CN1436238A - 抗李斯特菌细菌素 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及由清酒乳杆菌(Lactobacillussake)2512衍生的分离多肽，即称为Sakacine G的细菌素。本发明还涉及编码所述细菌素的核酸，以及所述多肽在食品制作中作为抗致病和非期望菌群的活性剂的用途。

Description

抗李斯特菌细菌素
本发明涉及清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)(更具体的说是清酒乳杆菌2512)的细菌素、编码该细菌素的核苷酸序列、和该细菌素在食品制作中作为针对致病或非期望菌群的活性剂的工业用途。
乳酸菌被广泛用于食品发酵，不仅用于改进食品的味道和质地，而且尤其用于延长它们的保存期。事实上，许多乳酸菌能够抑制某些革兰氏阳性细菌(包括致病菌株，诸如单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes))的生长，这要归功于拮抗分子(包括肽化合物)的分泌。这些肽化合物(称为细菌素)因而具有潜在价值，可用于保持发酵食品的品质和卫生。
作为这种细菌素的范例，特别要提到那些构成称为抗李斯特菌细菌素的多肽亚型的细菌素、IIa型细菌素(S.Ennahar等人，2000，FEMSMicrobiol.Rev.，24：85-106)和cystibiotic细菌素(R.Jack等人，1995，Microbiol.Rev.，59(2)：171-200)。最近人们已经注意到了这些IIa型细菌素之一即divercin V41用于在熏鱼中防止单核细胞增生李斯特菌生长的潜在用途(F.Duffes等人，1999，J.FoodProt.，62(12)：1394-1403)。
这些多肽的序列在N端部分显示强相似性，特别是存在二硫键。疏水C端部分的差异要大得多，但是这些细菌素中的某些即所谓的片球菌素型细菌素(片球菌素PA-1、肠菌素A和divercin V41)特征为残基数目超过40且C端存在第二个二硫键。
本发明的作者发现了由清酒李斯特菌特定菌株生成的新的IIa型细菌素，经证明对抑制李斯特菌(尤其是单核细胞增生李斯特菌)的生长特别有效。
与J.R.Tagg等人，1976，Bacteriol.Rev.，40：722-756一致，术语“细菌素”在本发明的范围内指由能够特异抑制其它细菌生长的微生物通过核糖体合成而生成的多肽。
本发明因而首先涉及由清酒乳杆菌2512菌株衍生的、具有细菌素活性的多肽。
清酒乳杆菌2512菌株已于2000年5月25日保藏于国家微生物培养物收藏中心(Collection Nationale des Cultures deMicroorganismes)，保藏物编号I-2479。
已将本发明所涉及的细菌素命名为sakacin G。该多肽的分子量是3700-3900，优选大约3834Da(通过质谱测定)。它的细菌抑制谱与IIa型细菌素非常相似。因此，经证明它对除清酒乳杆菌2512以外的其它清酒乳杆菌、啤酒片球菌(Pediococcus cerevisiae)、全体李斯特菌、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和耐久肠球菌(Enterococcus durans)特别有效。相反，经证明它对乳杆菌的其它种诸如德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)和屎肠球菌(Enterococcusfaecium)的一种菌株无活性。
与片球菌素型抗李斯特菌细菌素一样，sakacin G在其肽结构中有利的具有两个二硫键。
关于几种IIa型细菌素的遗传决定因子的分析显示，参与其生成、转运和免疫的基因被组织成一个或多个操纵子型结构。这些操纵子通常位于质粒中，而且通常具有至少两种编码与ABC转运蛋白和辅助蛋白同源的蛋白质的基因，所述蛋白质可能参与细菌素转运。
包含sakacin G基因的核苷酸片段的克隆揭示了存在三个完整的开放读码框即skgA1(SEQ ID NO：1)、skgA2(SEQ ID NO：3)和skgDc(SEQ ID NO：13)(包括截短的读码框skgD(SEQ ID NO：7))及一个截短的读码框即skgI(SEQ ID NO：5)，图1显示了它们的示意图。核苷酸片段是双链的，SEQ ID NO：15显示了它的5’-3’单链。
基因skgA1和skgA2的产物(称为前细菌素)可经历成熟，在此过程中，在第18与19位残基之间切除各自的前导肽，从而释放有活性的sakacin G(第19-55位残基)。
SEQ ID NO：9显示了包含skgA1、skgA2、skgD和skgI的5’-3’单链核苷酸片段。
本发明因而还涉及对应于细菌素的分离多肽，特征为它包含SEQID NO：2和/或SEQ ID NO：4。成熟细菌素的序列对应于SEQ ID NO：12，且包含于SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4之中。
读码框skgI编码52个残基的蛋白质。该序列与数据库序列的比较显示SkgI与所谓的免疫蛋白之间存在强相似性。它可能编码可保护sakacin G生产细菌的免疫蛋白。
本发明还延伸至包含对应于读码框skgI的SEQ ID NO：6的分离多肽。
关于最后一个基因skgDc，它编码与ABC转运蛋白家族的蛋白质(更具体的说是片球菌素PA-1的转运蛋白)同源的蛋白质。基因skgDc可能编码对sakacin G特异的ABC转运蛋白。
本发明还延伸至包含对应于所谓skgD基因的SEQ ID NO：8的分离多肽，以及包含对应于所谓skgDc基因的SEQ ID NO：14的分离多肽。
应当理解，本发明还包括同源序列，定义如下：1)与序列SEQ ID NO：2、4、6、8、12或14至少70％相似的序列；或2)由下文定义的同源核酸序列编码的序列，即在严谨杂交条件下与序列SEQ ID NO：1、3、5、7、9、13或15或其互补序列发生杂交的核酸序列。
同样，术语“相似”指进行比较的同源序列氨基酸之间的完全类似性或同一性，还包括不完全类似性，称为相似性。多肽序列中的这种相似性搜索考虑到了保守替代，即相同类型氨基酸的替代，诸如侧链不带电荷的氨基酸(诸如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸)、侧链碱性的氨基酸(诸如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、侧链酸性的氨基酸(诸如天冬氨酸和谷氨酸)、侧链非极性的氨基酸(诸如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和半胱氨酸)之中的替代。
因此，更一般的说，“同源氨基酸序列”应理解为因一个氨基酸或少数氨基酸的替代、删除和/或插入(尤其是在这些修饰不会显著影响分离多肽(优选sakacin G)的生物学活性的位置中用非天然氨基酸或假氨基酸替代天然氨基酸)而与SEQ ID NO：2、4、6、8、12或14不同的任何氨基酸序列。
这种同源氨基酸序列优选与序列SEQ ID NO：2、4、6、8、12或14的至少85％相似，优选至少95％。
通常使用序列分析软件(例如威斯康星大学生物技术中心遗传学计算机小组的序列分析软件包，威斯康星州麦迪逊市大学路1710号，53705)来测定同源性。比对相似的氨基酸序列，以获得最大同源程度(即同一性或相似性，见上文定义)。为此目的，可能必需在序列中人工导入缺口。一旦完成最佳比对，如下计算同源程度：记录比较的两种序列中氨基酸相同的所有位置，并除以位置总数。
分离多肽(更具体的说是sakacin G)的生物学活性指其抑制致病和/或非期望细菌菌株(优选李斯特菌，更具体的说是单核细胞增生李斯特菌)生长的能力。
本发明还涉及编码上述多肽的分离核酸。
更准确的说，本发明涉及包含SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：3的分离核酸。
已经测定了参与sakacin G表达的区域的完整核苷酸序列(3055bp)。它是双链DNA，SEQ ID NO：15显示了它的5’-3’链。图2显示了它的3’-5’链。本发明还涉及包含这种序列的核酸。
如上所述，该序列具有三个完整的开放读码框即skgA1、skgA2和skgDc及一个截短的读码框即skgI。假设基因skgA1(SEQ ID NO：1)、skgA2(SEQ ID NO：3)和skgI(SEQ ID NO：5)在其中的取向与skgDc(SEQ ID NO：13)相反。
本发明的范围还要求包含SEQ ID NO：5的核酸、包含SEQ ID NO：13的核酸和包含SEQ ID NO：17的核酸。
应当理解，本发明还包括同源序列，定义如下：1)与序列SEQ ID NO：1、3、5、7、9、1 3或1 5至少70％相似的序列；2)在严谨杂交条件下与序列SEQ ID NO：1、3、5、7、9、13或15或其互补序列发生杂交的序列；或3)编码上述称为sakacin G的多肽的序列。
依照本发明的同源核苷酸序列优选与序列SEQ ID NO：1、3、5、7、9、13、或15至少75％相似，优选至少85％或至少90％相似。
这种同源核苷酸序列优选能够在严谨条件下与序列SEQ ID NO：1、3、5、7、9、13或15的互补序列发生特异杂交。定义严谨条件的参数取决于50％的配对链分开的温度(Tm)。
对于包含超过30个碱基的序列，Tm由如下方程定义(Sambrook等人，1989，纽约，冷泉港实验室)：
    Tm＝81.5+0.41(％G+C)+16.6Log(阳离子浓度)
        -0.63(％甲酰胺)-(600/碱基数目)
对于长度小于30个碱基的序列，Tm由如下方程定义：
    Tm＝4(G+C)+2(A+T)
在适当的严谨条件(在此条件下非特异序列不发生杂交)下，杂交温度可优选比Tm低5-10℃，而且所用杂交缓冲液优选高离子强度溶液，诸如6xSSC溶液。
上文所用表述“相似序列”指进行比较的核苷酸之间的完全类似性或同一性，还包括不完全类似性，称为相似性。核酸序列中的这种相似性搜索将区分例如嘌呤和嘧啶。
具有SEQ ID NO：1、3、5、7、9、13或15中所示开放读码框的同源核苷酸序列包括因一个或多个碱基的突变、插入、删除或替代或者遗传密码的简并性而与序列SEQ ID NO：1、3、5、7、9、13或15不同、但编码下文定义的具有sakacin G生物学活性的多肽的任何核苷酸序列。
这种同源序列包括编码sakacin G的、除乳杆菌以外的其它细菌的基因序列。
可以通过本领域技术人员知道的任何方法来合成本发明的多肽。可以通过例如化学合成技术(诸如Merrifield型合成)来合成本发明的多肽，就纯度、抗原特异性、不含非期望次级产物且易于生产而言，这种方法是有利的。
本发明还涉及用于生产重组多肽的方法，其中将包含依照本发明的核酸的载体转移至宿主细胞中，并将其在容许表达依照本发明的多肽或由依照本发明的核酸序列编码的多肽的条件下进行培养。
还可以通过如下方法来生产重组细菌素，其中：将载体转移至宿主细胞中，并将其在容许表达相应多肽的条件下进行培养，所述载体包含依照本发明的核苷酸序列(优选序列SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：3或其同源序列)的核酸。然后可以回收并纯化生成的蛋白质。本领域技术人员知道所用的纯化方法。可以单独或联合使用诸如分级分离、层析法、使用特异单克隆或多克隆抗体的免疫亲和技术等方法，由裂解物和细胞提取物、培养物上清液开始，纯化生成的重组多肽。
可以将编码sakacin G的目的核酸序列插入表达载体，在其中以可操作方式连接容许调控其表达的元件，诸如(尤其是)启动子、激活子和/或转录终止子。根据所用宿主细胞来选择控制核苷酸序列表达的信号(启动子、激活子、这种序列、等)。为此目的，可以将依照本发明的核苷酸序列插入能够在所选宿主中自主复制的载体或可整合到所选宿主中的载体内。本领域技术人员可以通过常规使用的方法来制备这种载体，并通过标准方法(诸如电穿孔或磷酸钙沉淀)将由此生成的克隆导入合适的宿主。
包含依照本发明的核苷酸序列的上述克隆和/或表达载体也构成本发明的一部分。
本发明还涉及经那些表达载体暂时或永久转化的宿主细胞。可以如下获得这些细胞：将插入上述载体的核苷酸序列导入宿主细胞(优选原核宿主细胞)，然后在容许转移的核苷酸序列复制和/或表达的条件下培养所述细胞。
宿主细胞的范例具体包括诸如乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、链球菌属(Streptococcus)、片球菌属(Pediococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)的细菌和酵母。
本发明的核苷酸序列可以是合成或天然来源的。它们可以是使用基于序列SEQ ID NO：1、3、5、7、9、13和/或15而生成的探针筛选序列文库而得到的DNA或RNA序列。可以通过本领域技术人员知道的常规分子生物学技术来制备这种文库。
还可以通过化学合成法或者通过混合法来制备依照本发明的核苷酸序列，所述混合法包括对通过筛选文库而得到的序列进行化学或酶促修饰。
本发明还涉及在可能是或不是食品环境且易于受到单核细胞增生李斯特菌污染的环境中抑制李斯特菌(尤其是单核细胞增生李斯特菌)生长的方法。
单核细胞增生李斯特菌是致病微生物，是人类和动物严重疾病的根源，尤其易于通过污染食品进行传播，更具体的说是通过肉类、肉制品、海产品、奶类及由其衍生的产品。本发明因而提出了在有可能包含单核细胞增生李斯特菌作为污染物的食品中抑制单核细胞增生李斯特菌生长的方法，所述方法包括以足以抑制单核细胞增生李斯特菌生长的数量在所述食品中添加依照本发明的多肽。
优选以每克食品1-100,000任意单位(AU)细菌素的数量将依照本发明的细菌素用于任何食品系统。
一个AU的细菌素定义为在琼脂培养基上，相对于革兰氏阳性细菌的对照菌株，5μl最高稀释度的培养物上清液导致确定的生长抑制圈。
虽然食品最受单核细胞增生李斯特菌污染的影响，但是兽医和医学产品也可能受到这类细菌的污染，化妆品或相似产品也一样。
依照本发明的细菌素(更具体的说是sakacin G)因而可用于在这些产品中抑制这类病原体的生长。
因此，本发明涉及依照本发明的细菌素在食品制作中作为针对致病或非期望菌群的活性剂的用途，更准确的说是在食品中抑制李斯特菌(更具体的说是单核细胞增生李斯特菌)的生长和繁殖。
可以如此将多肽掺入讨论的食品，或者可以在其中由清酒乳杆菌2512生成该多肽。
因此，本发明还涉及清酒乳杆菌2512菌株在食品中生成依照本发明的细菌素多肽的用途。
本发明还涉及细菌素组合物，特征为它包含至少一种依照本发明(即由清酒乳杆菌2512菌株衍生或包含序列SEQ ID NO：2、4、12或14)的多肽或清酒乳杆菌2512菌株。
本发明还延伸至清酒乳杆菌2512菌株意欲在食品中生成上文定义的多肽以用于抑制李斯特菌(更具体的说是单核细胞增生李斯特菌)的生长和繁殖的用途，及包含该菌株的组合物。
给出下文实施例和图作为范例，而非限制本发明的主题。
                         图
图1：参与sakacin G生成的基因座的示意图。
图2：对应于参与sakacin G表达的区域的完整核苷酸序列的3’-5’互补链，它的5’-3’链显示于SEQ ID NO：15。
                        材料和方法细菌菌株和培养基
在MRS培养基(DIFCO Laboratories)(于110℃灭菌12分钟)中于30℃培养清酒乳杆菌2512。在BHI培养基(脑心浸液；DIFCOLaboratories)中于37℃培养指示菌株。活性测试
在将添加10g/L琼脂的BHI培养基倒入培养皿之前，以1％接种量接种处于静止期的指示菌株预培养物。用打孔器在冷却后的琼脂中打孔，并加入50μl sakacin G。于37℃保温过夜后，细菌素通过孔周围出现的抑菌圈而显现其活性。蛋白质分析
使用配备了离子喷射电离源的Perkin-Elmer Sciex API 165设备通过质谱分析sakacin G。冻干后，用含0.1％甲酸的乙腈/水溶液(1∶1)溶解有活性的HPLC级分，然后以5μl/min的流速注入。
使用BCA试剂盒(Sigma)，依照制造商的指示，通过二金鸡宁酸法测定蛋白质浓度。
使用可以由瑞士生物信息研究所(Swiss Institute ofBioinformatics)的ExPASy服务器获得的BLAST(1)程序进行蛋白质序列比较。分子克隆和转化
分别依照先前由Sambrook等人，1989，纽约，冷泉港实验室及Muriana和Klaenhammer，1987，Appl.Environ.Microbiol.，53：553-560描述的方法，由大肠杆菌和清酒乳杆菌2512提取和纯化质粒。
依照供应商(Gibco-BRL)的指示使用DNA限制酶和修饰酶。依照由Sambrook等人，1989，纽约，冷泉港实验室描述的方法，在Tris/硼酸/EDTA缓冲液(pH8.3)中进行分析性和制备性琼脂糖凝胶电泳。使用“制备基因”试剂盒(Bio-Rad)由琼脂糖凝胶纯化消化得到的DNA片段。依照供应商的建议在质粒pGEM-T(Promega)和pZERO2(Invitrogen)中进行克隆。依照Sambrook等人，1989，纽约，冷泉港实验室的方法，在尼龙膜(Hybond-N+，Amersham)上进行Southern型转移。转移后，使用借助“随机引物DNA标记系统”试剂盒(Gibco-BRL)通过32P标记得到的放射性探针进行杂交。依照Hanahan，1983，J.Mol.Biol.，166：557-580的方法，使大肠杆菌处于感受态和进行转化。
依照供应商的建议使用Taq聚合酶(Gibco-BRL)。使用“基因扩增9700”装置(Perkin-Elmer)进行编码sakacin G的DNA片段的扩增，条件如下：35个循环，变性94℃30sec、杂交45℃30sec、延伸72℃60sec；1个额外的延伸，72℃5min。
使用ABI Prism 310自动测序仪(Perkin-Elmer)和“大染料终止剂”测序试剂盒(Perkin-Elmer)及适当的核苷酸引物对携带sakacin G基因座的DNA片段进行测序。
                       实施例实施例1：sakacin G的分离和纯化
将100ml清酒乳杆菌2512的16小时培养物以6000g离心15分钟。然后将培养物上清液于70℃加热20分钟。用1倍体积的水稀释冷却后的上清液(稀释后溶液的pH必须低于6，如果需要就加入1M HCl)，然后流过装有阳离子交换树脂(羧甲基纤维素；Cellufine C-200，Amicon)并经水平衡的层析柱(2.5×18cm)。先用100ml水、后用150ml 0.1M NaCl连续清洗后，用200ml 0.5M NaCl洗脱sakacin G。所有溶液的pH必须低于6。然后将活性级分在固相提取柱(Sep-pak+C18，Waters)(用水平衡)上沉积。用5ml含0、10、20和30％乙腈的20mM醋酸铵连续清洗后，用10ml含80％乙腈的20mM醋酸铵洗脱sakacin G。冻干后，将提取物溶于1ml 40％乙腈水溶液，然后注射到C8反相分析HPLC柱(Kromasil，5μm，100，4.6×250mm，A.I.T.)上。在包括Perkin-Elmer系列200LC泵且连接Perkin-Elmer 785A检测器的装置上进行HPLC。记录220nm的吸收色谱。以0.8ml/min流速进行分离，梯度如下：溶剂A＝水/0.1％三氟乙酸；溶剂B＝乙腈/水/0.07％三氟乙酸。用20％的溶剂B清洗5分钟后，以如下梯度进行洗脱：20-40％溶剂B 10min；40-55％溶剂B 20min。
对应于第23分钟峰的级分经证明对伊氏李斯特菌(Listeriaivanovii)BUG 496有活性，并通过“离子喷射”电离质谱进行分析。该分子表现为至少95％纯，且具有分子量3834.32±0.31Da。由此纯化的sakacin G的质量估计是100ml培养物得到120μg。纯化产量估计是所发现活性的55％。
通过微量测序测定了sakacin G的部分一级序列，并由该序列确定了两种简并寡核苷酸。实施例2：参与sakacin G生成的基因座的克隆
通过反求遗传学，选择两种简并寡核苷酸即SakG01(5’-AARTATTATGGNAAYGGNGT-3’)(SEQ ID NO：10)和SakG02S(5’-ACATGATGNCCNCCRTTNGC-3’)(SEQ ID NO：11)，用于通过聚合酶链式反应(PCR)扩增对应于成熟sakacin G结构基因(SEQ ID NO：15)的DNA片段。将由此获得的、近似大小100bp的扩增产物克隆到质粒pGEM-T中，形成质粒pJMBYC01。在为了将结构基因在清酒乳杆菌2512基因组上定位而进行的Southern型转移过程中，将由pJMBYC01衍生的、包含插入片段的560bp PvuII限制性片段用作杂交探针。由经限制酶HindIII和EcoRI消化的清酒乳杆菌2512质粒提取物开始，探针分别揭示了近似大小2.1和9kb的片段。纯化2.1kb的HindIII片段，然后插入载体pZER02，生成质粒pJMBYC02。通过使用引物SakG01和SakG02的PCR扩增及插入pJMBYC02中的片段的核苷酸测序，证明了pJMBYC02中存在sakacin G的结构基因。将相似策略用于测定基因skgD的完整序列。用XbaI消化清酒乳杆菌2512的质粒提取物。将消化产物插入质粒pBluescript SK+。使用寡核苷酸SakG03(5’-CCTTGGTCAGGCTATCG-3’)(SEQ ID NO：16)和SakG04(5’-ATCACCTTTTTGAATTACCC-3’)(SEQID NO：17)在质粒pJMBYC02上通过PCR制备放射性探针，并将其用于揭示携带目的序列的克隆。
对该区域完整核苷酸序列(3051bp)的分析揭示了存在三个完整的开放读码框即skgA1、skgA2和skgDc及一个截短的读码框即skgI。假设基因skgA1、skgA2和skgI的取向与skgDc相反。
每个开放读码框的前面都有一个潜在的核糖体结合位点。基因skgA1和skgA2都编码具有55个氨基酸残基的蛋白质，它们的第19-55位序列完全相同。第19-52位序列对应于通过微量测序得到的sakacinG序列。值得注意的是第9、14和24位和C末端存在4个半胱氨酸。此外，该肽的计算分子量是3838.2Da，与测量分子量(3834.32Da)相差4Da，显示在sakacin G中存在两个二硫键，正如其它抗李斯特菌细菌素早就证明的。
蛋白质SkgA1和SkgA2的第1-18位序列只差3个残基，而且与II型细菌素的“前导”肽具有强同源性，所述前导肽参与那些肽通过特异ABC转运蛋白的转运。具体而言，末端GG单位是这些前导序列的特征，并构成这些细菌素的成熟位点。基因skgA1和skgA2的核苷酸序列比较还显示基因中编码成熟细菌素的部分的序列同一性超过95％。
称为skgI的不完整开放读码框编码52个残基的蛋白质。该序列与数据库序列的比较显示SkgI与所谓免疫蛋白LccI和MesI之间存在强同源性。已经证明了MesI参与针对肠膜菌素Y105的保护。可以假设skgI编码sakacin G免疫蛋白。
最后一种基因skgDc编码727个氨基酸的蛋白质。依照数据库，SkgDc与ABC转运蛋白家族的蛋白质高度同源，尤其是与片球菌素PA-1：PedD或PapD(Marugg等人，1992，Appl.Environ.Microbiol.，58：2360-2367；Motlagh等人，1994，Lett.Appl.Microbiol.，18：305-312)、sakacin P：SppT(Huhne等人，1996，Microbiology，142：1437-1448)、sakacin A：SapT(Axelsson和Holck，1995，J.Bacteriol.，177：2125-2137)和肠膜菌素Y105：MesD(Fremaux等人，1995，Microbiology，141：1637-1645)的转运蛋白高度同源。
实施例3：抑制谱
通过孔试法(见材料和方法)测试了17种细菌菌株对sakacin G的敏感性。下文表1显示了结果。
                              表1
菌株  抑菌圈半径(mm)
乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)ATCC 11454  0
类肠膜明串珠菌(Leuconostoc paramesenteroides)DSM 20288  0
肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)DSM20484  0
肠膜明串珠菌DSM 20240  0
德氏乳杆菌DSM 20081  0
植物乳杆菌DSM 20174  0
短乳杆菌DSM 20054  0
干酪乳杆菌DSM 20011  0
清酒乳杆菌2515  1
乳酸片球菌(Pediococcus acidilactic)ENSAIA 583  0
啤酒片球菌IP 5492  1
屎肠球菌ENSAIA 631  0
粪肠球菌IP 5430  2
粪肠球菌ENSAIA 636  1
耐久肠球菌ENSAIA 630  2
无害李斯特菌(Listeria innocua)8811  3
伊氏李斯特菌BUG 496  6
这种细菌素的抑制谱显得相当窄，而且对于乳酸菌仅限于菌株清酒乳杆菌和啤酒片球菌。与其它IIa型细菌素一样，这种肽显得对测试的所有李斯特菌菌株以及粪肠球菌和耐久肠球菌有活性，而对屎肠球菌无活性。序列表<110>RHODIA CHIMIE<120>抗李斯特菌细菌素<130><140><141><160>17<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>196<212>DNA<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)<220><221>CDS<222>(20)..(187)<400>1ttaacaggag gtattcaaa  atg aag aat aca cgt agc tta acg atc caa gaa 52
                  Met Lys Asn Thr Arg Ser Leu Thr Ile Gln Glu
                    1               5                  10ata aaa tcc atc aca ggt ggt aaa tac tat ggt aat ggt gtt agc tgt   100Ile Lys Ser Ile Thr Gly Gly Lys Tyr Tyr Gly Asn Gly Val Ser Cys
         15                  20                  25aac tct cat ggt tgt tca gta aat tgg ggg caa gca tgg act tgt ggg   148Asn Ser His Gly Cys Ser Val Asn Trp Gly Gln Ala Trp Thr Cys Gly
     30                  35                  40gta aat cat cta gct aat ggc ggt cat ggg gtt tgt taa ttatttaaa     196Val Asn His Leu Ala Asn Gly Gly His Gly Val Cys
 45                  50                  55<210>2<211>55<212>PRT<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)<400>2Met Lys Asn Thr Arg Ser Leu Thr Ile Gln Glu Ile Lys Ser Ile Thr1               5                  10                  15Gly Gly Lys Tyr Tyr Gly Asn Gly Val Ser Cys Asn Ser His Gly Cys
         20                  25                  30Ser Val Asn Trp Gly Gln Ala Trp Thr Cys Gly Val Asn His Leu Ala
     35                  40                  45Asn Gly Gly His Gly Val Cys
 50                  55<210>3<211>196<212>DNA<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)<220><221>CDS<222>(20)..(187)<400>3taatttggag atgttcttt atg aaa aac gca aaa agc cta aca att caa gaa  52
                 Met Lys Asn Ala Lys Ser Leu Thr Ile Gln Glu
                   1               5                  10atg aaa tct att Aca ggt ggt aaa tac tat ggt aat ggc gtt agc tgt   100Met Lys Ser Ile Thr Gly Gly Lys Tyr Tyr Gly Asn Gly Val Ser Cys
         15                  20                  25aac tct cac ggc tgt tca gta aat tgg ggg caa gca tgg act tgt gga   148Asn Ser His Gly Cys Ser Val Asn Trp Gly Gln Ala Trp Thr Cys Gly
     30                  35                  40gta aac cat cta gct aat ggc ggt cat gga gtt tgt taa ttaccagat     196Val Asn His Leu Ala Asn Gly Gly His Gly Val Cys
 45                  50                  55<210>4<211>55<212>PRT<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)<400>4Met Lys Asn Ala Lys Ser Leu Thr Ile Gln Glu Met Lys Ser Ile Thr1               5                  10                  15Gly Gly Lys Tyr Tyr Gly Asn Gly Val Ser Cys Asn Ser His Gly Cys
         20                  25                  30Ser Val Asn Trp Gly Gln Ala Trp Thr Cys Gly Val Asn His Leu Ala
     35                  40                  45Asn Gly Gly His Gly Val Cys
 50                  55<210>5<211>181<212>DNA<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)<220><221>CDS<222>(24)..(179)<400>5ttaaaaaagg agacgtgatt aaa atg gca aac aaa gac aat att aaa act gaa 53
                      Met Ala Asn Lys Asp Asn Ile Lys Thr Glu
                        1               5                  10tct aaa aac aac atc gaa gct ctc ttg cac tta cta gaa aag cgt cct   101Ser Lys Asn Asn Ile Glu Ala Leu Leu His Leu Leu Glu Lys Arg Pro
             15                  20                  25gta aaa tcc agt gaa tta ctc gat att att gac gtt ctt tcc caa gtt   149Val Lys Ser Ser Glu Leu Leu Asp Ile Ile Asp Val Leu Ser Gln Val
         30                  35                  40tat agc aaa att gat ata gct aag aat ccc ga                        181Tyr Ser Lys Ile Asp Ile Ala Lys Asn Pro
     45                  50<210>6<211>52<212>PRT<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)<400>6Met Ala Asn Lys Asp Asn Ile Lys Thr Glu Ser Lys Asn Asn Ile Glu1               5                  10                  15Ala Leu Leu His Leu Leu Glu Lys Arg Pro Val Lys Ser Ser Glu Leu
         20                  25                  30Leu Asp Ile Ile Asp Val Leu Ser Gln Val Tyr Ser Lys Ile Asp Ile
     35                  40                  45Ala Lys Asn Pro
 50<210>7<211>1203<212>DNA<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)<220><221>CDS<222>(20)..(1201)<400>7aaattaggag acttatata ttg ttt aat ctg ttg aga tac aaa aaa tta tat  52
                 Leu Phe Asn Leu Leu Arg Tyr Lys Lys Leu Tyr
                   1               5                  10tgt tca caa gtg gat gaa gat gat tgt gga atc gca gct ttg aat atg   100Cys Ser Gln Val Asp Glu Asp Asp Cys Gly Ile Ala Ala Leu Asn Met
         15                  20                  25att ttt aaa aat ttt ggt tcc gaa tat tca cta tca aaa ttg cga ttc   148Ile Phe Lys Asn Phe Gly Ser Glu Tyr Ser Leu Ser Lys Leu Arg Phe
     30                  35                  40tta gca aaa acc agt caa caa ggg act act att ttt gga ctg ata aag   196Leu Ala Lys Thr Ser Gln Gln Gly Thr Thr Ile Phe Gly Leu Ile Lys
 45                  50                  55gct gca gag gaa cta aat tta gaa gcg aat gca tta caa gct gat atg   244Ala Ala Glu Glu Leu Asn Leu Glu Ala Asn Ala Leu Gln Ala Asp Met60                  65                  70                  75ggc atc ttt aaa gat gaa aat tta atg cta cca atc att gca cat gtt   292Gly Ile Phe Lys Asp Glu Asn Leu Met Leu Pro Ile Ile Ala His Val
             80                  85                  90tta aag caa gga aaa gtt ctg cat tac tac gtt gta ttt gat gtt tcg   340Leu Lys Gln Gly Lys Val Leu His Tyr Tyr Val Val Phe Asp Val Ser
         95                 100                 105aaa gac ttt tta att att ggt gac cca gac cca aca ata gga att acg   388Lys Asp Phe Leu Ile Ile Gly Asp Pro Asp Pro Thr Ile Gly Ile Thr
    110                 115                 120gaa atc tcc aaa aag gat ttt gaa aat gaa tgg acg ggt aat ttc ata   436Glu Ile Ser Lys Lys Asp Phe Glu Asn Glu Trp Thr Gly Asn Phe Ile
125                 130                 135aca ttt tca aaa gga aag aac ttt gtt tca gag aag cag aga aat aac   484Thr Phe Ser Lys Gly Lys Asn Phe Val Ser Glu Lys Gln Arg Asn Asn140                 145                 150                 155agt tta ctc aag ttt att cct att ttg aga cag caa aaa tcc cta ata   532Ser Leu Leu Lys Phe Ile Pro Ile Leu Arg Gln Gln Lys Ser Leu Ile
            160                 165                 170ttc tgg ata gct ttc gcc gca ata cta ttg atg ata att agt att gca   580Phe Trp Ile Ala  Phe Ala Ala Ile Leu Leu Met Ile Ile Ser Ile Ala
        175                  180                 185gga tca ctt ttt tta gaa caa ctt gta gat ata tat ata cca cac aaa   628Gly Ser Leu Phe Leu Glu Gln Leu Val Asp Ile Tyr Ile Pro His Lys
    190                 195                 200aat atg gat aca ttg ggg att atc tcg att tgc tta att gga gcc tat   676Asn Met Asp Thr Leu Gly Ile Ile Ser Ile Cys Leu Ile Gly Ala Tyr
205                 210                 215ctt tta cag gcc gta atg acg tat ttt cag aat ttt tta cta act ata   724Leu Leu Gln Ala Val Met Thr Tyr Phe Gln Asn Phe Leu Leu Thr Ile220                 225                 230                 235ttt gga caa aat ctt tct aga aaa att att tta aat tat att aat cac   772Phe Gly Gln Asn Leu Ser Arg Lys Ile Ile Leu Asn Tyr Ile Asn His
            240                 245                 250ctt ttt gaa tta ccc atg tct ttc ttc tca aca cgt aga gtt ggc gaa   820Leu Phe Glu Leu Pro Met Ser Phe Phe Ser Thr Arg Arg Val Gly Glu
        255                 260                 265ata gtc tct cgg ttt aca gat gca agc aag att ata gat gct ttg gca   868Ile Val Ser Arg Phe Thr Asp Ala Ser Lys Ile Ile Asp Ala Leu Ala
    270                 275                 280agt acg att ttg act ctc ttt tta gat gtt tgg atg ttg gtt aca atc   916Ser Thr Ile Leu Thr Leu Phe Leu Asp Val Trp Met Leu Val Thr Ile
285                 290                 295tca atc gtt ctc gta ttt tta aat aca aag tta ttt atg att tct ctg   964Ser Ile Val Leu Val Phe Leu Asn Thr Lys Leu Phe Met Ile Ser Leu300                 305                 310                 315gta tct ata ccg gtg tac tca gtt ata att tat gcg ttt aaa aat aca   1012Val Ser Ile Pro Val Tyr Ser Val Ile Ile Tyr Ala Phe Lys Asn Thr
            320                 325                 330ttt aat ggc ctg aac cat aaa tca atg gaa aat gca gca tta ttg aat   1060Phe Asn Gly Leu Asn His Lys Ser Met Glu Asn Ala Ala Leu Leu Asn
        335                 340                 345tct gca ata atc gaa aac gta act ggc ata gaa act gta aaa tca tta   1108Ser Ala Ile Ile Glu Asn Val Thr Gly Ile Glu Thr Val Lys Ser Leu
    350                 355                 360act tca gaa gaa ttt tcc tac aat caa atc act gat aga ttc gaa aat   1156Thr Ser Glu Glu Phe Ser Tyr Asn Gln Ile Thr Asp Arg Phe Glu Asn
365                 370                 375ttt ctt aac agt tcc tta cgg tat acg ata gct gac caa gga cag ca    1203Phe Leu Asn Ser Ser Leu Arg Tyr Thr Ile Ala Asp Gln Gly Gln380                 385                 390<210>8<211>394<212>PRT<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)<400>8Leu Phe Asn Leu Leu Arg Tyr Lys Lys Leu Tyr Cys Ser Gln Val Asp1               5                  10                  15Glu Asp Asp Cys Gly Ile Ala Ala Leu Asn Met Ile Phe Lys Asn Phe
         20                  25                  30Gly Ser Glu Tyr Ser Leu Ser Lys Leu Arg Phe Leu Ala Lys Thr Ser
     35                  40                  45Gln Gln Gly Thr Thr Ile Phe Gly Leu Ile Lys Ala Ala Glu Glu Leu
 50                  55                  60Asn Leu Glu Ala Asn Ala Leu Gln Ala Asp Met Gly Ile Phe Lys Asp65                  70                  75                  80Glu Asn Leu Met Leu Pro Ile Ile Ala His Val Leu Lys Gln Gly Lys
             85                  90                  95Val Leu His Tyr Tyr Val Val Phe Asp Val Ser Lys Asp Phe Leu Ile
        100                 105                 110Ile Gly Asp Pro Asp Pro Thr Ile Gly Ile Thr Glu Ile Ser Lys Lys
    115                 120                 125Asp Phe Glu Asn Glu Trp Thr Gly Asn Phe Ile Thr Phe Ser Lys Gly
130                 135                 140Lys Asn Phe Val Ser Glu Lys Gln Arg Asn Asn Ser Leu Leu Lys Phe145                 150                 155                 160Ile Pro Ile Leu Arg Gln Gln Lys Ser Leu Ile Phe Trp Ile Ala Phe
            165                 170                 175Ala Ala Ile Leu Leu Met Ile Ile Ser Ile Ala Gly Ser Leu Phe Leu
        180                 185                 190Glu Gln Leu Val Asp Ile Tyr Ile Pro His Lys Asn Met Asp Thr Leu
    195                 200                 205Gly Ile Ile Ser Ile Cys Leu Ile Gly Ala Tyr Leu Leu Gln Ala Val
210                 215                 220Met Thr Tyr Phe Gln Asn Phe Leu Leu Thr Ile Phe Gly Gln Asn Leu225                 230                 235                 240Ser Arg Lys Ile Ile Leu Asn Tyr Ile Asn His Leu Phe Glu Leu Pro
            245                 250                 255Met Ser Phe Phe Ser Thr Arg Arg Val Gly Glu Ile Val Ser Arg Phe
        260                 265                 270Thr Asp Ala Ser Lys Ile Ile Asp Ala Leu Ala Ser Thr Ile Leu Thr
    275                 280                 285Leu Phe Leu Asp Val Trp Met Leu Val Thr Ile Ser Ile Val Leu Val
290                 295                 300Phe Leu Asn Thr Lys Leu Phe Met Ile Ser Leu Val Ser Ile Pro Val305                 310                 315                 320Tyr Ser Val Ile Ile Tyr Ala Phe Lys Asn Thr Phe Asn Gly Leu Asn
            325                 330                 335His Lys Ser Met Glu Asn Ala Ala Leu Leu Asn Ser Ala Ile Ile Glu
        340                 345                 350Asn Val Thr Gly Ile Glu Thr Val Lys Ser Leu Thr Ser Glu Glu Phe
    355                 360                 365Ser Tyr Asn Gln Ile Thr Asp Arg Phe Glu Asn Phe Leu Asn Ser Ser
370                 375                 380Leu Arg Tyr Thr Ile Ala Asp Gln Gly Gln385                 390<210>9<211>2042<212>DNA<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)<400>9agcttcggga ttcttagcta tatcaatttt gctataaact tgggaaagaa cgtcaataat 60atcgagtaat tcactggatt ttacaggacg cttttctagt aagtgcaaga gagcttcgat 120gttgttttta gattcagttt taatattgtc tttgtttgcc attttaatca cgtctccttt 180tttatagtaa taaaaaaaac acaattaaat tagtgctttt ttatctggta attaacaaac 240tccatgaccg ccattagcta gatggtttac tccacaagtc catgcttgcc cccaatttac 300tgaacagccg tgagagttac agctaacgcc attaccatag tatttaccac ctgtaataga 360tttcatttct tgaattgtta ggctttttgc gtttttcata aagaacatct ccaaattata 420ttttttagtg attcttgaag ttctgttgta acgcagaatt ttggaagaat gagtacttgt 480tagaaatttg ccgatttaaa taattaacaa accccatgac cgccattagc tagatgattt 540accccacaag tccatgcttg cccccaattt actgaacaac catgagagtt acagctaaca 600ccattaccat agtatttacc acctgtgatg gattttattt cttggatcgt taagctacgt 660gtattcttca ttttgaatac ctcctgttaa ataattttta cacgatcagt gtagttctaa 720tgtgaaattg tgtcaagttt agcaaatata tattttaggc atggaaaaac ttgcttttaa 780ttcgacttga ctataacggt ataatactgg tattactata tttgtttagc ttcacaaaaa 840aattaggaga cttatatatt gtttaatctg ttgagataca aaaaattata ttgttcacaa 900gtggatgaag atgattgtgg aatcgcagct ttgaatatga tttttaaaaa ttttggttcc 960gaatattcac tatcaaaatt gcgattctta gcaaaaacca gtcaacaagg gactactatt 1020tttggactga taaaggctgc agaggaacta aatttagaag cgaatgcatt acaagctgat 1080atgggcatct ttaaagatga aaatttaatg ctaccaatca ttgcacatgt tttaaagcaa 1140ggaaaagttc tgcattacta cgttgtattt gatgtttcga aagacttttt aattattggt 1200gacccagacc caacaatagg aattacggaa atctccaaaa aggattttga aaatgaatgg 1260acgggtaatt tcataacatt ttcaaaagga aagaactttg tttcagagaa gcagagaaat 1320aacagtttac tcaagtttat tcctattttg agacagcaaa aatccctaat attctggata 1380gctttcgccg caatactatt gatgataatt agtattgcag gatcactttt tttagaacaa 1420cttgtagata tatatatacc acacaaaaat atggatacat tggggattat ctcgatttgc 1500ttaattggag cctatctttt acaggccgta atgacgtatt ttcagaattt tttactaact 1560atatttggac aaaatctttc tagaaaaatt attttaaatt atattaatca cctttttgaa 1620ttacccatgt ctttcttctc aacacgtaga gttggcgaaa tagtctctcg gtttacagat 1680gcaagcaaga ttatagatgc tttggcaagt acgattttga ctctcttttt agatgtttgg 1740atgttggtta caatctcaat cgttctcgta tttttaaata caaagttatt tatgatttct 1800ctggtatcta taccggtgta ctcagttata atttatgcgt ttaaaaatac atttaatggc 1860ctgaaccata aatcaatgga aaatgcagca ttattgaatt ctgcaataat cgaaaacgta 1920actggcatag aaactgtaaa atcattaact tcagaagaat tttcctacaa tcaaatcact 1980gatagattcg aaaattttct taacagttcc ttacggtata cgatagctga ccaaggacag 2040ca                                                                2042<210>10<211>20<212>DNA<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)<400>10aartattatg gnaayggngt                                           20<210>11<211>20<212>DNA<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)<400>11acatgatgnc cnccrttngc                                            20<210>12<211>37<212>PRT<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)<400>12Lys Tyr Tyr Gly Asn Gly Val Ser Cys Asn Ser His Gly Cys Ser Val1               5                  10                  15Asn Trp Gly Gln Ala Trp Thr Cys Gly Val Asn His Leu Ala Asn Gly
         20                  25                  30Gly His Gly Val Cys
     35<210>13<211>2214<212>DNA<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)<220><221>CDS<222>(20)..(2200)<400>13aaattaggag acttatata ttg ttt aat ctg ttg aga tac aaa aaa tta tat  52
                 Leu Phe Asn Leu Leu Arg Tyr Lys Lys Leu Tyr
                   1               5                  10tgt tca caa gtg gat gaa gat gat tgt gga atc gca gct ttg aat atg   100Cys Ser Gln Val Asp Glu Asp Asp Cys Gly Ile Ala Ala Leu Asn Met
         15                  20                  25att ttt aaa aat ttt ggt tcc gaa tat tca cta tca aaa ttg cga ttc   148Ile Phe Lys Asn Phe Gly Ser Glu Tyr Ser Leu ger Lys Leu Arg Phe
     30                  35                  40tta gca aaa acc agt caa caa ggg act act att ttt gga ctg ata aag   196Leu Ala Lys Thr Ser Gln Gln Gly Thr Thr Ile Phe Gly Leu Ile Lys
 45                  50                  55gct gca gag gaa cta aat tta gaa gcg aat gca tta caa gct gat atg   244Ala Ala Glu Glu Leu Asn Leu Glu Ala Asn Ala Leu Gln Ala Asp Met60                  65                  70                  75ggc atc ttt aaa gat gaa aat tta atg cta cca atc att gca cat gtt   292Gly Ile Phe Lys Asp Glu Asn Leu Met Leu Pro Ile Ile Ala His Val
             80                  85                  90tta aag caa gga aaa gtt ctg cat tac tac gtt gta ttt gat gtt tcg   340Leu Lys Gln Gly Lys Val Leu His Tyr Tyr Val Val Phe Asp Val Ser
         95                 100                 105aaa gac ttt tta att att ggt gac cca gac cca aca ata gga att acg   388Lys Asp Phe Leu Ile Ile Gly Asp Pro Asp Pro Thr Ile Gly Ile Thr
    110                 115                 120gaa atc tcc aaa aag gat ttt gaa aat gaa tgg acg ggt aat ttc ata   436Glu Ile Ser Lys Lys Asp Phe Glu Asn Glu Trp Thr Gly Asn Phe Ile
125                 130                 135aca ttt tca aaa gga aag aac ttt gtt tca gag aag cag aga aat aac   484Thr Phe Ser Lys Gly Lys Asn Phe Val Ser Glu Lys Gln Arg Asn Asn140                 145                 150                 155agt tta ctc aag ttt att cct att ttg aga cag caa aaa tcc cta ata   532Ser Leu Leu Lys Phe Ile Pro Ile Leu Arg Gln Gln Lys Ser Leu Ile
            160                 165                 170ttc tgg ata gct ttc gcc gca ata cta ttg atg ata att agt att gca   580Phe Trp Ile Ala Phe Ala Ala Ile Leu Leu Met Ile Ile Ser Ile Ala
        175                 180                 185gga tca ctt ttt tta gaa caa ctt gta gat ata tat ata cca cac aaa   628Gly Ser Leu Phe Leu Glu Gln Leu Val Asp Ile Tyr Ile Pro His Lys
    190                 195                 200aat atg gat aca ttg ggg att atc tcg att tgc tta att gga gcc tat   676Asn Met Asp Thr Leu Gly Ile Ile Ser Ile Cys Leu Ile Gly Ala Tyr
205                 210                 215ctt tta cag gcc gta atg acg tat ttt cag aat ttt tta cta act ata   724Leu Leu Gln Ala Val Met Thr Tyr Phe Gln Asn Phe Leu Leu Thr Ile220                 225                 230                 235ttt gga caa aat ctt tct aga aaa att att tta aat tat att aat cac   772Phe Gly Gln Asn Leu Ser Arg Lys Ile Ile Leu Asn Tyr Ile Asn His
            240                 245                 250ctt ttt gaa tta ccc atg tct ttc ttc tca aca cgt aga gtt ggc gaa   820Leu Phe Glu Leu Pro Met Ser Phe Phe Ser Thr Arg Arg Val Gly Glu
        255                 260                 265ata gtc tct cgg ttt aca gat gca agc aag att ata gat gct ttg gca   868Ile Val Ser Arg Phe Thr Asp Ala Ser Lys Ile Ile Asp Ala Leu Ala
    270                 275                 280agt acg att ttg act ctc ttt tta gat gtt tgg atg ttg gtt aca atc   916Ser Thr Ile Leu Thr Leu Phe Leu Asp Val Trp Met Leu Val Thr Ile
285                 290                 295tca atc gtt ctc gta ttt tta aat aca aag tta ttt atg att tct ctg   964Ser Ile Val Leu Val Phe Leu Asn Thr Lys Leu Phe Met Ile Ser Leu300                 305                 310                 315gta tct ata ccg gtg tac tca gtt ata att tat gcg ttt aaa aat aca   1012Val Ser Ile Pro Val Tyr Ser Val Ile Ile Tyr Ala Phe Lys Asn Thr
            320                 325                 330ttt aat ggc ctg aac cat aaa tca atg gaa aat gca gca tta ttg aat   1060Phe Asn Gly Leu Asn His Lys Ser Met Glu Asn Ala Ala Leu Leu Asn
        335                 340                 345tct gca ata atc gaa aac gta act ggc ata gaa act gta aaa tca tta   1108Ser Ala Ile Ile Glu Asn Val Thr Gly Ile Glu Thr Val Lys Ser Leu
    350                 355                 360act tca gaa gaa ttt tcc tac aat caa atc act gat aga ttc gaa aat   1156Thr Ser Glu Glu Phe Ser Tyr Asn Gln Ile Thr Asp Arg Phe Glu Asn
365                 370                 375ttt ctt aac agt tcc tta cgg tat acg ata gct gac caa gga cag caa   1204Phe Leu Asn Ser Ser Leu Arg Tyr Thr Ile Ala Asp Gln Gly Gln Gln380                 385                 390                 395gct tta aaa gtg ggt ttg aag cta att ctt ata gtc ttt atc tta tgg   1252Ala Leu Lys Val Gly Leu Lys Leu Ile Leu Ile Val Phe Ile Leu Trp
            400                 405                 410gct gga gca atc caa gtt atg agg ggg aat ctc aca gtc gga aga tta   1300Ala Gly Ala Ile Gln Val Met Arg Gly Asn Leu Thr Val Gly Arg Leu
        415                 420                 425ttg gct ttt aat gct tta gta aca tac ttt tta aat ccc tta gag aat   1348Leu Ala Phe Asn Ala Leu Val Thr Tyr Phe Leu Asn Pro Leu Glu Asn
    430                 435                 440att att aat tta caa cca aag cta caa act gca aga gtc gct aat att   1396Ile Ile Asn Leu Gln Pro Lys Leu Gln Thr Ala Arg Val Ala Asn Ile
445                 450                 455aga cta aat gaa gta tta tta gtg gat tct gag ttt aat agg ggg gga   1444Arg Leu Asn Glu Val Leu Leu Val Asp Ser Glu Phe Asn Arg Gly Gly460                 465                 470                 475cgc gac agc tca aca aac tta aat ggg gat atc gta ttt caa gat gta   1492Arg Asp Ser Ser Thr Asn Leu Asn Gly Asp Ile Val Phe Gln Asp Val
            480                 485                 490gaa ttt agt tat ggt tac gga tcg aac gta ttg cac aac atc aat ata   1540Glu Phe Ser Tyr Gly Tyr Gly Ser Asn Val Leu His Asn Ile Asn Ile
        495                 500                 505aaa ata caa aag aat agt agt aca acg att gtt ggt atg agc ggt tct   1588Lys Ile Gln Lys Asn Ser Ser Thr Thr Ile Val Gly Met Ser Gly Ser
    510                 515                 520ggg aaa tcc aca tta gca aaa tta atg gtt ggt ttc tat caa gcc gga   1636Gly Lys Ser Thr Leu Ala Lys Leu Met Val Gly Phe Tyr Gln Ala Gly
525                 530                 535tca gga caa ata tta tta aat ggt aaa tta atc gat aac att gat cgt   1684Ser Gly Gln Ile Leu Leu Asn Gly Lys Leu Ile Asp Asn Ile Asp Arg540                 545                 550                 555cat gcc ctg aga caa tcg att acg tat gta cca cag gaa ccg gta atg   1732His Ala Leu Arg Gln Ser Ile Thr Tyr Val Pro Gln Glu Pro Val Met
            560                 565                 570ttc gca ggt aca att tta gaa aat ctt att atg cag aat aaa aga aat   1780Phe Ala Gly Thr Ile Leu Glu Asn Leu Ile Met Gln Asn Lys Arg Asn
        575                 580                 585tta tct att gat aaa gtg aaa gag gca tgt agg ata gcc gaa att gat   1828Leu Ser Ile Asp Lys Val Lys Glu Ala Cys Arg Ile Ala Glu Ile Asp
    590                 595                 600aaa gat ata gaa aat ttt cct atg ggg tat gat aca gat att tcc gaa   1876Lys Asp Ile Glu Asn Phe Pro Met Gly Tyr Asp Thr Asp Ile Ser Glu
605                 610                 615cat ggg agt tca atc tca gta ggt caa aaa caa aga ctt tct att gca   1924His Gly Ser Ser Ile Ser Val Gly Gln Lys Gln Arg Leu Ser Ile Ala620                 625                 630                 635aga tca ctg ctg aca gag tct aat gtt tta ctg ttt gat gaa tca acc   1972Arg Ser Leu Leu Thr Glu Ser Asn Val Leu Leu Phe Asp Glu Ser Thr
            640                 645                 650agt agt ttg gac act att act gag cag cga ata att gaa aac cta ttg   2020Ser Ser Leu Asp Thr Ile Thr Glu Gln Arg Ile Ile Glu Asn Leu Leu
        655                 660                 665aat tta aat gac aaa aca tta ata ttc gtt gca cat cga ttg tca gtt   2068Asn Leu Asn Asp Lys Thr Leu Ile Phe Val Ala His Arg Leu Ser Val
    670                 675                 680gct aag caa act gaa aat att atc gtt atg gat cac ggt gga att gtt   2116Ala Lys Gln Thr Glu Asn Ile Ile Val Met Asp His Gly Gly Ile Val
685                 690                 695gaa aca ggt tcg cat gat aaa tta ata ttg gaa aat gga tat tat aaa   2164Glu Thr Gly Ser His Asp Lys Leu Ile Leu Glu Asn Gly Tyr Tyr Lys700                 705                 710                 715gaa tta tgt act gtg aag acg aag aaa aaa gaa ttt tagataaaac aaaa   2214Glu Leu Cys Thr Val Lys Thr Lys Lys Lys Glu Phe
            720                 725<210>14<211>727<212>PRT<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)<400>14Leu Phe Asn Leu Leu Arg Tyr Lys Lys Leu Tyr Cys Ser Gln Val Asp1               5                  10                  15Glu Asp Asp Cys Gly Ile Ala Ala Leu Asn Met Ile Phe Lys Asn Phe
         20                  25                  30Gly Ser Glu Tyr Ser Leu Ser Lys Leu Arg Phe Leu Ala Lys Thr Ser
     35                  40                  45Gln Gln Gly Thr Thr Ile Phe Gly Leu Ile Lys Ala Ala Glu Glu Leu
 50                  55                  60Asn Leu Glu Ala Asn Ala Leu Gln Ala Asp Met Gly Ile Phe Lys Asp65                  70                  75                  80Glu Asn Leu Met Leu Pro Ile Ile Ala His Val Leu Lys Gln Gly Lys
             85                  90                  95Val Leu His Tyr Tyr Val Val Phe Asp Val Ser Lys Asp Phe Leu Ile
        100                 105                 110Ile Gly Asp Pro Asp Pro Thr Ile Gly Ile Thr Glu Ile Ser Lys Lys
    115                 120                 125Asp Phe Glu Asn Glu Trp Thr Gly Asn Phe Ile Thr Phe Ser Lys Gly
130                 135                 140Lys Asn Phe Val Ser Glu Lys Gln Arg Asn Asn Ser Leu Leu Lys Phe145                 150                 155                 160Ile Pro Ile Leu Arg Gln Gln Lys Ser Leu Ile Phe Trp Ile Ala Phe
            165                 170                 175Ala Ala Ile Leu Leu Met Ile Ile Ser Ile Ala Gly Ser Leu Phe Leu
        180                 185                 190Glu Gln Leu Val Asp Ile Tyr Ile Pro His Lys Asn Met Asp Thr Leu
    195                 200                 205Gly Ile Ile Ser Ile Cys Leu Ile Gly Ala Tyr Leu Leu Gln Ala Val
210                 215                 220Met Thr Tyr Phe Gln Asn Phe Leu Leu Thr Ile Phe Gly Gln Asn Leu225                 230                 235                 240Ser Arg Lys Ile Ile Leu Asn Tyr Ile Asn His Leu Phe Glu Leu Pro
            245                 250                 255Met Ser Phe Phe Ser Thr Arg Arg Val Gly Glu Ile Val Ser Arg Phe
        260                 265                 270Thr Asp Ala Ser Lys Ile Ile Asp Ala Leu Ala Ser Thr Ile Leu Thr
    275                 280                 285Leu Phe Leu Asp Val Trp Met Leu Val Thr Ile Ser Ile Val Leu Val
290                 295                 300Phe Leu Asn Thr Lys Leu Phe Met Ile Ser Leu Val Ser Ile Pro Val305                 310                 315                 320Tyr Ser Val Ile Ile Tyr Ala Phe Lys Asn Thr Phe Asn Gly Leu Asn
            325                 330                 335His Lys Ser Met Glu Asn Ala Ala Leu Leu Asn Ser Ala Ile Ile Glu
        340                 345                 350Asn Val Thr Gly Ile Glu Thr Val Lys Ser Leu Thr Ser Glu Glu Phe
    355                 360                 365Ser Tyr Asn Gln Ile Thr Asp Arg Phe Glu Asn Phe Leu Asn Ser Ser
370                 375                 380Leu Arg Tyr Thr Ile Ala Asp Gln Gly Gln Gln Ala Leu Lys Val Gly385                 390                 395                 400Leu Lys Leu Ile Leu Ile Val Phe Ile Leu Trp Ala Gly Ala Ile Gln
            405                 410                 415Val Met Arg Gly Asn Leu Thr Val Gly Arg Leu Leu Ala Phe Asn Ala
        420                 425                 430Leu Val Thr Tyr Phe Leu Asn Pro Leu Glu Asn Ile Ile Asn Leu Gln
    435                 440                 445Pro Lys Leu Gln Thr Ala Arg Val Ala Asn Ile Arg Leu Asn Glu Val
450                 455                 460Leu Leu Val Asp Ser Glu Phe Asn Arg Gly Gly Arg Asp Ser Ser Thr465                 470                 475                 480Asn Leu Asn Gly Asp Ile Val Phe Gln Asp Val Glu Phe Ser Tyr Gly
            485                 490                 495Tyr Gly Ser Asn Val Leu His Asn Ile Asn Ile Lys Ile Gln Lys Asn
        500                 505                 510Ser Ser Thr Thr Ile Val Gly Met Ser Gly Ser Gly Lys Ser Thr Leu
    515                 520                 525Ala Lys Leu Met Val Gly Phe Tyr Gln Ala Gly Ser Gly Gln Ile Leu
530                 535                 540Leu Asn Gly Lys Leu Ile Asp Asn Ile Asp Arg His Ala Leu Arg Gln545                 550                 555                 560Ser Ile Thr Tyr Val Pro Gln Glu Pro Val Met Phe Ala Gly Thr Ile
            565                 570                 575Leu Glu Asn Leu Ile Met Gln Asn Lys Arg Asn Leu Ser Ile Asp Lys
        580                 585                 590Val Lys Glu Ala Cys Arg Ile Ala Glu Ile Asp Lys Asp Ile Glu Asn
    595                 600                 605Phe Pro Met Gly Tyr Asp Thr Asp Ile Ser Glu His Gly Ser Ser Ile
610                 615                 620Ser Val Gly Gln Lys Gln Arg Leu Ser Ile Ala Arg Ser Leu Leu Thr625                 630                 635                 640Glu Ser Asn Val Leu Leu Phe Asp Glu Ser Thr Ser Ser Leu Asp Thr
            645                 650                 655Ile Thr Glu Gln Arg Ile Ile Glu Asn Leu Leu Asn Leu Asn Asp Lys
        660                 665                 670Thr Leu Ile Phe Val Ala His Arg Leu Ser Val Ala Lys Gln Thr Glu
    675                 680                 685Asn Ile Ile Val Met Asp His Gly Gly Ile Val Glu Thr Gly Ser His
690                  695                700Asp Lys Leu Ile Leu Glu Asn Gly Tyr Tyr Lys Glu Leu Cys Thr Val705                 710                 715                 720Lys Thr Lys Lys Lys Glu Phe
            725<210>15<211>3055<212>DNA<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)<400>15agcttcggga ttcttagcta tatcaatttt gctataaact tgggaaagaa cgtcaataat 60atcgagtaat tcactggatt ttacaggacg cttttctagt aagtgcaaga gagcttcgat 120gttgttttta gattcagttt taatattgtc tttgtttgcc attttaatca cgtctccttt 180tttatagtaa taaaaaaaac acaattaaat tagtgctttt ttatctggta attaacaaac 240tccatgaccg ccattagcta gatggtttac tccacaagtc catgcttgcc cccaatttac 300tgaacagccg tgagagttac agctaacgcc attaccatag tatttaccac ctgtaataga 360tttcatttct tgaattgtta ggctttttgc gtttttcata aagaacatct ccaaattata 420ttttttagtg attcttgaag ttctgttgta acgcagaatt ttggaagaat gagtacttgt 480tagaaatttg ccgatttaaa taattaacaa accccatgac cgccattagc tagatgattt 540accccacaag tccatgcttg cccccaattt actgaacaac catgagagtt acagctaaca 600ccattaccat agtatttacc acctgtgatg gattttattt cttggatcgt taagctacgt 660gtattcttca ttttgaatac ctcctgttaa ataattttta cacgatcagt gtagttctaa 720tgtgaaattg tgtcaagttt agcaaatata tattttaggc atggaaaaac ttgcttttaa 780ttcgacttga ctataacggt ataatactgg tattactata tttgtttagc ttcacaaaaa 840aattaggaga cttatatatt gtttaatctg ttgagataca aaaaattata ttgttcacaa 900gtggatgaag atgattgtgg aatcgcagct ttgaatatga tttttaaaaa ttttggttcc 960gaatattcac tatcaaaatt gcgattctta gcaaaaacca gtcaacaagg gactactatt 1020tttggactga taaaggctgc agaggaacta aatttagaag cgaatgcatt acaagctgat 1080atgggcatct ttaaagatga aaatttaatg ctaccaatca ttgcacatgt tttaaagcaa 1140ggaaaagttc tgcattacta cgttgtattt gatgtttcga aagacttttt aattattggt 1200gacccagacc caacaatagg aattacggaa atctccaaaa aggattttga aaatgaatgg 1260acgggtaatt tcataacatt ttcaaaagga aagaactttg tttcagagaa gcagagaaat 1320aacagtttac tcaagtttat tcctattttg agacagcaaa aatccctaat attctggata 1380gctttcgccg caatactatt gatgataatt agtattgcag gatcactttt tttagaacaa 1440cttgtagata tatatatacc acacaaaaat atggatacat tggggattat ctcgatttgc 1500ttaattggag cctatctttt acaggccgta atgacgtatt ttcagaattt tttactaact 1560atatttggac aaaatctttc tagaaaaatt attttaaatt atattaatca cctttttgaa 1620ttacccatgt ctttcttctc aacacgtaga gttggcgaaa tagtctctcg gtttacagat 1680gcaagcaaga ttatagatgc tttggcaagt acgattttga ctctcttttt agatgtttgg 1740atgttggtta caatctcaat cgttctcgta tttttaaata caaagttatt tatgatttct 1800ctggtatcta taccggtgta ctcagttata atttatgcgt ttaaaaatac atttaatggc 1860ctgaaccata aatcaatgga aaatgcagca ttattgaatt ctgcaataat cgaaaacgta 1920actggcatag aaactgtaaa atcattaact tcagaagaat tttcctacaa tcaaatcact 1980gatagattcg aaaattttct taacagttcc ttacggtata cgatagctga ccaaggacag 2040caagctttaa aagtgggttt gaagctaatt cttatagtct ttatcttatg ggctggagca 2100atccaagtta tgagggggaa tctcacagtc ggaagattat tggcttttaa tgctttagta 2160acatactttt taaatccctt agagaatatt attaatttac aaccaaagct acaaactgca 2220agagtcgcta atattagact aaatgaagta ttattagtgg attctgagtt taataggggg 2280ggacgcgaca gctcaacaaa cttaaatggg gatatcgtat ttcaagatgt agaatttagt 2340tatggttacg gatcgaacgt attgcacaac atcaatataa aaatacaaaa gaatagtagt 2400acaacgattg ttggtatgag cggttctggg aaatccacat tagcaaaatt aatggttggt 2460ttctatcaag ccggatcagg acaaatatta ttaaatggta aattaatcga taacattgat 2520cgtcatgccc tgagacaatc gattacgtat gtaccacagg aaccggtaat gttcgcaggt 2580acaattttag aaaatcttat tatgcagaat aaaagaaatt tatctattga taaagtgaaa 2640gaggcatgta ggatagccga aattgataaa gatatagaaa attttcctat ggggtatgat 2700acagatattt ccgaacatgg gagttcaatc tcagtaggtc aaaaacaaag actttctatt 2760gcaagatcac tgctgacaga gtctaatgtt ttactgtttg atgaatcaac cagtagtttg 2820gacactatta ctgagcagcg aataattgaa aacctattga atttaaatga caaaacatta 2880atattcgttg cacatcgatt gtcagttgct aagcaaactg aaaatattat cgttatggat 2940cacggtggaa ttgttgaaac aggttcgcat gataaattaa tattggaaaa tggatattat 3000aaagaattat gtactgtgaa gacgaagaaa aaagaatttt agataaaaca aaaac      3055<210>16<211>17<212>DNA<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)<400>16ccttggtcag gctatcg                                                17<210>17<211>20<212>DNA<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)<400>17atcacctttt tgaattaccc                                             20

Claims (23)

1.分离多肽，特征为它是由清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)2512衍生的、称为sakacin G的细菌素。
2.依照权利要求1的分离多肽，特征为它是IIa型细菌素。
3.分离多肽，特征为它包含SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：4。
4.分离多肽，特征为它包含SEQ ID NO：12。
5.核酸，特征为它包含编码依照权利要求1-4之任一的多肽的核苷酸序列。
6.依照权利要求5的核酸，特征为它包含SEQ ID NO：1和/或SEQID NO：3。
7.依照权利要求5或6的核酸，特征为它包含核酸序列SEQ ID NO：15。
8.依照权利要求5或6的核酸，特征为它包含核酸序列SEQ ID NO：9。
9.分离多肽，特征为它包含SEQ ID NO：6。
10.分离多肽，特征为它包含SEQ ID NO：8。
11.分离多肽，特征为它包含SEQ ID NO：14。
12.包含SEQ ID NO：5的核酸。
13.包含SEQ ID NO：7的核酸。
14.包含SEQID NO：13的核酸。
15.包含依照权利要求5-8、12或14之任一项的核酸的克隆和/或表达载体。
16.经依照权利要求15的载体转化的宿主细胞。
17.依照权利要求16的宿主细胞，特征为它是选自下组的微生物：乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、链球菌属(Streptococcus)、片球菌属(Pediococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)，或者它是酵母。
18.重组多肽的生产方法，其中将包含依照权利要求5-8、12或14之任一项的核酸的载体转移至宿主细胞中，并将其在容许表达依照权利要求1-4或9-11之任一项的多肽或由权利要求5-8、12或14之任一中定义的核酸序列编码的多肽的条件下进行培养。
19.依照权利要求1-4之任一的多肽在食品制作中作为抗致病或非期望菌群的活性剂的用途。
20.依照权利要求19的用途，特征为将所述多肽用于在食品中抑制李斯特菌(Listeria)、尤其是单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的生长和繁殖。
21.依照权利要求19或20的用途，特征为在食品中由菌株清酒乳杆菌2512生成所述多肽。
22.菌株清酒乳杆菌2512在食品中用于生成依照权利要求1-4之任一的细菌素多肽的用途。
23.细菌素组合物，特征为它包含至少一种依照权利要求1-4之任一的多肽或菌株清酒乳杆菌2512。
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