイルスを組織に直接注入してそれを体内に戻す方法などが挙げられる（日本遺伝子治療学会編、遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス、１９９９）。
本発明の細胞障害性腫瘍特異的ウイルスの投与量は、投与する対象、投与方法、投与形態等によって異なるが、通常成人１人当たり１×１０９〜１×１０１４ウイルス粒子数の範囲、好ましくは１×１０１０〜１×１０１３ウイルス粒子数の範囲である。
本発明の細胞障害性腫瘍特異的ウイルスは、通常臨床的に使用されている抗癌化学療法剤と併用することもできる。併用することにより抗腫瘍活性において相乗効果を発揮することができ、従って両者の投与量を低用量として副作用を軽減しかつ抗腫瘍効果を高めることができる。抗癌化学療法剤としては、シスプラチン、シクロホスファミドなどのアルキル化剤；メトトレキセート、メルカプトプリン、シトシンアラビノシドなどの代謝拮抗剤；アクチノマイシン、アドリアマイシンなどの抗癌抗生物質；エトポシド、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチンなどの植物アルカロイド；ピシバニール、クレスチンなどの免疫系薬剤；イリノテカン、トポテカンなどのＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤等が挙げられる。これらのなかでも、シスプラチン、シクロホスファミド、アドリアマイシン、エトポシド、タキソールなどが好ましい。
更に本発明の腫瘍特異的プロモーターは、薬剤代謝酵素遺伝子と癌治療用プロドラッグとを組み合わせた自殺遺伝子治療、サイトカイン遺伝子などを癌細胞に導入して免疫機能を高めて癌を治療する免疫遺伝子治療などに利用することもできる。
自殺遺伝子治療としては、薬剤代謝酵素遺伝子と癌治療用プロドラッグとの組み合わせが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子とガンシクロビルもしくはアシクロビル、シトシンデアミナーゼ遺伝子と５−フルオロシトシン、水痘帯状疱疹ウイルスシミジンキナーゼ遺伝子と６−メトキシプリアラビノシド、Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｐｔ遺伝子と６−チオキサンチン、チトクロームＰ４５０ ２Ｂ１遺伝子とサイクロフォスファミド、ヒトデオキシシチジンキナーゼ遺伝子とサイトシンアラビノシド、Ｅ．ｃｏｌｉ ＵＰＲＴ遺伝子と５−フルオロウラシル、またはＥ．ｃｏｌｉ ｄｅｏＤ遺伝子と６−メチルプリン−２’−デオキシリボヌクレオシドの組み合わせなどの例が挙げられる。自殺遺伝子治療を実際に行うには、本発明の腫瘍特異的プロモーター及びその下流に薬剤代謝酵素遺伝子を発現可能なように組み込んだ発現ベクターを構築して、その発現ベクターを癌細胞に導入し、次いで癌治療用プロドラッグを投与することによって実施できる。ベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどの遺伝子導入に通常用いられるベクターが挙げられる。あるいは、本発明の腫瘍特異的プロモーター及びその下流に薬剤代謝酵素遺伝子を発現可能なように組み込んだプラスミドＤＮＡを、リポソームに封入して、あるいはポリリジン−ＤＮＡ−タンパク質複合体として、癌細胞に導入することもできる。また、ネイキッドプラスミド（ｎａｋｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ）の形態で癌細胞に導入することもできる。遺伝子を導入するには、これらのベクター、リポソーム封入体等を静脈あるいは動脈内にあるいは直接腫瘍内部や腫瘍周囲に注入することによって行われる。この際、エレクトロポレーション法や超音波を併用することにより遺伝子導入効率を高めることも可能である。遺伝子導入後、癌治療用プロドラッグは、経口、静脈、動脈内投与等の通常の方法により投与される。
導入された遺伝子は、本発明の腫瘍特異的プロモーターの作用によって癌細胞内で特異的に薬剤代謝酵素が発現され、発現された薬剤代謝酵素により、癌細胞内において癌治療用プロドラッグは活性型の癌治療剤へ変換され、この変換された癌治療剤により癌細胞が選択的に死滅して自殺遺伝子治療が完了する。
このような自殺遺伝子治療の手法自体は既に公知であり、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子とガンシクロビルとの組み合わせは、脳腫瘍等で臨床応用されており（Ｏｌｄｆｉｅｌｄ，Ｅ Ｈ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４，３９−６９，１９９３）、またシトシンデアミナーゼ遺伝子と５−フルオロシトシンとの組み合わせも、大腸癌などに臨床応用の可能性が示唆されており（Ｈｕｂｅｒ，Ｂ Ｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５３，４６１９−４６２６，１９９３）、これらの例が、本発明の遺伝子治療を実施する際に参照される。
本発明の腫瘍特異的プロモーターを利用した免疫遺伝子治療としては、インターフェロン、ＴＮＦα、インターロイキンなどのサイトカインをコードする遺伝子を、上記の自殺遺伝子治療と同様の方法で、本発明の腫瘍特異的プロモーターと共に発現ベクターに組み込み、あるいはリポソームに封入して、あるいはネイキッドプラスミド（ｎａｋｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ）の形態で癌細胞に導入することができる。癌細胞に導入してサイトカインを発現させて、それによりヒトが本来有する生体防御機構である免疫応答を高めて癌を治療する方法が採用される。
また、本発明の腫瘍特異的プロモーターを利用して、癌遺伝子のアンチセンス遺伝子や正常型の癌抑制遺伝子を、腫瘍において特異的に発現させ、その結果、腫瘍の脱癌化（正常復帰）や細胞死（アポトーシス）、更には腫瘍細胞の抗癌剤感受性、放射線感受性の亢進を惹起することもできる。また、本発明の腫瘍特異的プロモーターは、Ｅ１欠失部位に前記したサイトカインなどをコードする遺伝子とともに挿入してＥ１欠失、Ｅ１／Ｅ３欠失アデノウイルスベクターを構築して、通常行なわれている遺伝子治療に用いることもできる。
本発明の腫瘍特異的プロモーターを利用した遺伝子治療は、特に卵巣癌の治療に有効である。
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例の範囲に何ら限定されるものではない。
実施例１
ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子における腫瘍特異的プロモーターのクローニング
（１）実験方法
ＩＡＩ．３Ｂのエクソン１およびその上流域１６０ｂｐに基いてＰＣＲ法によりＤＮＡテンプレートを作成し、これを基にしてＣｌｏｎｔｅｃｈのＥＭＢＬ３ ＳＰ６／Ｔ７ファージ・ライブラリーよりシングルクローン（ｐＣＡ１）を分離し、ＰＣＲによりＩＡＩ．３Ｂのエクソン１およびその上流部分１ｋｂが含有されている事を確認した。実験には、卵巣癌細胞株ＰＡ−１、ＨＲＡ、ＨＥＹ、正常ヒト卵巣細胞ＮＯＥ１、ＮＯＥ２、ＮＯＥ３、子宮頚癌細胞株ＳＫＧＩＩＩＡ、正常ヒトケラチノサイト細胞株Ｋ４２を用いた。具体的には以下のようにして実験を行った。
１．ＳＭＡＲＴ ＰＣＲ ｃＤＮＡ合成キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により転写開始点（Ｃａｐ ｓｉｔｅ）を決定した。
２．アンチセンスプライマーをエクソン１Ｂに設定し、センスプライマーを５０〜５００ｂｐ毎に設定することにより、エクソン１Ｂの上流側のＰＣＲ生成物を作成し、これらをルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）ベクター（ＰｉｃａＧｅｎｅ ｖｅｃｔｏｒ、東洋インキ）のＭｌｕ ＩおよびＢｇｌ ＩＩの制限酵素部位に組み込んだ。さらに、二重ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＰＣＲ生成物である欠失変異体（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ）のルシフェラーゼスアッセイをおこない、プロモーター活性の特定を行った。各欠失変異体と、それを組み込んで得られたルシフェラーゼベクターとの関係を図２に示した。図２において、例えばルシフェラーゼベクターｐＧＶ−２９４１は、配列番号１の１〜２９４１番目の２９４１ｂｐの塩基配列からなる欠失変異体が組み込まれたものである。同様に例えばｐＧＶ−１９４１、ｐＧＶ−１８１６、ｐＧＶ−１６９１、ｐＧＶ−５６６、ｐＧＶ−４４１およびｐＧＶ−３１６は、配列番号１のそれぞれ１００１〜２９４１番目の１９４１ｂｐの塩基配列、１１２６〜２９４１番目の１８１６ｂｐの塩基配列、１２５１〜２９４１番目の１６９１ｂｐの塩基配列、２３７６〜２９４１番目の５６６ｂｐの塩基配列、２５０１〜２９４１番目の４４１ｂｐの塩基配列および２６２６〜２９４１番目の３１６ｂｐの塩基配列からなる欠失変異体が組み込まれたものである。
３．ＰＣＲにより得られ、各ルシフェラーゼベクターに挿入した各欠失変異体については、突然変異のないことを確認するため、配列分析を自動ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ３１０；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により行った。
４．上記の実験によって決定された各プロモーター領域を含むルシフェラーゼベクターにより、卵巣癌に対する臓器特異的遺伝子発現について、従来のプロモーター（ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター）と比較した。
（２）結果
転写開始点は、エクソン１Ｂであることが明かとなりさらに従来から報告されていた（Ｂｒｏｗｎ，ＭＡ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１２：２５０７−２５１３，１９９６）エクソン１Ｂはさらに上流３ｂｐから開始することが明かとなった。また、従来より報告されていた（Ｂｒｏｗｎ，ＭＡ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１２：２５０７−２５１３，１９９６）エクソン１Ａは転写されていないことも明かとなった。
エクソン１Ｂの５’上流域の１９１ｂｐから２９４１ｂｐまで各欠失変異体を組み込んで作成したルシフェラーゼベクター（図２）について、二重ルシフェラーゼアッセイによりプロモーター活性を測定した結果、図３に示すように、最も高いプロモーター活性は１８１６ｂｐ上流域にあることが明かとなった。下流域の欠失変異体のプロモーター活性は徐々に減少しはじめ、ｐＧＶ−９４１で最も低下し、１６９１ｂｐから９４１ｂｐの間にポジティブエレメントのあることが明かとなった。さらに、下流域の欠失変異体のプロモーター活性を比較すると、各活性は上昇しはじめ、ｐＧＶ−４４１で最も高い価を示した。このため、８１６ｂｐから４４１ｂｐまでにネガティブエレメントのあることが明かとなった。さらに、下流域の欠失変異体を検討すると、プロモーターは低下しはじめ、３１６ｂｐより下流域にポジティブエレメントのあることが明かとなった。
さらに、図３に示すように、卵巣癌細胞株ＨＥＹにおいてｐＧＶ−１８１６のプロモーター活性はＳＶ４０プロモーターであるｐＧＶ−コントロールに比べ約３０倍の活性を示し、ＣＭＶプロモーターであるｐＧＶ−ＣＭＶに比べ約８０％程度の非常に高い活性を示すことが明かとなった。
また、図４に示すように、他の卵巣癌細胞株ＰＡ−１においては、最も高い活性がｐＧＶ−１８１６にありその値はＳＶ４０プロモーターの約２０００倍で、ＣＭＶプロモーターの約２倍であった。さらに、他の卵巣癌細胞株ＨＲＡにおいては、最も高い活性がｐＧＶ−１８１６にありその値はＳＶ４０プロモーターの約７０倍で、ＣＭＶプロモーターの約２倍であった。子宮頚癌細胞株ＳＫＧＩＩＩＡにおいては、ｐＧＶ−１８１６のプロモーター活性は、ＳＶ４０プロモーターの５倍でＣＭＶプロモーターの１３％であった。他の子宮頚癌細胞株ＨＴ３においてもｐＧＶ−１８１６のプロモーター活性は、ＳＶ４０プモーターの３倍でＣＭＶプロモーターの５％であった。一方、正常卵巣細胞のＮＯＥ１、ＮＯＥ２、ＭＯＥ３においてはｐＧＶ−１８１６のプロモーター活性は、ＳＶ４０プロモーターの約２５％であり、ＣＭＶプロモーターの０．２５％であった。さらに正常ヒトケラチノサイト細胞株Ｋ４２においてもｐＧＶ−１８１６のプロモーター活性は、ＳＶ４０プロモーターの約２０％であり、ＣＭＶプロモーターの０．７％であった。
以上により、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子プロモーターは卵巣癌に特異性が高くＣＭＶプロモーターの８０％から２倍であった。さらに、子宮頚癌細胞株においても高い活性は認められ、ＳＶ４０プロモーターの約２倍から３倍程度であった。一方、正常卵巣細胞およびケラチノサイト細胞においては、活性は低くＳＶ４０プロモーターの約２０％から３０％程度であった。
実施例２
ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子プロモーターの転写活性
実施例１の（１）の２．に記載した方法とほぼ同様にして、二重ルシフェラーゼ法により、樹立化卵巣癌細胞株（ＯＣ）、初代培養卵巣癌細胞株（ｐＯＣ）におけるＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６の転写活性を測定した。対照として子宮頚癌（ＣＣ）と正常ヒト卵巣細胞株（ＮＯＥ）を用いた。具体的には、実施例１の（１）の２．で構築された配列番号１の１１２６〜２９４１番目の１８１６ｂｐの塩基配列からなるプロモーターＩＡＩ．３Ｂ−１８１６を含むルシフェラーゼベクターｐＧＶ−１８１６とコントロールとしてＲＬ−ＴＫベクターを１０：１の比率で混合し、ＤＯＴＡＰリポソーム試薬に結合した後各細胞を播いた細胞培養用の１２ウエルプレートの各ウェルに、胎児牛血清を添加しない培養液とともに追加し、２日間培養して、ルミカウンターによりホタルルシフェラーゼ、つぎにウミシイタケルシフェラーゼの測定を行った。転写活性はＳＶ４０のプロモーター活性を１とした時の値で示した。得られた結果は図５、６および７に示した。図５および６は、樹立化卵巣癌細胞株（ＯＣ）におけるＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６の転写活性を子宮頚癌（ＣＣ）と正常ヒト卵巣細胞株（ＮＯＥ）における転写活性と比較したものであり、図７は、初代培養卵巣癌細胞株（ｐＯＣ）におけるＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６の転写活性を子宮頚癌（ＣＣ）と正常ヒト卵巣細胞株（ＮＯＥ）における転写活性を比較したものである。図５、６および７から分かるように、Ａｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６の樹立化卵巣癌細胞株（ＯＣ）および初代培養卵巣癌細胞株（ｐＯＣ）における転写活性は、子宮頚癌（ＣＣ）と正常ヒト卵巣細胞株（ＮＯＥ）におけるそれに比べて顕著に高いことが分かる。
実施例３
細胞障害性腫瘍特異的アデノウイルスの構築および効果
（１）細胞障害性腫瘍特異的アデノウイルスの構築
ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子プロモーターによるオンコリティックアデノウイルスを作成するため、図８に示すようにシャトルベクターｐＸＣ１（Ｇｒａｈａｍ，ＦＬ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．３：２９１７−２９２２，１９８４）の５５２ｂｐの位置にＴを挿入し、この部位にＡｇｅＩ部位を導入し、クレノーフラグメントにより平滑末端にし、この部位にさらにクレノーフラグメントにより平滑末端にしたＩＡＩ．３Ｂ−１８１６（配列番号１の１１２６〜２９４１番目の１８１６ｂｐの塩基配列）を挿入した。このシャトルベクターを２９３細胞においてｐＢＨＧＥ３（Ｇｒａｈａｍ，ＦＬ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．３：２９１７−２９２２，１９８４）と相同組換えし、配列番号１の１１２６〜２９４１番目の１８１６ｂｐの塩基配列がアデノウイルスのＥ１Ａプロモーター領域に挿入されたオンコリティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６を作成した。
（２）細胞障害性腫瘍特異的アデノウイルスの効果
ａ）各種細胞株に対する増殖抑制効果
オンコリティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６の卵巣癌細胞株ＰＡ−１、子宮頚癌細胞株ＳＫＧＩＩＩＡ、正常ヒト卵巣細胞株ＮＯＥ１および正常ヒトケラチノサイト細胞株に対する増殖抑性効果を検討した。培養条件は、卵巣癌細胞株、子宮頚癌細胞株は、ＲＰＭＩに１０％ＦＣＳを加えたものを３７℃、５％ＣＯ２にて行った。正常ヒト卵巣細胞および正常ヒトケラチノサイト細胞株に関しては、ＭＣＤＢ液（ニッスイ）に５％ＦＣＳを加えて培養を行った。
得られたＩＣ５０値を図９に示した。卵巣癌細胞株ＰＡ−１においてＩＣ５０は０．０１ＭＯＩであり、これは正常ヒト卵巣細胞株ＮＯＥ１の２００００倍であり、子宮頚癌細胞株ＳＫＧＩＩＩＡの１００００倍であった。
以上により、配列番号１の１１２６〜２９４１番目の１８１６ｂｐの塩基配列からなるプロモーターを導入したオンコリィティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６は卵巣癌に特異的に抗腫瘍効果を有することが明かとなった。
ｂ）ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性
オンコリティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を調べた。即ち、６週令のヌードマウス１０匹の背部に１ｘ１０７個の卵巣癌細胞株ＰＡ−１を皮下に接種し、腫瘍の大きさを観察し、腫瘍の直径が約５ｍｍに到達した時点で２群に分けた。１群のみにオンコリティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６の１ｘ１０１０個のウイルス粒子を、３回（１、３および５日）腫瘍内部に注入した。その後腫瘍塊の大きさをノギスで測定してその体積を求めた。得られた結果を図１０に示した。図１０のグラフから明らかなように、オンコリティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６を腫瘍内に投与した群（Ａｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６投与群）では腫瘍は投与直後から退縮し始め、投与２０日目以降完全に消失した。これに対して、Ａｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６の非投与群（コントロール群）では、ＰＡ−１接種後に日数の経過とともに腫瘍の体積が増加した。
また、図１１にオンコリティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６投与群のヌードマウスの５０日後の写真（左）およびコントロール群のヌードマスウスの５０日後の写真（右）を示した。コントロール群の腫瘍の大きさに対し、Ａｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６投与群のヌードマウスの投与部位では（左側のヌードマウスの右背部）癌は完全に消失した。
ｃ）各種細胞株に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ抗腫瘍活性
上記ａ）と同様にして、オンコリティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６の卵巣癌細胞株、子宮頚癌細胞株、正常ヒト卵巣細胞株および正常ヒトケラチノサイト細胞株に対する増殖抑制効果を検討した。卵巣癌細胞株、子宮頚癌細胞株はＲＰＭＩに１０％ＦＣＳを加えたものを３７℃、５％ＣＯ２にて行った。正常ヒト卵巣細胞株、正常ヒトケラチノサイト細胞株に関しては、ＭＣＤＢ液（ニッスイ）に５％ＦＣＳを加えて培養した。培養は３０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（ｎ＝３）で開始し各ＭＯＩで感染後ＩＣ５０値を測定した。得られた結果を表１に示した。表１の結果から明らかなように、卵巣癌細胞株（ＰＡ−１、ＲＭＧ−１、４２０、ＯＣＣ−１、ＯＶＣＡＲ３、ＫＫ、ＫＦ、４２９、ＤＯＶ１３およびＭＨ）においてのみオンコリティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６の高い細胞障害活性が認められた。
オンコリティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６とシスプラティン（ＣＤＤＰ）との抗癌相乗効果を卵巣癌細胞株ＰＡ−１で検討した。即ち、１２ウエルプレートに３００個／ウエルのＰＡ−１細胞を播き、翌日オンコリティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６あるいはシスプラチンを添加し、９日間培養を行った。培養液はＲＰＭＩ培養液で１０％胎児牛血清添加し、３７℃、５％ＣＯ２の状態で行った。培養終了後トリバンブルー染色を行い生存している細胞数を測定することにより、それぞれの増殖抑性効果をＩＣ５０を計算することにより相乗効果を検討した。得られた結果を図１２に示した。図１２の結果から分かるように、ＰＡ−１はＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６のＭＯＩ ０．００１及びＣＤＤＰの０．０１μｇ／ｍｌをそれぞれ単独で９日間作用させた時には細胞障害を受けなかった。しかしこの条件下で両者を併用するとＰＡ−１の細胞数は９日間の培養で半分以下に減じ、Ａｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６とシスプラティンの間に相乗効果が確認された。
産業上の利用の可能性
以上から明らかな通り、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子のプロモーター活性は、転写開始点より１８１６ｂｐ上流側に最も高い活性があり、卵巣癌細胞株においてＣＭＶプロモーターとほぼ同様の転写活性があり、子宮頚癌細胞株においてはＳＶ４０プロモーターの２倍から３倍の活性を示し、正常卵巣細胞およびケラチノサイトでは活性が低くＳＶ４０プロモーターの２０から３０％程度の極めて低い活性値であった。従って、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子プロモーターは特に卵巣癌に特異性が高く、他の癌細胞においても正常細胞に比べ高い活性が認められた。また、本発明により作成されたオンコリティックアデノウイルスにより非常に高い抗腫瘍効果が卵巣癌細胞株において認められ、卵巣癌の治療剤として十分に期待できるものである。この本発明プロモーターは、通常のＥ１欠失あるいはＥ１／Ｅ３欠失のアデノウイルスベクターにも使用できるものであり、さらに最近行われているネイキッド（ｎａｋｅｄ）プラスミドベクターによる遺伝子治療あるいはリボソームを用いた遺伝子治療にも使用可能である。本発明の腫瘍特異的プロモーターによる卵巣癌特異的遺伝子発現により副作用を軽減せしめ、大量投与が可能となり遺伝子治療の臨床的有用性がさらに高めることができる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、ＩＡＩ．３Ｂゲノム遺伝子とＢＲＣＡ１ゲノム遺伝子との関係を示した図である。
図２は、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子のプロモーター領域の各欠失変異体と、それらを挿入したルシフェラーゼベクターとの関係を示した図である。
図３は、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子のプロモーター領域の各欠失変異体を挿入したルシフェラーゼベクターにおけるプロモーター活性を示したグラフである。
図４は、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子のプロモーター領域の１８１６ｂｐおよび４４１ｂｐ欠失変異体を挿入したルシフェラーゼベクターにおける各種細胞株でのプロモーター活性を示したグラフである。
図５は、樹立化卵巣癌細胞株（ＯＣ）におけるプロモーターＩＡＩ．３Ｂ−１８１６の転写活性を子宮頚癌（ＣＣ）と正常ヒト卵巣細胞株（ＮＯＥ）における転写活性と比較したグラフである。
図６は、樹立化卵巣癌細胞株（ＯＣ）におけるプロモーターＩＡＩ．３Ｂ−１８１６の転写活性を子宮頚癌（ＣＣ）と正常ヒト卵巣細胞株（ＮＯＥ）における転写活性と比較したグラフである。
図７は、初代培養卵巣癌細胞株（ｐＯＣ）におけるプロモーターＩＡＩ．３Ｂ−１８１６の転写活性を子宮頚癌（ＣＣ）と正常ヒト卵巣細胞株（ＮＯＥ）における転写活性と比較したものである。
図８は、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子のプロモーター領域の１８１６ｂｐ欠失変異体がＥ１Ａ遺伝子のプロモータ領域に挿入されたオンコリティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６の構築過程を示した図である。
図９は、オンコリティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６の各種細胞株に対する増殖抑制効果を示したグラフである。
図１０は、オンコリティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示したグラフである。
図１１は、ヌードマウスにおけるオンコリティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示した写真である。
図１２は、オンコリティックアデノウイルスＡｄ−ＩＡＩ．３Ｂ−１８１６とシスプラティン（ＣＤＤＰ）との抗癌活性相乗効果を示すグラフである。
Claims (10)
- 配列表の配列番号１に示す１１２６〜２９４１番目または２５０１〜２９４１番目の塩基配列を有する腫瘍特異的プロモーター。
- 配列表の配列番号１に示す１１２６〜２９４１番目または２５０１〜２９４１番目の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、それらの塩基配列と同様のプロモーター機能を有する腫瘍特異的プロモーター。
- 配列表の配列番号１に示す２６２６〜２９４１番目、２３７６〜２９４１番目、１２５１〜２９４１番目または１００１〜２９４１番目の塩基配列を有する、請求項２の腫瘍特異的プロモーター。
- 卵巣癌に特異的な請求項１から３のいずれかの腫瘍特異的プロモーター。
- 請求項１から４のいずれかの腫瘍特異的プロモーターを用いてウイルスを腫瘍細胞あるいは腫瘍組織で特異的に増殖するようにウイルス遺伝子を改変した細胞障害性腫瘍特異的ウイルス。
- 卵巣癌に特異的な請求項５の細胞障害性腫瘍特異的ウイルス。
- ウイルスがアデノウイルスである請求項５または６の細胞障害性腫瘍特異的ウイルス。
- 抗癌化学療法剤とともに用いるための請求項５から７のいずれかの細胞障害性腫瘍特異的ウイルス。
- 請求項５から８のいずれかの細胞障害性腫瘍特異的ウイルスをヒトに投与することからなる腫瘍の治療方法。
- 細胞障害性腫瘍特異的ウイルスとともに抗癌化学療法剤を投与する請求項９の治療方法。
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