CN102439453A - 癌症起始细胞的线粒体活性抑制剂及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于预防和/或治疗肿瘤的化合物。更具体而言，本发明涉及神经胶质瘤起始细胞(GIC)中电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂，所述抑制剂用于在进行过神经胶质瘤实体先期移除的受试者中预防和/或治疗表现神经胶质瘤起始细胞(GIC)的肿瘤的方法。本发明还提供包含本发明的抑制剂的药物组合物，以及识别本发明的抑制剂的筛选方法。

Description

癌症起始细胞的线粒体活性抑制剂及其用途
技术领域
本发明涉及用于预防和/或治疗肿瘤的化合物。更具体而言，本发明涉及神经胶质瘤起始细胞(GIC)中电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性的抑制剂，所述抑制剂用于在进行过神经胶质瘤实体先期移除的受试者中预防和/或治疗表现神经胶质瘤起始细胞的肿瘤的方法。本发明还提供一种包含本发明的抑制剂的药物组合物，以及一种识别本发明的抑制剂的筛选方法。
背景技术
神经胶质瘤是成人中最常见的一种脑部肿瘤。神经胶质瘤的恶性形式，IV级，也称为多形性成胶质细胞瘤(GBM)，是众所周知地难以治疗。在大多数情况下这种肿瘤都会复发，而实际上与包括手术、放疗和化疗的目前所有的治疗方法无关。存活率非常低，例如，14.6个月，即使在结合了化疗与放疗的情况下。还没有环境风险因素被确认，而且关于这些脑部肿瘤的发生发展过程中的生物学机制，了解的也非常少。
奥托-瓦尔堡(Otto Warburg)1930年提出，当非肿瘤细胞在以下两个连续阶段之后采用无氧代谢时，癌症会发生，所述两个连续阶段为：(1)呼吸作用的不可逆损伤；(2)醣酵解成功取代呼吸作用的不可挽回的损失。根据这个理论，大多数的癌细胞被认为在有氧环境下会优先通过由葡萄糖产生乳酸来生产能量，这种现象通常被称为“有氧糖酵解”并被称为瓦尔堡效应(Warburg’s effect)。因此，针对这种有氧糖酵解代谢途径开发癌症治疗在最近几十年中受到越来越多的关注，这种途径可以允许代谢过程向有效呼吸的重建和通过线粒体产生能量。
一些出版物提出，神经胶质瘤细胞的线粒体是癌症化疗的潜在靶点(Daley等，2005，Biochemical and Biophysical Research Communications，328(2)：623-632；Pilkington等，2008，Seminars in cancer biology England，18(3)：226-235)。这些出版物公开了无需进一步化疗或手术的治疗，所述治疗涉及作为线粒体复合物III抑制剂的氯丙咪嗪或常规三环化合物和用于神经胶质瘤细胞(癌细胞)的潜在化学疗法。所述抑制剂通过激活线粒体途径即通过释放细胞色素C和激活胱天蛋白酶-3诱导细胞凋亡。这种疗法是可能的，因为神经胶质瘤细胞(癌细胞)具有与正常细胞不同的代谢。
WO 2008/031171(格里菲斯大学)也公开了一些抗癌化合物和治疗或预防癌症的方法。具体而言，公开了促氧化剂抗癌化合物，例如维生素E的助氧化剂形式，其选择性地与癌细胞中线粒体呼吸链的复合物II(琥珀酸-泛醌氧化还原酶)相互作用，产生活性氧并诱导这些细胞的凋亡。
然而，这种治疗策略假定了每一个单独的癌细胞(例如神经胶质瘤细胞)的生物学和代谢是相似的，不幸的是，这种治疗策略没有在神经胶质瘤的治疗中提供显著进步。
尽管神经胶质瘤确切的细胞起源仍不清楚，人们认为，只有一部分具有干细胞性质的癌细胞，通常被称为癌症干细胞(CSC)，才具有真正致瘤的可能性，并构成神经胶质瘤中的肿瘤起始细胞的离散储存库。最近在许多人类癌症如急性骨髓性白血病(AML)、乳腺癌、卵巢癌和脑癌中类似干细胞的细胞(SC)的识别，重新唤起了对癌症可能来源于成人干细胞/祖细胞的体细胞突变这一假设的兴趣。
称为神经胶质瘤起始细胞(GIC)的脑部肿瘤癌症起始细胞最初被识别为CD133+细胞，但最近的研究证明这个标志特异性相对不足。这些细胞是具有不同致瘤能力的异质细胞群体，某些肿瘤细胞具有出众的肿瘤发生和繁殖能力。神经胶质瘤起始细胞(GIC)是神经胶质瘤的发生和复发的原因。具有干细胞性质的神经胶质瘤起始细胞的作用还没有被充分地研究。这些细胞表现出典型的干细胞特征，包括在单细胞层面上的自我更新能力、具有星形胶质迹象的多潜能性、在体外的神经元和少突神经胶质分化和在在体内的致瘤性。像其他人类癌症那样，神经胶质瘤包括多个细胞层次，在所述细胞层次的顶端具有干细胞性质的肿瘤起始和繁殖细胞(称为癌症干细胞-CSC)似乎控制肿瘤的生长。这种较少两的类似癌症干细胞的细胞GIC只占肿瘤细胞(神经胶质瘤)的约5％的GIC可能代表着肿瘤细胞扩张、复发和转移的来源，从而决定肿瘤的生物学行为，包括增殖、生长以及随后的对治疗的响应。
标靶神经胶质瘤起始细胞仍然具有挑战性，因为这些细胞培养时罕见且不稳定，并且缺乏有效的追踪试剂。到目前为止，没有针对神经胶质瘤起始细胞的治疗显示完全根除神经胶质瘤生长，或在任何常位异种移植和/或转基因小鼠模型中没有复发。已经证明了神经胶质瘤衍生的肿瘤起始细胞对常规放疗的抵抗性(Bao等，2006；Clement等，2007)。例如众所周知，神经胶质瘤起始细胞抵抗化疗药物如替莫唑胺。这些数据可以解释神经胶质瘤不可避免的复发，并且将神经胶质瘤起始细胞定义为新型靶点以克服这种疾病中对常规疗法的抵抗性。
到目前为止，还没有针对神经胶质瘤复发的有效治疗。仍然需要找到特别是针对神经胶质瘤起始细胞的有效治疗。但是，在识别任何针对神经胶质瘤起始细胞的有效分子以及在神经胶质瘤治疗中获得任何重大进展之前，更好并更深入地了解神经胶质瘤起始细胞的细胞和分子机制是至关重要的。
发明内容
出乎意料地，本申请人已经证明，神经胶质瘤起始细胞具有与其他癌细胞如神经胶质瘤不同的代谢方式。
因此，本发明提供一种神经胶质瘤起始细胞(GIC)中电子传输链和/或线粒体TCA循环活性的抑制剂，所述抑制剂用于在进行过神经胶质瘤实体先期移除的受试者中预防和/或治疗表现神经胶质瘤起始细胞(GIC)的肿瘤的方法，其中，所述抑制剂满足以下条件：
1)在暴露于所述电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂最多20天的时间里，GIC的存活降低超过50％；
2)在最多20天的恢复阶段的时间里，GIC的恢复低于0.2倍；以及
3)在暴露于所述电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂期间和之后，正常脑细胞的存活是可持续和可恢复的。
并且由此，所述电子传输链和/或线粒体TCA循环活性的抑制剂阻止由GIC产生能量。
此外，本发明提供一种用于在进行过神经胶质瘤实体先期移除的受试者中预防和/或治疗表现神经胶质瘤起始细胞(GIC)的肿瘤的药物组合物，所述药物组合物含有至少一种本发明所述的电子传输链和/或线粒体TCA循环活性的抑制剂，以及一种或多种可药学可接受的稀释剂或载体。
本发明的另一目的是一种在进行过神经胶质瘤实体先期移除的受试者中预防和/或治疗表现神经胶质瘤起始细胞(GIC)的肿瘤的方法，所述方法包括施用有效量的电子传输链和/或线粒体TCA循环活性的抑制剂，其中，所述抑制剂满足以下条件：
1)在暴露于所述电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂最多20天的时间里GIC的存活降低超过50％；
2)在最多20天的恢复阶段期间，GIC的恢复低于0.2倍；以及
3)在暴露于所述电子传输链和/或线粒体TCA循环活性的抑制剂期间以及之后，正常脑细胞的存活是可持续和可恢复的。
并且由此，所述电子传输链和/或线粒体TCA循环活性的抑制剂阻止由GIC产生能量。
此外，本发明提供一种用于识别神经胶质瘤起始细胞(GIC)中电子传输链和/或线粒体TCA循环活性抑制剂的筛选方法，所述方法包括使从肿瘤细胞样本中分离的FL1+细胞和正常脑细胞与待筛选的抑制剂接触，所述抑制剂满足以下条件：
1)在暴露于所述抑制剂最多20天的时间里，FL1+细胞的存活降低超过50％；
2)在最多20天的恢复阶段的时间里，FL1+细胞的恢复低于0.2倍；
3)在暴露于所述抑制剂期间以及之后，正常脑细胞的存活是可持续和可恢复的。
本发明还包括一种用于筛选神经胶质瘤起始细胞(GIC)中电子传输链和/或线粒体TCA循环活性抑制剂的试剂盒，所述抑制剂满足以下条件：
1)在暴露于所述抑制剂最多20天的时间里，FL1+细胞的存活降低超过50％；
2)在最多20天的恢复阶段的时间里，FL1+细胞的恢复低于0.2倍；
3)在暴露于所述抑制剂期间以及之后，正常脑细胞的存活是可持续和可恢复的；
所述试剂盒用于治疗表现神经胶质瘤起始细胞的肿瘤，其中所述试剂盒含有原代CIC培养物、原代黏附性神经胶质瘤细胞、正常细胞以及线粒体电子传输链复合物(I)或复合物(III)活性的至少一种标准抑制剂，所述标准抑制剂选自鱼藤酮和抗霉素A。
附图说明
图1表示哺乳动物细胞的厌氧和有氧途径的示意图。(修改自Lemire等，2008，PLoSONE，3(2)卷，e1250)
图2表示指示癌症干细胞中线粒体活性的参数。A：FL1+(具有黑色短划线的白色背景)和FL10细胞群(白色)中Mito+细胞(通过在加入M75-13染料后通过对FL3阳性细胞的数量定量来确定)的百分比以及通过FACS中的FL1-H和FL3-H通道检测的FL1+细胞(黑色)中FL1自体荧光的水平。
图3示出了与FL10、原代神经胶质瘤和正常脑细胞相比的FL1+细胞降低的糖酵解活性。A：FL1+和FL10细胞的代谢水平(LAC：乳酸(lactate)，PYR：丙酮酸(pyruvate)，GLUC：葡萄糖)。B和C：乳酸(LAC)增加对相差成像的FL1+细胞形态(B)和FL10细胞百分含量(C)的影响。未处理的(NT)；比例尺：150μM。D：在纯化的FL1+和FL10细胞中活性乳酸脱氢酶的水平(以UI/L表达的LD)。
图4示出了DCA或草酸盐处理对FL1+细胞的影响，所述影响基于用上述试剂处理的样品中与处理载体对照的样品中死亡的FL1+细胞百分比的比值。A：DCA处理(氧化途径的活化剂)。B：草酸盐处理(细胞质基质的乳酸脱氢酶3-5(LDH3-5)的抑制剂)。
图5示出了实施例2中描述的用于测试抗癌症干细胞试剂的方案。A：治疗及恢复期间的实验操作。B：用有效的(黑色粗线)抗SCS试剂或无效的(黑色粗虚线)抗SCS试剂处理CIC之后的存活响应曲线的示意图。Tx代表处理了x时间的期间，例如10天(T10)、20天(T20)，R代表特定时间期间的恢复阶段，如10天(R10)和20天(R20)。
图6示出了实施例2所描述的体外复发分析中药物的效果，用存活的处理过的FL1+百分含量与存活的对照FL1+百分含量的比(1)，或者存活的处理过的细胞的百分含量与存活的对照细胞的百分含量的比(2)来表示。A：25Gy的γ-射线。B：25μM的替莫唑胺(TMZ)。C：5μM的鱼藤酮(Rot)；D：5μM的抗霉素A(AA)。E：5μM的寡霉素A/B(Oligo A)。F：氯丙咪嗪，又称为氯米帕明(anfranil)(10μM)。Tx代表处理了x时间的期间，例如10天(T10)、20天(T20)，R代表特定时间期间的恢复阶段，如10天(R10)和20天(R20)。
图7示出了用不同抑制剂处理的细胞的体内致肿瘤性。曲线图示出了在用原代GBM-2细胞注射之后的所有无病症小鼠总数的百分比，所述原代GBM-2细胞在植入前用不同分子在体外处理了10天。对照小鼠在植入4周后出现病症并被处死。组织学分析表明有块状肿瘤的存在。植入有用AA、鱼藤酮或氯米帕明处理的细胞的小鼠仍然存活并没有病症。实验在植入后17周停止。组织学分析表明没有可见的肿瘤。
具体实施方式
尽管与本文描述的方法或材料相似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但是下面描述合适的方法与材料。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其参考文献都通过引用并入它们的全部内容。提供本文所讨论的出版物和申请仅是针对其在本申请提交日之前的公开。本文并不被解释为承认本发明无权凭借在先发明而这些出版物。此外，材料、方法和实施例都只是说明性的，并不是为了限定。
在有冲突的情况下，本说明书，包括定义，将作为标准。
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语与本领域技术人员的通常理解一致。当在本文中使用时，为了方便理解本发明，提供以下定义。
术语“含有”一般用于表达包含的意思，即是说允许存在一个或多个特征或组分。
除非上下文中另外清楚地表述，当在本说明书与权利要求书中使用时，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括有复数的含义。
当在本文中使用时，术语“受试者”或“患者”是本领域中公知的，在本文可交替地用于表示哺乳动物，包括狗、猫、大鼠、小鼠、猴子、牛、马、山羊、绵羊、猪、骆驼，以及最优选地，人。在某些实施方案中，所述受试者是需要治疗的受试者，或患有疾病或病症的受试者，所述疾病或病症例如癌症，优选神经胶质瘤。然而，在其他实施方案中，受试者可以是正常受试者或已经经过治疗的受试者，所述治疗例如神经胶质瘤实体的前期移除。这一术语不表示具体年龄或性别。因此，成熟和新生受试者，无论雄性或雌性，都将被覆盖。
在治疗表现神经胶质瘤起始细胞的癌症中有用试剂例如抑制剂的识别，是指运用可靠的筛选方法识别、分离并表征整个癌症起始细胞(CIC)库。优选使用由一般从常规干细胞生物学(Burdsal等，1995，Cytometry，21，145-152)外推得到的任意标记物(如作为干性的读出的CD133)确定的癌细胞系例如神经胶质瘤细胞系的方法被认为是有偏差的。
因此，本申请人采用在国际专利申请PCT/IB2008/054872中描述的他们近期所开发的方法来分离和富集表现出自我更新和肿瘤起始性质的亚群。这种方法依赖于来源于人样本的原代细胞培养物并依赖于肿瘤细胞的简单、强大的表型特征，并且允许从非致瘤性神经胶质瘤细胞(被称为FL10细胞)中快速的识别和分离癌症起始细胞(CIC)(在本方法中被称为FL1+细胞)，而不依赖于任何细胞表面标记，例如CD133。
本申请人出乎意料地发现，癌症起始细胞(CIC)，例如神经胶质瘤起始细胞，(更具体而言，本文使用的FL1+细胞群)确实使用有氧途径(TCA循环/氧化磷酸化-电子转移链)来产生它们的能量、分裂以及存活。本申请人还出乎意料地发现，神经胶质瘤起始细胞(GIC)与来自肿瘤实体的其他神经胶质瘤细胞(癌细胞)相比，具有不同的代谢方式，肿瘤实体优先使用有氧糖酵解(Warburg’s效应)。本申请人确实得到了一个有趣且出乎意料的的发现，FL1+细胞(GIC)富有NADH、活性线粒体和活性LD。此外，与FL10细胞相比，FL1+细胞具有较低的乳酸水平，这表明FL1+细胞可能优先于采用有氧-线粒体途径来产生ATP。
PCT/IB2008/054872所述方法有以下步骤：
(a)提供肿瘤细胞样品；
(b)在培养基中任选地培养在步骤(a)中提供的细胞；
(c)在亚样品中从根据步骤(a)或(b)提供的细胞中分离表现自发荧光发射的细胞(FL1+细胞)，当通过荧光活化细胞分选的方法用波长为或约为488纳米的激光束激发时，在FL1通道中检测所述自发荧光发射。
(d)在另一亚样品中通过荧光活化细胞分选法分离在步骤(c)中没有荧光性的细胞(FL10细胞)以及在FL3和/或FL4通道中检测的荧光中表现出微小正偏移的细胞；
(e)从根据步骤(c)和(d)获得的每个分离细胞亚样品中排除死细胞；
(f)在根据步骤(e)处理之后汇集根据步骤(c)得到的细胞亚样品；
(g)在根据步骤(e)处理之后汇集根据步骤(d)得到的细胞亚样品。
FL1+和FL10神经胶质瘤细胞群之间的体外和体内的表型和行为差异由进一步的表征支持，所述表征证明FL1+细胞富有干性相关基因、是多能性的、能够产生FL10细胞并且是超长时间保持长期自我更新能力的原因。因为源自FL10的培养物不产生任何FL1+细胞的培养基，其进一步证明FL10细胞来源于FL1+细胞群，保持存活若干代，但一旦它们从FL1+状态转变为FL10状态它们就不能重新获得自发荧光的性质。因此，这种方法和这种分离出的细胞群提供了用于测试试剂如抑制剂的可靠的技术，所述试剂可以用于治疗表现神经胶质瘤起始细胞的癌症。
采用筛选他们设计的抗GIC试剂的特异性的新型体外复发分析法，本申请人发现，标靶氧化性细胞能量制造过程的试剂如抑制剂表现出了可靠的持续时间长的根除CICs的功效。因此，防止NADH在线粒体复合物I或III中转化为细胞ATP并诱导H2O2生成的抑制剂，可以被认为是针对神经胶质瘤起始细胞的新型的特异性治疗策略。
采用上述用于识别GIC的强大的技术，本申请人还开发了一种强大且可靠的筛选工具来识别特异性的和有效的抗GIC试剂。
通过利用本申请人的上述技术和他们设计用于测试和验证特异性的抗CSC试剂(抗癌症干细胞试剂)的体外分析法，本申请人证明，阻止通过有氧途径产生的能量制造足以杀死整个CIC细胞群(所述杀死通过饿死CIC而不是通过凋亡来完成)。干扰电子传输链如在复合物I和III水平上线粒体的电子传输链的抑制剂表现出在体外和体内杀死每个神经胶质瘤起始细胞的特殊能力。由于复合物I和III的抑制剂会产生大量的活性氧物质(ROS)和自由基，所以CIC也很有可能由于ROS的堆积或解毒系统的饱和而被杀死。
与其他优先利用肿瘤细胞系和干细胞标记如CD133作为干性读出的方法相比，本申请人的技术依靠来源于人样本的原代细胞培养物以及依赖于独立于任何标记物的使用的简单且无偏差的CIC检测。因此本申请人利用这种方法设计并开发了体外复发分析法来筛选和验证用于根除神经胶质瘤中癌症干细胞的潜在治疗试剂。在被转移回没有任何试剂如抑制剂的恢复阶段(恢复：R)之前，使CIC、原代神经胶质瘤细胞和正常脑细胞暴露于试剂如抑制剂最多20天，优选10天或20天(处理：T)。新颖性本文的在于用于测试任何药物的效用的干性读出以及识别特异性抗CSC试剂的可能性。
基本上，任何试剂或抑制剂可以被认为是有效的抗CSC试剂，只要其符合以下条件：
1)在暴露于所述试剂或抑制剂最多20天的时间里，GIC(FL1+细胞)的存活降低超过50％；
2)在最多20天的恢复阶段的时间里，GIC(FL1+细胞)的恢复低于0.2倍；以及
3)在暴露于所述试剂或抑制剂期间以及之后，正常脑细胞的存活是可持续和可恢复的。
优选地，所述试剂或抑制剂是电子传输链和/或线粒体TCA循环活性的抑制剂。
作为本申请人的体外复发分析法的概念和验证的证据，测试了γ-辐射和目前用于GBM的首要细胞毒性试剂替莫唑胺的效用。与FBS-培养的神经胶质瘤细胞相比，～40％的FL1+细胞能够耐受25Gy的辐射，存活并因此在基因毒性压力后30天内恢复，这证实了辐射主要不是靶向到CIC亚群而是肿瘤实体中快速分化的细胞。之前的替莫唑胺治疗，如Hegi等，N Engl J Med.，2005，352(10)，997-1003中所描述的，首次测试了神经胶质瘤球(gliomasphere)细胞中MGMT启动子的甲基化状态，预测了神经胶质瘤球细胞应当是对替莫唑胺敏感的。然而，即使用25μM的替莫唑胺处理多达20天之后，这比临床使用剂量高5倍，仍有超过30％的FL1+细胞存活，并能在20天内恢复(0.2＜R＜1)。
从表型和分子观点看，根据定义，GBM是高度异质的肿瘤。在区别地被激活或沉默的信号传导途径中，在～60％的GBM中表皮生长因子受体(EGFR)信号级联被放大/过表达，并且在～65％的GBM中PI3K/AKT/PTEN信号级联在PTEN表达中显示变化。相似的，PTEN的丧失似乎与不良预后和辐射耐受性相关。使用5μM埃罗替尼的长期处理在超过50％的FL1+细胞中诱导细胞死亡，仅在2/6GBM中诱导细胞死亡，而与EGFR状态无关，这因此证实EGFR基因的扩增与对EGFR激酶抑制剂如吉非替尼或埃罗替尼的响应能力无关。此外，所有的神经胶质瘤球培养物均能在10天内从处理中恢复，这表明在受体水平上阻断EGFR信号传导途径是无效的。
主要的发育途径如Notch、SHH-Gli和WNT、mTOR与若干人肿瘤有关，通常包括神经胶质瘤，但很少有研究系统地强调它们在人癌症干细胞中的作用。更具体而言，用环巴胺抑制SHH-Gli的活性，或用γ-分泌酶抑制剂DAPT抑制NOTCH信号传导途径的活性，或通过潜在的影响癌症起始细胞群的增殖和自我更新来降低肿瘤生长。相似但不完全相同的，用特癌适抑制mTOR，或分别用5μM环巴胺的或5μM的DAPT靶向发育途径如SHH-Gli或NOTCH引起存活FL1+细胞的数量的降低。但是，即使在治疗20天后仍能观察到残留的CIC，并导致CIC群的快速恢复，这些药物仍被认为是无效的。
根据活性线粒体的数量、代谢的含量以及无氧能量制造途径的抑制剂的效用，与FL10细胞相比，FL1+细胞很可能优先通过有氧途径来制造它们的能量。因此，本申请人提出这样的概念，任何具有抑制线粒体活性有效能力的试剂都会削弱CIC中的能量制造，很可能杀死CIC。这一概念通过本发明所使用的体外复发分析法进行测试，并筛选电子传输链(如鱼藤酮，抗霉素A，安那芬尼)和质子泵(寡霉素A/B)的抑制剂。暴露于5μM的鱼藤酮或抗霉素A或安那芬尼(氯丙咪嗪)或寡霉素A/B 20天杀死所有的FL1+细胞。对于治疗的开发和治疗策略的设计，本申请人缩短了暴露于抑制有氧途径的试剂的时间，发现10天的治疗甚至足以杀死整个CIC库。为了测试这些抑制剂对CIC的特异性，使正常脑细胞和原代神经胶质瘤细胞(FBS培养物)暴露于上述线粒体试剂10天。发现正常脑细胞和原代神经胶质瘤细胞对寡霉素A/B也是敏感的，这表明阻断线粒体复合物IV活性可能不是合适的，因为其确实影响正常脑细胞的存活。虽然轻微地影响生长和增殖，但是暴露于抗霉素A或安那芬尼以及在较小程度上暴露于鱼藤酮允许正常脑细胞存活，并因此打开了作为治疗药物的前景。有趣的是，在FBS中培养的原代神经胶质瘤可以抵抗这些试剂，这进一步证实了来自肿瘤实体的细胞具有与CIC不同的代谢方式。
本发明提供神经胶质瘤起始细胞(GIC)中电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性的抑制剂，所述抑制剂用于在进行过神经胶质瘤实体先期移除的受试者中预防和/或治疗表现神经胶质瘤起始细胞(GIC)的肿瘤的方法，其中，所述抑制剂满足以下条件：
1)在暴露于所述电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂最多20天的时间里，GIC的存活降低超过50％；
2)在最多20天的恢复阶段的时间里，GIC的复发低于0.2倍；以及
3)在暴露于所述电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂期间和之后，正常脑细胞的存活是可持续和可恢复的。
并且由此，所述电子传输链和/或线粒体TCA循环活性的抑制剂阻止由GIC制造能量。
优选地，神经胶质瘤实体的所述移除是指神经胶质瘤实体的部分切除。
优选地，所述神经胶质瘤起始细胞(GIC)中电子传输链和/或线粒体TCA循环活性的抑制剂以相当于最多10倍IC2剂量的剂量施用。最优选地，所述IC2剂量在0.157至0.315mg/kg的范围。
表现神经胶质瘤起始细胞(GIC)的肿瘤优选选自神经胶质瘤、神经鞘瘤、转移到脑组织的肿瘤、脑膜瘤、室管膜细胞瘤、星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、少突星形细胞瘤、复发性癌症以及转移性癌症。
术语“样品”包括来自任何来源的组织或液体样品，例如来自于患有癌症、具有复发癌症或疑似患有例如人神经胶质瘤、神经鞘瘤、转移到脑组织的肿瘤、脑膜瘤、星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、少突星形细胞瘤和室管膜细胞瘤的癌症的患者(例如哺乳动物患者，更具体而言，人类患者)的组织或液体样品。在另一个实施方案中，所述样品包括来自任何来源的组织或液体样品，例如来自于患有转移性癌症或怀疑患有例如从黑色素瘤，乳腺癌，结肠癌，肺癌转移至大脑的癌症的患者(例如哺乳动物患者，更具体而言，人类患者)的组织或液体样品。
术语“癌症干细胞样品”是指选自含有根据本发明所述的FL1+和FL10细胞的混合物的神经胶质瘤球培养物(如实施例中所述的那样培养)或含有两种被分离的FL1+或FL10细胞群的样品，其中细胞通过根据本发明的方法分离。
术语“癌细胞样品”包括新鲜地从肿瘤样品中解离的细胞样品，或从肿瘤样品中解离之后经过培养的细胞样品，例如，诸如在干细胞培养基等中培养的神经胶质瘤球培养物、诸如在富含血清的培养基等中培养的附着的细胞培养物以及诸如在分化培养基等中培养的分化的细胞培养物。
本文所使用的术语“肿瘤”(或瘤)是指赘生物或由于细胞异常生长形成的赘生物或固态病变。肿瘤可以是良性的，癌前的或恶性的。肿瘤可能与中枢和外周神经系统、转移至脑部和肺部转移、急性粒细胞性白血病(AML)、乳腺肿瘤、结肠肿瘤和卵巢肿瘤有关。此外，术语肿瘤还包括诸如神经胶质瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、室管膜细胞瘤、星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、少突星形细胞瘤、黑色素瘤。
术语“干细胞培养基等”包括其中铺展有来源于新鲜解离的组织样品的癌症干细胞(也成为神经胶质瘤球)的培养基。例如，神经干细胞培养基包括用1/1’000的盘尼西林-链霉素(Gibco公司)、B27(1/50Gibco公司)或BIT9500(20％Stem cell Technologies公司)、30mM的羟乙基哌嗪乙硫磺酸(Sigma-Aldrich公司)、人重组EGF(20ng/mlInvitrogen公司)以及碱性FGF-2(20ng/ml Invitrogen公司)补充的DMEM-F12-Ham’s(Gibco公司)。
术语“富含血清的培养基等”包括其中铺展有来源于新鲜解离的组织样品的附着培养物的培养基。(例如10％的FBS，用1/1’000的盘尼西林-链霉素(Gibco公司)补充的DMEM-F12-Ham’s(Gibco公司))。
术语“分化培养基等”包括其中铺板有癌症干细胞的用于分析其多潜能能力的培养基，例如涂覆有在水中1∶100稀释的聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白(sigma公司)混合物的平板，用于37摄氏度下O/N。解离细胞并以10个细胞/μl的密度铺板于用1/1000(Gibco公司)地盘尼西林-链霉素、B27(1/50Gibco公司)或BIT9500(20％Stem cell Technologies公司)、30mM的羟乙基哌嗪乙硫磺酸(Sigma-Aldrich公司)补充的DMEM-F12-Ham’s(Gibco公司)中。
术语“FL1通道”是诸如在Practical Flow Cytometry，Shapiro等，第四版，2003，Wiley & Sons，Inc.中描述的荧光的纵向检测通道。典型地，对于488nm的激发波长，在FL1通道中以520nm或约520nm的波长进行自发荧光的检测。
术语“FL3通道”是诸如在Practical Flow Cytometry，Shapiro等，第四版，2003，Wiley & Sons，Inc.中描述的荧光的侧向检测(45度)通道。典型地，对于488nm的激发波长，在FL3通道中以＞630nm的波长进行自发荧光的检测。
术语“FL4通道”是诸如在Practical Flow Cytometry，Shapiro等，第四版，2003，Wiley & Sons，Inc.中描述的荧光的侧向检测通道。典型地，对于632nm或约632nm的或者546nm或约546nm的激发波长，在FL4通道中以＞630nm的波长进行自发荧光的检测。
术语“正常脑细胞”是指具有正常生理功能未患有任何疾病或病症如肿瘤的健康脑细胞。术语“正常脑细胞的存活是可持续的和可恢复的”是指在暴露于本发明的抑制剂期间或之后，正常脑细胞保持其正常的生理功能并且不被削弱。
术语“FL1+细胞”或“FL1-H细胞”或“GIC”或“CIC”是指通过本发明所述的方法由荧光活化细胞分选法所分选的细胞，尤其是通过选择性检测和分选表现特定形态(高FSC和低/中SSC)的细胞以及在用激光束激发细胞亚样品时在FL1通道中检测的自发荧光发射。这种亚样品存在于当以488纳米(例如蓝色激光束，如氩)激发时表现出在FL1通道中以约520nm的波长检测的自发荧光发射的细胞亚群中。更具体而言，可以在FL1通道中用530nm+/-15分光镜，或更紧密地用515nm+/-5分光镜检测FL1自发荧光，这证实FL1自发荧光发射光谱的特异性。
术语“FL10细胞”或“非FL1-H细胞”或“无自发荧光细胞”是指通过本发明所述的方法由荧光活化细胞分选法所分选的细胞，尤其是通过选择性地检测和分选表现特定形态(低/中FSC和中/高SSC)、在FL1通道中不是荧光性的并且表现在FL3或FL4通道中检测到的荧光中轻微的正偏移的细胞。
术语“FL1-细胞”或“原代神经胶质瘤细胞”或“FBS培养的神经胶质瘤细胞”是指在10％的FBS培养基中培养的、附着性的、不是通过本发明所述的方法由荧光活化细胞分选法所分选的细胞。这些细胞表现特定形态(中FSC和高SSC)、高的细胞质/细胞核比例(＞1)并且在FL1通道或Fl3或FL4通道中都不是荧光性的。
术语“高FSC”或“高FSC-H”或“高FSC-A”是指前向散射并对应于粒径和速率的测定(细胞直径在5至7μm之间)。
术语“低/中FSC”或“低/中FSC-H”或“低/中FSC-A”是指前向尺寸散射并对应于细胞尺寸(细胞直径＜5至7μm)。
术语“中/高SSC”或“中/高SSC-H”或“中/高SSC-A”是指侧向或直角散射并对应于细胞复杂性或粒度(具有大的细胞质和颗粒的细胞)。
术语“低/中SSC”或“低/中SSC-H”或“低/中SSC-A”是指侧向或直角散射并对应于细胞复杂性或粒度(具有无颗粒的且限定在细胞核周围的细胞质的细胞)。
典型地，FL1+或FL1-H细胞结合了“高FSC”或“高FSC-H”或“高FSC-A”与“低/中SSC”或“低/中SSC-H”或“低/中SSC-A”，并因此细胞核/细胞质直径比＞1。
典型地，FL10或非FL1-H细胞结合了“低/中FSC”或“低/中FSC-H”或“低/中FSC-A”与“中/高SSC”或“中/高SSC-H”或“中/高SSC-A”，并因此细胞核/细胞质直径比＜1。
术语“干细胞培养基”是适用于干细胞培养的培养基。典型地，干细胞培养基包括例如促细胞分裂原(碱性FGF-2，EGF)和无补充培养基(B27或BIT9500)。
术语“球原性(spherogenicity)”包括单个干细胞对称或不对称的分裂形成克隆体的能力。这种克隆体被称为球体，更准确的说，当所述球体是衍生自神经胶质瘤时，其被称为神经胶质瘤球。这种能力可以通过无性繁殖分析法来检测，所述无性繁殖分析法也称为自我更新分析法，例如在PCT/IB2008/054872中所描述的。自我更新分析法确实可以检测出单个细胞形成克隆体的能力，但不是所有的克隆体都会形成球体。只有干细胞或正常发育中的早期先祖细胞或某些癌症类型表现球原性的潜力，并且这种特性存在于神经和神经胶质瘤干细胞中。
术语“多潜能性”包括细胞分化为若干细胞类型的能力，例如，对于来自中枢神经系统的细胞而言，多潜能性是指分化为诸如GFAP(星形胶质细胞)、NESTIN(神经祖细胞)、TUJ1(神经元)的细胞的能力。
术语“恢复阶段”包括在处理之后，FL1+细胞和FL10细胞被转移回干细胞培养基中。
术语“复发”是指在用试剂处理之后，癌症干细胞存活以保持其固有性质(在FL1通道中的自发荧光、球原性)、其分裂能力以及任选地保持其他性质(例如通过分化标记物的表达检测的分化能力、通过干性标记物的表达检测的干性性质以及使用氧化-还原比色法(MTS)通过NAD/NADPH+酶的活性和比率测定的代谢特性)的能力。复发的检测通过本发明所述的筛选分析法来进行，并包括在处理之后分析FL1+和FL10细胞的存在及比例，如图5所总结的。复发水平将以在恢复期期间存活的处理后的癌症干细胞的比例为基础并根据未观察到癌症干细胞复发的恢复期的长度来评价。
本文所用术语“有效量”是指根据本发明的至少一种化合物或其药学制剂的量，所述能够在目标组织、系统、动物或人体产生所要求的生物学或医学响应。在一个实施方案中，所述有效剂量是用于缓解要被治疗的疾病或病症的症状的“治疗有效量”。这一术语在本文中还包括足以减轻疾病发展，特别是指缓解或抑制复发过程(例如妨碍复发的发生，或降低复发过程的频率或程度)，和/或引起并由此产生目标所要求的响应的活性化合物的量(例如“抑制有效量”)。
根据本发明，术语治疗的“效用”，可以根据相应于本发明的用法或方法的疾病过程中的变化来检测。例如，根据本发明的治疗的效用依赖于两个条件：
-杀死FL1+细胞的能力，其通过10或20天后存活的FL1+细胞至少降低50％来测定；
-FL1+细胞没有恢复(r＜0.2)，其通过治疗后至少20天后存活的FL1+细胞的数量来测定。
本发明治疗的效用可通过患者状况的改善以及本发明的治疗对患者的积极影响来测定。
术语“抑制癌症干细胞复发的能力”是指试剂在处理之后以及处理后的恢复期的观察之后能够减少癌症干细胞样品中癌症干细胞数量的性质。优选地，抑制癌症干细胞复发的能力是指根除癌症干细胞样品中的癌症干细胞并且在恢复期观察之后避免这些细胞复发的能力。
本文中可互换使用的术语“抗肿瘤试剂”或“治疗试剂”或“试剂”包括易于具有肿瘤治疗活性例如在肿瘤治疗中有效的分子或化合物，所述治疗如降低或停止肿瘤的生长、预防、降低或停止肿瘤的复发。其包括已知的对癌症具有治疗活性的试剂或研究发现对肿瘤具有治疗活性的试剂。术语“抗肿瘤试剂”或“治疗试剂”或“试剂”还包括任何分子(如化学的，生物学的)或任何外部/环境因素(如机械的，辐射)。
本文所用“治疗”和“进行治疗”等一般表示获得了期望的药理学或生理学效果。这些效果在防止或部分地防止诸如癌症(神经胶质瘤)的疾病、其症状和病症方面可以是预防性的，和/或在部分或完全治愈疾病、病症、症状或归因于所述疾病的副作用方面可以是治疗性的。本文所用术语“治疗”覆盖哺乳动物特别是人类中的所有治疗，包括：(a)防止疾病例如癌症(神经胶质瘤)在受试者中发生，所述受试者已经进行过治疗，例如手术(切除或部分切除)、放疗和/或化疗，或可能有倾向患有疾病但还未被确诊；(b)抑制疾病，例如癌症(神经胶质瘤)，即阻止其发展；或缓解疾病，即引起疾病和/或其症状或病症的复原。
在本发明的情况下使用的术语“抑制剂”被定义为完全或部分抑制生物分子活性的分子。
术语“线粒体活性抑制剂”被定义为氧化细胞能量制造过程的抑制剂，典型地，是有氧细胞代谢的抑制剂。氧化细胞能量制造过程抑制剂包括细胞三羧酸(TCA)或柠檬酸循环(碳水化合物、脂肪和蛋白质化学转化为二氧化碳和水产生可使用形式的能量)的抑制剂，或细胞氧化(有氧)糖酵解(在细胞质中由葡萄糖代谢为丙酮酸根)的抑制剂，或糖酵解底物(丙酮酸根)氧化磷酸化的抑制剂。典型地，线粒体活性抑制剂是在体外和体内复发分析法中显示阻断电子传输链或氧化磷酸化导致产生活性氧物质(ROS)的能力的试剂。
如本文所使用的，电子传输链活性的抑制剂，例如可以是二亚苯基碘氯化物(DPI)或其衍生物。二亚苯基碘氯化物(DPI)与黄素蛋白牢固地结合，因此是若干重要的酶，包括一氧化氮合成酶(NOS)、NADPH-泛醌氧化还原酶、NADPH氧化酶和NADPH细胞色素P450氧化还原酶，的强力的特异性的抑制剂。
优选地，电子传输链和/或线粒体TCA循环的抑制剂是二亚苯基碘氯化物(DPI)和其衍生物。
更有选地，电子传输链和/或线粒体TCA循环的抑制剂是线粒体电子传输链的复合物(I)和/或复合物(III)活性的抑制剂。
术语“线粒体电子传输链的复合物(I)活性的抑制剂”包括抑制线粒体复合物I活性的试剂。例如，氧化磷酸化复合物(I)的抑制剂包括在NADH脱氢酶结合位点与线粒体复合物I结合的试剂(Hogan & Singer，1967，Biochem.Biophys.Res.Commun.，27(3)：356-60)，如鱼藤酮，一种已知的杀虫剂，及其衍生物。鱼藤酮衍生物包括芳基叠氮紫穗槐素(arylazidoamorphigenin)、螺甾酮型拟鱼藤酮、灰叶素、紫穗槐素、12a-羟基紫穗槐素、12a-羟基达潘醇和6’-O-D-吡喃葡萄糖基达潘醇(6’-O-D-glucopyranosyldalpanol)。
“线粒体电子传输链复合物(III)活性的抑制剂”包括抑制线粒体复合物III活性的试剂。例如，氧化磷酸化复合物(III)的抑制剂包括抑制复合物III催化活性的抑制剂，如抗霉素A，一种已知的抗真菌剂，及其衍生物。抗霉素A衍生物包括黏噻唑菌醇、标桩菌素的十三烷基类似物(Hu等，2008，Tetrahedron letters，49(35)：5192-5195)。氧化磷酸化复合物(III)的抑制剂的其他实例包括任何二本西平衍生物，其是已知的抗抑郁药，例如氯丙咪嗪，一种双重血清素-去甲肾上腺素再摄入抑制剂(Anafranil
Figure BPA00001464029100151
)或其衍生物及类似物，如丙咪嗪和氯丙嗪。丙咪嗪及其盐酸盐公开于美国专利2,554,736，其噻嘧啶盐公开于在美国专利3,326,896。丙咪嗪及其盐是口服活性的二本西平三环抗抑郁药。氧化磷酸化复合物(III)的抑制的其他剂实例有甘草查耳酮A、壳二孢氯素和嗜球果伞素B(Strobilirubin B)。
双重血清素-去甲肾上腺素再摄入抑制剂(DSNRI)，其抑制血清素和去甲肾上腺素的再摄入，包括文拉法辛(Effexor
Figure BPA00001464029100152
)、文拉法辛代谢物O-去甲文拉法辛、氯丙咪嗪(Anafranil
Figure BPA00001464029100153
)、氯丙咪嗪代谢物去甲氯丙咪嗪(Cymbalta
Figure BPA00001464029100154
)、米那普仑和丙咪嗪(Tofranil
Figure BPA00001464029100155
或Janimine
Figure BPA00001464029100156
)。
他们的化学名称、商品名称、结构、治疗学和药理学信息以及治疗种类可以在文献中找到，例如Merck Index，第九版1976，Goodman & Gilman，The PharmacologicalBasis of Therapeutics，第九版1996，和the Physician′s Desk Reference 2004。
通常根据本发明，抑制剂抑制线粒体氧化磷酸化复合物(I)的活性或线粒体氧化磷酸化复合物(III)的活性。
然而，一些抑制剂如标桩菌素、黏噻唑菌醇、杀粉蝶菌素或其衍生物和类似物可以同时抑制线粒体氧化磷酸化复合物(I)和复合物(III)的活性。上述双重抑制剂可以是更强力的抑制剂，因此可以是需要较低浓度的更强的抗GIC试剂。
表1列出了放疗和化疗或临床试验中所使用的经典试剂、所引用的文献出处以及在体外复发分析法中所使用的计量。
表2和3列出了靶向有氧/无氧途径的试剂、所引用的文献出处以及在体外复发分析法中所使用的计量。
优选地，线粒体电子传输链复合物(I)和/或(III)活性的抑制剂选自鱼藤酮、抗霉素A、丙咪嗪、氯丙咪嗪、黏噻唑菌醇、标桩菌素、嗜球果伞素b、甘草查尔酮A、壳二孢氯素、杀粉蝶菌素和/或它们的组合和/或它们的衍生物和/或它们的药学可接受的盐。
例如，线粒体电子传输链复合物(I)和(III)活性的抑制剂的所述组合包括鱼藤酮与抗霉素A组合或者鱼藤酮与氯丙咪嗪组合。
最优选地，线粒体电子传输链复合物(I)和/或(III)活性的抑制剂选自黏噻唑菌醇、标桩菌素、杀粉蝶菌素和/或它们的衍生物和/或它们的药学可接受的盐。
术语“线粒体TCA循环活性的抑制剂”包括通常由底物可用性、内源性和/或外源性的终产物来确定的化合物。线粒体TCA循环活性的抑制剂例如有NADH和ATP、柠檬酸盐、乙酰辅酶A、TCA的钙抑制关键酶，例如异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶以及柠檬酸合成酶。优选地，根据本发明，线粒体TCA循环的活性可以由电子传输链的抑制剂间接地抑制，诸如选自鱼藤酮、抗霉素A、丙咪嗪、氯丙咪嗪、黏噻唑菌醇、标桩菌素、嗜球果伞素b、甘草查尔酮A、壳二孢氯素、杀粉蝶菌素和/或它们的组合和/或它们的衍生物和/或它们的药学可接受的盐的线粒体电子传输链复合物(I)和复合物(III)的抑制剂。
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在另一实施方案中，本发明提供具有协同和/或积累效应的本发明的不同抑制剂的组合。例如，可以执行线粒体电子传输链复合物(I)和复合物(III)的抑制剂的组合，如鱼藤酮和抗霉素的组合或鱼藤酮和氯米帕明的组合，从而优化治疗的效用，以根除整个GIC库。如之前所观察的，抑制剂的这种组合可以降低每种抑制剂独立的剂量，其能够协同地或积累地杀死GIC。这种组合和协同的实例有：Clement等，2007和Stecca等，2007。
术语“产生ROS的试剂”是能够诱导细胞中活性氧物质(ROS)和自由基水平升高的试剂。典型地，这种试剂包括桂皮醛、过氧化氢、放线菌素D和喜树碱(camptotecin)。
本文所使用的术语“电子传输链”(ETC)是通过一系列介导的生化反应，连接电子给体(如NADH)和电子受体(如O2)之间的化学反应以将H+离子跨膜转移。当这些H+离子重新跨膜回来时，其可用于制造三磷酸腺苷(ATP)，活生物体中主要的能量中间物。例如，使用氧作为呼吸作用一部分的大多数真核细胞含有由柠檬酸循环、脂肪酸氧化和氨基酸氧化的产物制造ATP的线粒体。在线粒体内膜上，来自NADH和琥珀酸根的电子通过电子传输链传递给氧，氧被还原为水。在线粒体中，已经识别了四种涉及电子传输链的膜结合复合物。每种复合物都是嵌入到内膜中的非常复杂的跨膜结构。这四种复合物是复合物(I)(NADH脱氢酶，也称为NADH：泛醌氧化还原酶)、复合物(II)(琥珀酸脱氢酶)、复合物(III)(细胞色素bc1复合物)和复合物(IV)(细胞色素c氧化酶)。
电子传输链也是过早电子泄露给氧的主要位点，因而成为产生过氧化物和氧化应激驱动的主要位点。
如本文所使用的，“TCA循环”(三羧酸循环)，也被称为柠檬酸循环，是一系列酶催化的化学反应，其在使用氧作为细胞呼吸作用一部分的所有细胞中都非常重要。在真核细胞中，TCA循环在线粒体的基质中发生。
术语“神经胶质瘤实体的移除”是指从患者的上神经胶质瘤实体的任何移除、摘除或切除。所述移除可以是化学的、辐射或外科手术。优选地，所述移除是手术，例如摘除或切除。切除可以是“部分切除”(或部分切除术)，一种从受试者上移除部分器官或腺体的手术程序。它也可以用于移除肿瘤及其周围的正常组织。
术语“阻止由GIC制造能量”是指抑制神经胶质瘤起始细胞(GIC)中发生的将生化能量从营养物质转化为三磷酸腺苷(ATP)的代谢反应和过程。通常阻碍能量制造意味着细胞会饿死。
术语“复发癌症”或“复发肿瘤”是指通常在检测不到癌症的一段时间之后再次发生(恢复)的癌症，例如神经胶质瘤。癌症可能恢复到原来(原发)肿瘤的同一部位或受试者身体的其他位置。
术语“减积试剂”包括能够杀死肿瘤实体中癌细胞(例如FL10和FL1-细胞)的任何分子(例如化学的或生物学的)或任何外部/环境试剂(例如γ-辐射)或传统手术。
术语“标准放疗”是指将电离辐射作为控制恶性细胞的肿瘤治疗的一部分。优选地，所述电离辐射是γ-辐射。将放疗与手术、化疗、激素疗法或它们的组合结合也是常见的。大多数常见的癌症类型通常可以用放疗进行治疗。精确的治疗目的(治疗的、辅助的、新辅助的或缓和的)将取决于肿瘤的类型、部位和阶段以及需要进行治疗的受试者的一般健康状况。
术语“标准化疗”一般是指用特定的化疗的/化学的试剂治疗癌症的方法。化疗试剂是指一般用于治疗癌症的药物试剂。治疗癌症的化疗试剂包括，例如，顺式铂氨、脱羧铂氨、依托泊苷、长春新碱、环磷酰胺、阿霉素、异环磷酰胺、紫杉醇、吉西他滨、多西他赛和伊立替康，以及基于铂的抗癌试剂，包括顺式铂氨和脱羧铂氨。其他化疗种类包括酪氨酸激酶抑制剂，例如吉非替尼、伊马替尼；法尼基转移酶抑制剂，包括洛那法尼(lonafarnib)；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂如依维莫司(evereolimus)；血管生成抑制剂，包括贝伐单抗、萨尼替比(sunitibid)和西仑吉肽；PKC的抑制剂；PI3K和AKT。更具体地，本发明的化疗试剂包括烷基化试剂如替莫唑胺或卡莫司汀。根据本发明，针对标准化疗优选的试剂是替莫唑胺和贝伐单抗。
神经胶质瘤的标准放疗和化疗也可以是联合放化疗。术语“联合放化疗”用于当两种治疗(化疗和放疗)同时或几乎同时使用的情况，例如一种紧接着另一种，或在同一天等。神经胶质瘤的其他标准放疗和化疗方法可以伴随和辅助的莫唑胺和放疗的组合放化疗(TMZ/RT→TMZ)(Stupp等，2005，2009)。
在本发明的涉及预防和/或治疗表现神经胶质瘤起始细胞的肿瘤的方法中，很重要的一点是受试者进行过神经胶质瘤实体先期移除。确实，根据初期所表现出来的症状(癫痫发作、病灶神经障碍、颅内高血压的迹象、性格扭曲)，组织专业随访并进行成像，常常会由放射学方法发现颅内肿块。虽然放射学特征和患者病史能够产生对肿瘤类型和病因的推测，但是具有说服力的结论仍将通过病理学检查以及随后的活组织切片或全切除获得。因此，神经胶质瘤实体的移除，例如通过部分切除(活组织切片或全切除)，常常是在施用治疗有效剂量的本发明所述电子传输链和/或线粒体TCA循环活性抑制剂之前进行。例如可以通过标准手术方法移除神经胶质瘤实体。这种减积步骤允许移除神经胶质瘤起始细胞(在高级别神经胶质瘤中神经胶质瘤实体的最多5-7％)和主要含有神经胶质瘤细胞、巨噬细胞、内皮细胞(神经胶质瘤实体的约93-95％)的剩余肿瘤。
另一个实施方案中，在手术移除神经胶质瘤实体之后，施用治疗有效量的本发明的电子传输链和/或线粒体TCA循环活性抑制剂或含有所述抑制剂的药物组合物，用于预防和防治复发。
神经胶质瘤起始细胞的代谢与神经胶质瘤实体细胞以及正常脑细胞不同，用于减积的特定试剂(根除FL10细胞和FL1-细胞)和神经胶质瘤起始细胞的特定抑制剂(根除FL10细胞)的组合可以是根除神经胶质瘤生长和复发的有利策略。因此，任选地，标准放疗和/或化疗可以在施用治疗有效量的本发明的电子传输链和/或线粒体TCA循环活性抑制剂或含有所述抑制剂的药物组合物之前、同时或之后进行。如果标准化疗与施用治疗有效量的本发明的电子传输链和/或线粒体TCA循环活性抑制剂同时进行，则化疗试剂可以以相同或不同的组合物形式以及通过相同或不同的施用途径施用。
优选地，标准放疗和/或化疗在施用治疗有效量的本发明的电子传输链和/或线粒体TCA循环活性抑制剂或含有所述抑制剂的药物组合物之前或之后进行。
例如，在施用治疗有效量的本发明的电子传输链和/或线粒体TCA循环活性抑制剂或含有所述抑制剂的药物组合物之后应用标准放疗和/或化疗得到以下事实的支持：本申请人观察到从致瘤性(FL1+细胞)到非致瘤性状态(FL10细胞)的表型转化是不可逆的，并且与导致分化和细胞死亡的倾向相关。因此一种替代的治疗策略可以包括，首先在GIC细胞中诱导从有氧糖醇解向无氧糖酵解的代谢转化，以使每一个单FL1+细胞转化成FL10细胞表型；其次使用减积试剂(即放疗和/或化疗)，任选地与神经外科手术组合，以根除整个FL10细胞和FL1-细胞群。在施用治疗有效量的本发明的电子传输链和/或线粒体TCA循环活性抑制剂或含有所述抑制剂的药物组合物之后应用标准的放疗和/或化疗，还得到以下事实的支持：GIC耐受标准放疗和/或化疗，并在标准放疗和/或化疗之后恢复(图6)。
在另一个实例中，在施用治疗有效量的本发明的电子传输链和/或线粒体TCA循环活性抑制剂或含有所述抑制剂的药物组合物之前应用标准放疗和/或化疗，能够用于治疗和/或预防复发性神经胶质瘤。
本发明还提供一种用于在已经进行过神经胶质瘤实体的先期移除的受试者中预防和/或治疗表现神经胶质瘤起始细胞的肿瘤的方法的给药方案。
对于短期剂量响应，使GIC暴露于增加剂量的抑制剂48小时。然后通过本发明所述方法分析GIC的存活、细胞死亡和恢复。针对长期处理的剂量选择(即10或20天后恢复)相当于与对照分子相比诱导细胞死亡的总数的2倍增加(即双倍)的抑制剂的剂量，这一剂量被称为IC2。与标准IC50相反，IC50相当于48小时诱导至少50％细胞死亡的剂量，本申请人的IC2允许确定非常低的并因此没有毒性的剂量。
根据本发明，IC2优选在0.157至0.315mg/kg的范围，这取决于抑制剂。如果没有观察到毒性的迹象，根据本发明的给药方案最高可达IC2剂量的10倍，即1.57至3.15mg/kg。这个剂量可以使适合且足够剂量的抑制剂通过血脑屏障并扩散进入肿瘤部位的机会最大化。
以单一剂量或多计量施用给受试者剂量，可以根据各种因素而变化，这些因素包括药代动力学性质、患者状况和特征(性别、年龄、体重、健康状况、大小)、病症范围、同时进行的治疗、治疗频率和预期效果。
治疗通常可以包括本发明的电子传输链和/或线粒体TCA循环活性抑制剂或含有所述抑制剂的药物组合物的多次施用，通常以若干小时、天或周的间隔。
本发明所提供用于治疗进行过神经胶质瘤实体先期移除的受试者的抑制剂、药物组合物和方法，所述受试者优选为哺乳动物受试者，最优选为患有表现神经胶质瘤起始细胞的肿瘤或表现神经胶质瘤起始细胞的复发性肿瘤的人类患者，在具体的实施方案中，所述人类患者患有人神经胶质瘤、神经鞘瘤、转移到脑部的肿瘤、脑膜瘤、室管膜细胞瘤，复发性癌症如复发神经胶质瘤，转移性癌症如黑色素瘤、乳腺癌，结肠癌或肺癌。
本发明还提供在进行过神经胶质瘤实体的先期移除的受试者中预防和/或治疗表现神经胶质瘤起始细胞的肿瘤的方法，所述方法包括施用治疗有效量的电子传输链和/或线粒体TCA循环活性抑制剂，其中所述抑制剂满足以下条件：
1)在暴露于所述电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂最多20天的时间里，GIC的存活降低超过50％；
2)在最多20天的恢复阶段的时间里，GIC的恢复低于0.2倍；以及
3)在暴露于所述电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂期间和之后，正常脑细胞的存活是可持续和可恢复的；
并由此，所述电子传输链和/或线粒体TCA循环活性的抑制剂阻止由GIC制造能量。
优选地，所述神经胶质瘤实体的移除是神经胶质瘤实体的部分切除。
优选地，所述治疗有效剂量为最多10倍IC2的剂量。最优选地，所述IC2剂量在0.157到0.315mg/kg的范围。
在一个替代的实施方案中，本发明的在进行过神经胶质瘤实体先期移除的受试者中预防和/或治疗表现神经胶质瘤起始细胞的肿瘤的方法还可以包括在施用治疗有效量的所述电子传输链和/或线粒体TCA循环活性抑制剂之前或之后通过标准放疗和/或化疗治疗的步骤。
优选地，所述电子传输链和/或线粒体TCA循环活性抑制剂是二亚苯基碘氯化物(DPI)及其衍生物。在另一个实施方案中，优选地，所述电子传输链和/或线粒体TCA循环活性抑制剂是线粒体电子传输链复合物(I)和/或复合物(III)的活性抑制剂。
优选地，所述表现神经胶质瘤起始细胞的肿瘤选自神经胶质瘤、神经鞘瘤、转移到脑组织的肿瘤、脑膜瘤、室管膜细胞瘤、星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、少突星形细胞瘤、复发性癌症以及转移性癌症。
本发明还提供用于在进行过神经胶质瘤实体先期移除的患者中预防和/或治疗表现神经胶质瘤起始细胞的肿瘤的药物组合物，所述药物组合物含有至少一种根据本发明所述的电子传输链和/或线粒体TCA循环活性抑制剂，和一种或多种药学可接受的稀释剂或载体。
优选地，本发明的药物组合物包含线粒体电子传输链复合物(I)活性的一种抑制剂与线粒体电子传输链复合物(III)活性的一种抑制剂的组合，以及一种或多种药学可接受的稀释剂或载体。
根据本发明所述电子传输链和/或线粒体TCA循环活性抑制剂可以被配制为药物组合物，所述药物组合物可以以本文所述的任何形式包含至少一种本发明所述的电子传输链和/或线粒体TCA循环活性抑制剂。本发明的药物组合物可以还含有一种或多种药学可接受的稀释剂或载体，例如但不限于明矾、稳定剂、抗菌剂、缓冲剂、着色剂、调味剂、佐剂等。
本发明的针对肠道外和肠道施用的药物组合物可以包含任何常规添加剂，如赋形剂、佐剂、粘接剂、崩解剂、分散剂、润滑剂、稀释剂、吸收增强剂、缓冲剂、表面活性剂、增溶剂、防腐剂、乳化剂、等渗剂、稳定剂、注射增溶剂、pH调节剂等。
可接受的载体、稀释剂和佐剂在使用剂量和浓度下对受试者(患者)是无毒的，其有利于将本发明的抑制剂加工成药学上能够使用的药物组合物，并可以包含缓冲剂如磷酸、柠檬酸或其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；氯化苄烷铵；苯索氯铵，苯酚，丁醇或苯甲醇(butylorbenzyl alcohol)；对-羟基苯甲酸烷基酯如对-羟基苯甲酸甲酯或对-羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐的反离子，如钠；金属复合物(如锌-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEEN、PLURONICS
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或聚乙二醇(PEG)。
本发明的电子传输链和/或线粒体TCA循环活性抑制剂以及通常使用的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂可以被置于药物组合物及其单位剂量的形式中，其在这种形式中可以以固体形式如片剂或填充的胶囊剂或者液体形式如溶液剂、混悬剂、乳剂、酏剂或填充了相同物的胶囊剂使用，所有形式用于口服使用，或以无菌注射溶液的形式用于肠道外(包括皮下的)使用。这种药物组合物及其单一剂型可以包含常规比例的成分，含有或不含有额外的活性化合物或要素，并且这些单一剂型可包含任何合适的有效量的活性成分，所述活性成分相当于待使用的预期每日剂量范围。
至少含有一种电子传输链和/或线粒体TCA循环活性抑制剂的本发明的药物组合物，也可以是液体制剂，包括但不限于，水或油混悬剂、溶液剂、乳剂、糖浆和酏剂。适合于口服施用的液体形式可包括含有缓冲剂的水性或非水性载体、悬浮剂和分散剂、着色剂、香料等。本发明的药物组合物也可以被配制成在使用前用水或其它适合的载体复溶的干产品。这种液体制剂可包含添加剂，所述添加剂包括但不限于，悬浮剂、乳化剂、非水性载体和防腐剂。悬浮剂包括但不限于，山梨糖醇糖浆、甲基纤维素、葡萄糖/蔗糖糖浆、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶和氢化食用脂。乳化剂包括但不限于，卵磷脂、山梨醇酐单油酸酯和阿拉伯树胶。非水性载体包括但不限于，食用油、杏仁油、精馏椰子油、油性酯、丙二醇和乙醇。防腐剂包括但不限于，对羟基苯甲酸甲酯或丙酯以及山梨酸。其它材料及生产工艺等在Remington’s PharmaceuticalSciences，第二十版，2000，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania的第五部分中列出，其通过引用并入本文。
在一个实施方案中，根据本发明的受试者是患有表现神经胶质瘤起始细胞的癌症的患者。在一个具体实施方案中，根据本发明的患者患有人神经胶质瘤、神经鞘瘤、转移到脑部的肿瘤、脑膜瘤或室管膜细胞瘤。另一个具体实施方案中，根据本发明的患者患有复发性癌症，如复发性神经胶质瘤。在另一个实施方案中，根据本发明的患者患有转移性癌症，如黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌或肺癌。
本发明的电子传输链和/或线粒体TCA循环活性抑制剂或含有所述抑制剂的药物组合物能够通过各种途径施用，例如肠胃外的或肠内的途径。肠胃外的施用包括静脉内施用、肌内施用、动脉内施用或大脑内施用。肠内施用包括任何口服施用、胃部施用或直肠施用。本发明的组合物的递送方法包括用于抗癌药物的已知递送方法，如远端静脉内(intra-venal peripheral)注射、肿瘤内注射或任何类型的颅内递送如增强对流递送(CED)(Bobo等，1994，PNAS，91(6)，2076-2080；Lino等，2009，Curr.Opin.Cell Biol.，21，311-316)。
根据发明的另一实施方案，根据本发明的电子传输链和/或线粒体TCA循环活性抑制剂和含有所述抑制剂的药物组合物可以单独施用或与在癌症治疗中有用的助剂例如用于放疗和/或化疗中直接针对实体瘤的物质组合使用。例如，助剂选自减积试剂如替莫唑胺(temozolimide)或γ-辐射。
本发明还提供用于识别神经胶质瘤起始细胞(GIC)中电子传输链和/或线粒体TCA循环活性抑制剂的筛选方法。所述方法包括使分离自肿瘤细胞样本的FL1+细胞和正常脑细胞与待筛选的抑制剂接触，其中所述抑制剂满足以下条件：
1)在暴露于所述抑制剂最多20天的时间里，FL1+细胞的存活降低超过50％；
2)在最多20天的恢复阶段的时间里，FL1+细胞的恢复低于0.2倍；以及
3)在暴露于所述抑制剂期间和之后，正常脑细胞的存活是可持续和可恢复的。
本发明的筛选方法还包括使原代神经胶质瘤细胞与待筛选得所述抑制剂接触。
本发明还提供了用于筛选满足以下条件的神经胶质瘤起始细胞(GIC)中电子传输链和/或线粒体TCA循环活性抑制剂的试剂盒：
1)在暴露于所述抑制剂最多20天的时间里，FL1+细胞的存活降低超过50％；
2)在最多20天的恢复阶段的时间里，FL1+细胞的恢复低于0.2倍；以及
3)在暴露于所述抑制剂期间和之后，正常脑细胞的存活是可持续和可恢复的；
并且用于治疗表现神经胶质瘤起始细胞的肿瘤，其中所述试剂盒含有原代CIC培养物、原代附着的神经胶质瘤细胞、正常细胞以及至少一种线粒体电子传输链复合物(I)或复合物(III)活性的标准抑制剂，所述标准抑制剂选自鱼藤酮和抗霉素A。
本文所述的试剂盒还可以包括描述如何进行抑制剂的筛选信息材料。所述信息材料还可以包括如何确定所测试的抑制剂是否符合本发明的条件。试剂盒的信息材料不限于其形式。在很多情况下，所述信息材料如说明书以印刷品如打印的文本、图形和/或照片例如标签或印张的形式提供。但是，所述信息材料也可以以其他格式提供，如盲文、计算机可读材料、录像或录音。当然，所述信息材料也可以以这些格式的任何组合的形式提供。
所述试剂盒可以进一步包含试剂和信息材料的独立的容器、分隔物或隔间。容器可以被适当地标记。
本发明的电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂、其用途、方法以及试剂盒，具有允许杀死癌症干细胞的整个群、在标准癌症治疗例如标准手术、放疗和化疗之后避免癌症干细胞复发的优点。这些特别的性质在特别是用于肿瘤预防和/或治疗的情况下表现突出优点，其中它们可以与标准肿瘤减积试剂组合使用，能够杀死癌细胞例如神经胶质瘤细胞和肿瘤起始细胞例如神经胶质瘤起始细胞，抑制由于标准癌症治疗之后残留的癌症干细胞引起的癌症复发。
本领域技术人员应当理解，本文所描述的发明除了明确描述的那些发明之外还允许变化和修改。应当理解，在不脱离其精神或本质特征的情况下，本发明包括了所有的这些变化和修改。本发明还独立地或共同地包括本说明书中所引用的或说明的所有的步骤、特征、组合物和化合物，以及任何和所有组合，或任何两种或多种所述步骤或特征。因此，本公开应当被理解为在所有方面都是说明性的而不是限定性的。本发明的范围由所附权利要求书显示，并且在等同物的范围和意义内的所有变化都包括在其中。
参照一下实施例，将更充分地理解上文的说明。但是，这些实施例是实施本发明的示例性方法，并不是为了限定本发明的范围。
实施例
一般程序和条件
下述实施例证实了癌症起始细胞中有氧能量生产途径的作用，以及癌症起始细胞线粒体活性抑制剂在癌症治疗中的潜在活性。
下述缩写分别表示以下定义：
Gy(戈瑞)、mM(毫摩尔)、μM(微摩尔)、nm(纳米)、AML(急性粒细胞白血病)、ATP(三磷酸腺苷)、BIT 9500(牛血清白蛋白、胰岛素、转铁蛋白(transferring))、BSA(牛血清白蛋白)、CIC(癌症起始细胞)、DAPT(N-[N-(3，5-二氟苯乙酰基-L-丙氨酰)]-S-苯基甘氨酸t-丁基酯)、DCA(二氯乙酸)、DMSO(二甲基亚砜)、EGF(表皮生长因子)、DMEM(Dulbecco改进的Eagle培养基)，FBS(胎牛血清)、FSC(前向散射)、FGF-2(成纤细胞生长因子2)、GBM(成胶质细胞瘤)、GLC(葡萄糖)、LD(乳酸脱氢酶)、MGMT(O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶)、MTS([3-(4，5-二甲基-2-基)-5-(3-羧基甲氧苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑，内盐)、NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)、NB(正常脑部细胞)、OD(光密度)、PFA(低聚甲醛)、PBS(磷酸盐缓冲盐水)、ROS(活性氧物质)、R(恢复)、r(部分恢复)、SC(干细胞)、SSC(侧向散射)、T(治疗)。
所使用的筛选方法被描述于PCT/IB2008/054872中，例如，包含以下步骤：
a)提供癌症干细胞样品；
b)用试剂处理步骤(a)中提供的癌症干细胞样品；
c)在干细胞培养基中培养处理的干细胞样品一个周期，不做处理；
d)从根据步骤(c)培养的干细胞样品中选出存活的细胞群；
e)在用波长为或约为488纳米的激光束激发时，通过采用荧光活化细胞分选法在FL1通道中检测表现自发荧光发射的细胞来测量根据步骤(d)分离的存活细胞群的自发荧光的平均水平；
f)在用波长为或约为488纳米的激光束激发根据步骤(d)分离的存活细胞群时，通过采用发用荧光活化细胞分选法，分离具有特定形态(高FSC和低/中SSC)并且在FL1通道中表现自发荧光发射的细胞；
g)在用激光束激发根据步骤(d)分离的存活细胞群时，通过采用荧光活化细胞分选法，分离具有特定形态(低/中等FSC和中等/高SSC)并且根据步骤(d)在FL1通道中不表现自发荧光发射而在FL3和/或FL4通道中表现细胞荧光发射的轻微正偏移的细胞；
h)通过比较根据步骤(a)提供的癌症干细胞样品中自发荧光的平均水平与根据步骤(e)检测的自发荧光的平均水平来计算自发荧光性存活细胞的百分比。
i)通过比较存在于根据步骤(a)提供的癌症干细胞样品中初始细胞的数目与根据步骤(d)分离得到的存活细胞群的细胞数目来计算细胞死亡的百分比；
j)通过比较存在于根据步骤(a)提供的癌症干细胞样品中初始FL1+细胞的数目与根据步骤(f)分离得到的存活FL1+细胞群的细胞数目来计算存活FL1+细胞的百分比；
k)通过比较存在于根据步骤(a)提供的癌症干细胞样品中初始FL10细胞的数目与根据步骤(g)分离得到的存活FL10细胞群的细胞数目来计算出活得FL10细胞所占百分比；
l)检测根据步骤(f)和(g)所检测的细胞群的球原性；
m)通过试剂抑制癌症干细胞复发的能力来确定其活性。
使用以下材料：
●根据PCT/IB2008/054872中描述的方法制备的6个原代CIC细胞的培养物；
●在用1/1000的盘尼西林/链霉素补充的含有DMEM-F12-Glutamax、10％的胎牛血清(FBS，Invitrogen公司)的FBS培养基中培养2种被称为癌细胞的原代附着神经胶质瘤细胞和2种正常脑细胞。
用于测试试剂杀死CIC的杀伤效用(在筛选试剂盒中选择)的其他兼性参数(facultative parameter)包括：
●增殖细胞(例如Ki67+细胞)的百分比，如下：在治疗和/或恢复之后，采集细胞，清洗，并用4％的PFA固定。用含有0.1％TritonX-100的PBS1x-BSA1％对细胞进行渗透，然后用溶于PBS1x-BSA1％中的抗人Ki67抗体染色(在冰上旋转培养30分钟)。用PBS1x清洗细胞2次，然后用在PBS1x-BSA1％中再次稀释的二级抗体培养(4摄氏度下旋转30分钟)。最后，用FACS测定FL1+和FL10细胞群中Ki67+细胞的百分比。
●用实时PCR(例如OCT4，SOX2，NANOG或NOTCH1)表达干性基因，如下：在治疗和/或恢复之后，采集细胞。用RNAqueous-Micro试剂盒(Ambion公司)提取所有的RNA。用Superscript II(Invitrogen公司)进行反转录。用SYBER green master mix(Applied Biosystems公司)进行定量的RT-PCR反应，样品在7900HT序列检测系统设备上操作(Applied Biosystems公司)。引物序列参考Clement，2007，Curr Biol，17，165-172。
●表达至少一种分化标记(TUJ1，MAP2或GFAP)，如下：在治疗和/或恢复之后，采集细胞，清洗，并用4％的PFA固定。用含有0.1％TritonX-100的PBS1x-BSA 1％对细胞进行渗透，然后用溶于PBS1x-BSA 1％中的抗人MAP2或抗人GFAP或抗人TUJ1抗体染色(在冰上旋转培养30分钟)。用PBS1x清洗细胞2次，然后用在PBS1x-BSA1％中再次稀释的二级抗体培养(4摄氏度下旋转30分钟)。最后，用FACS测定FL1+和FL10细胞群中阳性细胞的百分比。
本发明所用方法中根据步骤(a)所用的肿瘤细胞样品(例如人来源的)通过获取对应肿瘤组织的活体切片来制备，其在无菌条件下用适用于要采集的特定细胞的标准方法获取。如下表4和表5列出了所用的肿瘤和正常脑部样品：
表4
表5
  组织   来源   部位   性别   年龄
NB3 非致瘤性癫痫患者 颞左侧 M 17
NB3 非致瘤性癫痫患者 未测得 F 27
实施例1：证明氧化细胞能量产生过程和癌症起始FL1 + 细胞群的线粒体活性的分析
图1示出了细胞中的无氧和有氧途径。糖酵解是一种在细胞质中将葡萄糖代谢为丙酮酸的过程。在缺氧状态下，丙酮酸会被LDH转化为乳酸：1GLC→2ATP。
三羧酸(TCA)组合氧化磷酸化(OXPHOS)是利用从糖酵解得到的丙酮酸、通过NADH和FADH2到线粒体中呼吸链复合物的电子转移以及质子梯度泵从ADP产生ATP的过程。在有氧条件下：1GLC→36ATP。
通过测定以下参数研究癌症起始细胞中的代谢途径：
●活性线粒体(例如M75-13)的数目：采集细胞，解离、洗涤并在37摄氏度下在DMEM-F12-Glutamax 1/1000盘林西尼/链霉素中用以250nM最终浓度稀释的M75-13培养30分钟。染色后，用PBS1x洗涤细胞两次，并用FacsCan在FL1和FL3通道中分析。最终在FL1+和FL3+细胞群中测定Mito+细胞(即FL3+)的百分比。
●用基于MTS氧化还原的反应测定NADH水平：如PCT/IB2008/054872所描述的那样，根据FL1+和FL10细胞纯化被解离的神经胶质瘤球(gliomaspheres)。根据制造商的说明利用水性单溶液细胞增殖分析仪(AQueous One Solution Cell ProliferationAssay)(Promega公司)间接评价NADH的水平。在96孔板读取器(Biorad公司)于490nm处进行检测。
●乳酸水平：根据PCT/IB2008/054872所描述的方法存储CIC。通过重复如下冻-融循环两次(-80℃下5分钟，37℃下2分钟)将1.5 105纯化的FL1+和/或FL10细胞溶解于100μL无菌水中。然后将溶解物在4摄氏度下1500rpm离心5分钟，将上清液转移到新的1.5ml的微管中。取3μl与乳酸氧化酶(700U/L)、过氧化物酶(508U/L)、DCBSA(2mmol/L)和4-氨基安替比林(1.16mmol/L)混合并用SYNCHRON系统(Beckman Coulter公司)根据厂商的说明书进行分析。
●葡萄糖水平：根据PCT/IB2008/054872所描述的方法存储CIC。通过重复如下冻-融循环两次(-80℃下5分钟，37℃下2分钟)将1.5 105纯化的FL1+和FL10细胞溶解于100μL无菌水中。然后将溶解物在4摄氏度下1500rpm离心5分钟，将上清液转移到新的1.5ml的微管中。取10μl与葡萄糖氧化酶(150U/L)、变性乙醇(5％)、碘化钾(0.04mmol/L)和钼酸铵(0.036mmol/L)混合并用SYNCHRON系统(Beckman Coulter公司)根据厂商的说明书进行分析。
●丙酮酸水平：根据PCT/IB2008/054872所描述的方法存储CIC。通过重复如下冻-融循环两次(-80℃下5分钟，37℃下2分钟)将1.5 105纯化的FL1+和FL10细胞溶解于100μL无菌水中。然后将溶解物在4摄氏度下1500rpm离心5分钟，将上清液转移到新的1.5ml的微管中。乳酸水平用HPLC进行检测。
●LD水平：根据PCT/IB2008/054872所描述的方法存储CIC。通过重复如下冻-融循环两次(-80℃下5分钟，37℃下2分钟)将1.5 105纯化的FL1+和FL10细胞溶解于100μL无菌水中。然后将溶解物在4摄氏度下1500rpm离心5分钟，将上清液转移到新的1.5ml的微管中。取13μl与乳酸(50mmol/L)和NAD(11mmol/L)混合并用SYNCHRON系统(Beckman Coulter公司)根据厂商的说明书进行分析。
对于每一个分析，进行储存细胞的三个独立组进行三重平行分析。这些实验表明，与FL10细胞相比，FL1+细胞富含NADH，其确实含有更多数量的活性线粒体，因而可能具有更高的代谢活性(图2)。此外，与FL10细胞相比，FL1+细胞在体内和体外具有低乳酸水平(图3A)。加入外源性的乳酸10天足以诱导细胞附着(图3B)并使细胞向FL10表型转变(图3C)。与FL10细胞相比，CIC具有高活性LD水平(图3D)。
已知的激活细胞氧化途径的化合物(DCA，已知激活氧化途径，和草氨酸，已知抑制胞质LDH3-5，参见Michelakis等，2008，Br J Cancer，99，989-994以及Lemire等，2008，PLoS ONE，3，e1550)对CIC的作用效果测试如下：
对于短期/剂量响应(48小时)：将解离的神经胶质瘤球细胞、附着的神经胶质瘤和正常细胞以10个细胞/μl铺板于DMEM-F12Glutamax、BIT20％或B27(1/50)、盘林西尼/链霉素1/1000中，使用1ng/ml的降低的促分裂原或降低水平的血清(2.5％)。
对于长期治疗/恢复分析(T10和/或T20)：将解离的神经胶质瘤球细胞、附着的神经胶质瘤和正常细胞以2个细胞/μl铺板于DMEM-F12Glutamax、30mM的羟乙基哌嗪乙硫磺酸、BIT20％或B27(1/50)、盘林西尼/链霉素1/1000中，使用1ng/ml的降低的促分裂原或降低水平的血清(2.5％)。
对于恢复，采集细胞，用PBS1x洗涤，再放回它们的标准培养基中(例如对神经胶质瘤球，在DMEM-F12 Glutamax、BIT20％或B27(1/50)、羟乙基哌嗪乙硫磺酸30mM、1％的盘林西尼/链霉素中，使用10ng/ml的促分裂原；对原代神经胶质瘤细胞和正常细胞，在DMEM-F12 Glutamax、10％的FBS、的盘林西尼/链霉素1％)。
结果显示，FL1+细胞没有被将细胞推向活性有氧途径或抑制无氧途径的试剂杀死，如FL1+细胞的比例所示，其在暴露于增加的DCA或草氨酸甚至10天之后没有明显变化(图4)。相反的，在这样处理后，FL1+细胞显示甚至更健康的趋势和较少的分化。因此，可以认为与有氧糖酵解体系下的FL10或FL1-细胞相比，FL1+细胞优先采用有氧途径(TCA和氧化磷酸化-电子传输链)来产生能量。此外，从有氧到有氧糖酵解的代谢转换和分化倾向密切相关，并且二者都是不可逆的过程。
实施例2：测试潜在的抗癌症干细胞试剂(抑制剂)
根据线粒体活性、代谢物含量以及无氧能量产生途径的抑制剂效果的结果(在实施例1中描述)，与有氧糖酵解体系下的FL10或FL1-细胞相比，FL1+细胞很可能优先采用有氧途径来产生自身能量。因此，任何具有抑制线粒体活性的有效能力的试剂会削弱CIC中的能量产生，这很可能杀死CIC。在图5和如下描述的体外复发分析中对此进行了测试：
对于短期/剂量响应(48小时)：将解离的神经胶质瘤球、附着的神经胶质瘤和正常细胞以10个细胞/μl铺板于DMEM-F12 Glutamax、BIT20％或B27(1/50)、盘林西尼/链霉素1/1000中，使用1ng/ml的降低的促分裂原或降低水平的血清(2.5％)。
对于长期治疗/恢复分析(T10和/或T20)：将解离的神经胶质瘤球、附着的神经胶质瘤和正常细胞以2个细胞/μl铺板于DMEM-F12Glutamax、羟乙基哌嗪乙硫磺酸30mM、BIT20％或B27(1/50)、盘林西尼/链霉素1/1000中，使用1ng/ml的降低的促分裂原或降低水平的血清(2.5％)。
对于恢复，采集细胞，用PBS1x洗涤，再放回它们的标准基质中(例如对于神经胶质瘤球，在DMEM-F12 Glutamax、BIT20％或B27(1/50)、羟乙基哌嗪乙硫磺酸30mM、盘林西尼/链霉素1/1000中，使用10ng/ml的促裂原；对于原代神经胶质瘤细胞和正常细胞，在DMEM-F12 Glutamax、10％FBS、盘林西尼/链霉素1/1000中)。
可以通过用本发明的试剂或抑制剂处理之后检测干细胞在细胞样品中的存在来测试用于降低和/或根除癌症干细胞(例如癌症干细胞的复发)的化合物的效果，例如，通过PCT/IB2008/054872中所描述的方法，即，包括以下步骤：
a)提供用发明的化合物或方法处理的癌症干细胞样品；
b)在干细胞培养基中将处理的干细胞样品培养一个培养周期，不做处理；
c)从根据步骤(b)培养的干细胞样品中选择存活的细胞群；
d)当用波长为或约为488纳米的激光束激发时，通过采用荧光活化细胞分选法检测在FL1通道中表现自发荧光发射的细胞来测量根据步骤(c)分离的存活细胞群的自发荧光的平均水平；
e)用荧光活化细胞分选法分离具有特定形态(高FSC和低/中SSC)并且当用波长为或约为488纳米的激光束激发根据步骤(c)分离的存活细胞群时在FL1通道中表现自发荧光发射的细胞；
f)用荧光活化细胞分选法分离具有特定形态(低/中FSC和中/高SSC)并且当用激光束激发根据步骤(c)分离的存活细胞群时在FL3和/或FL4通道中表现细胞荧光发射信号有轻微正偏移的细胞；
g)通过比较根据步骤(a)提供的癌症干细胞样品中自发荧光的平均水平与根据步骤(d)检测的自发荧光的平均水平来计算自发荧光性的存活细胞的百分比；
h)用过比较存在于根据步骤(a)提供的癌症干细胞样品中的原始细胞数目与根据步骤(c)分离的存活细胞群来计算细胞死亡的百分比；
i)通过比较存在于根据步骤(a)提供的癌症干细胞样品中的原始FL1+细胞数目与根据步骤(e)分离的存活FL1+细胞群来计算存活FL1+细胞的百分比；
j)通过比较存在于根据步骤(a)提供的癌症干细胞样品中的原始FL10细胞数目与根据步骤(f)分离的存活FL10细胞群来计算存活FL10细胞的百分比；
k)检测根据步骤(e)和(f)检测的细胞群的球原性；
l)通过试剂抑制癌症干细胞复发的能力来确定其活性。
所测试的化合物列于表2和表3中。
测试了γ-辐射(图6B1)和替莫唑胺(图6A1和A2)的效果，替莫唑胺是目前用于GBM的首要细胞毒性试剂。与FBS-培养的神经胶质瘤细胞相比，～40％的FL1+细胞耐受25Gy的辐射，存活并因此在基因毒性压力后三十天内恢复，这证实了辐射大部分没有靶向到CIC亚群，而是靶向到肿瘤实体中快速分裂的细胞。在替莫唑胺治疗之前，如Hegi等，2005，N.Engl.J.Med.，352，997-1003中所描述的那样测试神经胶质瘤球细胞中MGMT启动子的甲基化状态，预测神经胶质瘤球细胞会对替莫唑胺敏感。然而，即使用25μM的替莫唑胺处理20天之后，仍有超过30％的FL1+细胞存活，并因此能够在20天内恢复(0.2＜R＜1)。
使用5μM的埃罗替尼(EGFR信号传导途径的抑制剂，已知用于的非小细胞肺癌、胰腺癌和其他种类癌症的治疗)长期处理，只有在2/6GBM中诱导超过50％的FL1+细胞死亡，而与EGFR状态无关，这证实了EGFR基因的扩增与对EGFR激酶抑制剂如吉非替尼或埃罗替尼的响应能力无关。此外，所有的神经胶质瘤球培养物均能在10天内从处理中恢复，这表明在受体水平上阻断EGFR信号传导途径可能是无效的。相似但不完全相同的，用1μM特癌适抑制mTOR，或靶向发育途径如SHH-Gli或NOTCH(分别用5μM的环巴胺或5μM的DAPT)导致存活FL1+细胞的数量降低。但是，同样地，这些药物不能根除全部的FL1+细胞群，因而即使在20天的处理之后，它们也在10天内容易地恢复。
抑制线粒体复合物I(鱼藤酮)、复合物III(抗霉素A)或复合物IV(寡霉素A/B)可以杀死FL1+细胞群(图6A至C)。与阻断复合物I(图6A1和A2)和III(图6B1和B2)不同，用寡霉素A/B阻断复合物IV可以根除任何种类的脑细胞，包括正常脑细胞和神经胶质瘤细胞(图6C1和C2)。更具体而言，抑制复合物III(使用例如抗霉素A)对于CIC可能是更适合的，因为它不会真正影响到正常脑细胞的存活。
由于CIC的代谢与肿瘤实体细胞和正常脑细胞不同，因此特异性减积试剂(根除FL10和FL1-细胞)和CIC特异性试剂(根除FL1+细胞)的组合可以是根除人神经胶质瘤的生长与复发的有利策略。
在处理和恢复阶段所使用的条件培养基以及评价试剂杀死CIC的效能所需的条件，请参见图5A。

Claims (26)

1.神经胶质瘤起始细胞(GIC)中电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂，所述抑制剂用于在进行过神经胶质瘤实体先期移除的受试者中预防和/或治疗表现神经胶质瘤起始细胞(GIC)的肿瘤的方法，其中，所述抑制剂满足以下条件：
1)在暴露于所述电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂最多20天的时间里，GIC的存活降低超过50％；
2)在最多20天的恢复阶段的时间里，GIC的恢复低于0.2倍；
3)在暴露于所述电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制期间和之后，正常脑细胞的存活是可持续和可恢复的；
并且由此，所述电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂阻止由GIC产生能量。
2.如权利要求1所述的神经胶质瘤起始细胞(GIC)中电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂，其中神经胶质瘤实体的所述移除是神经胶质瘤实体的部分切除。
3.如权利要求2所述的神经胶质瘤起始细胞(GIC)中电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂，其中所述抑制剂以相当于10倍IC2剂量的剂量施用。
4.如权利要求1或3所述的神经胶质瘤起始细胞(GIC)中电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂，其中所述IC2剂量在0.157mg/kg至0.315mg/kg的范围。
5.如权利要求1至4所述的神经胶质瘤起始细胞(GIC)中电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂，其中所述抑制剂是二亚苯基碘氯化物(DPI)及其衍生物。
6.如权利要求1至5所述的神经胶质瘤起始细胞(GIC)中电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂，其中所述抑制剂是线粒体电子传输链的复合物(I)和/或复合物(III)的活性抑制剂。
7.如权利要求6所述的神经胶质瘤起始细胞(GIC)中电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂，其中所述线粒体电子传输链的复合物(I)和/或复合物(III)的活性抑制剂选自鱼藤酮、抗霉素A、丙咪嗪、氯丙咪嗪、黏噻唑菌醇、标桩菌素、嗜球果伞素b、甘草查耳酮A、壳二孢氯素、杀粉蝶菌素和/或它们的组合和/或它们的衍生物和/或它们的药学可接受的盐。
8.如权利要求7所述的神经胶质瘤起始细胞(GIC)中电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂，其中所组合包括将鱼藤酮与抗霉素A组合，或者将鱼藤酮与氯丙咪嗪组合。
9.如权利要求6所述的神经胶质瘤起始细胞(GIC)中电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂，其中所述线粒体电子传输链的复合物(I)和/或复合物(III)的活性抑制剂选自黏噻唑菌醇、标桩菌素、杀粉蝶菌素和/或它们的衍生物和/或它们的药学可接受的盐。
10.如权利要求1至9所述的神经胶质瘤起始细胞(GIC)中电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂，其中所述表现神经胶质瘤起始细胞(GIC)的肿瘤选自神经胶质瘤、神经鞘瘤、转移到脑组织的肿瘤、脑膜瘤、室管膜细胞瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、少突星形细胞瘤、复发性癌症和转移性癌症。
11.用于在进行过神经胶质瘤实体先期移除的受试者中预防和/或治疗表现神经胶质瘤起始细胞(GIC)的肿瘤的药物组合物，所述药物组合物包含至少一种如权利要求1至10中任一项所述的电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂，以及一种或多种药学可接受的稀释剂或载体。
12.如权利要求11所述的用于在进行过神经胶质瘤实体先期移除的受试者中预防和/或治疗表现神经胶质瘤起始细胞(GIC)的肿瘤的药物组合物，所述药物组合物包含一种线粒体电子传输链复合物(I)的活性抑制剂和一种线粒体电子传输链复合物(III)的活性抑制剂的组合，以及一种或多种药学可接受的稀释剂或载体。
13.在进行过神经胶质瘤实体先期移除的受试者中预防和/或治疗表现神经胶质瘤起始细胞(GIC)的肿瘤的方法，所述方法包括施用治疗有效量的电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂，其中，所述抑制剂满足以下条件：
1)在暴露于所述电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂最多20天的时间里，GIC的存活降低超过50％；
2)在最多20天的恢复阶段的时间里，GIC的恢复低于0.2倍；
3)在暴露于所述电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制期间和之后，正常脑细胞的存活是可持续和可恢复的；
并且由此，所述电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂阻止由GIC产生能量。
14.如权利要求13所述的在进行过神经胶质瘤实体先期移除的受试者中预防和/或治疗表现神经胶质瘤起始细胞(GIC)的肿瘤的方法，其中神经胶质瘤实体的所述移除是神经胶质瘤实体的部分切除。
15.如权利要求13至14所述的在进行过神经胶质瘤实体先期移除的受试者中预防和/或治疗表现神经胶质瘤起始细胞(GIC)的肿瘤的方法，其中所述治疗有效量为最多10倍IC2剂量。
16.如权利要求15所述的在进行过神经胶质瘤实体先期移除的受试者中预防和/或治疗表现神经胶质瘤起始细胞(GIC)的肿瘤的方法，其中所述IC2剂量在0.157mg/kg至0.315mg/kg的范围。
17.如权利要求13至16所述的在进行过神经胶质瘤实体先期移除的受试者中预防和/或治疗表现神经胶质瘤起始细胞(GIC)的肿瘤的方法，其中所述方法还包括，在施用治疗有效剂量的所述电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂之前或之后用标准放疗和/或化疗治疗的步骤。
18.如权利要求13至17所述的在进行过神经胶质瘤实体先期移除的受试者中预防和/或治疗表现神经胶质瘤起始细胞(GIC)的肿瘤的方法，其中所述电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂是二亚苯基碘氯化物(DPI)及其衍生物。
19.如权利要求13至18所述的在进行过神经胶质瘤实体先期移除的受试者中预防和/或治疗表现神经胶质瘤起始细胞(GIC)的肿瘤的方法，其中所述电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂是线粒体电子传输链的复合物(I)和/或复合物(III)的活性抑制剂。
20.如权利要求19所述的在进行过神经胶质瘤实体先期移除的受试者中预防和/或治疗表现神经胶质瘤起始细胞(GIC)的肿瘤的方法，其中所述线粒体电子传输链的复合物(I)和/或复合物(III)的活性抑制剂选自鱼藤酮、抗霉素A、丙咪嗪、氯丙咪嗪、黏噻唑菌醇、标桩菌素、嗜球果伞素b、甘草查耳酮A、壳二孢氯素、杀粉蝶菌素和/或它们的组合和/或它们的衍生物和/或它们的药学可接受的盐。
21.如权利要求20所述的在进行过神经胶质瘤实体先期移除的受试者中预防和/或治疗表现神经胶质瘤起始细胞(GIC)的肿瘤的方法，其中所述组合包括将鱼藤酮与抗霉素A组合，或者将鱼藤酮与氯丙咪嗪组合。
22.如权利要求20所述的在进行过神经胶质瘤实体先期移除的受试者中预防和/或治疗表现神经胶质瘤起始细胞(GIC)的肿瘤的方法，其中所述线粒体电子传输链的复合物(I)和/或复合物(III)的活性抑制剂选自黏噻唑菌醇、标桩菌素、杀粉蝶菌素和/或它们的衍生物和/或它们的药学可接受的盐。
23.如权利要求13至22所述的在进行过神经胶质瘤实体先期移除的受试者中预防和/或治疗表现神经胶质瘤起始细胞(GIC)的肿瘤的方法，其中所述表现神经胶质瘤起始细胞(GIC)的肿瘤选自神经胶质瘤、神经鞘瘤、转移到脑组织的肿瘤、脑膜瘤、室管膜细胞瘤、星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、少突星形细胞瘤、复发性癌症和转移性癌症。
24.用于识别神经胶质瘤起始细胞(GIC)中电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂的筛选方法，所述方法包括使从肿瘤的细胞样本中分离的FL1+细胞和正常脑细胞与带筛选的抑制剂接触，所述抑制剂满足以下条件：
1)在暴露于所述抑制剂最多20天的时间里，FL1+细胞的存活降低超过50％；
2)在最多20天的恢复阶段的时间里，FL1+细胞的恢复低于0.2倍；
3)在暴露于所述抑制剂期间和之后，正常脑细胞的存活是可持续和可恢复的。
25.用于识别神经胶质瘤起始细胞(GIC)中电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂的筛选方法，所述方法包括使原代神经胶质瘤细胞与所述待筛选的抑制剂接触。
26.用于筛选神经胶质瘤起始细胞(GIC)中电子传输链和/或线粒体TCA循环的活性抑制剂的试剂盒，所述抑制剂满足以下条件：
1)在暴露于所述抑制剂最多20天的时间里，FL1+细胞的存活降低超过50％；
2)在最多20天的恢复阶段的时间里，FL1+细胞的恢复低于0.2倍；
3)在暴露于所述抑制剂期间和之后，正常脑细胞的存活是可持续和可恢复的；
并且所述抑制剂在表现神经胶质瘤起始细胞的肿瘤的治疗中有用，其中所述试剂盒包含原代CIC培养物、原代附着的神经胶质瘤细胞、正常细胞以及选自鱼藤酮和抗霉素A中至少一种线粒体电子传输链的复合物(I)或复合物(III)的活性的标准抑制剂。
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