MXPA01012004A - Adenovirus recombinantes que codifican para el transportador especifico del yodo. - Google Patents

Abstract

La presente invencion concierne al campo de la terapia genetica y al tratamiento de tumores. La invencion concierne mas particularmente a la introduccion de un gen que codifica para el transportador especifico del yodo (Proteina de transporte Na+/I-) NIS en celulas tumorales por medio de un vector adenoviral para favorecer la acumulacion de yodo en estas celulas. La invencion concierne igualmente a los adenovirus recombinantes defectuosos para la replicacion que comprenda al gen nis y la utilizacion de estos vectores en un metodo de tratamiento de los canceres que asocia la transferencia- del gen nis en celulas tumorales y la radioterapia metabolica.

Description

ADENOVIRUS RECOMBINANTES QUE CODIFICAN PARA EL . TRANSPORTADOR ESPECIFICO DEL YODO DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención concierne al campo de la terapia genética y al tratamiento de los tumores. La invención concierne más particularmente a la introducción de un gen que codifica para el transportador específico del yodo (Proteína de transporte (conocida como wsymporteur" ) NaV I"), NIS en células tumorales por medio de un vector adenoviral para favorecer a la acumulación de yodo en estas células. La invención concierne igualmente a los adenovirus recombinantes defectuosos para la replicación que comprende el gen ni s y al utilización de estos vectores en un método de tratamiento de los cánceres que asocian la transferencia del gen ni s en células tumorales y la radioterapia etabólica por el yodo 131. El yodo 131 se utiliza desde hace más de cincuenta años en el tratamiento de los cánceres diferenciados de la tiroides. Su eficiencia terapéutica está relacionada con la dosis de radiación liberada en el tejido tumoral. Por ejemplo en el caso de metástasis, se observó una respuesta tumoral después de tratamiento por el yodo cuando la dosis liberada al nivel del tejido tumoral es superior a 80 gray mientras que la proporción de respuesta tumoral es débil o nulo para dosis inferiores a 35 grays [Maxon, NEJM, 309: 937- REF: 133853 941, 1983]. Se puede, generalmente estimar que las dosis totales necesarias para tratar o reducir el volumen de un tumor varían entre 40 y 60 grays en función de su radiosensibilidad. Esta dosis total puede ser liberada en el caso de varios tratamientos por el yodo 131, como se realiza en el caso del tratamiento de las metástasis fijadoras de cáncer tiroidiano diferenciado. La dosis de radiación liberada en el tejido tumoral depende de dos factores biológicos: la media vida efectiva (Tef) del yodo 131 en el tejido tumoral y la concentración radioactiva . - la media vida efectiva (Tef) del yodo 131 en el tejido tumoral depende de la media vida biológica (Tb?oi) y de la media vida física (Tfl?) según la relación . La media vida biológica (Tblo?) del yodo 131 en las células fijadoras depende de su capacidad de organificación del yodo. En ausencia de la organificación, como por ejemplo en las células ' no tiroidianas, la media vida biológica es breve, de algunas horas a algunas decenas de horas. La media vida física (Tfls) del yodo 131 es de 8.02 días. Así, se puede estimar lo mejor posible, que la media vida efectiva del yodo 131 en un tejido tumoral es de algunas horas a algunas decenas de horas. - la concentración radioactiva es la relación entre la fijación global del yodo 131 por el tejido tumoral y la masa ,ai de este tejido. A título de ejemplo, para una fijación de yodo de 0.1 % de la actividad administrada para 1 g de tejido y una vida media efectiva de 1.5 días, se puede estimar que la administración de 3.7 gigabecquerels (o 100 mCi) libera una dosis de 30 grays en el tejido tumoral. La fijación global de yodo 131 es un parámetro que depende por una parte, de la actividad del yodo 131 administrada - al paciente y por otra parte, de las capacidades del tejido tumoral para concentrar el yodo 131. La actividad máxima de yodo 131 que puede ser administrada a un paciente está limitada por la toxicidad de yodo del yodo 131 que resulta de las dosis de irradiación liberadas en los tejidos sanos y particularmente en la médula ósea. Así en caso de cáncer de la tiroides, las actividades terapéuticas administradas, en el caso en el que los pacientes estén en estado hipertiroideo, están en general comprendidas entre 3.7 y 10 GBq (100 a 300 mCi).Las actividades máximas que pueden ser administradas a pacientes eutiroidianos son más elevadas ya que la retención del yodo es entonces dos veces inferior a la observada en caso de hipotiroidismo) , alcanza los valores comprendidos entre 8.5 y 22.2 GBq (500 a 600 mCi) . - La capacidad del tejido tumoral de concentrar el yodo 131, para una actividad determinada administrada al ^isaa ... a-., » paciente, depende del nivel de expresión del conjunto portador del yodo y de su actividad biológica. Esto se ha demostrado por el estudio de los tejidos tiroidianos humanos normales y patológicos y por estudios in vi tro de la actividad del NIS. Estando elevada la actividad específica del yodo 131 , no se observó el fenómeno de saturación con aumento de la actividad de yodo 131 administrada. En razón de la misma limitación de la actividad máxima de yodo 131, que pueda ser administrada al paciente, sería deseable poder acrecentar la capacidad del tejido tumoral para concentrar el yodo 131 para aumentar la fijación global del yodo 131. Es igualmente determinante que el aumento de la fijación del yodo se haga de manera homogénea al nivel del tejido tumoral. En efecto, la fijación del yodo en un tejido fijador puede ser muy heterogénea de una célula a otra, hasta de una zona tumoral a otra. La dosis de irradiación al nivel del tejido tumoral es liberada esencialmente por emisión ß del yodo 131. O, su recorrido en los tejidos biológicos está al máximo de 2 a 3 mm. Además, alrededor de una fuente puntual, la dosis de irradiación disminuye de manera exponencial con la distancia. Estos elementos refuerzan la importancia de alcanzar una fuerte concentración radioactiva al nivel de las zonas tumorales fijadoras y por otra parte, la necesidad de obtener una t. ,L A,?* &*• **&*&** i ,á fijación de yodo tan homogénea como sea posible. Hay que notar que la fijación del yodo 131 por la tiroides humana, y entonces su irradiación, puede ser suprimida fácilmente (fijación del yodo 131 no medible) por la administración de L-triyodo tironina 1 µg/kg/día dividida en tres tomas cotidianas durante tres semanas. El transportador NIS es responsable de la concentración de yodo que circula (bajo la forma de yoduro I") por los tireocitos [para una revisión ver P. Thomopoulos, Medecine et Science, vol. 4(10), p. 825-828]. La concentración del yodo en estas células presenta las características siguientes: el yodo es concentrado en un factor de 30 a 40 veces contra un gradiente electroquímico; lo que requiere la presencia de sodio (Na+) ; se trata de un transporte activo, que es inhibido de manera competitiva por ciertos aniones, tales como el tiocianato, el perclorato, el pertecnetato . La concentración de iodo por los tireocitos es seguida de la organificación del yodo y la síntesis de iodotirosinas y de hormonas tiroidianas (tirosinas T4 y triyodotironina T3) . Los genes que codifican para el transportador murina [Dai y colaboradores, Nature 379: 458- 460 (1960)] y el transportador humano [Smanik P. A. y colaboradores Biochem. Biophys. Res. Común. 226: 339- 345 (1996)] del yodo NIS han sido aislados, son idénticos en 84 %. El gen está localizado sobre el cromosoma 19p en la especie humana. Consta de 15 fctéias-»&.¿ >¿ i¿. exones separados por 14 intrones. Su transcripción da nacimiento a dos formas de empalme alternativo, cuya forma larga predomina en la tiroides. La proteína tiene un peso molecular de 55 kDa, que alcanza 80 kDa después de glicosilación. Esta localizada en la membrana laterobasal de los tirocitos. Sus extremos aminoterminal y carboxiterminal son intracelulares mientras que el resto de la cadena peptídica, consta de 13 segmentos transmembranarios reunidos por desviaciones intracelulares y extracelulares [Levy y colaboradores, 1998, J. Biol. Chem. 273: 22657-22663]. La introducción del gen que codifica para NIS en células no tiroideas le_ confiere la capacidad de captar el yodo, con las mismas propiedades que los tirocitos, en particular la presencia obligatoria de sodio (Na+) y la inhibición por los aniones percloratos. La trancripción del gen nis es activada en los tirocitos por la TSH. Este efecto es mediado por la AMP cíclica. La media vida de la proteína, en los tirocitos murinos es de 4 días [Paire A. Y colaboradores, J. Biol. Chem. 272: 18245 - 18249 (1997)]. En los tejidos extratiroidianos, la actividad del gen es más débil que la de la tiroides en el estado basal. Esto es verdaderamente debido a la estimulación de la transcripción del gen ni s en los tirocitos, por el factor específico de transcripción TTF-1 Tthyroid transcription factor 1", factor de ^ial 4 J 1 fe-^a transcripción de la tiroides 1), que puede relacionarse al promotor del gen ni s tiroidiano, pero no al de los otros tejidos [Endo- T. y colaboradores, Mol. Endocrinol. 11: 1747- 1755 (1997)]. Además de la tiroides, ciertos tejidos son 5 capaces de captar y de concentrar el yodo particularmente las glándulas salivales y la mucosa gástrica. Un estudio reciente relaciona la transferencia del gen nis por medio de un vector retroviral en células tumorales humanas o murinas [Mandell y colaboradores. Cáncer Research 10 59: 661- 668 (1999)]. Estos resultados son interesantes porque muestran que es posible expresar el gen nis en células no tiroidianas y observar una concentración del yodo en células que no acumulan este elemento naturalmente. No obstante, un cierto número de factores limitantes quedan por 15 vencer a fin de alcanzar un nivel de fijación de yodo suficiente para contemplar una aplicación terapéutica. Un primer factor es el débil nivel de expresión del gen ni s al nivel de las células tumorales. Por ejemplo, en el estudio anteriormente citado, los resultados in vi tro 20 muestran que la concentración de yodo alcanza en las células tumorales no tiroidianas queda aproximadamente dos veces inferior a la concentración de yodo acumulado en las células tiroidianas. Además, considerando perturbaciones importantes que 25 presentan las células tumorales al nivel membranario, parece ^^»^1Mit fTf^-t- - > . „ t í i 4 difícil asegurar la integración funcional de un transportador con una eficiencia comparable a la de las células tiroidianas no tumorales. Otro factor limitante es la ausencia de organificación del yodo al nivel de las células no tiroidianas, o esta organificación del yodo es un elemento necesario al mantenimiento del yodo en las células. Así, en el estudio reportado anteriormente, se observa un efluvio muy rápido del yodo acumulado in vi tro (entre 30 y 60 minutos) para las células no tiroidianas. Finalmente teniendo en cuenta la heterogeneidad de las células tumorales y modificaciones importantes de estas células al nivel membranario, parece difícil poder alcanzar una repartición homogénea del transportador NIS al nivel de las membranas de las células tumorales. Así, ningún procedimiento descrito hasta la fecha ha permitido alcanzar una acumulación de yodo al nivel de tumor no tiroidiano con un nivel de expresión suficiente para contemplar la utilización del yodo 131 para el tratamiento de los tumores no tiroidianos. La presente invención presenta un método mejorado de tratamiento de los tumores que combina la terapia genética y la radioterapia con el yodo 131. La presente invención describe en particular un método que permite aumentar la eficiencia de la fijación del yodo '..J^.. ..„ ...... .... ...» -., ...^.^.. -^ . - ,..„ • • - M^^ al nivel de los tumores no tiroidianos y que permite también aplicar a los tumores no tiroidianos, los principios de radioterapia desarrollados con éxito para los tratamientos de cánceres tiroidianos. La presente invención resulta de poner en evidencia que la transferencia del gen que codifica para el transportador específico del yodo (Proteína de transporte Na+/I~) NIS por medio de un adenovirus recombinante defectuoso permite alcanzar una acumulación de yodo muy importante al nivel de células tumorales no tiroidianas. En una modalidad de realización específica, la aportación de un adenovirus defectuoso que expresa al gen ni s, permite acumular el yodo en concentraciones aproximadamente cinco veces superiores a las observadas en las células tiroidianas. Esta capacidad sorprendente . de las células tumorales no tiroidinas de acumular el yodo 125, permite contemplar para este tipo de tumores un nuevo procedimiento terapéutico basado en la radioterapia metabólica por el yodo 131; procedimiento hasta entonces reservado al tratamiento de ciertos tumores tiroidianos. El interés principal de la radioterapia metabólica es liberar dosis de irradiación importantes en los tejidos que fijan el isótopo radioactivo, sin irradiar significativamente los tejidos circundantes. El descubrimiento de que es posible efectivamente tií -ia.ii .....i. , J^J . .¡?u?«i A- concentrar de manera importante el yodo, en células tumorales que son normalmente incapaces de acumular este elemento permite contemplar la aplicación de este método en numerosas indicaciones para el tratamiento de los tumores de 5 origen no tiroidiano. Dos tipos de indicaciones son más particularmente contempladas: los tumores difícilmente accesibles a la radioterapia externa en razón de su localización, a título de ejemplo se puede * citar los cánceres de la próstata inoperables o los tumores 10 intracerebrales; los tumores que hayan ya sido irradiados y para los cuales un complemento de radioterapia externa es imposible, ya que las dosis máximas han sido ya liberadas: esto concierne a todos los cánceres que sobrevienen o recaen en zonas irradiadas. Este método es igualmente 15 aplicable al tratamiento de los tumores tiroidianos que hayan perdido la capacidad de captar el yodo y que no responden a la terapia metabólica. Es igualmente contemplable combinar la radioterapia metabólica y- la radioterapia externa como es realizado en 20 casos de metástasis de cáncer diferenciado de la tiroides. Esta combinación permite aumentar la eficiencia terapéutica de la radioterapia, sin aumentar la toxicidad. Esta combinación parece particularmente interesante para los tumores poco sensibles a la radioterapia. Por otra parte, 25 permite contemplar la aplicación de esta técnica a tumores WSI tHmm 1*. ».??Ji?..*¡A ¿.L-a.*¡t » ...-. ^ ... ^-^t^ que no serían accesibles a la radioterapia metabólica sola, en razón de su tamaño demasiado importante. Un primer objeto de la invención reside entonces en un adenovirus recombinante defectuoso que comprenda al menos una secuencia de ADN heteróloga que codifica para el transportador' específico del yodo (Proteína de transporte Na+/I") NIS, o uno de sus derivados. En el sentido de la presente invención, se entiende por * derivado" del transportador específico del yodo (Proteína de transporte Na+/I") NIS, todo análogo, fragmento o forma mutada que se derive del polipéptido N1S y que conserve una actividad de transporte específico del yodo. Diferentes derivados pueden existir en el estado natural. Estos derivados pueden ser variaciones alélicas caracterizadas por diferencias en la secuencia nucleotídica de los genes de estructura que codifica para el NIS o pueden resultar de un empalme diferencial o de modificaciones post-transduccionales . Estos derivados pueden obtenerse por substitución, eliminación, adición y/o modificación de uno o varios residuos aminoácidos. Estas modificaciones pueden realizarse por todas las técnicas conocidas por el experto en la materia. Estos derivados son particularmente moléculas que tengan una mayor afinidad por sus substratos, secuencias que permitan una expresión mejorada in vi vo, moléculas que presenten una mayor resistencia a las proteasas, moléculas l JíJ. Á &.£-- &;l-& ^S te f A í S que tengan una eficiencia biológica más grande o efectos secundarios menores, o eventualmente nuevas propiedades biológicas. Otros derivados utilizables en el marco de la invención son particularmente las moléculas en las cuales 5 uno o varios residuos han sido substituidos, los derivados obtenidos por eliminación de las regiones que no intervienen o intervienen poco en la interacción con los sitios de unión considerados o que expresan una actividad indeseable, y los derivados que constan, en relación a la secuencia nativa, de 10 los residuos suplementarios, tales como por ejemplo una señal de secreción y/ó un péptido de unión. El transportador específico del yodo (Proteína de transporte Na+/I~) NIS o su derivado, producido en el marco de la presente invención, puede ser un ADNc, un ADN genómico 15 (ADNg) , o una construcción híbrida que consiste por ejemplo, de un ADNc en el cual estarían insertados uno o varios intrones. Puede igualmente tratarse de secuencias sintéticas o semi-sintéticas . De manera ventajosa, se utiliza un ADNc o un ADNg. En particular, la utilización de un ADNg puede 20 permitir una mejor expresión en las células humanas. Según una primera modalidad de realización, se trata de una secuencia de ADNc que codifica para el transportador específico del yodo (Proteína de transporte Na+/I~) NIS de origen murino. Según una modalidad preferida de la 25 invención, se trata de una secuencia que codifica para el £ gj n»¡ *. aL¿.«.*, transportador específico del iodo (Proteína de transporte Na+/I") NIS, de origen humano. Los adenovirus utilizados en el marco de la presente invención son adenovirus recombinantes, es decir, que comprenden una secuencia de ADN heteróloga. Ventajosamente, se trata de adenovirus recombinantes defectuosos, es decir incapaces de replicación autónoma en las células objetivo. Para la construcción de los adenovirus según la invención, pueden utilizarse diferentes serotipos, cuya estructura y propiedades varían un poco, pero que presentan una organización genética comparable. Más particularmente, los adenovirus recombinantes pueden ser de origen humano o animal. En lo que concierne a los adenovirus de origen humano, se puede citar preferencialmente aquellos clasificados en el grupo C, en particular los adenovirus de tipo 2(Ad2), 5(Ad5), 7 (Ad7 ) o 12(Adl2). Entre los diferentes adenovirus de origen animal, se pueden citar preferencialmente los adenovirus de origen canino, y particularmente todas las cepas de los adenovirus CAV2 [cepa mannhattan o A26/61 (ATCC VR-800) por ejemplo]. Otros adenovirus de origen animal son citados particularmente en la solicitud WO 94//26914. El genoma de los adenovirus comprende particularmente una secuencia invertida repetida (ITR) en cada extremo, una secuencia de encapsidación (Psi), de los genes precoces y de los genes tardíos. Los principales genes precoces están contenidos en las regiones El, E2, E3 y E4. Entre éstos, los genes contenidos en la región El particularmente son necesarios para la propagación viral. Los principales genes tardíos están contenidos en la región Ll a L5. El genoma del adenovirus Ad5 ha sido completamente secuenciado y es accesible en base de datos (ver particularmente Genbank M73260) . Asimismo, partes, hasta la totalidad de otros genomas adenovirales (Ad2, Ad7, Adl2, etc) han sido igualmente secuenciados . Como se indicó anteriormente, los adenovirus según la invención son defectuosos y son pues incapaces de replicarse de manera autónoma en la célula objetivo. Para este efecto, diferentes construcciones derivadas de los adenovirus han sido preparadas, incorporando diferentes genes terapéuticos. En cada una de estas construcciones, el adenovirus ha sido modificado de manera de volverlo incapaz de replicación en la célula infectada. Así, las construcciones descritas en el arte anterior son adenovirus eliminados de la región El, esencial para la replicación viral, al nivel de la cual están insertadas las secuencias de ADN heterólogas (Levrero y colaboradores, Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury y colaboradores, Gene 50 (1986) 161). Por otra parte, para mejorar las propiedades del vector, se ha propuesto crear otras eliminaciones o modificaciones en el genoma del adenovirus. Así, una mutación puntual termosensible se ha introducido en el mutante tsl25, que permite inactivar la proteína de 72 kDa de unión con el ADN (DBP) (Van der Vliet y colaboradores, J. Virola 1975, 15(2) 348-354). Otros vectores comprenden una eliminación de otra región esencial para la replicación y/o para la propagación viral, la región E4. La región E4 está, en efecto, implicada en la regulación de la expresión de los genes tardíos, en la estabilidad de los ARN nucleares tardíos, en la extinción de la expresión de las proteínas de la célula huésped y en la eficiencia de la replicación del ADN viral. Vectores adenovirales en los cuales las regiones El y E4 son eliminadas poseen entonces una interferencia de transcripción y una expresión de genes virales muy reducida. Tales vectores han sido descritos por ejemplo en las solicitudes WO 94/28152, WO 95/02697, WO 96/ 22378. Además, vectores que contienen una modificación al nivel del gen IVa2 ' han sido descritos igualmente (WO 96/10088) . En una modalidad preferida de utilización de la invención, el adenovirus recombinante es un adenovirus humano del grupo C. De manera más preferencial, se trata de un adenovirus Ad2 o Ad5. Ventajosamente, el adenovirus recombinante utilizado en el marco de la invención comprende una eliminación en la región El de su genoma. Aún más particularmente, comprende esa. * t * . ^¿a-lifcáAfc.^. una eliminación de las regiones Ela y Elb. A título de ejemplo, se puede citar eliminaciones que afectarn a los nucleótidos 454-3328, 386-3446, 459-3510 o 357-4020 (en referencia al genoma del Ad5) . Según otra variante, el adenovirus recombinante utilizado en el marco de la invención es defectuoso para todas o parte de las regiones El y E3, al menos. Según otra variante, el adenoviruss recombinante utilizado en el marco de la invención comprende además una eliminación en la región El, una eliminación que afecta toda o parte de la región E4 de su genoma. Más particularmente, la eliminación en la región E4 afecta al conjunto de las fases abiertas. Se puede citar a título de ejemplo preciso las eliminaciones 33466-35535 o 33093-33535 o una parte solamente de la región E4 (ORF6 u ORF3, por ejemplo) , como se describe en las solicitudes WO 95/02697 y WO 96/22378. Puede tratarse por ejemplo de adenovirus recombinantes llamados de tercera generación, es decir defectuosos por las regiones El y E4, en toda o parte, y eventualmente por la región E3. Variantes particulares de la invención están constituidas .por la utilización de adenovirus que contienen las eliminaciones que afectan total o parcialmente a las regiones funcionales siguientes: - El, E4 y E3, - El, E4 y E2, -..!..,t. i- M í - El, E4, E2 y E3, - las regiones anteriores así como todos o parte de los genes que codifican para las funciones tardías del adenovirus (Ll a L5) , o aún, 5 - el conjunto de las regiones virales codificadoras. En lo que concierne a los adenovirus desprovistos además de las funciones tardías (vector wminimun" ) o del conjunto de las regiones codificadorass (vector *gutless" ) , su construcción se describe por ejemplo en Parks y 10 colaboradores PNAS 93 (1996) p. 13565 y Lieber y colaboradores, J. Virol. 70 (1996) p. 8944. Puede tratarse igualmente de vectores adenovirales híbridos tales como aquellos descritos en la solicitud WO 99/60144 y en los cuales el adenovirus es utilizado como 15 vector de otro virus y particularmente como vector de retrovirus . El * cassette" de expresión que contiene el ácido nucleico que codifica para el transportador del yodo (NIS) puede ser insertado en diferentes sitios del genoma 20 recombmante. Puede ser insertado al nivel de la región El, E3 o E4, en reemplazo de las secuencias eliminadas o en exceso. Puede igualmente ser insertado en cualquier otro sitio, afuera de las secuencias necesarias en cis para la producción de los virus (secuencias ITR y secuencia de 25 encapsidación) . ^iiití Éml^m^ímllmiiÉi?-ttii^aá..i..iía^..^^^,^.l^íi^^t^,i*..,......-....tá i^,.. . -, .,^. .., ...... - . . - • .„„. ..„. .,, , . ... .t J ?-.* .L .

En el sentido de la presente invención se entiende por * cassette" de expresión", de un ácido nucleico, un fragmento de ADN que puede ser insertado en un vector en sitios de restricción específicos; el fragmento de ADN comprende, 5 además la secuencia nucleotídica que codifica para un ARN o un polipéptido de interés, las secuencias necesarias para la expresión (mejoradoras, promotoras, secuencia de poliadenilación... ) de la mencionada secuencia de interés. El fragmento de ADN y los sitios de restricción son 10 concebidos para asegurar una inserción de dicho fragmento en un marco de lectura apropiado para la transcripción y/o la traducción . Los adenovirus recombinantes son producidos en una línea de encapsidación, es decir una línea de células 15 capaces de complementar en trans una o varias de las funciones deficientes en el genoma adenoviral recombinante . Entre las líneas de encapsidación conocidas por el experto en la materia, se puede citar, por ejemplo la línea 293 en la cual una parte del genoma del adenovirus ha sido 20 integrada. Más precisamente, la línea 293, es una línea de células embrionarias humanas de riñon que contienen en el extremo izquierdo (aproximadamente 11- 12 %) del genoma del adenovirus serotipo 5 (Ad5) , que comprende el ITR izquierdo, la región de encapsidación, la región El, que incluye Ela y 25 Elb, la región que codifica para la proteína pIX y una parte de la región que codifica para la proteína pIVa2. esta línea es capaz de trans-complementar a los adenovirus recombinantes defectuosos por la región El, es decir desprovistos total o parcialmente de la región El, y de 5 producir * stocks" virales que tengan títulos elevados. Esta línea es igualmente capaz de producir, a temperatura permitida (32 °C) , "stocks" de virus que contengan además la mutación E2 termosensible. Otras líneas celulares capaces de complementar a la región El, han sido descritas, basadas 10 particularmente en células de carcinoma de pulmón humano A549 (WO 94/28152) o en retinoblastos humanos (Hum. Gen. Ther. (1996) 215). Por otra parte, líneas capaces de trans- . complementar varias funciones del adenovirus han sido igualmente descritas. En particular, se puede citar líneas 15 que complementan las regiones El y E4 (Yeh y colaboradores, J. Virol. Vol. 70 (1996) pp 559-565; Cáncer Gen. Ther. 2 (1995) 322; Krougliak y colaboradores, Hum. Gen. Ther. 6 (1995) 1575) y líneas que complementan a las regions El y E2 (WO 94/28152, WO 95/ 02697, WO 95/ 27071) o líneas derivadas 20 de éstas utilizables para producir adenovirus minimun, en particular porque expresan además una actividad de recombinasa sitio específico implicada en la construcción de dichos virus. Los adenovirus recombinantes pueden igualmente ser 25 modificados en la estructura de la cápsida para aumentar la eficiencia de infección al nivel del tumor. Por ejemplo, la cápsida puede contener un ligando de uPAR o un motivo RGD que permita la focalización de los adenovirus hacia las células tumorales de dichos vectores y de las secuencias diana, ha sido descrita particularmente en la solicitud WO 00/12738. Las secuencias diana pueden ser insertadas en la proteína del hexon o en la proteína de la fibra. De preferencia las secuencias diana son insertadas al nivel de eliminación de la proteína de la fibra o del hexón. La secuencia polipeptídica del hexon es ventajosamente eliminada de 13 aminoácidos correspondientes a las posiciones 279 a 292 de la secuencia polipeptídica del hexon de Ad 5. la secuencia polipeptídica de la fibra es ventajosamente eliminada de 11 aminoácidos correspondientes a las posiciones 539 a 547 de la secuencia polipeptídica de la fibra (HI Loop) de Ad 5. Los adenovirus recombinantes son habitualmente producidos por introducción del ADN viral en la línea de encapsidación, seguido por una lisis de las células después de aproximadamente 2 o 3 días (siendo la cinética adenoviral de 24 a 36 horas) . Para la utilización del procedimiento, el ADN viral introducido puede ser el genoma viral recombinante completo, eventualmente construido en una bacteria (WO 96/ 25506) o en -una levadura (WO 95/ 03400), infectada en las células. Puede igualmente tratarse de un virus recombinante . A ¿?j JSJÍJ,J .... utilizado para infectar la línea de encapsidación. El ADN viral puede también ser introducido bajo la forma de fragmentos que contienen cada uno una parte del genoma viral recombinante y una zona de homología que permita, después de introducción en la célula de encapsidación, reconstituir el genoma viral recombinante por recombinación homologa entre los diferentes fragmentos. Después de la lisis de las células, las partículas virales recombinantes pueden ser aisladas por toda técnica conocida tal como la centrifugación en gradiente de cloruro de cesio o la cromatografía. Un método alternativo ha sido descrito en la solicitud WO 98/ 00528. Secuencias de regulación de expresi ón . El gen que codifica para el transportador específico del yodo (Proteína de transporte NaVl", NIS) puede ser colocado bajo el control de cualquier secuencia reguladora de la expresión tal como por ejemplo un promotor o un promotor/ mej orador, funcional y que permita la expresión en las células huéspedes tumorales . Las secuencias reguladoras de la expresión pueden comprender, además la región promotora, una región situada en 3' del gen que codifica para el transportador específico del yodo y que proporciona una señal de fin de transcripción y un sitio de poliadenilación. El conjunto de estos elementos constituye un "cassette" de expresión. clA ? ?< i..¿-i . fe,.«*,.i El promotor puede ser constitutivo o regulable (inducible) . Puede tratarse del propio promotor del gen.

Puede igualmente tratarse de secuencias de origen diferente (responsables de la expresión de otras proteínas, o también de un promotor sintético) . Particularmente, puede tratarse de secuencias promotoras de genes eucariotas o virales. Por ejemplo, puede tratarse de secuencias promotoras originarias del genoma de la célula que se desea transfectar. Asimismo, puede tratarse de secuencias promotoras originarias del genoma de un virus, comprendiendo las del virus utilizado. A este respecto, se puede citar por ejemplo los promotores E1A, MLP, CMV, LTR-RSV, MT-1, SV40 etc. Además, estas secuencias de expresión pueden ser modificadas por adición de secuencias de activación, de regulación, que permitan una expresión tejido- específica o predominante en ciertos tejidos (promotor enolasa, GFAP, etc.) . Puede en efecto, ser particularmente interesante utilizar señales de expresión activas específicamente o mayoritariamente en las células tumorales, de manera de que el gen terapéutico no sea expresado y produzca su efecto solo cuando el virus ha infectado efectivamente una célula tumoral. El carácter específico o mayoritario de la expresión significa que la actividad del promotor es significativamente muy superior en las células tumorales. Aunque una expresión no-específica pueda existir en otras células, el nivel de actividad correspondiente permanece generalmente muy débil (despreciable) en relación al observado en las células tumorales, generalmente inferior en un factor de 10 al menos. 5 Entre los promotores utilizables en el marco de la invención se puede citar a los promotores ubiquitarios (PRET, vimentina, a-actina, tubulina, etc.), los promotores de los filamentos intermediarios (desmina, neurofilamentos, queratina, GFAP) , los promotores de genes de interés 10 terapéutico (MDR, CFTR, factor VIII, etc.), los promotores específicos de tejidos (promotores de los genes de la desmina, de las miosinas, de la creatina cinasa, de la fosfoglicerato cinasa) , los promotores más específicamente activos en las células en crecimiento o aún los promotores 15 que responden a un estímulo tal como promotores que responden a las hormonas naturales (receptores de las hormonas esferoides, receptor del ácido retinoico, etc.) o un promotor regulado por los antibióticos (tetraciclina, rapamicina, etc.) u otros promotores que responden a otras 20 moléculas de origen natural o sintético o de secuencias promotoras originarias del genoma de un virus como el mejorador/promotor del citomegalovirus CMV, el promotor LTR del retrovirus, el promotor SV40, el promotor del gen E1A, el promotor MLP . Los promotores regulables por la 25 tetraciclina y el promotor CMV han sido descritos en WO 96/ 01313, US 5,168,062 y US 5,385,839. Entre los promotores utilizables para la aplicación de la invención se puede citar particularmente al promotor del citomegalovirus (CMV) , la región promotora precoz del SV40 (Benoist y Chambón, 1981, Nature 290: 304-310), el promotor comprendido en la región 3' LTR del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto, y colaboradores, 1980, Cell 22: 787- 797), el promotor de la timidina cinasa del virus del herpes (Wagner y colaboradores, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneina (Brinster y colaboradores, 1982, Nature 296: 39- 42); los promotores de origen procariotas como el promotor de 1 ß-lactamasa (Villaa-Kamaroff, y colaboradores, 1978, Proc. " Nati. Acad. Sci. USA. 75:3727-3731) o el promotor tac (DeBoer, y colaboradores, 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80: 21- 25); ver igualmente "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242: 74-94; los promotores de levaduras tales como los promotores Gal4, ADC (alcohol deshidrogenasa), PGK (fosfoglicerol cinasa), fosfatasa alcalina; y las secuencias de regulación transcripcional de origen animal que presentan una especificidad de tejidos y que son utilizados para los anímales transgénicos: las secuencias de regulación del gen de la elastasa I que son activas en las células de los acini del páncreas (S ift, 1984, Cell 38:639-646; Ormitz y colaboradores, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant . Biol.. 50: 399- 409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425- 515); las secuencias de regulación del gen la insulina que son activas en las células beta del páncreas (Hanahan, 1985, Nature 315: 115- 122), las secuencias de regulación de la expresión de las inmunoglobulinas que son activas en las células linfoides (Grosschedl y colaboradores, 1984, Cell 38: 647-658; Adames y colaboradores, 1985, Nature 318: 533- 538; Alexander y colaboradores, 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444), la secuencia de regulación del virus de los tumores mamarios de ratón que es activo en las células de los testículos, del seno, los linfocitos y los mastocitos (Leder y colaboradores, 1986, Cell 45: 485- 495), la secuencia de regulación del gen PSA que es activo en los tumores prostéticos, la secuencia de regulación del gen de la albúmina que es activo en el hígado (Pinkert y colaboradores, 1987, Genes and Devel. 1: 268- 276), la secuencia de regulación del gen de la alfa-fetoproteína que es activa en el hígado (Krumlauf y colaboradores, 1985, Mol. Cell. Biol.. 5: 1639- 1648; Hammer y colaboradores, 1987, Science 235: 53- 58), la secuencia de regulación del gen de la alfa 1- antitripsina que está activa en el hígado (Kelsey y colaboradores, 1987, Genes y Devel. 1: 161- 171), la secuencia de regulación del gen de la ß-globina que está activa en las células mieloides (Mogram y colaboradores, L^^^Ü É 1985, Nature 315: 338- 340; Kollias y colaboradores, 1986, Cell 46: 89- 94), la secuencia de regulación del gen de la mielina básica que está activa en los oligodentrocitos en el cerebro (Readhead y colaboradores, 1987, Cell 48: 703- 712), la secuencia de regulación del gen de la cadena ligera 2 de la miosina que está activa en el músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314: 283- 286), y la secuencia de regulación del gen de la hormona de liberación de las gonadotropinas que está activa al nivel del hipotálamo (Masón y colaboradores, 1986, Science 234: 1372- 1378). En una modalidad particular de realización de la invención, se utiliza un adenovirus recombinante defectuoso que comprende un gen que codifica para el transportador específico del yodo (Proteína de transporte Na+/I") NIS bajo el control de un promotor viral, seleccionado de preferencia entre el LTR-RSV o el promotor precoz del CMV. Es igualmente posible asociar la introducción del gen NIS con el vector según la invención a la introducción de un sistema biológico que permita el aumento de la media vida biológica del yodo 131. Es así posible liberar en las células tumorales de manera simultánea o sucesiva el gen NIS y un gen o varios genes que codifican para polipéptidos implicados en un sistema de organificación del yodo. Se puede citar por ejemplo a los genes que codifican para polipéptidos implicados en un sistema peroxidásico tal como el gen que codifica para la glucosa oxidasa. Se puede igualmente citar el gen que codifica para la tiroperoxidasa, enzima de las células tiroidianas implicadas en el proceso de organificación del iodo (Nucleic Acids Res. 5 15: 6735- 6735 (1987); secuencia GenBank g37251). La introducción del gen que codifica para la tiroperoxidasa puede estar asociada igualmente a la introducción de secuencias nucleicas que codifican para toda o parte de la tiroglobulina (partes de la tiroglobulina ricas en residuos 10 tirosmas) . Se puede contemplar liberar en las células tumorales el gen NIS y un gen o varios genes que codifican para polipéptidos implicados en un sistema de organificación del yodo por medio de un vector único que expresa a varios 15 trasngenes o por co-infección de dos vectores, un vector adenoviral que expresa al gen NIS y otro vector, viral o plasmídico, que expresa a uno o varios genes que codifican para polipéptidos implicados en un sistema de organificación del yodo. 20 Es además posible asociar la introducción del gen NIS con el vector según la invención en la administración de un sistema que permita una disminución del efluvio del yodo por un agente farmacológico (por ejemplo, una sal de litio) . Según otra variante, es igualmente contemplable asociar 25 la introducción del gen NIS con otros genes de interés jn» i j¡ -t ?tk a aj-iü „>...,. a * & í terapéutico para el tratamiento de los cánceres. Puede tratarse de un gen suicida tal como el gen de la timidina cinasa del herpes o el gen de la citosina desaminasa. Puede tratarse de genes que codifican para proteínas que inducen la apoptosis como p53, Bax, BclX-s, Bad o cualquier otra antagonista de Bcl2 y de BclX-1. Puede tratarse de genes que codifican para variantes de estas proteínas que presentan propiedades mejoradas como una variante de p53 (CTS-1, WO 97/04092). Puede tratarse igualmente de genes que codifican para factores anti-angiogénicos o angiostáticos tales como particularmente el ligando de Tie-1 y de Tie-2, la angiostatina, la endostatina, el factor ATF, los derivados del plasminógeno, la endotelina, las trombospondinas 1 y 2, el PF-4, el inferieron a o ß, la interleucina 12, el TNFa, el receptor de la urocinasa, fltl, KDR, PAI1, PAl2, TIMP1, el fragmento prolactina. Puede tratarse igualmente de genes que codifican para proteínas capaces de inducir una inmunidad antitumoral o estimular la respuesta inmunitaria (IL2, GM-CSF, IL12, etc.). entre los genes que codifican para proteínas de interés terapéutico en el tratamiento de los cánceres, es igualmente importante subrayar los anticuerpos, los fragmentos variables de anticuerpos de cadena simple (ScFv) o cualquier otro fragmento de anticuerpo que posea capacidades de reconocimiento para una utilización en inmunoterapia para el tratamiento de los t ¿?¿*»k*j4 ? s i j t ^ t , ¿e. .A tumores: anticuerpo anti-RAS (WO 9429446). De manera ventajosa, puede tratarse de un gen cuya expresión implica una radiosensibilización de las células tumorales como el gen p53. La administración de estos genes o de la combinación de dos o varios de estos genes de interés terapéutico previamente citados puede realizarse por introducción de uno o varios de estos genes en el vector adenoviral que comprenda el gen que codifica para el transportador NIS o en un vector separado de naturaleza viral o no viral. Según otra variante, el vector según la invención puede ser administrado en combinación con un agente anticanceroso tal como particularmente, el taxol, el taxoter, y otros taxoides [tales como los descritos particularmente en U. S. 4,857,653; US 4,814,470; US 4,924,011; US 5,290, 957; US 5,292,921; US 5,438,072; US 5,587,493; EP 0 253 738; y WO 91/17976, WO 93/00928, WO 93/00929, y WO 9601815], u otros agentes terapéuticos anticancerosos tales como el cis- platino y los derivados del platino, la etoposida y fosfato de etoposida, bleomicina, mitomicina, C, CCNU, doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, ifosfamida, etc. La invención concierne igualmente a una composición farmacéutica que comprende a un vector adenoviral tal como el descrito anteriormente y un vehículo fisiológicamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas de la invención están de preferencia bajo la forma inyectable y pueden ser formuladas en vista de una administración intratumoral o por vía oral, , parenteral, intranasal, intra-arterial, intravenosa, intra-traqueal, etc. Preferencialmente, la composición farmacéutica contiene vehículos farmacéuticamente aceptables para una formulación destinada a ser administrada por vía intratumoral. Las composiciones según la invención pueden comprender dosis variables de adenovirus recombinantes, fácilmente adaptables por el experto en la materia en función de las aplicaciones contempladas y de diferentes parámetros, y particularmente en función de la modalidad de administración utilizada o aún de la duración de la expresión buscada. De una manera general, los virus recombinantes según la invención son formulados y administrados bajo la forma de dosis comprendidas entre 104 y 1014 pfu, y de preferencia 106 a 1011 pfu. El término pfu ("plaque forming unit" ) corresponde al poder infeccioso del virus, y es determinado por infección de un cultivo celular apropiado, y medida del número de zonas de células infectadas. Las técnicas de determinación del título pfu de una solución viral están bien documentadas en la literatura. Además, las composiciones según la invención pueden igualmente comprender un agente de trasnferencia química o bioquímica. Se entiende por el término "agente de transferencia química o bioquímica" todo compuesto (es decir, diferente de un virus recombinante) que facilita la penetración de un ácido nucleico en una célula. Puede tratarse de agentes no virales catiónicos como lípidos 5 catiónicos, péptidos catiónicos, polímeros (Polietilen Imina, Polilisina) , nanopoartículas; u agentes no virales no catiónicos como liposomas no catiónicos, polímeros o nanopartículas no catiónicas. Según una modalidad preferida, las composiciones según 10 la invención comprenden un vector recombinante defectuoso que comprende un gen que codifica para el transportador del yodo NIS y son formulados para una administración intratumoral. Ventajosamente, las composiciones de la invención comprenden de 104 y 1015 pfu, y de preferencia 107 a 1012 pfu. 15 La invención tiene igualmente por objeto un procedimiento de preparación de un medicamento útil para la prevención, el mejoramiento y/o el tratamiento de los tumores, caracterizado porque se mezcla un vector recombinante que comprenda un ácido nucleico que codifica 20 para un transportador del yodo (NIS) con uno o varios adyuvantes compatibles y farmacéuticamente aceptables. La invención concierne igualmente a un método de tratamiento de los tumores de los mamíferos, y particularmente del hombre, que comprende la administración 25 de una cantidad eficaz de un vector adenovirus recombinante MamuM ÉMJ.ilttiii ipninr1 - ¡ J, ? _-. ¿ i ^n? ' i : «k , .. - .- .«»»»_- . ... ...¿. — -«¡-M» » «-.«-•« - , , - .., = <_* e - -> ?. A « i maga defectuoso que comprenda un ácido nucleico que codifica para el transportador del yodo (NIS) . El término "cantidad eficaz", designa a una cantidad suficiente para reducir de al menos aproximadamente 15 %, de preferencia de al menos 50 % y de preferencia aún de ai menos 90 % el volumen de los tumores, y más preferencialmente aún una cantidad suficiente para la eliminación de los tumores cuando la administración del adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica para el transportador del yodo (NIS) está asociado a un tratamiento por radioterapia metabólica con el yodo 135. La invención concierne al tratamiento de los tumores y más particularmente al tratamiento de los tumores sólidos. Entre los tumores sólidos que pueden ser tratados por el objeto de la. invención se pueden citar particularmente los sarcomas y los carcinomas, y a título de ejemplo no limitativo, los fibrosarcomas, los sarcomas osteogénicos, los angiosarcomas, los endoteliosarcomas, los linfangiosarcomas, los tumores de E ing, el cáncer del colon, el cáncer del páncreas, el cáncer de los ovarios, el cáncer de la próstata, los adenocarcinomas, los carcinomas del riñon, del hígado, del canal biliar, los tumores de Wilm's, el cáncer del cuello del útero, el cáncer de los testículos, el cáncer del pulmón, el cáncer del pulmón no de células pequeñas, el cáncer de la vejiga, los carcinomas . f. - tt epiteliales, los gliomas, los astrocitomas, los melanomas, los neuroblasto as y los retinoblastomas . La invención concierne igualmente a la prevención y/o al tratamiento de los desórdenes proliferativos (tales como las metaplastias y las displastias) de los tejidos epiteliales tales como el epitelio del cuello del útero, del esófago y de los pulmones. A este respecto, la invención concierne al tratamiento de las condiciones conocidas o sospechadas por preceder una evolución hacia una neoplasia o un cáncer, en particular en los estados en los que el crecimiento de células no-neoplásticas tal como la hiperplasia, la metaplasia, y más particularmente la displasia se produce (para una revisión de estas condiciones anormales de crecimiento, ver Robbins y Angelí, 1976, basic Pathology, 2a Ed, W. B. Saunders Co . , Philadelphia, pp. 68-79) . Hiperplasia es una forma de proliferación celular controlada que implica un aumento del número de células en un órgano, sin alteración estructural o funcional significativa de este órgano. Por ejemplo, una hiperplasia del endometrio puede preceder al cáncer del endometrio. La metaplasia es una forma controlada de crecimiento celular en la cual un tipo de célula adulta o totalmente diferenciada se substituye por otro tipo de célula. La metaplasia puede producirse en los tejidos epiteliales o en los tejidos conjuntivos. La displasia es frecuentemente un ,JÍ-' signo previo habitual del cáncer y se encuentra principalmente al nivel del epitelio; es la forma más frecuente de crecimiento celular no neoplástico que implica la pérdida de la uniformidad de las células individuales y 5 la pérdida de la orientación estructural de las células. La displasia se produce de manera típica cuando existe una irritación o una inflamación crónicas, y es frecuentemente observada al nivel del cuello del útero, las vías respiratorias, la cavidad bucal, y sobre la pared de la 10 vejiga, para una revisión, ver Fishman y colaboradores, 1985, Medicine, 2a Ed. J. B. Lippincott Co . , Philadelphia . La presente invención será descrita más en detalle con la ayuda de los ejemplos que siguen que deben considerarse como ilustrativos y no limitativos. 15 SUBTÍTULOS DE LAS FIGURAS Figura 1: esquema del plásmido pABl, del plásmido pXL3048 y del plásmido pAB2. El plásmido pXL3048 comprende el extremo izquierdo del genoma del adenovirus de tipo 5 (nucleótidos " 1-382), un "polylinker" que comprende tres 20 sitios únicos de clonación y una parte del gen pIX (nucleótidos 3446-4296) . El plásmido pAB2 resulta de la clonación del frgamento SspI-EcoRV de pABl en pXL3048 previamente alineado por EcoRV. Figura 2: obtención del plásmido pXL3215 generado por 25 doble recombinación a partir de los plásmidos pAB2 y pXL3215 según el método descrito por Crouzet y colaboradores (PNAS vol 94 pl414, 1997) . El plásmido pXL3215 contiene el genoma de un adenovirus de tipo 5 eliminado por la región El y E3 y contiene el "cassette" de expresión de NIS. Figura 3: cinética de acumulación del yodo 125 por las células FTRL-5 y SiHa infectadas con el .vector Ad-NIS (multiplicidad de infección 10) . Los resultados de la cinética son expresados en número de golpes por minuto por 10d células. La determinación del número de células por pocilio en el momento del contacto con el yodo es la media de dos medidas. Figura 4: inhibición específica del transporte del yodo por NIS en presencia de perclorato (NaC104) 30, 300 y 3000 µM. El tiempo de contacto de las células con el yodo 125 es de 15 minutos. Figura 5: acumulación del yodo in vi vo por tumores infectados con el vector Ad-NIS. Las células MCF-7 (células tumorales humanas de cáncer mamario) han sido han sido inyectadas subcutáneamente en los ratones desnudos (5 x 106 células) . Después de 15 días (inicio de la aparición de tumores) , inyecciones intraperitoneales diarias de tirosina ( 2 µg/ animal/ día) han sido efectuadas durante 15 días. El vector Ad-CMV-NIS ha sido a continuación inyectado a ciertos animales intratumoralmente ( 2 x 109 pfu/ tumor; tamaño de los tumores 3-6 mm) . Tres días después de la infección, 6 µCi de 125I son inyectadas a los ratones intraperitonealmente. Las cuentas se efectuaron sobre 10 segundos a intervalos de tiempo regulares colocando la sonda sobre la tiroides, sobre el tumor, justo en proximidad del tumor. Los resultados son expresados en número de golpes detectados (medido sobre 10 segundos) en función del tiempo. Figura 6 : centellografía de un ratón cuyo tumor ha sido infectado por el vector Ad-NIS. Las células MCF-7 (células tumorales humanas, cáncer mamario) han sido inyectadas sub-cutáneamente en el ratón desnudo (5 x 106 células) . Después de 15 días (inicio de aparición de los tumores) , inyecciones intraperitoneales diarias de tirosina (2 µg/animal/día) han sido efectuadas durante 15 días. El vector Ad-NIS ha sido a continuación inyectado intratumoralmente (2 x 109 pfu/ tumor; tamaño de los tumores 3-6 mm) . Tres días post-infección, 50 µCi de *2DI son inyectados intraperitonealmente a los ratones. Las cuentas son realizadas 1 hora después de inyección del yodo. El cliché es una vista ventral del animal. MATERIAL Y MÉTODOS Técnicas generales de biología molecular Los métodos clásicamente utilizados en biología molecular tales como las extracciones preparativas de ADN plasmídico, la centrifugación de ADN plasmídico en gradiente de cloruro de cesio, la electroforesis sobre geles de agarosa o de acrilamida, la purificación de fragmentos de ADN por electroelución, las extracciones de proteínas al fenol o al fenol-cloroformo, la precipitación de ADN en medio salino por el etanol o el isopropanol, la transformación en Escherichia coli , etc. Son bien conocidas 5 por el experto en la materia y son abundantemente descritas en la literatura [Maniatis T. y colaboradores, "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1982; Ausubel F. M. Y colaboradores (eds) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, 10 New York, 1987]. Para las ligaciones, los fragmentos de ADN pueden ser separados según su talla por electroforesis en geles de agarosa o de acrilamida, extractos al fenol o por una mezcla de fenol/cloroformo, precipitados al etanol luego incubados 15 en presencia del ADN ligasa del fago T4 (Biolabs) según las recomendaciones del proveedor. El llenado de los extremos 5' prominentes puede efectuarse por el fragmento Klenow del ADN polimerasa I de E. coli (Biolabs) según las especificaciones del proveedor. 20 La destrucción de los extremos 3' prominentes es efectuada en presencia del ADN Polimerasa del fago T4 (Biolabs) utilizada según las recomendaciones del fabricante. La destrucción de los extremos 5' prominentes es efectuada por un tratamiento arreglado por la nucleasa SI. 25 La mutagénesis dirigida in vi tro por oligodesoxmucleótidos sintéticos puede ser efectuada según el método desarrollado por Taylor y colaboradores [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749- 8764] utilizando el equipo distribuido por Amersham. 5 La amplificación enzimética de fragmentos de ADN por la técnica llamada de PCR [" Polimerase-catalyzed Chain Reaction", Saiki R. K. y colaboradores, Science 230 (1985) 1350- 1354; Mullís K. B. Y Falona F. A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] puede efectuarse utilizando un "DNA Thermal 10 Cycler" (Perkin Elmer Cetus) según las especificaciones del fabricante . La verificación de secuencias nucleotídicas puede efectuarse por el método desarrollado por Sanger y colaboradores [Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 74 (1997) 5463- 15 5467] utilizando el equipo distribuido por Amersham. EJEMPLOS Ejemplo 1.-construcción de un adenovirus recombinante defectuoso que expresa al gen que codifica para el transportador específico del yodo (Proteína de transporte 20 Na+/I") NIS. Este ejemplo describe la construcción de un vector adenoviral defectuoso que contiene al gen que codifica para el transportador específico del yodo (N+/I~ Conjunto portador) NIS (ref Genbank U60282) unido de manera 25 operacional al promotor CMV.

El fragmento que có tiene a los nucleótidos 74 a 2046 de la secuencia del gen nis de rata (Dai y colaboradores, 1996, Nature 379: 458- 460) ha sido clonado bajo la forma de un fragmento AatlI- HindIII en los sitios PvuII-HindlII del plásmido pCEP-4 (invitrogen) . El sitio AatlI del fragmento AatlI-HindIII ha sido previamente convertido en extremo franco por tratamiento con la nucleasa Mung Bean (Biolabs) antes de inserción en el plásmido pCEP-4. El plásmido resultante es llamado pABl . El plásmido pABl (figura 1) comprende al gen ni s cuya expresión es colocada bajo el control del mejorador/ promotor del citomegalovirus CMV (nucleótidos -522 a + 72) (Boshart y colaboradores 1985, Cell, 41: 521 - 530) y seguido del sitio de poliadenilación del virus SV40 (nucleótidos 2538 a 2759 de acuerdo al genoma de SV40, Genbank locus SV4CG) . El conjunto formado por (i) el mejorador/ promotor del citomegalovirus, (ii) el ADNc del gen ni s y (iii), el sitio de poliadenilación del virus SV40 es llamado a continuación el "cassette" de expresión de NIS. El fragmento SspI-EcoRV (3711 bp) del plásmido pABl que comprende el "cassette" de expresión de NIS definido posteriormente, es a continuación clonado en el vector lanzadera pXL3048 previamente linearizado por EcoRV. El vector resultante es llamado pAB2 (figura 2) . El plásmido pXL3048 es un plásmido derivaddo del plásmido Kaan-SacB (Crouzet y colaboradores PNAS vol 94 pl414-1419, 1997) que comprende el extremo izquierdo del genoma del adenovirus de tipo 5 (nucleótidos 1-382), un "polylinker" que comprende tres sitios únicos de clonación y una parte del gen pIX (nucleótidos 3446- 4296) . El adenovirus Ad-NIS ha sido construido según el método descrito por. Crouzet y colaboradores (PNAS vol 94 pl414-1419, 1997) por recombinación homologa entre el plásmido pAB2 y el plásmido pXL3215. El plásmiddo pXL3215 contiene el genoma de un adenovirus que contiene un "cassette" RSV-LacZ insertado en su región El (?E1 386-3446) y una eliminación en la región E3 (?E3 28592-30470) . El principio de la construcción está descrito en la figura 2. El plásmido pXL3215 generado por esta doble recombinación contiene el genoma de un adenovirus de tipo 5 eliminado por la región El y E3 y que contiene el "cassette" de expresión CMV-NIS-poly A SV40. esta construcción es verificada por secuenciación del "cassette" de expresión de NIS. El adenovirus Ad-NIS es generado por infección del ADN de pXL3215 digerido por Pací en la línea 293 (ATCC CRL-1573) . Las partículas virales obtenidas son a continuación amplificadas en esta misma línea y "stocks" de virus i ? A «. producidos son purificados por doble gradiente de CsCl. Las partículas virales son a continuación utilizadas para estudiar la expresión del gen NIS en diferentes líneas tumorales . Ejemplo 2: acumulación del yodo in vitro por células tumorales infectadas con el vector Ad-NIS La capacidad de acumulación del yodo en las células infectadas con el vector Ad-NIS ha sido probada en diferentes líneas: células tumorales epiteliales SiHa (ATCC HTB-35), células tumorales mamarias MCF7 (ATC HTB-22) y T-47D (ATCC HTB-133) y células tumorales de origen prostético DU-145 (ATCC HTB-81) y PC-3 (ATCC CRL-1435) . Las células son infectadas con el vector Ad-NIS a una multiplicidad de infecciones de 10. La capacidad de las células para captar el, yodo es probada 28 a 29 horas después de infección, según el método de Weiss y colaboradores [Endocrinology (1984) 114:1090-1098]. Las células infectadas son lavadas con tampón HBSS y puestas en contacto durante el tiempo indicado en la figura 3 con 0.5 mi de tampón HBS que contiene 0.1 µCi de yodo 125. al final del tiempo de contacto, las células son lavadas una vez con tampón HBS frío, luego incubadas durante 20 minutos con el etanol frío. La cantidad de yodo 125 captada por las células es determinada por dosificación de la radioactividad del etanol, con un contador gama.

Los resultados obtenidos con la línea SiHa son presentados en la figura 3 y pueden ser comparados a los obtenidos con las células FRTL-5 (células tiroidianas de rata, que captan el yodo naturalmente y que sirven de control) . La inhibición espcífica del transporte del yodo por NIS ha sido verificada en presencia de perclorato. El NaC104 es añadido en el tampón que contiene el yodo 125 de manera de obtener concentraciones finales de 30, 300 y 3000 µM. El tiempo de contacto de las células con el yodo 125 es de 15 minutos. Los resultados se presentan en la figura 4. Los resultados se expresan en número de golpes por un mismo número de células. Las células FRTL-5 (control positivo) fijan una cierta cantidad de yodo, y se observa que este fenómeno es muy rápido (el máximo casi se alcanza después de 15 minutos de contacto) . Los resultados obtenidos muestran que las células SiHa (células epiteliales humanas, tumorales) no infectadas no captan yodo. De manera sorprendente, se observa que las células SiHa infectadas con el vector Ad-NIS captan hasta 5 veces más yodo que las células FRTL-5. Se observa igualmente que la cinética inicial del fenómeno es comparable a la observada para las células FRTL-5. La especificidad del transporte ha sido confirmada por infección con un adenovirus control que no contiene el gen ni s (resultado no jktJ A ? ± .i~.l..± . .. : M-k_ presentado) . Los resultados de las experiencias de inhibición (figura 4) muestran que la fijación de yodo en las células FRTL-5 es inhibida a más de 90 % a partir de una concentración de NaC104 de 30 µM (93 % para 30 µM, 95 % a concentraciones superiores) . Es interesante observar que, por el contrario, para las células SiHa infectadas por Ad-NIS, la concentración de inhibidor necesaria para obtener la misma proporción de inhibición es mucho más elevada (40 % de inhibición solamente para 30 µM de NaC104, 92 % de inhibición para 300 µM de NaC104 y 98 % para 3 mM de NaCl04) . La experiencia de inhibición permite concluir que la capacidad de las células SiHa infectadas por Ad-NIS para captar el yodo es bien debida a la expresión de NIS en estas células, ya que el fenómeno es inhibido por NaC104 que es un inhibidor competitivo y específico del transporte de los' iones yoduros por NIS. Se han obtenido resultados similares para otra líneas celulares tumorales humanas (células tumorales mamarias: MCF-7 y T47-D, y células tumorales de origen prostético: DU-145 y PC-3) . Los resultados que conciernen a la inhibición por NaC104, confirman igualmente que la infección de células tumorales por Ad-NIS conduce a un nivel de expresión de NIS particularmente elevado, ya que concentraciones elevadas de NaC104 son requeridas para inhibir el fenómeno (en el caso de . ¿ 1 las células SiHa, y en relación a las células FRTL-5, una concentración de inhibidor 10 veces superior es requerida para obtener una misma proporción de inhibición) . El conjunto de estos resultados demuestra que el vector adenoviral es un vector particularmente ventajoso para la transferencia del gen nis y que la utilización de dicho vector permite alcanzar un nivel de acumulación del yodo en células tumorales no tiroidianas del orden de 5 veces superior al observado para células que captan naturalmente el yodo 125. Ejemplo 3:acumulación del yodo in vivo por tumores infectados por el vector Ad-NIS Células MCF-7 (células tumorales humanas de cáncer mamario) se inyectaron subcutáneamente en el ratón desnudo (5 x 106 células) . Después de 15 días (inicio de la aparición de los tumores), inyecciones intraperitoneales diarias de tirosina (2 µg/animal/día) se efectuaron durante 15 días, de manera de poner la tiroides de los animales en reposo. El vector Ad-NIS se inyectó a continuación en ciertos animales intratumoralmente (2 x 109 pfu/tumor) ; el diámetro de los tumores en el momento de la inyección era de 3 a 6 mm. Tres días después de la infección, 6 µCi de 125I se han inyectado intraperitonealmente a los ratones, y se efectuaron conteos sobre 10 segundos con la ayuda de una sonda que pueda ser desplazada a diferentes lugares del animal. Se efectuaron conteos a intervalos de tiempo regulares colocando la sonda sobre la tiroides, sobre el tumor, y justo en proximidad del tumor. Los resultados se presentan sobre la figura 5. Los resultados se expresan en número de golpes detectados (medida sobre 10 segundos) en función del tiempo. En los animales controles (sin administración de Ad- NIS), la tiroides fija una pequeña cantidad de yodo, pero gracias al tratamiento por la tirosina no se observa acumulación importante del yodo en la tiroides en el transcurso del tiempo. No se observa fijación de yodo en el tumor, en los animales controles (ver la figura 5A) . El hecho de que NIS esté naturalmente presente en el estómago, así como el hecho de que el yodo sea eliminado por vía urinaria explican los valores relativamente elevados observados (interferencia relativamente importante) . Los animales tratados con Ad-NIS administrada intratumoralmente (figura 5B) no presentan acumulación importante de yodo al nivel de la tiroides (efecto del tratamiento por la tirosina) . Sobre estos animales, las cantidades de yodo detectadas colocando la sonda sobre el tumor son sistemáticamente más elevadas que las cantidades de yodo detectadas en proximidad del tumor, lo que indica que hay fijación del yodo en el tumor después de tratamiento por el vector Ad-NIS. A fin de confirmar la fijación del yodo al nivel de los tumores, medidas de radioactividad por centellografía se realizaron sobre animales tratados por el vector Ad-NIS. Los resultados obtenidos se presentan sobre la figura 6. Los animales utilizados se prepararon según el protocolo descrito anteriormente, excepto que se inyectaron 50 µCi de 125I intraperitonealmente; la imagen se obtuvo una hora después de la inyección del yodo. El cliché es una vista ventral del animal. Cuatro zonas de fijación del yodo son visibles: la tiroides, la vejiga (vía de eliminación del yodo) , el estómago (en el cual NIS se expresa naturalmente), y el tumor. Estos resultados de centellografía confirman los resultados precedentes obtenidos por conteo y muestran que los vectores según la invención permiten obtener una fijación importante del yodo al nivel de los tumores. Ejemplo 4: evaluación cuantitativa de la acumulación del yodo in vivo en tumores infectados por el vector Ad-NIS.

Células SiHa (5 x 106 células) se inyectaron subcutáneamente en el ratón desnudo (n = 12) sobre los dos flancos del animal. Después de 15 días (inicio de aparición de los tumores), se efectuaron inyecciones intraperitoneales diarias de tirosina (2 µg/animal/día) , durante 15 días, de manera de poner la tiroides de los animales en reposo. Para cada animal, el vector Ad-NIS se inyecto a continuación intratumoralmente (2 x 109 pfu/tumor) a^J *á¡ i -sobre un tumor; el otro tumor sirvió de control; el diámetro de los tumores en el momento de la inyección era de 5 a 8 mm. Tres días después de la infección, 6 µCi de 125I se han inyectado intraperitonealmente a los ratones. Los animales fueron sacrificados 90 minutos después de la administración de 125I, y se determinó la cantidad de 125I. Los resultados se expresan en porcentaje de 125I administrado por gramo de tejido .

Los resultados obtenidos muestran que los tumores tratados con el vector Ad-NIS son capaces de acumular yodo I de manera muy eficiente y hasta 25 veces más que en los tumores no tratados. Estos resultados confirman los resultados precedentes y muestran que los vectores según la invención permiten obtener una fijación importante del yodo 10 al nivel de los tumores. e ^y^— - i tí ? ? í i -iMM Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma se refiere. ??.4.A ¿ A.-t fa«?. . i -, **&,! ?.. íj..- to& - . . - tUÉ,tMÍif^fiiÉ

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Adenovirus recombinante defectuoso caracterizado porque comprende al menos una secuencia de ADN que codifica para el transportador específico del yodo (Proteína de transporte Na+/I~) NIS o un derivado de éste. 2. Adenovirus según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de ADN es una secuencia de ADNc. 3. Adenovirus según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de ADN es una secuencia de ADNg. . Adenovirus según alguna de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la secuencia de ADN codifica para el transportador específico del yodo (Proteína de transporte Na+/I") NIS murino. 5. Adenovirus según alguna de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la secuencia de ADN codifica para el transportador específico del yodo (Proteína de transporte Na l") NIS humano. 6. Adenovirus según alguna de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la secuencia de ADN está colocada bajo el control de un promotor transcripcional que permita la expresión en las células tumorales. 7. Adenovirus según la reivindicación 6, caracterizado, Í ^A ?^ k **-a t t &* . *jp porque el promotor transcripcional es seleccionado entre los promotores virales, de preferencia entre los promotores E1A, MLP, CMV y LTR-RSV, MT-1, SV40. 8. Adenovirus recombinante defectuoso que esté 5 caracterizado porque comprende una secuencia de ADNc que codifica para el transportador del yodo NIS humano bajo el control del promotor CMV. 9. Adenovirus recombinante defectuoso que está caracterizado porque comprende una secuencia de ADN que 10 codifica para el transportador del yodo NIS o un derivado de éste bajo el control de un promotor que permita una expresión mayoritaria en células tumorales. 10. Adenovirus reco binante defectuoso según la reivindicación 9, caracterizado porque el promotor es 15 seleccionado entre la secuencia de regulación del gen de la elastasa I, del gen de la insulina, de los genes de las mmunoglobulinas, del virus de los tumores mamarios de ratón, del gen PSA, del gen de la alfa-fetoproteína, del gen de la alfa 1-antitripsina, del gen de la ß-globina, del gen 20 de la mielma básica, del gen de la cadena ligera 2 de la miosina y del gen de la hormona de liberación de las gonadotropinas . 11. Adenovirus según alguna de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque comprende al menos una eliminación 25 total o parcial de la región El y una eliminación total o íí £, J¡ a A ,*íkl^... parcial de la región E4. 12. Adenovirus según la reivindicación 11, caracterizado porque comprende además una eliminación total o parcial de la región E4. 5 13. Adenovirus según alguna de las revindicaciones 1 a 12, caracterizado porque se trata de un adenovirus humano de tipo Ad 2 o Ad 5 o canino de tipo CAV-2. 14. Adenovirus según alguna de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque consta además de un gen que 10 codifica para un polipéptido implicado en un sistema peroxidásico tal como el gen de la glucosa oxidasa o de la tiroperoxidasa . 15. Utilización de un adenovirus según alguna de las reivindicaciones 1 a 14 para la preparación de una 15 composición farmacéutica destinada al tratamiento y/o a la inhibición del crecimiento de tumores. 16. Composición farmacéutica que está caracterizada porque comprende uno ó varios adenovirus recombinantes defectuosos según alguna de las reivindicaciones 1 a 14. 20 17. Composición farmacéutica según la reivindicación 16, caracterizada porque está bajo la forma inyectable. 18. Composición farmacéutica según la reivindicación 16 o 17, caracterizada porque comprende entre 104 y 1014 pfu/ml, y de preferencia 106 a 1011 pfu/ml adenovirus recombinantes 25 defectuosos. - - ^- <&&*tl¿*LJI*¡^ ??? Ajt^,ttJ^íi t J .lL^I^ ? .,.,,, ,^ . ........ ^^.«.^^.^.^ .. ^.... .,. ^. >j.i.. ..-.^t.a.t.fe