CN103409450A - 一种产广谱耐热细菌素基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了产广谱耐热型细菌素基因工程菌及其构建方法与应用。本发明提供了一种基因工程菌，细菌素的编码基因如序列1DNA分子或与序列1DNA分子杂交且有相同功能的DNA分子或与上述DNA分子具有90％以上同源性而且具有相同功能的DNA分子。其步骤：(1)细菌素编码基因引物的设计与扩增(2)PCR产物的纯化、回收，克隆与鉴定(3)目的基因与表达载体质粒pET-28a(+)的酶切(4)目的基因与表达载体质粒的连接与转化(5)重组基因工程菌的鉴定与细菌素表达。本发明提供的基因工程菌可超量表达耐热型广谱细菌素，稳定性好可连续批量生产。

Description

一种产广谱耐热细菌素基因工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，提供了一种利用大肠埃希氏菌表达系统构建基因工程菌生产广谱耐热细菌素的方法和应用。

背景技术

细菌素(Bacteriocins)是某些细菌在代谢过程中，通过核糖体合成机制产生的一类具有抗菌活性的多肽、蛋白质或蛋白质复合物，具有高效、无毒、耐高温、无残留、无抗药性等优点。乳酸菌分泌的细菌素是一类重要的蛋白、肽类抑菌物质，它能抑制多种食物源病原菌和腐败菌，是潜在的生物防腐保鲜剂和饲料抑菌添加剂，在食品工业和饲料添加剂领域中具有重要的作用。

近年来备受人们关注的乳酸链球菌肽Nisin即是是世界上公认安全的细菌素类防腐剂，作为食品保鲜剂，已在52个国家和地区使用。而采用传统的筛选野生菌种生产细菌素，存在细菌素产量低，分离纯化步骤复杂，生产成本高等问题。因此，可以通过细菌素的异源表达来提高产量，以便进行细菌素结构与功能及应用的研究。目前适于细菌素表达的系统包括乳酸菌表达系统和大肠埃希氏菌表达系统，特别是大肠埃希氏菌表达系统具有表达蛋白活性高和纯化方便等特点。由于大多数细菌素是小分子多肽，容易被细胞酶降解，且不易检测，因此可以通过融合表达的方式将细菌素基因克隆到pET-28a(+)表达载体并转化到大肠埃希菌中，从而获得细菌素融合表达蛋白。

我国有丰富的乳酸菌资源，随着乳酸菌基因组序列报道的日趋增多，根据细菌素氨基酸的保守序列及其结构基因上下游编码基因的特征，利用生物信息学工具设计细菌素基因的引物，扩增、克隆和表达细菌素基因，已成为必然的趋势和规模化生产细菌素的新途径。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种构建产细菌素基因工程菌方法。

本发明提供的构建产细菌素基因工程菌方法，包括以下步骤：

(1)利用PCR方法扩增细菌素编码基因

参考GenBank上Enterococcus faecium enterocin A序列，应用Primer5设计一对引物，引物序列：上游引物P1：5′-TAGGGGATCCGAGATTATGAAACAT-3′(下划线处为BamHI酶切位点)，下游引物：5′-TTTTCTCGAGTTAGCACTTCCCTGG-3′(下划线处为XhoI酶切位点)。上述引物由上海生工合成。

以粪肠球菌E15-CUI细菌培养物中提取的DNA产物为模板，应用PCR技术扩增出了实验室分离株粪肠球菌E15-CUI的伏尔加霉素细菌素蛋白全基因，该目的基因片段大小为273bp。

上述粪肠球菌菌株E15-CUI于2012年5月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.6130，分类命名为粪肠球菌Enterococcus faecalis。

(2)目的基因PCR产物的纯化与克隆载体T载体pGM-T EntA连接

参照DNA回收试剂盒说明书进行操作，电泳分离DNA片段，从琼脂糖凝胶上切下所需DNA片段，PCR和酶切鉴定。

(3)融合表达载体质粒pET-28a EntA的构建

以测序正确的pGMT-EntA为模板，利用引物P1和P2进行PCR扩增，产物回收、纯化后进行BamH I和Xho I双酶切，酶切产物连接至经同样酶切的pET-28a载体，

构建重组表达载体pET-28a EntA，转化BL21(DE3)感受态细胞，阳性克隆命名为

BL21(DE3)/pET28a-EnterocinA。

(4)重组蛋白EnterocinA的诱导表达

将重组菌株BL21(DE3)/pET28a-EnterocinA划线培养，挑取单菌落接种于LB(Luria-Bertani)培养基中(含100mg/L氨苄青霉素和34mg/L氯霉素)，37℃振荡培养，转速设定为200rpm，至OD600值的范围在0.6-0.8之间时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG诱导，37℃200rpm振摇诱导培养3-6h离心收集菌体，室温超声破碎，离心收集上清液，用一次性滤器过滤。

(5)EnterocinA细菌素的耐热性

将收集的上清液分别于60至121℃水浴作用一定时间，取3株指示菌进行抑菌试验，同时设未处理组对照，观察EnterocinA细菌素对热的耐受性。

(6)EnterocinA细菌素的抑菌活性

采用琼脂双层扩散法测定EnterocinA细菌素对畜禽病原菌的抑菌活性，上述抑菌为抑制大肠埃希氏菌、鸡白痢沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌、炭疽芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、中的至少一种；

本发明的实验证明，从实验室分离株E15-CUI CGMCC NO.6130扩增出伏尔加霉素全基因，经过产物纯化、提取、克隆，成功构建融合表达载体pET-28a EntA和阳性重组菌株BL21(DE3)/pET28a-EnterocinA，该菌株表达的伏尔加霉素以包涵体形式存在，对大肠埃希氏菌、鸡白痢沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、普通变形杆菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌、炭疽芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌具有显著的抑制作用。

附图说明

图1为表达载体pET-entA构建过程图

图2为entA基因PCR和表达载体酶切鉴定结果

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1表达伏尔加霉素A(enterocin A)基因工程菌的构建

1.伏尔加霉素A基因的克隆

(1)基因扩增引物的设计

以粪肠球菌Enterococcus faecium基因组DNA为模板，参考GenBank上Enterococcusfaecium enterocin A序列，应用Primer5设计一对引物，引物序列：上游引物P1：

5′-TAGGGGATCCGAGATTATGAAACAT-3′(下划线处为BamHI酶切位点)，下游引物：5′-TTTTCTCGAGTTAGCACTTCCCTGG-3′(下划线处为XhoI酶切位点)，上述引物由上海生工合成。

(2)PCR扩增

以肠球菌DNA为模板，按顺序加入以下试剂，建立50μL PCR反应体系：

用无菌去离子水补至50μL，按以下程序进行反应：95℃预变性10min，进入循环：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，共30个循环，最后72℃延伸10min，4℃1min。预期扩增产物长度为273bp。

(3)PCR产物的纯化、回收，克隆与鉴定

琼脂糖凝胶电泳，对胶回收的条带进行BamHI和XhoI双酶切鉴定。对回收的目的片段和pMD19-T载体进行T4连接酶连接，转化到dH5α大肠埃希菌中，筛选阳性克隆，提取质粒，PCR扩增并测序，测序结果与GenBank登记的enterocin A基因一致。(详见序列表的表1)。

2.伏尔加霉素A基因表达载体的构建

(1)目的基因与表达载体质粒pET-28a(+)的酶切

用限制性内切酶BamHI和XhoI对目的基因和表达载体质粒pET-28a(+)进行酶切，条件如下：

用无菌去离子水补至40μL，离心混匀于管底，37℃水浴作用3h。

(2)电泳回收酶切后的目的基因和表达载体DNA

参照DNA回收试剂盒说明书操作。

(3)目的基因与表达载体DNA的连接与转化

按顺序加入下列试剂建立10μL的连接体系，将纯化回收后的产物与表达载体pET-28a(+)连接：

用无菌去离子水补至10μL，离心混匀于管底，4℃连接过夜。

取-80℃冰冻的BL21(DE3)感受态细胞(100μL/管)于冰上融化，吸取5μL连接物加入上述盛有感受态细胞的离心管中，轻弹管壁混匀，冰浴30min。42℃水浴热激30s后，立即冰浴2min。加入250μL LB培养液37℃摇菌1h。取100μL菌液涂布于Kan或Amp/LB平板，37℃培养过夜，利用抗生素抗性筛选重组转化体。

(4)重组表达载体的鉴定

挑取单个抗性转化子菌落，接种3mL Kan或Amp/LB液体培养基，37℃摇菌过夜，用碱裂解法提取阳性重组质粒pET-28a-EntA，做以下鉴定：

PCR鉴定：应用基因特异性引物进行PCR扩增，电泳鉴定扩增产物，见图1。

酶切鉴定：用BamH I和Xho I双酶切重组质粒，37℃反应3h，1％琼脂糖电泳检查插入片段的大小，见图1。阳性重组菌命名为BL21(DE3)/pET28a-EntA

实施例2BL21(DE3)/pET28a-EntA产enterocin A的诱导表达

将BL21(DE3)/pET28a-EntA接种到100mL Kana/LB液体培养基中。置37℃摇床中进行增菌。3h后，取出菌液，取少量样品，用分光光度计测其OD₆₀₀值，当OD₆₀₀值的范围在0.6-0.8之间时，从-20℃冰箱中取出IPTG，置室温下融化，用涡旋震荡器将IPTG混匀。向100ml菌液中加入12μL IPTG，将菌液重新放入摇床中，进行IPTG诱导，25℃、200rpm培养4h。将所有菌液转移到离心管中，于4℃条件下，8000rpm离心6min。将上清液弃去，收集诱导表达后的菌体，用灭菌PBS缓冲液3ml使全部菌体重新悬浮，然后进行超声波裂解。裂解条件如下：4℃冰浴间断超声，超声5s、间歇5s，共5min，波幅为38％。待菌液较清亮时(作用约20min)，将破碎完的细胞菌体再次转移到新离心管中，进行二次离心，4℃条件下，12000rpm离心20min。将上清液用一次性滤器过滤后保存于4℃冰箱中备用。

实施例3BL21(DE3)/pET28a-EntA产enterocin A的耐热性

取实施例2制备好的enterocin A进行以下热处理：121℃高压、100℃、80℃和60℃水浴分别作用10min、20min，取100ul/孔，加到已分别涂布大肠埃希氏菌C83552、大肠埃希氏菌C83907和金黄色葡萄球菌2086指示菌的平板，37℃，24h培养后测定enterocin A的抑菌活性，以未处理的样品作为对照，检测抑菌活性的变化。

表2enterocinA对热的稳定性

注：+++表示抑菌直径＞16mm，++表示11mm＜抑菌直径＜16mm，+表示抑菌直径＜11mm

可以看出，重组菌产生的enterocin A对热具有一定的耐受性，60℃、80℃、100℃、121℃高压、处理10min-20min与对照组比较，对3株指示菌的抑菌活性几乎没有影响，仅121℃高压、处理20min组，抑菌活性略有下降，表明该细菌素enterocin A对热具有一定的抵抗力，属于耐热型细菌素。

实施例4BL21(DE3)/pET28a-EntA产enterocin A的抑菌谱

抑菌实验采用琼脂平板双层扩散法，在涂布指示菌的PYG平板上，用打孔器在平板上打孔，孔径6mm、孔距2cm-3cm，用酒精灯加热封底，中央孔内，加入步骤(4)收集的上清液100ul，另设生理盐水对照孔，每株指示菌3个重复，待细菌上清液4℃冰箱静止扩散完后，倒置37℃培养24h，测定其抑菌圈直径。

表1为抑菌试验结果

可以看出重组菌株BL21(DE3)/pET28a-EntA培养后经诱导产生的EnterocinA以包涵体形式存在，具有可溶性，显示了广谱的抗菌活性，对大肠埃希氏菌、鸡白痢沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、普通变形杆菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌等17株病原菌具有抑制作用，抑菌圈直径达7-26mm，对2株大肠埃希氏菌抑菌活性最强，达到25-26mm。

Claims (8)

1.一种构建产细菌素基因工程菌的方法，包括以下具体步骤，模板细菌素编码基因的扩增，目的基因克隆，PCR和双酶切鉴定，构建表达载体，目的基因导入宿主菌，获得表达细菌素的基因工程菌，所述细菌素的核苷酸、氨基酸序列如序列1所示。 

2.根据权利要求1所述的方法，其细菌素的编码基因如序列1 DNA分子或与序列1 DNA分子杂交且有相同功能的DNA分子或与上述DNA分子具有90％以上同源性而且具有相同功能的DNA分子。 

3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于：细菌素编码基因通过构建重组表达载体。 

4.根据权利要求1-3中上述方法，其特征在于：表达载体导入的宿主菌为大肠埃希菌BL21(DE3)。 

5.根据权利要求1-4任一上述方法，其特征在于：所述表达载体为pET28a，将细菌素的编码基因插入pET28a的多克隆位点而获得重组表达载体，导入BL21(DE3)大肠埃希菌获得基因工程菌。 

6.权利要求5所述基因工程菌制备细菌素。 

7.一种制备细菌素的方法，包括如下步骤：培养权利要求5所述基因工程菌，IPTG诱导表达，获得细菌素。 

8.权利要求7所述的方法，其特征在于：培养基因工程菌的温度为37℃、200rpm，当菌液浓度达到OD₆₀₀介于0.6-0.8时，加入IPTG、25℃、200rpm诱导培养4h，收集菌体，加入PBS缓冲液，4℃或室温进行超声波菌体裂解，收集上清液，即为表达的细菌素。 

Images