CN1774243A - 治疗组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了抑制或降低细胞内例如血管系统的细胞内特别是含有平滑肌的脉管系统和/或含有内皮细胞的脉管系统和/或含有血管外膜成纤维细胞的脉管系统的细胞内，活性氧自由基(ROS)产生的化合物、组合物和方法。也抑制了包括例如人类的哺乳动物在内的动物的非血管细胞内ROS的产生。此处构思的非血管细胞包括神经细胞、干细胞、先祖细胞和一些癌症和肿瘤细胞。更加特别地，本发明提供了能够调节NADPH氧化酶的活性、功能或水平因而控制超氧化物产生和下游ROS产生的试剂，甚至更特别地细胞非通透性试剂。本发明特别地实现了选择性针对含有Nox4的NADPH氧化酶形式的试剂，所述NADPH氧化酶具有所述酶的一部分，例如所有或部分细胞外暴露的Nox4组分。

Description

治疗组合物

发明背景

发明领域

本发明提供了抑制或降低细胞内，例如血管系统，尤其是含有平滑肌的脉管系统(vasculature)和/或含有内皮细胞的脉管系统和/或含有血管外膜成纤维细胞的脉管系统的细胞内，氧自由基(ROS)产生的化合物、组合物和方法。也抑制了包括例如人类的哺乳动物的动物非血管细胞内ROS的产生。此处预期的非血管细胞包括神经细胞、干细胞、先祖细胞和一些癌症和肿瘤细胞。更加特别地，本发明提供了能够调节NADPH氧化酶的活性、功能或水平因而控制超氧化物产生和下游ROS产生的试剂，甚至更特别地细胞非通透性试剂。本发明特别地实现了选择性抗含有Nox4的NADPH氧化酶形式的试剂，所述NADPH氧化酶具有所述酶的一部分，例如所有或部分细胞外暴露的Nox4组分。

现有技术的描述

作者在本发明中涉及的文献书目详情收录在本说明书的最后。

本详述中任何现有技术的参考文献不是并且不应当认作是承认或任何形式地暗示任何国家内此现有技术构成了普遍通识的一部分。

活性氧自由基(ROS)例如次氯酸盐、脂质过氧化物、过亚硝酸盐(peroxynitrite)、过氧化氢和羟自由基以及起源自由基超氧化物强烈参与动脉粥样硬化、细胞增殖、高血压和缺血再灌注。不仅例如动脉粥样硬化的所有危险因素增加了动脉壁内超氧化物的产生，而且ROS体外还诱导了许多“前动脉粥样硬化形成”的细胞反应。这些包括失活内皮衍生的一氧化氮(NO)[Gryglewski等人，自然320：454-456，1986；Paravicini等人，循环研究91：54-61，2002；Dusting等人，临床和实验药理学和生理学25：S34-41，1998]、上调粘附分子的表达[Lo等人，美国生理学杂志264：L406-412，1993]、刺激血管平滑肌细胞的增殖和迁移[Griendling和Ushio-Fukai，实验室临床医学杂志132：9-15，1998]以及氧化修饰脂蛋白[Lynch和Frei，脂质研究杂志34：1745-1753，1993]。这些观察导致了动脉粥样硬化的“氧化应激假说”，并激起了对抗氧化剂治疗动脉粥样硬化潜在益处的兴趣。虽然对于有高抗氧化剂例如维生素E和C饮食摄入的个人心血管疾病危险降低有流行病学的证据，但是随机试验未能证明在有高危心血管事件(event)的个人抗氧化治疗有任何临床益处[Yusuf等人，新英格兰医学杂志342：154-160，2000]。为什么传统抗氧化剂对血管疾病无效有很多原因。这些包括抗氧化剂由于吸收的不足或水相对脂相的分隔而在疾病位点的吸收很差，以及与ROS和重要的生物分子例如NO和脂蛋白的快速反应相比，它们和抗氧化物的慢反应动力学。另外，传统抗氧化剂通过引起超氧化物的一个电子的还原而起作用。这个导致了H₂0₂的形成，它本身是前动脉粥样硬化形成分子并且是甚至更加有害的ROS例如HOCl^-和OH^*的前体。明显地，设计快速去除超氧化物而不引起下游ROS产生的策略是需要的。

血管内ROS的主要来源是产超氧化物的NADPH氧化酶[Griendling等人，循环研究86：494-501，2000]，与负责噬菌细胞呼吸爆发的酶相似[Babior，血液93：1464-1476，1999]。NADPH氧化酶由膜结合细胞色素b558结构域和三个细胞质蛋白亚基p47phox、p67phox和小G蛋白质Rac组成。细胞色素结构域是异源二聚体蛋白，包含22Kda的α亚基以及底物结合和从NADPH至分子氧的电子转移必需的更大的含黄素的β亚基。当被激活时，细胞质组分转位到膜组分以允许活性氧化酶的组装。动脉周围环[Paravicini等人，2002，同上；Dusting等人，1998，同上]、遗传高胆固醇血症[Drummond等人，循环104.II-71，2001]、动脉球囊损伤术[Shi等人，动脉粥样硬化血栓形成血管生物学21：739-745，2001]、静脉移植[West等人，动脉粥样硬化血栓形成血管生物学21：189-194，2001]和高血压[Beswick等人，高血压38：1107-1111，2001]诱导的内膜增生启动了NADPH氧化酶。NADPH氧化酶产生血管超氧化物的增加也与人类动脉粥样硬化临床危险因素和有冠状动脉疾病的病人受损的内皮NO功能相连[Guzik等人，循环研究86：E85-90，2000]。重要地，小鼠NADPH氧化酶p47phox亚基的靶向破坏明显地降低了VSMC中超氧化物的产生并且显著地延迟了这些动物高胆固醇血症诱导的动脉粥样硬化[Barry-Lane等人，临床研究杂志108：1513-1522，2001]。共同地，这些数据提供了有力的证据，证明增加的NADPH氧化酶活性不仅是动脉粥样硬化的症状，也是该疾病病理形成的主要原因。

近来的研究提示NADPH氧化酶NADPH结合β亚基的性质依赖于细胞类型而不同。因而，虽然中性粒细胞中gp91phox与p22phox相联合[Babior，1999，同上]，这个蛋白质的同类物对于VSMC和内皮细胞中NADPH氧化酶的活性很重要[Ago等人，循环109(2)：227-233，2004]。VSMC表达不同于噬菌细胞NADPH氧化酶的NADPH氧化酶异构体的第一个线索是观察到VSMC缺乏gp91phox[Ushio-Fukai等人，生物化学杂志271：23317-23321，1996]。随后，显示无gp91phox小鼠的VSMC和全部动脉(aortas)仍然能够反应于NADPH而产生超氧化物(NADPH氧化酶的底物)[Barry-Lane等，2001，同上；Souza等，美国生理学心脏循环生理学杂志，280：658-667，2001]。假设gp91phox起中性粒细胞氧化酶关键催化亚基的作用[Babior，1999，同上]，肯定涉及一个替代的催化亚基。

最近，gp91phox的两个新型同源物，称为Nox1和Nox4，在培养的大鼠VSMC中鉴别出来[Lassegue等人，循环研究88：888-894，2001]。Nox4也被称为renox这个名字。这两个蛋白质含有NADPH的结合位点、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和血红素基团，使得它们是血管NADPH氧化酶关键催化亚基的有力候选[Lambeth等人，生物化学科学趋向25：459-461，2000]。尽管Nox4在兔和小鼠的VSMC和全部血管中有表达，在任何这些制备中未检测到Nox1的表达[Paravicini等，2002，同上；Dusting等，1998，同上]。同样地，其他团组对新鲜分离的人和大鼠动脉的研究证明了非常低的Nox1：Nox4比例(即＜0.5％)[Ritchie等人，欧洲药理学杂志461：171-179，2003]，提示Nox4很可能在血管超氧化物产生中具有比Nox1更大的作用。

鉴别能特异性靶向特定细胞例如血管和非血管系统的细胞中NADPH氧化酶因而降低直接和下游ROS产生的化合物是需要的。这样的化合物对于治疗包括例如如下病理情况的各种事件和病变(conditions)是有用的，动脉粥样硬化、动脉硬化、I和II型糖尿病的心血管并发症、内膜增生、冠心病、脑、冠状或动脉血管痉挛、内皮功能障碍、包括充血性心衰的心衰、败血症、外周动脉疾病、再狭窄和血管成形术后再狭窄、中风、器官移植后的血管并发症、源自病毒和细菌感染的心血管并发症以及独立于或继发于包括心肌梗塞的另一种病变的任何病变、高血压、动脉粥样硬化斑块形成、血小板聚集、心绞痛、动脉瘤、暂时缺血发作、异常氧气流和/或递送、萎缩症或器官损害、肺栓塞、血栓或普遍的动脉或静脉病变包括内皮功能障碍、血栓事件包括深度静脉血栓或支架、起搏器或其他修复装置造成的循环系统血管的损伤或支架失败或创伤，以及缺血再灌注损伤包括缺血后血流和氧气递送的恢复造成的任何损伤、坏疽、(癌症和/或异常肿瘤)、干或祖细胞增殖、呼吸疾病(例如哮喘、支气管炎、过敏性鼻炎和成人呼吸窘迫综合征)、皮肤疾病(牛皮癣、湿疹和皮炎)和骨代谢(骨质疏松、甲状旁腺功能亢进、骨硬化、骨质减少(oestoporasis)和牙周炎)和肾衰的各种失调。

发明概要

除非上下文另外要求，本说明书从头至尾中单词“包含”或变异形式例如“包含了”或“包含的”将理解为指的是所述要素或整数或者要素或整数组的包含，但不是任何其它要素或整数或者要素或整数组的排除。

核苷酸和氨基酸序列提及为序列鉴别号(SEQ ID NO：)。SEQ IDNO在数字上相应于序列鉴别号1(SEQ ID NO：1)、2(SEQ ID NO：2)等等。表1中提供了序列鉴别概要。在权利要求后提供了序列列表。

本发明部分预言了NADPH氧化酶细胞外暴露组分诸如所有或部分Nox4(也已知为renox)的鉴别，它是血管和非血管系统内多种细胞表达的NADPH氧化酶的关键催化亚基。血管系统包括含有平滑肌的脉管系统和/或含有内皮细胞的脉管系统和/或含有血管外膜成纤维细胞的脉管系统。非血管系统包括神经细胞、癌细胞、成纤维细胞和干细胞和祖细胞。目的NADPH氧化酶形式是包含Nox4的形式，Nox4由于含有NADPH结合结构域的所有或部分Nox4的细胞外表达而与白细胞和噬菌细胞中含有gp91phox的NADPH氧化酶同工型截然不同。白细胞和噬菌细胞的NADPH氧化酶的同工型包含Nox4同源物，即gp91phox。所以，本发明提供了选择性抑制NADPH氧化酶的化合物，所述NADPH氧化酶含有细胞外暴露的Nox4NADPH结合位点。特别有用的化合物包括细胞非通透性Nox4拮抗剂或抑制剂。选择性抑制NADPH氧化酶(含有Nox4的形式)的能力实现了超氧化物产生和例如如下的下游活性氧自由基(ROS)形成的抑制，例如来自血管平滑肌细胞(VSMC)、内皮细胞和/或血管外周成纤维细胞脉管系统的次氯酸盐、脂质过氧化物、过亚硝酸盐、过氧化氢和羟自由基，认为所述脉管系统至少部分负责例如下列病理情况的发展：粥样硬化硬化和动脉硬化、I和II型糖尿病的心血管并发症、内膜增生、冠心病、脑、冠状或动脉血管痉挛、内皮功能障碍、包括充血性心衰的心衰、败血症、外周动脉疾病、再狭窄和血管成形术后再狭窄、中风、器官移植后的血管并发症、源自病毒和细菌感染的心血管并发症以及独立于或继发于包括心肌梗塞的另一种病变的任何病变、高血压、动脉粥样硬化斑块形成、血小板聚集、心绞痛、动脉瘤、暂时缺血发作、异常氧气流和/或递送、萎缩症或器官损害、肺栓塞、血栓或普遍的动脉或静脉病变包括内皮功能障碍、血栓事件包括深度静脉血栓或支架、起搏器或其他修复装置造成的循环系统血管的损伤或支架失败或创伤，以及缺血再灌注损伤包括缺血后血流和氧气递送的恢复造成的任何损伤、坏疽、(癌症和/或异常肿瘤)、干或祖细胞增殖、呼吸疾病(例如哮喘、支气管炎、过敏性鼻炎和成人呼吸窘迫综合征)、皮肤疾病(牛皮癣、湿疹和皮炎)和骨代谢的各种失调(骨质疏松、甲状旁腺功能亢进、骨硬化、骨质减少和牙周炎)和肾衰。

所以本发明提供了抑制特定细胞(例如含有VSMC和/或内皮的脉管系统和/或含有外周血管成纤维细胞的脉管系统以及成纤维细胞、干细胞、神经细胞和癌细胞)中包含细胞外暴露的Nox4的NADPH氧化酶的化合物。本发明的化合物包括小或大化学分子、肽、多肽和蛋白质、抗体(包括多克隆、单克隆、去免疫化的嵌合重组和合成免疫交互分子)以及对于诱导共抑制或其它RNAi介导的基因沉默事件有用的核酸分子或它们的类似物，包括反义寡核苷酸、有义寡核苷酸或全长有义核酸分子。提及的“RNAi”包括“siRNA”。核酸分子可以被修饰，例如包含C5丙基(propynl)修饰或完全硫代磷酸酯修饰。特别有用的化合物是细胞非通透性Nox4的抑制剂和/或拮抗剂。

本发明预期的特别有用的化合物是苯甲酰胺和芳基磺酸酯和衍生物或类似物，例如苏拉明或其衍生物、类似物或同系物。其它有用的化合物包括反应蓝-2[1-氨基-4[[4[[4-氯-6-[n-磺苯基]氨基]-1，3，5-三嗪-2-基]氨基]-3-磺苯基]氨基]-9，10-二氢-9，10-二氧-2-蒽-磺酸，其中n是3或4]和PPADS[吡哆醛磷酸-6-axo(苯-2，4-二磺酸)]或4-[[-甲酰基-5-羟基-6-甲基-3-[(膦氨基)甲基]-2-吡啶基]偶氮]-1，3-苯二磺酸。依据本发明也期望使用Tempol(4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶氧(piperidinoxyl))和DPI(二亚苯基碘鎓)(diphenyleneiodonium)或它们的衍生物、类似物或同系物以及用于基因治疗的一系列遗传试剂，例如核苷酸反义和有义分子。其它有用的化合物包括Nox4-抑制剂相互作用的激动剂。“激动剂”包括增强Nox4拮抗剂抑制活性的化合物，例如苏拉明。

本发明提供了包含本发明化合物的药物组合物，并且构思了治疗或预防或否则缓解例如下列病理情况的症状或与其相关的症状的方法，粥样硬化、动脉硬化、I和II型糖尿病的心血管并发症、内膜增生、冠心病、脑、冠状或动脉血管痉挛、内皮功能障碍、包括充血性心衰的心衰、败血症、外周动脉疾病、再狭窄和血管成形术后再狭窄、中风、器官移植后的血管并发症、源自病毒和细菌感染的心血管并发症以及独立于或继发于包括心肌梗塞的另一种病变的任何病变、高血压、动脉粥样硬化斑块形成、血小板聚集、心绞痛、动脉瘤、暂时缺血发作、异常氧气流和/或递送、萎缩症或器官损害、肺栓塞、血栓或普遍的动脉或静脉病变包括内皮功能障碍、血栓事件包括深度静脉血栓或支架、起搏器或其他修复装置造成的循环系统血管的损伤或支架失败或创伤，以及缺血再灌注损伤包括缺血后血流和氧气递送的恢复造成的任何损伤、坏疽、(癌症和/或异常肿瘤)、干或祖细胞增殖、呼吸疾病(例如哮喘、支气管炎、过敏性鼻炎和成人呼吸窘迫综合征)、皮肤疾病(牛皮癣、湿疹和皮炎)和骨代谢的各种失调(骨质疏松、甲状旁腺功能亢进、骨硬化、骨质减少和牙周炎)和肾衰。

表1提供了本发明中从头至尾使用的序列鉴别的概要。

                        表1

                 序列鉴别的概要

序列鉴别号	描述
		1	编码人Nox4的mRNA序列
2	人Nox4氨基酸序列
		3	编码小鼠Nox4的mRNA序列
4	小鼠Nox4氨基酸序列
		5	编码人Nox4细胞外羧基末端部分的mRNA序列
6	小鼠人Nox4细胞外羧基末端部分的氨基酸序列
		7	小鼠Nox4细胞外羧基末端部分的mRNA序列
8	小鼠小鼠Nox4细胞外羧基末端部分的氨基酸序列
		9	引物
10	探针
		11-14	引物
15	探针
		16	引物
17-19	寡核苷酸

表2提供了此处使用的缩写列表。

                     表2

                     缩写

缩写	描述
		ROS	活性氧自由基1
VSMC	血管平滑肌细胞
		NO	一氧化氮
FAD	黄素腺苷二核苷酸
		tempol	4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶氧
DPI	二亚苯基碘鎓
		ICAM-1	细胞内粘附分子1
VCAM-1	血管细胞粘附分子1
		MCP-1	单核细胞化学趋化蛋白1
IEL	内弹性膜
		BrdU	溴脱氧尿苷
PCR	多聚酶链式反应
		DHE	二氢乙啶
DCFH-DA	2’-7’二氯荧光素二乙酯
		PPADS	[磷酸吡哆醛-6-axo(苯-2，4-二磺酸]

¹包括超氧化物、过氧化氢、羟自由基、过亚硝酸盐、次氯酸盐、脂质过氧化物等等。

附图描述

图1是苏拉明化学结构和苏拉明类似物结构特征的图表陈述[Jentsch等人，基因病毒学杂志68：2183-2192，1987；美国专利号5,173,509]

图2是显示了苏拉明作为含有Nox4的血管NADPH氧化酶之选择性抑制剂的作用的图示。苏拉明(≤100μM)完全抑制了小鼠血管平滑肌细胞(VSMC，a)和内皮100μM NADPH驱动的含有Nox4的NADPH氧化酶的活性，但是对小鼠巨噬细胞系J774(b)含有gp91phox的NADPH氧化酶几乎没有作用(^*与对照比P＜0.05)。

图3是人Nox4 mRNA和相应的氨基酸序列。突出显示的区域编码或包含构成推测的苏拉明结合位点的氨基酸[http://www.biochem.emory.edu/labs/dlambe/noxfamilypage.html #noxfamily]；下划线序列编码或包含预计的细胞外羧基末端结构域。

图4是小鼠Nox4mRNA和相应氨基酸序列。突出显示的区域编码或包含构成推测的苏拉明结合位点的氨基酸[http://www.biochem.emory.edu/labs/dlambe/noxfamilypage.html #noxfamily]；下划线序列编码或包含预计的细胞外羧基末端结构域。

图5A-C是显示了培养的小鼠VSMC中NADPH依赖性超氧化物产生的特征的图示。(A)中，与浓度增加的NADPH孵育45分钟后测量超氧化物的产生。(B)中，VSMC与100μM NADPH单独或在载体(DMSO 0.1％)或浓度增加的DPI存在下孵育45分钟。(C)中，VSMC在含有5％v/v FBS和载体或浓度增加的罗布麻宁的DMEM中孵育24小时。然后细胞在有或无载体或罗布麻宁存在下用100μM NADPH处理45分钟。所有的实验中，用5μmol/L光泽精(lucigenin)增强的化学发光测量超氧化物。数值(4至8个实验的平均值±SEM)表示为计数/秒/活细胞(A)或为单独NADPH处理的细胞得到的计数百分数/秒/活细胞(B&C)。^*与载体相比P＜0.05。

图6A和6B是显示了培养的小鼠VSMC中Nox4 mRNA表达的图示。对从培养的小鼠VSMC或从新鲜分离的小鼠VSMC和全部主动脉提取的总RNA进行反转录，5ng cDNA用于实时PCR以检查Nox4的表达。(A)中，上图是单个VSMC培养中测量的FAM(Nox4)依赖性荧光强度比PCR循环数的代表性痕迹(注：三复样进行反应)。下图显示了相同反应中VIC(18S)依赖性荧光对PCR循环数。作为基因组DNA污染的对照，也使用相同的未进行逆转录(-RT)的RNA样本作为模板进行实时PCR。(B)显示了相对于培养的VSMC对新鲜分离的VSMC和全部主动脉中“参考”样品的Nox4表达的组合数据。数值是得自4至8个实验的平均值±SEM。5ng cDNA用于每个实时PCR反应以检查相对于18S rRNA的Nox4的表达。

图7是显示了Nox4反义核酸对培养的小鼠VSMC中NADPH驱动超氧化物产生时间和浓度依赖性作用的优化实验的图示。VSMC与增加浓度的Nox4反义核酸(序列+13/+33)孵育共72h。细胞然后与NADPH(100μmol/L)孵育45分钟，用5μmol/L光泽精增强的化学发光分析超氧化物。数值(得自4个实验的平均值±SEM)是标准化为单独用转染试剂处理细胞得到的相同数值的百分数的计数/秒/活细胞数。

图8是显示了+13/+33 Nox4反义序列对培养的小鼠VSMC中NADPH驱动的超氧化物产生的特异性反义作用的图示。用NADPH处理45分钟之前，VSMC单独(8μL/mL；白柱)或在500nmol/L反义核酸(黑柱)、错配(阴影线柱)或混杂寡核苷酸(垂直线)的存在下与转染试剂孵育24h。用5μmol/L光泽精增强的化学发光分析超氧化物的产生。数值(得自8个单独实验的平均值±SEM)是标准化为未处理细胞得到的相同数值的百分数的计数/秒/活细胞数。^*P＜0.05，^***P＜0.001。

图9是显示了+13/+33 Nox4反义序列对培养的小鼠VSMC中Nox4 mRNA表达的特异性反义作用的图示。VSMC单独(8μL/mL；空白柱)或在500nmol/L反义核酸(黑柱)、错配(阴影线柱)或混杂寡聚核苷酸(垂直线)的存在下与转染试剂孵育24h。提取RNA并反转录为cDNA，5ng用作随后即时PCR中的模板以测量Nox4的表达。Nox4的表达标准化为各自样本(ΔCt)中18S的表达。进一步通过减去“参考”样品得到的ΔCt(ΔΔCt)标准化每个样品中得到的ΔCt值，这个数值最终用于方程2^-ΔΔCt中。数值来自7个单独实验。^***P＜0.001。

图10A和10B是显示了反应蓝2和PPAD对小鼠血管平滑肌细胞中NADPH刺激的超氧化物产生的作用。细胞与100μM NADPH单独或在浓度增加的反应蓝2(A)或PPADS(B)存在下孵育45分钟。用5μM光泽精增强的化学发光测量超氧化物的产生。数值(得自4至6个实验的平均值±SEM)表示为未处理细胞中得到的计数/秒/存活细胞的百分数。

图11显示了(A)Nox4和(B)gp91phox跨膜结构域和拓扑结构的PSORT预言结果。(C)显示了Nox4和gp91phox预言模型的示意图。注意Nox4上NADPH结合位点(白柱)主要在细胞外，而gp91phox的在细胞外。(A)中的左图显示了膜拓扑结构的概述而右图显示了疏水性图(膜结构域在盒中)

图12是显示了苏拉明对动脉粥样硬化损害形成的作用的图示。慢性给予12周龄并也喂饲高脂肪饮食的ApoE-/-小鼠苏拉明(每周15mg/Kg共4个月，n＝5)导致全部动脉上(a)尤其是胸和腹动脉片段上(b)比载体(生理盐水)处理小鼠(n＝6)更小的损害区域。对动脉弓上的损害大小没有作用(b)。(与载体处理比^*P＜0.05)

图13是显示了苏拉明对蛛网膜下腔出血(SAH)后脑动脉NADPH氧化酶活性增加的影响的图示。苏拉明的慢性给予(30-300mg/kg总共7天)对分离的对照Sprague-Dawley大鼠(CON，n＝17比SUR，n＝5)基底动脉NADPH(100μM)驱动的超氧化物产生没有作用。相反，接受SAH的大鼠中，体内苏拉明的处理在SAH 2天后阻止了体外观察到的超氧化物产生的增加(SAH，n＝9对SAH十SUR，n＝13)(与所有其它组比^*P＜0.05)。

图14是显示了体内蛛网膜下腔出血(SAH)后苏拉明体内对脑动脉内皮依赖性扩张损害的作用的图示。体内通常发生在反应于乙酰胆碱的对照大鼠(CON，n＝7)的大鼠基底动脉的直径剂量依赖性的增加在SAH后2天(SAH，n＝8)显著受损。相反，苏拉明的慢性给予(300mg/kg皮下总共7天)阻止了SAH后体内对乙酰胆碱反应的任何的显著下降(SAH+SUR，n＝8)(与SAH比^*P＜0.05)。

图15是显示了苏拉明对血管紧张素II诱导的高血压的作用的图示。苏拉明的慢性给予(每周150mg/kg皮下，共2周)对氯氨酮-甲苯噻嗪麻醉下测量的对照大鼠的平均动脉血压没有作用(CON，n＝4对SUR，n＝4)。单独血管紧张素II的慢性给予(5mg/kg皮下总共1周)引起显著的高血压(AngII，n＝7；与CON比^*P＜0.05)，而血管紧张素给予之前以及1周之内苏拉明慢性处理1周得到了较小的动脉压增加(Ang II+SUR，n＝8；与Ang II比^*P＜0.05)。

发明详述

本发明提供了选择性靶向对于特定细胞类型特别是血管细胞基本上是独特的NADPH氧化酶亚组分的化合物。后者细胞包括含有平滑肌的脉管系统和/或含有内皮细胞的脉管系统和/或含有血管外周成纤维细胞的脉管系统中的细胞。本发明也适用于非血管细胞，包括成纤维细胞、神经细胞、癌细胞和干细胞和祖细胞。更加特别地，本发明提供了靶向细胞外暴露的亚组分的化合物。甚至更加特别地所述亚组分是所有或部分NADPH氧化酶的Nox4组分，或者特定细胞例如但不限于含有血管平滑肌细胞(VSMC)和/或内皮细胞的脉管系统和/或含有血管外周成纤维细胞的脉管系统和/或非血管系统之上存在的Nox4的同系物。所以本发明提供了选择性靶向包含Nox4细胞外暴露部分的NADPH氧化酶的拮抗剂。本发明的化合物是有选择性的，即在例如白细胞和噬菌细胞的NADPH氧化酶中NADPH结合结构域位于细胞内时，本发明的化合物基本上不影响同源gp91phox组分在优选的实施方案中，Nox4的抑制剂和/或拮抗剂是细胞非通透性化合物，并且不能靶向NADPH氧化酶的细胞内化合物。

详细描述本发明前，要理解除非另外指出，本发明不限于特定制剂组分、生产方法、剂量方案等等，这些可以变化。也要理解此处使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的而不是意在限制。

必须注意，如本发明使用地，单数形式“一个”、“一个”和“那个”包括复数方面，除非上下文另外清楚地指出。这样，例如，提及的“溶剂”包括单一溶剂以及两种或两种以上溶剂；提及的“活性试剂”包括单一活性试剂，以及两种或多种活性试剂等等。

在描述和要求保护的本发明中，依据下面列出的定义使用下列术语。

术语“化合物”、“活性试剂”、“药理活性试剂”、“药剂”、“活性的”和“药”此处交替使用，指的是诱导期望的药理、生理作用的化学化合物。术语也包括此处具体提到的那些活性试剂的药物可接受的和药理活性的成分，包括但不限于盐、酯、胺、前药、活性代谢物、类似物等等。当使用术语“化合物”、“活性试剂”、“药理活性试剂”、“药剂”、“活性的”和“药”时，要理解这个包括活性试剂本身以及药物可接受的、药理活性盐、酯、酰胺、前药、代谢物、类似物等等。术语“化合物”不仅仅解释为化学化合物，还延伸到肽、多肽和蛋白质和抗体以及基因分子例如RNA、DNA和它们的化学类似物。

所以本发明构思对于预防或缓解脉管和非脉管系统内生理和病理生理事件或症状有用的化合物。术语“脉管系统”包括含有平滑肌细胞的脉管系统和/或含有内皮细胞的脉管系统和/或含有血管外周成纤维细胞的脉管系统。此处预期的非血管系统包括成纤维细胞、神经细胞、癌细胞、祖细胞和干细胞。

脉管系统相关的病变或事件包括特征在于或包括病理转变为心血管系统任何或所有腔室或生理分类的病变，所述心血管系统包括一个或多个器官的全身脉管系统。如此处预期地，与含有VSMC和/或内皮细胞和/或血管外周成纤维细胞的脉管系统和/或含有内皮细胞的脉管系统和/或含有血管外周成纤维细胞的脉管系统相关的病变或事件包括例如如下的病理情况：粥样硬化、动脉硬化、I和II型糖尿病的心血管并发症、内膜增生、冠心病、脑、冠状或动脉血管痉挛、内皮功能障碍、包括充血性心衰的心衰、败血症、外周动脉疾病、再狭窄和血管成形术后再狭窄、中风、器官移植后的血管并发症、源自病毒和细菌感染的心血管并发症以及独立于或继发于包括心肌梗塞的另一个病变的任何病变、高血压、动脉粥样斑块形成、血小板聚集、心绞痛、动脉瘤、暂时缺血发作、异常氧气流和/或递送、萎缩症或器官损害、肺栓塞、血栓或普遍的动脉或静脉病变包括内皮功能障碍、血栓事件包括深度静脉血栓或支架、起搏器或其他修复装置造成的循环系统管道的损伤或支架失败或创伤，以及缺血再灌注损伤包括缺血后血流和氧气递送的恢复造成的任何损伤、坏疽、(癌症和/或异常肿瘤)、干或祖细胞增殖、呼吸疾病(例如哮喘、支气管炎、过敏性鼻炎和成人呼吸窘迫综合征)、皮肤疾病(牛皮癣、湿疹和皮炎)和骨代谢(骨质疏松、甲状旁腺功能亢进、骨硬化、骨质减少和牙周炎)和肾衰的各种失调。

本发明进一步构思了通过给予包含细胞外暴露的Nox4的NADPH氧化酶之抑制剂治疗癌症或缓解癌症相关症状的方法。此处预期的癌症的实例包括但不限于ABL1原癌基因、AIDS相关癌症、听觉神经瘤、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、腺囊样(Adenocystic)癌、肾上腺皮质癌、病因不明的骨髓转移、秃头症、腺泡状软组织肉瘤、肛门癌、血管肉瘤、再生障碍性贫血、星细胞瘤、毛细管扩张失调症、基底细胞癌(皮肤)、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑干神经胶质瘤、脑和CNS肿瘤、乳癌、CNS肿瘤、良性肿瘤、子宫颈癌、儿童脑肿瘤、儿童癌症、儿童白血病、儿童软组织肉瘤、软骨肉瘤、绒毛膜癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、结直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、隆突皮肤纤维肉瘤、结缔组织增生(Desmoplastic)小圆细胞肿瘤、腺管癌、内分泌癌、子宫内膜癌、室骨膜瘤、食管癌、尤因瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼：黑素瘤、视网膜母细胞瘤、输卵管癌、范科尼贫血、纤维肉瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道癌、胃肠道良性肿瘤、泌尿生殖器癌症、生殖细胞肿瘤、妊娠性滋养细胞层疾病、神经胶质瘤、妇科癌症、血液恶性疾病、毛细胞性白血病、头颈癌、肝细胞癌、遗传性乳癌、组织细胞增多症、何杰金氏疾病、人乳头瘤病毒、葡萄胎、高血钙、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、朗革汉氏细胞组织细胞增多症、喉癌、平滑肌瘤、白血病、里-费综合症、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴水肿、淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、男性乳癌、恶性肾横纹肌肿瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、默克尔氏细胞癌、间皮瘤、转移癌、口癌、多发性内分泌瘤、菌样肉芽肿、骨髓增生异常综合症、骨髓瘤、骨髓增生性失调、鼻癌、鼻咽癌、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经纤维瘤、尼比(Nijmegen Breakage)综合征、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、眼癌、食管癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、造瘘术卵巢癌、胰腺癌、鼻窦癌、甲状旁腺癌、腮腺癌、阴茎癌、外周神经外胚层肿瘤、垂体癌、真性红血球增多症、前列腺癌、罕见癌症相关疾病、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、罗-汤综合征、唾液腺癌、肉瘤、神经鞘瘤、赛塞利综合征、皮肤癌、小细胞肺癌(SCLC)、小肠癌、软组织肉瘤、脊髓肿瘤、鳞状细胞癌(皮肤)、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行细胞癌(膀胱)、移行细胞癌(肾-骨盆-/-输尿管)、胚胎滋养层癌、尿道癌、泌尿系统癌、Uroplakins、子宫肉瘤、子宫癌、阴道癌、外阴癌、Waldenstrom氏巨球蛋白血症和Wilm氏肿瘤。

通过如此处使用的术语试剂的“有效量”或“治疗有效量”是指提供期望的治疗作用的足够量的试剂。此外，“有效抑制Nox4的量”或“有效NADPH氧化酶抑制量”是至少部分抑制或缓解由ROS的产生介导或引起的症状的足够量的试剂。一个特别有用的量度是超氧化物产生和下游ROS的降低。当然，非期望的作用，例如副作用，有时与期望的作用一起表现出来；因此，从业者在决定什么是合适的“有效量”要权衡潜在的益处和潜在的危险。需要的确切量将因研究对象而不同，依赖于种类、年纪和研究对象的一般状况、给药模式等等。因此，不可能指定确切的“有效量”。但是，任何个案中合适的“有效量”通过只在使用常规实验的技术领域中的一个普通的技术进行测定。

“药物可接受的”载体赋形剂或稀释剂是指由不是生物学上或其它非期望的材料组成的药物溶剂，即可以与经选择的活性试剂一起给予研究对象而不引起任何或实质性不良反应的材料。载体包括赋形剂和其他添加剂，例如稀释剂、去污剂、上色剂、湿润或乳化剂、pH缓冲剂、防腐剂等等。

相似地，如此处提供的化合物的“药理可接受的”盐、酯、酰胺、前药或衍生物是盐、酯、酰胺、前药或衍生物，它们不是生物学上或其它非期望的。

如此处使用的术语“进行治疗”和“治疗”指的是症状的严重性和/或频率的降低、症状和/或潜在原因的消除、症状和/或它们潜在原因发生的预防，以及损伤的改善或补救。因而，例如，“治疗”病人包括通过抑制或引起紊乱或疾病的衰退以预防易得病个人的特定紊乱或不良生理事件以及治疗有临床症状的个人。因而，例如，“治疗”需要血管系统治疗的病人的方法包括病变(condition)、疾病或紊乱的预防以及治疗病变、疾病或紊乱。在任何事件中，本发明预期任何导致各种细胞例如血管系统和非血管系统的细胞产生或可能产生超氧化物和/或下游ROS的病变的治疗或预防。

如此处使用的“患者”指的是哺乳动物，优选的是人，能从本发明的药物制剂和方法受益的个体。对于能从现在描述的药物制剂和方法受益的哺乳动物的类型没有限制。患者不管是人或非人的哺乳动物可以指个体、研究对象、哺乳动物、宿主或受者。

相应地，本发明提供了调节NADPH氧化酶的功能、活性或水平因而影响所述酶能产生超氧化物和下游ROS的程度的化合物。这样的ROS包括次氯酸盐、脂质过氧化物、过亚硝酸盐、过氧化氢和羟自由基。特别是，本发明的化合物通过特异性靶向细胞外暴露的Nox4而选择性地抑制血管细胞(例如VSMC和内皮细胞)中的NADPH氧化酶，所述Nox4是那些细胞中NADPH氧化酶的NADPH结合β亚基。在一些非血管细胞中，例如白细胞和噬菌细胞，NADPH结合β亚基是gp91phox。因此，本发明的化合物抑制或降低细胞外暴露的Nox4的水平，但是对gp91phox基本上作用较少或优选地没有作用。这意味着在脉管系统事件之后，本发明的化合物能选择性抑制含有平滑肌细胞的脉管系统和/或含有内皮细胞的脉管系统和/或含有成纤维细胞的脉管系统中直接或下游ROS的产生。化合物对于Nox4是有选择性的，或者在它们是细胞非通透性的，并且因此不能抑制细胞内Nox4组分或gp91phox组分，在这种意义上是有选择性的。

本发明这个方面的化合物是大或小分子、核酸分子、肽、多肽或蛋白质或抗体或杂交分子，例如RNAi复合物、核酶或DNA酶。

本发明的另一个方面提供了能够与包含SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：4列出的氨基酸序列或与其具有至少大约50％相似性的多肽相互作用或与如下核酸分子相互作用的化合物：所述核酸分子包含SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：3中列出的核苷酸序列或其互补物或与SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：3具有至少大约50％相同的核苷酸序列或其互补物，或在低严格条件下能杂交于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的核苷酸序列或其互补形式的核苷酸序列，其中所述化合物起所述多肽的活性或功能或者所述核酸分子表达的拮抗剂的作用。

SEQ ID NO：2代表人Nox4的氨基酸序列。SEQ ID NO：1是编码人Nox4的核苷酸序列。

SEQ ID NO：3定义了编码小鼠Nox4的核苷酸序列。SEQ ID NO：4定义了相应的氨基酸序列。

图3和4分别显示了人和小鼠Nox4的核苷酸和氨基酸序列。重要地，预期Nox4细胞外结构域加了下划线(分别相应于SEQ ID NO：5和7，由SEQ ID NO：4和6编码)

因此，本发明的另一个方面提供了能够与包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7列出的氨基酸序列或与其具有至少大约50％相似性的多肽相互作用或者与包含下列核酸分子相互作用的化合物：所述核酸分子包含如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中列出的核苷酸序列或其互补物，或与具有与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6至少大约50％相同的核苷酸序列或其互补物，或者在低严格条件下能杂交于SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：6或其互补形式的核苷酸序列，其中所述化合物起所述多肽的活性或功能或者所述核酸分子表达的拮抗剂的作用。

然而，本发明延伸到靶向任何哺乳动物来源的Nox4，例如来源于其它的灵长类、家畜动物、实验室测试动物、陪伴动物或捕获的野生动物。

实验室测试动物的实例包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠和仓鼠。兔和啮齿类动物，例如大鼠和小鼠，提供了便利的测试系统或动物模型。家畜动物包括绵羊、奶牛、猪、山羊、马和驴。非哺乳动物例如斑马鱼和两栖动物(包括甘蔗蟾蜍)也是有用的模型。

如此出使用的术语“相似”或相同包括经比较的序列在核苷酸或氨基酸水平精确的相同。在核苷酸水平不相同的地方，“相似”包括导致不同氨基酸在结构、功能、生化和/或构象水平仍然相互相关的序列之间的不同。在氨基酸水平不同的地方，“相似”包括在结构、功能、生化和/或构象水平仍然相互相关的氨基酸。在特别优选的实施方案中，在相同而不是相似的水平上进行核苷酸和氨基酸序列的比较。

用于描述两个或两个以上多核苷酸或多肽之间序列关系的术语包括“参比序列”、“比较窗”、“序列相似性”、“序列相同性”、“序列相似的百分比”、“序列相同的百分比”、“基本相似的”和“基本相同”。“参比序列”是长度至少12个但频繁地是15至18个并且通常是至少25个以上，例如30个包括核苷酸和氨基酸残基的单体单位。因为两个多核苷酸每一个包含(1)两个多核苷酸之间相似的序列(即只有完整多核苷酸序列的一部分)，和(2)两个多核苷酸之间不同的序列，一般通过在“比较窗”上比较两个多核苷酸的序列进行两个(或两个以上)多核苷酸的序列比较以鉴别和比较序列相似的局部区域。“比较窗”指的是与参比序列相比的一般12个连续残基的概念片段。为了两个序列的优化比对，与参比序列(它不包含添加或缺失)相比时比较窗包含大约20％或更少的添加或缺失(即缺口)。为了比对比较窗，可以通过对数的计算机运行(Wisconsin遗传学软件包版本7.0中的GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA，遗传学计算机组，575 Science DriveMadison，WI，USA)或通过任何经选择的各种方法产生的检查和最佳比对(即比较窗上得到最高的同源百分数)进行序列的优化比对。可参考例如如Altschul等人(核酸研究25：3389，1997)公开的BLAST家族程序。在Ausubel等人(″分子生物学当代试验方案″John Wiley &Sons Inc，1994-1998，15章)的19.3部分找到序列分析的详细讨论。

如此出使用的术语“序列相似性”和“序列相同性”指的是在比较窗上一个核苷酸接着一个核苷酸的基础上或一个氨基酸接着一个氨基酸的基础上序列相同或者功能或结构上相似的程度。因此，例如，通过下列方法计算“序列相同的百分数”：在比较窗上比较两个优化比对的序列，测定两个序列中相同核酸碱基(例如A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如Ala，Pro，Ser，Thr，Gly，Val，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，Lys，Arg，His，Asp，Glu，Asn，Gln，Cys和Met)发生的位点数以得到匹配的位点数，匹配位点数除以比较窗内的总位点数(即，窗户的大小)，结果乘以100以得到序列相同性的百分数。为了本发明的目的，“序列相同”将理解为指的是用DNASIS计算机程序(windows 2.5版本；可从Hitachi软件工程有限公司，South San Francisco，California，USA，获得)使用软件附带的参考手册中使用的标准默认值计算的“匹配百分数”。

优选地，特定序列和参比序列(核苷酸或氨基酸)之间的相似百分数是至少大约60％或至少大约70％或至少大约80％或至少大约90％或至少大约95％或以上，例如至少大约96％、97％、98％、99％或更大。50至100之间的相似或相同百分数也是预期的。

此处所指的低严格对于杂交包括和包含从至少大约0到至少大约15％v/v甲酰胺，从至少大约1M到至少大约2M盐，对于清洗条件包括和包含至少大约1M到至少大约2M盐。一般地，低严格是在从大约25-30℃到大约42℃。温度可以改变，更高的温度可以用于替代甲酰胺和/或给予替代的严格条件。在必须的地方可以采用替代的严格条件，例如中等严格，它对于杂交包括和包含从至少大约16％v/v到至少大约30％甲酰胺和从至少大约0.5M到至少大约0.9M盐，对于清洗条件包括和包含至少大约0.5M至至少大约0.9M盐，或者高严格，它对于杂交包括和包含从至少大约31％v/v到至少大约50％甲酰胺和从至少大约0.01M到至少大约0.15M盐，对于清洗条件包括和包含至少大约0.01M到至少大约0.15M盐。一般，在Tm＝69.3+0.41(G+C)％进行清洗(Marmur和Doty，分子生物学杂志5：109，1962)。然而，随着错配碱基对的数目每增加1％，双股DNA的Tm降低1℃(Bonner和Laskey，欧洲生物化学杂志46：83，1974)。甲酰胺在这些杂交条件下是可选的。相应地，严格的特别优选水平定义如下：低严格是6x SSC缓冲液，0.1％w/v SDS，在25-42℃；中等严格是2x SSC缓冲液，0.1％w/v SDS，温度范围20℃至65℃；高严格是0.1x SSC缓冲液，0.1％w/vSDS，在至少65℃的温度。

很容易被本领域技术人员理解地，术语“核酸”、“核苷酸”和“多核苷酸”包括RNA、cDNA、基因组DNA、合成形式和混合的多聚体，有义和反义链，并且可以是化学或生化修饰的或可以含有非天然或衍生化的核苷酸碱基。这样的修饰包括，例如，标记、甲基化、一个或多个天然发生的核苷酸被类似物替代(例如吗啉环)，核苷酸间的修饰例如不带电荷的键(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酸酰胺、氨基甲酸酯等等)、带电荷的键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等等)、悬垂基团(pendent moieties)(例如多肽)、交联剂(例如吖啶、补骨脂素等等)、螯合剂、酰化剂和修饰的连接(例如α-异位碳的核酸等等)。还包括模仿多核苷酸经由氢键合和其它化学相互作用结合于指定序列的能力的合成分子。在本领域这样的分子是已知的，包括，例如，其中分子主干中的磷酸酯键被肽键取代的那些分子。

本发明延伸到Nox4基因或其mRNA的一段(portion)或部分或片段。“一段或部分或片段”定义为具有最少至少大约8个核苷酸或优选地大约12-17个核苷酸或更优选地至少大约18-25个核苷酸，以及可以具有最多至少大约5000个核苷酸。也可采用大于5000个核苷酸的基因组等同物。这个定义包括所有大小范围在8-5000个核苷酸。因此，这个定义包括12、15、20、25、40、60、80、100、200、300、400、500或1000个核苷酸的核酸或具有这些数值之内(例如13、16、23、30、28、50、72、121等等个核苷酸)任何数量核苷酸的核酸或具有多于500个核苷酸或500和SEQ ID NO：1中显示的数量之间的任何数目的核苷酸的核酸。本发明包括所有具有至少8个从SEQ IDNO：1或其互补物或功能等同物衍生的核苷酸的所有新型核酸。

本发明提供了筛选包含如下药物的方法，例如，用本领域众所周知的方法，将前药与Nox4多肽或其片段接触，以及分析(i)药物和Nox4多肽或片段之间的复合物的存在，或(ii)Nox4多肽或片段和配体之间的复合物的存在。在这样的竞争结合试验中，Nox4多肽或片段一般是标记的。游离的Nox4多肽或片段与蛋白质：蛋白质复合物中存在的Nox4多肽分开，游离(即未形成复合物的)标记物的量是受试试剂与Nox4结合的一种测量。也可以测量结合的而不是游离的Nox4的量。也可能标记配体而不是Nox4并且测量在有和无受试药物存在下结合于Nox4的配体的量。

另一个药物筛选的技术提供了具有合适Nox4结合亲和力的化合物的高通量筛选，在Geysen(国际专利公开号W084/03564)中有详细描述。简言之，在固相底物上，例如塑料针或一些其它的表面，合成大量不同小肽测试化合物。肽测试化合物与Nox4反应并清洗。然后用本领域众所周知的方法检测结合的Nox4多肽。可以改编这个方法以筛选非肽的化学实体。所以，这个方面延伸到组合方法以筛选Nox4的拮抗剂。

纯化的Nox4能直接在平板上包被以用于前面提到的药物筛选技术。然而，多肽的非中和抗体能用于捕获抗体而将Nox4多肽固定在固相上。

本发明也构思了竞争性药物筛选试验的使用，其中能够特异性结合于Nox4多肽的中和抗体与结合于Nox4多肽或其片段的测试化合物竞争。以这种方式，所述抗体能用于检测共同拥有Nox4多肽的一个或多个抗原决定簇的任何肽的存在。

上面筛选方法不限于仅采用Nox4的试验，也适用于研究Nox4-蛋白质复合物，例如完整的NADPH氧化酶或包含它们的膜制备物。分析药物对这个复合物活性的作用。

此外，基于此处至少一部分Nox4组分在细胞外或至少在外部、内部或细胞内之间(intraternal)之间存在着平衡的发现，许多试验是预期的。这个在下面有进一步的考虑。

依据本发明，苯甲酰胺和/或芳基磺酸酯和/或衍生物或类似物并且特别是磺酸酯化的苯甲酰胺和芳基磺酸酯和衍生物或类似物被认为选择性地抑制Nox4。实行本发明一个特别有用的芳基磺酸酯和衍生物或类似物是苏拉明及其衍生物、类似物和功能同系物。

图1中呈现了苏拉明的结构。此处指的苏拉明包括Jentsch等人，1987，同上，公开的类似物。图1显示了这些类似物的概要[Jentsch等人，1987，同上，美国专利号5,173,509]。

另外，此处包含的并且Jentsch等人，1987，同上，2187和2188页表3和4中公开的特异活性的苏拉明相关类似物具有如表3显示的结构和分子量：

                    表3

化合物号	结构1	分子量2
			13	(Aa-Bb-Ba-)2Cc	1429.2
2	(Ai-Ba-)2Cc	698.4
			3	(Ab-Bk-Bk-)2Cc	1401.1
4	(Ab-Ba-Ba-)2Cc	1401.1
			5	(Aa-)4Cj	1096.2
6	(Aa-Bg-)2Cc	1198.2
			7	(Aa-Bi-Ba-)2Cc	1429.2
8	(Aa-Bn-)2Cc	1315.1
			9	(Ab-Bk-Ba-)2Cc	718.6
10	(Aa-Bc-)2Cc	1219.0
			11	(Aa-Bb-)2Cg	1295.1
12	(Aa-Bb-Ba-)2Cf	1535.5
			13	(Aa-Bb-)2Cc	1191.O
14	(Aa-Bs-)2Cc	1315.1
			15	(Ab-)Cl	610.5
16	(Ab-Bk-Ba-)2Cc	1401.1
			17	(Ah-Bk-)2Cc	654.4
18	(Aa-Bc-Ba-)2Cc	1457.9
			19	(Aa-Bi-)2Cc	1191.O
20	(Aa-Ba-)2Cc	1162.0
			21	(Ai-Bk-)2Cc	698.4
22	(Aa-)Cl	610.5
			23	(Aa-Bb-Ba-)2Cg	1535.3
24	(Af-Bb-Ba-)2Cc	674.6
			25	Aa-Bs-Ca	1060.9
26	Ab-Bk-Bk-Ca	717.6
			27	(Ae-Bb-Ba-)2Cc	1060.9
28	(Ah-Ba-)2Cc	654.5

化合物号	结构1	分子量2
			29	Ab-Bk-Bk-Ca	687.6
30	Aa-Bs-Cb	644.5
			31	Aa-Bb-Cl	730.5
32	(Ac-Bb-Ba-)2Ce	920.9
			33	(Aa-Ba-Bb-)2Cc	1429.2
34	(Aa-Bd-)2Cc	1247.1
			35	(Aa-Bd-Bd-Bd-)2Ce	1723.6
36	(Aa-Bh-Ba-)2Cc	1489.3
			37	(Aa-Bb-Bb-)2Ce	1457.3
38	(Aa-Bb-)2Cc	1301.1
			39	(Aa-Bb-)2Ce	1485.4
40	(Aa-bj-Ba-)2Ce	1162.8
			41	(Ab-Bk-)2Ce	1429.2
42	(Aa-Bl-Ba-)2Ce	1251.O
			43	(Aa-Bh-)2Cc	1191.0
44	(Aa-Br-)2Ce	1351.1
			45	(Aa-Bg-Ba-)2Ce	1477.1
46	(Aa-Bb-)Cm	721.6
			47	(Aa-Bq-)	1351.1
48	(Aa-Bc-)2Ce	1275.1
			49	(Aa-Bm-)2Ce	1315.1
50	(Aa-Be-Ba-)2Ce	1513.4
			51	(Aa-Bd-Ba-)2Ce	1485.4
52	(Aa-Bf-)2Cc	1315.1
			53	(Aa-Bf-Ba-)2Ce	1553.4
54	(Aa-Bj-)2Ce	1245.O
			55	(Aa-)Cm	588.2
56	(Ai-Bk-)2Cd	714.5
			57	(Ah-Ba-)2Cd	670.7

¹以前报告了每一个苏拉明类似物(化合物号2-57)的合成[Nickel等人，Arzneimittel-Forschung 36：1153-57，1986和Holzmann等人，生物医学质谱12：659-663，1985]。A、B和C结构单位如上定义。

²钠盐的分子量

³苏拉明(钠盐)

特别是，分别在图3和4中突出显示了人和小鼠Nox4上的苏拉明结合位点。

相应地，本发明构思了与如图3(人)和图4(小鼠)定义的细胞外暴露的苏拉明或NADPH结合位点或其它哺乳动物或非哺乳动物的其功能等同物结合或另外相互作用的任何化合物。

苏拉明鉴别为Nox4的拮抗剂促成了为测定Nox4上苏拉明结合位点的位置而开发的策略。这实现了苏拉明-Nox4相互作用的激动剂(即增效剂)的产生以及鉴别其他相似的拮抗剂。

在一个方法中，在用NADPH刺激的VSMC中证实产生了超氧化物或其它ROS。显示在相同条件下，苏拉明的加入阻断了超氧化物或其它ROS的产生。然后，VSMC与标记的苏拉明(例如荧光素标记的苏拉明)孵育，使用化学发光法测量NADPH刺激的超氧化物(或其它ROS)的产生以确定标记不影响苏拉明的抑制活性。如果这个是事实，在使用共聚焦或荧光显微镜的高能量下可显现VSMC以证明标记的苏拉明结合于细胞外位点并且没有穿透浆膜。

抗原决定簇标记(tagging)是另一个方法。苏拉明是NADPH的类似物并可以通过占据Nox4亚基的NADPH结合位点抑制NADPH氧化酶活性。既然Nox4的NADPH结合位点位于其羧基尾端，这个区域的抗原决定簇标记和其后对完整细胞中抗体的分析与经通透的细胞相比实现了它是否位于浆膜细胞内或细胞外表面的测定。

从VSMC提取总RNA并使用多聚dT引物逆转录。得到的cDNA用作模板通过多聚酶链式反应(PCR)以扩增Nox4的全部编码结构域。PCR产物立即插入GATEWAY(注册商标)表达载体(Invitrogen，CA，美国)FLAG抗原决定簇的上游或其它合适的含有抗原决定簇的载体中。构建提在合适的细胞中瞬时表达，然后使用共聚焦或荧光显微镜比较完整的和经通透的细胞中抗FLAG抗原决定簇(或其它的抗原决定簇)抗体的结合。

与苏拉明作用方式相同的其它有用的药物是反应蓝2和PPADS。反应蓝2(也已知为Basilen蓝E-3G，Cibacron蓝F3G-A和Procion蓝H-B)是[1-氨基-4{[4{[4-氯-6-{[n-磺酸苯基]氨基-1，3，5-三嗪-2-基}氨基]-3-磺酸苯基}氨基-9，10-二氢-9，10-二氧-2-蒽磺酸，其中n是3或4]。PPADS是4-{[-甲酰基-5-羟基-6-甲基-3-[(膦氧基)甲基]-2-嘧啶基]偶氮}-1，3苯基二磺酸。

进一步有用的药物包括超氧化物清除剂，例如tempol(4-羟基-2，2，6，6-四甲基-吡啶氧)和阻断NADPH氧化酶形成超氧化物的化合物，例如苏拉明(上述的)、二亚苯基碘鎓(DPI)和罗布麻宁以及结合于Nox4细胞外部分因而清除ROS的分子。

本发明对于筛选抑制Nox4多肽的其它化合物也是有用的。Nox4多肽或其结合片段可用于各种药物筛选技术的任何一个，例如此处描述的和国际公开号W097/02048中的那些。

Nox4拮抗剂包括Nox4变异多肽。术语“多肽”指的是氨基酸的多聚体和其等同物，并不指具体长度的产物，因而，肽、寡肽和蛋白质都包括在多肽的定义之内。这个术语也不指或不排除多肽的修饰，例如，糖基化、酰化、磷酸化等等。包括在定义之内的有，例如，天然和非天然发生的含有氨基酸(包括，例如，非天然氨基酸等等)一个或多个类似物的多肽、有取代连接以及其他本领域已知的修饰的多肽。通常，这样的多肽将至少大约40％相似于天然Nox4序列，优选地多于90％和更加优选地至少大约95％相似的。也包括在高或低严格条件下杂交于编码Nox4的核酸的DNA编码的蛋白质和与Nox4蛋白密切相关的抗血清找回的多肽或蛋白质。

取代变异体一般含有蛋白质内一个或多个位点的一个氨基酸与另一个的交换，并可被设计为调节多肽的一个或多个特性，例如抗水解切割的稳定性而没有其它功能或特性的损失。可在涉及残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、疏脂性和/或两性的基础上进行氨基酸的取代。优选的取代是保守的那些，就是说，一个氨基酸被一个有相似形状和电荷的氨基酸取代。保守取代在本领域是众所周知的，一般包括下列组内的取代：甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；酪氨酸，苯丙氨酸。

某些氨基酸被蛋白质结构中其它的氨基酸取代而没有与结构相互反应结合能力的显著丧失，例如，抗体的抗原结合区域或底物分子上的结合位点或与Nox4多肽相互反应的蛋白质上的结合位点。既然是蛋白质的相互反应能力和性质定义了这个蛋白质的生物功能活性，能在蛋白质序列和它们潜在的DNA编码序列中进行某些氨基酸取代并且仍然得到有相似特性的蛋白质。在进行这样的改变中，可考虑氨基酸的疏水指数。赋予蛋白质相互反应生物功能的疏水性氨基酸指数的重要性一般在本领域中是可以理解的(Kyte和Doolittle，分子生物学杂志157：105-132，1982)。或者，在亲水性的基础上能够有效地进行相似氨基酸的取代。赋予蛋白质相互反应生物功能的疏水性的重要性一般在本领域中是可理解的(美国专利号4,554,101)。疏水指数或亲水性在设计多肽中的使用在美国专利号5,691,198中有进一步的讨论。

比较同源性的多肽序列的长度一般是至少大约16个氨基酸，通常至少大约20个残基，更加通常地至少24个残基，一般至少大约28个残基并且优选多于大约35个残基。

本发明进一步预期Nox4多肽的化学类似物。再次，这些一般拮抗Nox4活性。

此处预期的类似物包括但不限于侧链的修饰，肽、多肽或蛋白质合成中非天然氨基酸和/或它们衍生物的整合，以及交联剂和其它强加于似蛋白质分子或它们的类似物构象约束的方法的使用。

本发明预期的侧链修饰的实例包括氨基基团的修饰，例如通过用乙醛反应的还原乙酰化后用NaBH4的还原反应；用甲基乙酰亚氨酯的脒基化；用醋酐的酰化；用氰酸盐的氨基基团甲氨酰化；用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)的氨基基团的三硝基苄基化；用琥珀酸酐和四氢对苯二甲酸酐的氨基基团的酰化；以及用5-磷酸吡哆醛的赖氨酸之吡哆醛化，之后用NaBH4的还原反应。

可以用试剂例如2，3-丁二酮、苯甲酰甲醛和乙二醛形成杂环缩合反应修饰精氨酸残基的胍基。

可以通过经由O-酰基异脲形成的碳二亚胺激活，之后是随后的例如衍生化为相应的酰胺来修饰羧基基团。

巯基基团可以通过如下的方法进行修饰，例如用醋乙酸或碘乙酰胺的羧甲基化；过蚁酸氧化为半胱磺酸；与其它硫醇化合物的混合二硫化物的形成；与马来酰亚胺、马来酸酐或其它取代的马来酰亚胺的反应；使用4-氯汞基苯甲酸盐、4-氯汞基苯磺酸、氯化苯汞、2-氯汞基-4-硝基苯酚和其它汞化合物的汞衍生物的形成；在碱性pH用氰酸盐的甲氨酰化。

可以例如用N-溴琥珀酰亚胺的氧化或用2-羟基-5-硝基苄溴或硫苯基卤化物之吲哚环酰化修饰色氨酸残基。另一方面，可以用四硝基甲烷的硝基化改变酪氨酸残基以形成3-硝基酪氨酸衍生物。

可以用碘乙酸衍生物的酰化或用二乙基焦炭酸的N-乙酯基化来完成组氨酸残基咪唑环的修饰。

肽合成过程中掺入非天然氨基酸和衍生物的实例包括，但不限于，正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯戊酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、正缬氨酸、苯甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D型异构体的使用。表4中显示了此处预期的非天然氨基酸的列表。

                           表4

                    非传统氨基酸的代码

非传统氨基酸	代码	非传统氨基酸	代码
				α-氨基丁酸	Abu	L-N-甲基丙氨酸	Nmala
α-氨基-α-甲基丁酯	Mgabu	L-N-甲基精氨酸	Nmarg
				氨基环丙烷羧酸酯	Cpro	L-N-甲基天冬酰胺	Nmasn
氨基异丁酸	Aib	L-N-甲基天门冬氨酸	Nmasp
				氨基正冰片基羧酸酯	Norb	L-N-甲基半胱氨酸	Nmcys
环己烷丙氨酸	Chexa	L-N-谷氨酰胺	Nmgln
				环戊烷丙氨酸	Cpen	L-N-谷氨酸	Nmglu
D-丙氨酸	Dal	L-N-组氨酸	Nmhis
				D-精氨酸	Darg	L-N-甲基异亮氨酸	Nmile
D-天冬氨酸	Dasp	L-N-甲基亮氨酸	Nmlcu
				D-半胱氨酸	Dcys	L-N-甲基赖氨酸	Nmlys
D-谷氨酰胺	Dgln	L-N-甲基蛋氨酸	Nmmet
				D-谷氨酸	Dglu	L-N-甲基正亮氨酸	Nmnle
D-组氨酸	Dhis	L-N-甲基正缬氨酸	Nmnva
				D-异亮氨酸	Dile	L-N-甲基鸟氨酸	Nmorn
D-亮氨酸	Dleu	L-N-甲基戊烷丙氨酸	Nmphe
				D-赖氨酸	Dlvs	L-N-甲基脯氨酸	Nmpro
D-蛋氨酸	Dmet	L-N-甲基丝氨酸	Nmser
				D-鸟氨酸	Dorn	L-N-甲基苏氨酸	Nmthr
D-戊基丙氨酸	Dphe	L-N-甲基色氨酸	Nmtrp
				D-脯氨酸	Dpro	L-N-甲基酪氨酸	Nmtyr
D-丝氨酸	Dser	L-N-甲基缬氨酸	Nmval
				D-色氨酸	Dtrp	L-N-甲基乙基甘氨酸	Nmetg
D-酪氨酸	Dtvr	L-N-甲基-叔丁基甘氨酸	Nmtbug
				D-缬氨酸	Dval	L-正亮氨酸	Nle
D-α-甲基丙氨酸	Dmala	L-正缬氨酸	Nva
				D-α-甲基精氨酸	Dmarg	α-甲基-氨基异丁酯	Maib
D-α-甲基天冬酰胺	Dmasn	α-甲基-γ-氨基丁酯	Mgabu
				D-α-甲基天冬氨酸	Dmasp	α-甲基环己基丙氨酸	Mchexa
D-α-甲基半胱氨酸	Dmcys	α-甲基环戊基丙氨酸	Mcpen
				D-α-甲基谷酰胺	Dmgln	α-甲基-α-萘基丙氨酸	Manap
D-α-甲基组氨酸	Dmhis	α-甲基青霉胺	Mpen
				D-α-甲基异亮氨酸	Dmile	N-(4-氨丁基)甘氨酸	Nglu
D-α-甲基亮氨酸	Dmleu	N-(2-氨乙基)甘氨酸	Naeg

D-α-甲基赖氨酸	Dmlys	N-(3-氨丙基)甘氨酸	Norn
				D-α-甲基蛋氨酸	Dmmet	N-氨基-α-甲基丁酯	Nmaabu
D-α-甲基鸟氨酸	Dmorn	α-萘基丙氨酸	Anap
				D-α-甲苯基丙氨酸	Dmphe	N-苄基甘氨酸	Nphe
D-α-甲基脯氨酸	Dmpro	N-(2-氨基甲酰乙基)甘氨酸	Ngln
				D-α-甲基丝氨酸	Dmser	N-(氨基甲酰甲基)甘氨酸	Nasn
D-α-甲基苏氨酸	Dmthr	N-(2-羧乙基)甘氨酸	Nglu
				D-α-甲基色氨酸	Dmtrp	N-(羧甲基)甘氨酸	Nasp
D-α-甲基酪氨酸	Dmty	N-环丁基甘氨酸	Ncbut
				D-α-甲基缬氨酸	Dmval	N-环庚基甘氨酸	Nchep
D-N-甲基丙氨酸	Dnmala	N-环己基甘氨酸	Nchex
				D-N-甲基精氨酸	Dnmarg	N-环癸基甘氨酸	Ncdec
D-N-甲基天冬酰胺	Dnmasn	N-环十二烷基甘氨酸	Ncdod
				D-N-甲基天冬氨酸	Dnmasp	N-环辛基甘氨酸	Ncoct
D-N-甲基半胱氨酸	Dnmcys	N-环丙基甘氨酸	Ncpro
				D-N-甲基谷氨酰胺	Dnmgln	N-环十一烷基甘氨酸	Ncund
D-N-甲基谷氨酸酯	Dnmglu	N-(2，2-二苯乙基)甘氨酸	Nbhm
				D-N-甲基组氨酸	Dnmhis	N-(3，3-二苯丙基)甘氨酸	Nbhe
D-N-甲基异亮氨酸	Dnmile	N-(3-胍基丙基)甘氨酸	Narg
				D-N-甲基亮氨酸	Dnmleu	N-(1-羟乙基)甘氨酸	Nthr
D-N-甲基赖氨酸	Dnmlys	N-(羟乙基)甘氨酸	Nser
				N-甲基环己丙氨酸	Nmchexa	N-(咪唑乙基)甘氨酸	Nhis
D-N-甲基鸟氨酸	Dnmorn	N-(3-吲哚乙基)甘氨酸	Nhtrp
				N-甲基甘氨酸	Nala	N-甲基-γ-氨基丁酯	Nmgabu
N-甲氨基异丁酯	Nmaib	D-N-甲基蛋氨酸	Dnmmet
				N-(1-甲丙基)甘氨酸	Nile	N-甲基环戊基丙氨酸	Nmepen
N-(2-甲丙基)甘氨酸	Nleu	D-N-甲苯基丙氨酸	Dnmphe
				D-N-甲基色氨酸	Dnmtrp	D-N-甲基脯氨酸	Dnmpro
D-N-甲基酪氨酸	Dnmtyr	D-N-甲基丝氨酸	Dnmser
				D-N-甲基缬氨酸	Dnmval	D-N-甲基苏氨酸	Dnmthr
γ-氨基丁酸	Gabu	N-(1-甲乙基)甘氨酸	Nval
				L-叔丁基甘氨酸	Tbug	N-甲萘基丙氨酸	Nmanap
L-乙基甘氨酸	Etg	N-甲基青霉胺	Nmpen
				L-高苯丙氨酸	Hphe	N-(对羟苯基)甘氨酸	Nhtyt
L-α-甲基精氨酸	Marg	N-(巯甲基)甘氨酸	Ncvs
				L-α-甲基天冬氨酸	Masp	青霉胺	Pen
L-α-甲基半胱氨酸	Mcys	L-α-甲基丙氨酸	Mala
				L-α-甲基谷氨酰胺	Mgln	L-α-甲基天冬酰胺	Masn

L-α-甲基组氨酸	Mhis	L-α-甲基-叔丁基甘氨酸	Mtbug
				L-α-甲基异亮氨酸	Mile	L-甲乙基甘氨酸	Metg
L-α-甲基亮氨酸	Mleu	L-α-甲基谷氨酸	Mglu
				L-α-甲基蛋氨酸	Mmet	L-α-甲基高苯基丙氨酸	Mhphe
L-α-甲基正缬氨酸	Mnva	N-(2-甲基巯乙基)甘氨酸	Nmet
				L-α-甲苯基丙氨酸	Mphe	L-α-甲基赖氨酸	Mlys
L-α-甲基丝氨酸	Mser	L-α-甲基正亮氨酸	Mnle
				L-α-甲基色氨酸	Mtrp	L-α-甲基鸟氨酸	Morn
L-α-甲基缬氨酸	Mval	L-α-甲基脯氨酸	Mpro
				N-(N-(2，2-二苯乙基)氨甲酰基甲基)甘氨酸	Nnbhm	L-α-甲基苏氨酸	Mthr
1-羧基-1-(2，2-二苯基-乙氨基)环丙烷	Nmbc	L-α-甲基酪氨酸	Mtyr
						L-N-甲基高苯基丙氨酸	Nmhphe
		N-(N-(3，3-二苯丙基)氨甲酰甲基)甘氨酸	Nnbhe

例如，能够使用交联剂稳定3D构象，使用同源双功能的交联剂例如具有(CH₂)n间隔子基团n＝1至n＝6的双功能的亚氨酸酯、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯以及通常含有氨基反应基团例如N-羟基琥珀酰亚胺和另一组特异反应基团例如马来酰亚胺或二巯基基团(SH)或碳二亚胺(COOH)的异源双功能试剂。另外，例如，能够通过如下在构象上局限肽：Cα和Nα-甲基氨基酸的掺入，氨基酸的Cα和Cβ之间双键的引入，以及通过引入共价键例如在氨基和羧基末端之间、两个侧链之间或侧链和氨基或羧基末端之间形成酰胺键以形成环肽或类似物。

术语“肽模仿物”或“模仿物”意在指与Nox4具有一些化学相似性但是拮抗Nox4多肽的物质。肽模仿物可以是模仿蛋白质二级结构元素的含有肽的分子(Johnson等人，″Peptide Turn Mimetics″，Biotechnology and Pharmacy，Pezzuto等人，Eds.，Chapman and Hall，New York，1993)。在肽模仿物使用的背后潜在的基本原理是蛋白质的肽骨架主要以促进分子相互作用(例如抗体和抗原、酶和底物或支架蛋白的相互作用)的方式存在以确定氨基酸侧链的方向。设计肽模仿物以允许相似于天然分子的分子相互作用，并因而另外与天然发生的Nox4一起竞争产ROS的分子。

再次，可以选择本发明的化合物使其仅靶向Nox4，或者单个或多个化合物可用于靶向Nox4和一个或多个其它NADPH氧化酶组分。

在这样的测试中采用的Nox4多肽或片段可以游离在溶液中、固定于固相支持物或负荷于细胞表面。药物筛选的一个方法利用稳定转染了表达多肽或片段的重组多核苷酸的真核或原核宿主细胞，优选地在竞争结合试验中。活的或固定形式的这样的细胞能用于标准结合试验。一个方法可以测量例如Nox4多肽或片段和受试药剂之间复合物的形成，或者检查受试药剂帮助或干扰Nox4多肽或片段和已知配体之间复合物形成的程度。

上面的方法和下面进一步描述的方法也可应用于鉴别Nox4-抑制剂相互作用(例如苏拉明-Nox4相互作用)的激动剂。这样的激动剂可与苏拉明或其它Nox4抑制剂联合使用以增强抑制作用。这些激动剂起抑制Nox4的化合物的增效剂的作用。

如本领域技术人员所理解地，反义多核苷酸序列对于阻止或减少Nox4基因座的表达是有用的。多核苷酸载体，例如含有所有或部分Nox4基因座或其它来自Nox4区域的序列(特别是Nox4基因座侧面的那些)的，以反义方向被放置在启动子控制下并引入细胞内。细胞内这样的反义构建体的表达将干扰Nox4转录和/或翻译。此外，也可采用诱导RNAi(即siRNA)的共抑制和机制。这样的技术对于抑制正性促进Nox4表达的基因是有用的。或者，可直接给予反义或有义分子。在这个后者实施方案中，反义或有义分子可被制成组合物，然后通过任何方式给予靶细胞。

反义和有义分子的变异包括吗啉基(morpholinos)的使用，它们是吗啉核苷酸衍生物和二氨基磷酸酯连接组成的寡核苷酸(例如，Summerton和Weller，反义和核酸药物开发7：187-195，1997)。将这样的化合物注射到胚胎中，观察用mRNA干扰的作用

在一个实施方案中，本发明采用了例如用于调节编码Nox4的核酸分子的功能或作用的寡核苷酸和相似种类的化合物，即诱导转录或转录后基因沉默的寡核苷酸。这通过提供特异性杂交于一个或多个编码Nox4的核酸分子的寡核苷酸来完成。如此处使用地，为了方便使用术语“靶核酸”和“编码Nox4的核酸分子”以包含编码Nox4的DNA、从这样DNA转录来的RNA(包括前mRNA和mRNA或它们的部分)以及这样RNA衍生来的cDNA。本发明化合物与其靶核酸的杂交一般指的是“反义”。因此，相信包括在本发明的一些优选实施方案实行中的优选的机制此处指的是“反义抑制”。这样的反义抑制一般基于氢键合基础上的寡核苷酸链或片段的杂交，使得至少一条链或片段被切割、降解或者另外使其不可操作的。在这点上，为了这样的反义抑制，靶向特异性核酸分子和它们的功能目前是优选的。

要被干扰的DNA的功能包括复制和转录。例如复制和转录能来自内源的细胞模板、载体、质粒构建体或其它。要被干扰的RNA的功能包括例如如下的功能：RNA转位到蛋白质翻译的位点，RNA转位到细胞内远离RNA合成位点的位点，从RNA翻译蛋白质，产生一个或多个RNA种类的RNA的剪切，以及有RNA参加或由RNA促进的涉及RNA的催化活性或复合物的形成。这样靶核酸功能干扰的一个优选的结果是Nox4基因表达的调节。本发明的上下文中，“调节”和“表达的调节”指的是编码基因，例如DNA或RNA，的核酸分子的量或水平的增加(刺激)或降低(抑制)。抑制通常是优选的表达调节形式，mRNA通常是优选的靶核酸。

本发明的上下文中，“杂交”指的是寡聚化合物互补链的配对。本发明中，配对优选的机制包括寡聚化合物链的互补核苷或核苷酸碱基(核碱基)的氢键合，可以是Watson-Crick、Hoogsteen或翻转Hoogsteen氢键合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过氢键的形成而配对的互补核碱基。杂交能在不同环境下发生。

当化合物与靶核酸的结合干扰了靶核酸的正常功能而造成活性的损失时，反义化合物是特异性可杂交的，并且有足够的互补程度以避免在如下条件下反义化合物与非靶点核酸序列的非特异性结合：特异性结合是期望的，即在体内试验或治疗情况在生理条件下以及在体外试验情况进行试验的条件下。

如此处使用的“互补的”指的是寡聚化合物的两个核碱基之间精确配对的能力。例如，如果寡核苷酸(寡聚化合物)某个位置的核碱基能够氢键合于靶核酸某个位置的核碱基，所述靶核酸是DNA、RNA或寡核苷酸分子，那么寡核苷酸和靶核酸之间氢键合的位置就考虑是互补的位置。当每个分子中足够数量的互补位置被能互相氢键合的核碱基占据时，寡核苷酸和更远的DNA、RNA或寡核苷酸分子相互互补。如此，“特异性可杂交的”和“互补的”是用于指足够数量的核碱基上的足够程度的精确配对或互补使得在寡核苷酸和靶核酸之间发生稳定和特异性的结合的术语。

根据本发明，化合物包括反义寡聚化合物、反义寡核苷酸、核酶、外部指导序列(EGS)寡核苷酸、替代剪切子、引物、探针和其它杂交于至少部分靶核酸的寡聚化合物。像这样，这些化合物以单链、双链、环状或发夹寡聚化合物的形式引入并且可含有结构元素，例如内部或末端突出或环。一旦引入系统，本发明的化合物引发一个或多个酶或结构蛋白质的作用以影响靶核酸的修饰。这样的酶的一个非限制实例是RNAse H，切割RNA：DNA双体的RNA链的细胞核酸内切酶。本领域已知“DNA样”的单链反义化合物引发RNAse H。所以RNAse H的激活导致了RNA靶点的切割，因此大大增强了寡核苷酸介导的基因表达的抑制。假设其它的核糖核酸酶有相似的作用，例如RNase III和核糖核酸酶L家族的那些酶。

虽然反义化合物优选的形式是单链反义寡核苷酸，在许多种类中双链结构的引入，例如双链RNA(dsRNA)分子，已经显示诱导基因或其相关基因产物的功能很强并且特异性的反义介导的降低。这个现象在植物和动物都有发生。

本发明的上下文中，术语“寡聚化合物”指的是有许多单体单位组成的多聚体或寡聚体。本发明的上下文中，术语“寡核苷酸”指的是核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或它们的模仿物、嵌合体、类似物和同类物的寡聚体或多聚体。这个术语包括天然发生的核碱基、糖和共价核苷酸间(骨架)连接组成的寡核苷酸以及具有相似功能的非天然发生部分的寡核苷酸。这样修饰或取代的寡核苷酸由于期望的特性例如增加的细胞摄入、增加的对靶核酸的亲和力和在核酸酶存在下增加的稳定性而通常比天然形式优选。

虽然寡核苷酸是本发明化合物的优选形式，本发明也包含其他家族的化合物，包括但不限于寡核苷酸的类似物和模仿物，例如此处描述的那些。

依据本发明的化合物优选地包含大约8至大约80个核酸酶(即大约8至大约80个连接的核苷酸)。本领域一个普通的技术将理解本发明包括长度是8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79或80个核酸酶的化合物。

本领域已知指的是翻译起始密码子到翻译中止密码子之间区域的开发阅读框(ORF)或“编码区域”是可有效靶向的区域。本发明的上下文中，一个区域是包含基因的开放阅读框(ORF)翻译起始或中止密码子的基因内区域。

其它的靶区域包括5’非翻译区域(5’UTR)和3’非翻译区域(3’UTR)，本领域已知地5’UTR指的是从翻译起始密码子开始5’方向的部分mRNA，因而包括mRNA的5’帽子位点和翻译起始密码子之间的核苷酸(或基因上相应核苷酸)，本领域已知地3’UTR指的是从翻译中止密码子开始3’方向的mRNA部分，因而包括翻译中止密码子和mRNA 3’末端之间的核苷酸(或基因上相应核苷酸)。mRNA的5’帽子位点包含经由5’-5’三磷酸酯键而连接于mRNA最5’端残基的N7甲基化鸟苷残基。认为mRNA的5’帽子区域包括5’帽子结构本身以及邻近帽子位点的最初的50个核苷酸。靶向5’帽子区域也是优选的。

虽然一些真核mRNA的转录物直接被翻译，许多含有一个或多个已知为“内含子”的区域，它们在翻译前从转录物上被切割下来。已知剩下的(所以，翻译的)区域为“外显子”并且剪切在一起以形成连续的mRNA序列。靶向剪切位点，即内含子-外显子连接点或外显子-内含子连接点，在疾病涉及异常剪切或疾病涉及特定剪切产物过量产生的情况下也特别有用。由于重排或缺失的异常融合连接点也是优选的靶向位点。经由不同基因来源的两个(或两个以上)mRNA的剪切过程产生的mRNA转录物为“融合转录物”是已知的。使用靶向例如DNA或前mRNA的反义化合物能有效靶向内含子也是已知的。

如本领域已知地，核苷是碱基-糖的联合。核苷的碱基部分通常是杂环碱基。这样的杂环碱基两个最普通的类型是嘌呤和嘧啶。核苷酸是进一步包括共价连接于核苷糖基部分的磷酸酯基团的核苷。对于那些包括五元呋喃糖的核苷，磷酸酯基团能连接于糖基的2’、3’或5’羟基基团。在形成寡核苷酸中，磷酸酯基团相互共价连接于邻近的核苷以形成线性多聚化合物。依次，这个线性多聚化合物各自的末端能进一步连接以形成环状化合物，然而，线性化合物一般是优选的。另外，线性化合物可具有内部的核碱基互补性，所以以产生全部或部分双链化合物的方式折叠。寡核苷酸之内，磷酸酯基团普遍地指的是形成寡核苷酸的核苷间的骨架。RNA和DNA的正常连接或骨架是3’至5’磷酸二酯键。

本发明中有用的优选反义化合物的具体实例包括含有修饰的骨架或非天然核苷间连接的寡核苷酸。如本详述中定义地，具有修饰骨架的寡核苷酸包括骨架中保留磷原子的那些以及骨架中不具有磷原子的那些。为了本详述的目的，并有时如本领域中提到地，它们核苷间骨架中不具有磷原子的修饰的寡核苷酸能被认为是寡核苷。

此处含有磷原子的优选的修饰寡核苷酸骨架包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、包括3’-烯基膦酸酯、5’-烯基膦酸酯和手性膦酸酯的甲基膦酸酯和其他烷基的膦酸酯、亚膦酸酯、包括3’-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯的磷酰胺酯、硫代磷酰胺酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、具有正常3’-5’键的硒磷酸酯和硼磷酸酯、这些的2’-5’键的类似物，以及具有其中一个或多个核苷酸间键是3’至3’、5’至5’或2’至2’键的反向极性的那些。优选的具有反向极性的寡核苷酸在最3’端核苷酸间键包含单个3’至3’键，即一个可以是脱碱基(核碱基丢失或它们适当位置上具有羟基基团)的反向核苷残基。多种盐、混合盐和游离酸形式也包括在内。

上面描述的许多优选的特性是适合有义核酸分子的。

本发明延伸至定向于其它基因的反义和其它核酸分子，所述基因例如与其他细胞相比对于特定靶细胞是唯一的NADPH氧化酶的其它部分。

在鉴别调节或影响多肽活性或基因表达或mRNA翻译和/或激动(即增强)抑制剂和Nox4之间相互作用的物质之后，进一步研究了所述物质。此外，它可以制造于制剂中和/或用于制剂中，即产品、制剂或组合物，例如药剂、药物组合物或药。这些可以以治疗或预防的方式给予个体。或者，它们可以整合进贴剂、缓释胶囊或植入体或支架或其它插入血管或组织的装置，例如插管。

因此，所以本发明延伸到药物组合物、药剂、药物或其它组合物，包括包含Nox4活性或基因表达拮抗剂的支架、插管、贴剂或缓释制剂。优选地，药剂或药物是细胞非通透性的。或者它对Nox4有选择性。另外，药物组合物进一步含有Nox4-抑制剂相互作用的激动剂或激动剂在分开的组合物中。本发明的另一个方面预期包含例如为了治疗或预防例如动脉粥样硬化或内皮功能障碍的全身脉管系统事件或病变而给予患者这样的组合物的方法。为了治疗或预防全身脉管系统事件或病变，本发明的化合物也用于药剂的生产。此外，本发明预期制造包含本发明的化合物与药物可接受的赋形剂、溶剂或载体以及可选的其它成分混合的药物组合物的方法。在提供多个组合物的地方，例如有Nox4抑制剂和Nox4-抑制剂相互作用的激动剂，这样的组合物可以同时或相继给予。相继给药包括在纳秒、秒、分钟、小时或天之内给药。优选地，在秒或分钟之内。

认为这样的组合物对于例如如下的病理情况的治疗和/或预防是有用的：粥样硬化、动脉硬化、I和II型糖尿病的心血管并发症、内膜增生、冠心病、脑、冠状或动脉血管痉挛、内皮功能障碍、包括充血性心衰的心衰、败血症、外周动脉疾病、再狭窄和血管成形术后再狭窄、中风、器官移植后的血管并发症、源自病毒和细菌感染的心血管并发症以及独立于或继发于包括心肌梗塞的另一种病变的任何病变、高血压、动脉粥样硬化斑块形成、血小板聚集、心绞痛、动脉瘤、暂时缺血发作、异常氧气流和/或递送、萎缩症或器官损害、肺栓塞、血栓或普遍的动脉或静脉病变包括内皮功能障碍、血栓事件包括深度静脉血栓或支架、起搏器或其他修复装置造成的循环系统血管的损伤或支架失败或创伤，以及缺血再灌注损伤包括缺血后血流和氧气递送的恢复造成的任何损伤、坏疽、(癌症和/或异常肿瘤)、干或祖细胞增殖、呼吸疾病(例如哮喘、支气管炎、过敏性鼻炎和成人呼吸窘迫综合征)、皮肤疾病(牛皮癣、湿疹和皮炎)和骨代谢的各种失调(骨质疏松、甲状旁腺功能亢进、骨硬化、骨质减少和牙周炎)和肾衰。

本制剂也可以是多组分药物组合物的形式，包含Nox4拮抗剂或NADPH氧化酶细胞外暴露部分(例如全部或部分Nox4)的拮抗剂和选自降胆固醇药剂、抗高血压药剂、抗糖尿病药剂、抗氧化剂和抗心律失常药剂的一个或多个药剂。这样的制剂也指的是多药物包装，单独活性药剂可以制在一起或使用前混合。或者，它们可以相互在秒、分钟、小时、天或周之内分开给予。

相应地，本发明的另一个方面预期哺乳动物病变的治疗或预防的方法，所述方法包含给予所述哺乳动物如此处描述的有效量的化合物或包含上述化合物的组合物。一般地，病变涉及由含有Nox4 NADPH氧化酶产生ROS或由其引起。

优选地，哺乳动物是人或实验室测试动物，例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、仓鼠、斑马鱼或两栖动物。此处预期的病变包括例如如下的病理情况：动脉粥样硬化、动脉硬化、I和II型糖尿病的心血管并发症、内膜增生、冠心病、脑、冠状或动脉血管痉挛、内皮功能障碍、包括充血性心衰的心衰、败血症、外周动脉疾病、再狭窄和血管成形术后再狭窄、中风、器官移植后的血管并发症、源自病毒和细菌感染的心血管并发症以及独立于或继发于包括心肌梗塞的另一种病变的任何病变、高血压、动脉粥样硬化斑块形成、血小板聚集、心绞痛、动脉瘤、暂时缺血发作、异常氧气流和/或递送、萎缩症或器官损害、肺栓塞、血栓或普遍的动脉或静脉病变包括内皮功能障碍、血栓事件包括深度静脉血栓或支架、起搏器或其他修复装置造成的循环系统血管的损伤或支架失败或创伤，以及缺血再灌注损伤包括缺血后血流和氧气递送的恢复造成的任何损伤、坏疽、(癌症和/或异常肿瘤)、干或祖细胞增殖、呼吸疾病(例如哮喘、支气管炎、过敏性鼻炎和成人呼吸窘迫综合征)、皮肤疾病(牛皮癣、湿疹和皮炎)和骨代谢的各种失调(骨质疏松、甲状旁腺功能亢进、骨硬化、骨质减少和牙周炎)和肾衰。

鉴别为多肽功能或基因活性的调节剂的物质本质上可以是肽或非肽。为了许多体内药物用途，非肽“小分子”通常是优选的。相应地，可以为了药物用途设计所述物质的模仿物或模拟物(mimic)(尤其是如果是肽)。

模仿物设计为已知的药物活性化合物是基于“先导”化合物的药物开发的已知的方法。这个在活性化合物的合成很难或很昂贵时或不适于特定的给药方法时是期望的，例如肽因为它们很容易被消化道的蛋白酶降解而不是口服组合物的合适的活性药剂。模仿设计、合成和测试一般用于避免为了靶点特性随机筛选大量分子。

从具有假定靶点特性的化合物设计模仿物普遍地采用一些步骤。首先，测定对于确定靶点特性是关键的和/或重要的化合物的特别部分。在肽的情况下，这个能通过系统性改变肽中的氨基酸残基，例如通过依次替代每一个残基来完成。肽的丙氨酸扫描普遍地用于定义这样的肽基团。已知组成化合物活性区域的这些部分或残基是它们的“药物团”。

一旦找到药物团，根据它的物理特性，例如立体化学、键合、大小和/或电荷，使用来自一系列来源的数据，例如分光光度计技术、x-射线衍射数据和NMR，来模拟它的结构。计算机分析、相似性绘图(它模拟了药物团的电荷和/或体积，而不是原子之间的键合)以及其它技术能用于这个模拟方法。

在这个方法的变异中，模拟了配体和其结合伴侣的三维结构。这个在配体和/或结合伴侣改变结合的构象尤其有用，允许模型在模仿物的设计中考虑这个。图3和4分别显示了人和小鼠Nox4的NADPH结合位点。模拟能用于产生与线性序列或三维构型相互作用的抑制剂。

然后选择模仿药物团的化学基团能枝接在其上的模板分子。能很方便地选择接枝到它上面的模板分子和化学基团使得模仿物很容易合成、很可能是药理可接受的并体内不会降解而保持先导化合物的生物活性。或者，在模仿物是基于肽的地方，通过环化肽增加其刚性而获得进一步的稳定性。然后能够筛选通过此方法找到的模仿物或很多模仿物以观察它们是否具有靶点特性，或者在什么程度它们展现它。然后进行进一步的优化或修饰以得到体内或临床测试的一个或多个最终模仿物。

合理药物设计的目标是产生目的生物活性多肽或与小分子(例如激动剂、拮抗剂、抑制剂或增效剂)相互作用的结构类似物，以形成例如是有更高活性或稳定形式的多肽或例如是体内增强或干扰多肽功能的药物。见，例如Hodgson(生物/技术9：19-21，1991)。在一个方法中，一个首先通过x-射线结晶学、通过计算机模拟或最一般地通过方法的组合来测定目的蛋白质的三维结构。通过基于同源蛋白质结构的模拟也可获得关于多肽结构的有用的信息。合理药物设计的一个实例是HIV蛋白酶抑制剂的开发(Erickson等人，科学249：527-533，1990)。另外，还可以通过丙氨酸扫描分析Nox4(Wells，酶学方法202：2699-2705，1991)。在这个技术中，氨基酸残基被丙氨酸取代，测定它对肽活性的作用。用这个方式分析肽的每一个氨基酸残基以测定肽的重要区域。

分离由功能试验挑选的靶点特异性抗体并解释其晶体结构也是可能的。原则上，这个方法产生了其后药物设计所基于的药物团。通过将抗独特性抗体(anti-ids)产生为功能药理活性抗体而完全绕过蛋白质晶体学是可能的。作为镜像的镜像，抗独特性抗体的结合位点是原先受体的类似物将是期望的。抗独特性抗体能用于从化学或生物产生的肽库的库中鉴别和分离肽。经挑选的肽起药物团的作用。

再次，相似的方法用于鉴别增强其他化合物对Nox4的抑制作用的化合物。此处增效剂指的是Nox4抑制剂的激动剂。

因而，一个方法可以设计对于Nox4或Nox4基因表达具有拮抗活性的药物。

根据本发明，方法也提供了向细胞供应野生型或突变型的Nox4基因功能。当产生强调ROS产生在VSMC以及其它细胞中的作用的动物模型时，这个特别有用。或者，它可以是基因治疗方法的一部分。将载体中的Nox4基因或所述基因的一部分引入细胞使得基因保持在染色体之外。在这样的条件下，细胞将从染色体外位置表达基因。如果部分基因引入并表达在携带突变型Nox4等位基因的细胞中，那么部分基因应当编码Nox4蛋白质的一部分。为了重组和为了染色体外维持用于基因引入的载体在本领域是已知的，可以使用任何合适的载体。DNA引入细胞的方法例如电穿孔、磷酸钙共沉淀和病毒转换在本领域是已知的。

本领域已知的基因转移系统对于实行基因操作是有用的。这些包括病毒和非病毒的转移方法。许多病毒已经被用作基因转移载体或制备基因转移载体的基础，包括乳头状病毒(例如SV40，Madzak等人，遗传病毒学杂志73：1533-1536，1992)、腺病毒(Berkner，微生物学免疫学现代话题158：39-66，1992；Berkner等人，生物技术6；616-629，1988；Gorziglia和Kapikians，病毒学杂志66：4407-4412，1992；Quantin等人，美国国立科学院进展89：2581-2584，1992；Rosenfeld等人，细胞68：143-155，1992；Wilkinson等人，核酸研究20：2233-2239，1992；Stratford-Perricaudet等人，人类基因治疗1：241-256，1990；Schneider等人，自然遗传学18：180-183，1998)，牛痘病毒(Moss，微生物学免疫学现代话题158：25-38，1992；Moss，美国国立科学院进展93：11341-11348，1996)、腺相关病毒(Muzyczka，微生物学免疫学现代话题158：97-129，1992；Ohi等人，基因89：279-282，1990；Russell和Hirata，自然遗传学18：323-328，1998)、包括HSV和EBV的疱疹病毒(Margolskee，微生物学免疫学现代话题158：67-95，1992；Johnson等人，病毒学杂志66：2952-2965，1992；Fink等人，人类基因治疗3：11-19，1992；Breakefield和Geller，分子神经生物学1：339-371，1987；Freese等人，生化药理学40：2189-2199，1990；Fink等人，神经科学年鉴19：265-287，1996)、慢病毒(Naldini等人，科学272：263-267，1996)、Sindbis和Semliki森林病毒(Berglund等人，生物技术11：916-920，1993)、鸟(Bandyopadhyay和Temin，分子细胞生物学4：749-754，1984；Petropoulos等人，病毒学杂志66：3391-3397，1992)、鼠[Miller，微生物学免疫学现代话题158：1-24，1992；Miller等人，分子细胞生物学5：431-437，1985；Sorge等人，分子细胞生物学4：1730-1737，1984；Mann和Baltimore，病毒学杂志54：401-407，1985；Miller等人，病毒学杂志62：4337-4345，1988]和人[Shimada等人，临床研究杂志88：1043-1047，1991；Helseth等人，病毒学杂志64：2416-2420，1990；Page等人，病毒学杂志64：5270-5276，1990；Buchschacher和Panganiban，病毒学杂志66：2731-2739，1982]来源的逆转录病毒。

非病毒基因转移方法在本领域是已知的，例如包括磷酸钙共沉淀的化学技术、例如微注射的机械技术、经由脂质体的膜融合介导的转移和直接DNA摄入和受体介导的DNA转移。病毒介导的基因转移能联合于使用脂质体递送的直接体内基因转移，允许一个将病毒载体定向于肿瘤细胞而不进入周围的非分裂细胞。或者，能将逆转录病毒载体生产细胞注射入肿瘤。生产细胞的注射将提供连续来源的载体颗粒。

在联合生物和物理基因转移方法的方法中，任何大小的质粒DNA联合于特异于腺病毒六联体蛋白质的聚赖氨酸结合抗体，得到的复合物结合于腺病毒载体。然后三分子复合物用于转染细胞。腺病毒载体允许偶联的DNA损坏之前有效的结合、内化和内涵体的降解。对于递送基于腺病毒的载体的其它技术，见美国专利号5,691,198。

已经显示脂质体/DNA复合物能够介导直接的体内基因转移。虽然在标准脂质体制备中，基因转移过程是非特异性的，已有报告例如在直接原位给予后，肿瘤沉淀物中有局部的体内摄入和表达(Nabel，[1992；同上])。

如果多核苷酸编码有义或反义多核苷酸或核酶或DNA酶，那么表达将产生有义或反义多核苷酸或核酶或DNA酶。因而，在此上下文中，表达不要求合成蛋白质产物。除了克隆进表达载体的多核苷酸，载体还含有真核细胞中有功能的启动子。克隆的多核苷酸序列在该启动子的控制下。合适的真核启动子包括上面描述的那些。表达载体还包括序列，例如可选择的标志物和其它此处描述的序列。

携带突变Nox4等位基因或有一个或两个等位基因缺失的细胞和动物能用作模型系统以研究Nox4在ROS产生的作用和/或测试具有抑制性化合物潜能的物质。小鼠、大鼠、兔、豚鼠、仓鼠、斑马鱼和两栖动物作为模型系统特别有用。特别有用的插入是能被cre切割的Nox4基因侧面的loxP序列。测试物质应用于细胞后，测定产生ROS的能力。

所以，本发明提供了编码Nox4的基因座中或侧翼的突变。突变可以是Nox4编码序列或其5’或3’非翻译区域的插入、缺失、替代或添加。

本发明的动物模型对于筛选能够改善或模仿Nox4作用的试剂是有用的。在一个实施方案中，动物模型产生了低量的Nox4。这样的动物将展现低的ROS产生。

本发明的另一个方面提供了基因修饰动物，其中相对于同类的非基因修饰动物所述动物产生低量的Nox4。所指的“低量”包括0数量或一共比正常量低大约10％。

本发明另一方面提供了多个(即两个或两个以上)修饰的基因。多个基因的实例包括双Nox4和其它NADPH氧化酶组分。

本发明的动物模型可以是包括鱼的动物形式或例如可以用于移植的胚胎形式。胚胎优选地维持在冷冻状态，可选地与使用说明书一起出售。

遗传修饰动物也可以产生大量的Nox4。

相应地，本发明的另一方面涉及过度表达编码Nox4的基因序列的遗传修饰动物。

遗传修饰动物包括转基因动物，或“敲除”或“敲进”动物以及条件缺失突变体。此外，共抑制可用于诱导转录后基因沉默。共抑制包括RNAi的诱导。

双杂交筛选对于鉴别Nox4相关的生化或基因途径的其他成员特别有用。双杂交筛选方便地使用了酿酒酵母和裂变酵母。使用酵母双杂交系统能进行抑制剂与Nox4相互作用和抑制剂的筛选，它利用了由两个物理可分的功能结构域组成的转录因子。最普遍使用的是由DNA结合结构域和转录激活结构域组成的酵母GAL4转录激活子。两个不同的克隆载体用于产生GAL4结构域与编码潜在结合蛋白质的各自的融合。融合蛋白是共表达的，靶向核的，如果相互作用发生，报告基因(例如lacZ)的激活产生可检测的表型。在该情况下，例如，酿酒酵母与表达cDNA GAL4激活结构域融合的库或载体以及表达Nox4-GAL4结合结构域融合的载体共转化。如果lacZ用作报告基因，融合蛋白质的共表达将产生蓝色。与Nox4相互作用的小分子或其它候选化合物将导致细胞颜色的消失。这个系统能用于筛选抑制Nox4功能因而保护酵母抗细胞死亡的小分子以及测定Nox4中参与ROS产生的残基。例如，酵母双杂交系统的参考如Munder等人(应用微生物学生物技术52(3)：311-320，1999)和Young等人，自然生物技术16(10)：946-950，1998)公开的。在动物细胞中重新测试这个系统鉴别出来的分子。

本发明也预期定向于NADPH氧化酶细胞外暴露部分，例如Nox4或其一部分的抗体。这样的抗体可以是多克隆或单克隆抗体，但去免疫化或嵌合抗体是特别优选的。这些抗体也指的是免疫相互作用分子，包括重组和合成形式。

所以本发明进一步提供了生化技术的应用以给予源自一个动物或鸟类的免疫相互作用分子(例如抗体)基本上相同或不同种类的另一个动物或鸟类的非免疫原性。生化方法此处指的是“去免疫化”。此处所指的“去免疫化”包括如下的过程：例如互补决定簇区域(CDR)的接枝，关于免疫相互作用分子的框架区域和变异(v)区域突变的“再成形”，所有都旨在降低特定宿主(例如人研究对象)中免疫相互作用分子的免疫原性。在该情况下，优选的免疫相互作用分子是抗体，例如多克隆或单克隆抗体。在最优选的实施方案中，免疫相互反应分子是单克隆抗体，来源于一个动物或鸟类并在另一个来自相同或不同种类的动物或鸟类，例如但不限于人，展现了降低的免疫原性。

相应地，本发明的一个方面提供了免疫相互作用分子的变异体，所述变异体包含对NADPH氧化酶上细胞外暴露的抗原决定簇具有特异性的部分和来源于得自一个动物或鸟类的免疫相互作用分子的部分，其中所述变异体在来自相同或不同种类的另一个动物或鸟类中展现了降低的免疫原性。

如上面陈述地，免疫相互作用分子的优选形式是抗体，特别是单克隆抗体。

所指的“基本无免疫原性的”包括与亲本抗体相比降低的免疫原性，亲本抗体即在暴露于去免疫化过程之前的抗体。术语“免疫原性”包括引发、诱导或另外促进宿主动物体液和/或T细胞介导的反应的能力。特别方便的免疫原性准则包括来源于抗体变异(v)区的氨基酸序列与MHC II型分子相互作用因而刺激或促进T细胞介导的反应包括T细胞辅助的体液反应的能力。

“抗体”指的是能够结合、相互作用或另外联合于抗原的免疫球蛋白家族的蛋白质。所以抗体是抗原结合分子。“抗体”是免疫相互作用分子的实例，包括多克隆或单克隆抗体。本发明的优选的免疫相互作用分子是单克隆抗体。

此处就其最广泛的意义使用的术语“抗原”指的是能够反应产生和/或诱导免疫反应的物质。所指的“抗原”包括抗原的决定簇或抗原决定簇。Nox4细胞外暴露部分是优选的抗原或抗原决定簇的实例。

“抗原结合分子”是指任何对靶抗原具有结合亲和力的分子。将理解这个术语延伸至免疫球蛋白(例如多克隆或单克隆抗体)、免疫球蛋白片段和呈现抗原结合活性的非免疫球蛋白衍生的蛋白质框架。术语“抗体”和“抗原结合分子”包括这些分子的去免疫形式。

“抗原决定簇”或“表位”指的是抗特定免疫反应指向的并且包括半抗原的抗原分子的一部分。一般地，在动物，抗原同时递呈一些或甚至许多抗原决定簇。“半抗原”是能特异性结合于抗体但是除非结合于载体，否则不能或仅很差地诱导免疫反应的物质。半抗原一般包含单个抗原决定簇或表位。

如上面陈述地，虽然本发明优选的抗体是用于人的小鼠单克隆抗体的去免疫化形式，本发明延伸至来自任何来源并且用于任何宿主的去免疫的抗体。动物和鸟来源和宿主的实例包括人、灵长类、家畜动物(例如绵羊、奶牛、马、猪、驴)、实验室测试动物(例如小鼠、兔、豚鼠、仓鼠)、陪伴动物(例如狗、猫)、家禽鸟类(例如鸡、鸭、鹅、火鸡)和比赛鸟类(例如雉)。

使用如例如Kohler和Milstein(Kohler等人，自然256：495-499，1975和Kohler等人，欧洲免疫学杂志6(7)：511-519，1976，Coligan等人，免疫学现代试验方案，1991-1997或Toyama等人，单克隆抗体，试验手册，Kodansha Scientific出版，1987)描述的标准试验方案进行免疫和其后单克隆抗体的生产。基本上，通过标准方法用含有抗原(例如含有Nox4的样品)或其一部分免疫动物以产生产抗体的细胞，特别是产抗体的体细胞(例如B淋巴细胞)。然后为了永生化，能从经免疫的动物取出这些细胞。抗原首先需要与载体联合。

“载体”指的是一般高分子量的任何物质，有无或差免疫原性的物质(例如半抗原)天然地或人工地连接于其上以增强其免疫原性。

适用本领域众所周知的方法进行产抗体细胞的永生化。例如，可以使用EB病毒(EBV)的转化方法获得永生化(Kozbor等人，酶学方法121：140，1986)。优选的实施方案中，使用细胞融合的方法永生化产抗体的细胞(Coligan等人，免疫学现代试验方案，1991-1997，中描述的)，所述方法广泛用于单克隆抗体的生产。该方法中，有产生抗体潜能的产抗体的体细胞，特别是B细胞，与骨髓瘤细胞系融合。这些体细胞可以来源于已接触抗原(primed)的动物的淋巴结、脾和外周血，优选的是啮齿类动物例如小鼠和大鼠。本发明作为实例的实施方案中，使用了脾细胞。然而，使用大鼠、兔、绵羊或山羊细胞或其它替代的动物种类的细胞将是可能的。

专门化的骨髓瘤细胞系从淋巴细胞肿瘤发展而来而用于产杂交瘤的融合程序中(Kohler和Milsten同上1976，Kozbor等人，酶学方法121：140，1986和Volk等人，病毒杂志42(l)：220-227，1982)。这些细胞系的发展至少有三个原因。第一个是促进从非融合的和相似无限自身繁殖的骨髓瘤细胞挑选融合杂交瘤。通常，这个通过使用有给予杂交瘤不能在某些支持它们生长的选择性培养基上生长的酶缺陷的杂交瘤来完成。第二个原因来自淋巴细胞性肿瘤细胞天生的生产它们自己抗体的能力。为了消除杂交瘤产生肿瘤细胞抗体，使用不能产生内源性轻或重免疫球蛋白链的骨髓细胞系。选择这些细胞系的第三个原因是为了它们融合的合适性和效率。

许多骨髓瘤细胞系可以用于生产融合细胞杂交体，包括例如P3X63-Ag8、P3X63-AG8.653、P3/NS1-Ag4-1(NS-1)、Sp2/0-Ag14和S194/5.XXO.Bu.1。Kohler和Milstein(Kohler等人，欧洲免疫学杂志6(7)：511-519，1976)已经描述了P3X63-Ag8和NS-1细胞系。Shulman等人，自然276：269-270，1978，发展了Sp2/0-Ag14骨髓瘤系。Trowbridge，实验医学杂志148(1)：220-227，1982，报告了S194/5.XXO.Bu.1系。

生产产抗体的脾或淋巴结细胞和骨髓瘤细胞的杂交体的方法通常包括体细胞与骨髓瘤细胞分别在促进细胞膜融合的试剂或许多试剂(化学的、病毒的或电的)的存在下以10∶1的比例混合。融合方法已有描述(Kohler等人，自然256：495-499，1975，Kohler等人，欧洲免疫学杂志6(7)：511-519，1976，Gefter等人，体细胞遗传学3：231-236，1977和Volk等人，病毒杂志42(1)：220-227，1982)。那些研究者使用的促进融合的试剂是仙台病毒和聚乙二醇(PEG)。

因为融合程序以很低的频率产生活的杂交体(例如当脾被用作体细胞的来源时，大约每1×10⁵脾细胞只得到一个杂交体)，具有从剩余的未融合细胞，特别是未融合的骨髓瘤细胞，挑选融合细胞杂交体的方法是优选的。在其它的得到的融合细胞杂交体中检测期望的产抗体杂交瘤的方法也是必须的。一般地，通过在支持杂交瘤生长但是阻止未融合的杂交瘤细胞生长的培养基中培养细胞来完成融合细胞杂交体的挑选，它们通常进行无限分裂。融合中使用的体细胞在体外培养中不能维持长期的存活，因此不会造成问题。本发明的实例中，使用了缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT阴性)的骨髓瘤细胞。在次黄嘌呤/氨基喋呤/胸苷(HAT)培养基中完成这些细胞的挑选，在该培养基中融合的细胞杂交体由于脾细胞HPRT阳性的基因型而存活。有不同基因缺陷(药物敏感性等等)的骨髓瘤细胞的使用也是可能的，能依靠支持基因表型感受态杂交体生长的培养基挑选所述细胞。

选择性培养融合的细胞杂交体需要几周。在该时期的早期，鉴别产生期望抗体的那些杂交体是必须的，以至于它们随后被克隆和繁殖。一般地，大约10％得到的杂交体产生期望的抗体，尽管大约1％至30％的范围也不是不常见的。通过一些标准试验方法的任何一个能完成产抗体杂交体的检测，包括例如如Chou等人，美国专利号6,056,957描述的酶联免疫试验和放射免疫试验技术。

一旦挑选到期望的融合细胞杂交体并克隆进每一个产抗体细胞系，每个细胞系用两个标准方法中的任何一个进行增殖。杂交瘤细胞的悬浮液能注射到组织相容性动物。经注射的动物将生长可分泌由融合细胞杂交体产生的特异性单克隆抗体的肿瘤。能利用(tapped)动物的体液，例如血清或腹水，以提供高浓度的单克隆抗体。或者，体外在实验室培养器皿中增殖每一个细胞系。能通过倾泻(decantation)、过滤或离心和其后的纯化收集合有高浓度单个特异性单克隆抗体的培养基。

通过任何合适的免疫检测方法测试细胞系的特异性以检测目的抗原。例如，将细胞系等量分装到许多孔中，孵育，通过酶联免疫吸收试验(ELISA)、间接荧光抗体技术等等分析每孔的上清液。对生产能识别靶抗原但不识别非靶抗原决定簇的单克隆抗体的细胞系进行鉴别，然后直接体外培养或注射进组织相容性动物以形成肿瘤并生产、收集和纯化需要的抗体。

因而，本发明第一步提供了特异性与细胞外暴露的Nox4或其抗原决定簇相互作用的单克隆抗体。

单克隆抗体一般用于去免疫化方法。这样的方法采取许多形式的任何一种，包括具有根据本发明制备的单克隆抗体相同或相似的特异性的嵌合抗体的制备。嵌合抗体是一般通过基因工程从属于不同种类的免疫球蛋白变异和恒定区的基因构建其轻和重链基因的抗体。因而，依据本发明，一旦获得生产期望的单克隆抗体的杂交瘤，就使用产生种间单克隆抗体的技术，其中一个种类的结合区域与另一种类的抗体的非结合区域联合(Liu等人，美国国立科学院进展84：3439-3443，1987)。例如，来自非人(例如鼠)单克隆抗体的CDRs能接枝到人抗体上，因此“人源化”鼠抗体(欧洲专利公开号0 239 400，Jones等人，自然321：522-525，1986，Verhoeyen等人，自然239：1534-1536，1988和Richmann等人，自然332：323-327，1988)。在该情况下，去免疫化方法对人是特异性的。更加特别地是，CDRs能接枝到有或无人恒定区的人抗体变异区。提供CDRs的非人抗体一般指的是“供体”，提供框架的人抗体一般指的是“受体”。恒定区不需要存在，但是如果它们存在，它们必须基本上与人免疫球蛋白恒定区相同，即至少大约85-90％，优选地大约95％或更多地相同。因此，除了可能的CDRs外，人源化抗体的所有部分基本上与天然人免疫球蛋白序列的相应部分相同。如此，“人源化抗体”包含人源化的轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。供体抗体据说是“人源化的”，通过“人源化”方法的，因为得到的人源化抗体结合于与提供CDRs的供体抗体相同的抗原是期望的。此处所指的“人源化的”包括所指的对于特定宿主去免疫化的抗体，在该情况下，是人宿主。

将理解去免疫化抗体可具有额外的保守氨基酸取代，所述取代基本上对抗原结合或其它免疫球蛋白的功能没有影响。

在例如Richmann等人(自然332：323-327，1988)、Chou等人(美国专利号6,056,957)、Queen等人(美国专利号6,180,377)、Morgan等人(美国专利号6,180,377)和Chothia等人(分子生物学杂志196：901，1987)中描述了根据本发明产生去免疫化抗体而采用的示例方法。

除了它们抑制ROS的治疗价值外，为了用于测定有细胞外部分的NADPH氧化酶的存在，也可用报告分子例如荧光标记物来标记抗体。合适的荧光标记物的实例包括表5中列出了那些。

                       表5

探针	Ex1(nm)	Em2(nm)
			反应和偶联探针
羟基香豆素	325	386
			氨基香豆素	350	455
甲氧香豆素	360	41O
			Cascade兰	375；400	423
Lucifer黄	425	528
			NBD	466	539
R-藻红蛋白(PE)	480；565	578
			PE-Cy5联合物	480；565；650	670
PE-Cy7联合物	480；565；743	767
			APC-Cy7联合物	650；755	767
Red 613	480；565	613
			荧光素	495	519
FluorX	494	520
			BODIPY-FL	503	512
TRITC	547	574
			X-罗丹明	570	576
Lissamine罗丹明B	570	590
			PerCP	490	675
Texas Red	589	615
			别藻蓝蛋白(APC)	650	660
TruRed	490，675	695
			Alexa Fluor 350	346	445
Alexa Fluor 430	430	545
			Alexa Fluor 488	494	517
Alexa Fluor 532	530	555
			Alexa Fluor 546	556	573
Alexa Fluor 555	556	573
			Alexa Fluor 568	578	603
Alexa Fluor 594	590	617
			Alexa Fluor 633	621	639
Alexa Fluor 647	650	688
			Alexa Fluor 660	663	690

探针	Ex1(nm)	Em2(nm)
			反应和偶联探针
Alexa Fluor 680	679	702
			Alexa Fluor 700	696	719
Alexa Fluor 750	752	779
			Cy2	489	506
Cy3	(512)；550	570；(615)
			Cy3，5	581	596；(640)
Cy5	(625)；650	670
			Cy5，5	675	694
Cy7	743	767
			探针	Ex1(nm)	Em2(nm)
核酸探针
			Hoeschst 33342	343	483
DAPI	345	455
			Hoechst 33258	345	478
SYTOX兰	431	480
			色霉素A3	445	575
光辉霉素	445	575
			YOYO-1	491	509
SYTOX绿	504	523
			SYTOX橙	547	570
溴化乙啶	493	620
			7-AAD	546	647
吖啶橙	503	530/640
			TOTO-1，TO-PRO-1	509	533
噻唑橙	510	530
			碘化丙啶(PI)	536	617
TOTO-3，TO-PRO-3	642	661
			LDS 751	543；590	712；607
细胞功能探针
			Indo-1	361/330	490/405
Fluo-3	506	526
			DCFH	505	535
DHR	505	534
			SNARF	548/579	587/635

荧光蛋白质
			Y66F	360	508
Y66H	360	442
			EBFP	380	440
野生型	396，475	50，503
			GFPuv	385	508
ECFP	434	477
			Y66W	436	485
S65A	471	504
			S65C	479	507
S65L	484	51O
			S65T	488	511
EGFP	489	508
			EYFP	514	527
DsRed	558	583
			其它探针
Monochlorobimane	380	461
			钙黄绿素	496	517

1Ex：激发峰波长(nm)

2Em：发射峰波长(nm)

本发明的化合物、试剂、药剂、核酸分子和其它的Nox4拮抗剂能制成根据常规药物合成技术制备的药物组合物。见，例如Remington氏药物科学，第18版(1990，Mack出版公司，Easton，PA，U.S.A.)。组合物含有活性试剂或活性试剂药物可接受的盐。除了一个活性物质外，这些组合物包含药物可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其它本领域众所周知的材料。这样的材料应当是非毒性的并且不应当干扰活性成分的效能。根据给药途径所期望的制备形式载体可采取非常多的形式，例如静脉、口腔、鞘内、神经外(epineural)或非肠道。

对于口服给药，化合物能制成固相或液相制剂，例如胶囊、药丸、片剂、锭剂(lozenge)、粉末、悬浮液或乳浊液。在制备口服给药形式的组合物中，可以采用任何通常的药物介质，例如，在口服液体制剂(例如，悬浮剂、乳液和溶液)的情况下例如水、乙二醇、油、酒精、调味剂、防腐剂、着色剂、悬浮剂等等；或在口服固相制剂(例如，粉末、胶囊和片剂)的情况下载体，例如淀粉、糖、稀释剂、粒化剂、润滑剂、结合剂、分解剂等等。因为它们很容易给药，片剂和胶囊代表了最有利的口服给药单位形式，在该情况下显然采用了固相药物载体。如果是期望的，片剂可以是通过标准技术包被糖的或肠溶的。活性药剂能被制成胶囊使其稳定地通过胃肠道而在同时允许通过血脑屏障。见，例如，国际专利公开号WO 96/11698。

对于非胃肠道给药，化合物可以溶于药物载体并以溶液或悬浮剂的形式给予。合适载体的例证是水、食盐、葡萄糖溶液、果糖溶液、乙醇或动物、植物和合成来源的油。载体也可以含有其它的成分，例如，防腐剂、悬浮剂、溶解剂、缓冲剂等等。当鞘内给予化合物时，它们也可以溶于脑脊液中。

优选地以治疗有效量给予活性药剂。给予的实际的量和给药的速率和时程将依赖于要治疗的病变的性质和严重程度。治疗的处方，例如剂量的决定、时间选择等等都在全科医生或专家的责任之内，一般考虑要治疗的紊乱、个体病人的状态、给药位点、给药方法以及其它医生已知的因素。Remington氏药物科学，同上，中能找到技术和试验方案的实例。

或者，通过靶向系统例如抗体或细胞特异性配体或特异性核酸分子的使用，靶向治疗可用于将活性药剂更加特异性地递送到某些类型的细胞。由于许多原因靶向是期望的，例如，如果药剂有不可接受的毒性或另外如果它要求非常高的剂量或另外如果它不能进入靶细胞。

除了直接地给予这些药剂，它们还能在靶细胞内产生，例如在例如上面描述的病毒载体中或在例如美国专利号5,550,050和国际专利公开号WO 92/19195，WO 94/25503，WO 95/01203，WO 95/05452，WO96/02286，WO 96/02646，WO 96/40871，WO 96/40959和WO 97/12635描述的基于细胞的递送系统中。载体能靶向于靶细胞。基于细胞的递送系统被设计成接种于病人体内期望的位点，并且含有靶药剂的编码序列。或者，药剂能以前体形式给予，通过要治疗的细胞内产生的或靶向于要治疗的细胞的激活药剂将前体形式转化为活性形式。见，例如，欧洲专利公开号0 425 731A和国际专利公开号WO 90/07936。

优选的实施方案中，一旦研究对象经历了脉管系统事件，就立即单独或联合其他治疗剂例如血凝抑制或溶解剂或一个或多个细胞因子而给予血管NADPH氧化酶的拮抗剂。为了血管疾病和再灌注损伤的治疗和预防，本发明预期药物试剂盒或多部分(即两个或两个以上组分)药物制剂。这样的NADPH氧化酶抑制剂对于癌症的治疗以及阻止癌细胞以及特别是增生、分化和/或自我更新过程中干细胞或祖细胞中ROS的产生也是有用的。

本发明进一步构思了Nox4拮抗剂或抑制剂在治疗或预防哺乳动物或非哺乳动物的事件或病变的药物的制造中的用途。

本发明也提供了苯甲酰胺和芳基磺酸酯以及衍生或类似物在治疗或预防哺乳动物或非哺乳动物的病变或事件的药物的制造中的用途。

本发明进一步定向于苏拉明或其衍生物或类似物在治疗或预防哺乳动物或非哺乳动物的病变或事件的药物的制造中的用途。

尽管本发明特别涉及Nox4，本法明还预期Nox4的同系物例如另一个Nox化合物。

另外，虽然Nox4的拮抗剂或其同系物是特别优选的，本发明在ROS的促进是期望的情况下(例如杀死癌细胞)，还延伸到激动剂。

本发明也提供了tempol在治疗或预防哺乳动物或非哺乳动物的病变或事件的药物的制造中的用途。

本法明还提供了DPI在治疗或预防哺乳动物或非哺乳动物的病变或事件的药物的制造中的用途。

下面非限制性实例进一步描述了本发明。

下面的实例研究了Nox4 NADPH氧化酶亚基在血管疾病发展中的作用。实例检验了来源于含有Nox4的NADPH氧化酶的ROS是许多心血管系统疾病发病机理的主要原因这个假说，所述疾病包括动脉粥样硬化和血管再塑例如再狭窄、高血压和蛛网膜下出血。实例联合了旨在清除超氧化物(tempol)或特异性阻断它从NADPH氧化酶形成(DPI、罗布麻宁、苏拉明)的药理方法，所述方法有体内直接抑制NADPH氧化酶Nox4亚基表达的基因策略(反义、靶向基因删除)。使用一个在兔中(动脉周围环)，另一个在小鼠中(颈动脉接扎)的两个短期动脉粥样化形成的模型以及遗传性高胆固醇血症诱导小鼠动脉粥样硬化的长期模型(载脂蛋白E敲除小鼠)评价了这些动脉粥样化形成干预的效果。大鼠蛛网膜下腔出血(将血液注射进小脑延髓池(cisterna magna)和高血压(血管紧张素II的灌注)模型的研究也包括在内。所有这些模型在本领域内是广泛使用的。

                   实施例1

超氧化物清除化合物和特异性NDAPH氧化酶抑制剂在血管重塑

            和动脉粥样化形成中的效能

为了测定NADPH氧化酶衍生的超氧化物在动脉粥样化形成中的作用，在血管疾病的兔和小鼠模型中有经证实的体内效能的超氧化物清除化合物对ROS水平和新生内膜形成的作用与三个结构和机制截然不同的NADPH氧化酶抑制剂进行比较。抑制剂是：

Tempol：硝基氧分子例如tempol(4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶氧)很长时间被用作检测和定量生物系统中超氧化物产生的电子自旋捕获剂。然而，最近认识到这些化合物是体内强超氧化物清除剂，它们减少一些血管疾病实验模型的氧化性损伤，包括高血压[Schnackenberg等人，高血压33.424-428，1999；Beswick等人，高血压37：781-786，2001]、糖尿病[Nassar等人，欧洲药理学杂志436：111-118，2002]和缺血-再灌注损伤[Cuzzocrea等人，休克14：150-160，2000]。既然tempol部分通过电子自旋捕获超氧化物因而消除导致动脉粥样化形成的下游ROS例如H₂O₂和OH^*的形成而起作用，此处认为它应当具有在传统抗氧化剂例如维生素E和黄酮醇(flavonols)之上的治疗动脉粥样硬化的治疗优势。

二亚苯基碘鎓(DPI)：DPI是已确立的血管NADPH氧化酶依赖性超氧化物产生的黄素拮抗剂和抑制剂[Paravicini等人2002，同上；Dusting等人，1998，同上]。DPI是小鼠VSMC中表达的含有Nox4的NADPH氧化酶的强抑制剂(图5)。重要地，DPI抑制NADPH氧化酶的浓度(IC₅₀，1nM)比抑制内皮一氧化氮合酶所需的那些浓度(例如IC₅₀，180-300nM [Stuehr等人，实验生物学美国协会联盟杂志(Faseb J.)5：98-103，1991；Wang等人，英国药理学杂志110：1232-1238，1993])要低两个数量级。因而，抑制血管NADPH氧化酶活性的选择性能够通过动脉周围环的局部应用获得。

罗布麻宁：罗布麻宁是甲氧基取代的儿茶酚，通过结合于NADPH氧化酶胞浆p47phox亚基因而阻止其与膜结合的细胞色素氧化酶结构域联合而抑制NADPH氧化酶活性[Stolk等人，美国呼吸细胞分子生物学杂志11：95-102，1994]。已经显示罗布麻宁抑制培养的小鼠VSMC中表达的含有Nox4的NADPH氧化酶的活性(图5)。同样，罗布麻宁减弱了人和大鼠分离血管中NAD(P)H刺激的超氧化物的产生并增加了NO的生物利用度[Hamilton等人，高血压40：755-762，2002]。重要地，已经显示经由饮用水给予DOCA盐高血压大鼠罗布麻宁显著地降低了这些动物动脉超氧化物的产生和血压，证明了它的体内效能[Beswick等，2001，同上]。评估了罗布麻宁是否抑制血管重塑和动脉粥样硬化。

苏拉明：苏拉明和相关磺酸酯化的芳基化合物和/或苯甲酰胺衍生物，例如反应蓝2和PPADS是细胞非通透性的NADPH类似物。这些化合物是培养的小鼠VSMC中含有Nox4的NADPH氧化酶的强抑制剂(图2A)。相反，苏拉明不抑制噬菌细胞中gp91phox依赖性NADPH氧化酶的活性(图2B)[Roilides等人，抗微生物药和化学治疗37：495-500，1993；Heyneman，兽医研究通讯11：149-157，1987]。更合适地，这些细胞需要通透处理使得苏拉明发挥它对NADPH氧化酶活性的抑制作用[Heyneman，1987，同上]。依据本发明认为该选择性起源于Nox4的NADPH结合结构域位于细胞外的事实，与gp91phox的NADPH结合位点位于细胞内相反。因而，磺酸酯苯甲酰胺和烷基磺酸酯和衍生物或类似物代表了一类选择性抑制血管NADPH氧化酶活性的药物。

实验模型描述如下：

兔动脉周围环：将DPI经由环通过动脉周围递送到损伤位点[Gaspari等人，在一氧化氮生物学第7部分中，Ed.S.Moncada，L.Gustafson，P.Wiklund和E.A.Higgs，Portland Press，London，pp.72-73，2000a]，避免DPI的全身副作用并保证严格控制局部浓度以避免对eNOS的影响。为了直接比较所有药理试剂的效能，tempol、罗布麻宁和苏拉明也以这个方式递送。每只兔中，一条动脉接受tempol(0.1或1mM)、DPI(10或100nM)、罗布麻宁(0.1或1mM)或苏拉明(10或100μM)。这些浓度对于体外抑制VSMC NADPH氧化酶的活性是有效的(图2A和5)。对侧上了环的动脉接受合适的溶剂作为动物自身对照，损害将允许发展共14天。

小鼠颈动脉接扎：12周龄雄性小鼠将接受tempol(饮用水中0.1或1mM)[Beswick等人，2001，同上]、罗布麻宁(饮用水中0.15或1.5mM)[Beswick等人，2001，同上]、苏拉明(30或300mg.kg^-1，i.p.)或合适的溶剂。治疗一周后，小鼠进行一条颈动脉的接扎和对侧动脉的虚假手术。小鼠再接着接受合适的治疗四周。

ApoE/-小鼠：小鼠断奶后(即四周龄)立即分配接受tempol、罗布麻宁、苏拉明或合适的溶剂。剂量是相信在上面颈动脉接扎研究中最有效的那些。所有的小鼠高脂肪饮食饲养共六个月并且在此期间将继续溶剂、罗布麻宁或苏拉明的治疗。

血管紧张素II诱导的实验高血压：在第0天，大鼠暂时麻醉(克他命80mg/kg ip加甲苯噻嗪10mg/kg ip)，皮下接种含有生理盐水或苏拉明的渗透性迷你泵。苏拉明的剂量速率是每14天300mg/Kg。在第7天，大鼠再次麻醉，皮下接种另一个含有生理盐水或血管紧张素II的迷你泵。血管紧张素II的剂量速率是每7天5mg/kg。在第14天，每只大鼠再次麻醉，将插管插入股动脉以测量血压。血管紧张素引起对照大鼠平均动脉压(大约60-80mmHg)的大幅升高。

蛛网膜下腔出血：在第0天，大鼠暂时麻醉(苯巴比妥50mg/kgip)，皮下接种含有生理盐水或苏拉明的渗透性迷你泵。苏拉明的剂量速率是每7天300mg/kg。在第5天，大鼠再次麻醉，从股动脉采血0.3ml，经由小脑延髓池注入脑腹部表面周围的脑脊液中。一些对照大鼠中，将生理盐水注入脑脊液而不是动脉血。大鼠再允许恢复2天，然后再次在第7天麻醉以进行研究。

血管重塑和动脉硬化是复杂的多因素过程，它们严重程度的定量分析需要测量血管壁的多个形态、生化和分子参数。进行下面的试验：

血管超氧化物水平和氧化应激：评价每个药物效能的第一步是测定它对血管超氧化物水平和氧化应激的影响。每一个化合物减弱了上面所有模型的血管超氧化物水平。另外，化学反应计量去除超氧化物(tempol)或阻断它们的来源(NADPH氧化酶抑制剂)消除了H₂O₂及其衍生物(HOCI^-，OH^*)的形成，所以降低了血管壁的总氧化应激。

内皮功能障碍：这是动脉硬化的早期临床症状，显然是动脉反应于内皮依赖性松弛剂(例如乙酰胆碱)的扩张能力降低(Cai和Harrison，循环研究87：840-844，2000)。内皮功能障碍的主要原因是超氧化物介导的内皮衍生NO的失活[Gryglewski等，1986，同上；Cai和Harrison，2000，同上；Paravicini等，2002，同上；Dusting等，1998，同上]。这不仅减低了血管保护性NO的生物利用度，还导致了强氧化自由基过亚硝酸盐(ONOO^*)的形成。因而，通过消除超氧化物，上面的干预恢复了患病动脉的内皮功能(血管反应性研究)并降低了过亚硝酸盐的形成(由氧化应激的降低反映的)。

炎症标志物：动脉硬化另一个早期症状是增加的细胞间粘附分子1(ICAM-1)、血管细胞粘附分子1(VCAM-1)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的血管表达。这些蛋白质的上调支撑着白细胞吸附和迁移至内皮下区域。ROS特别是H₂O₂，增加了血管中ICAM-1、VCAM-1和MCP-1的表达[Lo等人，1993，同上]。另外，NO通常抑制这些炎症标志物的表达，因而血管疾病中降低的NO生物利用度很可能参与它们的上调。血管疾病所有的模型中，通过清除超氧化物或通过阻断它的形成而恢复的ROS/NO^*平衡抑制了炎症标志物的表达(即时PCR，免疫染色)。

VSMC的增殖：形成上面模型的新生内膜的损害很大程度上由在培养基中增殖并且穿过内弹性膜板(IEL)的VSMC组成。超氧化物和H₂O₂是VSMC的强促细胞分裂素，能刺激这些细胞的迁移[Griendling和Ushio-Fukai，1998，同上]。ROS也激活降解IEL并促进VSMC通过新生内膜的基质金属蛋白酶[Belkhiri等人，实验室研究77.533-539，1997]。既然上面所有的干预都抑制了血管壁中总ROS水平(包括H₂O₂)，它们也降低VSMC的增殖和其后迁移到新生内膜[溴脱氧尿苷的核掺入]。

损害大小：通过限制白细胞和VSMC迁移至内皮下区域，抑制NADPH氧化酶衍生的超氧化物具有降低所有上面动脉粥样硬化模型损害大小的全部作用。

血管紧张素II诱导的实验高血压：在第0天，大鼠暂时麻醉(克他命80mg/kg ip加甲苯噻嗪10mg/kg ip)，皮下接种含有生理盐水或苏拉明的渗透性迷你泵。苏拉明的剂量速率是每14天300mg/Kg。在第7天，大鼠再次麻醉，皮下接种另一个含有生理盐水或血管紧张素II的迷你泵。血管紧张素II的剂量速率是每7天5mg/kg。在第14天，每只大鼠再次麻醉，将插管插入股动脉以测量血压。血管紧张素II引起对照大鼠平均动脉压(大约60-80mmHg)的大幅升高。

蛛网膜下腔出血：在第0天，大鼠暂时麻醉(苯巴比妥50mg/kgip)，皮下接种含有生理盐水或苏拉明的渗透性迷你泵。苏拉明的剂量速率是每7天300mg/kg。在第5天，大鼠再次麻醉，从股动脉采血0.3ml，经由小脑延髓池注入脑腹部表面周围的脑脊液中。一些对照大鼠中，将生理盐水注入脑脊液而不是动脉血。大鼠再允许恢复2天，然后在第7天再次麻醉以进行研究。

总之，上面的测量指出从血管壁去除过多的超氧化物降低了血管重塑和动脉粥样硬化。

                   实施例2

抗Nox4的反义核酸对超氧化物的产生和新生内膜发展的作用

以前硫代磷酸酯保护的反义寡核苷酸已经用于体内，证实了多种多样的基因在大鼠和兔的气球插管损伤后在VSMC增殖和再狭窄中的作用(例如c-myb、c-myc、c-fos、c-jun、转化生长因子β、Ca²⁺-钙调蛋白依赖性蛋白激酶)[Simons等人，自然359：67-70，1992；Bennett等人，临床研究杂志93：820-828，1994；Merrilees等人，血管研究杂志31：322-329，1994；Villa等人，循环研究76：505-513，1995；Herbert等人，细胞生理学杂志170：106-114，1997]。所有的这些研究中，反义寡核苷酸经由普鲁兰凝胶(pluronic gel)应用于动脉的血管外膜表面。重要地，体内血管外膜应用24小时之内导致反义核酸在血管壁所有层之间统一的分布[Merrilees等人，1994，同上；Villa等人，1995，同上]。另外，反义分子显著地降低了损伤血管中靶基因的表达，而对照寡核苷酸序列(即有义、无义)则没有作用[Bennett等人，1994，同上，Merrilees等人，1994，同上；Herbert等人，1997，同上]。

使用下面的实验方案：

小鼠颈动脉接扎：12周龄雄性小鼠进行手术以接扎一侧颈动脉。接扎的动脉的血管外膜表面用含有没有添加剂、Nox4反义或错配对照寡核苷酸的0.25％F-127-聚烯凝胶包被。三个反义浓度(最初检查了0.3、1和3mg/ml)对Nox4mRNA表达的影响(实时PCR)。这些浓度涵盖了以前显示的对于抑制体内损伤动脉中基因表达是有效的反义浓度的范围[Simons等人，1992，同上；Bennett等人，1994，同上；Merrilees等人，1994，同上；Villa等人，1995，同上；Herbert等人，1997，同上]。被认为是抑制Nox4的表达最有效的反义浓度将用于其后所有的研究。四周后，处死小鼠，取出它们接扎的或作过假手术的颈动脉用于终点测量。

兔动脉周围环：检查了Nox4反义核酸对兔动脉周围环诱导的超氧化物的产生和损害的发展的作用。在这些研究中，动脉周围环既起诱导新生内膜损伤的刺激剂的作用，又起反义核酸直接局部应用到动脉血管外膜表面的溶剂的作用。为了获得抗兔Nox4有效的反义核酸，使用了与用于小鼠VSMC的相似的设计策略。将Nox4反义核酸递送到左侧动脉共14天，而对侧动脉将接受溶剂(生理盐水或Oligofectamine-见下)。

已经确定反义分子分布在血管壁的所有层并且定位于血管细胞细胞质和细胞核。这个通过体内用FITC标记的反义分子体内处理之后上了环的动脉切片的荧光免疫获得，就像我们以前培养VSMC上进行的。如果相信反义分子并不充分地摄入细胞内，它们将在负载到迷你泵之前与转然试剂(Oligofectamine)形成复合物。已经确定反义核酸分布至血管壁的所有层饼定位于血管细胞胞浆和胞核。这个通过用FITC标记的反义分子体内治疗后上环动脉切片的荧光成像可以获得，就像我们以前在培养的VSMC中进行地。如果相信细胞摄入的反义分子不足，它们在负载到迷你泵前就与转染试剂(Oligofectamine)形成复合物。Oligofectamine促进Nox4反义分子进入小鼠VSMC的胞浆和胞核。然后进行优化实验以评估抑制上了环的动脉中Nox4表达所需要的反义分子的浓度。最初，检查了三个反义浓度的作用，所述浓度覆盖了已经显示对于体外抑制基因表达是有效的浓度范围[Drummond，澳大利亚健康和医学研究大会中，Melbourne，澳大利亚，335页，2002；Bengsston等人，澳大利亚健康和医学研究大会中Melbourne，澳大利亚，1203页，2002]。反义处理的上环动脉中Nox4mRNA的表达与其上游、未上环的片段以及对侧溶剂处理的上环动脉比较。然后终点测量以测定Nox4抑制的影响。为了保证寡核苷酸处理的任何作用是反义特异性的，同样的研究在兔上进行，其中一条上环动脉用拼凑的寡核苷酸处理。

                      实施例3

与gp91phox基因缺失相比靶向Nox4基因缺失对小鼠血管重塑和

                 动脉粥样硬化的影响

p47phox的靶向缺失减小了高血脂ApoE^-/-小鼠降主动脉的动脉粥样硬化损害区域[Barry-Lane等人，2001，同上]。既然p47phox是血管和噬菌细胞NADPH氧化酶异构体的基本亚基，仍然不清楚这些酶中的哪一个(以及哪个Nox亚基)在小鼠动脉粥样硬化的发展中是重要的。所以，靶向Nox4基因缺失对小鼠动脉粥样硬化的颈动脉接扎和ApoE敲除模型的作用与gp91phox比较。

使用下面小鼠模型：

gp91phox^-/-：最初通过129/SvJ x C57BL/6小鼠胚胎干细胞中gp91phox基因的靶向缺失之后同源重组创建这些小鼠的F1代[Pollock等人，自然遗传学9：202-209，1995]。小鼠再回过来与野生型C57BL/6系杂交共10代[Pollock等，1995，同上]。

Nox4^-/-：使用与用于gp91phox基因缺失相似的试验方案通过商业手段(Ozgene，WA)创建纯合子Nox4缺失小鼠(Nox4^-/-)[Pollock等人，1995，同上]。假设没有展示NADPH氧化酶活性的p47phox敲除小鼠是存活的[Barry-Lane等人，2001，同上]，Nox4基因的破坏不应当影响胚胎的存活。

使用下面的试验方案：

小鼠颈动脉接扎：对年龄配对的野生型、Nox4^-/-和gp91phox^-/-小鼠进行颈动脉接扎。四周后，处死小鼠，取出它们接扎的和假手术的颈动脉以测量Nox4和gp91phox mRNA(即时PCR)和蛋白质(Western blot试验)的表达。这些研究是必须的，因为它们不仅证实合适的基因受抑制还将提供基因缺失是否造成其它NADPH氧化酶亚基表达的补偿性增加。最后，测定分离自每个系的外周巨噬细胞中超氧化物的产生，以测定基因缺失对噬菌细胞NADPH氧化酶活性的影响。

Nox4敲除小鼠和颈动脉接扎也用于证实苏拉明对血管重塑任何有益的作用真的是选择性抑制血管含有Nox4的NADPH氧化酶的结果。这些研究中，用研究中找到的最有效剂量的苏拉明处理Nox4^-/-小鼠。如果苏拉明通过抑制Nox4起作用，除了已经在Nox4^-/-小鼠看到的作用外，应当观察不到这个药物对超氧化物产生、内皮功能和其他终点测量的进一步的作用。

ApoE^-/-小鼠：Nox4^-/-和gp91phox^-/-小鼠与纯合子ApoE^-/-小鼠杂交以产生两个双敲除系(即ApoE^-/-/Nox4^-/-和ApoE^-/-/gp91phox^-/-)。对于这些实验，未杂交的ApoE^-/-小鼠起对照组的作用。另外一组ApoE^-/-/Nox4^-/-小鼠包括在内，它们用苏拉明处理以证实这个药物对于动脉粥样化形成任何有益的作用是选择性抑制Nox4的结果。每个系的小鼠高脂肪饮食饲养共六个月，之后它们被处死并且取出它们的动脉以测量Nox4和gp91phox mRNA(即时PCR)和蛋白质(Westernblot试验)的表达。

在缺乏Nox4基因的小鼠降低的血管超氧化物的产生是期望的。相反，gp91phox的缺失对血管超氧化物的产生应当没有作用，但是将抑制噬菌细胞NADPH氧化酶的活性。所以，Nox4缺失的动物而不是gp91phox缺失的动物将显示导致血管重塑和动脉粥样硬化降低的更低水平的血管氧化剂应激。

                    实施例4

              Nox4对超氧化物产生的作用

这个实例研究了未刺激小鼠的VSMC中Nox4亚基对NADPH氧化酶依赖性超氧化物产生的作用。

小鼠

使用购于动物资源中心(澳大利亚)维持正常咀嚼饮食的十三周龄雄性C57BL6/J小鼠。对于所有的实验，小鼠在断头处死之前，被肝素化(250IU，i.p.)并且用Isoflo吸入麻醉剂(Abbot)进行麻醉。

VMSC培养

对于每个培养物，分离两个小鼠的胸动脉，在放置于消化培养基(即含有0.5mg/ml弹性蛋白酶、1.0mg/ml胶原酶和1.25mg/ml胰酶的DMEM)并在37℃孵育5分钟之前，清除粘附的脂肪和结缔组织。然后用细镊子剥落血管外膜层，消化培养液冲洗血管腔以冲下内皮细胞。剩下的中间平滑肌细胞管被切成环状片段(2-3mm)并转移到含有500μl消化培养基的微离心管中。在37℃孵育90分钟后，用P1000移液器吸头上下吸附VMSC使其分散，置于60mm培养皿中，皿中含有补充了10％v/v热失活的胎牛血清(FBS，CSL)、2mmol/L L-谷氨酸(CSL)、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素(CSL)的5mL DMEM。细胞在37℃5％v/v CO₂潮湿培养箱中培养，每周以1∶4的比例传代。4和20代之间的细胞用于实验。

反义核酸的设计和合成

在Gene Runnder软件(Hastings Software公司)的帮助下设计六个反义序列以互补于天然小鼠Nox4 mRNA(GenBank登陆号NM_015760)翻译起始密码子周围不同的位点(表6)。对于这些反义分子中的一个，也设计了+13/+33、拼凑的和错配的对照序列。拼凑的序列含有与反义分子相同的碱基组成但是顺序是随机的，而错配序列与反义序列有三个碱基位置不同(表6)。所有硫代磷酸酯化的寡核苷酸通过商业手段合成并且用聚丙烯酰胺凝胶纯化(SigmaGenosys)。

                          表6

                实时PCR的引物和探针的序列和浓度

基因(NCBI登陆号)	引物序列(浓度nmol/L)	探针序列(浓度nmol/L)	cDNA浓度
				Nox4(NM_015760)	Fwd：5′-TGTTGGGCCTAGGATTGTGTT(150)[SEQ IDNO：9]Rev  5′-AAAAGGATGAGGCTGCAGTTG(300)[SEQ IDNO：11]	5′-FAM-AAGCAGAGCATCTGCATCTGTCCTCAACC(200)[SEQ ID NO：10]	20ng
Nox1	Fwd：5′-TGGTCATGCAGCATTAAACTTTG(300)[SEQID NO：12Rev：5′-CATTGTCCCACATTGGTCTCC(300)[SEQ IDNO：13]	不适用	20ng
				18s	Fwd：5′-CGGCTACCACATCCAAGGAA(40)[SEQ  IDNO：14]Rev：5′-GCTGGAATTACCGCGGCT(80)[SEQ ID NO：16]	5′-VIC-TGCTGGCACCAGACTTGCCCTC-TAMRA(200)[SEQ ID NO：15]

反义转染

小鼠VSMC稀疏地接种于96孔ViewPlates(Packard Bioscience)(对于超氧化物的测量)或35mm培养皿(对于RNA提取)以至于它们在转染24小时后是30-50％融合的。在转染时，细胞用没有血清和抗生素的DMEM清洗，然后在含有8μL/mL Oligofectamine转染试剂(Invitrogen Life Technologies)复合于反义(0-1000nmol/L)、错配(500nmol/L)或混杂(500nmol/L)寡核苷酸的没有血清和抗生素的DMEM中孵育。在37℃孵育4小时后，加入等体积的含有10％v/v FBS的DMEM(即得到5％v/v的FBS终浓度)，在RNA提取前细胞在37℃孵育24小时或在测试超氧化物产生前孵育共72小时。

超氧化物的测量

用光泽精增强的化学发光测试小鼠VSMC中超氧化物的产生。为了检查药理试剂对超氧化物产生的作用，VSMC接种于96孔ViewPlate的孔中并允许生长至融合。测试超氧化物前24小时，常用的细胞培养基换成含有降低的FBS浓度(5％v/v)和L-谷氨酸和抗生素的DMEM。在一些实验中，这个培养基进一步地补充了NADPH氧化酶抑制剂罗布麻宁(10-1000μmol/L)或溶剂(DMSO 0.1％)。第二天，细胞培养基换成Krebs-Hepes预孵溶液，溶液中有DECTA(3mmol/L，Cu²⁺/Zn²⁺超氧化物歧化酶的抑制剂)和一个或多个下面的药物：NADPH(3-3000μmol/L；NADPH氧化酶的底物)；罗布麻宁(10-1000μmol/L)；DPI(0.03-1000nmol/L；黄素酶的抑制剂)。在37℃预孵育45分钟后，用200gl含有光泽精(5μmol/L)和合适的药物处理的Krebs-HEPES试验溶液替换预孵育溶液。在TopCount单光子计数器(Packard Bioscience)监测每孔每秒平均光子发射共20分钟。

细胞存活率

测量VSMC中超氧化物的产生后，按照生产厂商的说明书，用250μL Krebs-HEPES液清洗细胞，在100μL溶于Krebs-Hepes的20％CellTitler96(注册商标)AQ_ueous One Solution细胞增殖试验(Promega)中孵育3小时。测量490nm处上清液的吸光度评估细胞的存活率。

RNA提取

根据生产厂商的试验方案使用RNAwiz(Ambion)从培养的和新鲜分离的小鼠VSMC以及从新鲜分离的全部动脉提取RNA。用分光光度计法通过测量260nm处的吸光度测定RNA的浓度。

逆转录(RT)反应

根据生产厂商的试验方案使用TaqMan逆转录试剂(PE appliedBiosystems)逆转录RNA(100-500ng)。作为其后即时PCR中基因组DNA污染的对照，对于所有RNA样品，制备含有除逆转录酶外所有试剂的平行的RT反应混合物。

实时PCR

使用如前面描述的即时PCR和ΔΔCt方法检查相对于“参考”样品的Nox4和Nox1 mRNA的表达。[Paravicini等人，2002，同上；Winer等人，1999，同上]。使用引物表达软件(PE Biosystems)和已经公开的Nox4基因的小鼠同源物来设计Nox4的引物和5’-FAM标记的荧光探针(表7)。对于Nox1，在小鼠的序列没有描述的地方，基因的人和大鼠的同源物之间高度同源的区域被鉴别出来并用于设计引物，同样用引物表达软件(表7)。既然实时PCR中探针的结合不允许单个碱基的错配，在Nox1 PCR混合物中使用SYBR(注册商标)绿(PEBiosystems)代替标记的探针。18S核糖体RNA用作每个反应的内标并用市售的啮齿动物18S引物和5’-VIC标记探针(PE Biosystems；表7)进行检测。

Nox4在含有1x TaqMan(注册商标)、通用PCR总体试剂(master-mix)(PE Biosystems)、cDNA模板(5ng)和18S与Nox4的优化引物和探针浓度(表7)的PCR混合物(25μL终体积)中以与18S的双体形式扩增。N0x1的PCR混合物含有1x SYBR(注册商标)绿总体试剂(PE Biosystems)、cDNA模板(20ng)和优化引物浓度，终体积25μL。PCR热循环参数是50℃ 2分钟，95℃ 10分钟和40个循环的95℃ 30秒和60℃ 1分钟。在ABI Prism 7700序列检测器(PE Biosystems)中进行反应并监测荧光。

                      表7

       Nox4的反义、错配和拼凑寡核苷酸序列

Nox4	寡核苷酸序列
		+13/+33反义	TTGGCCAGCCAGCTCCTCCA[SEQ ID NO：17]
+13/+33错配	T AGGCCAGC AAGCTCCT ACA[SEQ ID NO：18]
		+13/+33拼凑	CGTCACGCTCAGCTCACCGT[SEQ ID NO：19]

统计分析

结果表示为n个独立实验的平均值±平均标准误差(SEM)。超氧化物的产生表示为每孔每秒的计数，标准化为细胞的存活率和未处理或溶剂处理对照的百分比。mRNA的量表示为相对于“参考”样品的倍数变化。通过单因子重复测量ANOVA之后是Tukey所有成对多重比较程序进行统计分析。差异在P＜0.05被认为是有统计显著性的。

小鼠VSMC中NADPH氧化酶的活性

在未刺激的小鼠培养的VSMC中几乎检测不到超氧化物的产生。然而，这些细胞与NADPH孵育，NADPH氧化酶优选的电子底物引起超氧化物的产生有浓度依赖性的增加(EC₅₀，5.0±0.6μmol/L；图5A)。黄素拮抗剂和被认为是NADPH氧化酶抑制剂的二苯基碘以浓度依赖性的方式抑制NADPH驱动的超氧化物的产生(IC₅₀，1±0.4μmol/L，图5B)。NADPH氧化酶结构不相关的抑制剂罗布麻宁在45分钟后对NADPH驱动的超氧化物的产生没有作用，但是在24小时后抑制这个反应大约50％(图5C)。共同地，这些数据提供了NADPH氧化酶存在于培养的小鼠VSMC有力的功能性证据。

Nox4在小鼠VSMC中表达

已经确立NADPH氧化酶存在于培养的小鼠VSMC，使用即时RT-PCR检查这些细胞中Nox4的表达。Nox4 mRNA似乎在培养的小鼠VSMC的RNA提取物中高度表达(ΔCt＝12.3±0.2；图6A)。重要地，相对于18S的Nox4表达的这个水平与全部动脉中(ΔCt＝12.2±0.5)和健康13周龄小鼠新鲜分离的VSMC中(ΔCt＝12.4±0.3)观察到的水平相似(图6B)。与Nox4相反，Nox1在培养的VSMC中或在新鲜分离的VSMC和全部动脉中不能检测到。注意这个后面的阴性发现不是由于引物无效，因为Nox1的表达在得自小鼠结肠的RNA中很容易检测到，已知小鼠结肠是表达高水平Nox1的组织。

Nox4反义核酸抑制了NADPH驱动的超氧化物的产生

为了直接评估Nox4在小鼠VSMC中NADPH氧化酶活性中的作用，采用了反义方法。测试了六个设计为结合于天然Nox4 mRNA翻译起始密码子周围不同位点的硫代磷酸酯反义分子。在筛选的六个反义分子中，一个序列+13/+33引起了显著的产生NADPH驱动的超氧化物45％的降低(n＝4)。这个作用进一步的特征分析证明了+13/+33反义核酸引起了NADPH驱动的超氧化物产生的时间和浓度依赖性的抑制(图7)。尽管一些抑制在12小时后才观察到，最大的作用在24小时后可以看到并且有1000nM的反义浓度。48小时后，在所有反义浓度抑制的程度显著削弱了，而在72小时，它完全消失。

为了排除上面的研究中+13/+33反义核酸非特异性作用的可能性，在第二系列的实验中，它对NADPH驱动的超氧化物产生的作用与错配和拼凑寡核苷酸序列的作用比较。虽然反义核酸再次引起显著的产生NADPH驱动的超氧化物41％的降低，错配或拼凑序列没有任何作用(图8)。

反义核酸对Nox4 mRNA的下调

为了确立Nox4反义处理之后观察到的NADPH驱动的超氧化物产生的抑制是否反映在分子水平，使用了即时PCR以检查反义核酸对Nox4 mRNA表达的影响。细胞与反义核酸孵育24小时后显示了Nox4mRNA表达65％的降低，而转染了错配或拼凑序列细胞中未观察到作用(图9)。Nox4反义核酸也似乎不引起Nox1 mRNA表达的补偿性增加。

这个实施例提供了Nox4是VSMC中产生超氧化物的NADPH氧化酶复合物关键组分的直接证据。发现Nox4在新鲜分离的和培养的小鼠VSMC中有高水平的表达，用序列特异性反义核酸下调Nox4mRNA表达显著地削弱了这些细胞中NADPH氧化酶的活性。

                    实施例5

                 动物模型和方法

兔动脉周围环模型：这个动脉疾病的兔模型12年前[Dusting等人，心血管药理杂志16：667-674，1990；Arthur等人，血管研究杂志31：187-194，1994；Dusting等人，美国心脏病学杂志76：24E-27E，1995；Arthur等人，动脉粥样硬化血栓形成和血管生物学17：737-740，1997；Yin和Dusting，临床和实验药理学和生理学24：436-438，1997；Yin等人，血管研究杂志35：156-164，1998；Gaspari等人，2000a，同上；Gaspari等人，临床和实验药理学和生理学27：653-655，2000b；Paravicini等人，2002，同上]。在中空硅胶环放置于普通颈动脉周围后，新生内膜增厚发生。这个模型的优点是(1)损害的形成发生在数天之内，(2)能够局部给予药物至血管损害的位点而没有全身作用。新生内膜损害显示了早期人动脉粥样化(atheroma)的许多特征，包括48小时内内皮ICAM-1、VCAM-1和MCP-1表达的上调，之后白细胞的渗透、胆固醇酯的蓄积以及胶原和纤维连接蛋白的沉积[Kock等人，动脉硬化和血栓形成12：144.7-14-57，1992；Kockx等人，动脉硬化和血栓形成13：1874-1884，1993]。新生内膜主要含有在横跨IEL迁移之前培养基中复制的VSMC[Kockx等人，1993，同上]。另外，上环的动脉发生了联想到人动脉粥样化的功能性变化，包括对5-羟色胺收缩作用的高敏感性[Dusting等人，1990，同上；Kockx等人，1992，同上]和对乙酰胆碱受损的松弛[Dusting等人，1990，同上；Arthur等人，1994，同上；De Meyer等人，心血管药理杂志29(12)：S205-207，1992；Yin等人，1998，同上；Gaspari等人，2000a，同上；Gaspari等人，2000b，同上；Paravicini等人，2002，同上]。重要地，发明者显示了上环动脉中NADPH氧化酶活性的增加并且这个造成了内皮功能障碍。

小鼠颈动脉接扎：这是一个广泛使用的动脉重塑小鼠模型，由此颈动脉近其分歧处的完全接扎短期内(数周)诱导新生内膜损伤[Kumar和Linder，动脉粥样硬化血栓形成和血管生物学17：2238-2244，1997]。作为小鼠模型，它也服从旨在确定特异性基因在动脉粥样硬化形成中的作用的研究。一个普通颈动脉的结扎造成血流的停止导致了近接扎处VSMC的增殖和富含VSMC的新生内膜的形成[Kumar和Linder，1997，同上]。早期局部炎症是明显的，有整个血管壁粘附分子表达的增加和白细胞的蓄积[McPherson等人，动脉粥样硬化血栓形成和血管生物学21：791-796，2001]。虽然已经很好地确立了在损伤发展的整个过程中内皮保持完整[Kumar和Linder，1997，同上]，但是没有研究调查了此模型中内皮功能或NADPH氧化酶的活性是否改变。

载脂蛋白E缺失小鼠：NADPH氧化酶是动脉粥样硬化的血管中过度超氧化物产生的主要来源[Drummond等人，2001，同上；Jiang等人，欧洲药理杂志4241-149，2001]。此外，这个造成了主动脉内皮依赖性血管松弛的失败，甚至当有最小脂肪性损伤的时候[Jiang等人，2001，同上]。当单核细胞附着于内皮并迁移到内皮下区域时，从五周龄开始损伤在动脉弓、颈、锁骨下、肠系膜、肾和回肠动脉的分支点以及冠状和肺动脉中发生[Breslow，科学272：685-688，1996]。在10-15周，脂肪条似乎由泡沫细胞和在通过IEL迁移到新生内膜前隔在中间层中的VSMC组成[Breslow，1996，同上]。20周时，损伤与由坏死核心和有弹性纤维和胶原蛋白包绕的VSMC的纤维帽组成的人纤维斑点相似[Breslow，1996，同上]。这个模型的主要优点是(1)表现了人动脉粥样硬化的大多数阶段，(2)高脂肪饮食能加速动脉粥样硬化，和(3)动脉片段显示了内皮功能障碍，其中过度NADPH氧化酶衍生的超氧化物是原因。

血管超氧化物和ROS的发光检测：如以前描述地[Paravicini等人，2002，同上；Dusting等人，1998，同上]，光泽精和发光氨(luminol)增强的化学发光分别被用作血管超氧化物的产生和总氧化剂应激的定量测量。光泽精是已经验证的检测血管组织中超氧化物的技术[Skatchkov等人，生物化学生物物理研究通讯254：319-324，1999]。另外，使用氮蓝四唑，暴露于5μM光泽精的VSMC产生的超氧化物信号不高于未暴露细胞中的信号。同样地，发光氨以前已经用于测量血管过亚硝酸盐和H₂O₂的形成[Laursen等人，循环103：1282-1288，2001]，因而本身是血管氧化剂应激方便的指示剂。用于光泽精试验的动脉环形片段在二乙基二硫代胺基甲酸酯(DETCA；3mM)中预孵育45分钟使内源性Cu²⁺/Zn²⁺超氧化物歧化酶失活。一些这些DETCA处理的动脉进一步地与NADPH(100μM)预孵育以确保NADPH氧化酶合适底物的可获得性。动脉片段将转移到含有光泽精(5μM)或发光氨(100μM)以及合适底物处理的不透明96孔板分开的孔中。使用单光子计数器测量每孔每秒的光子发射并标准化为干组织重量以解决血管大小的差异。

血管超氧化物和ROS的荧光检测：如以前描述地[Paravicini等人，2002，同上；Dusting等人，1998，同上；Tarpey和Fridovich，循环研究89：224-236，2001]，二氢乙啶(DHE)和还原的2’-7’-二氯荧光素二乙酸(DCFH-DA)分别用于证实发光的结果以及局限超氧化物的产生和氧化剂应激。血管片段(颈动脉和主动脉)冷冻于OCT中，切为20μm切片并放(mount)在明胶包被的载玻片上。在盖片和在黑暗中37℃孵育45分钟之前，切片用10μl DHE(2μM)或DCFH-DA(5μM)处理。然后切片被激发(对于DHE 568nm；对于DCFH-DA498nm)并使用共聚焦显微镜显现发射光(对于DHE 585nm；对于DCFH-DA 522nm)并成像。

噬菌细胞NADPH氧化酶的活性：小鼠处死前24小时腹腔注射硫乙醇酸盐(1mL 4％w/v溶液)以招募巨噬细胞至腹腔。处死的时候，通过灌洗收集这些细胞，并用光泽精增强的化学发光(光泽精)测量佛波酯刺激的超氧化物的产生(即噬菌细胞NADPH氧化酶的活性)[Kirk等人，动脉粥样硬化血栓形成和血管生物学20：1529-1535，2000]。

mRNA表达的实时PCR测量：如以前描述地[Paravicini等人，2002，同上；Dusting等人，1998，同上；Winer等人，生物化学分析270：41-49，1999]，使用即时PCR和ΔΔCT方法测量血管组织(颈动脉和主动脉)中mRNA的表达。用引物表达软件从每个基因的兔和小鼠同源物公开的mRNA序列来设计Nox4、gp91phox、ICAM-1、VCAM-1和MCP-1的引物和5’-FAM标记的荧光探针。使用市售的啮齿类18s引物和5’-VIC标记探针，将18s rRNA用作每个反应的内部标准。在含有Taqman通用PCR总体试剂、cDNA模板和优化浓度的引物和探针的PCR混合物中Nox4、gp91phox、ICAM-1、VCAM-1和MCP-1每一个以与18s的双体扩增。进行即时PCR并在ABI Prism 7700序列检测器中监测荧光。

Western blot试验：如以前描述地[Paravicini等人，2002，同上；Dusting等人，1998，同上；Winer等人，分析生物化学270：41-49，1999]，使用抗每个蛋白质的初级抗体(所有可以公开获得的)、结合于辣根过氧化酶的第二抗体和ECL检测系统，这个试验用于定量兔和小鼠动脉中Nox4、gp91phox、ICAM-1、VCAM-1和MCP-1的蛋白质的表达。

免疫染色：分别用小鼠单克隆抗ICAM-1(1∶200稀释)、抗VCAM-1(1∶200稀释)和抗MCP-1(1∶500稀释)的抗体免疫染色新鲜冷冻的动脉切片检查了ICAM-1、VCAM-1和MCP-1的定位和表达。生物素标记的山羊抗小鼠第二抗体(SantaCruz)和卵白素-辣根过氧化酶和作为颜色底物的3，3’-二氨基苄胺用于所有的染色。

VSMC增殖：动物安乐死前24小时和6小时接受两次皮下注射BrdU(兔30mg.Kg^-1，i.p.；小鼠0.1mg.kg^-1s.c.)[Kumar和Lindner，1997，同上]。取出动脉，OCT中瞬间冷冻并切成4μm的切片以放于明胶包被的载玻片上。用抗BrdU的小鼠单克隆抗体(1∶200稀释)染色血管来测定培养基和内膜中VSMC增殖的程度[Kumar和Lindner，1997，同上]。分别计数培养基和内膜中总的和染色的核的数量以允许计算每一层BrdU的标记指数[即(染色核/总核)×100]。

损伤大小定量如下：

兔颈动脉：如以前描述地[Dusting等，1990，同上；Arthur等人，1994，同上；Dusting等人，1995，同上；Arthur等人，1997，同上；Yin和Dusting，1997，同上；Yin等人，1998，同上；Gaspari等人，2000a，同上；Gaspari等人，2000b，同上；Paravicini等人，2002，同上]，从所有上环动脉的中心分离Imm环形片段，固定并放于载玻片上以允许新生内膜形成的定量分析[表示为内膜：培养基比例(IMR)]。

小鼠颈动脉接扎：小鼠安乐死后，用4％v/v多聚甲醛灌注固定。切割接扎的和假手术的颈动脉，乙醇中浸没固定并包埋于同一个石蜡块中。接扎的颈动脉从接扎线处开始朝着动脉弓切成4μm切片。标准化参考点设定在接扎线不扭曲血管的地方以及弹性层维持完整的地方(即从接扎线0.05mm和0.13mm之间)。使用MCID测量了从参考点起0.2、0.3和0.4mm处的交叉切片的IMR。

ApoE^-/-小鼠：分离全部动脉，经由沿着腹壁的切口切开[Jiang等人，2001，同上]。用60％v/v异丙醇淋洗组织并用红O油室温染色10分钟。染色后，组织在60％v/v异丙醇中淋洗并保存在10％v/v中性缓冲福尔马林中。使用MCID成像分析软件对动脉的正面(en face)成像并且定量分析损伤区域(红染色的)。

体外血管反应性研究：如以前描述地[Yin等人，1998，同上；Gaspari等人，2000a，同上；Gaspari等人，2000b，同上；Paravicini等人，2002，同上；Drummond等人，英国药理杂志129：811-819，2000]，这个用于定量分析主动脉和颈动脉环形片段(～3mm)中的NO生物利用度。兔颈动脉环设置于传统的器官水浴中，两个不锈钢丝钩(250μm)将其悬浮，一个连于等容力量传导器，另一个连于千分尺可调支持物。使用40μm不锈钢丝将小鼠颈动脉和主动脉片段悬浮于Mulvany-Halpern型肌动测定仪(myograph)。所有血管平衡20分钟，拉紧至最佳静止直径并用等渗125mM K+溶液(KPSSmax)使其最大收缩。为了消除前列环素和EDHF可能造成的血管松弛反应(即为了孤立NO介导的反应)，所有的环用吲哚美辛(3μM)、卡律蝎毒素(charybdotoxin)(10nM)和蜂毒明肽(100nM)处理。然后用U46619将环收缩至～50％KPSSmax，为了评价内皮血管舒张功能用增加浓度的乙酰胆碱使环松弛。为了证实Ach反应的不同是因为NO生物利用度的改变而不是受体密度/功能的改变，使环再收缩并且用Ca²⁺离子载体A23187第二次松弛。最后，用内皮非依赖性松弛剂异丙肾上腺素松弛环。

统计分析：在兔，上环动脉(药物和溶剂处理的)的终点测量表示为相对于相同动脉近非上环部分的相同测量。特定药物对这些测量指标的作用将经由Student’s成对t-test在动物内与溶剂比较。为了比较不同药物和浓度的效能，经由单因子ANOVA后Tukey Kramer检验在动物之间进行分析。同样地，在接扎模型中，接扎动脉的终点测量将表示为相对于对侧假手术动脉的相同测量。药物或反义核酸对这些测量的作用经由单因子ANOVA后Tukey Kramer检验回过去与溶剂处理的动物比较。最后，药物或靶向基因缺失对ApoE^-/-小鼠终点测量的作用也经由单因子ANOVA后Tukey Krame检验在动物之间进行比较。P＜0.05的数值认为是显著的。

动脉血压的测量：大鼠暂时麻醉(克他命80mg/kg i.p.加甲苯噻嗪10mg/kg i.p.)，注满生理盐水的插管插入股动脉。插管连于压力传导器和图表记录仪。当观察到动脉压稳定时(5分钟之内)，计算并记录平均动脉压。

血管紧张素II诱导的实验性高血压：在第0天，大鼠暂时麻醉(克他命80mg/kg i.p.加甲苯噻嗪10mg/kg i.p.)，皮下接种含有生理盐水或苏拉明的渗透性迷你泵。苏拉明的剂量速率是每14天300mg/kg。在第7天，大鼠再次麻醉，皮下接种另一个含有生理盐水或血管紧张素II的迷你泵。血管紧张素II的剂量速率是每7天5mg/kg。在第14天，每只大鼠再次麻醉，将插管插入股动脉以测量血压。血管紧张素II引起了对照大鼠平均动脉压(大约60-80mmHg)大大的增加。

蛛网膜下腔出血：在第0天，大鼠暂时麻醉(苯巴比妥50mg/kgip)，皮下接种含有生理盐水或苏拉明的渗透性迷你泵。苏拉明的剂量速率是每7天300mg/kg。在第5天，大鼠再次麻醉，从股动脉采血0.3ml并经由小脑延髓池注入大脑腹侧表面周围的脑脊液。在一些对照大鼠，将生理盐水注入脑脊液而不是动脉血。大鼠允许恢复两天，然后为了研究在第7天再次麻醉。

体内脑动脉反应的测量：大鼠用苯巴比妥(50mg/kg ip)麻醉，麻醉用追加的苯巴比妥(每小时10-20mg/kg iv)维持。使用头盖窗法手术暴露脑干腹侧表面的基底动脉。使用基于计算机的成像追踪装置连续测量基底动脉的直径。内皮依赖性血管舒张剂乙酰胆碱以稳定的浓度1微摩尔倾注于基底动脉上共3-5分钟，测量直径的增加。然后乙酰胆碱的浓度增加到10，然后以相同的方式到100微摩尔，记录直径的增加。最后，通过测量对100微摩尔硝普钠加上10微摩尔尼莫地平的联合的反应来记录动脉的最大直径容量。对乙酰胆碱的反应表示为这个最大反应的百分比。受损的内皮功能，例如在实验性蛛网膜下腔出血之后，将通过与对照动物的反应相比对乙酰胆碱有更弱的血管舒张反应而证实。

                      实施例6

慢性苏拉明治疗对脂肪饲养的ApoE突变小鼠动脉中动脉粥样硬

              化损伤形成的抑制作用

12周龄ApoE突变小鼠再喂饲高脂肪饮食共4个月。这4个月期间，小鼠每周皮下注射给予生理盐水或苏拉明。具体地，小鼠最初每周注射300mg/kg苏拉明共两次。四周后，给予25mg/kg剂量的苏拉明，然后再每周给于15mg/kg剂量的苏拉明共11周。在治疗期的最后，小鼠过量麻醉处死，取出动脉，清除血管外膜表面上粘附的脂肪，沿着全长纵向切割。用红O油染色动脉粥样硬化损伤，福尔马林中固定血管。主动脉正面(en face)成像，对于总动脉、胸动脉、腹动脉和主动脉弓，定量分析每一个的损伤面积(红染的)并表示为总腔表面积的百分比。发现结果指出与生理盐水治疗的对照小鼠的血管相比苏拉明治疗的小鼠动脉含有明显更小的损伤区域(无论认为是总动脉、胸动脉或腹动脉)。因此，苏拉明对含有Nox4的NADPH氧化酶的慢性抑制抑制了动脉粥样硬化损伤的形成。

                       实施例7

慢性苏拉明治疗对大鼠体内蛛网膜下腔出血后乙酰胆碱诱导的基

                底动脉舒张反应的保护作用

在第0天，大鼠暂时麻醉，皮下接种含有生理盐水或苏拉明的渗透性迷你泵。苏拉明的剂量速率是每7天300mg/kg。在第5天，大鼠再次麻醉，从股动脉采血0.3ml并经由小脑延髓池注射进大脑腹侧表面周围的脑脊液。在一些大鼠，将生理盐水注入脑脊液而不是动脉血。大鼠允许恢复两天，然后在第7天再次麻醉。使用头盖窗法手术暴露脑干腹侧表面的基底动脉。使用基于计算机的成像追踪装置连续测量基底动脉的直径。乙酰胆碱以稳定的浓度1微摩尔倾注于基底动脉上共3-5分钟，测量直径的增加。然后乙酰胆碱的浓度增加到10，然后以相同的方式增加到100微摩尔，并记录直径的增加。最后，测量对100微摩尔硝普钠加上10微摩尔尼莫地平的联合的反应来记录动脉的最大直径容量。对乙酰胆碱的反应表示为这个最大反应的百分比。对浓度-反应曲线作图并统计比较。发现与只在第0和5天接受生理盐水的大鼠的反应相比，生理盐水预处理并经受蛛网膜下腔出血的动物对乙酰胆碱的反应基本上降低。重要地，苏拉明预处理的动物在蛛网膜下腔出血后对乙酰胆碱的反应没有受损。所以，苏拉明对含有Nox4的NADPH氧化酶的慢性抑制阻止了蛛网膜下腔出血后脑动脉内皮功能的损伤。

                        实施例8

慢性苏拉明治疗对蛛网膜下腔出血后体外大鼠基底动脉产生

            NADPH诱导的超氧化物的抑制作用

在第0天，大鼠暂时麻醉，皮下接种含有生理盐水或苏拉明的渗透性迷你泵。苏拉明的剂量速率是每7天30或300mg/kg。在第5天，大鼠再次麻醉，从股动脉采血0.3ml并经由小脑延髓池注射进大脑腹侧表面周围的脑脊液。在一些大鼠，将生理盐水注射进脑脊液而不是动脉血。大鼠再允许恢复两天，然后在第7天过量麻醉处死。

取出大脑，分离基底动脉，然后与5微摩尔光泽精、100微摩尔NADPH和3毫摩尔二乙基二硫代氨基甲酸孵育。使用光泽精增强的化学发光来测量超氧化物的产生。发现在接种了含有生理盐水的迷你泵的大鼠，血液注射进脑脊液导致基底动脉产生更高的超氧化物。相反，任一剂量的苏拉明预处理大鼠的基底动脉产生的超氧化物与非手术对照大鼠测量的水平没有不同。

相应地，苏拉明对含有Nox4的NADPH氧化酶的慢性抑制阻止了蛛网膜下腔出血后脑动脉过度超氧化物的产生。

                  实施例9

慢性苏拉明治疗对血管紧张素II灌注造成的高血压的抑制作用

在第0天，大鼠暂时麻醉，皮下接种含有生理盐水或苏拉明的渗透性迷你泵。苏拉明的剂量速率是每14天300mg/kg。在第7天，大鼠再次麻醉，皮下接种另一个含有生理盐水或血管紧张素II的迷你泵。血管紧张素II的剂量速率是每7天5mg/kg。在第14天，每个大鼠再次麻醉，将插管插入股动脉以测量血压。血管紧张素II引起生理盐水预处理的大鼠的血压大大的升高。相反，在苏拉明预处理的大鼠血管紧张素II引起的血压的增加被抑制了大约60％。

相应地，苏拉明对含有Nox4的NADPH氧化酶的慢性抑制抑制了血管紧张素II引起的高血压。

                        实施例10

             跨膜区域的预言和膜外区域的拓朴结构

这个实例利用PSORT软件(http://psort.nibb.ac.jp/)基于小鼠Nox4的氨基酸序列(Genebank登陆号NP 056575)预言其跨膜结构域和拓朴结构。这个实例显示Nox4的NADPH结合位点位于细胞外。

蛋白质分选信号和定位位点(PSORT)软件程序用于预言含有NADPH结合裂口的gp91phox和Nox4羧基尾端的拓朴结构(Lambeth等人，生化科学趋向，25：459-61，2000)。从NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/)获得NADPH氧化酶亚基gp91phox(Genebank登陆号AAB05997)和Nox4(Genebank登陆号NP 056575)的小鼠同源物的氨基酸序列。

发现Nox4具有5个预言是跨膜结构域的疏水区域(表8；图11A)。PSORT也不能够检测Nox4上任何氨基末端信号肽。另外，基于规定了第一个跨膜结构域更加阳性的末端(氨基或羧基末端)几乎总是位于细胞浆侧的“阳性在内准则”(Hartman等人，美国国立科学院进展86：5786-90，1989)，Nox4的氨基末端被预言在细胞内而羧基尾端悬挂于细胞外(图11A)。预言Nox4的NADPH结合位点位于氨基酸位置425-442、459-468、515-534和541-552(Lambeth同上)。这将大部分NADPH结合位点放置于第5个跨膜结构域之外的羧基尾端，因而提示它位于细胞外(图11C)。为了比较，我们也分析了预言也具有5个跨膜结构域的小鼠gp91phox的膜拓朴结构(表8；图11B)。然而，不象Nox4，含有NADPH结合位点的gp91phox的羧基尾端(氨基酸位置403-420、441-450、505-514和531-5421)被预言在细胞内(图11C)。

该实例中实验略述了并且其他实例提供了证据证明Nox4的NADPH结合位点位于浆膜的细胞外侧。使用PSORT软件的拓朴结构的预言指出Nox4的NADPH结合位点位于细胞外。PSORT预言Nox4含有代表了第一个跨膜结构域的不可切割的信号锚定序列。基于“阳性在内准则”(Hartmann同上)，预言比第一个跨膜结构域的羧基侧带更多正电荷的其氨基侧在细胞内。假设PSORT也预言Nox4具有一共5个跨膜生成区域。相反，第一个跨膜结构域的羧基侧比氨基侧带有更多正电荷的gp91phox被预言其氨基末端在细胞外。因而，含有NADPH结合位点的gp91phox的羧基末端预言有5个跨膜区域，应当在细胞内。gp91phox细胞内NADPH结合位点解释了为什么苏拉明和反应蓝2对于抑制完整J774小鼠巨噬细胞中NADPH氧化酶是无效的。

表8.PSORT对Nox4和gp91phox催化亚基上跨膜结构域的预言

跨膜结构域	1氨基酸位置Nox4	Gp91phox
			12345	14-30106-122159-175196-212425-441	11-2756-72174-190212-228403-419

                   实施例11

   苏拉明不穿透小鼠血管平滑肌细胞浆膜的证明

以前在60mm直径的培养皿中在补充了10％v/v肽牛血清的Dulbecco’s Modified Eagles培养基(DMEM)生长至融合的小鼠血管平滑肌细胞(VSMC)胰酶消化并以1∶4的比例接种于含有Thermanox(注册商标)(Nune，II，USA)的60mm培养皿或明胶包被的玻璃组织培养盖玻片。允许VSMC生长3天(即直到它们大约50％融合)。细胞用Krebs-Hepes缓冲液清洗一次以去除所有残量的酚红(存在于DMEM中)，然后在相同的缓冲液中在37℃孵育～2小时。接着，用苏拉明(100μM)处理VSMC共45分钟，因为这个浓度和孵育时间足够取消VSMC中NADPH驱动的超氧化物的产生(例如见图2A)。然后从培养皿中取出含有盖玻片的细胞并以倒置的位置置于显微镜载玻片上。为了保持细胞潮湿，在盖上玻片之前加入一滴20μl含有苏拉明(100μM)的Krebs-Hepes到载玻片上。然后载玻片置于偶联于UV激光的共聚焦显微镜或偶联于水银灯的荧光显微镜的平台上。苏拉明的内在荧光特性被用来显现它在VSMC制备物中的腔室分布(compartmentalisation)。用光波长315或330nm激发苏拉明并且在350-450nm的范围内测量发射光(Fleck等人，生物化学杂志278：47670-77，2000)。VSMC从头至尾平面(Z)成像证实强烈的荧光在浆膜周围，指出苏拉明结合于细胞外结合位点，假设是Nox4。每个细胞周围“阴暗的发光”(即在水浴溶液中的苏拉明)指出细胞外的位置。相反，缺乏“阴暗的发光”和任何强烈荧光点细胞的胞内腔室指出苏拉明未能获得足够的细胞内穿透以显著地与任何细胞内结合位点相互作用。

本领域的技术人员将理解此处描述的本发明容许除具体描述的那些以外的改变和修饰。本发明包括所有这样的改变和修饰是可以理解的。本发明也包括该详述提到的或指出的所有步骤、特性、组合物和化合物的任何一个或全部，以及任何两个或两个以上所述步骤或特性的任何和所有的联合。

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                           序列表

<110>Howard Florey实验生理和药物研究所

     DUSTING，Gregory James(仅对美国)

     DRUMMOND，Grant Raymond(仅对美国)

     SOBEY，Christopher Graeme(仅对美国)

<120>治疗性组合物

<130>12414670/EJH

<150>US 60/450,892

<151>2003-02-28

<160>19

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2220

<212>DNA

<213>人

<400>1

ccgcacaact gtaaccgctg ccccggccgc cgcccgctcc ttctcgggcc ggcgggcaca     60

gagcgcagcg cggcggggcc ggcggcatgg ctgtgtcctg gaggagctgg ctcgccaacg    120

aaggggttaa acacctctgc ctgttcatct ggctctccat gaatgtcctg cttttctgga    180

aaaccttctt gctgtataac caagggccag agtatcacta cctccaccag atgttggggc    240

taggattgtg tctaagcaga gcctcagcat ctgttcttaa cctcaactgc agccttatcc    300

ttttacccat gtgccgaaca ctcttggctt acctccgagg atcacagaag gttccaagca    360

ggagaaccag gagattgttg gataaaagca gaacattcca tattacctgt ggtgttacta    420

tctgtatttt ctcaggcgtg catgtggctg cccatctggt gaatgccctc aacttctcag    480

tgaattacag tgaagacttt gttgaactga atgcagcaag ataccgagat gaggatccta    540

gaaaacttct cttcacaact gttcctggcc tgacaggggt ctgcatggtg gtggtgctat    600

tcctcatgat cacagcctct acatatgcaa taagagtttc taactatgat atcttctggt    660

atactcataa cctcttcttt gtcttctaca tgctgctgac gttgcatgtt tcaggagggc    720

tgctgaagta tcaaactaat ttagataccc accctcccgg ctgcatcagt cttaaccgaa    780

ccagctctca gaatatttcc ttaccagagt atttctcaga acattttcat gaacctttcc    840

ctgaaggatt ttcaaaaccg gcagagttta cccagcacaa atttgtgaag atttgtatgg    900

aagagcccag attccaagct aattttccac agacttggct ttggatttct ggacctttgt    960

gcctgtactg tgccgaaaga ctttacaggt atatccggag caataagcca gtcaccatca   1020

tttcggtcat aagtcatccc tcagatgtca tggaaatccg aatggtcaaa gaaaatttta   1080

aagcaagacc tggtcagtat attactctac attgtcccag tgtatctgca ttagaaaatc   1140

atccatttac cctcacaatg tgtccaactg aaaccaaagc aacatttggg gttcatctta   1200

aaatagtagg agactggaca gaacgatttc gagatttact actgcctcca tctagtcaag   1260

actccgaaat tctgcccttc attcaatcta gaaattatcc caagctgtat attgatggtc   1320

cttttggaag tccatttgag gaatcactga actatgaggt cagcctctgc gtggctggag   1380

gcattggagt aactccattt gcatcaatac tcaacaccct gttggatgac tggaaaccat   1440

acaagcttag aagactatac tttatttggg tatgcagaga tatccagtcc ttccgttggt   1500

ttgcagattt actctgtatg ttgcataaca agttttggca agagaacaga cctgactatg   1560

tcaacatcca gctgtacctc agtcaaacag atgggataca gaagataatt ggagaaaaat   1620

atcatgcact gaattcaaga ctgtttatag gacgtcctcg gtggaaactt ttgtttgatg   1680

aaatagcaaa atataacaga ggaaaaacag ttggtgtttt ctgttgtgga cccaattcac   1740

tatccaagac tcttcataaa ctgagtaacc agaacaactc atatgggaca agatttgaat   1800

acaataaaga gtctttcagc tgaaaacttt tgccatgaag caggactcta aagaaggaat   1860

gagtgcaatt tctaagactt tgaaactcag cggaatcaat cagctgtgtt atgccaaaga   1920

atagtaaggt tttcttattt atgattattt gaaaatggaa atgtgagaat gtggcaacat   1980

gaccgtcaca ttacatgttt aatctggaaa ccaaagagac cctgaagaat atttgatgtg   2040

atgattcatt ttcagttctc aaattaaaag aaaactgtta gatgcacact gttgattttc   2100

atggtggatt caagaactcc ctagtgagga gctgaacttg ctcaatctaa ggctgattgt   2160

cgtgttcctc tttaaattgt ttttggttga acaaatgcaa gattgaacaa aattaaaaat   2220

<210>2

<211>578

<212>PRT

<213>人

<400>2

Met Ala Val Ser Trp Arg Ser Trp Leu Ala Asn Glu Gly Val Lys His

1               5                   10                  15

Leu Cys Leu Phe Ile Trp Leu Ser Met Asn Val Leu Leu Phe Trp Lys

            20                  25                  30

Thr Phe Leu Leu Tyr Asn Gln Gly Pro Glu Tyr His Tyr Leu His Gln

        35                  40                  45

Met Leu Gly Leu Gly Leu Cys Leu Ser Arg Ala Ser Ala Ser Val Leu

    50                  55                  60

Asn Leu Asn Cys Ser Leu Ile Leu Leu Pro Met Cys Arg Thr Leu Leu

65                  70                  75                  80

Ala Tyr Leu Arg Gly Ser Gln Lys Val Pro Ser Arg Arg Thr Arg Arg

                85                  90                  95

Leu Leu Asp Lys Ser Arg Thr Phe His Ile Thr Cys Gly Val Thr Ile

            100                 105                 110

Cys Ile Phe Ser Gly Val His Val Ala Ala His Leu Val Asn Ala Leu

        115                 120                 125

Asn Phe Ser Val Asn Tyr Ser Glu Asp Phe Val Glu Leu Asn Ala Ala

    130                 135                 140

Arg Tyr Arg Asp Glu Asp Pro Arg Lys Leu Leu Phe Thr Thr Val Pro

145                 150                 155                 160

Gly Leu Thr Gly Val Cys Met Val Val Val Leu Phe Leu Met Ile Thr

                165                 170                 175

Ala Ser Thr Tyr Ala Ile Arg Val Ser Asn Tyr Asp Ile Phe Trp Tyr

            180                 185                 190

Thr His Asn Leu Phe Phe Val Phe Tyr Met Leu Leu Thr Leu His Val

        195                 200                 205

Ser Gly Gly Leu Leu Lys Tyr Gln Thr Asn Leu Asp Thr His Pro Pro

    210                 215                 220

Gly Cys Ile Ser Leu Asn Arg Thr Ser Ser Gln Asn Ile Ser Leu Pro

225                 230                 235                 240

Glu Tyr Phe Ser Glu His Phe His Glu Pro Phe Pro Glu Gly Phe Ser

                245                 250                 255

Lys Pro Ala Glu Phe Thr Gln His Lys Phe Val Lys Ile Cys Met Glu

            260                 265                 270

Glu Pro Arg Phe Gln Ala Asn Phe Pro Gln Thr Trp Leu Trp Ile Ser

        275                 280                 285

Gly Pro Leu Cys Leu Tyr Cys Ala Glu Arg Leu Tyr Arg Tyr Ile Arg

    290                 295                 300

Ser Asn Lys Pro Val Thr Ile Ile Ser Val Ile Ser His Pro Ser Asp

305                 310                 315                 320

Val Met Glu Ile Arg Met Val Lys Glu Asn Phe Lys Ala Arg Pro Gly

                325                 330                 335

Gln Tyr Ile Thr Leu His Cys Pro Ser Val Ser Ala Leu Glu Asn His

            340                 345                 350

Pro Phe Thr Leu Thr Met Cys Pro Thr Glu Thr Lys Ala Thr Phe Gly

        355                 360                 365

Val His Leu Lys Ile Val Gly Asp Trp Thr Glu Arg Phe Arg Asp Leu

    370                 375                 380

Leu Leu Pro Pro Ser Ser Gln Asp Ser Glu Ile Leu Pro Phe Ile Gln

385                 390                 395                 400

Ser Arg Asn Tyr Pro Lys Leu Tyr Ile Asp Gly Pro Phe Gly Ser Pro

                405                 410                 415

Phe Glu Glu Ser Leu Asn Tyr Glu Val Ser Leu Cys Val Ala Gly Gly

            420                 425                 430

Ile Gly Val Thr Pro Phe Ala Ser Ile Leu Asn Thr Leu Leu Asp Asp

        435                 440                 445

Trp Lys Pro Tyr Lys Leu Arg Arg Leu Tyr Phe Ile Trp Val Cys Arg

    450                 455                 460

Asp Ile Gln Ser Phe Arg Trp Phe Ala Asp Leu Leu Cys Met Leu His

465                 470                 475                 480

Asn Lys Phe Trp Gln Glu Asn Arg Pro Asp Tyr Val Asn Ile Gln Leu

                485                 490                 495

Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ile Gln Lys Ile Ile Gly Glu Lys Tyr

            500                 505                 510

His Ala Leu Asn Ser Arg Leu Phe Ile Gly Arg Pro Arg Trp Lys Leu

        515                 520                 525

Leu Phe Asp Glu Ile Ala Lys Tyr Asn Arg Gly Lys Thr Val Gly Val

    530                 535                 540

Phe Cys Cys Gly Pro Asn Ser Leu Ser Lys Thr Leu His Lys Leu Ser

545                 550                 555                 560

Asn Gln Asn Asn Ser Tyr Gly Thr Arg Phe Glu Tyr Asn Lys Glu Ser

                565                 570                 575

Phe Ser

<210>3

<211>1893

<212>DNA

<213>小鼠

<400>3

ttcggtcctg agcaccgagc agggcgcagc actccccgcg ccggcggcat ggcggtgtcc     60

tggaggagct ggctggccaa cgaaggggtt aaacacctct gcctgctcat ttggctgtcc    120

ctaaacgttc tacttttctg gaaaaccttc ctgctgtaca accaagggcc agaatactac    180

tacattcacc aaatgttggg cctaggattg tgtttaagca gagcatctgc atctgtcctg    240

aacctcaact gcagcctcat ccttttacct atgtgccgga cagtcctggc ttatcttcga    300

ggatcacaga aggtccctag caggagaaca agaagattgt tggataaaag caagactcta    360

cacatcacat gtggtgtaac tatctgtatt ttctcaggtg tgcatgtagc cgcccacttg    420

gtgaatgccc tcaacttttc agtgaactac agtgaagatt tccttgaact gaatgcagca    480

agataccaga atgaggatcc cagaaagctt ctcttcacaa ccattcctgg tctgacgggt    540

gtctgcatgg tggtggtatt gttcctcatg gttacagctt ctacctacgc aataagagtt    600

tctaattatg atatcttctg gtatactcac aacctcttct ttgtcttcta catgctgctg    660

ctgttgcatg tttcaggtgg tttgttgaag tatcagacaa atgtagacac tcaccctcct    720

ggctgcatta gtcttaacca gacatcatcc cagaatatgt ccataccaga ctacgtctca    780

gaacattttc atggatcttt gcctcgaggg ttttcaaaat tagaagatcg ttaccagaaa    840

acacttgtga agatttgcct ggaagaaccc aagttccaag ctcatttccc acagacctgg    900

atttggattt ctggaccttt gtgcctttat tgtgcggaga gactttaccg atgcatcagg    960

agcaacaaac ctgtcaccat catctcagtc atcaatcatc cctctgatgt aatggaactc   1020

cgtatgatca aagaaaactt taaagcaaga cctggtcagt atattattct ccattgcccc   1080

agtgtatcag cattagaaaa ccacccattt actctcacaa tgtgtcctac tgaaaccaaa   1140

gcaacatttg gtgtccactt taaagtagta ggagactgga cagaacgatt ccgggatttg   1200

ctactgcctc catcaagtca agactctgag attctaccct tcattcactc tagaaattac   1260

cctaagttat acattgatgg tccatttgga agcccatttg aggagtcact gaactatgaa   1320

gttagtctct gtgtggctgg aggcattgga gtcactccat ttgcatcgat actaaacact   1380

ctactggatg actggaaacc atacaagtta agaagactgt actttatctg ggtgtgcaga   1440

gacatccaat cattccagtg gtttgcagat ttactctgtg tgttgcataa caagttttgg   1500

caagaaaaca gacctgactt tgtgaacatc cagctgtacc tcagtcaaac agatgggatt   1560

cagaagataa ttggagaaaa atatcacaca ctgaattcga gacttttcat tgggcgtcct   1620

cggtggaaac ttttatttga tgaaatagca aaatgtaaca gagggaaaac agttggagtt   1680

ttctgctgtg gacccagttc tatttccaag actcttcata gtttgagtaa ccggaacaac   1740

tcatatggga caaaatttga atacaataaa gaatccttca gctgaaacct taggagacta   1800

ctggggactt taaagaggaa caagtgcaat ttctaagact tagagactca gctgaatcaa   1860

acagctgtgc tatgccaaag aataccaagg gtt                                1893

<210>4

<211>578

<212>PRT

<213>小鼠

<400>4

Met Ala Val Ser Trp Arg Ser Trp Leu Ala Asn Glu Gly Val Lys His

1               5                   10                  15

Leu Cys Leu Leu Ile Trp Leu Ser Leu Asn Val Leu Leu Phe Trp Lys

            20                  25                  30

Thr Phe Leu Leu Tyr Asn Gln Gly Pro Glu Tyr Tyr Tyr Ile His Gln

        35                  40                  45

Met Leu Gly Leu Gly Leu Cys Leu Ser Arg Ala Ser Ala Ser Val Leu

    50                  55                  6O

Asn Leu Asn Cys Ser Leu Ile Leu Leu Pro Met Cys Arg Thr Val Leu

65                  70                  75                  80

Ala Tyr Leu Arg Gly Ser Gln Lys Val Pro Ser Arg Arg Thr Arg Arg

                85                  90                  95

Leu Leu Asp Lys Ser Lys Thr Leu His Ile Thr Cys Gly Val Thr Ile

            100                 105                 110

Cys Ile Phe Ser Gly Val His Val Ala Ala His Leu Val Asn Ala Leu

        115                 120                 125

Asn Phe Ser Val Asn Tyr Ser Glu Asp Phe Leu Glu Leu Asn Ala Ala

    130                 135                 140

Arg Tyr Gln Asn Glu Asp Pro Arg Lys Leu Leu Phe Thr Thr Ile Pro

145                 150                 155                 160

Gly Leu Thr Gly Val Cys Met Val Val Val Leu Phe Leu Met Val Thr

                165                 170                 175

Ala Ser Thr Tyr Ala Ile Arg Val Ser Asn Tyr Asp Ile Phe Trp Tyr

            180                 185                 190

Thr His Asn Leu Phe Phe Val Phe Tyr Met Leu Leu Leu Leu His Val

        195                 200                 205

Ser Gly Gly Leu Leu Lys Tyr Gln Thr Asn Val Asp Thr His Pro Pro

    210                 215                 220

Gly Cys Ile Ser Leu Asn Gln Thr Ser Ser Gln Asn Met Ser Ile Pro

225                 230                 235                 240

Asp Tyr Val Ser Glu His Phe His Gly Ser Leu Pro Arg Gly Phe Ser

                245                 250                 255

Lys Leu Glu Asp Arg Tyr Gln Lys Thr Leu Val Lys Ile Cys Leu Glu

            260                 265                 270

Glu Pro Lys Phe Gln Ala His Phe Pro Gln Thr Trp Ile Trp Ile Ser

        275                 280                 285

Gly Pro Leu Cys Leu Tyr Cys Ala Glu Arg Leu Tyr Arg Cys Ile Arg

    290                 295                 300

Ser Asn Lys Pro Val Thr Ile Ile Ser Val Ile Asn His Pro Ser Asp

305                 310                 315                 320

Val Met Glu Leu Arg Met Ile Lys Glu Asn Phe Lys Ala Arg Pro Gly

                325                 330                 335

Gln Tyr Ile Ile Leu His Cys Pro Ser Val Ser Ala Leu Glu Asn His

            340                 345                 350

Pro Phe Thr Leu Thr Met Cys Pro Thr Glu Thr Lys Ala Thr Phe Gly

        355                 360                 365

Val His Phe Lys Val Val Gly Asp Trp Thr Glu Arg Phe Arg Asp Leu

    370                 375                 380

Leu Leu Pro Pro Ser Ser Gln Asp Ser Glu Ile Leu Pro Phe Ile His

385                 390                 395                 400

Ser Arg Asn Tyr Pro Lys Leu Tyr Ile Asp Gly Pro Phe Gly Ser Pro

                405                 410                 415

Phe Glu Glu Ser Leu Asn Tyr Glu Val Ser Leu Cys Val Ala Gly Gly

            420                 425                 430

Ile Gly Val Thr Pro Phe Ala Ser Ile Leu Asn Thr Leu Leu Asp Asp

        435                 440                 445

Trp Lys Pro Tyr Lys Leu Arg Arg Leu Tyr Phe Ile Trp Val Cys Arg

    450                 455                 460

Asp Ile Gln Ser Phe Gln Trp Phe Ala Asp Leu Leu Cys Val Leu His

465                 470                 475                 480

Asn Lys Phe Trp Gln Glu Asn Arg Pro Asp Phe Val Asn Ile Gln Leu

                485                 490                 495

Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ile Gln Lys Ile Ile Gly Glu Lys Tyr

            500                 505                 510

His Thr Leu Asn Ser Arg Leu Phe Ile Gly Arg Pro Arg Trp Lys Leu

        515                 520                 525

Leu Phe Asp Glu Ile Ala Lys Cys Asn Arg Gly Lys Thr Val Gly Val

    530                 535                 540

Phe Cys Cys Gly Pro Ser Ser Ile Ser Lys Thr Leu His Ser Leu Ser

545                 550                 555                 560

Asn Arg Asn Asn Ser Tyr Gly Thr Lys Phe Glu Tyr Asn Lys Glu Ser

                565                 570                 575

Phe Ser

<210>5

<211>462

<212>DNA

<213>人

<400>5

gtcagcctct gcgtggctgg aggcattgga gtaactccat ttgcatcaat actcaacacc     60

ctgttggatg actggaaacc atacaagctt agaagactat actttatttg ggtatgcaga    120

gatatccagt ccttccgttg gtttgcagat ttactctgta tgttgcataa caagttttgg    180

caagagaaca gacctgacta tgtcaacatc cagctgtacc tcagtcaaac agatgggata    240

cagaagataa ttggagaaaa atatcatgca ctgaattcaa gactgtttat aggacgtcct    300

cggtggaaac ttttgtttga tgaaatagca aaatataaca gaggaaaaac agttggtgtt    360

ttctgttgtg gacccaattc actatccaag actcttcata aactgagtaa ccagaacaac    420

tcatatggga caagatttga atacaataaa gagtctttca gc                       462

<210>6

<211>154

<212>PRT

<213>人

<400>6

Val Ser Leu Cys Val Ala Gly Gly Ile Gly Val Thr Pro Phe Ala Ser

1               5                   10                  15

Ile Leu Asn Thr Leu Leu Asp Asp Trp Lys Pro Tyr Lys Leu Arg Arg

            20                  25                  30

Leu Tyr Phe Ile Trp Val Cys Arg Asp Ile Gln Ser Phe Arg Trp Phe

        35                  40                  45

Ala Asp Leu Leu Cys Met Leu His Asn Lys Phe Trp Gln Glu Asn Arg

    50                  55                  60

Pro Asp Tyr Val Asn Ile Gln Leu Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ile

65                  70                  75                  80

Gln Lys Ile Ile Gly Glu Lys Tyr His Ala Leu Asn Ser Arg Leu Phe

                85                  90                  95

Ile Gly Arg Pro Arg Trp Lys Leu Leu Phe Asp Glu Ile Ala Lys Tyr

            100                 105                 110

Asn Arg Gly Lys Thr Val Gly Val Phe Cys Cys Gly Pro Asn Ser Leu

        115                 120                 125

Ser Lys Thr Leu His Lys Leu Ser Asn Gln Asn Asn Ser Tyr Gly Thr

    130                 135                 140

Arg Phe Glu Tyr Asn Lys Glu Ser Phe Ser

145                 150

<210>7

<211>462

<212>DNA

<213>小鼠

<400>7

gttagtctct gtgtggctgg aggcattgga gtcactccat ttgcatcgat actaaacact     60

ctactggatg actggaaacc atacaagtta agaagactgt actttatctg ggtgtgcaga    120

gacatccaat cattccagtg gtttgcagat ttactctgtg tgttgcataa caagttttgg    180

caagaaaaca gacctgactt tgtgaacatc cagctgtacc tcagtcaaac agatgggatt    240

cagaagataa ttggagaaaa atatcacaca ctgaattcga gacttttcat tgggcgtcct    300

cggtggaaac ttttatttga tgaaatagca aaatgtaaca gagggaaaac agttggagtt    360

ttctgctgtg gacccagttc tatttccaag actcttcata gtttgagtaa ccggaacaac    420

tcatatggga caaaatttga atacaataaa gaatccttca gc                      462

<210>8

<211>154

<212>PRT

<213>小鼠

<400>8

Val Ser Leu Cys Val Ala Gly Gly Ile Gly Val Thr Pro Phe Ala Ser

1               5                   10                  15

Ile Leu Asn Thr Leu Leu Asp Asp Trp Lys Pro Tyr Lys Leu Arg Arg

            20                  25                  30

Leu Tyr Phe Ile Trp Val Cys Arg Asp Ile Gln Ser Phe Gln Trp Phe

        35                  40                  45

Ala Asp Leu Leu Cys Val Leu His Asn Lys Phe Trp Gln Glu Asn Arg

    50                  55                  60

Pro Asp Phe Val Asn Ile Gln Leu Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ile

65                  70                  75                  80

Gln Lys Ile Ile Gly Glu Lys Tyr His Thr Leu Asn Ser Arg Leu Phe

                85                  90                  95

Ile Gly Arg Pro Arg Trp Lys Leu Leu Phe Asp Glu Ile Ala Lys Cys

            100                 105                 110

Asn Arg Gly Lys Thr Val Gly Val Phe Cys Cys Gly Pro Ser Ser Ile

        115                 120                 125

Ser Lys Thr Leu His Ser Leu Ser Asn Arg Asn Asn Ser Tyr Gly Thr

    130                 135                 140

Lys Phe Glu Tyr Asn Lys Glu Ser Phe Ser

145                 150

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列

<400>9

tgttgggcct aggattgtgt t                                            21

<210>10

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列

<400>10

aagcagagca tctgcatctg tcctcaacc                                    29

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列

<400>11

aaaaggatga ggctgcagtt g                                              21

<210>12

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<22D>

<223>人工序列

<400>12

tggtcatgca gcattaaact ttg                                            23

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列

<400>13

cattgtccca cattggtctc c                                              21

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列

<400>14

cggctaccac atccaaggaa                                               20

<210>15

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列

<400>15

tgctggcacc agacttgccc tc                                            22

<210>16

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列

<400>16

gctggaatta ccgcggct                                                 18

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>17

ttggccagcc agctcctcca                                                20

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>18

taggccagca agctcctaca                                                20

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>19

cgtcacgctc agctcaccgt                                                20

Claims (41)

1.一种抑制特定细胞内NADPH氧化酶活性的分离的化合物，其中所述NADPH氧化酶包含细胞外NADPH结合结构域。

2.权利要求1的化合物，其中所述化合物抑制或降低超氧化物、次氯酸盐、脂质过氧化物、过亚硝酸盐、过氧化氢和/或羟基自由基的产生。

3.权利要求1的化合物，其中所述化合物与细胞外暴露的NADPH氧化酶之NADPH结合β亚基相互作用或结合。

4.权利要求3的化合物，其中NADPH结合β亚基是Nox4。

5.权利要求4的化合物，其中所有或部分Nox4存在于细胞膜的外面。

6.权利要求1的化合物，其中所述细胞选自含有平滑肌的脉管系统、含有内皮细胞的脉管系统、含有血管外膜成纤维细胞的脉管系统和非脉管系统的细胞。

7.权利要求1或4的化合物，其中所述化合物是苯甲酰胺或其衍生物或类似物。

8.权利要求1或4的化合物，其中所述化合物是芳基磺酸盐或其衍生物或类似物。

9.权利要求8的化合物，其中所述芳基磺酸盐或衍生物或类似物是苏拉明或其衍生物或类似物。

10.权利要求8的化合物，其中苏拉明的衍生物选自在图1中公开的衍生物。

11.权利要求1或4的化合物，其中所述化合物是二亚苯基碘鎓(DPI)或4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶氧(tempol)或衍生物或类似物或同类物。

12.权利要求1或4的化合物，其中所述化合物是罗布麻宁、反应蓝2或PPADS或其类似物或衍生物。

13.权利要求1或4的化合物，其中所述化合物是超氧化物清除剂。

14.权利要求1或4的化合物，其中所述化合物结合SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6或SEQID NO：8具有至少大约60％相同性的氨基酸序列。

15.权利要求1或14的化合物，其中所述化合物是肽、多肽或蛋白质、非蛋白质化学分子或合成分子。

16.权利要求1或14的化合物，其中所述化合物结合包含如下的核酸分子：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5或SEQID NO：7中列出的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7具有至少大约60％相同性的核苷酸序列或其互补形式或在低严格条件下能够杂交于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的核苷酸序列或其互补形式。

17.权利要求16的化合物，其中所述化合物是核苷酸反义分子或其化学修饰形式或类似物。

18.权利要求17的化合物，其中所述化合物是核苷酸有义分子或其化学修饰形式或类似物。

19.一种组合物，包含权利要求1至18中任一项的化合物和一种或多种药物可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。

20.一种治疗或预防哺乳动物病症或事件的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物有效量的权利要求1至18中任一项的化合物或权利要求19的组合物。

21.权利要求20的方法，其中所述哺乳动物是人。

22.权利要求20的方法，其中所述哺乳动物是实验室测试动物。

23.权利要求20或21或22的方法，其中所述病症或事件包括例如如下的病理情况：动脉粥样硬化和动脉硬化、I和II型糖尿病的心血管并发症、内膜增生、冠心病、脑、冠状或动脉血管痉挛、内皮功能障碍、包括充血性心衰的心衰、败血症、外周动脉疾病、再狭窄和血管成形术后再狭窄、中风、器官移植后的血管并发症、源自病毒和细菌感染的心血管并发症以及独立于或继发于包括心肌梗塞的另一种病变的任何病变、高血压、动脉粥样硬化斑块形成、血小板聚集、心绞痛、动脉瘤、暂时缺血发作、异常氧气流和/或递送、萎缩症或器官损害、肺栓塞、血栓或普遍的动脉或静脉病变包括内皮功能障碍、血栓事件包括深度静脉血栓或支架、起搏器或其他修复装置造成的循环系统血管的损伤或支架失败或创伤，以及缺血再灌注损伤包括缺血后血流和氧气递送的恢复造成的任何损伤、坏疽、(癌症和/或异常肿瘤)、干或先祖细胞增殖、呼吸疾病(例如哮喘、支气管炎、过敏性鼻炎和成人呼吸窘迫综合征)、皮肤疾病(牛皮癣、湿疹和皮炎)和骨代谢的各种失调(骨质疏松、甲状旁腺功能亢进、骨硬化、骨质减少和牙周炎)和肾衰。

24.权利要求23的方法，其中所述癌症选自ABL1原癌基因、AIDS相关癌症、听觉神经瘤、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、腺囊样癌、肾上腺皮质癌、病因不明的骨髓转移、秃头症、腺泡状软组织肉瘤、肛门癌、血管肉瘤、再生障碍性贫血、星细胞瘤、毛细管扩张失调症、基底细胞癌(皮肤)、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑干神经胶质瘤、脑和CNS肿瘤、乳癌、CNS肿瘤、良性肿瘤、子宫颈癌、儿童脑肿瘤、儿童癌症、儿童白血病、儿童软组织肉瘤、软骨肉瘤、绒毛膜癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、结直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、隆突皮肤纤维肉瘤、结缔组织增生小圆细胞肿瘤、腺管癌、内分泌癌、子宫内膜癌、室骨膜瘤、食管癌、尤因瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼：黑素瘤、视网膜母细胞瘤、输卵管癌、范科尼贫血、纤维肉瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道癌、胃肠道良性肿瘤、泌尿生殖器癌症、生殖细胞肿瘤、妊娠性滋养细胞层疾病、神经胶质瘤、妇科癌症、血液恶性疾病、毛细胞性白血病、头颈癌、肝细胞癌、遗传性乳癌、组织细胞增多症、何杰金氏疾病、人乳头瘤病毒、葡萄胎、高血钙、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、朗革汉氏细胞组织细胞增多症、喉癌、平滑肌瘤、白血病、里-费综合症、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴水肿、淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、男性乳癌、恶性肾横纹肌肿瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、默克尔氏细胞癌、间皮瘤、转移癌、口癌、多发性内分泌瘤、菌样肉芽肿、骨髓增生异常综合症、骨髓瘤、骨髓增生性失调、鼻癌、鼻咽癌、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经纤维瘤、尼比综合征、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、眼癌、食管癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、造瘘术卵巢癌、胰腺癌、鼻窦癌、甲状旁腺癌、腮腺癌、阴茎癌、外周神经外胚层肿瘤、垂体癌、真性红血球增多症、前列腺癌、罕见癌症相关疾病、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、罗-汤综合征、唾液腺癌、肉瘤、神经鞘瘤、赛塞利综合征、皮肤癌、小细胞肺癌(SCLC)、小肠癌、软组织肉瘤、脊髓肿瘤、鳞状细胞癌(皮肤)、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行细胞癌(膀胱)、移行细胞癌(肾-骨盆-/-输尿管)、胚胎滋养层癌、尿道癌、泌尿系统癌、Uroplakins、子宫肉瘤、子宫癌、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和维尔姆斯瘤。

25.权利要求23的方法，其中全身脉管系统的病症或事件是动脉粥样硬化或内皮功能障碍。

26.权利要求20的方法，其中化合物给予的量对抑制或降低来自VSMC和/或含有内皮细胞的脉管系统和/或含有血管外膜成纤维细胞的脉管系统和/或非脉管系统的超氧化物和/或下游ROS的形成是有效的。

27.权利要求20的方法，其中化合物给予的量对抑制或降低超氧化物、次氯酸盐、脂质过氧化物、过亚硝酸盐、过氧化氢和/或羟基自由基在VSMC和/或含有内皮细胞的脉管系统和/或含有血管外膜成纤维细胞的脉管系统和/或非脉管系统中的形成或由其形成是有效的。

28.权利要求20的方法，其中所述化合物是核酸分子或其化学修饰或类似形式。

29.权利要求20的方法，其中所述化合物是苏拉明或其衍生物或类似物。

30.权利要求20的方法，其中所述化合物是tempol或DPI或其衍生物或类似物。

31.权利要求20的方法，其中所述化合物是反应蓝2或PPADS或其衍生物或类似物。

32.苯甲酰胺和/或芳基磺酸盐和衍生物或类似物在制备治疗或预防哺乳动物或非哺乳动物的病症或事件的药剂中的用途。

33.Nox4抑制剂在制备治疗或预防哺乳动物或非哺乳动物病症或事件的药剂中的用途，其中全部或部分Nox4是细胞外暴露的。

34.苏拉明或其衍生物或类似物在制备治疗或预防哺乳动物或非哺乳动物病症或事件的药剂中的用途。

35.Tempol在制备治疗或预防哺乳动物或非哺乳动物病症或事件的药剂中的用途。

36.DPI在制备治疗或预防哺乳动物或非哺乳动物病症或事件的药剂中的用途。

37.一种非人的动物模型，包含编码Nox4的基因座中或侧翼的突变。

38.权利要求37的动物模型，其中所述突变是对Nox4编码序列或其5’或3’非翻译区域的插入、缺失、替代或添加。

39.权利要求37的动物模型，其中所述突变是Nox4基因侧翼的loxP插入。

40.一种多部分的药物包装，包含第一部分或至少第二或更多的部分，所述第一部分包含权利要求1至18中任何一个的化合物，所述第二或更多的部分包含一种或多种对于减轻哺乳动物或非哺乳动物病症或事件的症状或影响有用的治疗剂。

41.权利要求40的多部分药物包装，其进一步包含含有Nox4-抑制剂相互作用的激动剂的部分。

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