CN116964196A - 重组溶瘤病毒及其医药用途 - Google Patents

Abstract

提供在溶瘤病毒的基因组中整合有能够在肿瘤细胞中表达靶向酶的RNA或DNA的编码序列得到重组溶瘤病毒，通过将该重组溶瘤病毒与靶向酶激活的抗肿瘤前药联用来达到改善溶瘤病毒抗肿瘤的效果；还提供一种重组溶瘤病毒，其特征在于，该重组溶瘤病毒为选择复制型溶瘤病毒，并且该重组溶瘤病毒的基因组中整合有能够在肿瘤细胞中表达靶向酶的RNA或DNA的编码序列，靶向酶为能够激活抗肿瘤前药的酶；还提供一种药物组合物，该药物组合物包括重组溶瘤病毒和靶向酶激活的抗肿瘤前药。

Description

重组溶瘤病毒及其医药用途 技术领域

本发明涉及重组溶瘤病毒及医药用途。

背景技术

溶瘤病毒依靠其本身的特异性在肿瘤细胞中复制来裂解肿瘤细胞，细胞裂解后释放出来的病毒或毒素又可以进一步感染周围的肿瘤细胞，同时对正常细胞和组织则没有破坏作用，或影响较小。

溶瘤病毒一般分为二类：一类为野生型病毒和自然变异的弱毒病毒株，这类病毒天然就对某些肿瘤细胞有亲和力，如呼肠孤病毒、新城疫病毒以及自主复制的细小病毒等，这些病毒能够在某些肿瘤细胞中繁殖并裂解细胞，具有天然的特异性溶瘤活性；另一类是对病毒基因组进行改造后，只能在肿瘤细胞内复制的病毒。

目前人们已经通过基因工程方法改造了腺病毒、单纯疱疹病毒、流感病毒和人牛痘病毒等。其中腺病毒是溶瘤病毒研究开展相对较早溶瘤机理研究相对较为清楚的，腺病毒中又以5型腺病毒研究得更为清楚。腺病毒发现后不久曾被用来治疗头颈部恶性肿瘤，注射腺病毒后肿瘤有不同程度缩小，但治疗后肿瘤易复发，效果难以持久；直到1996年，Bisc hoff等首次报道去除部分E1B的重组腺病毒Onyx-015能在p53异常的肿瘤细胞选择性复制引起肿瘤杀伤作用，溶瘤腺病毒研究才再次受到广泛关注并且发展迅速，因此出现了许多新型溶瘤腺病毒种类，医药界利用其特性一直致力于将溶瘤病毒开发上市成为治疗药品。

已在中国上市的针对鼻咽癌的腺病毒H101(安柯瑞)、美国FDA批准上市的针对黑色素瘤的单纯疱疹病毒Imlygic(talimogene laherparepvec)等。此外，还有多个溶瘤病毒疗法的临床试验正在进行中，具体如附图8的表格所示。

事实上，所有上市和正处于临床前的溶瘤病毒研发项目的给药方式大都是皮下注射，对应的适应症也都是实体瘤，这是因为需要通过注射的方式将病毒制剂直接注射到肿瘤部位。

由于种种原因，特别是溶瘤病毒作为免疫系统的异物，在进入实体肿瘤组织后会被免疫系统发现而被消灭或排除出去，因此溶瘤病毒在体内起效的时间有限，为此必须多次或较大量的在肿瘤部位进行注射给药。

对于血液癌症，由于T淋巴细胞或B淋巴细胞在于循环的血液系统中，溶瘤病毒必须在血液系统中循环后才能起效，然而作为免疫系统的异物，溶瘤病毒必然受到免疫系统的攻击，因此其作用时间相对于实体瘤必然更短，正因为如此，市面上没有治疗血液癌的溶瘤病毒上市，也没有相关的临床研发项目。

发明内容

为了强化溶瘤病毒的杀灭肿瘤的效果，目前使用溶瘤病毒治疗肿瘤的策略之一是将溶瘤病毒进行基因改造，携带具有治疗肿瘤意义的基因，并将这类基因导入肿瘤细胞中特异性的表达相关蛋白。利用表达出的蛋白或者抗体的抑瘤特性，联合治疗肿瘤。

溶瘤病毒构建设计的关键因素是考虑转染基因的表达时间和病毒复制导致的破裂时间。发明人设想可通过使用早期启动子基因转录保证靶向蛋白在病毒复制导致的肿瘤破裂前高表达，然后给予靶向蛋白或酶激活的化疗药物，使得化疗药物进入溶瘤病毒侵染后能在高表达的靶向蛋白或酶的激活下发挥药效，释放出细胞毒素而直接毒杀癌细胞，这样通过整合有特定靶向蛋白基因的溶瘤病毒侵染癌细胞，然后再给予靶向蛋白或酶激活的化疗药物，溶瘤病毒只需要侵染癌细胞而不需要最终裂解癌细胞就可以在靶向蛋白或酶激活的化疗药物的作用下杀灭癌细胞，因此溶瘤病毒的给药量可以大大减少，对于人体免疫系统的影响也更小，最终的结果是通过整合有特定靶向蛋白基因的溶瘤病毒和靶向蛋白或酶激 活的化疗药物的联合使用或复方，能大大提高溶瘤病毒抗癌的效果。

化疗药物历史长，疗效得到了长期验证，但具有副作用大的缺点。通过将化疗药物改造设计为前药来减少毒副作用是一个重要的方向。化疗药物经过结构改造后得到的前药是一类在体外活性较小或者无活性，在体内经酶或非酶作用，释放出活性物质而发挥药理作用的化合物为前药。在大多数情况下，前药是简单的化学衍生物，经一步或两部化学或酶催化可以转变为有活性的母体药物。

上述靶向蛋白或酶激活的化疗药物包括靶向酶激活的大分子抗肿瘤前药和靶向酶激活的小分子抗肿瘤前药。靶向酶激活的大分子抗肿瘤前药，在ADEPT(Antibody-Directed En zyme Prodrug Therapy)中，施用的酶抗体与抗原呈递靶细胞的表面。随后，施用被该酶激活的前药，导致有毒药物的形成。在大多数情况下，有毒药物必须穿透细胞膜才能使细胞死亡。在某些情况下，该药物可导致细胞死亡而不穿透细胞膜(例如海葵毒素palytoxin)(Rooseboom M,Commandeur J N M,Vermeulen N P E.Enzyme-Catalyzed Activation of Anticancer Prodrugs[J].Pharmacological Reviews,2004,56(1):53-102，DOI：10.1 124/pr.56.1.3)。

靶向酶激活的小分子抗肿瘤前药，其可以通过与导入肿瘤部位的外源性酶或肿瘤细胞内表达的酶(GDEPT和VDEPT，Gene-Directed Enzyme Prodrug Therapy和Virus directed enzyme prodrug therapy)即靶向酶相互作用，从而转化为细胞毒药物。靶向酶激活的小分子抗肿瘤前药可提高抗肿瘤药物的靶向性，而溶瘤病毒中整合的表达靶向酶基因能使得癌细胞表达更高水平的能够激活前药的靶向酶，从而更好的发挥靶向酶激活的小分子抗肿瘤前药的抗肿瘤效果并降低毒副作用。

有多种前药被特定的酶所激活。这些酶包括内生性的酶以及外源性的酶。

内生性的酶包括氧化还原酶类Oxidoreductases、转移酶类Transferases、水解酶类Hydrolases、裂解酶类Lyases。

氧化还原酶类Oxidoreductases包括醛脱氢酶Aldehyde oxidase、氨基酸氧化酶类Amino acid oxidase、细胞色素P450还原酶Cytochrome P450 reductase、DT-黄递酶DT-Diaphorase、细胞色素P450 Cytochrome P450、酪氨酸酶Tyrosinase等。

转移酶类Transferases包括胸苷酸合成酶Thymidylate synthase、胸苷磷酸化酶Thymidine phosphorylase、谷胱甘肽S-转移酶Glutathione S-Transferase、脱氧胞苷激酶Deoxycytidine kinase等。

水解酶类Hydrolases包括羧酸酯酶Carboxylesterase、碱性磷酸酶Alkaline phosphatase、β葡萄糖醛酸苷酶β-Glucuronidase等。

由人体内生的靶向酶激活的抗肿瘤前药的情况如下表1所示。

表1：由人体内生的靶向酶激活的抗肿瘤前药(下列中的酶均为人源的酶)

外源性的酶包括硝基还原酶类Nitroreductase、嘌呤核苷磷酸化酶Purine-nucleoside phosphorylase、胸苷激酶类Thymidine kinase、碱性磷酸酶Alkaline phosphatase、β葡萄糖醛酸苷酶β-Glucuronidase、羧肽酶类Carboxypeptidase、青霉素酰胺酶类Penicillin amidase、β内酰胺酶类β-Lactamase、胞嘧啶脱氨酶Cytosine deaminase、蛋氨酸γ裂解酶Methionineγ-lyase等。

由并非人体具有通过介入手段(ADEPT、GDEPT和VDEPT)介入的外源性的靶向酶激活的抗肿瘤前药的情况如下表2所示。

表2：外源的靶向酶激活的抗肿瘤前药(下列中的酶均为非人源的酶)

上述表1/2的内容参见Rooseboom M,Commandeur J N M,Vermeulen N P E.Enzyme-Catalyzed Activation of Anticancer Prodrugs[J].Pharmacological Reviews,2004,56(1):53-102，DOI：10.1124/pr.56.1.3及其他专业文献。

外文及外文缩写注释：

5-Ethynyl-2(1H)-pyrimidinone，即5-乙炔基-2(1H)-嘧啶酮

5-Ethynyluracil，即5-乙炔尿嘧啶

IPdR，即Ropidoxuridine罗匹昔定

IUdR，即碘脱氧尿苷

5-FP，即5-氟-2-嘧啶酮

5-FU，即5-氟尿嘧啶

5-Ethynyl-2(1H)-pyrimidinone，即5-乙炔基-2(1H)-嘧啶酮

IPdR，即Ropidoxuridine罗匹昔定

5-FP，即5-氟-2-嘧啶酮

d-alanine，即D-丙氨酸

SeCys conjugates，硒代胱氨酸偶联物

Menadione，甲萘醌别名维生素K3

Tirapazamine，即替拉扎明

Mitomycin C，即丝裂霉素C

TH-302，又名Evofosfamide

EO9，即apaziquone，中文名为阿哌喹酮

Streptonigrin，即链黑菌素

CB 1954，即Tretazicar

Diaziquone，即地吖醌

4-Ipomeanol，即4-甘薯黑疱霉醇

Ftorafur(tegafur)，即替加氟

Dacarbazine，即达卡巴嗪

Trofosfamide，即曲磷胺

Ifosfamide，即异环磷酰胺

Cyclophosphamide，即环磷酰胺

AQ4N，即banoxantrone，中文名为巴诺蒽醌，CAS号为136470-65-0

2,4-Dihydroxyphenylalanine，即2,4-二羟基苯丙氨酸

4-S-CAP，即4-S-cysteaminylphenol，中文名为4-S-半胱氨酰苯酚

GHB，即γ-L-glutaminyl-4-hydroxybenzene，中文名为γ-L-谷氨酰胺-4-羟基苯

BVdUMP，即(E)-5-(2-bromovinyl)-2-deoxyuridine 5-monophosphate，中文名为(E)-5-(2-溴乙烯基)-2-脱氧尿苷5-单磷酸酯

NB1011，即(E)-5-(2-bromovinyl)-2-deoxy-5-uridylphenyl-L-methoxyalaninylphosphoramidate

5’-DFUR，即5-deoxy-5-fluorouridine，又名Doxifluridine，中文名为去氧氟尿苷

Capecitabine，即卡培他滨

TER286，即[γ-glutamyl-α-amino-β(2-ethyl-N,N,N′,N′-tetrakis(2-chloroethyl)phosphorodiamidate)-sulfonyl-propionyl-(R)-(-)phenylglycine]，无合适中文翻译

S-CPHC-ethylsulfoxide，S-(N-p-chlorophenyl-N-hydroxycarbamoyl)ethylsulfoxide，无合适中文翻译

PTA，即cis-3-(9H-purin-6-ylthio)acrylic acid，可中文翻译为顺-3-(9H-嘌呤-6-硫基)丙烯酸

Cytarabine，即阿糖孢苷

Pentostatin，即喷司他丁

Cladribine，即克拉屈滨

Gemcitabine，即吉西他滨

Fludarabine，即氟达拉滨

Ancitabine，即安西他宾

Enocitabine，即依诺他宾

Decitabine，即地西他滨

Azacitidine，即阿扎胞苷

Nelarabine，即奈拉滨

CPT-11，即Irinotecan，中文名伊立替康

paclitaxel-2-ethylcarbonate，中文名紫杉醇-2-乙基碳酸酯

Capecitabine，即卡培他滨

Tertiary amidomethylesters，即叔胺基甲酯

Amifostine，即氨磷汀

3-AP phosphate，即3-amino-pyridine-2-carboxaldehyde thiosemicarbazone的磷酸酯

BHAMG，tetra-n-butyl ammonium salt of(p-di-2-chloroethylaminophenyl-β-D-glucopyranoside)uronic acid，无合适的中文翻译， 结构为 其中

Epirubicin-glucuronide，即表柔比星-葡糖醛酸偶联物。

HMR 1826，该化合物的CAS号为148580-25-0，为葡糖醛酸与阿霉素的偶联物

DNR-GA3，即N-[4-daunorubicin-N-carbonyl-(oxymethyl)-phenyl]O-β-glucuronyl carbamate，也称为glucuronidated daunorubicin，为柔红霉素与赤霉素的偶联物；

DOX-GA3，即N-[4-doxorubicin-N-carbonyl(oxymethyl)phenyl]O-beta-glucuronyl carbamate也称为glucuronidated doxorubicin，为阿霉素与赤霉素的偶联物；

Paclitaxel glucuronide，Glucuronic acid-derived paclitaxel compound，中文翻译为葡萄糖醛酸衍生紫杉醇化合物

5-FU glucuronide，5-FU的葡糖醛酸衍生物。

Glufosfamide，即葡磷酰胺

PC，即S-(6-purinyl)-L cysteine，中文翻译为S-(6-嘌呤基)-L半胱氨酸

GC，即S-(guanin-6-yl)-L-cysteine，中文翻译为S-(鸟苷-6-基)-L-半胱氨酸

SeCys conjugate，即selenocysteine Se conjugates，中文翻译为硒代半胱氨酸硒结合物

5-Ethynyluracil，即5-乙炔尿嘧啶

IUdR，即即碘脱氧尿苷

5-FU，即5-Fluorouracil，中文名为5-氟脲嘧啶

Hydrogen peroxide，即过氧化氢。

Selenols and hydrogen peroxide，硒醇与过氧化氢

Semiquinone radical，即半醌自由基

Nitroxide radical，即一氧化氮自由基

Quinone methide intermediate，中文翻译为甲基苯醌中间体

5-(Aziridin-1-yl)-4-hydroxyl-amino-2-nitrobenzamide，中文翻译为5-(叠氮基-1-基)-4-羟基氨基-2-硝基苯甲酰胺，CAS号为119643-82-2

HMMTIC，produce5-(3-hydroxymethyl-3-methyl-triazen-1-yl)imidazole-4-carboxamide

Trofosfamide mustard，即曲磷胺芥子结构

Isophosphamide mustard，即异环磷酰胺芥子结构

Phosphoramide mustard，即磷酰胺芥子结构

AQ4，即1,4-bis-{[2-(dimethylamino)ethyl]amino-5,8-dihydroxyanthracene-9,10-Dione，化学结构为

6-Hydroxydopa，即6-羟基多巴

BQ，即dihydro-1,4-benzothiazine-6,7-dione，可翻译为二氢-1,4-苯并噻嗪-6,7-二酮

GBQ，即γ-l-glutaminyl-3,4-benzoquinone，可翻译为γ-l-谷氨酰胺-3,4-苯醌

dUMP，即2’-Deoxyuridine-5’-monophosphate，中文名为2'-脱氧尿苷-5'-单磷酸

Aziridinium agent，即氮丙啶阳离子盐结构试剂，具有以下的化学结构

S-CPHC-glutathione，即S-(N-p-chlorophenyl-N-hydroxycarbamoyl)glutathione，中文可翻译为S-(N-对氯苯基-N-羟基氨基甲酰基)谷胱甘肽

6-MP，即6-mercaptopurine，即6-巯基嘌呤

triphosphate metabolites，即三磷酸代谢物

SN-38，CAS登记号为86639-52-3

Paclitaxel，即紫杉醇

Carboxylic acids and amines，即羧酸与胺

WR-1065，即胺硫醇，结构式为

3-AP，即3-amino-pyridine-2-carboxaldehyde thiosemicarbazone，CAS登记号为143621-35-6

pHAM，即N,N-di-(2-chloroethyl)-p-hydroxyaniline mustard，可翻译为N，N-二(2-氯乙基)-对羟基苯胺氮芥

Epirubicin，即表柔比星

Doxorubicin，即阿霉素

Daunorubicin，即柔红霉素

mustard agent ifosforamide，即异环磷酰胺对应的氮芥结构

6-Thioguanine，即6-硫鸟嘌呤

Selenol，即硒醇

CB 1954，即5-(aziridin-1-yl)-2,4-dinitrobenzamide，又名 _{Tretazicar，CAS登记号为21919-05-1}

4-Ipomeanol，CAS登记号为32954-58-8

MeP-dR，即9-(β-2-deoxyerythropentofuranosyl)-6-methylpurine (6-methylpurine-2-deoxyribonucleoside)，中文翻译为6-甲基嘌呤-2′-脱氧核糖核苷

Ganciclovir，即更昔洛韦，又名丙氧鸟苷

Etoposide phosphate，即磷酸依托泊苷

Mitomycin C phosphate，即p-[N,N-bis(2-chloroethyl)amino]phenyl phosphate,丝裂霉素C磷酸酯

POMP，即p-(N,N-bis(2-chloroethyl)amino)phenyl phosphate，中文可翻译为对-(N，N-双(2-氯乙基)氨基)磷酸苯酯

N-(4-phosphonooxy)-phenylacetyl)doxorubicin，可翻译为N-(4-膦酰氧基)-苯乙酰基)阿霉素

Glucuronidated Nornitrogen mustard，即葡萄糖醛酸化的氮芥结构

Glucuronidated 9-amino-camptothecin，即葡萄糖醛酸化的9-氨基喜树碱

Glucuronide mustard，即葡糖苷酸氮芥结构

Methotrexate-amino acids，即甲氨蝶呤氨基酸

CMDA，即4-[N-(2-chloroethyl)-N-[2-(mesyloxy)ethyl]amino]benzoyl-L-glutamic acid，CAS号为122665-73-0

DPO，即doxorubicin-N-p-hydroxyphenoxyacetamide，可翻译为阿霉素-N-对羟基苯氧基乙酰胺

MelPO，即melphalan-N-p-hydroxyphenoxyacetamide，可翻译为美法仑-N-对羟基苯氧基乙酰胺

NHPAP，即N-(4’-hydroxyphenylacetyl)palytoxin，可翻译为N-(4，-羟苯基乙酰基)海葵毒素

N-(phenylacetyl)doxorubicin，即N-(苯乙酰基)阿霉素

N-(phenylacetyl)melphalan，即N-(苯乙酰基)美法仑

LY 266070，CAS号为137848-36-3

C-DOX，又名BMY46633，为cephalosporin doxorubicin prodrug，结构式为 (参见文献Evans LE,Krishna A,Ma Y,et al.Exploitation of Antibiotic Resistance as a Novel Drug Target:Development of aβ-Lactamase-Activated Antibacterial Prodrug.J Med Chem.2019；62(9):4411-4425.doi:10.1021/acs.jmedchem.8b01923)

PRODOX，化学结构为

CM，即7-(phenylacetamido)-cephalosporin mustard，可翻译为7-(苯乙酰胺基)头孢菌素氮芥结构

CCM，即7-(4-carboxybutanamido)-cephalosporin mustard，可翻译为7-(4-羧基丁酰胺基)-头孢菌素氮芥结构

Cephalosporin-DACCP，即头孢菌素与4’-carboxyphthalato(1,2-cyclohexanediamine)platinum，可翻译为4，-羧基邻苯二甲酸(1,2-环己二胺)铂偶联化合物，参见文献Hanessian,Stephen,and J.Wang."Design and synthesis of a cephalosporincarboplatinum prodrug activatable by a-lactamase."Canadian Journal of Chemistry(1993)，具体结构为

PROTAX，结构式为 (参见文献Evans LE,Krishna A,Ma Y,et al.Exploitation of Antibiotic Resistance as a Novel Drug Target:Development of a β-Lactamase-Activated Antibacterial Prodrug.J Med Chem.2019；62(9):4411-4425.doi:10.1021/acs.jmedchem.8b01923)

Cephalosporin mitomycin C，即头孢菌素丝裂霉素C

C-Mel，即cephalosporin melphalan偶联化合物，化学结构为

5-Fluorocytosine，即5-氟胞嘧啶

Selenomethionine，即硒蛋氨酸

Trifluoromethionine，即三氟蛋氨酸

5-(Aziridin-1-yl)-4-hydroxyl-amino-2-nitro-benzamide，可翻译为5-(叠氮基-1-基)-4-羟基氨基-2-硝基苯甲酰胺，化学结构为

Isophosphoramide mustard，即异磷酰胺氮芥

Phosphoramide mustard，即磷酰胺氮芥

2-Fluoroadenine，即2-氟肾上腺素

MeP，即6-methylpurine，翻译为6-甲基嘌呤

Ganciclovir-triphosphate nucleotide，即更昔洛韦三磷酸核苷酸

Etoposide，即依托泊苷

Mitomycin C，即丝裂霉素C

POM，即p-(N,N-bis(2-chloroethyl)amino)phenol，翻译为对-(N，N-双(2-氯乙基)氨基)苯酚

Doxorubicin，即阿霉素

Oxazolidinone，即恶唑烷酮

9-Aminocamptothecin，即9-氨基喜树碱

Mustard，氮芥结构

Methotrexate，即氨蝶呤

Benzoic acid mustard，即苯甲酸氮芥

Melphalan，即美法仑

Palytoxin，即海葵毒素

DAVLBHYD，即4-desacetylvinblastine-3-carboxylic acid hydrazide，可翻译为4-去乙酰长春碱-3-羧酸酰肼

Phenylenediamine mustard，即苯二胺氮芥

DACCP，即4’-carboxyphthalato(1,2-cyclohexanediamine)platinum，可翻译为4’-羧基邻苯二甲酸(1,2-环己二胺)铂

Taxol，即紫杉醇

Methylselenol，即甲基硒醇

CSF2，即二氟硫化碳

特别的，醛酮还原酶1C3,AKR1C3(EC：1.1.1.188)激活的抗肿瘤前药在以下专利中公开：

1)DNA烷化剂，对应PCT申请号PCT/US2016/021581，公开号WO2016/145092A，对应中国申请号2016800150788，公开号CN107530556A；

2)(R)-及(S)-1-(3-(3-N,N-二甲基胺基羰基)苯氧基-4-硝苯基)-1-乙基-N,N’-双(伸乙基)胺基磷酸酯、组合物及其使用及制备方法，对应PCT申请号PCT/US2016/062114，公开号WO2017087428A1，对应中国申请号2016800446081，公开号CN108290911A中的S构型化合物；

3)硝基苄基衍生物抗癌试剂，对应PCT申请号PCT/US2016/025665，公开号WO2016/161342，对应中国申请号2016800200132，公开号CN108136214A；

4)通过AKR1C3激活的前药化合物及其治疗过度增殖性失调的用途，对应的PCT申请号PCT/NZ2019/050030，公开号WO2019190331，对应中国申请号201980023423.6，公开号CN111918864A。

5)含氟化合物及医药用途，对应PCT申请号好PCT/CN2020/089692，公开号WO2020/228685。

6)三环ARK1C3依赖性KARS抑制剂，对应的PCT申请号PCT/IB2020/057285，公开号WO2021005586A1，对应的中国申请号CN202080053804.1，公开号CN114206870A。

7)靶向醛酮还原酶1C3的苯并二氢吡喃类化合物，对应的PCT申请号PCT/CN2020/120281，公开号WO2021068952A1。

上述7个专利申请中公开的化合物均为AKR1C3酶激活的抗肿瘤/抗癌前药。

醛酮还原酶1C3(英文简称为AKR1C3，EC：1.1.1.188)激活的抗肿瘤前药应满足以下条件：

在存在AKR1C3抑制剂(如上述三个专利1/2/3中公开的TH-3021，Flanagan等人，Bioorganic and Medicinal Chemistry(2014)第962-977页中的化合物36即 )的环境下，检测得到的某化合物的癌细胞增殖抑制作用小于不存在AKR1C3抑制剂(如上述三个专利中公开的TH-3021)的环境下检测得到的该化合物的癌细胞增殖抑制作用，如癌细胞增殖抑制作用使用IC50进行量化，则如果某个化合物对某个癌细胞系在存在AKR1C3抑制剂时检测得到的IC50大于不存在AKR1C3抑制剂时检测得到的IC50，则可以判定该化合物为AKR1C3激活的抗癌药物。其差值越大，AKR1C3激活的特异性越高。

前药形式的上述化合物在癌细胞特殊的微环境中通过AKR1C3的催化而发生还原，得到具有细胞毒性的毒素而发挥癌细胞毒杀作用。

特别的，中文名为(S)-1-(3-(3-N,N-二甲氨基羰基)苯氧基-4-硝基苯基)-1-乙基-N,N'-双(亚乙基)氨基磷酸酯，也称为AST-3424、OBI-3424、TH-3424、AST-106)，CAS号为2097713-69-2，其结构如下：

已在中国和美国进行I/II期临床试验。

细胞色素P450还原酶cytochrome P450 reductase(EC：1.6.2.4)激活的抗肿瘤前药以 TH-302、PR-104等为代表，都是在乏氧条件和细胞色素P450还原酶共同作用下激活的，因此下列乏氧活化的抗癌前药(HAP，Hypoxia Activated Prodrugs)专利申请在以下专利中公开：

1)氨基磷酸酯烷化剂前体药物，对应PCT申请号PCT/US2006/025881，公开号WO2007/002931，对应中国申请号200680030082.8，公开号CN101501054A；

2)含有DNA烷化剂的氮丙啶，对应PCT申请号PCT/US2016/039092，公开号WO2016/210175，对应中国申请号201680036898.5，公开号CN108024974A；

上述2个专利申请中公开的化合物均为细胞色素P450还原酶cytochrome P450 reductase(EC：1.6.2.4)激活的抗肿瘤/抗癌前药。

细胞色素P450还原酶cytochrome P450 reductase(EC：1.6.2.4)激活的抗肿瘤前药应满足以下条件：

在乏氧的环境下，检测得到的某化合物的癌细胞增殖抑制作用大于常氧的环境下检测得到的该化合物的癌细胞增殖抑制作用，如癌细胞增殖抑制作用使用IC50进行量化，则如果某个化合物对某个癌细胞系在常氧环境检测得到的IC50大于乏氧环境时检测得到的IC50，则可以判定该化合物为乏氧激活的抗癌药物。其差值越大，乏氧激活的特异性越高。

另外，对于以往认为是乏氧激活的前药PR-104，经深入研究已证明其亦被硝基还原酶(nitroreductase，NTR)活化(Singleton,D.C.,Mowday,A.M.,Guise,C.P.et al.Bioreductive prodrug PR-104 improves the tumour distribution and titre of the nitroreductase-armed oncolytic adenovirus ONYX-411NTR leading to therapeutic benefit.Cancer Gene Ther(2021).https://doi.org/10.1038/s41417-021-00409-2)，因此硝基还原酶,nitroreductase激活的抗肿瘤前药，这些前药结构类似于PR-104，其在以下专利中公开：

1)基于硝基苯胺的烷化剂和它们作为前体药物的用途，对应的PCT申请号PCT/NZ2003/000225，公开号WO2004/033415A1，对应中国申请号200380102812.7，公开号CN1711236A；

2)新的硝基苯基氮芥和硝基苯基氮丙啶醇以及它们相应的磷酸酯和作为靶向细胞毒素剂的用途，对应PCT申请号PCT/NZ2004/000275，公开号WO 2005/042471，对应中国申请号200480039430.9，公开号CN1902159A。

前药形式的上述化合物在癌细胞特殊的微环境中(肿瘤由于增殖快，因而中肿瘤的癌细胞中会由于供氧不足而发生缺氧即肿瘤的癌细胞会处于乏氧环境)会在乏氧和细胞色素P450还原酶cytochrome P450 reductase(EC：1.6.2.4)催化而发生还原((参见Meng et al,Molecular and Cellular Pharmacology of the Hypoxia-Activated Prodrug TH-302,MCT,2012(11):740；DOI:10.1158/1535-7163.MCT-11-0634))，得到具有细胞毒性的毒素而发挥癌细胞毒杀作用。

葡磷酰胺(glufosfamide)，化学名为β-D-吡喃葡萄糖基-N，N′-二(2-氯乙基)磷酰胺，英文名为β-D-Glucopyranosyl-[N，N′-bis[(2-chloroethyl)]phosphoric acid diamide，为一种新型的烷化剂类抗肿瘤药物，是由一分子具有直接烷化作用的异磷酰胺氮芥与一分子葡萄糖通过糖苷键相连而形成的。葡磷酰胺在钠依赖性的葡萄糖跨膜转运蛋白SAAT1的作用下转运进入肿瘤细胞，然后通过β-葡萄糖醛酸苷酶(EC：3.2.1.31)水解释放异磷酰胺氮芥而发挥活性。

美国Threshold公司于2004年获得该药在美国FDA的快速审批资格，用于治疗以前接受过吉西他滨(gemcitabine)治疗的无法重新切除的局部晚期或转移胰腺癌(W.Steve Ammons,Jin-Wei Wang y,Zhijian Yang y,George F.Tidmarshz and Robert M.Hoffmany，Neoplasia，2007.8,9(8)：625-633)，但2007年该公司宣布作为二线治疗用于转移性胰腺癌患者的Ⅲ期临床试验没有显著增加总的存活率(Tudor E.Ciuleanua，Alexander V.Pavlovskyb，Gyorgy Bodokyc，,Avgust M.Garind，Virginia K.Langmuire，Stewart Krolle，George T.Tidmarshe， A randomised Phase III trial of glufosfamide compared with best supportive care in metastatic pancreatic adenocarcinoma previously treated with gemcitabine，European Journal Of Cancer，45(2009):1589-1596)，现该药尚有多个临床试验在美国进行。

显然，由于以上靶向酶激活的抗肿瘤前药在未活化时细胞毒性较小(抑制癌细胞增殖的IC50值较大)，而在被靶向酶激活后得到活性成分时细胞毒性较大(抑制癌细胞增殖的IC50值较小)基于以上的靶向酶激活的抗肿瘤前药的事实可知，这些前药对患者的治疗效果与患者体内的肿瘤组织或癌细胞表达的靶向酶水平高低以及靶向酶催化激活的特性有关，因此通过提高肿瘤组织或癌细胞表达的靶向酶水平有望能改善靶向酶在肿瘤组织或癌细胞内表达水平低的患者对该靶向酶激活的抗肿瘤前药的用药响应情况，即对于可能因为靶向酶在肿瘤组织或癌细胞内表达水平低的肿瘤或癌症患者，通过干预来选择性的提高肿瘤组织或癌细胞内靶向酶的表达水平有望改善靶向酶激活的抗肿瘤前药的治疗效果并扩展临床应用范围。

为此本申请通过改造溶瘤病毒，在溶瘤病毒的基因组中整合有能够在肿瘤细胞中表达靶向酶的RNA或DNA的编码序列得到重组溶瘤病毒，通过将该重组溶瘤病毒与靶向酶激活的抗肿瘤前药联用来达到改善溶瘤病毒抗肿瘤的效果。

提供一种重组溶瘤病毒，其特征在于，该重组溶瘤病毒为选择复制型溶瘤病毒，并且该重组溶瘤病毒的基因组中整合有能够在肿瘤细胞中表达靶向酶的RNA或DNA的编码序列，靶向酶为能够激活抗肿瘤前药的酶。

这里的靶向酶可以是人体内生的酶，也可以是非人体内生的外源酶，人体内生的酶的具体种类可以参考上表1中的激活的靶向酶及酶分类号EC，非人体内生的外源酶的具体种类可以参考表2中的激活的靶向酶，上述表1/2中列出的酶仅仅是列出的文献报道的可以激活抗肿瘤前药的酶，并不是完全列举。

作为一种优选，该重组溶瘤病毒的基因组中整合有能够在肿瘤细胞中表达下列靶向酶的RNA或DNA的编码序列中的任意一种或多种：

醛酮还原酶，

β-葡萄糖醛酸苷酶(EC：3.2.1.31)，

细胞色素P450还原酶(EC：1.6.2.4)，

脱氧胞苷激酶(EC：2.7.1.74)，

胸苷磷酸化酶(EC：2.4.2.4)。

作为一种优选，该重组溶瘤病毒的基因组中整合有能够在肿瘤细胞中同时表达脱氧胞苷激酶(EC：2.7.1.74)、脱氧鸟苷激酶(EC:2.7.1.113)这两种所述靶向酶的RNA或DNA的编码序列。

进一步的，醛酮还原酶为人源醛酮还原酶家族1，更进一步的，优选为所述人源醛酮还原酶为人源醛酮还原酶家族1成员C3(AKR1C3)。

AKR1C3酶的RNA的编码序列如SEQ ID No.1所示；人源醛酮还原酶的氨基酸编码序列如SEQ ID No.2所示。

特别地，当该重组溶瘤病毒的基因组中整合有能够在肿瘤细胞中表达人源醛酮还原酶家族1成员C3的RNA或DNA的编码序列时，所述抗肿瘤前药选自下式(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)的化合物或其盐、酯、溶剂合物、同位素异构体：

其中，X、Y、Z、R、T、A以及X ¹⁰的定义如专利申请PCT/US2016/021581，公开号WO2016145092A1(对应中国申请号CN201680015078.8，公开号CN107530556A)中的权利要求书所记载；

其中，R ₁、R ₂、R ₃、R ₄、R ₅、R ₈、R ₉、R ₁₀的定义如专利申请PCT/CN2020/089692，公开号WO2020228685A1(对应中国申请号CN202080035889.0，公开号CN113853379A)中的权利要求书所记载；

其中：

A是取代或未经取代的C6-C10的芳基、联芳基或取代的联芳基、5-15元的杂芳基或-N＝CR ¹R ²，其中取代时的取代基选自由以下组成的群：卤基、-CN、-NO ₂、–O-(CH ₂)-O-、-CO ₂H及其盐、-OR ¹⁰⁰、-CO ₂R ¹⁰⁰、-CONR ¹⁰¹R ¹⁰²、-NR ¹⁰¹R ¹⁰²、-NR ¹⁰⁰SO ₂R ¹⁰⁰、-SO ₂R ¹⁰⁰、-SO ₂NR ¹⁰¹R ¹⁰²、C1-C6烷基、C3-C10杂环基；

其中，R ¹⁰⁰、R ¹⁰¹及R ¹⁰²各自独立是氢、C1-C8烷基、C6-C12芳基；或R ¹⁰¹及R ¹⁰²与其附接至的氮原子一起形成5-7元杂环；

其中烷基及芳基各自是经1-3个卤基或1-3个C1-C6烷基取代；

R ¹及R ²各自独立是苯基或甲基；

X、Y及Z各自独立是氢或卤基；

R是氢或C1-C6烷基或卤素取代烷基；

其中，Rw的定义如专利申请PCT/CN2020/120281，公开号WO2021068952A1中的权利要求书所记载；

其中，A、E、G、X、Y的定义如专利申请PCT/NZ2019/050030，公开号WO2019190331A1(对应中国申请号CN201980023423.6，公开号CN111918864A)中的权利要求书所记载；

其中， n、H、Z、R ¹、R ^2a、R ^2b、R ³、R ⁴、R ⁵的定义如专利申请PCT/IB2020/057285，公开号WO2021005586A1(对应中国申请号CN202080053804.1，公开号CN114206870A)中的权利要求书所记载。

特别地，式(1)的抗肿瘤前药选自以下结构化合物：

式(2)的抗肿瘤前药选自以下结构化合物：

式(3)的抗肿瘤前药选自以下结构化合物：

式(4)的抗肿瘤前药选自以下结构化合物：

以及

及

式(5)的抗肿瘤前药选自以下结构化合物：

式(6)的抗肿瘤前药选自以下结构化合物：

式(7)的抗肿瘤前药选自以下结构化合物：

重组溶瘤病毒选自具有溶瘤作用的腺病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、塞姆利基森林病毒、水疱性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒、逆转录病毒、呼肠孤病毒、塞内卡谷病毒、埃可型肠道病毒、柯萨奇病毒、新城疫病毒和马拉巴病毒。

本发明所述的溶瘤病毒包括具有溶瘤作用的经基因突变的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒。

所述具有溶瘤作用的经基因突变的病毒包括选自：腺病毒(adenovirus)、痘病毒(也称痘苗病毒vacciniavirus)、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)、麻疹病毒(measles virus)、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)、水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)和逆转录病毒(retrovirus)。

所述具有溶瘤作用的野生型病毒选自：呼肠孤病毒(reovirus)、水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus)、脊髓灰质炎病毒、塞内卡谷病毒(SenecaValley Virus)、埃可型肠道病毒(echo enterovirus)、柯萨奇病毒(Coxsackie virus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)和马拉巴病毒(maraba virus)。

所述腺病毒选自：人5型腺病毒或人嵌合型腺病毒；具体包括(例如)：Onyx-015(可得自Onyx Pharmaceuticals公司)、H101(可得自上海三维生物技术有限公司)、Ad5-yCD/mutTKSR39rep-hIL12(可得自Henry Ford Health System公司)、CG0070(可得自Cold Genesys公司)、DNX-2401(可得自DNAtrix公司)、OBP-301(可得自Oncolys BioPharma公司)、ONCOS-102(可得自Targovax Oy公司/Oncos Therapeutics公司)、ColoAd1(可得自PsiOxus Therapeutics公司)、VCN-01(可得自VCN Biosciences公司)、ProstAtakTM(可得自Advantagene公司)等。

所述痘病毒选自：Pexa-vac(可得自Jennerex Biotherapeutics公司)、JX-963(可得自Jennerex Biotherapeutics公司)、JX-929(可得自Jennerex Biotherapeutics公司)、VSC20(制备方法可参见科技文献：“McCart,JA,et al.Systemic cancer therapy with a tumor-selective vaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes.Cancer Res(2001)61:875

所述单纯疱疹病毒包括(但不限于)：HSV-1、HSV-2型单纯疱疹病毒；具体包括(例如)： (可得自Amgen公司)、G207(可得自Medigene公司)、HF10(可得自Takara Bio公司)、Seprehvir(可得自Virttu Biologics公司)、OrienX010(可得自北京奥源和力生物公司)、NV1020(可得自Catherax公司)等。

本发明还提供所述重组溶瘤病毒在制备用于治疗肿瘤和/或癌症的药物中的应用，优选的，肿瘤、癌症包括肺癌、非小细胞肺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、骨癌、食道癌、乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌、结肠癌、卵巢癌、膀胧癌、子宫颈癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊性腺癌、囊性癌、髓状癌、支气管癌、骨细胞癌、上皮癌、胆管癌、绒毛膜癌、胚癌、精原细胞癌、维尔姆斯癌、胶质细胞癌、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血细胞瘤、声带神经瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、成视神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、神经纤维瘤、纤维肉瘤、成纤维细胞瘤、纤维瘤、纤维腺瘤、纤维软骨瘤、纤维囊瘤、纤维粘液瘤、纤维骨瘤、纤维粘液肉瘤、纤维乳头状瘤、粘液肉瘤、粘液囊瘤、粘液软骨瘤、粘液软骨肉瘤、粘液软骨纤维肉瘤、粘液腺瘤、 成粘液细胞瘤、脂肉瘤、脂肪瘤、脂肪腺瘤、成脂细胞瘤、脂肪软骨瘤、脂肪纤维瘤、脂肪血管瘤、粘液脂瘤、软骨肉瘤、软骨瘤、软骨肌瘤、脊索瘤、绒毛膜腺瘤、绒毛上皮瘤、成绒毛膜细胞瘤、骨肉瘤、成骨细胞瘤、骨软骨纤维瘤、骨软骨肉瘤、骨软骨瘤、骨囊瘤、骨牙质瘤、骨纤维瘤、骨纤维肉瘤、血管肉瘤、血管瘤、血管脂肪瘤、血管软骨瘤、成血管细胞瘤、血管角质瘤、血管神经胶质瘤、血管内皮瘤、血管纤维瘤、血管肌瘤、血管脂肪瘤、血管淋巴管瘤、血管脂肪平滑肌瘤、血管肌脂瘤、血管肌神经瘤、血管粘液瘤、血管网状内皮瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉芽瘤、淋巴管瘤、淋巴瘤、淋巴粘液瘤、淋巴肉瘤、淋巴管纤维瘤、淋巴细胞瘤、淋巴上皮瘤、成淋巴细胞瘤、内皮瘤、成内皮细胞瘤、滑膜瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤、结缔组织瘤、尤因瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、成平滑肌瘤、平滑肌纤维瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、横纹肌粘液瘤、急性淋巴白血病、急性骨髓性白血病、慢性病贫血、红细胞增多症、淋巴瘤、子宫内膜癌、胶质瘤、结直肠癌、甲状腺癌、尿路上皮癌或多发性骨髓瘤。

由于上述靶向酶激活的抗肿瘤前药对应的活性代谢物都是细胞毒性的化合物，一般而言根据药物的来源和化学结构，分为烷化剂、抗代谢药、抗癌抗生素、植物类药物等，而根据药物对细胞增殖动力学的影响的不同分为细胞周期特异性药物和细胞周期非特异性药物，上述多数烷化剂及抗癌抗生素均为细胞周期非特异性药物，而大部分抗代谢和植物抗癌药均为细胞周期特异性药物，他们均能广谱的抑制癌细胞的增殖。

但由于各种不同癌细胞内，对于靶向酶的表达水平不同，因此不同靶向酶激活的前药对于不同的肿瘤或癌症可能具有不同的效果。以AKR1C3激活的抗肿瘤前药AST-3424为例，不同的肿瘤组织内AKR1C3的表达水平有较大的差异，据文献(Harvey D J,Singleton R S,Dachs G U,et al.The Bioreductive Prodrug PR-104A Is Activated under AerASTc Conditions by Human Aldo-Keto Reductase 1C3[J].Cancer Research,2010,70(4):1573.)统计2700份肿瘤组织样本分析可知，AKR1C3在肝癌、胃癌、食道癌、膀胱癌等具有较高表达，而在小细胞肺癌、乳腺癌、白血病、前列腺癌中具有较低表达。因此，单用AKR1C3激活的抗肿瘤前药AST-3424治疗肝癌、胃癌、食道癌、膀胱癌等AKR1C3具有较高表达的癌症患者可能有较好的效果，而对于小细胞肺癌、乳腺癌、白血病、前列腺癌等AKR1C3具有较低表达的癌症患者应该联用上述重组溶瘤病毒或联用上述整合有AKR1C3酶基因的重组溶瘤病毒具有更好的治疗效果。

还提供一种药物组合物，其中该药物组合物包括作为活性成分的上述重组溶瘤病毒，及可药用辅料。

药用辅料系指生产药品和调配处方时使用的赋形剂和附加剂；是除活性成分以外，在安全性方面已进行了合理的评估，且包含在药物制剂中的物质。药用辅料除了赋形、充当载体、提高稳定性外，还具有增溶、助溶、缓控释等重要功能，是可能会影响到药品的质量、安全性和有效性的重要成分。

对于重组溶瘤病毒而言，多开发为注射给药的剂型，注射给药一般要求等渗、等溶，对应的剂型可以是即用注射液、浓缩注射液或者是冻干粉，由于注射给药的剂型不同，药用辅料的类型也不同。

以中国境内上市的上海三维生物技术有限公司生产的重组人5型腺病毒注射液(Recombinant Human Adenovirus Type 5 Injection，商标名安科瑞)为例，其为乳白色混悬液。根据其申请的中国专利CN1640496A重组腺病毒冻干制剂及制备方法所公开的内容可知：

重组腺病毒冻干制剂是由体积比为重组腺病毒∶保护剂＝1∶(0.8-1.2)配制成的水溶液经冷冻干燥后获得的制剂，其中保护剂包含动物胶、糖、无机盐及pH为7.2-8.0氨基酸培养平衡盐。动物胶选自明胶、骨胶或皮胶等；糖选自蔗糖、甘露醇、海藻糖、乳糖、麦芽糖中的一种或多种；无机盐选自氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钙、氯化镁中的一种或多种；氨基酸培养基平衡盐选自市售的基础氨基酸培养基(Dulbecco’ s Modified Eagle Medium，简称D-MEM)平衡盐。

冻干制剂保护剂中采用的动物胶及糖可起到支架作用，若添加海藻糖可提高活病毒制剂的热稳定性；采用的无机盐为调节制剂的pH值及等渗点，以满足生理适应性要求及药物安全、稳定、有效的要求；采用的pH值为7.2-8.0的氨基酸培养基平衡盐为助溶剂，以增加腺病毒的溶解度，增强稳定性。

保护剂中还可添加其他成份：助溶剂如尿素、味精等；抗氧增效剂如L-半胱氨酸等；以进一步提高制剂的稳定性。

保护剂各组份优选的最终重量体积(w/v)浓度为动物胶0.5-2.0％，糖1.5～21.5％，无机盐0.1～12％，氨基酸培养平衡盐0.5～2％。

保护剂优选的配方组成为(w/v)蔗糖1.5-5.5％，甘露醇4.5-10.5％，明胶0.5-2.0％，L-半胱氨酸0.03-0.15％，海藻糖1.5-5.5％，氯化钾0.1-0.3％，磷酸二氢钾0.1-0.3％，PH值为7.2-8.0的基础氨基酸培养基(D-MEM)平衡盐0.5～2％，氯化钠3.5～8.5％，磷酸氢二钠1.2～2.9％，尿素0.4～1.2％，味精0.4～1.2％，其余为电阻率＝18.2MΩ/cm的纯水。

上述制剂中使用的保护剂即为药用辅料，其由动物胶、糖、无机盐、氨基酸培养基平衡盐组成，其中动物胶及糖可起到支架作用，无机盐用于调节制剂的pH值及等渗点，氨基酸培养基平衡盐为助溶剂，以增加腺病毒的溶解度，增强稳定性。

本发明提供一种药物组合物，该药物组合物包括重组溶瘤病毒和靶向酶激活的抗肿瘤前药，该重组溶瘤病毒的基因组中整合有能够在肿瘤细胞中表达靶向酶的RNA或DNA的编码序列，靶向酶为能够激活抗肿瘤前药的酶。

该药物组合物有两种类型：重组溶瘤病毒和靶向酶激活的抗肿瘤前药组成复方或重组溶瘤病毒和靶向酶激活的抗肿瘤前药各自单独包装构成药盒。

当重组溶瘤病毒和所述靶向酶激活的抗肿瘤前药各自独立地存在于所述药物组合物中而互不混合即重组溶瘤病毒和靶向酶激活的抗肿瘤前药各自单独包装构成药盒，这种情况类似于在中国市场上市的 (拜耳医药保健有限公司启东分公司，氨酚伪麻美芬片Ⅱ，中国药品批准文号国药准字H10940250，英文名Paracetamol,Pseudoephedrine Hydrochloride and Dextromethorphan Hydrobromide Tablets Ⅱ，White and Black)其将以上述重组溶瘤病毒为活性成分的药物(优选为注射给药剂型)和以上述靶向酶激活的抗肿瘤前药为活性成分的药物(优选为注射给药剂型或口服、舌下含服剂型)共同包装在一个药盒中(优选的溶瘤病毒注射液可以使用预灌封注射器分装)，并附上给药的说明。

溶瘤病毒通过瘤内注射给药或静脉注射给药，抗肿瘤前药静脉注射给药或口服给药。

而当重组溶瘤病毒和靶向酶激活的抗肿瘤前药组成复方时，可以考虑使用注射给药的方式，将重组溶瘤病毒和靶向酶激活的抗肿瘤前药共同作为药物的活性成分物理混合后通过制剂技术整合为复方注射剂，优选的，复方注射剂可以是乳剂(油包水或水包油)也可以说混悬剂等，通过使用特定的制剂技术使得重组溶瘤病毒进入癌细胞后起效再使得靶向酶激活的抗肿瘤前药进入癌细胞而起效。

本发明还提供一种药物组合物，该药物组合物包括重组溶瘤病毒和靶向酶激活的抗肿瘤前药，该重组溶瘤病毒的基因组中整合有能够在肿瘤细胞中表达靶向酶的RNA或DNA的编码序列，靶向酶为能够激活抗肿瘤前药的酶，肿瘤患者或癌症患者为肿瘤组织或癌细胞的靶向酶表达低的患者。

本发明还提供一种药物组合物，该药物组合物包括重组溶瘤病毒和靶向酶激活的抗肿瘤前药，该重组溶瘤病毒的基因组中整合有能够在肿瘤细胞中表达靶向酶的RNA或DNA的编码序列，靶向酶为能够激活抗肿瘤前药的酶，靶向酶激活的抗肿瘤前药对癌细胞增殖的抑制能力大小与所述靶向酶在肿瘤患者或癌症患者的肿瘤组织内或癌细胞内表达水平高低正相关。

抗肿瘤前药对患者的治疗效果与患者体内的肿瘤组织或癌细胞表达的靶向酶水平高低，靶 向酶催化激活，以及对释放毒素的敏感性密切相关，即当该靶向酶的表达水平高低即该靶向酶在癌细胞内或肿瘤组织内的浓度与催化前药转化为活性药物成分的反应速度正相关的情况下，通过提高靶向酶的表达水平即浓度才能更好的促进该肿瘤前药的抗肿瘤效果，因此当靶向酶激活的抗肿瘤前药对癌细胞增殖的抑制能力大小(癌细胞增殖抑制IC50值)与所述靶向酶在肿瘤患者或癌症患者的肿瘤组织内或癌细胞内表达水平高低(肿瘤组织内或癌细胞内含有的靶向酶含量)呈正相关时，将重组溶瘤病毒和靶向酶激活的抗肿瘤前药联合用药或复方制剂后用药才能取得最优的效果，这种情况下通过提高肿瘤组织或癌细胞表达的靶向酶水平才能更好改善靶向酶在肿瘤组织或癌细胞内表达水平低的患者对该靶向酶激活的抗肿瘤前药的用药响应情况，即对于可能因为靶向酶在肿瘤组织或癌细胞内表达水平低的肿瘤或癌症患者，通过施加重组溶瘤病毒干预来选择性的提高肿瘤组织或癌细胞内靶向酶的表达水平可以改善靶向酶激活的抗肿瘤前药的治疗效果。

申请人对于AKR1C3酶活化的抗肿瘤前药AST-3424对于不同AKR1C3酶表达水平的肿瘤细胞系做了测定研究，结果如下表3/4/5所示。

作为一种优选，在上文列举的部分靶向酶以及靶向酶激活的抗肿瘤前药中，优选出以下的重组溶瘤病毒与靶向酶激活的抗肿瘤前药组合：

由基因组中整合有能够在肿瘤细胞中表达醛酮还原酶1C3(EC：1.1.1.188)的RNA或DNA的编码序列的重组溶瘤病毒与醛酮还原酶1C3(EC：1.1.1.188)激活的抗肿瘤前药进行组合；或

由基因组中整合有能够在肿瘤细胞中表达β-葡萄糖醛酸苷酶(EC：3.2.1.31)的RNA或DNA的编码序列的重组溶瘤病毒与β-葡萄糖醛酸苷酶(EC：3.2.1.31)激活的小分子抗肿瘤前药进行组合；或

由基因组中整合有能够在肿瘤细胞中表达细胞色素P450还原酶(EC：1.6.2.4)的RNA或DNA的编码序列的重组溶瘤病毒与细胞色素P450还原酶(EC：1.6.2.4)激活的抗肿瘤前药进行组合；或

由基因组中整合有能够在肿瘤细胞中表达脱氧胞苷激酶(EC：2.7.1.74)的RNA或DNA的编码序列的重组溶瘤病毒与脱氧胞苷激酶(EC：2.7.1.74)激活的抗肿瘤前药进行组合；或

由基因组中整合有能够在肿瘤细胞中表达胸苷磷酸化酶(EC：2.4.2.4)的RNA或DNA的编码序列的重组溶瘤病毒与胸苷磷酸化酶(EC：2.4.2.4)激活的抗肿瘤前药进行组合；或

由基因组中整合有能够在肿瘤细胞中表达脱氧胞苷激酶(EC：2.7.1.74)、脱氧鸟苷激酶(EC:2.7.1.113)的RNA或DNA的编码序列的重组溶瘤病毒与脱氧胞苷激酶(EC：2.7.1.74)、脱氧鸟苷激酶(EC:2.7.1.113)共同激活的抗肿瘤前药物进行组合。

进一步的，所述醛酮还原酶1C3(EC：1.1.1.188)激活的抗肿瘤前药为小分子抗肿瘤前药，优选为AST-3424；

所述β-葡萄糖醛酸苷酶(EC：3.2.1.31)激活的抗肿瘤前药为小分子抗肿瘤前药，优选为葡磷酰胺；

所述细胞色素P450还原酶(EC：1.6.2.4)激活的抗肿瘤前药为小分子抗肿瘤前药，优选为TH-302；

所述脱氧胞苷激酶(EC：2.7.1.74)激活的抗肿瘤前药为脱氧胞嘧啶激酶激活的小分子抗肿瘤前药，优选为阿糖胞苷、安西他宾、依诺他滨、地西他滨、氟达拉滨、阿扎胞苷、吉西他滨、喷司他丁、克拉屈滨；

所述胸苷磷酸化酶(EC：2.4.2.4)激活的抗肿瘤前药为小分子抗肿瘤前药，优选为卡培他滨；

所述脱氧胞苷激酶(EC：2.7.1.74)、脱氧鸟苷激酶(EC:2.7.1.113)共同激活的抗肿瘤前药为脱氧胞苷激酶(EC：2.7.1.74)、脱氧鸟苷激酶(EC:2.7.1.113)共同激活的小分 子抗肿瘤前药，优选为奈拉滨。

上述抗肿瘤前药前药选择的是上市的药物或经过实验验证的具有广谱抗肿瘤效果的临床试验阶段的药物。

本发明还提供一种治疗肿瘤和/或癌症的方法，对肿瘤和/或癌症患者施用上述的药物组合物，包括依此执行的以下步骤：

对肿瘤和/或癌症患者施用所述的重组溶瘤病毒，该重组溶瘤病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制；

在施用所述重组溶瘤病毒之后的一段时间后，对所述肿瘤和/或癌症患者施用所述靶向酶激活的抗肿瘤前药。

还提供一种施用上述的药物组合物治疗肿瘤和/或癌症的方法，在检查确认该肿瘤患者或癌症患者的肿瘤组织或癌细胞的所述靶向酶的表达水平为低时，依此执行以下步骤：

对肿瘤和/或癌症患者施用所述的重组溶瘤病毒，该重组溶瘤病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制；

在施用所述重组溶瘤病毒之后的一段时间后，对所述肿瘤和/或癌症患者施用所述靶向酶激活的抗肿瘤前药。

本发明还提供一种施用上述的药物组合物治疗肿瘤和/或癌症的方法，在确认该肿瘤患者单用所述靶向酶激活的抗肿瘤前药无效或无响应时，依此执行以下步骤：

对肿瘤和/或癌症患者施用所述重组溶瘤病毒，该重组溶瘤病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制；

在施用所述重组溶瘤病毒之后的一段时间后，对所述肿瘤和/或癌症患者施用所述靶向酶激活的抗肿瘤前药。

显然，本发明对应上述治疗方法还提供了一种制药用途：

重组溶瘤病毒在制备治疗对于单用靶向酶激活的抗肿瘤前药无效或无响应的癌症患者的癌症中的用途；或

重组溶瘤病毒在制备治疗癌症或肿瘤疾病药物的制药用途，该癌症或肿瘤疾病为单用靶向酶激活的抗肿瘤前药无效或无响应的癌症。

为此，本发明提供一种用于治疗肿瘤和/或癌症的具有协同作用的联合药物的药盒，其包括：

上述包括重组溶瘤病毒和所述靶向酶激活的抗肿瘤前药的药物组合物；以及

载明给药时机和给药方式的说明书，

其中所述重组溶瘤病毒和所述靶向酶激活的抗肿瘤前药各自独立地由容器包装。

附图说明

图1为AST-342对不同肝细胞的抑制率IC ₅₀值与该肝细胞中AKR1C3蛋白水平的相关性示意图；

图2为AST-3424对不同AKR1C3表达水平的癌细胞系的抗癌活性相关性图，其中，图2a为AST-3424对6种B-ALL细胞系的细胞毒性的量效曲线；图2b为AST-3424对7种T-ALL细胞系的细胞毒性的量效曲线；图2c为在AST-3424的浓度10nmol/L下，AKR1C3蛋白表达与18种ALL PDX的体外细胞存活率的相关性曲线(显著负相关，r＝-0.53，P＝0.023)；图2d为在AST-3424的浓度100nmol/L下，AKR1C3蛋白表达与18种ALL PDX的体外细胞存活率的相关曲线(显著负相关，r＝-0.56，P＝0.015)；

图3为FV184载体(病毒质粒)DNA信息及图谱示意图；

图4为OVAD-hAKR1C3-3Flag-OE质粒电泳结果：左侧为质粒电泳结果图，其中17字符下对应的是OVAD-hAKR1C3-3Flag-OE质粒，M字符下对应的是Marker蛋白，右侧为Marker的标尺示意图；

图5为溶瘤病毒在感染HEK293细胞后不同时间的荧光和明场显微照片，左上图为第一天(24小时)后在明场条件下500倍放大拍摄的显微照片，右上图为第一天(24小时)后在荧光条件下500倍放大拍摄的显微照片，左下图为第二天(48小时)后在明场条件下500倍放大拍摄的显微照片，右上图为第二天(48小时)后在荧光条件下500倍放大拍摄的显微照片；

图6为免疫印迹结果示意图，左图为Marker蛋白的电泳结果，M表示Marker蛋白，中图为FLAG标签抗体作为对照的免疫印迹电泳结果，右图为Actin作为对照的免疫印迹电泳结果，其中，1为Hacat CON为对照细胞样本，2为HepG2CON对照细胞样本，3为1μL OVAD-hAKR1C3-3Flag-OE，感染Hacat细胞后蛋白样本，4为1μL OVAD-hAKR1C3-3Flag-OE，感染HepG2细胞后蛋白样本，M表示蛋白Marker的电泳结果；

图7为目的蛋白AKR1C3与Actin比较后的相对含量；

图8为溶瘤病毒疗法的多个正在进行中的临床试验表格。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

“患者”及“个体”可互换使用，是指需要癌症治疗的哺乳动物。通常，患者是人类。通常，患者是诊断患有癌症的人类。在某些实施例中，“患者”或“个体”可指用于筛选、表征及评估药物及疗法的非人类哺乳动物，例如非人类灵长类动物、狗、猫、兔、猪、小鼠或大鼠。

“前药”是指投与或施用之后经新陈代谢或以其他方式转化为关于至少一种性质的生物学活性或活性更高的化合物(或药物)的化合物。相对于药物，前药以使其相对于药物活性较低或无活性的方式化学修饰，但化学修饰使得在前药投与之后通过代谢或其他生物过程产生相应药物。前药可相对于活性药物具有改变的代谢稳定性或输送特征、较少副作用或较低毒性或经改良的风味。前药可使用除相应药物以外的反应物来合成。

“实体肿瘤”是指包括(但不限于)骨、脑、肝、肺、淋巴结、胰脏、前列腺、皮肤及软组织(肉瘤)中的转移肿瘤的实体肿瘤。

药物的“治疗有效量”是指当向患有癌症的患者投与或施用时，将具有预期的治疗效应(例如患者中一或多种癌症的临床表现的缓和、改善、缓解或消除)的药物的量。治疗效应不必通过投与或施用一个剂量而出现，且可仅在投与或施用一系列剂量后出现。因此，治疗有效量可以一或多次来投与或施用。

病况或患者的“治疗”是指采取步骤以获得有益或期望结果(包括临床结果)。出于本发明的目的，有益或期望临床结果包括(但不限于)一或多种癌症症状的缓和或改善；疾病程度的减弱；疾病进展的延迟或减缓；疾病状态的改善、缓解或稳定；或其他有益结果。在一些情形下，癌症的治疗可使得部分反应或稳定疾病。

“肿瘤细胞”是指任何适当物种(例如，哺乳动物，例如鼠类、犬、猫、马或人类)的肿瘤细胞。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

实验部分

实施例1

本实施例在于说明AKR1C3酶的表达水平与IC ₅₀值的相关性。

实施例1-1在肝癌细胞系，AKR1C3蛋白水平与IC ₅₀值的相关性。

1.试验材料和方法

1.1细胞系

所有人类癌细胞系均来自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)或日本研究生物资源保藏中心(JCRB，日本大阪)或CASToer Biosciences(南京，中国)。

1.2体外增殖测定方法

接种指数生长的细胞，24小时后，加入测试化合物AST-3424。加入测试化合物AST-3424后，将板在标准组织培养箱中于37℃下孵育指定的小时。试验结束时，使用CellTiter Glo(CTG)测定试剂盒。使用XLfit(IDBS，Boston，MA)或Prism 6(GraphPad，San Diego，CA)计算相对于未经处理的对照导致50％生长抑制的药物浓度(IC ₅₀)。

1.3免疫印迹法

制备人细胞提取物并测定蛋白质浓度。使用识别人AKR1C3和微管蛋白或β-肌动蛋白的抗体检测蛋白质。使用Odyssey激光成像系统和软件(LI-COR Biosciences，Lincoln，NE)对AKR1C3和微管蛋白或β-肌动蛋白的条带密度进行扫描和定量，并计算了AKR1C3对微管蛋白或β-肌动蛋白的比例。

2.试验结果

分别将肝癌细胞系暴露于化合物AST-342496h后，使用体外增殖测定方法测定了IC ₅₀值，并使用免疫印迹法测定了肝癌细胞系中AKR1C3蛋白的表达(微管蛋白用作上样对照)，结果如表3所示。

表3：AST-3424暴露96小时后，对一组人类肝癌细胞系的细胞毒性测定结果

如表3所示，在蛋白质水平都具有高AKR1C3表达的肝癌细胞系对AST-3424的敏感性更强，其中IC ₅₀值处于低纳摩尔范围内。另一方面，表达低AKR1C3的细胞对AST-3424的敏感性较低，其中IC ₅₀值高于1000nM。肝细胞中3424IC ₅₀与AKR1C3蛋白水平有高度相关性(R ²＝0.71，图1)，这些结果表明，在肝细胞系中3424介导的细胞毒性与AKR1C3表达水平呈高度正相关。

实施例1-2在白血病细胞系中，AKR1C3蛋白水平与IC ₅₀值的相关性

1.试验材料和方法

1.1体外研究中的细胞系

所有细胞系均购自HD Biosciences。所有实验工作均是在各自的机构审查委员会和每个机构的动物道德委员会的批准下进行的，使用人类相关组织样本均符合实验所在地的伦理和相关法律规定。实验使用了先前在20–25g雌性非肥胖/SCID(NOD.CB17-Prkdcscid/SzJ,NOD/SCID)或NOD/SCID/IL2受体γ–阴性(NOD.Cg-Prkdc ^scid Il2rg ^tm1Wjl/SzJAusb,NSG)中建立的连续PDX，如别处所述(Lock RB,Liem N,Farnsworth ML,Milross CG,Xue C,Tajbakhsh M,et al.The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient(NOD/SCID)mouse model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis and relapse.Blood 2002；99:4100–8.)。慢病毒转导的 ALL-11 PDX的开发[空载体(EV)和AKR1C3过表达]已在之前描述(Jamieson SM,Gu Y,Manesh DM,El-Hoss J,Jing D,Mackenzie KL,et al.A novel fluorometric assay for aldo-keto reductase 1C3 predicts metabolic activation of the nitrogen mustard prodrug PR-104A in human leukaemia cells.Biochem Pharmacol 2014；88:36–45.)。

1.2体外细胞毒性试验

白血病细胞系悬浮在补充有FBS(Biosera)的RPMI培养基中，而ALL PDX细胞在补充有Flt-3配体(20ng/mL，BioNovus Life Sciences)或IL7(10–20ng/mL，Jomar Life Research)的QBSF培养基(Quality Biological Inc,)中培养。根据最佳细胞密度接种细胞，并孵育3小时或过夜(37℃，5％CO ₂)。PDX细胞和白血病细胞系用AST-3424(10mmol/L–1pmol/L)或媒介物对照分别处理48或72小时。使用Cell Titer-Glo发光细胞活力测定法(Promega)确定活力。半最大抑制浓度(IC ₅₀)通过GraphPad Prism 7软件计算非线性回归曲线的插值。

1.3免疫印迹法

将冷冻保存的白血病细胞解冻，并在RIPA裂解缓冲液中裂解，并通过BCA测定法定量蛋白质浓度。每个样品均在NuPAGE 4-12％Bis-Tris蛋白凝胶中上样20μg蛋白质裂解物，然后在120V下电泳，并在30V下转移至聚偏二氟乙烯膜上1h。用小鼠抗AKR1C3(#A6229，Sigma-Aldrich，St.Louis,MO)或兔抗肌动蛋白一抗(#A2066，Sigma-Aldrich)，然后分别用辣根过氧化物酶结合的抗小鼠或抗兔IgG二抗(GE Healthcare，Buckingham，UK)探测膜。ImmASTlon Western化学发光HRP底物(Merck Millipore，Billerica，MA)用于通过定量BioRad Chemidoc触摸成像系统中的信号来检测结合的二抗。

2.试验结果

AKR1C3相关的AST-3424的体外细胞毒性在9种T-ALL细胞系、一种用粒细胞集落刺激因子转染的B-ALL细胞系和一种BCP-ALL细胞系。AKR1C3蛋白的表达水平使用免疫印迹分析法测定。使用CellTiter-Glo分析法测定AST-3424的体外细胞毒性，计算为50％最大抑制浓度(IC ₅₀)。

AST-3424显示的体外细胞毒性中，在6种表达高(强)水平AKR1C3的细胞系中IC ₅₀的范围为3.0-30.0nM。对于具有中等AKR1C3表达水平的细胞系，IC ₅₀范围为3.0-84.0nM(表4)。

表4：在ALL细胞系中，AST-3424的AKR1C3依赖性体外细胞毒性测定结果

注：G-CSF＝粒细胞集落刺激因子；BCP-ALL＝B细胞前体ALL

为了评估AST-3424的潜在抗白血病活性，在多种白血病细胞系上进行了体外细胞毒性测定。证明了，AST-3424可治疗T-ALL、B-ALL、急性髓性白血病、急性早幼粒细胞白血病(APL)和红白血病。AST-3424显示出有效的细胞毒性，特别针对衍生自高AKR1C3表达的T-ALL(T系急性淋巴细胞白血病)的细胞系，其中IC ₅₀值在低nmol/L范围内(参见表5)。细胞系之 间IC ₅₀值的差异具有高/中等AKR1C3表达和低表达表达具有统计学意义(P＝0.0016)。

表5：AST-3424暴露于白血病细胞系中72小时后，对白血病细胞系的体外细胞毒性

AKR1C3表达通过免疫印迹法评估，并相对于对照β-微管蛋白表达。高，AKR1C3/β-微管蛋白>5.0；中等，AKR1C3/β-微管蛋白2.0-5.0；低，AKR1C3/β-微管蛋白<2.0。

与白血病细胞系获得的结果相似，AST-3424对所有白血病细胞系发挥了有效的细胞杀伤作用。图2a中给出了AST-3424对6种B-ALL细胞系的细胞毒性，图2b中给出了AST-3424对7种T-ALL细胞系的细胞毒性。由图2a和图2b可以看出，AST-3424的AKR1C3依赖性激活为DNA烷基化试剂。此外，参见图2c，在AST-3424的浓度为10nmol/L下，AKR1C3蛋白表达显示与18种ALL PDX的体外细胞存活率显著负相关(r＝-0.53，P＝0.023)；同样地，参见图2d，在AST-3424的浓度为100nmol/L下，AKR1C3蛋白表达显示与18种ALL PDX的体外细胞存活率显著负相关(r＝-0.56，P＝0.015)。

实施例2

本实验将以人AKR1C3(hAKR1C3)基因组合进入溶瘤腺病毒得到重组溶瘤腺病毒以及AKR1C3酶活化的抗癌药物AST-3424为例来进行具体实验验证。

以下生物基因相关实验的所有术语、缩写除明确解释外均按照分子生物学、生物化学领域的教科书或实验手册的理解、说明为准。

5x、10x表示5倍、10倍稀释，其余依此类推。

ddH ₂O，双蒸水。

第一部分：将hAKR1C3基因构建在溶瘤病毒质粒上得到整合有hAKR1C3基因的重组溶瘤腺病毒OVAD-hAKR1C3-3Flag-OE

1.实验材料和方法

1.1整合有hAKRC3目的基因的溶瘤病毒质粒的构建

使用常规的方法将pLenti6.3-CMV-MSC慢病毒载体与已知的hAKR1C3基因序列连接得到pLenti6.3-CMV-MSC-hAKR1C3慢病毒载体质粒，将该质粒上的人源AKR1C3基因(hAKR1C3基因，NM_003739.6)的CDS序列作为模板，使用PCR扩增法获取目的基因序列，然后利用无缝克隆法，将PCR扩增的目的片段构建到溶瘤病毒载体PV184上(图1)。溶瘤病毒载体包括以下DNA原件，hTERT-455-E1A-IRES-E1B-mCMV-MCS-3Flag-SV40-EGFP，其上带有FLAG标签，用于后续免疫印迹检测hAKR1C3过表达蛋白，当FLAG标签蛋白被检测到有表达时，对应的，hAKR1C3蛋白也相应被表达。该溶瘤病毒是以5型腺病毒为基础改造而来，E1区基因被条件性启动，E3基因被缺失或被修饰，它对分裂期细胞和非分裂期细胞均具有感染能力，它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后将溶瘤腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。可以在HEK293细胞及一些肿瘤细胞内进行复制扩增，是较为安全的基因治疗载体。EGFP是一种绿色荧光蛋白对应的基因序列，可用于在感染癌细胞后表达EGFP蛋白而显示荧光。

1.2溶瘤病毒载体PV184信息

图3显示了FV184载体(溶瘤腺病毒质粒)信息及图谱。

载体大小：8.9kb；原核抗性：AmpR；筛选标记：EGFP；框架结构：hTERT-455-E1A-IRES-E1B-mCMV-MCS-3Flag-SV40-EGFP；MCS区正向测序引物：5'-GGTATAAGAGGCGCGACCAG-3'；MCS区反向测序引物：5'-TTCCACACCCTAACTGACAC-3'；常用酶切位点：SalI、BamHI、AgeI。

1.3 AKR1C3基因(序列)信息

所有信息均来自NCBI网站：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/。

基因名称：AKR1C3aldo-keto reductase family 1member C3[Homo sapiens(human)]

Gene ID：8644

转录本信息：NM_003739.6

基因大小：969bp

基因CDS区序列即hAKR1C3的DNA基因序列如SEQ ID No.1所示；对应的氨基酸序列，即hAKR1C3的氨基酸序列为如SEQ ID No.2所示。

1.4实验材料及实验设备：

表6：实验相关试剂

实验所使用的设备均为常规市售设备、仪器。

1.5 PCR扩增引物信息：

上游引物(即SEQ ID No.3)：cgactctagaggatccgccaccatggattccaaacaccagtgtgtaaag

下游引物(即SEQ ID No.4)：tgtagtccataccggtatattcatctgaatatggataattagggtggctag

双酶切位点：5’BamHI,3’AgeI

1.6 PCR扩增hAKR1C3目的基因实验方法：

表7：PCR反应体系

表8：PCR反应条件

1.7溶瘤病毒载体PV184双酶切处理：

表9：酶切体系配制

名称	加入量
载体质粒	1μg
BamHI	0.5μL
AgeI	0.5μL
10x Buffer	1μL
Total	ddH 2O补齐至20μL

酶切反应条件37℃/30min。

完成酶切反应的体系加至上样孔中进行电泳，电泳条件220V/30min。电泳结束后，将胶块放置在切胶台上，切下目的片段放入已灭菌1.5mL EP管中。按照TIANGEN普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行DNA回收，回收后的DNA测定其浓度及260/280值，储存于-20℃ 备用。

1.8溶瘤病毒载体PV184和hAKR1C3目的片段连接：

本实验采用无缝克隆法连接溶瘤病毒载体和目的基因片段。无缝克隆法又称交换重组克隆法，其区别于传统PCR产物克隆(TA克隆)，载体末端和PCR引物末端应具有15-20个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上了15-20个与载体序列同源性的碱基，依靠碱基间作用力互补配对成环，在重组酶Exnase的作用下将缺口修复，形成闭环质粒，构建OVAD-h AKR1C3-3Flag-OE溶瘤病毒质粒(Wu N,Ming X,Xiao J,et al.TBX6null variants and a common hypomorphic allele in congenital scoliosis.N Engl Med.2015,372(4):341-50)。

质粒使用量计算：目的基因回收产物大小(1000bp)x0.04(ng)；线性化载体大小(8900bp)x0.02(ng)(根据具体的产物浓度换算成使用体积)。

表10:无缝克隆链接体系

1.9连接产物转化、涂板及单克隆鉴定：

连接产物转化到TOP10感受态大肠杆菌中，均匀涂于带有氨苄抗性的LB培养平板上，并将平板倒扣置于37℃细菌培养箱培养过夜。从上述平板中挑取单克隆菌落，于LB液体培养基中培养，并进行质粒提取。质粒测序鉴定，将测序结果与目的基因序列进行比对鉴定。结果显示，测序结果与目的基因的DNA序列完全一致，表明OVAD-hAKR1C3-3Flag-OE质粒(即整合有hAKR1C3的病毒质粒)构建成功(图2)。

测序序列拼接结果如SEQ ID No.5所示。其中，第1032～1104位为3Flag DNA基因，其具体序列如SEQ ID No.6所示。

由此可知，上述实验已经将hAKR1C3基因构建在溶瘤病毒质粒上得到整合有hAKR1C3基因的重组溶瘤腺病毒OVAD-hAKR1C3-3Flag-OE。

第二部分：验证整合有hAKR1C3基因的重组溶瘤腺病毒能成功侵染癌细胞并表达人AKR1C3(hAKR1C3)酶蛋白

1.溶瘤病毒OVAD-hAKR1C3-3Flag-OE的制备

1.1实验材料和方法

溶瘤病毒包装细胞HEK293(ATCC，cat#CRL-1573)，为贴壁依赖性上皮样细胞，生长培养基为含10％FBS的DMEM培养基。该细胞中包含并表达溶瘤病毒启动复制的E1区域，以大量扩增溶瘤病毒。

表11：溶瘤病毒包装实验相关试剂

1.2溶瘤病毒的包装

1.2.1溶瘤病毒质粒转染

1)转染前24h，用0.25％胰蛋白酶消化对数生长期的HEK293细胞，以含10％FBS的DMEM培养基调整细胞密度为达30％～40％，重新接种于细胞培养瓶中，37℃、5％CO ₂培养箱内培养。24h左右待细胞密度达到50％～60％时用于转染。

2)转染前2h将细胞培养基更换为无血清OMEM培养基。

3)向一灭菌1.5ml离心管中加入所制备的DNA质粒(OVAD-hAKR1C3-3Flag-OE质粒5μg和病毒基因组载体质粒5μg)与OMEM混合均匀，调整总体积为50μL，在室温下温育5min。

4)将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取10μL Lipofectamine 2000试剂在另一管中与50μL OMEM混合，在室温下温育5min。

5)把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。

6)混合后，在室温下温育20min，以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释液的转染复合物。将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至HEK293细胞的培养液中，混匀，于37℃,5％CO ₂细胞培养箱中培养。

7)培养6h～8h后换液，每瓶细胞中加入含10％血清的细胞培养基5ml，于37℃、5％CO ₂培养箱内继续培养。

8)每天观察转染后细胞生长状况，若细胞培养基明显变黄，酌情补加适量的新鲜全培养液。

9)转染后大约10～15天时，HEK293细胞开始脱壁，部分细胞出现细胞病变(cytopathic effect,CPE)。

1.2.2重组溶瘤病毒的收集

待大部分细胞出现典型的CPE，且有50％的细胞脱壁，低速离心收集细胞并重悬于2ml DMEM中，-70℃/37℃反复冻融、振荡3次，于4℃，7000g离心5min，收集病毒上清于-70℃保存。

1.3溶瘤病毒的扩增

1.3.1第一轮扩增

将1个T25细胞培养瓶中生长状态良好的HEK293细胞4倍稀释后传入另1个T25细胞培养瓶中，以含10％FBS的DMEM培养液在37℃,5％CO ₂下培养(以下扩增中均使用此条件培养细胞)。待细胞达到60％汇合时，弃去旧培养液，向培养瓶中加入OVAD-hAKR1C3-3Flag-OE病毒重组成功后收获的粗提液2mL，将培养瓶置于细胞培养箱中孵育90min，最后再向培养瓶中补加完全培养液3mL并继续培养。待大部分细胞出现典型的CPE，且有50％的细胞脱壁时，低速离心收集细胞并重悬于2mL DMEM中，-70℃/37℃反复冻融、振荡3次，于4℃，7000g离心5min，收集病毒上清于-70℃保存。

1.3.2第二轮扩增

将1个T25细胞培养瓶中生长状态良好的HEK293细胞全部传入1个T75细胞培养瓶中，以完全培养基继续培养。待细胞达到90％汇合时，弃去旧培养液，向培养瓶中加入第1轮扩增所得的病毒液2mL，将培养瓶置于细胞培养箱中孵育90min，最后再向培养瓶中补加完全培养液10mL并继续培养。待大部分细胞出现典型的CPE，且有50％的细胞脱壁时，低速离心收 集细胞并重悬于10ml DMEM中，-70℃/37℃反复冻融、振荡3次，于4℃，7000g离心5min，收集病毒上清于-70℃保存。

图5显示了溶瘤病毒在感染HEK293细胞后不同时间的荧光和明场显微照片。如图5所示，观察可知，在荧光环境下，HEK293细胞发出荧光，对比可知在48小时后，病毒DNA得到了复制并表达EFGP荧光蛋白。

1.4溶瘤病毒的纯化

第2轮扩增后的病毒液，经超滤浓缩柱浓缩后，等体积分装至1.5mL离心管，保存于-70℃。

1.5溶瘤病毒的滴度测定

1.5.1溶瘤病毒滴度测定：终点稀释法

1)在实验前24h，向96孔板的每一个孔加入100μl HEK293细胞悬液，约含1x10 ³个细胞。

2)准备12个无菌的1.5mL离心管，在第一个离心管中加入990μl的完全培养液，其余的11个管中各加入900μL的完全培养液。

3)待测病毒液的稀释：取10Ll溶瘤病毒原液加入990μL的Ep管中做1:100稀释(1E-2)；然后以此为起点，再取100μL稀释液加入到900μL的Ep管中做1:10稀释(1E-3)，依次稀释，直至稀释到(1E-13)。

4)从孵箱中取出96孔板，在显微镜下确定每孔的细胞均生长良好。吸弃旧培养液，然后依次将1E-61至E-13稀释的病毒液加入96孔板中，每一稀释度占用一行，每一行的第1-10孔每孔加入90μL病毒稀释液，而每一行的第11-12孔均加入90μL不含病毒的完全培养基作为对照(以CON表示)。

5)将96孔板置于37℃、5％CO ₂细胞培养箱中继续培养。

6)第10天观察细胞病变现象，并对CPE孔进行计数，计算每一行的阳性率，计算病毒滴度(Spearman-Karber Method)(Darling AJ,Boose JA,Spaltro J.Virus assay methods:accuracy and validation.Biologicals.1998Jun；26(2):105-10)):

病毒滴度＝10 ^(x+0.8)(PFU/ml)

x＝1E-1到1E-13依次稀释度下CPE阳性率总和

公式使用条件:

a.阴性对照没有CPE和生长抑制现象；

b.加入最小稀释浓度病毒粗提液的孔均有CPE。

根据计算结果显示，病毒滴度＝1E+10(PFU/mL)。

图12：溶瘤病毒滴度检测数据示意图

稀释度	板	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
1E-6	A	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	-	CON
1E-7	B	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	-	CON
1E-8	C	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	-	CON
1E-9	D	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	-	CON
1E-10	E	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	CON
1E-11	F	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CON
1E-12	G	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CON
1E-13	H	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CON

1.稀释度1E-6到1E-13；+表示CPE阳性；－表示CPE阴性；

2.由于稀释度为1E-6的孔中CPE均为阳性，所以认为稀释度为1E-1至1E-5的孔中CPE也都为阳性；

3.计算公式：病毒滴度＝10 ^(x+0.8)(PFU/mL)

X为1E-1到1E-13依次稀释度下CPE阳性率总和。

4.本次实验中X＝9.2

溶瘤病毒滴度＝10 ^(x+0.8)(PFU/mL)＝1E+10(PFU/mL)

1.6溶瘤病毒对正常细胞和肿瘤细胞的侵染及目的蛋白的表达

实验中使用的Hacat和HepG2细胞均由复百澳(苏州)生物科技有限公司提供。Hacat细胞是人类永生化表皮细胞，是非肿瘤来源的人正常皮肤永生化角质形成细胞株，作为实验对照细胞。HepG2细胞为人肝癌细胞，来源于一名15岁白人的肝癌组织，该细胞分泌多种血浆蛋白：清蛋白、α2-巨球蛋白、血纤维蛋白溶酶原、铁传递蛋白等。由于OVAD-hAKR1C3-3Flag-OE溶瘤病毒带有hTERT启动子(人端粒逆转录酶)，能够在高表达该蛋白的肿瘤细胞中大量扩增，但在低表达hTERT蛋白的非肿瘤细胞中无法大量复制。因此该实验的目的是检测构建的溶瘤病毒是否能够在肿瘤细胞中大量复制，并导致目的蛋白hAKR1C3的过表达。同时在非肿瘤细胞中，由于溶瘤病毒无法复制，导致目的蛋白hAKR1C3低表达。

1.6.1试剂及仪器

表13：实验相关试剂

试剂名称	试剂来源	cat.No.
RIPA裂解液	Solarbio	R0020
Protease Inhibitor Tablets	Sigma	S8820
BCA蛋白质定量试剂盒	TIANGEN	FS-0026
4x Protein Loading Buffer	Fubio	/
宽范围彩色预染蛋白质Marker	TIANGEN	MP206
溴酚蓝(BromphenolBlue)	Solarbio	B8120
十二烷基硫酸钠SDS	阿拉丁Aladdin	S108347-500g
丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺30％溶液(29：1)	生工生物Sangon Biotech	B546017-0500
氯化钾	国药Sinoreagent	10016318
氯化钠	国药Sinoreagent	10019318
一抗稀释液	Solarbio	A1810
DMEM	biological industry	06-1055-57-1ACS
Ampicillin sodium salt	Genview	AA022-25G
ECL plus超敏发光液	Solarbio	PE0010-50ml*2
Foetal Bovine Serum	biological industry	04-001-1B
Penicillin G Sodium	Genview	AP231-10G
Glycine	Biosharp	BS003B
Tris	Sangon Biotech	A100826-0500
PVDF膜	Millipore	ISEQ00010
甲醇	国药Sinoreagent	10014118
NON-Fat Powdered Milk脱脂奶粉	BBI	NB0669-250g
FLAG标签抗体	SIGMA ALDRICH	F1804
Actin抗体	Bioss	AH11286487

1.6.2溶瘤病毒侵染细胞的及蛋白样品制备

1)第一天准备HepG2和Hacat细胞，融合度在90％的细胞，消化后在6孔板内培养过夜,每孔铺5ⅹ10 ⁵个。

2)第二天细胞融合度在70％左右，分别加入溶瘤病毒OVAD-hAKR1C3-3Flag-OE 1μL/孔和4μL/孔侵染细胞。

3)第三天观察细胞状态。

4)第四天病毒侵染48h后回收样品。

5)每孔加入蛋白裂解液40μL，置于冰上静置15min(每5min涡旋振荡30s)，12000g离心2min。

6)BCA法蛋白定量，每孔上样10μg蛋白。

7)蛋白电泳、转膜后，利用FLAG标签抗体和Actin检测目的蛋白和内参的表达。

8)对免疫印迹结果的蛋白条带进行灰度分析，电泳结果如图6所示。

9)灰度值进行计算并做统计分析：根据表10中的灰度值，Flag的灰度值除以Actin的灰度值，以校正误差，所得结果代表样品的目的蛋白相对含量，即单位Actin所表达的Flag数值，具体如图7所示。

表10：蛋白条带灰度分析原始数据

溶瘤病毒分别感染非肿瘤细胞Hacat和肿瘤细胞HepG2，侵染48小时后检测Flag标签蛋白表达量，从而相对确认溶瘤病毒中hAKR1C3基因在细胞内的表达量。结果显示，未侵染溶瘤病毒的对照细胞Hacat和HepG2中未检测到Flag蛋白表达；当感染体积为1μL时，溶瘤病毒在肿瘤细胞HepG2中的表达明显高于非肿瘤细胞Hacat(4.8倍)(图6，图7和表10)。

第三部分：验证对于AKR1C3(hAKR1C3)酶表达低的癌细胞或肿瘤，整合有hAKR1C3基因的重组溶瘤腺病毒与AKR1C3酶活化的抗癌药物AST-3424联用可以提高AST-3424或溶瘤病毒单用抑制癌细胞或肿瘤增殖的效果

在联合硝基还原酶激活前药PR-104与插入了硝基还原酶基因片段的溶瘤病毒ONYX-411 ^NTR的研究中(Singleton,D.C.,Mowday,A.M.,Guise,C.P.et al.Bioreductive prodru g PR-104improves the tumour distribution and titre of the nitroreductase-armed o ncolytic adenovirus ONYX-411 ^NTR leading to therapeutic benefit.Cancer Gene Ther(2021).https://doi.org/10.1038/s41417-021-00409-2)，通过将NTR对应的基因插入到O NYX中使得癌细胞能够表达硝基还原酶。再将硝基还原酶激活前药PR-104与插入了硝基还原酶基因片段的溶瘤病毒ONYX-411 ^NTR联用，联用效果优于单独的PR-104和单独的溶瘤病毒ONYX-411。

通过上述研究可知，当溶瘤病毒插入酶蛋白的基因后能在肿瘤细胞中表达目标酶蛋白，那么将特定酶蛋白激活的抗癌前药与溶瘤病毒联用，其抗肿瘤效果强于单独的溶瘤病毒和单独的特定酶蛋白激活的抗癌前药。

本实施例中，插入了AKR1C3基因到溶瘤病毒中，且该溶瘤病毒能在侵染肿瘤细胞HepG2后表达AKR1C3蛋白，因此本领域技术人员能够预测将AKR1C3酶激活的抗癌前药AST-3424与插入了AKR1C3基因的溶瘤病毒联用，其抗肿瘤效果强于单独的溶瘤病毒和单独的AKR1C3酶激活的抗癌前药AST-3424；同样的道理，对于AKR1C3酶表达不高或几乎没有表达的癌症患者， 先施用插入了AKR1C3基因溶瘤病毒，再施用AKR1C3酶激活的前药AST-3424，其将有较好的治疗效果。

Claims (12)

1. 重组溶瘤病毒，其特征在于，该重组溶瘤病毒为选择复制型溶瘤病毒，并且该重组溶瘤病毒的基因组中整合有能够在肿瘤细胞中表达靶向酶的RNA或DNA的编码序列，所述靶向酶为能够激活抗肿瘤前药的酶。
2. 根据权利要求1所述的重组溶瘤病毒，其特征在于，该重组溶瘤病毒的基因组中整合有能够在肿瘤细胞中表达下列靶向酶的RNA或DNA的编码序列中的任意一种或多种：

   醛酮还原酶，

   β-葡萄糖醛酸苷酶(EC：3.2.1.31)，

   细胞色素P450还原酶(EC：1.6.2.4)，

   脱氧胞苷激酶(EC：2.7.1.74)，

   胸苷磷酸化酶(EC：2.4.2.4)。
3. 根据权利要求1所述的重组溶瘤病毒，其特征在于，该重组溶瘤病毒的基因组中整合有能够在肿瘤细胞中同时表达脱氧胞苷激酶(EC：2.7.1.74)、脱氧鸟苷激酶(EC:2.7.1.113)这两种所述靶向酶的RNA或DNA的编码序列。
4. 根据权利要求2所述的重组溶瘤病毒，其中，所述整合有能够在肿瘤细胞中表达醛酮还原酶的RNA或DNA的编码序列中的醛酮还原酶为人源醛酮还原酶家族1。
5. 根据权利要求4所述的重组溶瘤病毒，其中，所述人源醛酮还原酶为人源醛酮还原酶家族1成员C3。
6. 根据权利要求4所述的重组溶瘤病毒，其中所述DNA的编码序列如SEQ ID No.1所示，所述人源醛酮还原酶的氨基酸编码序列如SEQ ID No.2所示。
7. 根据权利要求1所述的重组溶瘤病毒，当该重组溶瘤病毒的基因组中整合有能够在肿瘤细胞中表达人源醛酮还原酶家族1成员C3的RNA或DNA的编码序列时，所述抗肿瘤前药选自下式(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)的化合物或其盐、酯、溶剂合物、同位素异构体：

   其中，X、Y、Z、R、T、A以及X ¹⁰的定义如专利申请PCT/US2016/021581，公开号WO2016145092A1(对应中国申请号CN201680015078.8，公开号CN107530556A)中的权利要求书所记载；

   其中，R ₁、R ₂、R ₃、R ₄、R ₅、R ₈、R ₉、R ₁₀的定义如专利申请PCT/CN2020/089692，公开号WO2020228685A1(对应中国申请号CN202080035889.0，公开号CN113853379A)中的权利要求书所记载；

   其中：

   A是取代或未经取代的C6-C10的芳基、联芳基或取代的联芳基、5-15元的杂芳基或-N＝CR ¹R ²，其中取代时的取代基选自由以下组成的群：卤基、-CN、-NO ₂、–O-(CH ₂)-O-、-CO ₂H及其盐、-OR ¹⁰⁰、-CO ₂R ¹⁰⁰、-CONR ¹⁰¹R ¹⁰²、-NR ¹⁰¹R ¹⁰²、-NR ¹⁰⁰SO ₂R ¹⁰⁰、-SO ₂R ¹⁰⁰、-SO ₂NR ¹⁰¹R ¹⁰²、C1-C6烷基、C3-C10杂环基；

   其中，R ¹⁰⁰、R ¹⁰¹及R ¹⁰²各自独立是氢、C1-C8烷基、C6-C12芳基；或R ¹⁰¹及R ¹⁰²与其附接至的氮原子一起形成5-7元杂环；

   其中烷基及芳基各自是经1-3个卤基或1-3个C1-C6烷基取代；

   R ¹及R ²各自独立是苯基或甲基；

   X、Y及Z各自独立是氢或卤基；

   R是氢或C1-C6烷基或卤素取代烷基；

   其中，Rw的定义如专利申请PCT/CN2020/120281，公开号WO2021068952A1中的权利要求书所记载；

   其中，A、E、G、X、Y的定义如专利申请PCT/NZ2019/050030，公开号WO2019190331A1(对应中国申请号CN201980023423.6，公开号CN111918864A)中的权利要求书所记载；

   其中， n、H、Z、R ¹、R ^2a、R ^2b、R ³、R ⁴、R ⁵的定义如专利申请PCT/IB2020/057285，公开号WO2021005586A1(对应中国申请号CN202080053804.1，公开号CN114206870A)中的权利要求书所记载。
8. 根据权利要求7所述的重组溶瘤病毒，其中，

   式(1)的抗肿瘤前药选自以下结构化合物：

   式(2)的抗肿瘤前药选自以下结构化合物：

   式(3)的抗肿瘤前药选自以下结构化合物：

   式(4)的抗肿瘤前药选自以下结构化合物：

   以及

   及

   式(5)的抗肿瘤前药选自以下结构化合物：

   式(6)的抗肿瘤前药选自以下结构化合物：

   式(7)的抗肿瘤前药选自以下结构化合物：
9. 根据权利要求1-8中任意一项所述的重组溶瘤病毒，其中所述重组溶瘤病毒选自具有溶瘤作用的腺病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、塞姆利基森林病毒、水疱性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒、逆转录病毒、呼肠孤病毒、塞内卡谷病毒、埃可型肠道病毒、柯萨奇病毒、新城疫病毒和马拉巴病毒。
10. 一种溶瘤腺病毒质粒，用于治疗肿瘤和/或癌症，其中所述溶瘤腺病毒质粒的DNA序列如SEQ ID No.5所示。
11. 一种药物组合物，其中该药物组合物包括作为活性成分的根据权利要求1-9中任一项所述的重组溶瘤病毒或权利要求10所述的溶瘤腺病毒质粒，以及可药用辅料。
12. 一种用于治疗肿瘤和/或癌症的具有协同作用的联合药物的药盒，其包括：

    权利要求11所述的药物组合物；

    由所述靶向酶激活的所述抗肿瘤前药；以及

    载明给药时机和给药方式的说明书，

    其中所述重组溶瘤病毒和所述抗肿瘤前药各自独立地由容器包装。