CN1430669A - 新的环糊精·葡聚糖转移酶及其制造方法和用该酶制造环糊精的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种有下述酶化学性质的CGTase。①作用及底物特异性：作用于淀粉、糊精、支链淀粉或直链淀粉，主要生成γ－环糊精，β－及α－环糊精的生成量比γ－环糊精的生成量低。②最佳pH：10.5－11.0③最佳温度：60℃左右④稳定pH：6－11⑤温度稳定性：在50℃条件下、处理15分钟显示90％以上的残存活性。CGTase的制造方法是培养属于库拉奇芽孢杆菌种的有产生CGTase能力的微生物(例如FERM BP－7156)，使其在培养物中产生CGTase，然后获取生成的CGTase。CD的制造方法是在含有淀粉等的溶液中使库拉奇芽孢杆菌种产生的CGTase进行反应，使其主要生成γ－CD。提供能优先生成γ－CD的γ－环糊精·葡聚糖转移酶(CGTase)、有生产γ－CGTase能力的微生物、用γ－CGTase制造γ－CD的方法。

Description

新的环糊精·葡聚糖转移酶及其制造方法和 用该酶制造环糊精的方法
技术领域
本发明涉及一种环糊精·葡聚糖转移酶(glucanotransferase)(EC 2.4.1.19、以下称为CGTase)及其制造方法以及使用它制造环糊精(以下称为CD)的方法。
背景技术
CGTase(EC2.4.1.19)是作用于淀粉等的α-1，4-葡聚糖，由于其分子内转移活性而生成作为环状α-1，4-葡聚糖的环糊精(CD)的酶。由CGTase生成的CD的聚合度主要是6～8。分别称为α-、β-及γ-CD。除了CD生成反应之外，CGTase通过分子间转移反应，对偶合反应(使CD开环，把直链低聚糖转移到受容体糖分子中)或歧化反应(在受容体糖分子中使直链糖转移)进行催化。此外CGTase虽然微弱但也催化α-1，4葡糖苷键的加水分解反应。
因为CD与许多的分子形成包合物，它的化学及物理的许多性质都可能改变，所以CGTase在食品、医药、化妆品工业中是重要的酶。因此，1939年开始用浸麻类芽孢杆菌进行CD合成反应(E.B.Tilden andS.J.Pirt，J.Am.Chem.Soc.，63，2900-2902，1939)。其后，进行了包括对产生CGTase的细菌的检索或酶的精制等多方研究(Sumiokitahata，Naoto Tsuyama and Shigetaka Okada，Agr.Biol.Chem.，38(2)，387-393，1974、Sumio kitahata and Shigetaka Okada，Agr.Biol.Chem.，38(12)，2413-2417，1974、Sumio kitahata andShigetaka Okada，J.Jap.Soc.Starch Sci.，29(1)，13-18，1982、Michio Kubota，Yoshiki Matsuura，Shuzo Sakai and YukiteruKatsube，Denpun Kagaku，38(2)，141-146，1991、Lionel J.Bovetto，Daniel P.Backer，Jaques R.Villette，Philippe J.Sicard，andStephane J-L.Bouquelet，Biotechnology and Applied Biochemstry，15，48-58，1992、Shinske Fujiwara，Hirofumi Kakihara，Kim MyungWoo，Andre Lejeune，Mitsuhide Kanemoto，Keiji Sakaguchi，andTadayuki Imanaka，Applied and environmental microbiology，58(12)，4016-4025，1992、Florian Binder，Otto Huber and AugustBock，Gene，47，269-277，1986、Keiji Kainuma，Toshiya Takanoand Kunio Yamane，Appl.Microbiol.Biotechnol.，26，149-153，1987、Takahiro Kaneko，Tetsuo Hamamoto and Koki Horikoshi，J.general Microbiology，134，97-105，1988、Murai Makela，PekkaMattsson，M.Eugenia Schinina，and Timo Korpela，Biotechnologyand Applied biochemistry，10，414-427，1988、Ernest K.C.Yu，Hiroyuki Aoki，and MasanaruMisawa，Appl.Microbiol.Biotechnol.，28，377-379，1988)。
CGTase根据其合成的主要CD种类分为α-、β-CGTase及γ-CGTase。过去报告的许多都是α-或β-CGTase，报告的γ-CGTase酶数量很少(Shigeharu Mori，Susumu Hirose，Takaichi Oya，and SumioKitahata，Oyo Toshitsu Kagaku，41(2)，245-253，1994、YoshitoFujita，Hitoshi Tsubouchi，Yukio Inagi，Keiji Tomita，AkiraOzaki，and Kazuhiro Nakanishi，J.Fermentation andBioengineering，70(3)，150-154，1990、Takashi Kato and KokiHorikoshi，J.Jpn.Soc.Starch Sci.，33(2)，137-143，1986)。
而且，即使在γ-CGTase酶的报告中，γ-CD的生成量也仅为5％以下，在反应后期β-CD的生成速度加快，生成与γ-CD同量或比它多量的β-CD，或者在10％以上的底物浓度范围，γ-CD的产量显著地低，作为对策，有必要使乙醇在反应液中共存等，不是工业上可利用的酶。
另外，也在尝试改变α-或β-CGTase的构造遗传基因，改善γ-CD的产量(Akira Nakamura，KeikoHaga，and Kunio Yamane，Biochemstry，32，6624-6631，1993、Michio Kubota，YoshikiMatsuura，Shuzo Sakai and Yukiteru Kutsume，Oyo ToshitsuKagaku，41(2)，245-253，1994)。可是，即使这能增加γ-CD的产量，也不能使以原来的活性产生的β-CD明显减少，从工业的观点考虑不能说是充分的方法。
所以，现状是α-CD及β-CD被利用于各个领域而γ-CD却是几乎没有被利用。含有CD的糖浆也是同样，α-或β-CD为主要成分的CD糖浆应用于各个领域，以γ-CD为主要成分的CD糖浆的应用却很少。
本发明的目的是提供一种能优先生成γ-CD的新γ-CGTase，因此提供有生产新γ-CGTase能力的微生物也是本发明的目的。
进而，本发明的目的还在于提供用上述γ-CGTase制造γ-CD的方法。
为实现上述目的，本发明的发明者们在广阔的自然界中探索具有产生制造γ-CD的CGTase能力的微生物。结果发现在认定为属于库拉奇芽孢杆菌种的菌株中有能产生CGTase的菌株。而且，培养这种微生物，在培养物中使它产生CGTase，并采取它进行鉴定，结果发现这种CGTase是新的酶，完成了本发明。又发现使用这种CGTase能优先制造γ-CD，从而确立了γ-CD的工业制造法。
发明概述
本发明是关于具有下述酶化学性质的环糊精·葡聚糖转移酶。
①作用及底物特异性：作用于淀粉、糊精、支链淀粉或直链淀粉，主要生成γ-环糊精，β-及α-环糊精的生成量比γ-环糊精的生成量低。
②最适当的pH：10.5-11.0
③最适当的温度：60℃左右
④稳定的pH：6-11
⑤温度稳定性：50℃、经15分钟处理表现为90％以上的残存活性。
本发明制造环糊精·葡聚糖转移酶的方法有如下特征，培养属于库拉奇芽孢杆菌(Bacillus clarkii)种的有生产环糊精·葡聚糖转移酶能力的微生物，使环糊精·葡聚糖转移酶在培养物中产生，然后再获取生成的环糊精·葡聚糖转移酶。
在上述制造方法中属于库拉奇芽孢杆菌种的有生产环糊精·葡聚糖转移酶能力的微生物，可以采用库拉奇芽孢杆菌7364株(FERMBP-7156)。
进而，本发明的制造环糊精的方法有如下特征，在含有选自淀粉、糊精、支链淀粉及直链淀粉中至少1种的溶液中，使库拉奇芽孢杆菌种产生的环糊精·葡聚糖转移酶进行反应，使其主要生成γ-环糊精，然后获取生成的γ-环糊精。
在上述本发明的环糊精制造方法中的环糊精·葡聚糖转移酶可以是本发明的环糊精·葡聚糖转移酶。
本发明还涉及作为有产生环糊精·葡聚糖转移酶能力的库拉奇芽孢杆菌种菌的库拉奇芽孢杆菌7364株(FERMBP-7156)。
附图简要说明
图1为表示pH影响库拉奇芽孢杆菌7364产生的γ-CGTase活性(Blue value法)的曲线图。
图2为表示温度影响库拉奇芽孢杆菌7364产生的γ-CGTase活性(Blue value法)的曲线图。
图3为以可溶性淀粉为底物的γ-CD生成反应的经时变化图。
实施本发明的最佳形态
[环糊精·葡聚糖转移酶]
表1归纳了本发明者们新发现、分离的菌株的菌学性质。
表1
菌株的各种性质
    培养温度                   37℃
    细胞形态    有杆菌(0.6～0.8×3～5μm)伸长型
   革兰氏染色                  +
       孢子                  ±
      运动性                  +
    菌落形态 菌落的形状  ：不规则形菌落的边缘  ：丝状菌落表面隆起：低而平光泽        ：无光泽颜色        ：乳酪色大小        ：Φ3～4mm特征        ：菌落固定在培养基上
    过氧化氢酶                  +
    氧化酶                  +
     O/F试验                  -
  β-半乳化糖苷酶                  +
  精氨酸水化酶                  -
  蓖麻蛋白脱羧酶                  -
  鸟氨酸脱羧酶                  -
  柠檬酸的利用                  -
      H2S产生                -
      尿素酶                -
  色氨酸脱酰胺酶                -
    吲哚产生                -
   3-羟基丁酮产生                +
     白明胶酶                -
    硝酸盐还原                -
     加水分解             酪蛋白+动物胶+淀粉+Tween20-Tween40+Tween60+
苯基丙氨酸脱酰胺酶                -
     生育性               10℃-40℃+50℃-pH7-5％NaCl+10％NaCl+
    鉴定的结果        Bacillus clarkii
再把这个菌株的16S rDNA的碱基序列在序列表中用序列号1表示。
这个菌株是表现出伸长型的运动性革兰氏阳性杆菌，对过氧化氢酶、氧化酶都显示阳性，虽然确认芽孢的形成有困难，但可以看见长在伸长型末端的芽胞，而推定为芽孢杆菌(Bacillus)属。同时进行了菌体脂肪酸组成(CFA)、16S rDNA的碱基序列及糖化试验。该菌株在碱性领域能获得最大增殖速度，而且在pH为pH7.0以下不能生育，所以属于嗜碱性细菌的范畴。虽然与已发表的报告AlkalophilicBacillus clarkii(Preben Nielsen，Dagmar Fritze and FergusG.Priest，Microbiology，141，1745-1761，1995)在16S rDNA碱基序列上仅有96.12％的低相同率，但被推定为近亲种。可是，在其它的生理性状试验中与I.Yumoto等的报告值(I.Yumoto et al.J.Syat.Bacteriol.，48，565-571，1998)显示出良好的一致性，该菌株被推定为库拉奇芽孢杆菌。
从以上结果得知这种菌株是新菌株，把它命名为库拉奇芽孢杆菌7364株。这个菌株以FERM BP-7156保藏在工业技术院生命工程学工业技术研究所(目前在独立行政法人工业技术综合研究所专利生物保藏中心日本国茨城县筑波市东1丁目1-1)。
另外，以前在库拉奇芽孢杆菌种中还没有报道过关于有产生CGTase能力的菌株，而且确认在近亲种B.horti(JCM No.9943T)、B.clarkii(ATCC No.700162)及B.agaradhaerens(ATCC No.700163)中没有CGTase活性。也就是说本菌株是有产生CGTase能力的第一个属于库拉奇芽孢杆菌种的菌株。
[环糊精·葡聚糖转移酶的制造方法]
为了利用库拉奇芽孢杆菌7364菌株制造CGTase，使该微生物良好地生育，顺利地生产酶，在含有必要的碳源、氮源、无机盐、必要的营养素等的合成培养基或天然培养基中培养它。碳源可以利用淀粉、或它的构成部分、焙烧糊精、加工淀粉、淀粉衍生物、物理处理淀粉及α-淀粉等碳水化合物。具体的有，可溶性淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、甘薯淀粉、糊精、支链淀粉、直链淀粉等。氮源有细菌培养基用的胨、酪蛋白、肉提取物、酵母提取物、玉米浸渍液或大豆或豆饼等提取物等有机氮源物质、硫酸铵、磷酸铵等无机氮化合物、谷氨酸等氨基酸类。无机盐类可采用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等磷酸盐、硫酸镁等镁盐、氯化钙等钙盐、碳酸钠等钠盐等。培养优选在震荡培养或通气搅拌培养等需氧条件下、培养基的pH为7以上的范围优选调整在8～11的范围、温度在10～45℃的范围优选在30～42℃的条件下实施，但即使在此条件外，只要是微生物生育、生成目的酶的条件即可，没有特别限制。
在上述那样的条件下培养，通常从培养开始经48小时左右在培养液中就会生产大量的CGTase。接着从培养液中除去菌体，得到培养滤液。用超滤膜脱盐、浓缩、回收酶。这样得到的粗提纯酶也可直接用来进行CD生成反应。不过也可根据需要经过硫酸铵盐析或有机溶剂沉淀、用DEAE-交联葡聚糖、丁基离子交换树脂(トョパ一ル)等吸附洗脱、经葡聚糖凝胶、离子交换树脂(toyopearl)等进行柱分级、以γ-CD为配体经诱导的亲合色谱法精制以后使用。
以下说明酶活性测定法。
(CGTase活性测定)
CGTase活性测定用50mM甘氨酸-NaCl-NaOH(pH10.0)缓冲液，在40或50℃条件下进行。
(Blue value法)
把50mg直链淀粉(林原制EX-III型)在2ml的1N NaOH中经1夜溶解后，用1N HCl中和，用50mM甘氨酸-NaCl-NaOH(pH10.0)缓冲液调为50ml，以其作为底物溶液。把300μl的底物液在40℃条件下保温10分钟，添加200μl适当稀释的酶溶液，以此开始反应，在相同温度反应10分钟。添加4ml的0.2N HCl，以此停止反应。在同反应液中加入4ml的水及0.02％I2-0.2％KI溶液500μl测定700nm的吸光度。同样，添加0.2N HCl后与添加酶溶液的进行对照。把在本条件下与700nm的吸光度对照的1分钟减少10％的酶量定义为1U。
(γ-CD生成活性)
使1ml溶解在25mM甘氨酸-NaCl-NaOH(pH10.0)缓冲液中的可溶性淀粉(nacalai tesque)在50℃条件下加温10分钟，成为10％(质量/体积)。添加200μl适当稀释的酶溶液，以此开始反应，在相同温度反应30分钟，添加3ml的0.02N HCl，以此停止反应。20μl反应液供HPLC，测定生成的γ-CD量。把在本条件下1分钟生成1μmol/mlγ-CD的酶量定义为1U。
本测定中使用的HPLC的条件如下，
柱        YMC-pack AQ-312(6×150mm)
溶剂      10％MeOH
流速      1.0ml/min
温度      R.T.
检测      RI
ATT       7
在上述条件下，分析已知浓度的CD溶液，通过求CD含量与HPLC面积的关系得出下式校正曲线。
(HPLC面积)＝3.092×106×(γ-CD质量/体积％)R2＝0.999
(CD生成量的分析)
反应液中的CD含量用HPLC分析，分析条件如下，
HPLC法-1
柱        Aminex HPX-42A(Bio-Rad Lab.7.8×300mm)
溶剂H     H2O
流速      0.5ml/min
温度      55℃
检测      RI
ATT       9
HPLC法-2用与分析CD生成活性同样的方法进行。
用马铃薯可溶性淀粉(Sigma)为底物进行CD生成反应。
得到的CGTase的酶学方面的各种性质如下所示。
使200μl该酶(蛋白100μg)与溶解于pH3～11.9的各种缓冲液的1.0％(质量/体积)直链淀粉(DP117)在40℃条件下反应10分钟，求其相对活性(Blue value法)。再将50μl的酶溶液(蛋白25μg)与500μl的pH在3-11.9范围的各种缓冲液混合，在4℃条件下放置24小时，测定加入2.75ml的50mM甘氨酸-NaOH(pH10.0)缓冲液后的残存活性(图1)。其结果是该酶的最佳pH及pH稳定范围分别为10.5-11.0和6-11.0。
使200μl该酶(蛋白100μg)与溶解于50mM甘氨酸-NaOH(pH10.0)缓冲液的1.0％(质量/体积)直链淀粉(DP117)在各种温度条件下反应10分钟，求其相对活性(Blue value法)。再将20μl的酶溶液和1180μl的50mM甘氨酸-NaOH(pH10.0)缓冲液混合，在各种温度条件下保持15分钟测定其残存活性(图2)。其结果是该酶的最佳温度及温度稳定范围分别为60℃和30℃以下。这些结果在γ-CD生成活性方面也是同样。
以上结果以及参照该酶的分子量、等电点的研究结果，就酶的各种性质与其它菌株产生的CGTase的比较如表2所示。
表2
与已知的其它来源的CGTase的诸性质的比较
菌株    B.Clarkii7364株      B.sp.AL-6    嗜热脂肪芽孢杆菌    巨大芽孢杆菌(F1    F2)      环状芽孢杆菌(F1    F2)   浸麻类芽孢杆菌(IFO 490)
等电点       3.98         -       4.45     6.07    6.80      5.80    6.60        4.60
最佳pH    10.5-11.0      7.5-10.5        6.0        5.2-6.2          5.2-5.7       5.2-5.7
最适温度       60℃        55℃        70℃          55℃           55℃         55℃
稳定性(pH)     6.0-11.0        5-8       7.0-9.2        7.0-10.0          7.0-9.0       8.0-10.0
稳定性(温度)      30℃        40℃        50℃          55℃           55℃         55℃
分子量      66,000       74,000       68,000         66,000             -        65,000
主要生成物        γ        γ、β       α、β           β             β          α
由库拉奇芽孢杆菌7364株产生的CDTase的分子量按SDS-PAGE为66,000；等电点是3.98(聚焦电泳法)。
[环糊精的制造方法]
用本发明的CDTase制造CD可以在含1～30％淀粉(含淀粉或其构成部分、糊精、支链淀粉及直链淀粉等加工淀粉等)的水溶液中，添加0.5～300U(每1g干淀粉)本酶液(精制酶或粗酶)，在pH为4.5～12，温度为20～60℃的条件下，进行1～96小时酶反应。还可以根据需要对淀粉预先加热、液化处理后再用。用上述那样的方法调制的糖类(糖浆)中γ-CD比α-及β-CD含量多，除了这些CD以外，有时也会含有葡萄糖等单糖类、各种低聚糖(麦芽糖)或糊精等。也可以根据需要，把有所希望的单一聚合度的CD分离(利用结晶化、色谱分级、酵母等发酵处理及酶处理等)后再用。也就是说，也可以从上述生成物中分离、精制γ-CD。因为用本发明的方法获得的反应液γ-CD比α-及β-CD含量多，所以可以比以往容易地分离、精制γ-CD。而且，除了用上述方法获得的糖浆状之外，还可以有结晶状、冻结干燥状、粉末状、颗粒状等任意的形态。
用本发明的制造方法制造的CD(特别是γ-CD含量高的CD或高纯度γ-CD)和以往市场出售的CD同样可以用于可经口摄取的所有食品。这样的食品有，茶类、清凉饮料等饮料类、糖果、胶冻、日本点心等和式及西式点心、酸奶、冰激凌等乳制品类；火腿、香肠等肉类加工品类；鱼糕、海带鱼糕卷等水产加工品类及面类、咸菜类、其它经过烹调加工的食品类、速食品类等。而且香料等的稳定或乳化作用及赋形剂等由于添加、含有由本发明的制造方法制造的CD，会极其简便而有效地提高食品和饮料的可口性和功能性。另外，由本发明的制造方法制造的CD不仅能用于食品和饮料，还可以作为药品或化妆品等有效成分的稳定剂、乳化剂、赋形剂等应用。
由本发明的制造方法制造的CD的使用方法，只要是在食品和饮料、药品或化妆品中能使CD共存的条件即可，没有特别的限定。例如可以在作为基础的食品和饮料原料加工中同时添加CD，或了可在基础食品和饮料加工完了之后添加，可采用适合各种食品的制造工序的实际情况的添加方法。
在食品和饮料中CD的添加量，只要无损于基础食品和饮料本来的味道和风味，没有特别的限制，一般优选20重量％以下的添加量添加。若在20重量％以上，由于CD具有的遮蔽效果，基础食品和饮料的味道或风味可能会改变，从而降低可口性。在药品、化妆品方面只要无损于有效成分的作用，不作限定，但建议使用50重量％以下。
本说明书介绍的发明是关于2000年5月23日在日本专利厅申请的日本专利申请2000-151053记载的发明，这里援用了这个日本专利申请公开的全部内容。
实施例
下面以实施例对本发明作详细说明
实施例1
把库拉奇芽孢杆菌7364菌株在含有作为碳源的1.0％(质量/体积)ネォタック#30T(日本食品化工公司(株)制)、作为氮源的0.5％(ソャフラヮ一)FT(日清制油公司制)、以及0.5％酵母提取物(Difco制)、0.1％K2HPO4、0.02％MgSO4·7H2O及0.8％Na2CO3的液体培养基中在37℃条件下进行48小时震荡培养，在培养液中就分泌出CGTase(Blue value法20U/ml培养上清波)。
用亲和性色谱法精制获得的CGTase，其物性如表2所示。
实施例2
把实施例1中记载的培养上清液用UF浓缩膜(PM-10)浓缩后，以此作为粗酶液进行糖化试验。本浓缩液具有55U/ml(Blue value法)的活性。首先以可溶性淀粉为底物，使其溶解于50mM甘氨酸-NaCl-NaOH(pH10.0)缓冲液成为10％(质量/体积)并以此作为底物溶液。把粗酶液分别按照80、40、20、10及5U/g-DS添加于5ml底物溶液中，在50℃条件下进行反应。在反应开始后的第2、4、6、24、48小时取样，用HPLC法-1和2，求γ-CD生成量(图3)。其结果是按照DS为80U/g添加该酶时，48小时后γ-CD为9.7％；α-和β-CD分别是1.7和0.9％(HPLC面积)。
实施例3
按照常法把玉米淀粉用α-淀粉酶液化，调制成浓度为20重量％葡萄糖当量为7的淀粉液化液。然后把它调整为pH7之后，把实施例1记载的培养上清液用UF浓缩膜(PM-10)浓缩成粗酶液，添加450单位/g底物，在55℃条件下，反应48小时。此后，把本反应液加热，使其酶失去活性，进行脱色、离子交换等精制，调制出含CD的糖浆。其糖的成分如表3所示。CD的含量用HPLC法-1和2求出。
表3
    α-CD     1.7％
    β-CD     0.8％
    γ-CD     8.2％
   其它糖类     89.3％
实施例4
把实施例2的反应液(添加80U/g的DS，进行48小时反应的反应液)用葡萄直链淀粉酶处理后，载荷于活性碳柱(Φ2.5×20cm)，用纯水洗净，除去由葡萄直链淀粉酶处理产生的葡萄糖。再用20％酒精洗净后，用3倍量的25％酒精把吸附部分洗脱。把洗脱部分浓缩后，经4℃条件下冷却15分钟，使β-CD析出，通过离心分离除去。接着，把上清液提供给离子交换树脂(toyopearl)HW-40S(Φ2.9×90cm)。测定每10ml部分的Brix，观测1个主峰值(Tube：23-28)。经HPLC对各部分分析，23-26部分是α-CD或α-CD和γ-CD的混合物，所以把27部分和28部分收集浓缩、冻结干燥。通过HPLC检验的结果，该部分是纯度为99.5％的γ-CD。最终离析出175mg的γ-CD。该γ-CD经NMR证实为γ-CD。
13C-NMR da ta：104.30，83.08，75.56，74.93，74.40，62.86ppm
工业上利用的可能性
本发明可以提供有产生新γ-CGTase能力的微生物、优先生成γ-CD的新γ-CGTase。而且，由于本发明，可以提供用γ-CGTase有效制造γ-CD的方法。
                            序列表<110>日本食品化工株式会社<120>新的环糊精·葡聚糖转移酶及其制造方法和用该酶制造环糊精的方法<130>A15085H<160>1<210>1<211>1547<212>DNA<213>库拉奇芽孢杆菌7364<400>1tggagagagt ttgatcctgg ctcaggacga acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt60cgagcggacc aaaggaagct tgcttccgga ggtcagcggc ggacgggtga gtaacacgtg120ggcaacctgc cttacagact gggataactc cgggaaaccg gggctaatac cggatgaccg180atgggaccgc atggtcctgt cgtaaaagtt gggattacta acactgtaag atgggcccgc240ggcgcattag ctagttggtg aggtaacggc tcaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg300agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag360tagggaatca tccgcaatgg gcgaaagcct gacggtgcaa cgccgcgtga acgaggaagg420tcttcggatt gtaaagttct gttgtcaggg aagaagaagt gccattcgaa yaggttggca480ccgtgacggt acctgacgag aaagccccgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac540gtagggggca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaagc gcgcgcaggc ggtttcttaa600gtctgatgtg aaagcccacg gctcaaccgt ggagggtcat tggaaactgg gagacttgag660tgtaggagag gaaagtggaa ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa720caccagtggc gaaggcgact ttctggccta taactgacgc tgaggcgcga aagcgtgggg780agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taggtgttag840gggtttcgat acccttagtg ccgcagttaa cacattaagc actccgcctg gggagtacgg900ccgcaaggct gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcagtgg agcatgtggt960ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcctctgcc actcctggag1020acaggacgtt ccccttcggg ggacagagtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt1080gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca1140ttgagttggg cactctaagg tgactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt1200caaatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatgggt ggtacaaagg1260gcagcaacgc cgcgaggccg agcgaatccc agaaagccac tctcagttcg gattgcaggc1320tgcaactcgc ctgcatgaag ccggaattgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga1380atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa1440gtcggtgagg taaccttttg gagccagccg ccgaaggtgg gacagatgat tggggtgaag1500tcgtaacaag gtatccctac cggaaggtgc ggytggatca cctcctt1547

Claims (7)

1.环糊精·葡聚糖转移酶，其特征在于所述的环糊精·葡聚糖转移酶有下述酶化学性质，
①作用及底物特异性：作用于淀粉、糊精、支链淀粉或直链淀粉，主要生成γ-环糊精，β-及α-环糊精的生成量比γ-环糊精的生成量低，
②最佳pH：10.5-11.0，
③最佳温度：60℃左右，
④稳定pH：6-11，
⑤温度稳定性：在50℃条件下、处理15分钟显示90％以上的残存活性。
2.制造环糊精·葡聚糖转移酶的方法，其特征在于，培养属于库拉奇芽孢杆菌的有生产环糊精·葡聚糖转移酶能力的微生物，在培养物中产生环糊精·葡聚糖转移酶，然后获取生成的环糊精·葡聚糖转移酶。
3.根据权利要求2的制造方法，其中属于库拉奇芽孢杆菌种的有生产环糊精·葡聚糖转移酶能力的微生物是库拉奇芽孢杆菌7364株(FERM BP-7156)。
4.制造环糊精的方法，其特征在于，使库拉奇芽孢杆菌种产生的环糊精·葡聚糖转移酶在含有选自淀粉、糊精、支链淀粉及直链淀粉中至少1种的溶液中进行反应，使其主要生成γ-环糊精。
5.根据权利要求4的制造方法，其中所述的环糊精·葡聚糖转移酶是权利要求1所述的环糊精·葡聚糖转移酶。
6.根据权利要求4或5的制造方法，其特征在于，把生成的γ-环糊精从其它的环糊精中分离出来。
7.库拉奇芽孢杆菌7364株(FERM BP-7156)，其为有产生环糊精·葡聚糖转移酶能力的库拉奇芽孢杆菌种菌。
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