CN1426465B - 能从较大的核苷酸序列中以闭合环状形式释放,并且允许位点特异性地表达和/或发育调控性地表达所选遗传序列的构建体 - Google Patents

Abstract

本发明大体涉及构建体，特别是那些含有能从例如真核细胞基因组的较大的核苷酸序列中以共价闭合环状形式释放的多核苷酸序列的遗传构建体。优选，多核苷酸序列一旦释放，就重新构建成允许多核苷酸序列表达的形式。在一个实施方案中，重构的多核苷酸序列含有编码序列，其中插有例如但不限于内含子序列或者其它剪接信号的外源核苷酸的全部或者部分。编码序列的表达，特别是转录涉及将外源序列剪除。释放和环化通常是对刺激的反应，如某种蛋白质介导的刺激。更特别的是，这个蛋白质是来源于病毒、原核或真核细胞的蛋白质，或者是发育和/或组织特异性调控的蛋白质。本发明中的构建体在提供对病原体的遗传抗性或者诱导凋亡或其它细胞死亡机制中特别有用，其中这些机制在如治疗癌症或诱导植物雄性或雌性不育时是有用的。因此，这些构建体允许位点特异性地表达和/或发育调节性地表达所选遗传序列。

Description

能从较大的核苷酸序列中以闭合环状形式释放,并且允许位点特异性地表达和/或发育调控性地表达所选遗传序列的构建体

发明领域

本发明大体涉及构建体，特别是那些含有能从例如但不限于真核细胞基因组的较大的核苷酸序列中以共价闭合环状形式释放的多核苷酸序列的遗传构建体。优选，多核苷酸序列一旦释放，就重新构建成允许多核苷酸序列表达的形式。在一个实施方案中，重构的多核苷酸序列含有编码序列其中插有的外源核苷酸的全部或者部分。例如但并不限于内含子序列或者其它剪接信号。编码序列的表达，特别是转录涉及将外源序列剪除。根据这一实施方案，编码序列可以编码肽、多肽、蛋白质、反义或正义核酸分子或者核酶。在另外的实施方案中，重构的多核苷酸序列将含有位于启动子和编码序列之间的外源多核苷酸序列。在这一实施方案中，编码序列的表达基本上不会受到外源序列存在的不利影响。在更进一步的实施方案中，重构的序列形成了RNA启动子或者其它含有不影响启动子功能的外源序列的调控性遗传序列。释放和环化通常是对刺激的反应，如某种蛋白质介导的刺激。更具体的是，这个蛋白质来源于病毒、原核或真核细胞的蛋白质，或者是发育或组织特异性调控的蛋白质。本发明中的构建体特别用于提供对病原体的遗传抗性或者诱导用于例如治疗癌症或诱导植物雄性或雌性不育的凋亡或其它细胞死亡机制。因此，这些构建体允许位点特异性地表达和/或发育调节性地表达所选的遗传序列。

发明背景

在这一说明书中对任何现有技术的参考不能也不应该被认为是承认或者任何形式地暗示这些现有技术在澳大利亚或其它任何国家已经成为常识部分。

重组DNA技术的日益进步极大的推动了医学、园艺和农业等广泛技术领域的研究和发展。其中考察诸如病原体中自然出现的诱导细胞，如植物细胞的有利的表型变化的遗传机制具有特别的重要性。在涉及诱导植物对一系列植物病原体抗性的机制的园艺领域中，这一点尤其明显。

发展农作物的病毒抗性已经取得了相当大的进步，例如，通过用源于目标病毒的转基因进行转化。最成功的转基因应用是对于植物RNA病毒。尽管有许多希望通过转基因抗性来控制植物单链DNA(ssDNA)病毒的尝试，但是对植物RNA病毒成功的策略对ssDNA却没有同样有效。植物DNA病毒，特别是植物单链DNA(ssDNA)病毒造成了广泛的热带和亚热带水果、蔬菜、谷物以及纤维农作物的重大商业损失。

有两类感染植物的ssDNA病毒。它们是Geminiviridae属，以及最近描述的Nanovirus属。Geminiviridae属的成员具有成对的病毒体，以及单份或者双份的环状ssDNA基因组，每个分子的长度大约为2.7kb。在Geminiviridae属中，菜豆金色花叶病毒和玉米线条病毒是最重要的。菜豆金色花叶病毒是通过粉虱传播的，含有单份或双份基因组。这个属的成员包括现代农业中最具有经济破坏力的病毒，如番茄卷(黄)叶病毒(tomato(yellow)leafcurl)(由一系列散布在大部分热带和亚热带地区的不同病毒组成)，非洲木薯花叶病毒(Africacassavamosaic)(非洲)，菜豆金黄花叶病毒(beangoldenmosaic)(美洲南部和中部)，绿豆黄花叶病毒(mungbeanyellowmosaic)(印度)以及棉花卷叶病毒(cottenleafcurl)(亚洲南部和东南部)。在最近几年中，由于粉虱载体的攻击性B生物型，Bemesiatabaci，的大范围引入，许多种菜豆金色花叶病毒的影响急剧增加。玉米线条病毒对农业的影响较小，但也可以造成某些农作物的巨大损失。这些病毒通过叶蝉传播，含有一份基因组。这个属的成员包括玉米线条病毒(maizestreak)(非洲)，小麦矮缩病毒(wheatdwarf)(欧洲)和烟草黄矮病毒(tobaccoyellowdwarf)(澳大利亚)。

Nanovirus具有全对称的病毒颗粒和环状的ssDNA基因组，但是这些基因组是多组分的，至少含有六个不同的完整的基因组组分，每个长约1kb.这些病毒都是通过蚜虫传播的除了一种暂定为Nanovirus属的病毒，即椰子腐叶病毒(coconutfoliardecayvirus)，它是通过角蝉传播的，并且只在瓦努阿图报道过。经济上最重要的Nanovirus是香蕉束顶病毒(bananabunchytopvirus)(BBTV)，它在十九世纪二十年代几乎毁掉了澳大利亚的香蕉业，并且在南太平洋、亚洲和非洲造成了重大的损失。地三叶草Nanovirus(subterraneancloverstunt)(澳大利亚)，蚕豆坏死黄病毒(地中海)和椰子腐叶病毒(瓦努阿图)都造成了巨大的产量损失。

菜豆金色花叶病毒、玉米线条病毒和Nanovirus的基因组组织存在巨大差别，包括基因组成分的数目和大小，基因的数目和大小，转录过程，基因向位等等。但是也存在明显的相似性，它们表明这些病毒具有相似的复制和感染策略。所有的双联和Nanovirus都编码以下蛋白质：(i)Rep蛋白质，这种蛋白质具有切口和连接活性，指导病毒基因组的滚环复制；(ii)病毒体外壳蛋白质；(iii)参与结合宿主细胞类成视网膜细胞瘤蛋白的蛋白质，它能导致细胞进入S期；(iv)一种在细胞之间运动的蛋白质；和(v)核穿梭蛋白。另外，这些病毒还有相似的基因间隔区(IR)。例如，菜豆金色花叶病毒的IR，玉米线条病毒的LIR和香蕉束顶病毒的CR-SL都含有：(i)茎/环结构，其中九核苷酸的环状序列在所有Geminiviridae属和Nanovirus属中是高度保守的，并且是Rep蛋白进行切口和连接的位点；和(ii)这一区域中能识别Rep蛋白的结构域。玉米线条病毒的SIR和香蕉束顶病毒的CR-M是一个内源引物的结合位点，这一引物负责引发将病毒体ssDNA转变成具有转录活性的dsDNA的过程。

对农作物RNA病毒发展转基因抗性的成功以及对针对ssDNA病毒的此等抗性的日益增长的需求，已经导致人们研究一系列策略来对付ssDNA病毒，这些策略的靶标是各种病毒基因，包括外壳蛋白基因、运动蛋白基因和Rep蛋白基因。另外，也研究了使用缺陷型干扰DNA和自杀基因的策略。这一领域中大部分的工作涉及到了菜豆金色花叶病毒，而不是玉米线条病毒或者Nanovirus。

在本发明之前的工作中，发明者为在植物中诱导遗传抗性考察ssDNA病毒的复制机制。但是，本发明在调节遗传活性，如多核苷酸序列的表达影响特定表型而应答刺激中具有广泛的用途。

发明概述

在整个说明书中，除非上下文另外要求，单词“包含”或者如“包含”和“包括”之类的变体都应该理解成含有所述的元素、整体(integer)、元素群或整体群，但并不排除任何其它的元素、整体、元素群或整体群。

核苷酸和氨基酸序列可以通过序列标识符数字(SEQIDNO：)来参阅。SEQIDNO：在数字上对应于带有相应数字的序列标识符<400>1，<400>2等。在权利要求书之后列出了序列表。

本发明的一个方面提供含有遗传元件的构建体，该遗传元件侧翼操作性地连接有核苷酸序列，而这些核苷酸序列在整合入真核细胞基因组时，能被源于病毒的、复制辅助蛋白质或它的衍生物或真核和原核细胞的同源物所识别；源于病毒的、复制辅助蛋白质或它的衍生物或真核和原核细胞的同源物能促进遗传元件和全部或部分相邻核苷酸序列的剪切和环化，其中所述的能被源于病毒的、复制辅助蛋白质或它的衍生物或真核和原核细胞的同源物识别的核苷酸序列邻接于或插入在一个或多个包括内含子序列或部分内含子序列或其它剪接信号的外源序列中，其中遗传元件和其它核苷酸序列，在以非环状形式存在时，含有两个模块核苷酸序列，这两个模块核苷酸序列一旦环化，就会形成一段展示特性或者具有展示特性能力的遗传序列，而该特性或能力在两个模块核苷酸序列环化之前或环化和表达之前是没有的。

本发明的另一个方面提供含有遗传元件的构建体，该遗传元件侧翼操作性地连接有Rep蛋白识别序列或来源于其它病毒、真核或原核细胞的功能性同源物，在Rep蛋白或它的功能性衍生物或同源物存在的情况下，上述的Rep蛋白识别序列或它的同源物能促进含有所述遗传元件的环状核苷酸序列的产生，其中所述Rep蛋白识别序列邻接于或插入于一个或多个识别序列中，上述遗传元件含有操作性地连接在调控序列旁的多核苷酸序列，当所述遗传元件包含在环状分子中时，上述调控序列是表达上述多核苷酸序列所必需的，其中，遗传元件的线性形式从5’端到3’端，依次含有如下组分：多核苷酸序列；和处于环状形式时允许所述多核苷酸表达的调控序列。从而使得在环化后，遗传元件含有调控序列，这一调控序列被全部或部分Rep蛋白识别序列从多核苷酸序列中分隔开。其中一旦表达，所述多核苷酸序列编码表达产物。

本发明的另一个方面提供了构建体，该构建体从5’端到3’顺序含有第一、第二、第三、第四、第五和第六个核苷酸序列，其中：

第一和第六个核苷酸序列可以相同也可以不同，每个都含有Rep蛋白识别序列，这些Rep蛋白识别序列能被一个或多个Rep蛋白或它的衍生物或它的同源物识别，从而当所述构建体整合入较大的核苷酸序列如基因组序列时，被第一和第六序列包括全部或部分所述第一和第六序列包围的遗传物质能够被剪出并且环化，其中所述Rep蛋白识别序列邻接于或插入于一个或多个包括内含子序列或部分内含子序列或者其它的剪接信号的外源序列中。

第二个核苷酸序列含有多核苷酸序列的3’部分；

第三个核苷酸序列是操作性地连接于上述的第二个序列的转录终止子或者是它的功能性衍生物或同源物；

第四个核苷酸序列是操作性地连接于第五个核苷酸序列的启动子序列；

第五个核苷酸序列是多核苷酸序列的5’部分，其中所述多核苷酸的5’和3’部分代表了所述多核苷酸的全部编码序列；

其中，当构建体整合入一个较大的核苷酸序列如基因组序列时，在一个或多个Rep蛋白存在时，环化的遗传序列就会从所述较大的核苷酸序列中分离形成，它依次含有所述操作性地连接于多核苷酸序列的启动子序列，该多核苷酸序列含有全部或部分外源序列或其它剪接信号，这些剪接信号含有全部或部分所述第一和/或第六核苷酸序列以及转录终止序列。

本发明的另一个方面涉及到用来产生构建体的遗传元件，上述遗传元件从5’到3’方向依次包含操作性地连接在转录终止子上的多核苷酸序列的3’部分，操作性地连接在多核苷酸序列的5’部分的启动子，其中，一旦环化，多核苷酸序列的5’部分就会操作性地和被全部或部分外源序列或内含子序列或其它剪接信号所隔离的上述多核苷酸序列的3’部分连接。

本发明的另一个方面提供含有的核苷酸序列的构建体，该核苷酸序列基本上与SEQIDNO：31到SEQIDNO：36所述的核苷酸序列相同，或者与SEQIDNO：31到SEQIDNO：36中的每一个都有60％相似性的核苷酸序列，或者能够在42℃的低严紧条件下同SEQIDNO：31到SEQIDNO：36中的一个或多个序列或它们的互补序列进行杂交。

本发明的另一个方面考虑生产抗ssDNA病毒的转基因植物或它们的后代的方法，所述方法包含将构建体导入所述植物的基因组，这一构建体从5’端到3’端依次含有：邻接于或插入于内含子序列或其它剪接信号的Rep蛋白识别序列；多核苷酸序列的3’部分；转录终止子或它的功能等效物；操作性地连接在多核苷酸序列的5’部分的启动子，以及相同或不同的Rep蛋白识别序列，其中多核苷酸序列的5’部分和3’部分代表能诱导细胞死亡或休眠的肽、多肽或蛋白质的编码区域；一旦用含有能识别侧翼Rep蛋白识别序列的Rep蛋白的ssDNA病毒感染所述植物细胞，构建体就会被剪出并环化，从而将所述多核苷酸序列重构成可以表达成能杀死植物细胞或使植物细胞休眠的肽、多肽或者蛋白质的形式。

本发明的另一个方面提供含有遗传元件的构建体，这一遗传元件侧翼有Rep蛋白识别序列，而在Rep蛋白或它的功能衍生物或同源物存在的情况下，上述Rep蛋白识别序列能促进含有上述遗传元件的环状核苷酸序列的形成，其中所述Rep蛋白识别序列邻接于或插入于一个或多个包括内含子序列或部分内含子序列或其它剪接信号的外源序列，上述遗传元件含有启动子的3’和5’部分，这两部分被核苷酸序列分隔从而基本上阻止上述启动子行使功能，上述遗传元件的线性形式从5’端到3’端依次含有：上述启动子的3’部分；可选择的操作性地连接在上述启动子的3’部分的多核苷酸序列上述启动子的5’部分，从而使得一旦环化，遗传元件就含有启动子序列的5’和3’部分，这两部分被全部或部分Rep蛋白识别序列和/或内含子序列或其它剪接信号分隔，但它们并不使启动子的活性丧失，上述环状分子可以选择性的进一步包含操作性地连接在核苷酸序列上的启动子。

启动子可以DNA启动子或RNA启动子。

附图简述

图1是pTBN的图解描述。

图2是pTBN6的图解描述。

图3是pTBN1的图解描述。

图4是pRTBN6的图解描述。

图5是pRTBN1的图解描述。

图6是pRTBN1/6的图解描述。

图7是质粒p35S-2301的示意图。

图8是质粒pTEST1的示意图。

图9是质粒pTEST2的示意图。

图10是质粒pTEST3的示意图。

图11是质粒pTEST4的示意图。

图12是质粒pBI-TYDV1.1mer的示意图.

图13是质粒p35S-Rep的示意图.

图14是使用表达载体进行的细胞死亡实验结果的图表描述。误差棒显示95％的置信区间。

图15是使用表达载体进行的重新环化细胞死亡实验结果的图表描述。误差棒显示95％的置信区间。

图16是使用表达载体进行的可诱导的重新环化细胞死亡实验结果的图表描述。误差棒显示95％的置信区间。

图17是质粒p35S-BTR-LIR(图A)和p35S-BUTR-LIR(图B)的示意图。

图18是质粒p35S-BTR(图A)和p35S-BUTR(图B)的示意图。

图19是质粒pBTR.test1(图A)和pBUTRtest1(图B)的示意图。

图20是pGI的图表描述。

图21是pGI6的图表描述。

图22是pGI1的图表描述。

图23是pRGI6的图表描述。

图24是pRGI1的图表描述。

图25是pRGI1/6的图表描述。

图26是从质粒pHSA1中用Rep激活人血清白蛋白表达的建议模型的示意图。

图27是在正义/反义调控基因表达中使用的构建体的图表描述。

在此提供序列标识符的概述

序列标识符概述

序列标识符	描述
		SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：18	合成的寡聚核苷酸
SEQ ID NO：19到SEQ ID NO：44	引物
		SEQ ID NO：45到SEQ ID NO：52	合成的寡聚核苷酸
SEQ ID NO：66	芽孢杆菌RNA酶pTBN
		SEQ ID NO：67	芽孢杆菌RNA酶pRTBN6
SEQ ID NO：68	芽孢杆菌RNA酶pRTBN1
		SEQ ID NO：69	GFPpGI
SEQ ID NO：70	GFPpGI6
		SEQ ID NO：71	GFPpGI1
SEQ ID NO：72	引物
		SEQ ID NO：73	引物

优选实施方案详述

预见本发明部分由于认识到源于病毒的、复制辅助蛋白质可以用来从真核细胞基因组中剪出和环化特定的目标序列。在这种情况下，术语剪除”包括释放，特别是复制性的释放目标序列。源于病毒的、复制辅助蛋白质对位于特定序列包围中的遗传元件启动切口、剪出和环化，其中这些特异序列对源于病毒的、复制辅助蛋白质是特定性的，并且被它们识别。本发明可以扩展到源于病毒的、复制辅助蛋白质的衍生物以及它们的真核和原核细胞的同源物。因此，本发明扩展到能促进多核苷酸序列切割和连接的任何序列，这些序列在下文中将称为“识别序列”，在此也可以认为是“外源序列”。识别序列邻接于或插入在包括内含子序列或其它剪接信号的外源序列中。

在一个实施方案中，一但表达环化过程就允许由从两个被可剪接的外源序列分隔的模块组件形成特定的遗传序列。在环化前，模块组件在遗传上是分离的，因此不是操作性地连接在一起的。就方便的显示为含有模块组件的遗传序列能够表达操作性的连接例如在一个实施方案中。本例子中，术语“表达”包括转录成mRNA序列以及可选择的将mRNA序列翻译成翻译产物。但是，表达并不是从模块组件构建遗传序列的唯一标准。在另一个实施方案中，环化后形成的遗传序列不需要表达也可以具有其它有用的功能。例如，产生的遗传序列可以含有蛋白质结合识别序列，从而可以针对特定的细胞质蛋白质或细胞核蛋白质。或者，重构的多核苷酸序列在启动子元件和编码序列之间含有外源序列。在前面的例子中，启动子为来源于诸如TMV、AMV或TEV病毒的RNA启动子。或者，启动子也可以是插入识别序列后基本上不会对其活性产生不利影响的DNA启动子。

相应的，本发明的一个方面提供了含有遗传元件的构建体，该遗传元件侧翼操作性地连接有核苷酸序列，而这些核苷酸序列在整合入真核细胞基因组时，能被源于病毒、复制辅助蛋白质或它的衍生物或真核和原核细胞的同源物所识别；源于病毒的、复制辅助蛋白质或它的衍生物或真核或原核细胞的同源物能促进遗传元件和全部或部分相邻核苷酸序列的剪切和环化，其中上述的能被源于病毒的、复制辅助蛋白质或它的衍生物或真核或原核细胞的同源物识别的核苷酸序列邻接于或插入在一个或多个包括内含子序列或部分内含子序列或其它剪接信号的外源序列中，其中以非环状形式存在的遗传元件和其它核苷酸序列含有两个调控核苷酸序列，这两个调控核苷酸序列一旦环化，就会形成一段展示特性或者具有展示特性能力的遗传序列，这段遗传序列而该特性或能力在两个调控核苷酸序列环化之前或环化和表达之前是没有的。

术语“构建体”以最广泛的意义使用，包括遗传构建体、核酸分子、载体、质粒或者任何其它至少含有两个异源序列的核苷酸序列。因此，构建体是一个重组分子，构建为含有两个或多个来自于不同遗传源的核苷酸序列。在一个实施方案中，构建体以分离的形式存在。术语“分离的”包括生物学纯的、实质上纯的或者另外一种条件，其中对含有构建体的样品至少进行了一步纯化步骤。“纯化步骤”包括例如沉淀、离心和/或层析分离或电泳分离。在另一个实施方案中，遗传构建体整合到宿主细胞的基因组中。构建体可以含有会在整合之后丢失、去除或重排的核苷酸序列。在另一个实施方案中，构建体以环状形式存在，这种环状形式既可以在体外形成，也可以在从宿主细胞中剪除之后形成。

术语“遗传元件”以最广泛的意义使用，包括一系列两个或多个核苷酸序列，构建成相对于遗传元件的5’到3’或3’到5’方向的特定顺序排列。基本上，遗传元件含有两个以模块形式存在的核苷酸序列。术语“模块”并不是要给核苷酸的构建或结构施加任何限制，只是为了强调单个遗传序列被分成了两个组件，即模块组件。环化时，在去除任何外源序列包括内含子和剪接序列或者其它识别序列之后，这两个模块组件定向到一起而构建成单个遗传序列，这一遗传序列展现出特定的活性或特性，而这些活性或特性在遗传序列以分离的模块形式存在时是没有的。某些情况下，当处于环状形式时插在两个模块组件之间的外源基因可以不去除，只要在环化之后模块以相对彼此正确的方向构建时，外源基因的存在基本上不对模块组件的功能产生不利影响。通常，模块组件称为多核苷酸序列的5’部分和3’部分。一个部分包含从几个核苷酸(即从约2个到约500个)到许多核苷酸(即从约501个到约10000个)。5’和3’部分可以包围着中间部分。

在优选的实施方案中，当以环状形式存在时遗传元件包含操作性地连接在含有两个模块序列的遗传序列上的启动子。这两个模块序列可以被内含子序列、剪接信号或者其它识别序列分隔。因此，遗传元件的线性形式从5’到3’方向依次含有：含有核苷酸序列3’部分的第一个模块核苷酸序列；操作性地连接于上述多核苷酸序列5’部分的启动子序列。它在环化时，多核苷酸序列的3’部分通过碱基联系和多核苷酸序列的5’部分融合在一起，从而重构操作性地连接于启动子的朝向，并且功能性的多核苷酸序列，。依构建体的不同，内含子序列、剪接信号或其它识别序列可以将重构的多核苷酸序列的5’部分和3’部分分隔开。在表达时的加工过程中，内含子序列、剪接信号或者其它识别序列可以剪出。在一个特别优选的实施方案中，遗传元件含有转录终止序列，这些序列操作性地连接在多核苷酸序列3’部分的下游。如“启动子”和“终止子”之类的术语以它们的最广泛的意义使用，将在下面更详细地描述。

在另一个实施方案中，重构的多核苷酸序列编码内含子序列、剪接信号或者其它识别序列，它们位于启动子元件和编码序列之间。根据这一实施方案，识别序列在转录时将不被去除。

在另一个实施方案中，遗传元件含有启动子或其它调控序列的两个模块组件。优选，在环化之后模块组件形成启动子序列。如果内含子序列、剪接信号或其它识别序列分隔了启动子序列的模块组件，那么该序列并不损坏或部分损坏启动子序列的活性。或者，启动子可以是RNA启动子，例如来源于TMV、AMV或TEV的启动子。

在重构时，多核苷酸序列展示出活性或特性或者展示具有活性或特性的能力，而在环化后发生的融合之前，分隔的模块核苷酸序列不具备这些活性或特性或能力。这些活性和特性包括编码具有特定功能的肽、多肽或蛋白质的能力，以及编码mRNA序列的能力，这些mRNA序列可以紧接着翻译成肽、多肽或蛋白质，它们也可以作为反义或正义分子来负调节宿主基因或其它遗传序列，另外它们也可以作为启动子或其它调控序列。由遗传序列所提供的其他特性包括结合在蛋白质而与核酸调控序列相互作用，或者充当或编码核酶和/或脱氧核酶分子的能力。

尤其重要的是，遗传序列可以编码具有酶活性、调控活性、结构活性或者在施用给诸如人类或家畜之类的哺乳动物之后能显示出治疗活性的蛋白质。后一类型分子的例子包括细胞因子、干扰素和生长因子。具有酶活性的蛋白质是尤其优选的，这些蛋白质在以下几方面是很有用的，如激活生化途径，促进代谢物沿某一特定途径流动，提供某种特性，例如对杀虫剂、杀真菌剂或除草剂的抗性，或者提供对病原体的抗性，这些病原体可以是胞内病原体，包括病毒和胞内微生物。能作为本发明中遗传构建体的靶标的细胞包括动物细胞、植物细胞、单细胞生物和微生物。动物细胞可以来源于灵长类、人类、家畜、鸟类、鱼类、爬行类、两栖类、昆虫和蛛形纲。植物细胞可以来源于单子叶植物或双子叶植物。

在一个特别有用的实施方案中，由多核苷酸序列编码的肽、多肽或蛋白质例如诱导凋亡或其它形式的细胞死亡。作为促进对病毒的遗传抗性例如或介导特定类型的细胞死亡的方法，这一点特别有用。

在一个实施方案中例如，遗传构建体用于促进对单链DNA病毒(ssDNA)的抗性.通过感染重要的农作物和观赏植物，这些病毒对农业和园艺业造成了相当大的损失。感染植物的两类ssDNA病毒是Geminiviridae和Nanovirus.

在一个实施方案中，能被源于病毒的、复制辅助蛋白质或它的衍生物或者原核或真核细胞的同源物识别的侧翼的序列是茎/环核苷酸结构。优选，这种茎/环结构含有一个短的核苷酸序列环，这个环的核苷酸数目大约在5到20之间，优选在6到15之间，更优选9个核苷酸(即9核苷酸)，而且这个环是源于病毒的、复制辅助蛋白质或它的衍生物或者原核或真核细胞的同源物进行切口和连接的位点。在另一个实施方案中，侧翼的序列能被任何具有切割和连接活性的蛋白质识别。这种蛋白质的一个例子是拓扑异构酶。所有这种序列在这里都被称为“识别序列”。识别序列最优选被“Rep”蛋白质识别。这种蛋白质来源于Geminiviridae和Nanovirus的成员，并且结合在含有识别序列的茎/环结构的5’结构域。但是本发明并不仅限于使用茎环结构，尽管在此考虑这种用法。本发明可以扩展到任何来源于Geminiviridae和Nanovirus的Rep蛋白，以及它们的衍生物，或者是源于其它病毒、真核细胞或原核细胞的同源物。真核细胞的例子包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、爬行动物细胞、两栖类动物细胞和酵母细胞。

其它识别序列或它们的等价物的例子包括BBTVDNA1-6的基因间隔区、TLCV或TYDV的短重复序列和长重复序列。“内含子序列”是那些能在转录之后被剪切掉的核苷酸序列。在某种情况下，例如当内含子序列对它所插入的序列的功能不会产生不利影响时，这样的内含子序列就可以不被剪切掉。

本发明这方面的构建体可以含有和侧翼序列相同或基本相同的识别序列，即这些序列能够被单个Rep蛋白或者它的衍生物或同源物识别，或者构建体也可以含有不同的识别序列，这些序列能被不同的Rep蛋白或它的衍生物或者真核或原核细胞的同源物识别。更进一步，识别序列可以是全长序列或者是部分序列，如两个半份内含子序列。

Rep蛋白可以随病毒感染导入细胞，也可以在携带构建体的动物、植物或生物体中，被发育或组织特异性表达的遗传序列所编码。

在另一个优选的实施方案中，提供含有遗传元件的构建体，Rep蛋白识别序列或者来源于其它病毒或真核或原核细胞的具有功能同源物位于该遗传元件的侧翼，在Rep蛋白或它的功能衍生物或同源物存在的情况下，它们能够促进含有上述遗传元件的环状核苷酸序列的形成，其中上述Rep蛋白识别序列邻接于或插入于一个或多个识别序列中，上述遗传元件含有操作性地连接在调控序列旁的多核苷酸序列，当上述遗传元件包含在环状分子内时，上述的调控序列是允许表达上述多核苷酸序列所必须的；其中遗传元件的线性形式从5’到3’依次为：多核苷酸序列；和以环状形式存在时允许上述多核苷酸序列表达的调控序列，当上述多核苷酸序列从而使得在环化时，遗传元件含有调控序列，而这一调控序列和多核苷酸序列被全部或部分Rep蛋白识别序列隔开，其中一但表达，上述多核苷酸序列编码表达产物。

优选，调控序列包括或含有启动子序列和可选择的转录终止子。如上所述，识别序列包括外源序列，例如内含子序列或其它剪接信号。

在另一个实施方案中，提供了含有位于Rep蛋白识别序列包围中的遗传元件的构建体，在Rep蛋白或者它的功能衍生物或同源物存在的情况下，这一Rep蛋白识别序列能够促进含有上述遗传元件的环状核苷酸序列的形成，其中上述Rep蛋白识别序列邻接于或插入于一个或多个包括内含子序列或部分内含子序列或其它剪接信号的外源序列中，上述遗传元件含有启动子的3’部分和5’部分，这两个部分被核苷酸序列隔开，从而基本上防止了上述启动子行使功能，上述遗传元件的线性形式从5’到3’依次含有：上述启动子的3’部分；可选择的操作性地连接在上述启动子3’部分的多核苷酸序列；上述启动子的5’部分。从而使得在环化时，遗传元件含有启动子序列的5’和3’部分，这两个部分被全部或部分Rep蛋白识别序列所分隔，但是这一Rep蛋白识别序列不会使启动子的活性丧失，上述环状分子还可以进一步选择性的含有操作性地连接在多核苷酸序列上的启动子。

或者，启动子是来源于诸如TMV、TEV或AMV的RNA启动子。

这种系统的优点是，当构建体以线性形式并，例如整合入一个较大的核苷酸序列，如基因组时，启动子序列是没有活性的。但是一但环化，启动子序列重构，从而使启动子具有活性。接着，选择性存在的、操作性地连接的多核苷酸序列进行表达。

合适的启动子的例子包括花椰菜花叶病毒(cauliflowermosaicvisur)35S启动子。另一个有用的启动子是泛素启动子。通常，单子叶植物的启动子如泛素启动子需要在启动子和表达的外显子的起始密码之间存在内含子序列。如果缺少这一内含子序列，启动子的表达就会十分低或者完全不表达。本发明中的遗传构建体可以设计成这样，使得一但环化，含有茎环结构的内含子序列形成位于泛素启动子下游的内含子序列，从而允许它的操作。

另外一些合适的启动子将在下面描述。

在另一个优选的实施方案中，本发明提供从5’端到3’端依次含有第一、第二、第三、第四、第五和第六个核苷酸序列的构建体，其中：

第一和第六个核苷酸序列可以相同也可以不同，每个都含有能被一个或多个Rep蛋白或者它的衍生物或同源物识别的Rep蛋白识别序列，从而当上述构建体整合入一个较大的核苷酸序列如基因组序列时，上述第一和第六序列包括全部或部分的第一和第六序列所包围的遗传物质就能够被剪出并环化，其中上述Rep蛋白识别序列邻接于或插入于一个或多个包括内含子序列或部分内含子序列或其它剪接信号的外源序列中；

第二个核苷酸序列含有多核苷酸序列的3’部分；

第三个核苷酸序列是操作性地连接于上述第二个序列的转录终止子或者它的功能衍生物或同源物；

第四个核苷酸是操作性地连接于第五个核苷酸序列的启动子序列

第五个核苷酸是多核苷酸序列的5’部分，其中上述多核苷酸序列的5’和3’部分代表了上述多核苷酸序列的全部编码序列；

其中，当构建体整合入较大的核苷酸序列如基因组序列后，在一个或多个Rep蛋白存在的情况下，环化的遗传序列就从上述较大的核苷酸序列中分离产生，这一环状的遗传序列依次含有：操作性地连接于多核苷酸序列的启动子序列，多核苷酸序列含有全部或部分的外源序列或其它剪接信号，而这些剪接信号则含有全部或部分上述第一和/或第六核苷酸序列以及转录终止子序列。

根据上面提到的本发明的这一方面，第一和第六核苷酸序列代表识别序列，它们可以被源于病毒的、复制辅助蛋白质如Rep或它的衍生物或者真核或原核细胞的衍生物所识别，邻接或插入于内含子序列或其它剪接信号。第二到第五个核苷酸序列代表前面所定义的遗传元件。

本发明的另外一个方面是关于在形成构建体时所用的遗传元件，上述遗传元件从5’到3’方向依次含有：操作性地连接于转录终止子的多核苷酸序列的3’部分，操作性地连接于多核苷酸序列5’部分的启动子。其中一但环化，多核苷酸序列的5’部分操作性地连接在多核苷酸序列的3’部分上，它们被全部或部分外源序列或内含子序列或其它剪接信号隔开。

本发明的构建体有一系列用途。在某个实施方案中，构建体用来使植物细胞产生对ssDNA病毒的遗传抗性。保护措施所针对的那些特定的病毒包括但不限于Geminiviridae或Nanovirus.在这一实施方案中，构建体含有“自杀基因”，即基因编码的产物能诱导细胞凋亡、裂解、死亡或者进入生化或生理上的休眠状态。在允许整合入植物细胞基因组的条件下，将构建体导入植物细胞。植株从植物细胞中再生，并繁殖。当植株被含有Rep蛋白的特定ssDNA病毒感染之后，其中Rep蛋白能识别构建体中位于遗传元件旁的Rep蛋白识别序列，构建体就被剪切，并重新环化，从而重构成“自杀基因”，并且促进它的表达。接着细胞死亡或者休眠，从而阻止ssDNA病毒的复制和释放。

在一个特别优选的实施方案中，本发明提供含有核苷酸序列的构建体，这些核苷酸序列基本上与SEQIDNO：31到SEQIDNO：36中发表的序列相同，或者与SEQIDNO：31到SEQIDNO：36中的任何一个序列都有60％的同源性，或者能在42℃的低严紧条件下，和SEQIDNO：31到SEQIDNO：36中的一个或多个序列或它们的互补形式进行杂交。

因此，本发明的另一方面提供生产抗ssDNA病毒的转基因植物或者它们的后代的方法，上述方法包括将构建体导入上述植物的基因组，这个构建体从5’到3’依次含有：邻接于或插入于内含子序列或其它剪接信号中的Rep蛋白识别序列；多核苷酸序列的3’部分；转录终止子或它的功能等价物；操作性地连接在多核苷酸序列的5’部分上的启动子序列；其中多核苷酸的5’和3’部分代表了能诱导细胞死亡或休眠的肽、多肽或蛋白质的编码区域，以及相同或不同的Rep蛋白识别序列；其中当含有Rep蛋白的ssDNA病毒感染上述植物细胞时，Rep蛋白能够识别两侧的Rep蛋白识别序列，构建体就会被切出，并且环化，从而使多核苷酸序列重构成能够表达成肽、多肽或者蛋白质的形式，这种形式而这些肽、多肽或蛋白质能够杀死植物细胞或者使植物细胞休眠。

该构建体的另一个用途是生产雄性不育植物。在这个实施方案中，编码Rep蛋白的基因置于花粉特异性的启动子的控制下。用Rep蛋白识别序列也可以生成含有上述“自杀基因”的构建体，其中Rep蛋白识别序列可以被花粉特异性启动子控制下的Rep基因识别。当花粉形成时，花粉特异性启动子活化，从而激活自杀基因。接着花粉细胞就被选择性的摧毁或休眠。

此处所述的构建体的其他用途包括将促进颜色转变的遗产物质导入植株或特定的组织或种子或者植物的其它生殖物质中。能够促进颜色转变的遗传序列的一个例子是编码花青苷途径中的酶的基因，例如黄酮3’羟化酶(flavonal3’-hydroxylase)，黄酮3’、5’羟化酶(flavonal3’，5’-hydroxylase)，黄酮3’合成酶(flavonal3’-synthase).

在另一个实施方案中，构建体的两侧可以有两个不同的Rep蛋白识别序列，即被两个不同的Rep蛋白识别。一个Rep蛋白可以由插在植物基因组中的基因编码，另一个Rep蛋白可以通过感染ssDNA病毒来导入。或者，Rep蛋白可以由在不同的发育阶段表达的不同的启动子编码。

尽管本发明特别描述了关于植物和ssDNA病毒的东西，本发明还可以扩展到同源切割结构和来自于其它来源的具有位点特异性切割和连接活性的蛋白质，这些其它来源可以是非ssDNA病毒和真核细胞，如昆虫细胞、哺乳动物细胞或者爬行动物细胞。在本发明所涉及的植物范围内，这些植物可以是单子叶植物或双子叶植物。

此处所用的术语“植物细胞”包括原生质体或者来源于植物的其它细胞、产生配子的细胞以及能再生成整个植株的细胞。植物细胞包括植株中的细胞，以及原生质体或其它培养细胞。

此处所用的术语“多核苷酸”或“核酸”指mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。

此处“多肽”、“肽”和“蛋白质”可以互换使用，用来指氨基酸残基的聚合物以及它们的变体。

用来描述两个或多个多核苷酸或多肽的序列关系的术语包括“参考序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同源百分比”和“基本相同”。“参考序列”的长度至少为12，但常常是15到18个单体，通常情况下是至少25个单体，包括核苷酸和氨基酸残基。由于两个多核苷酸都可以含有一个序列(即仅仅是完整多核苷酸序列的一部分)，因此两个(或更多)多核苷酸之间的序列比较通常通过比较两个多核苷酸的比较窗口的序列而识别和比较序列相似的局部区域来实现。“比较窗口”至少含有六个连续的位点的概念片断，通常约为50到大约100个，更通常的情况下是100到大约150个，将其中的序列和具有相同数目的连续位点的参考序列最佳化排比，再进行比较。在把这两个序列最佳化排比时，同参考序列(不含有附加物或缺失)相比，比较窗口可以含有少于等于约20％的附加物或者缺失(即间隔)。在排比比较窗口时，对序列的最佳化排比可以通过计算机化的算法工具(威斯康星遗传软件包7.0版中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputerGroup，575ScienceDriveMadison，WI，USA)或者通过检查来进行，用所选许多方法中的任何一种产生最好的排比效果(即在比较窗口形成最高同源性百分比)。也可以参考如Altschul等人在1997年公开的BSLAST程序家族。序列分析的详细讨论可以在Altschul等人在1994-1998做的Unit19.3中找到。

此处所用的术语“序列同一性”指的是，比较窗口中的序列在碱基对碱基或氨基酸对氨基酸的基础上的序列相同程度。因此，“序列同源性百分比”可以通过以下方式计算：在比较窗口中比较两条选择性对齐的序列，确定在两条序列上都出现的相同的核酸碱基(如A，T，C，G，I)或者相同的氨基酸残基(如Ala，Pro，Ser，Thr，Gly，Val，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，Lys，Arg，His，Asp，Glu，Asn，Gln，Cys和Met)位点的数目得到相匹配的位置数目，将它除以比较窗口的总位点数目(即窗口大小)，再将结果乘以100，就得到了序列同源性的百分比。对于本发明的目的来说，“序列同一性”可以理解成由DNASIS计算机程序(适用于windows操作系统的2.5版本；可以从美国加利福尼亚州南旧金山城的Hitachi软件工程有限公司得到)计算的“匹配百分比”，采用随同软件的说明书中所用的标准默认值。

此处所指的低严紧性包括：用至少约0到至少约15％v/v的甲酰胺溶液，至少约1M到至少约2M的盐溶液来杂交，以及至少约1M到至少约2M的盐溶液作清洗条件。通常，低严紧性在大约25-30℃到大约42℃之间。温度可以改变，也可以用较高的温度来代替甲酰胺和/或提供其他严紧性条件。在任何必需的情况下，都可以使用其他严紧性条件，例如中等程度的严紧性，它包括：用至少约16％v/v到至少约30％v/v的甲酰胺溶液和至少约0.5M到至少约0.9M的盐溶液来杂交，以及至少约0.5M到约0.9M的盐溶液作为清洗条件；或者更高的严紧性条件，包括用至少约31％v/v到至少约50％v/v的甲酰胺溶液和至少约0.01M到至少约0.15M的盐溶液来杂交，以及至少约0.01M到至少约0.15M的盐溶液作清洗条件。通常，清洗在温度T_m＝69.3+0.14(G+C)％下进行(Marmur和Doty，1962)。但是，随着错配碱基对数每增加1％，双链DNA的T_m相应地降低1℃(Bonner和Laskey，1974)。在这些杂交条件中，甲酰胺是可选择的。因此，特别优选的严紧性程度定义如下：低严紧性是在25℃-42℃下，6XSSC缓冲液和0.1％w/vSDS；中等程度的严紧性是在20℃-65℃的范围内，2XSSC缓冲液和0.1％w/vSDS；高严紧性是在至少65℃下，0.1XSSC缓冲液和0.1％w/vSDS。

术语“转化”表示通过导入外源或内源核酸而改变生物如真核细胞的表型。

“载体”表示核酸分子，优选来自于如质粒、噬菌体或植物病毒的，其中可以插入或克隆核酸序列的DNA分子。载体优选含有一个或多个独特的限制性酶切位点，并且能够在定义的宿主细胞中自主复制，这些宿主细胞包括目标细胞、目标组织、它们的祖先细胞或祖先组织，或者优选载体能够整合入所定义的宿主的基因组中，从而使得克隆的序列能够复制。因此，载体可以是自主复制的载体，即能以染色体外实体形式存在的载体，它的复制不依赖于染色体的复制，例如，线性或闭合环状的质粒、染色体外元件、微型染色体或者人工染色体。载体可以含有任何能确保自主复制的方式。或者，在导入细胞之后，载体也可以整合入受体细胞的基因组，并且和它所整合入的染色体一起复制。载体系统可以含有单个载体或质粒，或者两个或更多的载体或质粒，它们共同含有待导入宿主细胞基因组的总DNA，载体系统也可以含有转座子。载体的选择通常依赖于载体和它所要导入的细胞的兼容性。载体也可以含有选择标记，如抗生素抗性基因，它们可以用来选择合适的转化体。这类抗性基因的例子是本领域中技术人员所熟知的。

术语“基因”以它最广泛的意义使用，包括和基因外显子相对应的cDNA。因此，此处提到的基因应该认为包括：

(i)经典的基因组基因，包括转录和/或翻译调控序列和/或编码区域和/或非翻译序列(即内含子、5’和3’非翻译序列)；

(ii)对应于编码区(即外显子)的mRNA或者cDNA，以及基因的5’和3’非翻译序列；和/或

(iii)对应于编码区(外显子)的结构区域，这一区域可选择性的进一步含有非翻译序列和/或异源启动子序列，该异源启动子序列含能够赋予上述结构区域表达特性的转录和/或翻译调控区域。

术语“基因”也可以用来描述合成或融合的分子，这些分子编码的全部或部分功能产物，具体为正义或反义mRNA产物或肽或寡肽或多肽或者具有生物活性的蛋白质。”基因”的提法也包括了“合成基因”。

术语“合成基因”是指如上文所定义的非自然出现的基因，它优选含有至少一个或多个操作性地连接于结构基因序列的转录和/或翻译调控序列。

术语“结构基因”应该被认为是指这样的核苷酸序列，它们能够产生mRNA，以及可选择地编码肽、寡肽、多肽或具有生物活性的蛋白质分子。本领域中的技术人员知道到并不是所有的mRNA都能够翻译成肽、寡肽、多肽或蛋白质，比如，缺少有功能性的翻译起始信号的mRNA，或者某条mRNA是反义mRNA。本发明明确涵盖了含有不能编码肽、寡肽、多肽或具有生物活性的蛋白质的核苷酸序列的合成基因。特别是，本发明者发现这样的合成基因在修饰目标基因在真核生物的细胞、组织或器官中的表达时是有优势的。

术语“结构基因区域”是指合成基因中能在细胞、组织或器官中表达的那部分，并且它的表达受它所操作性连接的启动子序列的控制。结构基因区域可以操作性地受单个启动子序列或多个启动子序列的控制。因此，合成基因的结构基因区域可以含有能编码氨基酸序列的核苷酸序列或者它的互补形式。在这一点上，本发明实现过程中所用的结构基因区域也可以含有这样的核苷酸序列，即编码氨基酸序列，但缺少功能性的翻译起始密码子和/或功能性的翻译终止密码子，从而不含完整的可读框。在这里的上下文中，术语“结构基因区域”也可以扩展到非编码核苷酸序列，例如基因的5’上游序列或者3’下游序列，通常这些序列在表达上述基因的真核细胞中是不翻译的。

因此，在本发明的上下文中，结构基因区域也可以含有相同或不同基因的两个或者多个可读框的融合体。在这样的实施方案中，通过针对向基因的非相邻的不同区域，本发明可以用来调节一个基因的表达，或者同时调节几个不同基因包括多基因家族的不同基因的表达。在核酸分子融合体的例子中，其中这一融合体对真核细胞来说是非内源的，并且这一融合体含有两个或多个源于病毒病原体的核苷酸序列，这样的融合体就可以提供额外的优势，即通过针对在上述几种病原体中的基因表达，来提供对几种病原体的同时免疫或保护。另外或者，通过针对病原体的一个以上基因的表达，融合体就可以提供对该病原体的更加操作性地免疫。

根据发明的这一方面，特别优选的结构基因区域是那些至少含有一个可翻译的可读框的区域，这一区域更优选进一步含有位于上述可读框5’末端的翻译起始密码子，该起始密码子不必位于上述结构基因区域的5’末端。在这一点上，尽管结构基因区域可以至少含有一个可翻译的可读框和/或AUG或ATG这样的翻译起始密码，但是包含这样的序列决不意味着本发明需要翻译导入的核酸分子从而调节目标基因的表达。尽管不受到任何理论或行动方式的束缚，在对象核酸分子中至少包含一个可翻译的可读框和/或翻译起始密码子可以增加它的mRNA转录产物的稳定性，从而改进本发明的效果。

可以包含在本发明的合成基因中的结构基因序列的最佳数目变化相当大，这个最佳数目依赖于每个上述结构基因序列的长度、它们的方向以及相互之间的同一性程度。例如，本领域的技术人员知道体内回文核苷酸序列的内在的不稳定性，以及构建含有反向重复核苷酸序列的长合成基因所紧密联系的困难，因为这些反向重复核苷酸序列在体内有重组的倾向。尽管存在这样的困难，要包含在本发明的合成基因中的结构基因的最佳数目可以由本领域中的技术人员凭经验确定，而不需要任何多余的实验，并遵循下述标准方法，例如用重组酶缺陷型的细胞系构建本发明的合成基因；将重复序列的数目减少到某一程度，使得在这一程度下，减少重组事件发生的概率到最小或者不发生；并使多结构基因序列的总长度限制在可以接受的水平，优选的长度是不超过5-10kb，更优选为2-5kb，且进一步更优选0.5-2.0kb。

为了在真核细胞中表达，除了含有多核苷酸序列之外，构建体通常还含有启动子和可选择的用来促进多核苷酸序列的表达其它被设计调控序列。

此处提到的“启动子”应当理解为其最广泛的含义，包括经典的基因组基因的转录调控序列，这一调控序列包含精确起始转录所需的TATA盒，它也可以含有或不含CCAAT盒以及其它的调控元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)，这些调控元件能对发育和/或外部刺激起反应，从而改变基因的表达，它们也可以以组织特异性的方式改变基因的表达。启动子通常但非必需位于，它所调控其表达的结构基因区域的上游或者5’端。更进一步，含有启动子的调控元件通常位于基因转录起始位点的2kb以内。

在此处的上下文中，术语“启动子”也可以用来描述合成分子或融合分子或者衍生物，这些分子能提供、激活或增强核酸分子在细胞中的表达。

优选的启动子也可以另外含有一或多个拷贝的特异的调控元件，从而进一步增强正义分子的表达，和/或改变上述正义分子的表达空间和/或表达时间。例如，能够提供铜离子诱导性的调控元件可以放置于异源启动子旁边，这一异源启动子能驱动正义分子的表达，从而给上述分子的表达提供铜离子诱导性。

将核酸序列放在启动子序列的调控下意味着对上述分子定位，从而使得表达受启动子序列的控制。启动子通常位于它所控制的基因的5’端(上游)。在构建异源启动子/结构基因组合体时，通常优选的是，将启动子放在基因转录起始位点的一定距离外，这一距离与启动子和它所控制的基因(即启动子的来源基因)之间在自然状态下的距离大致相同。如本领域中所熟知的，这一距离的一些改变也是可行的，而不会造成启动子功能的丧失。类似的，调控序列元件相对于它所控制下的异源基因的优选位置也可以通过这一元件在自然状态下即它所来源的基因的位置来定义。同样，如本领域所熟知的，这一距离的一些变化也是可以出现的。

适用于本发明中合成基因的启动子的例子包括病毒、真菌、细菌、动物和植物来源的启动子，这些启动子能够在植物、动物、昆虫、真菌、酵母或细菌细胞中行使功能。启动子可以对结构基因组件进行持续调控，或者随发生表达的细胞、组织或器官的不同而差异调控，或者随发生表达的发育阶段的不同而差异调控，或者这种差异调控应激于外部刺激，如生理压力、病原体、金属离子或者其它的一些刺激。

优选，启动子至少能在靶基因表达的那段时间里，在真核细胞、组织或器官中调控核酸分子的表达，更优选，靶基因在上述细胞、组织或器官中的可探测表达开始之前，启动子立即行使调控功能。

因此，强的组成型启动子对于本发明的目的是特别有用的，对于那些能被病毒感染或者靶基因表达的开始所诱导的启动子也是特别有用的。

植物中可操作的和动物中可操作的启动子特别优选用于本发明中的构建体。优选启动子的例子包括病毒启动子，如噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子，细菌启动子，如lac操纵子-启动子、tac启动子，病毒启动子，如SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMVIE启动子，或者植物病毒启动子，如CaMV35S启动子、SCSV启动子、SCBV启动子等等。

考虑到对启动子在目标基因表达的同时或之前的高水平表达的优选需要，启动子最好是目标宿主里的组成型强启动子，例如CMV-IE启动子，或者哺乳动物细胞中的SV40早期启动子序列、SV40晚期启动子序列，以及某些植物细胞中的CaMV35S启动子，或者SCBV启动子，等等。本领域的技术人员除了知道除那些特地描述过的启动子之外的其他启动子。

在此处的上下文中，术语“可操作的连接在”或“操作性地受控于”以及类似的术语都表明，在细胞、组织、器官或整个生物体中，结构基因区域或多结构基因区域的表达受到它在空间上所连接的启动子序列的控制。

构建体优选含有其他用于有效转录的调控元件，如转录终止序列。

术语终止子”是指位于转录单元末端的DNA序列，它提供转录终止的信号。终止子是3’端非翻译DNA序列，通常含有多腺苷酸化信号，这一信号能促使多腺苷酸序列加在初级转录物的3’末端。植物细胞中有活性的终止子是为人熟知的，并且在文献中有描述。它们可以从细菌、真菌、病毒、动物和/或植物中分离，也可以重新合成。

对启动子序列而言，终止子可以是任何能在它所应用的细胞、组织或器官中操作的终止子序列。

特别适用于本发明中合成基因的终止子的例子包括，SV40多腺苷酸化信号、HSVTK多腺苷酸化信号、CYC1终止子、ADH终止子、SPA终止子、根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciaens)中胭脂碱合成酶(NOS)基因的终止子、花椰菜花叶病毒(CaMV)35S基因的终止子、来自于玉米的zein基因终止子、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基基因(SSU)的终止子序列、地三叶草Nanovirus(SCSV)基因序列的终止子、任何不依赖rho的埃希氏大肠杆菌(E.coli)终止子或者lacZ的α终止子，等等。

在一个特别优选的实施方案中，终止子是SV40多腺苷酸化信号或者在动物细胞、组织和器官中可操作的HSVTK多腺苷酸化信号，也可以是植物细胞、组织或器官中有活性的章鱼碱合成酶(OCS)终止子或胭脂碱合成酶(NOS)终止子，或在原核细胞中有活性的lacZα终止子。

本领域中的技术人员知道另外一些适用于本发明的终止子序列。这类序列能很容易的使用，而不需要任何多余的实验。

将构建体导入(即转染或转化)细胞的方法为本领域中的技术人员所熟知。

上面所述的构建体能被进一步修饰，例如包含编码可探测的标记酶或它的功能类似物或它的衍生物的标记核苷酸序列，从而便于在它所表达的细胞、组织或器官中检测合成基因。根据这一实施方案，标记核苷酸序列将以可翻译的形式存在，并且例如以与一或多个结构基因的翻译产物构成融合多肽或者以非融合多肽的形式表达。

本领域中的技术人员知道怎样生产此处所述的合成基因，他们也知道需要时，在适合条件下让合成基因在特定细胞或细胞类型中表达的必要条件。特别是，本领域的技术人员知道，实现本发明所需的遗传操作需要让此处所述的构建体或它的衍生物在原核细胞，如埃希氏大肠杆菌，或植物细胞或动物细胞中扩增。

本发明中的构建体也可以不加任何修饰，以线性形式导入或者包含于合适的例如细胞、病毒颗粒或脂质体等的载体而合适的细胞、组织或器官中。为了生产遗传构建体，将本发明的合成分子插入一个合适的载体或opisome分子，例如，噬菌体载体、病毒载体或质粒、粘粒或人工染色体载体，这一载体能在它将要导入的宿主细胞、组织或器官中维持和/或复制和/或表达。

因此，本发明的另一个方面提供遗传构建体，这一构建体至少含有所述的遗传元件和一或多个复制起始位点和/或选择性标记基因序列。

除了给真核细胞提供对病毒病原体的抗性外，遗传构建体还特别适合于使真核细胞转化，从而对其引入新的遗传特性。这种附加的新特性可由通过分离的构建体，或者通过所述的含有合成基因的同一遗传构建体导入。本领域的技术人员知道将编码这类附加特性的遗传序列和此处所述的合成基因包含在单个遗传构建体中的巨大优越性，特别是可以减少遗传操作和组织培养的要求，并且能增加成本效益。

通常，适用于细菌的复制起始位点或选择性标记基因是从那些包含在遗传构建体中的基因序列中物理分离得到的，其中上述基因序列是要在真核细胞中表达或要转移到真核细胞，或者整合到真核细胞基因组。

如此处所用，术语“连择性标记基因”包括任何能对它所表达的细胞赋予表型而利于确认和/或选择那些被本发明构建体或它的衍生物转染或转化的细胞的基因。

此处所述的合适的选择性标记基因包括氨苄青霉素抗性基因(Amp^r)、四环素抗性基因(Tc^r)、细菌卡那霉素抗性基因(Kan^r)，它是一种zeocin抗性基因(zeocin是博来霉素家族的一种药物，是InVitrogenCorporation的商标)、能够对抗生素短柄霉素A提供抗性的AURI-C基因、膦丝菌素抗性基因、新霉素磷酸转移酶基因(nptII)、潮霉素抗性基因、β-葡糖醛酸酶(GUS)基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因、绿色荧光蛋白编码基因或者萤光素酶基因，等等。

选择性标记基因优选nptII基因或Kan^r基因或绿色荧光蛋白编码基因。

本领域的技术人员知道其他可用于本发明的选择性标记基因并且选择性标记苈在的性质不限制本发明。

本发明可以扩展到基本上在此描述的所有遗传构建体，这些构建体进一步包括使上述遗传构建体在原核或真核细胞中维持和/或复制，和/或使上述遗传构建体或它的一部分整合入真核细胞或生物体的基因组中的遗传序列。

上述的标准方法可以用来将构建体导入细胞、组织或器官，例如，脂质体介导的转染或转化，用减毒的病毒颗粒或细菌细胞对细胞进行转化，细胞接合，以及为本领域技术人员熟知的转化或转染方法。

将重组DNA导入植物组织或细胞的其它方法包括，但不限于：用CaCl₂和它的变体进行转化，原生质体直接吸收DNA，PEG介导的原生质体吸收DNA，微粒轰击，电穿孔，显微注射DNA，微粒轰击组织的外植体或细胞，用核酸对组织进行真空渗入，或者对植物而言，可以用T-DNA介导的从农杆菌向植物组织的转移。

在对细胞进行微粒轰击时，微粒被推进细胞里，从而产生转化的细胞。任何合适的弹道细胞转化方法和仪器都可以用来实现本发明。可仪器和方法的例示已经由Stomp等人(美国专利号5,122,466)以及Sanford和Wolf(美国专利号4,945,050)公布了。在使用弹道转化方法时，遗传构建体可以整合能在将被转化的细胞中复制的质粒，这个质粒。

适用于此类体系的微粒的例子包括1到5微米的金球。DNA构建体可以用任何合适的技术沉积在微粒上，例如通过沉淀作用。

在本发明的进一步实施方案中，此处所述的遗传构建体经过改造，适于整合入它所要表达的细胞的基因组中。本领域的技术人员知道，为了使遗传序列或遗传构建体整合入宿主细胞的基因组中，需要一些额外的遗传序列。对于植物而言，通常需要来自于根癌土壤杆菌Ti质粒的T-DNA的左右边界序列。

本发明进一步扩展到含有构建体或部分构建体的分离的细胞、组织和器官。本发明还可以进一步扩展到来源于上述细胞、组织和器官的再生组织、器官和整个生物体，它们的无性繁殖体和后代，以及种子和其它生殖物质。

例如，在含有激素的培养基中，植物可以从转化的植物细胞或组织或器官再生，再生的植物可以有多种形式，如转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆转化体(如所有细胞都经过转化而含有表达盒)；转化和非转化组织的嫁接体(如在柑桔中，将转化的砧木嫁接未转化的接穗)。转化的植物可以通过多种方法繁殖，如用克隆繁殖或经典的育种技术。例如，第一代转化的植物(或T1)可以通过自交产生纯合的第二代转化植物(或T2)，第二代植物可以用经典育种技术进一步繁殖。

在另一个实施方案中，构建体用来诱导对目标遗传序列表达的调控。例如，在线性形式下，构建体从5’到3’端依次含有反义序列、启动子和正义序列。源于病毒的、复制辅助蛋白识别序列(如茎环结构)或者哺乳动物或微生物的同源类似物位于这些元件的侧翼。终止子序列位于识别序列所包围的区域以外。在复制性释放时，含有目标遗传序列的正义和反义形式的多核苷酸序列就形成了。产生的多核苷酸序列可以接着形成发夹环。这一构建体可以变化成串连或多重重复，倒位，或者它们的组合。这种结构对植物或动物细胞中的基因沉默是很有用的。元件在线性形式中的顺序并不关键。例如，正义和反义序列的位置可以互换。图27表示一个合适的构建体的例子。

本发明将通过下面的非限制性实施例，进一步加以描述。

实施例1

基于BBTV的表达载体

构建一系列含有花椰菜花叶病毒35S启动子(35S)的载体，该启动子驱动芽孢杆菌RNA酶基因的表达。在该载体中插入了马铃薯中光诱导型的组织特异性ST-LS1基因的内含子(NT-内含子-CT)。终止子或者来自编码胭脂碱合成酶的基因(nos)，或者来自BBTVDNA-6(BT6)的主要可读框(ORF)。

这些构建体利用交迭的引物(表1)通过PCR方法装配而成，再利用本领域已知的标准技术克隆进pGEM-T载体中。如图1所示构建表达载体pTBN。pTBN(SEQIDNO：66)作为主干，其他表达载体则在此基础上构建而成。引物的名称、结合位点以及每个序列的大小均已标明。pTBN(同其他构建体一样)是逐步扩增而成的。最初，所有三个片段(亦即35S，NT-内含子-CT和nos)单独扩增而成。然后，整个序列通过利用引物+1和-4在混合各个片段的PCR中扩增而成。

如图2所示，pTBN6(SEQIDNO：67)含有插入其内含子中的624bp长的区域，该区域包含BBTVDNA-6(6I)的CR-SL和CR-M。

如图3所示，pTBN1(SEQIDNO：68)同pTBN6一样，含有插入其内含子中的163bp长的区域，该区域包含BBTVDNA-1(1I)的CR-SL和CR-M。用来自BBTVDNA-6大ORF的126bp长的终止子代替nos终止子。

载体重新环化是依据pTBN6和pTBN1。它们侧翼有Rep识别序列相接，并且设计成只有在BBTVRep存在时才可以重新环化并从而具有转录活性。构建三个不同的载体，即pRTBN6，pRTBN1和pRTBN1/6。

图4所示的pRTBN6是从pTBN6构建而来的。两个片段分别用+5和-4及+1和-6引物扩增。将这些片段克隆入pGEM-T载体中，再经亚克隆而得到pRTBN6。

图5所示的pRTBN1是以与pRTBN6相似的方式从pTBN1构建而来的。

图6所示的pRTBN1/6是pRTBN1和pRTBN6的杂合产物。

对于上述每个构建体(pTBN除外)，也构建成了非翻译型的载体。在这些载体中，用+11引物(参阅表1)删除芽孢杆菌RNA酶基因的起始密码子利。将这些构建体命名为pUBN6，pUBN1，pRUBN6和pRUBN1。

表1寡核苷酸引物序列

引物	名称	序列(5′-3′)
			+1	3TS1-H	AAGCTTCATGGAGTCAAAGA (SEQ ID NO：1)
+2	35S1-B	TCATTTGGAGAGGATCCATGGCACAGGTT (SEQ ID NO：2)
			-2	B2-35S	AACCTGTGCCATGGATCCTCTCCAAATGA (SEQ ID NO：3)
+3	B1-N	AAAATCAGATAAGAGCTCGATCGTTCAAA (SEQ ID NO：4)
			-3	N2-B	TTTGAACGATCGAGCTCTTATCTGATTTT (SEQ ID NO：5)
-4	NOS4-H	AAGCTTTTCGCCATTCAGGCTGC (SEQ ID NO：6)
			+5	B3-6	TATCATTAATTAGTAAGTTGTGCTGTAA (SEQ ID NO：7)
-5	6-B4	TTACAGCACAACTTACTAATTAATGATA (SEQ ID NO：8)
			+6	6-B3	GGAAGGCAGAAGCGAGTAATATAATATT (SEQ ID NO：9)
-6	B4-6	AATATTATATTACTCGCTTCTGCCTTCC (SEQ ID NO：10)
			+7	B5-I	ATCATTAATTAGTCACACTATGACAAAAG (SEQ ID NO：11)
-7	I-B6	TTGTCATAGTGTGACTAATTAATGATAAT (SEQ ID NO：12)
			+8	I-B5	GACATTTGCATCAGTAATATAATATTTCA (SEQ ID NO：13)
-8	B6-I	AATATTATATTACTGATGCAAATGTCCCG (SEQ ID NO：14)
			+9	B7-6T	TCAGATAAGAGCTCAGTAACAGCAACAAC (SEQ ID NO：15)
-9	6T2-B	GCTGTTACTGAGCTCTTATCTGATCTTTG (SEQ ID NO：16)
			-10	6T4-H	AAGCTTATTTCCCAAATATACGT (SEQ ID NO：17)
+11	UNTBarn	GGATCCGCACAGGTTATCAAC (SEQ ID NO：18)

实施例2

基于TYDV的表达载体

(a)含有内含子的GUS报告基因表达盒(cassette)的构建

载体pCAMBIA2301由CAMBIA得到(Canberra，澳大利亚)。该载体在uidA编码区域的5’部分含有一个189bp长的过氧化氢酶内含子。将CaMV35S的启动子区域(800bp)，uidA编码区域以及nos终止子以HindIII/SphI酶切片段的形式从pCAMBIA2301中移出，再插入到以同样的酶消化的pGEM-T(Promega)载体中。将随后的构建体称为pGEM-2301。通过NotI/BglII的消化和连接用更强的530bp长的CaMV35S启动子替换800bp长的CaMV35S启动子。将随后的构建体称为p35S-2301(图7)并充当所有后来克隆步骤的模板。

(b)烟草黄矮病线条病毒(tobaccoyellowdwarfmastrevirus)(TYDV)大基因间隔区域的分离及将其插入到p35S-2301的过氧化氢酶内含子中

用LIR-F和LIR-R引物通过PCR方法从TYDV感染的烟草叶片组织中扩增合并了TYDV(GenbankAccM81103)的大基因间隔区域(LIR)(nt+1到nt+272)的片段(见图1)。将该片段称为LIR。

引物：

LIR-F5’-GCTCTTCCTGCAGGCGGCCGCATTAAGGCTCAAGTACCGTA-3’[SEQIDNO：19]

LIR-R5’-GCTCTTCGTCGACGAATTCATTTTCAACTTTGGGATGTCAC-3’[SEQIDNO：20]

通过PCR用引物35S-IE和CAT-A从p35S-2301质粒DNA中扩增，包含CaMV35S启动子(530bp)，uidA第一外显子(19bp)及过氧化氢酶内含子的5’一半(83bp)的片段。将该片段称为CAT-A。

引物：

35S-IE5’-GAATTCCATGGAGTCAAAGATTCA-3’[SEQIDNO：21]

CAT-A5’-GCCCGCTGCAGAGTTTAAAGAAAGATCAAAGC-3’[SEQIDNO：22]

将包含过氧化氢酶内含子的3’一半(106bp)，和uidA第二外显子(1809bp)的片段通过PCR用引物CAT-B和GUS-BstEII从p35S-2301质粒DNA中扩增而得。。将该片段称为CAT-B。

引物：

CAT-B5’-GCCCCGGTCGACGATCTATTTTTTAATTGATTGG-3’[SEQIDNO：23]

GUS-BstEII5’-TTCGAGCTGGTCACCTGTAATTCACACGTGGTG-3’[SEQIDNO：24]

将结果得到的PCR产物克隆到pGEM-T中并验证其核苷酸序列。最后，从pGEM-T中切下每个片段(CAT-A用EcoRI/PstI，LIR用PstI/SalI，CAT-B用SalI/BstEII)，再一起连接到经EcoRI/BstEII消化的p35S-2301中而得到质粒pTEST1(图8)。

(c)确定GUS的表达是否受TYDVLIR插入过氧化氢酶内含子的影响

为了确定GUS的表达，因此也就是内含子剪接是否会因TYDVLIR插入p35S-2301的过氧化氢酶内含子中而受到影响，用构建体来轰击(bombard)香蕉胚胎发生细胞中并瞬时分析GUS的活性。将被试质粒pTEST1和正对照质粒p35S-2301涂在1μm的金粒上，再依照Becker等(2000)的方法用生物弹射击法(biolistically)引入到5日龄的香蕉(Musaspp.cv.“松脆饼(Ladyfinger)”AAA)胚胎发生细胞中。轰击后2日收获细胞并用组织化学方法分析GUS的活性(Jefferson等，1987)。

在没有被轰击的细胞中没有发现内源的GUS活性。在被正对照质粒p35S-2301轰击的细胞中观察到了强的GUS活性，显示明显的亮蓝色着色的细胞灶(cellfoci)。相反的，被pTEST1轰击的细胞中GUS的表达较低(约5倍)，这是通过蓝色着色细胞灶的数量和亮度来确定的。该结果提示将TYDVLIR插入p35S-2301中过氧化氢酶的内含子中并不废止GUS的表达，但可能在一定程度上影响内含子的加工。

(d)TYDVLIR中隐藏的内含子剪接位点的鉴定

为了确定TYDVLIR中是否含有潜在的隐藏的内含子剪接位点，该位点将影响mRNA前体的加工过程，被p35S-2301和pTEST1轰击过的细胞的RNA提取物合成cDNA。用Chang等(1993)的方法从被p35S-2301和pTEST1轰击后2日的香蕉细胞中分离得到总RNA。用引物uidA2自总RNA合成互补DNA。将该cDNA作模板用引物是uidA1和uidA3做嵌套式PCR。将结果得到的PCR产物克隆入pGEM-T并测序。通过测序鉴定出了TYDVLIR中2个可能的位点，这些位点可能导致过氧化氢酶内含子从uidA编码区mRNA前体中的异常剪接。第一个位点序列

位于用来分离TYDVLIR的引物LIR-F中，与3’剪接位点的一致序列(T(10X)

)有很强的相似性。第二个位点序列

(nt+43到nt+50)与5’剪接位点的一致序列(

)有一定的相似性。

引物：

uidA15’-CCATGGTAGATCTGAGGG-3’[SEQIDNO：25]

uidA25’-TACGTACACTTTTCCCGGCAATAAC-3’[SEQIDNO：26]

uidA35’-GTAACGCGCTTTCCCACCAACGC-3’[SEQIDNO：27]

(e)从TYDVLIR中的去除3’隐藏的内含子剪接位点

在鉴定出的2个隐藏的内含子剪接位点中，第一个(CTGCAGGC)由于其位置与5’过氧化氢酶内含子的剪接位点有关而被认为是最重要的。为了将这个序列从中TYDVLIR去除，设计了新引物LIR-Xho，该引物含有代替了原来的限制性酶切位点PstI和NotI的XhoI位点。

TYDVLIR用引物LIR-Xho和LIR-R通过PCR从pTEST1质粒DNA中再次扩增得到。将该片段称为LIR-X。类似地，含有CaMV35S启动子(530bp)，uidA第一外显子(19bp)及过氧化氢酶内含子的5’一半(83bp)的片段用引物FUP和CAT-Xho通过PCR从pTEST1质粒DNA中再次扩增得到。将该片段称为CAT-X。将两个PCR产物均克隆入pGEM-T并验证其序列。最后，将PCR片段从pGEM-T中切下(LIR-X用XhoI/SalI，CAT-X用PstI/XhoI)并连接到经PstI/SalI消化的pTEST1中以替换原来的插入片段。将该构建体称为pTEST2(图9)。去除隐藏的内含子剪接位点的pTEST2产生的GUS的表达水平较pTEST1要高，这应归于异常剪接的减少和改良的mRNA的加工。

引物：

LIR-Xho5’-CTCGAGATTAAGGCTCAAGTACCGTA-3’[SEQIDNO：28]

CAT-Xho5’-AGTTTAAAGAAAGATCAAAGC-3’[SEQIDNO：29]

FUP5’-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3’[SEQIDNO：30]

(f)Rep激活型GUS表达载体的构建

用引物SIR-F和SIR-R通过PCR从TYDV感染的烟草叶组织中扩增得到合并了TYDV小基因间隔区域(SIR)(nt+1275到nt+1504)的229bp的片段(见图2)。将结果得到的PCR产物克隆入pGEM-T并验证其核苷酸序列。将该质粒称为pGEM-SIR。将TYDVSIR以SphI酶切片段的形式从pGEM-SIR中切下并插入到pTEST1中nos终止子下游的唯一的SphI位点中。将该构建体称为pTEST1-SIR。

引物：

SIR-F5’-GCATGCAAGAGTTGGCGGTAGATTCCGCATGT-3’[SEQIDNO：31]

SIR-R5’GCTCTTCGCGGCCGCGCTCCTGAATCGTCGAGTCA-3’[SEQIDNO：32]

将CaMV35S启动子，uidA第一外显子，过氧化氢酶内含子的5’一半及TYDVLIR以一个NotI/SalI酶切片段的形式从pTEST2中切下并插入到用相同的酶消化的pGEM-T载体中。将随后的克隆称为pGEM-CATX。将TYDVLIR，过氧化氢酶内含子的3’一半，uidA第二外显子，nos终止子及TYDVSIR以一个NotI酶切片段的形式从pTEST1-SIR中切下并插入到pGEM-CATX的唯一的NotII位点。将该构建体称为pTEST3(图10)。随后将激活型GUS表达盒(cassette)用SacI/ApaI消化后从pTEST3中切下并插入到位于二元(binary)质粒pART27中nospro-NPTI-noster盒上游的SacI/ApaI限制性酶切位点中(Gleave1992)。将该构建体称为pTEST4(图11)。将pTEST4载体用Sighn等(1993)的方法通过电穿孔引入到根癌农杆菌(LBA4404)中。

(g)感染性TYDV1.1mer的构建

将TYDV基因组中2个交迭的片段用引物对LIR-F/SIR-R(SEQIDNO：19/SEQIDNO：32)和LIR-R/TYD-3F(SEQIDNO：20/SEQIDNO：33)通过PCR从TYDV感染的烟草叶组织中扩增得到。将结果得到的PCR产物(分别是TYD-R和TYD-L)克隆入pGEM-T并验证其序列。将这些质粒分别称为pGEM-TYD-R和pGEM-TYD-L。将TYDV基因组中一个1659bp的片段用EcoRI消化后从pGEM-TYD-L中切下并插入到pGEM-TYD-R中唯一的EcoRI位点中。将该构建体称为pGEM-TYDV1.1mer。将TYDV1.1mer通过SalI/EcoRI部分消化后从pGEM-TYDV1.1mer中切下并插入到用同样酶消化的pBI101.3载体(Clontech)中取代uidA基因和NOS终止子。将该构建体称为pBI-TYDV1.1mer(图12)。载体pBI-TYDV1.1mer用Sighn等(1993)的方法通过电穿孔引入到根癌农杆菌(LBA4404)中。

引物：

TYD-3F5’-TTTAAACGTTTAGGGGTTAGCA-3’[SEQIDNO：33]

(h)CaMV35S-TYDVRep融合体的构建

将TYDVRep(包括RepA)的全基因(nt+2580到nt+1481)用引物TYDVRepF和TYDVRepR通过PCR从TYDV感染的烟草叶组织中扩增得到。将结果得到的PCR产物直接克隆到pDH51中CaMV35S启动子(530bp)和CaMV35S终止子(200bp)之间的SmaI位点中(Pietrzak等，1986)。将该构建体称为p35S-Rep(图13)。

引物：

TYDVRepF5’-TCAGTGACTCGACGATTC-3’[SEQIDNO：34]

TYDVRepR5’-TTAATATGCCTTCAGCCC-3’[SEQIDNO：35]

实施例3

利用TYDV载体的GUS表达检测

(a)在单子叶和双子叶细胞中Rep激活的GUS的瞬时表达

烟草(NT-1)细胞基本上是按An(1985)所述的方法维持，并准备用来做微粒的轰击，详情如Dugdale等(1998)所述。香蕉(Musaspp.Cv.“Ladyfinger”AAA)的胚胎发生细胞悬液的制备如前文所述。金颗粒的涂布及生物弹射击(biolistic)参数基本上如Dugdale等(1998)或Becker等(2000)所述。

本研究所用到的质粒包括：

(i)p35S-2301，作为正对照(图7)，

(ii)pTEST3(图10)，

(iii)p35S-Rep(图13)，和

(iv)pTEST3和p35S-Rep。

两个细胞系中各5板被4种质粒组合中的每种进行轰击。轰击后3日，收获细胞，用组织化学方法和(或)荧光测定法分析GUS活性(Jefferson等，1987)。

在未被轰击的细胞内没有观测到内源的GUS活性。在被正对照质粒p35S-2301轰击的细胞中观察到了强的GUS活性，显示明显的亮蓝色着色的细胞灶。被p35S-Rep或pTEST3轰击的细胞内没有观测到GUS的表达。相反的，被p35S-Rep和pTEST3共同轰击的细胞中染上了很强的蓝色，比在正对照质粒p35S-2301中得到的还要强。该结果提示只有在以反式方式加入了TYDVRep时，pTEST3中的GUS表达盒才可以被激活。

(b)GUS多拷贝植物游离基因(MPE)中Rep协助的切口产生、连接及复制

用PCR途径完成对基于TYDV的GUSMPEs的检测。引物uidA1(SEQIDNO：25)和uidA3(SEQIDNO：27)扩增跨越过氧化氢酶内含子的uidA基因的一个片段。只有基于TYDV的MPE在Rep协助下从pTEST3质粒中释放时，该引物组合才能在PCR中得到一个600bp长的产物(包括uidA基因的140bp，过氧化氢酶内含子的190bp及TYDVLIR的270bp)。

用上面4种质粒组合中的每种对烟草NT-1和香蕉细胞进行了轰击。轰击后3日，收获细胞，用Stewart和Via(1993)的方法抽提得到总gDNA。将总gDNA(1μg)用作引物为uidA1(SEQIDNO：25)和uidA3(SEQIDNO：27)的PCR的模板。将PCR产物用质量体积比(w/v)为1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳。在用对照质粒p35S-2301轰击的细胞gDNA中得到了一300bp长的产物(图7)。该产物相当于所引入的质粒DNA中uidA基因和过氧化氢酶内含子的序列。在没有被轰击的细胞或单独用pTEST3或p35S-Rep轰击的细胞内的gDNA中没有得到PCR产物。在用pTEST3和p35S-Rep共同轰击的细胞内的gDNA中得到了一600bp长的产物。该结果支持前文GUS的组织化学分析，并提示基于TYDV的MPEs仅产生于用pTEST3和p35S-Rep共同轰击的细胞内。

基于TYDV的MPEs的复制是通过Southern杂交方法分析的。利用该方法，MPE的指示滚环复制的多聚体形式通过杂交得以检测。将被4种质粒组合中的每种进行了轰击的细胞内总gDNA(20微克)用质量体积比(w/v)为1.5％的琼脂糖凝胶进行了电泳。再将DNA用Southern的方法(1975)转移到尼龙膜上(Roche)。用引物uidA1(SEQIDNO：25)和uidA3(SEQIDNO：27)通过PCR扩增得到600bp特异于uidA基因和过氧化氢酶内含子的、DIG标记的探针。uidA特异的探针在42℃的DIGEasy-Hyb溶液(Roche)中与尼龙膜进行杂交，按照生产商的说明用CDP-Star底物(Roche)来检测信号。基于TYDV的MPEs特征性的超螺旋、线性和开环形式以及高分子量的多聚体形式仅在用pTEST3和p35S-Rep共同轰击的植物细胞内gDNA中检测到。这些结果共同证实在以反式方式提供时，TYDVRep在单子叶和双子叶细胞类型中均能够使基于TYDV的MPE产生切口、连接和复制。这些结果还进一步提示质粒pTEST3中uidA的表达仅在加入TYDVRep时才可激活，而且后者的加入导致了比非复制型的GUS表达盒(p35S-2301)高得多的表达程度。

实施例4

具有Rep激活型盒的单子叶和双子叶植物稳定的转化

香蕉(Musaspp.Cv.“Ladyfinger”AAA)的胚胎发生细胞悬液是基于微粒的稳定转化的目标作用物。如前文所述，用pTEST3轰击细胞，只是质粒是与1μgpDHKAN(Pietrzak等，1986)共同来转化的。该质粒包含一个CaMY35Spro-NPTII-CaMV35Ster盒，其中NPTII基因的表达提供对抗生素卡那霉素(kanamycin)或遗传霉素(geneticin)的抗性。转基因香蕉植株的筛选、培养及再生基本上是按照Becker等(2000)所述的方法完成的。通过PCR分别用引物对NPT-F/NPT-R和uidA4/uidA5证实独立的转基因植物中包含NPTII和uidA基因。将10个独立的转化突变型选出以供进一步的研究。

引物：

NPT-F5’-ATGATTGAACAAGATGGATT-3’[SEQIDNO：36]

NPT-R5’-TGAGAAGAACTCGTCAAGA-3’[SEQIDNO：37]

uidA45’-GTTATTGCCGGGAAAAGTGTACGTA-3’[SEQIDNO：38]

uidA55’-CTAGCTTGTTTGCCTCCCTGCTGCG-3’[SEQIDNO：39]

是按照Horsch等(1988)的方法通过农杆菌媒介的叶盘(leafdiscs)感染转化烟草(Nicotianatabacumcv.“Samsun”)。用来自质粒pTEST4的T-DNA转化得到了10个独立的转基因植株。如上所述，每一品系均通过PCR显示包含NPTII和uidA的编码区。

将来自被Rep激活型GUS表达盒转化的(也就是分别用pTEST3[图10]和pTEST4[图11]转化的)10个转基因香蕉和烟草品系中每种品系的叶子碎片接受质粒p35S-Rep轰击。轰击后3日，将叶子碎片进行GUS的组织化学分析。10个转基因香蕉和烟草品系内每一品系中未被射击到的叶子碎片均无明显的GUS表达。而被质粒p35S-Rep轰击的叶子碎片显示了多重蓝色的GUS染色位点。如前文所述，可以证实在基于TYDV的MPEs中Rep指导的切口产生、连接和复制存在于这些叶子碎片中。这些结果显示TYDVRep能够从任一稳定整合的质粒拷贝来激活GUS的表达，并能够在体内使TYDV的MPE产生切口、连接和复制。

实施例5

在转基因烟草中由TYDV感染激活的表达

10种转基因烟草品系中的每种均用农杆菌培养物浸润，该培养物是以Boulton等(1995)的方法用pBI-TYDV1.1mer(参考实施例2(f)，图12)转化的。两个月后，从感染的部位及整株植物上取得样品，并用组织化学方法分析其GUS的表达。与模拟接种的对照相比，仅在TYDV感染的植物中发现了GUS的活性(也就是蓝色染色的组织)。一段时间后，GUS的表达通过微管结构从最初的感染部位蔓延到了植物的各个不同部分。如前文所述，Rep指导的GUS表达盒的切口产生、连接及复制也得以建立。这个结果提示TYDV的感染足以导致GUS表达盒从整合的染色体拷贝中复制性地释放。

实施例6

利用基于BBTV的表达载体进行的瞬时细胞死亡的分析

为了证明芽孢杆菌RNA酶能够导致细胞死亡，利用表达载体(pTBN，pTBN6，pTBN1，图1，2和3)进行了分析。负对照是pUBN6和pUBN1(参考上文的实施例1)。这些构建体的每一个都与GUS载体共同轰击了香蕉(Musasppcv.Bluggoe)的胚胎发生细胞悬液，方法基本上按Dugdale等所述(1998)。该GUS载体含有一个强启动子(玉米Ubil，CaMV35S或香蕉Actl)可促进报告基因β-葡糖醛酸糖苷酶的表达(Jefferson，1987)。随后对GUS活性的MUG分析显示用pTBN，pTBN6或pTBN1转化的细胞具有较负对照(pUBN1或pUBN6)低的GUS活性。这提示内含子剪接仍可发生，并且至少在pTBN1的情况下与最初的pTBN载体无明显差别。因此，相对于pTBN而言，内含子中BBTV复制元件的加入没有明显降低剪接效率或随后的芽孢杆菌RNA酶的活性。

有实验显示基于BBTV的“1.1mers”的重新环化和复制是在Rep(BBTVDNA-1的基因产物)存在下发生的。同时也发现其复制被包含BBTV-DNA5基因产物(一种推定的成视网膜细胞瘤结合样蛋白质)的所增强。因此，每种重新环化载体(pRTBN6[图4]，pRTBN1[图5]，pRUBN6，pRUBN1)都与BBTVDNA-1和5“1.1mers”及一个GUS载体进行共轰击。

表2用作对香蕉细胞微粒轰击的质粒组合

图15中显示的结果支持前述表达载体细胞死亡检测(图14)。含有非翻译型的芽孢杆菌RNA酶的构建体(pRUBN6和pRUBN1)再一次比翻译型的构建体具有更高的GUS活性。

有实验证明芽孢杆菌RNA酶的活性仅在Rep蛋白质存在时才可诱导。因此，在+/-Rep(BBTVDNA-1“1.1mer”)的情况下进行了检测以证明该酶的表达仅在Rep存在时才可进行。将“填充片段”(“Stuffer”)DNA用来维持恒定的DNA浓度。

表3对香蕉细胞进行微粒轰击的质粒组合

为了观察重新环化构建体是否能在BBTVDNA-1和5“1.1mers”存在时复制，非翻译型的构建体被包括到香蕉细胞复制的瞬时检测中。在轰击后0，4和8日收获细胞，将总的细胞DNA提取出来并用于Southern杂交分析。

最初，用DIG标记的CaMV35S探针探测杂交膜。在4日或8日没有明显的复制形式。然而在0日，潜在的复制形式在pRUBN6和pURBN1中均以很低的浓度存在。将剥去35S探针后用DIG标记的BBTVDNA-1探针重新探测了杂交膜。在4日或8日收获的细胞中观察到了高水平的复制，而在0日收获的细胞中几乎没有。

实施例7

用基于TYDV的表达载体进行的细胞死亡检测

(a)提供TYDV的抗性的Rep激活型自杀基因载体

质粒pRTBN(DNAplantTechnologies，Oakland，California)包含有芽孢杆菌RNA酶的编码区(339bp)，在该区域整合有马铃薯STLS1内含子(188bp)。用引物BARN.EXP1和BARN.EXP2通过PCR在pRTBN中扩增得来芽孢杆菌RNA酶全基因和内含子。非翻译型的基因对照相似地用引物BARN.UTR和BARN.EXP2扩增得来。

引物：

BARN.EXP15’-GGATCCATGGCACAGGTTATCAACACGTTTGACG-3’[SEQIDNO：40]

BARN.EXP25’-CTAGAGTTATCTGATTTTTGTAAAGGTC-3’[SEQIDNO：41]

BARN.UTR5’-GGATCCGCACAGGTTATCAACACGTTTGACG-3’[SEQIDNO：42]

将PCR产物克隆进pGEM-T载体。将这些克隆分别称为pGEM-BTR和pGEM-BUTR。将TYDVLIR(LIR-X)以一EcoRI酶切片段的形式从pGEM-T中切下并插入到位于pGEM-BTR和pGEM-BUTR中马铃薯LTS内含子上的MfeI位点中。将这些质粒分别称为pBTR-LIR和pBUTR-LIR。将pBTR-LIR和pBUTR-LIR中含有LIR的芽孢杆菌RNA酶基因以BamHI/PstI酶切片段的形式切下并插入到用同样酶消化的pGUS2载体中去替换原来的uidA编码区。质粒pGUS2含有CaMV35Spro(530bp)-uidA基因-CaMV35Ster(200bp)。将这些构建体分别称为p35S-BTR-LIR和p35S-BUTR-LIR(图17)。两个对照质粒通过将芽孢杆菌RNA酶基因从pGEM-BTR和pGEM-BUTR中用BamHI/PstI酶切下再插入到用同样酶消化的pGUS2构建而成。将这些对照质粒分别称为p35S-BTR和p35S-BUTR(图18)。

(b)单子叶和双子叶细胞内用TYDVRep激活的芽孢杆菌RNA酶活性的瞬时估计

为了在体内测定芽孢杆菌RNA酶的活性，自杀型构建体与绿色荧光蛋白质(gfp)的表达盒进行共轰击。当与非翻译型的芽孢杆菌RNA酶对比时观察到绿色荧光转化灶有极大的降低，就可以认为有芽孢杆菌RNA酶的表达及作用(也就是细胞死亡)。

香蕉(Musaspp.Cv.“Ladyfinger”)和烟草(NicotianatabacumNT-1)细胞以如上文实施例3所述的方法用质粒(i)p35S-BTR，(ii)p35S-BUTR，(iii)p35S-BTR-LIR和(iv)p35S-BUTR-LIR(图17和18)进行了轰击。每种质粒都与1μgpWORM共同轰击。构建体pWORM包含有CaMV35Spro(530bp)-gfp(750bp)-CaMV35Ster(200bp)盒并且以前显示在对两种细胞类型的瞬时分析中都提供强的绿色荧光(Dugdale等，1998)。

轰击后3日，用带有GFP-Plus荧光组件(激发光＝490，发射光＝510)的LeicaMZ12立体显微镜显示绿色荧光。与p35S-BUTR和p35S-BUTR-LIR相比，p35S-BTR和p35S-BTR-LIR都大大降低了pWORM中gfp的表达(是通过测定绿色荧光转化灶的数量和亮度来确定)。该结果提示p35S-BTR的STLS1内含子中插入TYDVLIR的既不妨碍内含子的剪接也不抑制芽孢杆菌RNA酶的表达。

(c)TYDVRep激活型的芽孢杆菌RNA酶载体的构建

将CaMV35S启动子，芽孢杆菌RNA酶基因的5’一半，STLS1内含子的5’一半及TYDVLIR用引物35S-IE(SEQIDNO：21)和LIR-R(SEQIDNO：20)通过PCR从p35S-BTR-LIR(图17A)中再次进行扩增。将PCR产物克隆入pGEM-T载体并验证其序列。将该质粒称为pGEMB5’。将TYDVLIR，STLS1内含子的3’一半，芽孢杆菌RNA酶基因的3’一半及nos终止子以XhoI/SacI酶切片段的形式从p35S-BTR-LIR中切下，将TYDVSIR以SacI/NcoI酶切片段的形式从pGEM-SIR中切下，将芽孢杆菌RNA酶基因的5’一半，STLS1内含子的5’一半及TYDVLIR以NcoI/SacII的部分酶切片段的形式从pGEMB5’中切下。插入片段与用XhoI/SacII消化的pBluescriptII(Stratagene)连接。将所得的构建体称为pBTR.test1(图19A)。非翻译型的对照载体以类似方法制备，将所得构建体称为pBUTR.test1(图19B)。

(d)单子叶和双子叶细胞内TYDV中Rep激活的芽孢杆菌RNA酶的瞬时表达

香蕉(Musaspp.Cv.“Ladyfinger”)和烟草(NicotianatabacumNT-1)细胞以上文所述的方法用下表4所列的质粒组合进行轰击。

表4用于香蕉和烟草细胞中瞬时转化检测的质粒组合及其结果中gfp的表达(以+或-估计)

质粒组合

p35S-BTR pWORM

p35S-BUTR pWORM

pBTR.test 1pWORM

pBUTR.test 1pWORM

pBTR.test1 pWORM p35S-Rep

pBUTR.test 1pWORM p35S-Rep

轰击后3 日的绿色 荧光转化 灶

否

是

是

是

否

是

表4的结果提示在TYDVRep以反式方式提供时芽孢杆菌RNA酶的表达(及因此而导致的细胞死亡)仅从pBTR-test1中被激活。Rep激活的非翻译型的芽孢杆菌RNA酶基因盒(pBUTR-test1)的表达没有导致pWORM中gfp表达的明显降低。被用pBUTR-test1，pWORM和p35S-Rep轰击的细胞中MPEs的Rep协助的切口产生、连接及复制得到了如前文所述证实，除所用引物为BARN.UTR(SEQIDNO：40)和BARN.EXP2(SEQIDNO：41)以及DIG标记的芽孢杆菌RNA酶特异性探针用上述的引物合成。

外(e)含有Rep激活型的芽孢杆菌RNA酶基因盒的二元载体的构建

将Rep激活型的芽孢杆菌RNA酶盒以PvuII酶切片段的形式从pBTR-test1和pBUTR-test1中切下并插入到位于二元载体pTAB5(CSIRO，Canberra，澳大利亚)中CaMV35Spro-NPTII-CaMY35Ster盒下游的唯一EcoRI位点中(用DNA聚合酶大Klenow片段作用产生平头末端)。将所得的构建体分别称为pTAB-BTR1和pTAB-BUTR1。两个载体均按照Singh等(1993)的方法用电穿孔引入到根癌农杆菌(LBA4404)中。

(f)Rep激活型的芽孢杆菌RNA酶盒对单子叶和双子叶植物的稳定转化

香蕉(Musaspp.Cv.“Ladyfinger”)和烟草(Nicotianatabacumcv.“Samsun”)的稳定转化以如上文实施例4中所述的方法完成，只是用质粒pBTR-testI和pBUTR-testI分别与pDHKAN共同转化而得到稳定的香蕉转化，而含有质粒pTAB-BTR1和pTAB-BUTR1的农杆菌培养物用对烟草叶盘进行农杆菌媒介的转化。

分别用引物对LIR-F/LIR-R(SEQIDNO：19/SEQIDNO：20)和NPT-F/NPT-R(SEQIDNO：36/SEQIDNO：37)通过PCR证实转化的植物中含有芽孢杆菌RNA酶盒和NPTII基因。将单子叶和双子叶物种的各10个独立的转基因品系选出来以供将来的研究。

(g)转基因烟草中由Rep-激活的对TYDV的超敏感性抗性

在10个转化了pTAB-BTR1和pTAB-BUTR1的独立的烟草植株中Rep激活的芽孢杆菌RNA酶表达最初是通过所述的用p35S-Rep构建体颗粒轰击叶子碎片来检测的。轰击后2日，与非翻译型对照(pTAB-BUTR1)相比，仅在转化了Rep激活型的可翻译芽孢杆菌RNA酶基因盒(pTAB-BTR1)的烟草植株叶片上有明显的被轰击区域坏死。该结果提示以反式方式引入TYDV足以使芽孢杆菌RNA酶表达盒从整合的染色体拷贝中复制性释放出来。在转化了pTAB-BUTR1的烟草植株叶片中Rep协助的切口产生、连接及复制得到证实，方法如NT-1细胞中的瞬时检测所述。

为了证明转基因烟草对TYDV超敏感的抗性，用这些植物喂养带病毒的烟草叶蝉(Orosiusargentatus)2天。在随后一个星期后，检查植物中特征性的TYDV症状，该症状最初由Hill(1937)描述。用Rep激活型的非翻译芽孢杆菌RNA酶表达盒(pTAB-BUTR1)转化的植物产生了典型的TYDV症状，包括矮化，黄化，幼叶边缘和端部卷曲，以及节间距缩短。相反，用Rep激活型的翻译型芽孢杆菌RNA酶表达盒(pTAB-BTR1)转化的烟草植株在蚜虫咬食的位点显示非典型的坏死的病斑(极可能是芽孢杆菌RNA酶诱导的细胞死亡的结果)。与没有被感染的烟草植株相比较，这些植株在以后的3个月发育正常，并没有发展出TYDV感染的典型症状。

感染后2个星期，用Stewart和Via(1993)的方法从20个转基因烟草植株及未感染对照的每一株的叶子中分离得到了总gDNA。总gDNA(1μg)用作PCR的模板，引物是依TYDV外壳蛋白质基因设计的(CP-E和CP-R)。765bp长的外壳蛋白质基因及病毒的基因组仅在用pTAB-BUTR1转化的烟草中检测到了。该结果提示用pTAB-BTR1转化的烟草对TYDV感染有抗性并在长时期内不表现TYDV诱导的症状。

引物：

CP-F5’-ATGGCGGGCCGGTATAAGGGTTTGG-3’[SEQIDNO：43]

CP-R5’-TTATTGATTGCCAACTGATTTGAAAT-3’[SEQIDNO：44]

实施例8

基于BBTV的gfp载体的构建

用编码绿色荧光蛋白质(GFP)的报告基因和BBTV的基因间隔区构建类似的一系列基于Rep激活型芽孢杆菌RNA酶表达盒的载体。表达载体及重新环化载体是以与pRTBN系列的载体类似的方式通过交迭PCR构建并克隆入pUC19载体的。在这些载体的构建中所用的引物如表5所示。某些情况下用pBN，pTBN6和pTBN1作为PCR的模板。

表5寡核苷酸序列

引物	名称	序列(5′-3′)
			+1	35SH	AAGCTTCATGGAGTCAAAGA (SEQ ID NO：45)
+2	5′mGFPBam	GGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAACTT (SEQ ID NO：46)
			+3	GFPB1	AAGTCAAGTTTGAGGTAAGTTTCTGCTTC (SEQ ID NO：47)
-3	B2GFP	GAAGCAGAAACTTACCTCAAACTTGACTT (SEQ ID NO：448)
			+4	B1GFP	TTGTTGATGTGCAGGGAGACACCCTCGTC (SEQ ID NO：49)
-4	GFPB2	GACGAGGGTGTCTCCCTGCACATCAACAA (SEQ ID NO：50)
			-5	3′mGFPSac	GAGCTCTTATTTGTATAGTTCATCCAT (SEQ ID NO：51)
-6	NOS4-H	AAGCTTTTCGCCATTCAGGCTGC (SEQ ID NO：52)
			+7	B3-6	TATCATTAATTAGTAAGTTGTGCTGTAA(SEQ ID NO：53)
-8	B4-6	AATATTATATTACTCGCTTCTGCCTTCC (SEQ ID NO：54)
			+9	B5-I	ATCATTAATTAGTCACACTATGACAAAAG (SEQ ID NO：55)
-10	B6-I	AATATTATATTACTGATGCAAATGTCCCCG (SEQ ID NO：56)

最初，分别如图20，21和22所示构建质粒pGI(SEQIDNO：69)，pGI6(SEQIDNO：70)和pGI1(SEQIDNO：71)。最后，分别如图23，24和25所示构建质粒pRGI6，pRGI1和pRGI1/6。在图20到25中，内含子指马铃薯ST-LS1内含子，基因间隔区来自BBTVDNA-1或DNA-6，而CT和NT指GFP报告基因的C-末端和N-末端部分。

通过对香蕉细胞悬液进行微粒轰击的瞬时检测评估这多种构建体的效能。第一个瞬时检测测量GFP的表达以确定多种单体是否复制性释放和重新环化，以及GFP基因是否被正确地转录、加工和表达。将BBTVDNA-11.1mer以等摩尔的量与pGI1或pGI6混合并轰入香蕉胚胎发生细胞悬液。轰击后8日，用GFP-特异性探针对复制性释放和重新环化进行了Southern杂交检测。GFP的表达用一台GFP显微镜来监控并用Western印迹分析和GFP特异性的抗血清来定量。

Southern杂交显示仅当BBTVDNA-11.1mer以反式方式加入时，pGI1或pGI6中才有单体环状分子存在。类似的，GFP的表达仅在病毒的1.1mer存在时才可检测到。

实施例9

为获得芽孢杆菌RNA酶诱导的对BBTV的抗性对香蕉进行稳定转化

用pRTBN6和含有选择性标记基因的质粒以微粒轰击方法共同转化Bluggoe和Cavendish的香蕉胚胎发生细胞悬液(Becker等，2000)。再生的小植株通过PCR分析以确定Rep激活型芽孢杆菌RNA酶盒的完整拷贝是否整合于香蕉基因组。扩增阳性转化体，并且最初用20只带有BBTV病毒的蚜虫来试验每个转化的5个植株。用Sothern杂交分析来比较转化的植株和没转化的植株间病毒DNA积累水平。将预期的转基因品系进一步扩增，再次试验并分析。

与对照相比，在几乎所有的情况中转基因的香蕉植株没有明显的香蕉束顶病(bananabunchytopdisease)。相反，在蚜虫咬食的部位观察到了非典型性的坏死，极可能反映了芽孢杆菌RNA酶诱导的细胞死亡。用PCR和Southern杂交不能在所测试的植株的任一部分检测到BBTV的外壳蛋白质基因，这提示这些品系对BBTV的感染、复制和传播有抗性。

实施例10

基于BBTV的组织特异且可诱导的Rep激活表达

为了控制Rep表达位点并从而控制转基因在植物中的激活或复制，使用了组织特异性的启动子。

(a)组成型表达

载体pTAB16含有CaMV35Spro-bar选择性基因--ocster和CaMV35Spro-uidA-CaMV35Ster盒，该盒是位于pBIN16中T-DNA左右边缘之间。通过EcoRI/BamHI消化将CaMV35S-TYDVRep基因盒从p35S-Rep中切下并插入到用相同酶消化的pTAB16载体中以替换原来的CaMV35S-uidA盒。将该构建体称为pTAB-TYDV-Rep。

(b)种子特异性表达

已经显示1kb长的水稻谷蛋白(riceglutelin)启动子(GenbankAccessionX52153)在烟草中指导种子特异性的报告基因的表达(Leisy等，1989)。将水稻谷蛋白启动子用Nco□消化从质粒pGT3-JEFLK(Miller等，2001)中切下并连接到用相同酶消化的pTAB-TYDV-Rep载体中以替换原来的CaMV35S启动子。将该构建体称为pGL-TYDV-Rep。

(c)根特异性表达

已经显示880bp长的拟南芥(Arabidopsisthaliana)根特异性激酶同系物(ARSK1)启动子(GenbankAccessionL22302)在拟南芥根的表皮、内表皮及皮层区域指导组织特异性的uidA报告基因的表达(Hwang和Goodman，1995)。用引物ARSK-F和ARSK-R通过PCR从拟南芥gDNA中扩增ARSK1启动子。将结果得到的PCR产物克隆入pGEM-T并验证其序列。用NcoI消化从pGEM-T中切下ARSK1启动子并连接到用相同酶消化的pTAB-TYDV-Rep中以替换原来的CaMV35S启动子。将该构建体称为pAR-TYDV-Rep。

引物：

ARSK-F5’-CCATGGATCTCATTCTCCTTCAACAAGGCG-3’[SEQIDNO：57]

ARSK-R5’CCATGGTTTCAACTTCTTCTTTTGTGTTATTTG-3’[SEQIDNO：58]

(d)创伤诱导型表达

已经显示2032bp长的芦笋(Asparagusofficinalis)PR基因(AoPR1)启动子(GenbankAccessionA26573)可在受伤的或活跃地分裂的细胞类型如愈伤组织中指导报告基因的强表达(Firek等，1993)。利用引物AoPR-F和AoPR-R通过PCR从芦笋gDNA中扩增AoPR1启动子。将结果所得的PCR产物克隆入pGEM-T并验证了其序列。用NcoI消化从pGEM-T中切下AoPR1启动子并连接到用相同酶消化的pTAB-TYDV-Rep中替换原来的CaMV35S启动子。将该构建体称为pAo-TYDV-Rep。

引物：

AoPR-F5’-GAATTCAGGGGTAAGTTTGCAAATATC-3’[SEQIDNO：59]

AoPR-R5’-CGAGGTTGTGCCAGTCGAGCATTGCC-3’[SEQIDNO：60]

(e)酒精诱导型表达

源自构巢曲霉(Aspergillusnidulans)的ALC开关是基于AlcA启动子和AlcR受体的酒精诱导型启动子系统。已经用uidA报告基因模型显示ALC开关在植物体系中起作用(Caddick等，1998)。质粒pSRNAGS(BTI，CornellUniversity，Ithaca，NewYork)在pBIN16中包含CaMV35Spro-AlcR基因-noster和AlcApro-uidA报告基因-CaMV35Ster盒。用引物35S-IE(SEQIDNO：21)和Alc-R(SEQIDNO：61)通过PCR从pSRNAGS中扩增了CaMV35Spro-AlcR基因-noster-AlcApro盒。将PCR产物克隆入pGEM-T并验证了其序列。用Nco□消化从pGEM-T中切下插入片段并连接到用相同酶消化的pTAB-TYDV-Rep中以替换原来的CaMV35S启动子。将该构建体称为pAlc-TYDV-Rep。

引物：

Alc-R5’-CCATGGTTTGAGGCGAGGTGATAGGATTGG-3’[SEQIDNO：61]

利用Singh等(1993)的方法，将含有TYDVRep的二元质粒中的每一个都通过电穿孔引入到根癌农杆菌(LBA4404)中。

(f)组织特异且可诱导型的Rep表达指导报告基因在准确的组织类型中活化

利用Horsch等(1988)的方法，用内含质粒pTAB-TYDV-Rep，pGL-TYDV-Rep，pAR-TYDV-Rep，pAo-TYDV-Rep及pAlc-TYDV-Rep的农杆菌对转化了质粒pTEST4的烟草植株的叶子进行超量的感染。对经比，利用除草剂phosphoinothricinammonium(PPT)来筛选转化了的烟草植株。用引物TYDV.RepF和TYDV.RepR通过PCR来证实转基因植物含有TYDVRep基因。选出每种质粒的10个独立的转化体中以供将来的研究。使植物生长到成熟，使其开花并收集种子。收集独立转化体中不同的植物器官，包括叶，茎，根，花及种子，并用组织化学分析探测GUS的活性。

用质粒pTAB-TYDV-Rep超量转化的烟草植株在所有检验的植株部位中均显示强的GUS表达。这些植株中GUS表达的水平远远高于用非复制型的对照即pTAB16转化的植株。相反的，用质粒pGL-TYDV-Rep超量转化的植株只在种子中显示强的GUS表达，用质粒pAR-TYDV-Rep超量转化的植株只在根中显示强的GUS表达，用质粒pAo-TYDV-Rep超量转化的植株在受伤及分生组织的细胞中显示强的GUS表达，用质粒pAlc-TYDV-Rep超量转化的植株只在用体积比为1％的乙醇溶液浸泡时才显示强的组成型GUS表达。

Rep协助的GUS表达盒的切口产生，连接及复制在被质粒pTAB-TYDV-Rep超量转化的烟草植株的所有组织类型中得到了证实(如前文所述)。相反的，这种活性只在用质粒pGL-TYDV-Rep超量感染的植株的种子中，用质粒pAR-TYDV-Rep超量感染的植株的根中，用质粒pAo-TYDV-Rep超量感染的植株的受伤部位检测到了，以及在乙醇诱导的用质粒pAlc-TYDV-Rep超量感染的植株中检测到了组成型的活性。该结果提示TYDVRep基因的组织特异型或可诱导的表达只那些组织提供Rep激活型GUS盒的高水平表达。

实施例11

基于TYDV的TMVp50和hrmA基因媒介的抗性

(a)TYDVRep激活的TMVp50解旋酶片段的表达诱导烟草中获得性系统抗性(systemicacquiredresistance)(SAR)

以前的研究(Erickson等，1999)已经证明50kDa的烟草花叶病毒(TMV)的解旋酶片段(p50)非病毒的表达足以在适当的烟草变种中诱导N-媒介的过敏反应(HR)(例如，烟草cv.“PetiteHavana”SR1对N基因是纯合的)。该防御反应表征为病毒感染部位的细胞死亡及诱导获得性系统抗性(SAR)途径，其结果是阻止病毒的复制和运动。

利用引物p50-F和p50-R通过PCR从克隆的TMV基因组DNA(PlantGeneExpressionCentre，UniversityofCalifornia，美国)中扩增p50基因的片段。将PCR产物克隆入pGEM-T并验证了其序列。将来自pTEST3(图10)的含有TYDVLIR的过氧化氢酶内含子插入到p50编码区阅的唯一EcoRI位点中。将该质粒称为pGEM50-LIR。用如上文实施例2中对pTEST3所述的方法，随后构建基于pUC的Rep激活型p50基因质粒。用如对pTEST4所述的方法将该盒插入到pART27中。将所得的p50Rep激活型的二元质粒称为pSAR1。如前文所述，将载体pSAR1用来转化农杆菌。

引物：

p50-F5’-CCATGGAGATAGAGTCTTTAGAGCAGTTTC-3’[SEQIDNO：62]

p50-R5’-GGATCCTATTGTGTTCCTGCATCGACCTTA-3’[SEQIDNO：63]

(b)烟草中对TYDV的获得性系统抗性

利用农杆菌媒介的转化获得10个以质粒pSAR1的T-DNA转化的烟草植株，并如上所述通过PCR证实其含有Rep激活型盒及NPTII基因。如前所述，将植株用TYDV感染并观察其症状。感染后2日，转化了Rep激活型p50基因的烟草植株在蚜虫咬食的位点显示非典型的超敏感的坏死。这些植株在随后的3个月里发育正常，与受感染的非转基因烟草植株对比，后者显示典型的TYDV诱导的症状。

如前所述，在接种的非转基因烟草中检测到了TYDV的基因组DNA，而在转基因或未感染的对照品系中没有检测到。该结果提示TYDV诱导的TMVp50基因的表达足以刺激适当的烟草栽培品种中N基因过敏反应并提供对TYDV感染的抗性。

(c)创伤诱导型TYDVRep的表达激活TMVp50基因的表达并引发对多种病原体的SAR

如前文所述，用含有质粒pAo-TYDV-Rep的农杆菌超量感染pSAR1转化的烟草植株的叶子(实施例10)。将10个已证实含有创伤诱导型Rep基因的转化品系选出来以供将来的研究。将转基因植株和适当的对照用多种病毒病原体来感染，举例来说，(i)蚜虫传递的烟草脉斑驳病毒(tobaccoveinmottlingvirus)，(ii)经由厚皮异毛刺线虫(Paratrichodoruspachydermus)载体的烟草脆裂病毒(tobaccorattlevirus)和(iii)用生物弹射击(biolistic)引入的感染性的BeYDV1.1mer。一段时间后，观察植株中病毒诱导的特征性的症状。与对照相比，所有转基因植株均在病毒接种部位显示非典型性的超敏感的坏死。

(d)创伤诱导型TYDVRep表达激活烟草中hrmA媒介的对广泛病原体的抗性

已经显示来自丁香假单孢菌丁香亚种(Pseudomonassyringaepv.syringae)的hrmA的基因产物可激活许多烟草栽培品种中病原体相关的基因，并从而赋予烟草对多种病原体包括病毒、真菌及细菌的抗性(Shen等，2000)。

用引物hrm-F和hrm-R通过PCR从含有其编码序列的质粒中括增hrmA基因。随后，用如上文实施例2中对pTEST3所述的方法，构建基于pUC的Rep激活型hrmA质粒。用如对pTEST4所述的方法，将该盒插入到pART27。将结果得到的hrmA激活型二元质粒称为pSAR2。以所述的方法用质粒pSAR2来转化农杆菌。

引物：

hrm-F5’-CCATGGGCATGCACGCTTCTCCAGCGTAGAAGCG-3’[SEQIDNO：64]

hrm-R5’-GGATCCTCAGTTTCGCGCCCTGAGCGCCGG-3’[SEQIDNO：65]

通过农杆菌媒介的转化得到10个以质粒pSAR2的T-DNA转化的烟草植株并用如前文所述的方法通过PCR证实其含有Rep激活型盒及NPTI基因。以如前文所述的方法用含有质粒pAo-TYDV-Rep的农杆菌超量感染pSAR2转化的烟草植株的叶片。将10个已证实含有创伤诱导型Rep基因的超量转化的品系选出以供将来的研究。将转基因的植株和适当的对照用多种病原体来感染，例如烟草脉斑驳病毒(tobaccoveinmottlingvirus)，烟草蚀刻病毒(tobaccoetchvirus)，blankshank真菌寄生疫霉(Phytophthoraparasitica)和野生型fire细菌丁香假单孢菌tabaci亚种(Pseudomonassyringaepv.tabaci)。一段时间后，观察植株中病毒诱导的特征性的症状。与对照相比，所有转基因植株均在病毒接种部位显示非典型性的超敏感的坏死。

实施例12

基于TYDV的人血清白蛋白的过量表达

(a)Rep激活的有商业重要性的蛋白质，人血清白蛋白的过量表达

白蛋白是可溶性单体蛋白质，大约构成血清蛋白质的一半。白蛋白的主要功能在于充当类固醇，脂肪酸及甲状腺激素的载体蛋白质，并且对保持细胞外液体积的稳定起作用。

用引物Alb-F和Alb-R通过PCR从含有该基因的质粒中括增1831bp长的人血清白蛋白(HSA)的编码区域(Lawn等，1981)。随后，用如上文实施例2中对pTEST3所述的方法，构建了基于pUC的Rep激活型HSA质粒。用对pTEST4所述的方法，将该盒插入到pART27。将结果得到的HSA激活型的二元质粒称为pHSA1。以所述的方法用质粒pHSA1来转化农杆菌。

通过农杆菌媒介的转化得到了10个以自质粒pHSA1的T-DNA转化的烟草植株(Nicotianatabacum)并用如前文所述的方法通过PCR证实其含有Rep激活型盒及NPTII基因。以如前文所述的方法用含有质粒pTAB-TYDV-Rep，pGL-TYDV-Rep，pAo-TYDV-Rep，pAlc-TYDV-Rep的农杆菌超量感染pHSA1转化的烟草植株的叶片。每个转化的10个超量转化品系已证实含有Rep基因并被选出以供将来的研究。使植株生长到成熟，用ELISA和由HSA基因产物制取的抗体对其HSA的量进行了估定。检测到了高水平的HSA蛋白质，但是是在植株的不同部位或是在特定的情况下，即：组成型的(pTAB-TYDV-Rep)，只在种子中的(pGL-TYDV-Rep)，创伤组织的(pAo-TYDV-Rep)及在用酒精处理的植株中组成型的(pAlc-TYDV-Rep)。在图26中描述从质粒pHSA1表达Rep激活的人血清白蛋白基因的推荐模型。

引物：

Alb-F5’-CCATGGAGATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCC-3’[SEQIDNO：72]

Alb-R5’-GGATCCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACT-3’[SEQIDNO：73]

本领域的技术人员将意识到此处描述的发明除了那些特定描述的之外还可以有变化和修改。应当理解为本发明包括所有这些变化和修改。本发明也包括在本说明书中个别地或共同地指出或提及的的所有步骤，特征，组成物及化合物，以及任何两个或更多的所述步骤或特征的任何及所有组合。

参考书目

Altsehul等(1997)核酸研究(Nucl.AcidsRes.)25：3389

AnG(1985)培养的烟草细胞的高效转化。植物生理学(PlantPhysiology)79：568-570

Ausubel等，“分子生物学最新实验流程”JohnWiley&SonsInc.，1994-1998，第15章

BeckerDK，DugdaleB，SmithMK，HardingRM，DaleJL(2000)经由微粒轰击对Cavendish香蕉(Musaspp.AAAgroup)cv“GrandNain”的遗传转化。植物细胞报道(PlantCellReports)19(3)：229-234

Bonner和Laskey(1974)欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)46：83

BoultonMI(1995)Geminiviridae群向植物组织经农杆菌媒介的传递。分子生物学方法(MethodsinMolecularBiology)49：77-93

CaddickMX，GreenlandAJ，JepsonI，KrauseKP，QuN，RiddellKV，SalterMG，SchuchW，SonnewaldU，TomsettAB(1998)植物中乙醇可诱导的用于操纵碳代谢基因开关。自然生物技术(NatureBiotechnology)16(2)：177-80

ChangS，PuryearJ，CairneyJ(1993)从松树中分离RNA的一种简单而操作性地方法。植物分子生物学通讯员(PlantMolecularBiologyReporter)11(2)：113-116

DugdaleB，BeethamPR，BeckerDK，HardingRM，DaleJL(1998)转基因烟草和香蕉细胞中与香蕉束顶病毒DNA-1到-6联合的启动子活性。普通病毒学杂志(JournalofGeneralVirology)79(10)：2301-11

EricksonFL，HolzbergS，Calderon-UrreaA，HandleyV，AxtellM，CorrC，BakerB(1999)TMV复制酶的解旋酶结构域诱导烟草中N-媒介的防御反应。植物杂志(PlantJournal)18(1)：67-75

FirekS，OzcanS，WarnerSA，DraperJ(1993)可促使npt-□限于受伤部位取分化细胞中表达的伤口诱导的启动子足以用于对转基因结果的选择。植物分子生物学(PlantMolecularBiology)22(1)：129-42

GleaveAP(1992)一具有T-DNA组织结构的通用二元载体系统有益于克隆的DNA在植物基因组中的有效整合。植物分子生物学(PlantMolecularBiology)20(6)：1203-1207

HillAV(1937)澳大利亚的烟草黄矮病：□.通过烟草叶蝉(Evans)向一些替代宿主植物的传播。澳大利亚科学及工业研究杂志(JournalofScientificandIndustrialResearchAustralia)10：228-230

HorschRB，FryJ，HoffmannN，NeidermeyerJ，RogersSG，FraleyRT(1988)叶盘转化。植物分子生物学手册(PlantMolecularBiologyManual)pp.A5/1-A5/9.S.B.Gelvin和R.A.Schilperoort编辑。Dordrecht：Kluwer.

HwangI，GoodmanHM(1995)拟南芥(Arobidopsisthaliana)一根特异性的激酶同系物是由脱水，ABA及NaCl诱导的。植物杂志(PlantJournal)8(1)：37-43

JeffersonRA(1987)嵌合的植物基因的分析：GUS融合系统。植物分子生物学通讯员(PlantMolecularBiologyReporter)5：381-405

LawnRM，AdelmanJ，BockSC，FrankeAE，HouckCM，NajarianRC，SeeburgPH，WionKL(1981)人血清白蛋白cDNA序列及其在E.coli的表达。核酸研究(NucleicAcidsResearch)9(22)：6103-114

LeisyDJ，HniloJ，ZhaoY，OkitaTW(1990)转基因烟草中水稻谷蛋白启动子的表达。植物分子生物学(PlantMolecularBiology)14(1)：41-50

Marmur和Doty(1962)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)5：109

MillerJ(2000)植物中潜在疫苗的表达。博士论文，QueenslandUniversityofTechnology，Brisbane，澳大利亚。

PietrzakM，ShillitoRD，HohnT，PotrykusI(1986)用一个新植物表达载体进行原生质体转化后植物中两个细菌的抗生素抗性基因的表达。核酸研究(NucleicAcidsResearch)14(14)：5857-5868

ShenS，LiQ，HeSY，BarkerKR，LiD，HuntAG(2000)转基因烟草植株中丁香假单孢菌丁香亚种(Pseudomonassyringaepv.syringae)61hrm基因的表达而导致的从相容的植物-病原体相互作用向不相容的相互作用的转化。植物杂志(PlantJournal)23(2)：205-13

SinghA，KaoT，LinJJ(1993)用T-DNA载体通过高压电穿孔对根癌农杆菌的转化。焦点(Focus)15：84-87

Southern(1975)凝胶电泳分离的DNA片段中特定序列的探测。分子生物学杂志(JournalofMolecularBiology)98：503-517

StewartCN，ViaLE(1993)一种可应用于RAPD指纹和PCR的快速的CTABDNA分离技术。生物技术(Biotechniques)14：748-750

Claims (28)

1.含有遗传元件的构建体，该遗传元件侧翼操作性地连接有编码Rep蛋白的核苷酸序列，当其整合入植物细胞基因组时，该Rep蛋白促进该遗传元件和全部或部分的侧翼核苷酸序列的剪切和环化，其中上述编码Rep蛋白的核苷酸序列邻接于或插入于一个或多个包括内含子序列或部分内含子序列或其它剪接信号的外源序列中，其中以非环状形式存在的遗传元件和其它核苷酸序列含有两个模块核苷酸序列，所述模块是为了强调单个遗传序列被分成了两个组件，即模块组件；当环化时，在去除任何外源序列包括内含子和剪接序列或者其它识别序列之后，这两个模块组件定向到一起而构建成单个遗传序列，这一遗传序列展现出特定的活性或特性，而这些活性或特性在遗传序列以分离的模块形式存在时是没有的。

2.权利要求1的构建体，其中外源序列含有编码序列，启动子，以及一个或多个剪切信号。

3.权利要求2的构建体，其中当构建体以线性形式存在时，编码序列含有两个被内含子序列隔开的模块序列。

4.权利要求2或3的构建体，其中在遗传元件环化之后，完整的编码序列就操作性地连接于上述启动子上。

5.权利要求4的构建体，其中编码序列编码mRNA或肽、多肽或蛋白质，而这些肽、多肽或蛋白质能够给上述细胞或含有上述细胞的生物体或植物提供表型或基因型特性。

6.权利要求5的构建体，其中肽、多肽或蛋白质能导致或促进细胞死亡。

7.权利要求1到6中任何一项的构建体，其中构建体被导入植物细胞。

8.含有遗传元件的构建体，该遗传元件侧翼连接有Rep蛋白识别序列；在Rep蛋白存在的情况下，上述的Rep蛋白识别序列能促进含有上述遗传元件的环状核苷酸序列的产生，其中上述Rep蛋白识别序列邻接于或插入于一个或多个剪接信号中，上述遗传元件含有操作性地连接调控序列的多核苷酸序列，该调控序列是当上述遗传元件包含于环状分子时，表达上述多核苷酸序列所必需的；其中以5’端到3’端顺序，遗传元件的线性形式包含：多核苷酸序列，和当处于环状形式时允许上述多核苷酸表达的调控序列，从而使得在环化后，遗传元件含有被全部或部分Rep蛋白识别序列从多核苷酸序列中分隔开的调控序列，其中在表达后，上述多核苷酸序列编码表达产物。

9.权利要求8的构建体，其中当构建体以线性形式存在时，多核苷酸序列含有编码序列的5’部分和3’部分，这两部分被剪接信号隔开，从而使得在环状形式时能形成完整的编码序列。

10.权利要求8或9的构建体，其中多核苷酸序列进一步含有操作性地连接在编码序列3’末端的终止子序列。

11.权利要求8到10中任何一项的构建体，其中调控序列是操作性地连接在编码序列5’末端的启动子。

12.权利要求11的构建体，其中当遗传元件以环状形式存在时，编码序列编码mRNA或肽、多肽或蛋白质，而这些肽、多肽或蛋白质能够给上述细胞或含有上述细胞的有机体或植物提供表型或基因型特性。

13.权利要求12的构建体，其中肽、多肽或蛋白质能导致或促进细胞死亡。

14.权利要求8到13中任何一项的构建体，其中构建体被导入植物细胞。

15.从5’端到3’端依次含有第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列、第四核苷酸序列、第五核苷酸序列和第六核苷酸序列的构建体，其中：

第一核苷酸序列和第六核苷酸序列可以相同也可以不同，每个都含有Rep蛋白识别序列，这些Rep蛋白识别序列能被一个或多个Rep蛋白识别，从而当所述构建体整合入较大的核苷酸序列如基因组序列时，位于上述第一和第六序列包围中包括全部或部分所述第一和第六序列的遗传物质能够被剪切和环化，其中所述Rep蛋白识别序列邻接于或插入于一个或多个包括内含子序列或部分内含子序列或者其它的剪接信号的外源序列中；

第二核苷酸序列含多核苷酸序列的3’部分；

第三核苷酸序列是操作性地连接于上述第二序列的转录终止子；

第四核苷酸序列是操作性连接于第五核苷酸序列的启动子序列；且

第五核苷酸序列是多核苷酸序列的5’部分，其中上述多核苷酸序列的5’和3’部分代表了所述多核苷酸序列的全部编码序列；

其中，当构建体整合入一个较大的核苷酸序列如基因组序列时，在一个或多个Rep蛋白存在的情况下，环化的遗传序列就会从上述较大的核苷酸序列中分离形成，它依次含有上述操作性地连接于多核苷酸序列的启动子序列，这个多核苷酸序列含有全部或部分外源序列或其它剪接信号，它们含有全部或部分上述第一核苷酸序列和/或第六核苷酸序列，以及转录终止序列。

16.权利要求15中的构建体，其中多核苷酸序列的全部编码序列编码mRNA或肽、多肽或蛋白质，而这些肽、多肽或蛋白质能够给植物细胞提供表型或基因型特性。

17.权利要求16的构建体，其中肽、多肽或蛋白质能导致或促进细胞死亡。

18.权利要求15-17中任何一项的构建体，其中构建体被导入植物细胞。

19.生产抗ssDNA病毒的转基因植物或其后代的方法，上述方法包括将构建体导入上述植物的基因组，这个构建体从5’到3’依次含有：Rep蛋白识别序列，它邻近于或插入于内含子序列或其它剪接信号中；多核苷酸序列的3’部分；转录终止子；操作性地连接于多核苷酸序列的5’末端部分的启动子序列，其中多核苷酸的5’和3’部分代表了能诱导细胞死亡或休眠的肽、多肽或蛋白质的编码区域；以及相同或不同的Rep蛋白识别序列；其中当含有Rep蛋白的ssDNA病毒感染上述植物细胞时，Rep蛋白能够识别构建体两侧的Rep蛋白识别序列，构建体就会被切出并且环化，从而使多核苷酸序列重构为能够表达成肽、多肽或者蛋白质的形式，而这些肽链、多肽或蛋白质能够杀死植物细胞或者使植物细胞休眠。

20.权利要求19的方法，其中ssDNA是Geminiviridae属或Nanovirus属的成员。

21.权利要求20的方法，其中Geminiviridae是菜豆金色花叶病毒或玉米线条病毒.

22.权利要求19或20或21的方法，其中构建体含有SEQIDNo.31到SEQIDNo.36所示的核苷酸序列或者它们的互补形式。

23.用来产生共价闭合环状DNA构建体的线性遗传元件，上述遗传元件从5’到3’方向依次含有：操作性地连接于转录终止子的多核苷酸序列的3’部分；操作性地连接于多核苷酸序列的5’部分的启动子，其中，在环化时，多核苷酸序列的5’部分就操作性地连接于多核苷酸序列的上述3’部分，而这两个部分被全部或部分外源序列或内含子序列或其它剪接信号所隔开。

24.权利要求23的遗传元件，其进一步包含编码Rep的核苷酸序列。

25.权利要求23或24的遗传元件，其中当位于共价闭合的环状构建体中时，多核苷酸序列编码mRNA或者肽、多肽或蛋白质。

26.权利要求25的遗传元件，其中肽、多肽或蛋白质导致或促进细胞死亡。

27.权利要求23的遗传元件，其导入到植物细胞中。

28.含有遗传元件的构建体，该遗传元件被Rep蛋白识别序列包围，而在Rep蛋白存在的情况下，Rep蛋白识别序列能促进含所述遗传元件的环状核苷酸序列的形成，其中所述Rep蛋白识别序列邻接于或插入于一个或多个包括内含子序列或部分内含子序列或其它剪接信号的外源序列，所述遗传元件含有启动子的3’和5’部分，这两部分被核苷酸序列分隔从而基本上阻止所述启动子行使功能，所述遗传元件的线性形式从5’端到3’端顺序含有：上述启动子的3’部分；操作性地连接于上述启动子的3’部分的任选的多核苷酸序列；上述启动子的5’部分；从而使得一旦环化，遗传元件就含有启动子序列的5’和3’部分，这两部分被全部或部分Rep蛋白识别序列和/或内含子序列或其它剪接信号分隔，但它们并不使启动子的活性丧失，所述环状分子任选地进一步包含操作性地连接于多核苷酸序列上的启动子。

Images