CN1408022A - 碘的特异性转运蛋白的编码重组腺病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肿瘤基因治疗法与治疗领域。更具体地，本发明涉及借助腺病毒载体在肿瘤细胞中导入碘的特异性转运蛋白(Na+/I－同向转运蛋白)NIS的编码基因，以便促进碘在这些细胞中的积累。本发明还涉及用于含有nis基因的复制的缺损重组腺病毒以及这些载体在将nis基因转移到肿瘤细胞中与代谢放射性治疗相结合的癌治疗方法中的应用。

Description

碘的特异性转运蛋白的编码重组腺病毒
本发明涉及基因治疗和肿瘤治疗领域。更具体地，本发明涉及借助腺病毒载体在肿瘤细胞中引入能够促进碘在细胞中积累的碘的特异性转运蛋白(Na+/I-同向转运蛋白)NIS的编码基因。本发明还涉及用于复制的含nis基因的缺陷重组腺病毒，以及这些载体在与肿瘤细胞中nis基因转移相关的癌症的治疗方法中与采用碘131的代谢放射治疗中的应用。
五十多年来碘131一直被用于治疗甲状腺分化癌。其治疗效果与针对肿瘤组织使用的放射剂量相关。例如，在转移的情况下，当输送到肿瘤组织的剂量超过80戈瑞时，观察到用碘131治疗后的肿瘤反应，而剂量低于35戈瑞时，肿瘤反应率很低或没有[Maxon，NEJM，309：937-941，1983]。一般可以估计到，根据其辐射敏感度，治疗或降低肿瘤体积所必需的总剂量是40-60戈瑞。多次用碘131治疗时，可以施用此总剂量，如治疗分化甲状腺癌的固定(fixante)转移时施用此总剂量。
向肿瘤组织施用的辐射剂量取决于两个生物学因素：碘131在肿瘤组织中的有效半衰期(T有效)与放射性浓度。
-根据1/T有效＝1/T生物+1/T物理关系，在肿瘤组织中碘131的有效半衰期(T有效)取决于生物半衰期(T生物)和物理半衰期(T物理)。在固定的细胞中碘131的生物半衰期(T生物)取决于碘的器质化能力。在没有器质化时，例如像在非甲状腺细胞中，生物半衰期是短的，从几小时到几十小时。碘131的物理半衰期(T物理)是8.02天。于是，在最好的情况下，可以估计到，在肿瘤组织中碘131的有效半衰期(T有效)是几小时到几十小时。
-放射性浓度是肿瘤组织固定碘131的总量与该组织质量的比。
作为实例，对于施用于每1克组织的放射性的0.1％固定碘与有效半衰期1.5天，可以估计到，施用3.7千兆贝克勒尔(GBq)(或100毫居里)释放给肿瘤组织30戈瑞剂量。
碘131的总固定是一个参数，该参数一方面取决于给患者施用碘131的放射性，另一方面取决于肿瘤组织浓缩碘131的能力。
-可以给患者施用的最大的碘131放射性，受到由释放给健康组织，特别是释放给骨髓的辐照剂量所造成的碘131的碘毒性制约。因此，在甲状腺癌的情况下，患者处于甲状腺功能减退状态时，施用的治疗放射性一般是3.7-10GBq(100-300毫居里)。可以给甲状腺机能正常的患者施用的最大放射性是比较高的，因为这时保留的碘比在甲状腺功能减退状态时观察到的低二倍，其最大放射性值达到8.5-22.2GBq(500-600毫居里)。
-对于给患者施用的确定放射性，肿瘤组织浓缩碘131的能力取决于碘的同向转运蛋白表达水平及其生物活性。通过研究正常人的甲状腺组织和通过研究在体外的NIS活性可以证明这一点。由于碘131的特效活性很高，增加施用的碘131活性也未观察到饱和现象。
根据可以给患者施用的最大碘131放射性的限制，应希望能够提高肿瘤组织浓缩碘131的能力，以便增加碘131的总固定。
同样具有决定性意义的是碘固定在肿瘤组织中以均匀方式增加。事实上，在固定组织中固定碘可以与其他组织中的细胞是非常不同的，甚至与其他组织中的肿瘤区域也非常不同。在肿瘤组织中辐照剂量基本上由碘131的β发射提供。然而在生物组织中它的射程最大2-3毫米。此外，在点状源周围，辐照剂量随距离以指数方式降低。这些因素增强了在固定的肿瘤区域中达到高放射性浓度的重要性，以及达到尽可能均匀固定碘的必要性。
应该指出，通过人体甲状腺固定碘131的过程，因而其辐照过程，易于通过在三星期内每天分三次施用1微克/千克/天L-三碘甲腺氨酸加以消除(不可检测到的碘131的固定)。
转运蛋白NIS是负责浓缩通过甲状腺细胞循环的碘(呈碘离子I-形式)[可参看期刊P.Thomopoulos，《药物与科学》(Médecine et Science)，4(10)卷，第825-828页]。在这些细胞中碘的浓缩过程呈现下述特点：碘沿着与电化学梯度相反的方向浓缩，其因子达30-40倍；这要求有钠(Na+)存在；还涉及活性传导，某些阴离子，例如硫氰酸根、高氯酸根、高锝酸根，以竞争方式抑制这种传导。甲状腺细胞浓缩碘后发生碘的器质化过程，以及碘酪氨酸和甲状腺荷尔蒙(甲状腺素T4和三碘甲状腺氨酸T3)的合成。
曾分离出碘的鼠的转运蛋白NIS[Dai等人，《自然》(Nature)，379：458-460(1996)]和人的转运蛋白NIS[Smanik P.A.等人，生物化学生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)226：339-345(1996)]的编码基因，它们具有84％同一性。该基因在人类中位于染色体19p。它包括15个被14个内含子分开的外显子。其转录通过不同的剪接形成两种形式，其中较长的形式在甲状腺中占主要部分。该蛋白的分子量为55kDa，在糖基化作用后达到80kDa。它位于甲状腺细胞的外侧基底膜中。其氨基末端和羧基末端是在细胞内的，而肽链残基包括13个由细胞内和细胞外的环并合的跨膜节段[Levy等人，1998，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)273：22657-22663]]。在非甲状腺细胞中引入NIS编码基因，使它们具有俘获碘的能力，具有与甲状腺细胞同样的性质，特别是必须有钠(Na+)存在和由高氯酸根阴离子产生的抑制作用。
在甲状腺细胞中用TSH激活nis基因的转录作用。环状AMP介导这种作用。在鼠科动物甲状腺细胞中，该蛋白的半衰期是4天[Paire A.等人，《生物化学杂志》，272：18245-18249(1997)]。在甲状腺以外的组织中，基因活性低于基态甲状腺的活性。这实际上是由于特定的TTF-1转录因子(甲状腺转录因子1)刺激甲状腺细胞中nis基因转录作用，该因子可以与甲状腺的nis基因启动子连接，而不与其他组织的nis基因启动子连接[Endo T.等人，Mol.Endocrinol.11：1747-1755(1997)]。在甲状腺之外，某些组织，特别是唾腺和胃粘膜能够俘获和浓缩碘。
一项新近研究涉及使用逆转录病毒载体将nis基因转移到人类或鼠类肿瘤细胞中[Mandell等人，《癌研究》(Cancer Research)，59：661-668(1999)]。这些结果的意义在于，它们表明有可能在非甲状腺细胞中表达nis基因并且观察到碘在通常无法自然地积聚碘的细胞中的浓缩过程。但是，为了达到足以进行治疗应用的碘固定水平，某些限制因素仍要加以克制。
第一个因素是在肿瘤细胞中低水平表达nis基因。例如，在上述研究中，体外得到的结果表明，在非甲状腺的肿瘤细胞中达到的碘浓度，比甲状腺细胞中累积的碘浓度低约二倍。
此外，考虑到膜中肿瘤细胞具有明显的干扰作用，显然难以保证转运蛋白以与非肿瘤甲状腺细胞相同的效率进行功能整合。
另一个限制因素是在非甲状腺细胞中未出现碘的器质化(organification)，然而这种碘的器质化是在这些细胞中保持碘所必需的要素。于是，在上述研究中，观察到非甲状腺细胞在生物体外积累的碘非常快速溢出(30-60分钟)。
最后，考虑到肿瘤细胞不均匀性和这些细胞在膜处的严重变性，似乎在肿瘤细胞膜处难以达到NIS转运蛋白的均匀分布。
因此，目前所描述的任何方法都无法在非甲状腺肿瘤中以足以利用碘131治疗非甲状腺肿瘤的表达水平积累碘。
本发明提出一种将基因治疗与碘131放射性治疗结合的改进肿瘤治疗方法。
本发明特别地描述一种能够提高在非甲状腺肿瘤处固定碘的效率并且能够将这些成功研制的治疗甲状腺癌的放射性治疗原则应用于非甲状腺肿瘤的方法。
本发明证实，借助缺失重组腺病毒转移用于碘的特异性转运蛋白(Na+/I-同向转运蛋白)NIS的编码基因，能够在非甲状腺肿瘤细胞中非常明显地达到碘的积累。在特定实施方式中，加入表达nis基因的缺失腺病毒能够以比在甲状腺细胞中观察到的浓度高大约五倍的浓度积累碘。非甲状腺肿瘤细胞积累碘125的这种令人惊奇的能力使得对于这类肿瘤施用基于借助碘131代谢放射性治疗的新治疗方法；到那时为止为治疗某些甲状腺肿瘤保留的方法成为可能。
代谢的放射性治疗的主要优点是在不明显地辐照周围组织的条件下以很大的辐照剂量将放射性同位素传送到固定组织。
对于确定能够大量地将碘浓缩在通常不能积累这种元素的肿瘤细胞中的这种发现使得试图将这种方法应用于治疗非甲状腺源肿瘤的许多适应症成为可能。更具体地设想到的两类适应症是：由于肿瘤的定位，外部放射性治疗难以到达的这些肿瘤，作为实例，可以列举无法实施手术的前列腺癌或大脑内的肿瘤；经过辐照的并且由于已经施用了最大剂量无法进行外部补充放射性治疗的肿瘤：这涉及任何突如其来的癌或在辐照区域复发的癌。这种方法还可应用于失去俘获碘的能力与对代谢治疗没有反应的甲状腺肿瘤的治疗。
还可以设想将代谢放射性治疗与外部放射性治疗结合起来，如在甲状腺分化癌转移的情况实施的治疗。这种结合能够提高放射性治疗的治疗效率，同时不增加其毒性。这种结合对放射性治疗不太敏感的肿瘤是特别有意义的。另外，这种结合还使得试图将这种技术应用于由于其体积太大因而仅采用代谢放射性治疗不易接近的肿瘤。
因此，本发明的第一个目的在于一种含有至少一个编码碘特异性转运蛋白(Na+/I-同向转运蛋白)NIS的异源DNA片段的缺失重组腺病毒或其一种衍生物。
在本发明的意义上，碘特异性转运蛋白(Na+/I-同向转运蛋白)NIS的“衍生物”是指由NIS多肽衍生的保持碘的特异性运送活性的任何类似物、片段或突变形式。不同的衍生物可以自然状态存在。这些衍生物可以是等位基因变异，其特征在于编码NIS的结构基因的核苷酸序列的不同，或可以由不同剪接或翻译后修饰得到。这些衍生物可以由一种或多种氨基酸残基经置换、缺失、插入和/或修饰得到。可以采用本领域技术人员已知的任何技术进行这些修饰。这些衍生物特别是对其基质具有较大亲和性的分子，能够在体内使表达得到改善的序列，具有较大的蛋白酶抗性的分子，具有较大生物学效率或较小副作用，或任选地具有新生物学性质的分子。适用于本发明范围的其他衍生物特别地是其中一个或多个残基已被置换的分子，在与被考虑或表达不合乎要求活性的连接位点的相互作用中，通过缺失不相关或不太相关区域得到的这些衍生物，以及含有相对于天然序列互补残基例如分泌信号和/或连接肽的衍生物。
在本发明范围内产生的碘特异性转运蛋白(Na+/I-同向转运蛋白)NIS或其衍生物可以是cDNA、基因组的DNA(gDNA)，或一种例如由其中被插入一个或多个内含子的cDNA组成的杂合构建体，还可能涉及合成序列或半合成序列。有利地，使用cDNA或gDNA。特别地，使用gDNA在人的细胞中能更好地表达。
根据第一个实施方式，涉及鼠源的碘特异性转运蛋白(Na+/I-同向转运蛋白)NIS的编码的cDNA序列。根据本发明的优选方式，涉及人源的碘特异性转运蛋白(Na+/I-同向转运蛋白)NIS的编码cDNA序列。
用于本发明范围内的腺病毒是重组腺病毒，即含有异源DNA序列的腺病毒。有利地，涉及缺失重组腺病毒，即不能在靶细胞中自主复制的腺病毒。
对于本发明腺病毒的构建体，可以使用不同的血清型。事实上存在许多血清型，其结构和性质有些变化，但它们具有类似的遗传组构。更特别地，重组腺病毒可以是人源或动物源的。关于人源的腺病毒，优选地可以列举C组的腺病毒，特别是2(Ad2)、5(Ad5)、7(Ad7)或12(Ad12)类腺病毒。在动物源的不同腺病毒中，优选地可以列举犬源腺病毒，特别是所有CAV2腺病毒株[例如曼哈顿株或A26/61(ATCC VR-800)]。在申请WO94/26914中特别列举了其他动物源腺病毒。
腺病毒基因组特别地含有处在每个端部的末端反向重复序列(ITR)、衣壳化的序列(Psi)、早期基因和晚期基因。主要的早期基因包含在E1、E2、E3和E4区中。其中E1区中所包含的基因对于病毒繁殖尤其是必不可少的。主要的晚期基因包含在L1至L5区中。Ad5腺病毒基因组被完全测序，并且基于已知数据是可得到的(具体参见Genbank M73260)。同样地，部分，甚至全部其他的腺病毒基因组(Ad2、Ad7、Ad12等)也都被测序。
正如前面已指出的，本发明的腺病毒存在缺陷，因此在靶细胞中是不能自主性被复制的。为此，曾制备出由腺病毒衍生的不同构建体，同时加入不同的治疗基因。在每一种这些构建体中，该腺病毒被修饰，以便使其在感染细胞中不能复制。于是，在现有技术中描述的构建体是病毒复制必不可少的E1区中缺损的腺病毒，异源DNA序列已插入该区中[Levrero等人，《基因》，101(1991)195；Gosh-Choudhury等人，《基因》(Gene)，50(1986)161]。另外，为了改善载体的性质，曾提出在腺病毒基因组中产生其他缺失或修饰。于是，曾在ts125突变体中导入热敏点突变，这样能够使DNA链的72kDa的蛋白失活(DBP)(Van derVliet等人，病毒学杂志(J.Virol.)，1975，15(2)348-354)。其他载体含有对复制和/或病毒繁殖必不可少的另一区，E4区的缺失。事实上在调节晚期基因表达、在晚期核RNA的稳定性、在消除宿主细胞蛋白表达中和在病毒DNA复制的效率方面都涉及E4区。其中E1和E4区缺失的腺病毒载体因此具有非常低的转录水平和病毒基因表达。这样一些载体例如在申请WO94/28152、WO95/02697、WO96/22378中曾有描述。另外，还描述过在IVa2基因中带修饰的载体(WO96/10088)。
在一个本发明的优选实施方式中，重组腺病毒是C组的人腺病毒。更优选地，涉及Ad2或Ad5腺病毒。
有利地，在本发明范围内使用的重组腺病毒包含在其基因组的E1区中的一处缺失。更优选地，它包含E1a和E1b区的一处缺失。作为实例，可以列举影响核苷酸454-3328、386-3446、459-3510或357-4020(相对于Ad5基因组)的缺失。
根据另一个变化方式，在本发明范围内使用的重组腺病毒至少缺失E1和E3区的全部或部分。
根据另一个变化方式，在本发明范围内使用的重组腺病毒还包含在E1区中的一处缺失，影响该基因组的E4区的全部或部分的缺失。更具体地，在E4区中缺失整个开放可读框(phases ouvertes)。作为精确实例可以列举缺失33466-35535或33093-35535，或仅仅部分E4区(例如ORF6或ORF3)，如在申WO95/02697和WO96/22378中描述的。
例如可以涉及所述的第3代重组腺病毒，即全部或部分E1和E4区，以及任选地E3区是缺损的。本发明特定的变化方式由使用带有影响全部或部分下述功能区的缺失的腺病毒构成：
-E1、E4和E3区，
-E1、E4和E2区，
-E1、E4、E2和E3区，
-上述区以及腺病毒(L1～L5)晚期功能的编码基因的全部或部分，或
-全部病毒编码区。
对于同时不具备晚期功能的腺病毒(“最小”载体)或全部编码区(“没有生气的”载体)，例如Parks等人在PNAS93(1996)，第13565页和Lieber等人在病毒学杂志(J.Virol.)70(1996)，第8944页中描述过它们的构建。
还可能涉及如在申请WO99/60144中描述的并且其中腺病毒作为其他病毒载体，特别是作为逆转录病毒载体使用的杂合腺病毒载体。
包含碘转运蛋白(NIS)的编码核酸的表达盒可以插入重组体基因组的不同位点。该盒可以插入E1、E3或E4区，置换缺失的序列或添加。该盒还可以以顺式插入在产生病毒必不可少的序列(ITR序列和衣壳化序列)之外任何其他的位点。
在本发明的意义上，术语“表达盒”应当理解是核酸，其可以被插入载体中特定限制性位点的DNA片段；DNA片段还含有编码RNA或目标多肽的核苷酸序列，表达所述有意义序列必需的序列(增强子、启动子，聚腺苷酸化序列)。可以设想DNA片段和限制性位点来保证在转录和/或翻译的适当可读框内插入所述片段。
在衣壳化细胞系中，即能够在重组腺病毒基因组中反式互补一个或多个不足功能的细胞系，产生这些重组腺病毒。在本领域技术人员已知的衣壳化的细胞系中，例如可以列举293细胞系，其中一部分腺病毒基因组被整合。更确切地，293细胞系是含有血清型5腺病毒基因组(Ad5)左端(约11-12％)的肾的人胚细胞系，包含左ITR、衣壳化区、其中包括E1a和E1b的E1区、pIX蛋白编码区和一部分pIVa2蛋白编码区。这种细胞系能够与E1区缺损，即没有全部或部分的E1区的缺损重组腺病毒反式互补，还能够产生具有高效价的病毒原种。这种细胞系在允许的温度下(32℃)也能够产生还含有热敏突变E2的病毒原种。特别地基于A549人的肺癌细胞(WO94/28152)，或基于人的眼癌(人基因治疗(Hum.Gen.Ther).(1996)215)，描述了能够与E1区互补的其他细胞系。另外，也描述了能够反式互补多个腺病毒功能的细胞系。特别地，可以列举E1和E4区互补的细胞系(Yeh等人，病毒学杂志(J.Virol.)，第70卷(1996)，第559-565页；癌症基因治疗(Cancer Gen.Ther.)2(1995)322；Krougliak等人，人基因治疗(Hum.Gen.Ther.)6(1995)1575)和E1和E2区互补的细胞系(WO94/28152、WO95/02697、WO95/27071)或由适用于生产最小腺病毒的细胞系得到的细胞系，其原因尤其在于它们还表观在这样病毒构建体中涉及的特异性位点重组酶的活性。
在衣壳结构中还可以修饰重组腺病毒，以便增加在肿瘤中的感染效率。例如，衣壳可以含有uPAR的配体或RGD基序，它能够使腺病毒对准肿瘤细胞，这样一些靶载体和序列具体在申请WO00/12738中描述过。这些靶序列可以插入六邻体蛋白中或插入纤维蛋白中。优选地，靶序列插入纤维或六邻体蛋白的缺失处。有利地，使六邻体多肽序列缺失相应于Ad5六邻体多肽序列的第279-292位的13个氨基酸。有利地，使纤维多肽序列缺失相应于Ad5纤维(HI Loop)多肽序列第539-547位的11个氨基酸。
这些重组腺病毒通常是通过在衣壳化的细胞系中导入病毒DNA，接着在约2或3天后溶解细胞得到的(腺病毒循环动力学是24-36小时)。为了实施该方法，导入的病毒DNA可以是完全的重组病毒基因组，该基因组任选地在细菌中(WO96/25506)或在酵母中(WO95/03400)构建，在细胞中感染。还可能涉及感染衣壳化细胞系所使用的重组病毒。病毒DNA还能够以每个都带一部分重组病毒基因组和一个同源区的片段形式导入，在导入衣壳化细胞中之后，它们能够通过在不同片段之间的同源重组重新构建重组病毒基因组。
在溶解细胞之后，重组病毒颗粒可以采用任何已知的技术进行分离，例如氯化铯梯度离心法分离或色谱法分离。在申请WO98/00528中描述了另一种方法。
表达调节序列。在任何表达调节序列例如像启动子或启动子/增强子的控制下，碘的特异性转运蛋白(Na+/I-同向转运蛋白)NIS的编码基因发挥功能，能够在肿瘤宿主细胞中表达。
表达调节序列除了启动子区以外还含有位于碘的特异性转运蛋白编码基因3’位的区，该区提供转录结束的信号和聚腺苷酸化作用位点。所有这些元件构成了表达盒。
启动子可以是组成型或可调节的(可诱导的)。可以涉及固有的基因启动子。还可能涉及不同源的序列(负责其他蛋白的表达，或甚至是合成启动子)。特别地，可以涉及真核细胞或病毒基因的启动子序列。例如，可以涉及来自人们希望转染细胞的基因组的启动子序列。同样地，可以涉及来自病毒基因组的启动子序列，其中包括使用的病毒。在这方面，例如可以列举E1A、MLP、CMV、LTR-RSV、MT-1、SV40等启动子。
另外，这些表达序列可以通过添加能够使在某些组织中特异性组织表达或优势表达的激活序列，调节序列(烯醇酶启动子，GFAP等)进行修饰。事实上，特别有意义的是使用特异地或主要地在肿瘤细胞中活性表达的信号，以便仅仅在病毒有效地感染肿瘤细胞时表达治疗基因并且产生其效果。该表达的特异性或主要特性意味着启动子在肿瘤细胞中明显地呈现非常高的活性。尽管非特异性表达可以存在于其他细胞中，但是相应的活性水平与肿瘤细胞中观察到的相比一般仍然非常低(可忽略不计)，一般低至少10倍。
在可被用于本发明范围内的启动子中，可以列举遍在启动子(次黄嘌呤转磷酸核糖基酸、波形蛋白、α-肌动蛋白、微管蛋白等)，中间丝启动子(结蛋白、神经丝、角蛋白、GFAP)，有治疗意义的基因启动子(MDR、CFTR、VIII因子等)，组织的特异性启动子(结蛋白、肌球蛋白、肌酸激酶、磷酸甘油酸激酶的基因启动子)，在生长细胞中更具有特异活性的启动子或对刺激物反应的启动子，例如对天然激素反应的启动子(类固醇激素受体、视黄酸受体等)或用抗生素调节的启动子(四环素、雷帕霉素等)或对其他自然或合成来源的分子反应的其他启动子或来自病毒基因组的启动子序列，如巨细胞病毒CMV的增强子/启动子，逆转录病毒启动子LTR，SV40启动子，E1A基因启动子，MLP启动子。在WO96/01313、US5168062和US5385839中描述过用四环素可调节的启动子和CMV启动子。
在适用于实施本发明的启动子中，特别可以列举巨细胞病毒(CMV)启动子，SV40的早期启动区(Benoist和Chambon，1981，《自然》，290：304-310)，在Rous恶性毒瘤的病毒3’LTR区中含有的启动子(Yamamoto等人，1980，《细胞》，22：787-797)，疱疹病毒的胸腺密啶核苷激酶启动子(Wagner等人，1981，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)78：1441-1445)，金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等人，1982，《自然》，296：39-42)；原核生物源的启动子，如β-内酰胺酶启动子(Vi1la-Kamaroff等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)75：3727-3731)，或tac启动子(DeBoer等人，1983，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)80：21-25)；还参见在《科学的美国》，1980，242：74-94中“重组细菌中的适用蛋白”；酵母菌启动子，例如Gal4启动子，ADC(醇脱氢酶)，PGK(磷酸甘油激酶)，碱性磷酸酶；具有组织特异性并且用于转基因动物的动物源转染调节序列；在胰腺腺泡细胞中是活性的弹性蛋白酶I的基因调节序列(Swift，1984，《细胞》，38：639-646；Ornitz等人，1986，《Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.》50：399-409；MacDonald，1987，《肝脏病学》，7：425-515)；在胰腺β细胞中是活性的胰岛素基因调节序列(Hanahan，1985，《自然》，315：115-122)，免疫球蛋白的表达调节序列，它在淋巴样细胞中是活性的免疫球蛋白的表达调节序列(Grosschedl等人，1984，《细胞》，38：647-658；Adames等人，1985，《自然》，318：533-538；Alexander等人，1987，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)7：1436-1444)；在睾丸细胞、乳房细胞、淋巴细胞和肥大细胞中是活性的小鼠乳腺瘤病毒调节序列(Leder等人，1986《细胞》45：485-495)，在前列腺肿瘤中是活性的PSA基因调节序列，在肝脏中是活性的白蛋白基因调节序列(Pinkert等人，1987，基因和进展(《Genes and Devel.》)，1：268-276)，在肝脏中是活性的甲胎蛋白基因调节序列(Krumlauf等人，1985，分子细胞生物学(《Mol.Cell.Biol.》)5：1639-1648；Hammer等人，1987，《科学》，235：53-58)，在肝脏中是活性的α1-抗胰蛋白酶基因调节序列(Kelsey等人，1987，基因和进展(《Genes and Devel.》)，1：161-171)，在骨髓细胞中是活性的β-球蛋白基因调节序列(Mogram等人，1985，《自然》，315：338-340；Kollias等人，1986，《细胞》，46：89-94)，在脑少突胶质细胞中是活性的碱性髓磷脂基因调节序列(Readhead等人，1987，《细胞》，48：703-712)，在骨骼肌内是活性的肌球蛋白轻链2基因的调节序列(Sani，1985，《自然》，314：283-286)，和在下丘脑中是活性的促性腺激素释放激素的基因的调节序列(Mason等，1986，《科学》，234：1372-1378)。
在本发明的特别实施方式中，在优选地选自LTR-RSV或CMV早期性启动子的病毒启动子控制下，使用含有碘的特异性转运蛋白(Na+/I-同向转运蛋白)NIS的编码基因的缺损重组腺病毒。
将引入能够增加碘131生物半衰期的生物体系与借助本发明载体导入NIS基因相结合同样是可能的。同时或相继地往肿瘤细胞中输送NIS基因和在碘的器质化体系中涉及的多肽的一个或多个编码基因也是可能的。例如可以列举在过氧化物酶体系中涉及的多肽的编码基因，例如葡糖氧化酶的编码基因。还可以列举甲状腺过氧化酶，即在碘器质化过程中涉及的甲状腺细胞的酶的编码基因(《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)，15：6735-6735(1987)，GenBank g37251序列)。导入甲状腺过氧化酶的编码基因还可以与导入全部或部分甲状腺球蛋白(富含酪氨酸残基的甲状腺球蛋白部分)的编码核酸序列结合起来。
可以预料，通过表达多个转基因的单个载体或通过两个载体共同感染，往肿瘤细胞中导入NIS基因和在碘器质化体系中涉及的多肽的一个或多个编码基因，在上述两个载体中，一个为表达NIS基因的腺病毒载体，另一个为表达在碘器质化体系中涉及的多肽的一个或多个编码基因的病毒或质粒载体。
还可以将能够通过药剂(例如锂盐)延缓碘释放的体系的给药过程与借助本发明载体导入NIS基因相结合。
根据另一个变通方案，还可以预料将导入NIS基因与其他有治疗肿瘤意义的基因结合起来。可以涉及自杀基因，例如疱疹胸腺密啶核苷激酶的基因或胞嘧啶脱氨酶的基因。可以涉及诱导编程性细胞死亡蛋白的编码基因，例如p53、Bax、Bc1X-s、Bad或Bc12和Bc1X-1的任何其他拮抗剂。可以涉及这些具有改善性质的蛋白变体的编码基因，如p53(CTS-1，WO97/04092)变体。还可以涉及抗血管生成因子或血管静止因子的编码基因，例如具体是Tie-1的配体和Tie-2的配体，制管张素，内抑制素(endostatine)，ATF因子，血纤蛋白溶酶原衍生物，内皮缩血管肽，血小板反应蛋白1和2，PF-4，α或β干扰素，白细胞介素12，αTNF，尿激酶受体，flt1，KDR，PAI1，PAI2，TIMP1，促乳素片段。还可以涉及能够诱导抗肿瘤免疫或刺激免疫反应的蛋白的编码基因(IL2，GM-CSF，IL12等)。在治疗癌的有治疗意义的蛋白的编码基因中，也很重要的是强调指出抗体，简单链抗体的各种片段(ScFv)，或在肿瘤治疗中在免疫治疗应用方面具有检查能力的所有其他抗体片段：抗-RAS抗体(WO9429446)。
有利地，可以涉及其表达可引起肿瘤细胞辐射敏感性的基因，如p53基因。
通过将一种或多种这些基因导入含有NIS转运蛋白的编码基因的腺病毒载体中或导入病毒或非病毒的分离载体中，可以实现这些基因的施用或上述这些具有治疗意义的基因的两种或多种组合的施用。
根据另一个变通方案，本发明的载体可以与抗癌剂，例如特别是红豆杉醇、taxotère和其他taxo
Figure A0080859000151
de[例如具体地在US4857653；US4814470；US492401l；US5290957；US5292921；US5438072；US5587493；EP0253738和WO91/17976，WO93/00928，WO93/00929和WO9601815中描述的那些]或与其他抗癌治疗剂如顺铂和铂的衍生物，鬼臼乙叉苷与鬼臼乙叉苷磷酸酯，博来霉素，丝裂霉素C，CCNU，阿霉素，红比霉素，去甲氧柔红霉素，异环磷酰胺等结合施用。
本发明还涉及一种药物组合物，该组合物含有上述腺病毒载体和生理学上可接受的赋形剂。本发明的药物组合物优选地呈可注射形式并且可依据肿瘤内用药或口服．肠胃外、鼻内、动脉内、静脉内、气管内用药进行配制。
优选地，该药物组合物含有用于通过肿瘤内途径给药的配方的在药学上可接受的赋形剂。
本发明的组合物可以含有本领域技术人员根据目的应用以及不同的参数，特别是根据所用给药方式或寻求的表达时间很容易采纳的不同剂量的重组腺病毒。一般地，本发明重组病毒制以含有104-1014pfu、优选地106-1011pfu的剂量形式进行配制或给药。术语pfu(噬斑形成单位)对应于病毒感染能力，并可通过感染适当细胞培养物进行测量，是感染细胞的斑点数的度量。病毒溶液中pfu值的测定技术已被充分收集在文献中。
另外，本发明的组合物还可以含有化学或生物化学转移剂。术语“化学或生物化学转移剂”应当被理解为促进核酸渗透到细胞中的(即除了重组病毒之外)任何化合物。可以涉及阳离子的非病毒剂，如阳离子脂类，肽，聚合物(聚乙烯亚胺，聚赖氨酸)，纳米粒子；或非阳离子的非病毒剂，如非阳离子的脂质体，非阳离子的聚合物或纳米粒子。
根据优选方式，本发明的组合物含有缺损重组载体，该载体含有碘转运蛋白NIS的编码基因，并且该组合物可配制成供肿瘤内给药的形式。有利地，本发明的组合物含有1O4-1O15pfu，优选地1O7-1O12pfu。
本发明还涉及适用于预防、改善和/或治疗肿瘤的药物的制备方法，其特征在于将含有用于编码碘转运蛋白(NIS)的核酸的重组载体与一种或多种相容并且药学上可接受的佐剂混合。
本发明还涉及一种哺乳动物，特别是人的肿瘤治疗方法，该方法包括施用有效量的缺损重组腺病毒载体，该载体含有用于编码碘转运蛋白(NIS)的核酸。
术语“有效量”应当表示足以使肿瘤体积减小至少约15％，优选地是至少50％，更优选地是至少90％的量，更优选地表示施用含有用于碘转运蛋白(NIS)的编码核酸的腺病毒与通过碘135代谢放射性治疗法完成的治疗相配合时足以消除肿瘤的量。
本发明涉及肿瘤的治疗，更特别地涉及实体肿瘤的治疗。在可以采用本发明组合物治疗的实体肿瘤中，特别可以列举肉瘤和癌瘤以及作为非限制性实例被列举的纤维肉瘤，骨原性肉瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管肉瘤，Ewing瘤，结肠癌，胰腺癌，卵巢癌，前列腺癌，腺癌，肾癌，肝癌，胆管癌，Wilms瘤，宫颈癌，睾丸癌，肺癌，非小细胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，神经胶质瘤，星形细胞瘤，黑色素瘤，成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
本发明还涉及预防和/或治疗上皮组织如宫颈、食管和肺的上皮组织增生病症(如组织转化和displasies)。对此，本发明涉及在向瘤形成或癌发展之前，特别是在如增生、组织转化的非瘤形成细胞生长，更特别地产生displasies的状态下，已知或可疑症状的处理(为了查看这些非正常生长症状，可参见Robbin和Angell，1976，《基础病理学》(Basic Pathology)，第2版，W.B.Saunders公司，费城，第68-79页)。增生是一种可控制的细胞繁殖形式，它涉及在器官中细胞数量的增加，而这种器官没有严重的结构或功能变化。例如，子宫内膜增生可在子宫内膜癌之前发生。组织转化是一种细胞生长的可控制形式，其中一类成熟细胞或完全分化的细胞被另一类细胞取代。在上皮组织中或在结缔组织中可以产生组织转化。Displasies往往是一种癌的预兆信号，并主要出现在上皮中；这便是非瘤形成细胞生长最常见的形式，因此牵涉到失去单个细胞均匀性，还失去细胞的结构取向。存在慢性刺激或炎症时，典型地产生Displasies，并且往往在宫颈中，甚至呼吸道，口腔与膀胱壁上观察到Displasies。参见Fishman等人，1985，《药物》(Medicine)，第2版，J.B.Lippincott公司，费城。
通过下述实施例更详细地描述本发明，这些实施例应该认为是说明性的和非限制性的。
附图说明
图1：pAB1质粒pXL3048质粒和pAB2质粒的图。pXL3048质粒包含5型腺病毒基因组左端(核苷酸1-382)，多接头包含三个克隆特异性位点和一部分pIX基因(核苷酸3446-4296)。pAB2质粒是由在通过EcoRV预先线性化的pXL3048中pAB1的SspI-EcoRV片段克隆得到的。
图2：根据Crouzet等人(PNAS，第94卷，第1414页，1997年)描述的方法，由pAB2和pXL3215质粒经双重组制备pXL3215质粒的过程。pXL3215质粒含有E1和E3区缺失的5型腺病毒基因组，还含有NIS表达盒。
图3：用Ad-NIS载体感染的FTRL-5和SiHa细胞积累碘125的动力学(感染复数为10)。以每106个细胞每分钟的次数表示动力学结果。在与碘接触时每个孔的细胞数测量值是两次测量的平均值。
图4：在30、300和3000微摩尔高氯酸盐(NaClO4)存在下，NIS运送碘的特异性抑制作用。细胞与碘125的接触时间是15分钟。
图5：通过由Ad-NIS载体感染的肿瘤在体内积累碘。对裸鼠皮下注射MCF-7细胞(5×106个人的乳腺癌肿瘤细胞)。在15天后(肿瘤出现开始)，在15天期间内，每天腹膜内注射甲状腺素(2微克/动物/天)。然后某些动物在肿瘤内注入Ad-CMV-NIS载体(2×109pfu/肿瘤；肿瘤大小为3-6毫米)。注射后三天，在鼠的腹膜内注射6微居里125I。把探测器放在甲状腺、肿瘤上和正好在肿瘤附近，以10秒有规律的时间间隔进行计数。这些结果以检测计数脉冲(测量10秒钟)随时间的变化表示。
图6：对其肿瘤经过Ad-NIS载体感染的鼠获得的闪烁扫描图。对裸鼠皮下注射MCF-7细胞(5×106个人的肿瘤细胞，乳腺癌)。在15天后(肿瘤出现开始)，在15天期间内，每天腹膜内注射甲状腺素(2微克/动物/天)。然后在肿瘤内注入Ad-NIS载体(2×109pfu/肿瘤；肿瘤大小为3-6毫米)。注射后三天，在鼠的腹膜内注射50微居里123I。在注入碘后1小时进行计数。其轮廓是动物的腹部图。
材料与方法
分子生物学的一般技术
分子生物学中使用的常规方法，例如质粒DNA的制备提取，以氯化铯梯度表示的质粒DNA离心分离，采用琼脂糖或丙烯酰胺凝胶进行的电泳，采用电洗脱进行的DNA片段纯化，用酚或酚-氯仿提取蛋白，用乙醇或异丙醇在盐介质中沉淀DNA，在大肠杆菌中转化等，都是本领域技术人员熟知的，并且文献作了大量描述[Maniatis T等人，“分子克隆，实验室手册”，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1982；Ausubel F.M.等人(编著)，“分子生物学的通用规程”，John Wiley &Sons，纽约，1987]。
关于连接，根据DNA片段的大小，采用琼脂糖或丙烯酰胺凝胶的电泳分离这些DNA片段，用苯酚或苯酚/氯仿混合物提取，在乙醇中沉淀，然后在根据供应商推荐的噬菌体T4(Biolabs)的DNA连接酶存在下培养。
根据供应商的说明书，用大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段对凸出的5’端填平。在根据生产者建议使用的噬菌体T4(Biolabs)的DNA聚合酶存在下破坏凸出的3’端。通过借助核酸酶S1进行的处理破坏凸出的5’端。
根据Taylor等人[《核酸研究》(Nucleic acid Res.)，13(1985)8749-8764]研制的方法，使用Amersham提供的试剂盒，用合成的寡脱氧核苷酸进行体外诱变。
根据生产者的说明书，使用“DNA热循环仪”(Perkin Elmer Cetus)，采用所述的PCR技术进行DNA片段的酶促扩增[聚合酶催化的链反应，Saiki R.K.等人《科学》，230(1985)1350-1354；Mullis K.B.和Faloona F.A.，酶方法(《Meth.Enzym.》)，155(1987)335-350]。
采用Sanger等人研制的方法[美国国家科学院(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，74(1977)5463-5467]，使用Amersham提供的试剂盒，确认核苷酸序列。
实施例
实施例1：构建表达碘的特异性转运蛋白(Na+/I-同向转运蛋白)NIS的编码基因的缺损重组腺病毒。
该实施例描述构建带有碘的特异性转运蛋白(Na+/I-同向转运蛋白)NIS的编码基因(参见Genbank U60282)的缺损腺病毒载体，该基因以操作方式与CMV启动子连接。
含有鼠的nis基因序列的74-2046核苷酸的片段(Dai等人，1966，《自然》，379：458-460)，在pCEP-4质粒(Invitrogen)的PvuII-HindIII位点克隆形成AatII-HindIII片段形式。在插入pCEP-4质粒中之前，通过绿豆核酸酶(Biolabs)处理，事先使AatII-HindIII片段的位点AatII带有游离端。得到的质粒被称作pAB1。
pAB1质粒(图1)包含nis基因，其表达置于CMV巨细胞病毒的增强子/启动子(-522至+72核苷酸)的控制下(Boshart等人，1985《细胞》，41：521-530)，接着在SV40病毒的聚腺苷酸化位点的控制下(SV40基因组的2538-2759核苷酸，Genbank基因座SV4CG)。
由①巨细胞病毒的增强子/启动子、②nis基因的cDNA和③SV40病毒的聚腺苷酸化位点形成的整体在下面被称作NIS表达盒。
含有上述NIS表达盒的pAB1质粒的SspI-EcoRV片段(3711bp)然后在预先用EcoRV线性化的pXL3048梭子载体中进行克隆。得到的载体被称作pAB2(图2)。pXL3048质粒是一种由Kan-SacB质粒衍生得到的质粒(Crouzet等人，PNAS，第94卷，第1414-1419页，1997年)，包含5型腺病毒的基因组(1-382核苷酸)左端，多接头包含三个特异性克隆位点和一部分pIX基因(3446-4296核苷酸)。
根据Crouzet等人(PNAS，第94卷，第1414-1419页，1997年)描述的方法，通过在pAB2质粒与pXL3215质粒之间同源重组构建了Ad-NIS腺病毒。
pXL3215质粒含有腺病毒基因组，而后者含有插入其E1区(ΔE1 386-3446)的RSV-LacZ盒和在E3区(ΔE3 28592-30470)的缺失。
在图2中描述了这种构建的原理。由这种双重组产生的pXL3215质粒含有E1和E3区缺损5型腺病毒基因组，该基因组还含有CMV-NIS-poly A SV40表达盒。通过NIS表达盒的序列作用证实了这种构建。
通过由293细胞系(ATCC CRL-1573)中被PacI消化的pXL3215的DNA感染产生了Ad-NIS腺病毒。得到的病毒颗粒然后在此同样的细胞系中扩增，得到的病毒原种采用CsCl双梯度进行纯化。
这些病毒颗粒然后用于研究在不同肿瘤细胞系中NIS基因的表达。
实施例2：在体外由Ad-NIS载体感染肿瘤细胞积累碘
对不同细胞系试验了用Ad-NIS载体感染的细胞中碘的积累能力：SiHa上皮肿瘤细胞(ATCC HTB-35)，MCF7(ATCC HTB-22)和T-47D(ATCC HTB-133)乳腺肿瘤细胞，DU-145(ATCC HTB-81)和PC-3(ATCC CRL-1435)前列腺源肿瘤细胞。
使用Ad-NIS载体以感染复数10感染细胞。根据Weiss等人的方法[《内分泌学》(1984)114：1090-1098]，在感染后28-29小时检测细胞俘获碘的能力。这些感染的细胞用HBSS缓冲溶液洗涤，再与0.5毫升含有0.1微居里碘125的HBSS缓冲溶液接触达图3所示的时间。接触后，这些细胞用冷的HBSS缓冲溶液洗涤一次，然后与冷的乙醇一起培养20分钟。通过采用γ计数器测定乙醇的放射性剂量测量细胞俘获碘125的数量。
用SiHa细胞系得到的结果列于图3，并且与用FRTL-5细胞(大鼠的甲状腺细胞，自然地俘获碘并用作对比)得到的结果进行比较。
在高氯酸盐存在下，检测NIS运送碘的特异性抑制作用。在含有碘125的HBSS缓冲溶液中添加NaClO4，使其最后浓度达到30、300和3000微摩尔。细胞与碘125的接触时间是15分钟。这些结果列于图4中。这些结果以相对于同样细胞数的计数脉冲表示。
FRTL-5细胞(正对比)固定一定量的碘，并且观察到这种现象是非常快的(在接触15分钟后几乎达到最高)。所得到的结果表明未感染的SiHa细胞(人的上皮肿瘤细胞)不俘获碘。令人惊奇地，观察到用Ad-NIS载体感染的SiHa细胞与FRTL-5细胞相比俘获碘多达5倍。还应该提到，该现象的起始动力学与对FRTL-5细胞所观察到的相似。通过使用不含nis基因的对比腺病毒实现的感染可证实转移的特异性(未列出结果)。
抑制试验结果(图4)表明，用30微摩尔的NaClO4浓度抑制FRTL-5细胞中碘的固定达90％以上(30微摩尔为93％，更高浓度为95％)。值得指出的是，相反，对于用Ad-NIS感染的SiHa细胞，达到同样抑制率所必需的抑制剂浓度高得多(30微摩尔NaClO4抑制作用仅40％，300微摩尔NaClO4抑制作用为92％，3毫摩尔NaClO4抑制作用为98％)。
该抑制试验还给出如下结论：用Ad-NIS感染的SiHa细胞俘获碘的能力完全由于在这些细胞中NIS的表达，因为该现象是受NaClO4抑制的，而NaClO4是一种通过NIS运送碘离子这一过程的竞争性和特异性抑制剂。人的其他肿瘤细胞系曾得到类似的结果(乳腺肿瘤细胞：MCF-7和I47-D，以及前列腺源肿瘤细胞：DU-145和PC-3)。
NaClO4抑制结果还证实，Ad-NIS感染肿瘤细胞达到的NIS表达水平特别高，因为抑制这种现象需要很高的NaClO4浓度(在SiHa细胞的情况下，与FRTL-5细胞相比，要达到同样的抑制率，需要高10倍的抑制剂浓度)。
所有这些结果证明腺病毒载体是一种对nis基因转移特别有利的载体，还证明，使用这样的载体达到的在非甲状腺肿瘤细胞中碘的积累水平，比自然俘获碘125细胞所观察的结果高5倍。
实施例3：通过由Ad-NIS载体感染的肿瘤细胞在体内积累碘
对裸鼠皮下注射MCF-7细胞(5×106个人的乳腺癌肿瘤细胞)。在15天后(肿瘤出现开始)，在15天期间内，每天腹膜内注射甲状腺素(2微克/动物/天)，以便使动物的甲状腺处于停止工作的状态。然后某些动物被肿瘤内注入Ad-NIS载体(2×109pfu/肿瘤)；在注射时肿瘤直径为3-6毫米。注射后三天，在鼠的腹膜内注射6微居里125I。用探测器以10秒时间间隔进行计数，该探测器可以在动物的不同部位移动。把探测器放在甲状腺、肿瘤上和正好在肿瘤附近，以有规律的时间间隔进行计数。图5给出了结果，这些结果以检测计数脉冲(测量10秒钟)随时间的变化表示。
在对照动物(未施用Ad-NIS)中，甲状腺固定了少量碘，但是由于经过甲状腺素处理，未观察到随着时间改变，碘在甲状腺中大量积累。未观察到碘在对照动物的肿瘤中的固定作用(参见图5A)。NIS自然地存在于胃中的事实，以及通过尿道除去碘的事实可解释所观察到的相对高值的原因(相对大的背景噪声)。
通过在肿瘤内使用Ad-NIS得到处理的动物(图5B)未呈现其甲状腺中有大量碘积累(用甲状腺素处理的效果)。对于这些动物，通过将探测器放在肿瘤上所检测的碘量，系统地比在肿瘤附近所检测的碘量更高，这表明在用Ad-NIS载体处理后，在肿瘤中确实存在着碘固定作用。
为了证实碘在肿瘤中的固定作用，采用闪烁扫描法对通过Ad-NIS载体处理的动物测量放射性。得到的结果列于图6。根据上述的实施方案准备使用的动物，只是在腹膜内注射50微居里123I；在注射碘后1小时得到图象。
其图形是动物腹部图。可见到四个固定碘的区域：甲状腺，膀胱(除去碘的路径)，胃(其中自然表达NIS)和肿瘤。这些闪烁扫描结果证实了采用计数法得到的上述结果，并且表明本发明的载体能够实现在肿瘤中大量固定碘。
实施例4：对通过由Ad-NIS载体感染的肿瘤在体内积累碘进行定量评价
对裸鼠(n＝12)在动物两胁皮下注射SiHa细胞(5×106细胞)。在15天后(肿瘤出现开始)，在15天期间内，每天腹膜内注射甲状腺素(2微克/动物/天)，以便使动物的甲状腺处于停止工作的状态。然后对每只动物的一个肿瘤肿瘤内注入Ad-NIS载体(2×109pfu/肿瘤)；其他肿瘤作为对照肿瘤；在注射时肿瘤直径为5-8毫米。注射后三天，在鼠的腹膜内注射6微居里125I。在施用125I后90分钟杀死动物，测量125I的量。表1列出这些结果。这些结果以每克组织施用的125I的百分数表示。
    鼠       用Ad-NIS处理的肿瘤(％施用125I/每克组织)          对照肿瘤(％施用125I/每克组织)     比值
    123456789101112     9.5316.815.5611.934.2612.9112.765.5310.7514.5210.1010.91     1.750.881.081.511.020.921.161.421.450.850.411.17     5.419.15.17.94.214.011.03.97.417.124.69.3
    10.46±3.79     1.14±0.36     10.8±6.6
得到的结果表明，用Ad-NIS载体处理的肿瘤能够非常有效地积累碘125I，直到与未处理肿瘤相比高出25倍为止。这些结果证实了上述结果，还表明本发明的载体能够实现在肿瘤中大量固定碘。

Claims (18)

1.缺损重组腺病毒，其特征在于它含有至少一个编码碘的特异性转运蛋白(Na+/I-同向转运蛋白)NIS的DNA序列或其衍生物。
2.权利要求1的腺病毒，其特征在于所述DNA序列是cDNA序列。
3.权利要求1的腺病毒，其特征在于所述DNA序列是gDNA序列。
4.权利要求1-3中任一项的腺病毒，其特征在于所述DNA序列编码鼠的碘的特异性转运蛋白(Na+/I-同向转运蛋白)NIS。
5.权利要求1-3中任一项的腺病毒，其特征在于所述DNA序列编码人的碘的特异性转运蛋白(Na+/I-同向转运蛋白)NIS。
6.权利要求1-5中任一项的腺病毒，其特征在于所述DNA序列被置于能够在肿瘤细胞中表达的转录启动子的控制之下。
7.权利要求6的腺病毒，其特征在于所述转录启动子选自病毒启动子，优选地选自E1A、MLP、CMV和LTR-RSV、MT-1、SV40启动子。
8.缺损重组腺病毒，它含有在CMV启动子控制下编码人的碘转运蛋白NIS的cDNA序列。
9.缺损重组腺病毒，它含有在能够在肿瘤细胞中主要表达的启动子控制下编码碘转运蛋白NIS的cDNA序列或者其衍生物。
10.权利要求9的缺损重组腺病毒，其特征在于所述启动子选自弹性蛋白酶I基因的调节序列、胰岛素基因的调节序列、免疫球蛋白基因的调节序列、鼠的乳腺肿瘤病毒基因的调节序列、PSA基因调节序列、α-胎儿蛋白基因的调节序列、α-1抗胰蛋白酶基因的调节序列、β-球蛋白基因的调节序列、碱性髓磷脂基因的调节序列、肌球蛋白轻链2基因的调节序列和促性腺激素释放激素的基因的调节序列。
11.权利要求1-10中任一项的腺病毒，其特征在于它包含至少一种E1区的全部或部分缺失和E4区的全部或部分缺失。
12.权利要求11的腺病毒，其特征在于它还包含E4区的全部或部分缺失。
13.权利要求1-12中任一项的腺病毒，其特征在于它涉及Ad2或Ad5类型人的腺病毒或CAV-2类型犬的腺病毒。
14.权利要求1-13中任一项的腺病毒，其特征在于它还包含至少一个在过氧化酶体系中涉及的多肽的编码基因如葡糖氧化酶或甲状腺过氧化酶基因。
15.权利要求1-14中任一项的腺病毒在制备用于治疗和/或抑制肿瘤生长的药物组合物中的应用。
16.药物组合物，它含有一种或多种权利要求1-14中任一项的缺损重组腺病毒。
17.权利要求16的药物组合物，其特征在于它呈可注射形式。
18.权利要求16或17的药物组合物，其特征在于它含有104-1014pfu/毫升，优选地106-1011pfu/毫升缺损重组腺病毒。
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