CN1400304A - 以两歧双歧杆菌为主微生态制剂的液－固结合发酵工艺 - Google Patents

以两歧双歧杆菌为主微生态制剂的液－固结合发酵工艺 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物领域，涉及以两歧双歧杆菌为主微生态制剂的液－固结合发酵工艺，主要包括两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌分别依次经原种、1－3级液体培养，和固体培养二阶段。制剂中三种菌粉重量比依次为50－80∶10－15∶5－16。固体培养先灭菌，后接种20－30％的三级培养物、置于塑料袋内，再抽真空向该无毒无菌塑料袋中回灌无氧无菌N2，解决了固体培养不易成为厌氧环境的关键；如上所述接种量大，比单液或单固培养增加9－10倍；培养中在培养基尤其在固体培养基中加双歧因子，促进活菌增殖至108－109级，且延长保存期，经两年活菌数由38.6亿CFU/g降至5.0亿CFU/g；经毒理试验证明无毒，经人群试验，所有受试者均无不良反应，具有调节肠道菌群，增殖双歧杆菌、乳杆菌作用。

Description

以两歧双歧杆菌为主微生态制剂的液一固结合发酵工艺
                                技术领域
本发明属于微生物领域，涉及以两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)为主微生态制剂的液—固结合发酵工艺。尤其涉及两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumb bifidum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)和嗜热链球菌(Streptococus Salivarius subspthermophilus)微生态制剂的液—固结合发酵工艺
                                背景技术
目前，关于两歧双歧杆菌，嗜酸乳杆菌等液体培养，均有文献报道。然而，这种单纯液体(单液)培养，最终制剂中细胞数少，最多达10亿CFU/g，液体培养后用淀粉、葡萄糖作为吸附载体，对活菌保存不利，液体培养物直接冻干，培养物在失水时残有物合成渗透压增大，使活细胞减少；动力消耗大，成本高。此外，固体(单固)培养存在产品活菌少，因没有加双歧因子，不能在培养活菌时起到促进双歧杆菌增殖作用。
                                    发明内容
本发明的目的在于提供以两歧双歧杆菌为主微生态制剂的液—固结合发酵工艺，即用两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌微生态制剂的液—固相结合的发酵工艺，以达到提高活化细胞数，延长保存期之目的。
本发明采用下列技术方案完成的：
以两歧双杆菌为主微生态制剂的液——固结合发酵工艺，其特征在于该工艺主要包括下列过程：
(1)两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)种培养：
①原种液体培养：
取大豆蛋白胨3.0-7.0g，胰胨3.0-7.0g，酵母浸膏8.0-12.0g，葡萄糖8.0-12.0g，微量盐溶液30-50ml为添加剂，其中CaCl2 0.1-0.4g，MgSO4·7H2O 0.3-0.8g，K2HPO4 0.5-2.0g，KH2PO40.5-2.0g，NaHCO3 5.0-20.0g，NaCl 1.0-3.0g，蒸馏水1000ml，调PH6.5-7.5，以此作为培养基；0.1Mpa下灭菌30min，厌氧下速冷至45℃后，立即接种体积百分为5％的原种溶液，在上述培养基上倒一层0.5-1.0cm厚度的无菌食用植物油，在厌氧下37℃培养24-48h后，终止培养，于厌氧0-4℃保存备用；
②一级菌种培养：
取蛋白胨6.0-10.0g，酵母浸膏3.0-7.0g，葡萄糖8.0-12.0g，低聚异麦芽糖8.0-12.0g，微量盐溶液30-50ml，其中CaCl 0.1-0.4g，MgSO4·7H2O 0.3-0.8g，K2HPO4 0.5-2.0g，KH2PO40.5-2.0g，NaHCO3 5.0-20.0g，NaCl2 1.0-3.0g，蒸馏水1000ml，PH6.8-7.0，以此作为一级菌种培养基，0.1MPa下灭菌40min，灌满无色透明的细口瓶，立即在上述培养基上倒一层0.5cm厚度的无菌食用植物油，冷至42℃，立即接种5％原种培养物，以磨口瓶盖封口，并于37-38℃恒温下培养24-96h，每隔3h摇动1min，细胞数达2亿CFU/ml时，终止培养，厌氧下保存备用；
③二级菌种培养：
培养基及操作同一级菌种，只是用无色透明试剂瓶，接种一级菌种10％后，每隔4h摇动1min，培养24-96h，待细胞数达2.0亿CFU/ml，终止培养；
④三级菌种培养：
培养基及各项操作同二级菌种，接种二级菌种10％，待细胞达1.8亿CFU/g时终止培养：
⑤固体培养：
取脱脂大豆粉20.0-40.0g、麸皮45.0-65.0g小麦粉8.0-12.0g、脱脂乳粉1.0-3.0g、低聚异麦芽糖1.5-2.5g、葡萄糖0.5-2.0g、酵母浸膏0.05-0.2g。另外加入VB1 1.0-3.0mg/Kg、VB2 2.0-6.0mg/Kg，生物素0.5-2.0mg/kg，用自来水20-25ml混匀，0.1MPa下灭菌120min，以此作为培养基，冷至42℃无菌下立即接种20％-30％三级菌种，培养物置于灭菌不透气塑料袋中，然后抽真空向该无毒无菌塑料袋中回灌无氧无菌N2，于37℃进行厌氧培养24-48h，至细胞数达4.5亿CFU/g后终止培养，向该培养物中加入经165℃灭菌的5-10％葡萄糖、5％淀粉，拌匀后料温控制在30-40℃冷冻真空下干燥或真空下干燥，使水含量≤9.0％，粉碎过60目筛备用；
(2)嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)种培养
①斜面培养：
取酪蛋白胨8.0-12.0g，牛肉浸膏8.0-12.0g，酵母浸膏3.0-7.0g，葡萄糖3.0-7.0g，柠檬酸二胺1.0-3.0g，吐温-80(Tween-80)5.0-15.0ml，K2HPO4 1.0-3.0g，MgSO4·7H2O0.1-0.3g，MnSO4·H2O 0.03-0.08g，CaCO3 10.0-30.0g，琼脂10.0-20.0g，加蒸馏水1000ml，调节PH6.5-7.5以此作为培养基，0.1MPa灭菌30min，立即接种原种培养物，于37℃厌氧培养3-7d，长满斜面后于厌氧下存放备用；
②一级菌种培养：
培养基、灭菌同上述原种斜面培养，只是不加琼脂，接种上述原种斜面培养物，于37±1℃下厌氧培养3-4d，至细胞数≥10亿CFU/ml终止培养，室温下保存备用；
③二级菌种培养：
培养基及操作方法和灭菌同一级菌种培养，培养液冷至40℃时接种一级菌种25％，于35-37℃下厌氧培养3-4d，每隔2h摇动1min至细胞数达10亿CFU/ml时终止培养，室温下保存备用；
④三级菌种培养：
培养基及灭菌、接种同二级菌种，接种二级菌种10％，至细胞达10CFU/ml时终止培养，室温下保存备用；
⑤固体培养：
取脱脂大豆粉30.0-40.0g，玉米粉25.0-35.0g，大米粉8.0-12.0g，脱脂乳粉3.0-7.0g，麸皮10.0-20.0g，小麦粉2.0-6.0g，白砂糖0.3-0.7g，NaHCO3 0.3-0.7g，固体粉料加25-32％水混匀，在0.1MPa下灭菌120min，该培养基冷至50℃时，无菌下接种20％三级菌种，置于无菌无毒不透气塑料袋内，然后抽真空，向该无毒无菌塑料袋中回灌无菌无氧N2，于30-35℃无菌下厌氧培养2-3d，待干基细胞数＞80亿CFU/g终止培养，然后用45℃热风干燥至含水量为8.0％，粉碎过60目筛备用。
(3)嗜热链球菌(Streptococus Salivarius subsp thermophilus)种培养
各阶段培养基及操作方法、细胞数均同嗜酸乳杆菌。
(4)两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌培养物重量比为50-80∶10-15∶5 16，分别准确称取所需重量，无菌下装入胶囊，计数压板包装。
本发明从中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)引进两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum1.1852)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus 1.1854)、嗜热链球菌(Streptococus Salivarius subsp thermophilus 1.1855)。
本发明所述的液—固结合发酵工艺，是指液—固结合培养用上述三个菌种分别先后进行液体培养，然后进行固体培养的两个阶段；在固体培养基中加液体培养物20-30％，接种量大，比单液或单固培养增加9-10倍；在固体培养中加双歧因子，促进活菌增殖。
上述三个菌种的液—固结合发酵工艺的技术方案，是先灭菌，后接种20-30％各自的三级菌种培养物，然后再抽真空向无毒无菌塑料袋中回灌无氧无菌N2，控温进行厌氧培养，从而解决了固体培养不易成为厌氧环境的关键。两歧双歧杆菌厌氧，而嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌兼性厌氧。所谓回灌是指将二支管插入无毒无菌塑料袋中，无氧下先开抽真空管抽真空，用真空泵将所述的塑料袋抽真空后，将抽真空管关上。然后打开另一管向前述的塑料袋输送无氧无菌N2。
本发明在培养活化菌种时，即在以两歧双歧杆菌为主微生态制剂的制备过程中，在培养基中，特别是固体培养基中加双歧因子，以促进活菌的增殖，可达到108-109级，且可延长保存期，三菌混和物(产品)在30℃下，保存2年后细胞数由38.6亿CFU/g降至5.0亿CFU/g。
本发明提供的微生态胶囊制剂为：0.35g/粒×12粒/板，日服三次，每次三粒，空腹服用。其各项指标均符合Q/JL-TSG-01-2000企业标准，见下列各表：
           表1  感官指标
    项目     指标
    外形     有色或无色胶囊
    色泽     去掉胶囊，内为棕黄色粉末
    气味     无异味
    滋味     微甜、适口
    组织状态     呈均匀粉末状，无异物
           表2  理化指标
           项目      指标
净含量，g               ≥     28.35
净含量允许负偏差，％    ≤     9.0
水份，％                ≤     9.0
黄曲霉毒素B2，μg/kg    ≤     5.0
铅(以Pb计)，mg/kg       ≤     0.5
砷(以As计)，mg/kg       ≤     0.3
汞(以Hg计)，mg/kg       ≤     0.03
          表3  微生物指标
        项目     指标
大肠菌群，MPN/100g≤     40
霉菌，cfu/g       ≤     25
酵母，cfu/g       ≤     25
致病菌     不得检出
注：致病菌系指肠道致病菌及致病性球菌
                   表4  功效成份指标
             项目       指标
两歧双歧杆菌，cfu/100g        ≥     1.2×108
嗜酵乳杆菌，cfu/100g          ≥     4.2×108
嗜热链球菌，cfu/100g          ≥     4.3×108
本发明提供的液—固结合发酵工艺的制剂：
活菌数明显多于液体培养法(t检验，p＜0.01)。两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌分别比液体培养法高11.03、11.96、10.11倍，见表5
      表5  液固结合培养方法对活菌数目的影响(logCFU/g，X±SD，n＝12)
    培养方法     两歧双歧杆菌     嗜酸乳杆菌     嗜热链球菌
    液体     8.49±0.41     8.69±0.27     8.74±0.52
    液固结合     9.35±0.46     9.77±0.34     9.75±0.47
在30℃下保存期内活细胞数目远高于液体培养物(t验检，p＜0.01)，超出数百倍至亿倍，见表6。
      表6  培养物保存期内活菌数目(logCFU/g，30℃，X±SD，n＝12)
培养方式              两歧双歧杆菌                  嗜酸乳杆菌                 嗜热链球菌
0个月  12个月  24个月  0个月  12个月  24个月  0个月 12个月  24个月
  液体 8.49±0.41  3.10±0.12  0  8.69±0.27  6.55±0.20  4.17±0.09  8.74±0.52 5.90±0.18  3.63±0.16
 液固结合 9.53±0.46  8.72±0.37  8.23±0.25  9.77±0.34  8.79±0.31  8.40±0.29  9.75±0.47 8.49±0.39  8.75±0.33
小鼠三个剂量(由小到大)分别为人体(60kg体重)正常摄入量的8.3倍和20倍。从下表可见服用中剂量和高剂量的小鼠，肠道双歧杆菌和乳杆菌数目明显增加(t检验，p＜0.01)；灌服前后各组肠杆菌和肠球菌数量无明显差异(t检验，p＞0.05)。
      表7  对小鼠4种肠道菌群数量的影响(logCFU/g，X±SD，n＝18)
            对照组            52.5mg/kg组               436mg/kg组           1050mg/kg组
灌服前  灌服后  灌服前          灌服后  灌服前  灌服后  灌服前  灌服后
 双歧杆菌 9.51±0.52  9.43±0.25  9.27±0.38  9.81±0.44  9.42±0.30  10.27±0.35  9.47±0.49  10.29±0.40
 乳杆菌 9.13±0.16  9.08±0.29  9.18±0.19  9.50±0.26  9.25±0.27  9.87±0.25  9.18±0.30  9.85±0.24
 肠杆菌 7.49±0.58  7.53±0.59  7.62±0.37  7.55±0.57  7.52±0.42  7.43±0.39  7.67±0.47  7.60±0.36
 肠球菌 7.83±0.56  7.46±0.60  7.49±0.61  7.58±0.67  7.55±0.57  7.54±0.46  7.68±0.66  7.63±0.54
服用本发明的制剂，人体肠道中双歧杆菌、乳杆菌和肠球菌明显增加(p＜0.01)。拟杆菌减少(p＜0.01)。所有受试者均无不良反应。见表8。
      表8  人体肠道菌群检测结果(logCFU/g，X±SD，n＝60)
  双歧杆菌   乳杆菌   肠杆菌   肠球菌   拟杆菌   韦氏梭菌
  服用前   8.47±0.62   7.05±0.89   8.63±0.57   7.85±0.67   9.39±0.57   7.98±1.68
  服用后   9.54±0.59   8.25±1.03   8.44±0.85   8.24±0.73   9.05±0.79   7.91±1.75
经保健食品安全毒理学试验表明：本发明提供的制剂，小鼠经口急性毒性试验LD大于15.00g/kg.bw，根据毒性分析属于无毒级，小鼠微核。小鼠精子畸形试验、Ames试验均为阴性，30d喂养试验未见明显有害效应。
经调节肠道菌群作用动物试验表明：经口给予小鼠三个不同剂量的本发明提供的制剂10天后，小鼠肠道内菌群发生变化：双歧杆菌、乳杆菌的数量明显增加，肠杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌的数量变化不明显，说明具有调节肠道菌群的作用。
调节肠道菌群作用人体试食试验表明：服用本发明提供的制剂10天后，受试人群肠道内菌群数量发生有益的变化：粪便中双歧杆菌、乳杆菌的数量明显增加，差异有极显著性(p≤0.01)，肠杆菌、肠球菌、拟杆菌、产气荚膜梭菌的数量无明显变化，说明具有一定的调节肠道菌群，增殖双歧杆菌、乳杆菌的作用。
两歧双歧杆菌菌种鉴定：自样品中分离的两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)菌种，其形态、各项生化反应和气相色谱法有机酸代谢产物测定结果，均符合《伯杰氏细菌鉴定手册》、《SPI50CHL细菌鉴定表》、《乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验》GB/T16347-1996、《食品卫生微生物学检验双歧杆菌检验》(报批稿)中两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)的特征，判定为：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)。
两歧双歧杆菌菌种毒理试验：自样品中分离的两歧双歧杆菌，接种BBL液体培养基，36±1℃厌氧培养48h，培养物的原液和5倍浓缩液，经口以20ml/kgBW给小鼠灌胃3d，连续观察7d，对小鼠的体重增长无影响，与对照组相比，未观察到受试小鼠有毒性反应及引起死亡。
嗜酸乳杆菌菌种鉴定：自样品中分离的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)菌种，其形态、各项生化反应和气相色谱法有机酸代谢产物测定结果，均符合《伯杰氏细胞鉴定手册》、《SPI50CHL细菌鉴定表》、《乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验》GB/T16347-1996中嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)的特征，判定为：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。
嗜酸乳杆菌菌种毒理实验：自样品中分离的嗜酸乳杆菌，接种LBs液体培养基，36±1℃厌氧培养48h，培养物的原液和5倍浓缩液，经口以20ml/kgBW给小鼠灌胃3d，连续观察7d，对小鼠的体重增长无影响，与对照组相比，未观察到受试小鼠有毒性反应及引起死亡。
嗜热链球菌菌种鉴定：自样品中分离的嗜热链球菌(Streptococus Salivariussubsp thermophilus)菌株，其形态、各项生化反应和气相色谱法有机酸代谢产物测定结果，均符合《伯杰氏细胞鉴定手册》、《API50CHL细菌鉴定表》、《乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验》GB/T16347-1996中嗜热链球菌(Streptococus Salivarius subspthermophilus)的特征，判定为：嗜热链球菌(Streptococus Salivarius subspthermophilus)。
嗜热链球菌种毒理实验：自样品中分离的嗜热链球菌，接种MC液体培养基，36±1℃厌氧培养48h，培养物的原液和5倍浓缩液，经口以20ml/kgBW给小鼠灌胃3d，连续观察7d，对小鼠的体重增长无影响，与对照组相比，未观察到受试小鼠有毒性反应及引起死亡。
本发明提供的两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌最佳组合胶囊制剂，对胃肠道疾病的微生态菌群失调的调节作用，给30例胃肠疾人服用，对病情和效果分析。按临床观察的统一标准，对症状体征消减情况和康复状况等改变进行评定，总有效率达95.84％，总显效率达60.42％。尤以急性肠炎、浅表性胃炎效果最佳。其次是胃及十二指肠溃疡、慢性结肠炎。对于食道炎、糜烂性胃炎、溃疡性肠炎、胆囊炎等也有一定的效果。由此可见，本发明胶囊中的益生菌，对于纠正胃肠道功能紊乱，抑制致病菌，改善微生态平衡提高人体免病功能起到了重要作用，是胃肠道疾病人群的保健佳品。
                              具体实施方式
现通过具体实施例，对本发明以两歧双歧杆菌为主微生态制剂液一固结合发酵工艺进一步描述如下：
本发明经筛选的三种优秀菌种，即两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌，分别先进行液体培养，即分别依次进行原种、1-3级菌种液体培养，然后再分别进行其固体培养，得到各自菌粉按一定比例配料、混匀、装入胶囊、压板、包装等。
实施例1
1、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)
(1)原种液体培养
取大豆蛋白胨3.0g，胰胨3.0g，酵母浸膏8.0g，葡萄糖8.0g，微量盐溶液30ml，其中CaCl20.1g，MgSO4·7H2O 0.3g，K2HPO4 0.5g，NaHCO3 5.0g，NaCl 1.0g，蒸馏水500ml，PH6.5以此作为培养基。将该培养基装入试管(占试管重直长度的2/3左右)内塞上棉球，0.14MPa灭菌30min，立即换成经灭菌的橡皮塞。用冰水速冷至45℃后立即接种原种，并用经灭菌的食用植物油倒在培养基上面，使之成为0.5-1.0cm厚的油层，封以原橡皮塞，于厌氧环境和37℃下培养24-48h后，终止培养。在厌养及0-4℃下保存备用。
(2)一级菌种液体培养
取蛋白胨6.0g，酵母浸膏3.0g，葡萄糖8.0g，低聚异麦芽糖8.0g，微量盐溶液30ml，其中CaCl2 0.1g，MgSO4·7H2O 0.3g，K2HPO4 0.5g，KH2PO4 0.5g，NaHCO3 5.0g，NaCl 1.0g，蒸馏水500ml，PH6.8，以此作为培养基，将该培养基灌满无色透明细口瓶，以聚丙烯塑料薄膜封口，0.14MPa灭菌40min，立即在上述培养基上倒一层0.5cm左右厚度的无菌食用植物油，然后冷至42℃，立即接种5％原种液体培养物，以磨口瓶盖封口，并于37-38℃恒温箱中培养24-96h，每隔3h摇动1min，待细胞数达2亿CFU/ml时，终止培养，保存备用。
(3)二级菌种液体培养
培养基配方及各项操作同一级菌种，只是培养容器改用无色透明试剂瓶。按10％的量接种一级菌种。每隔4h摇动1min，培养24-96h，待细胞数达2亿CFU/ml时终止培养。
(4)三级菌种固体培养
培养基配方和各项操作同二级菌种，只是培养容器改用培养瓶。待细胞数达1.8亿CFU/g，即终止培养。
(5)固体培养
取脱脂大豆粉20.0g、麦皮45.0g、脱脂乳粉1.0g、低聚异麦芽糖1.5g、葡萄糖0.5g、酵母浸膏0.05g。另加VB1 1.0mg/kg、VB2 2.0mg/kg，生物索0.1mg/kg，用自来水混匀，0.14MPa灭菌120min后，作为培养基。该培养基冷至42℃时，在N2环境中立即接种20％-30％三级菌种。培养物置于不透气无毒无菌聚丙烯塑料袋中，然后抽真空，再向该袋中回灌无氧无菌N2，即将二支管插入袋中，无氧下先开抽真空管，用真空泵将上述塑料袋抽真空后，抽真空管关上；打开另一管，向袋中输送无菌无氧N2。并于37℃进行厌氧培养24-48h，至干基细胞数达4.5亿CFU/g后终止培养。
在上述培养物中加入经165℃灭菌的葡萄糖5-10％，淀粉5％，料温控制在30-40℃冷冻真空干燥至含水量≤9.0％。干燥后的培养物，粉碎至60目备用。
2、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)
(1)原种斜面培养
取酪蛋白胨8.0g，牛肉浸膏8.0g，酵母浸膏3.0g，葡萄糖3.0g，柠檬酸二胺1.0g，吐温-80(Tween-80)5.0g，K2HPO4 1.0g，MgSO4·7H2O 0.1g，MnSO4·H2O 0.03g，CaCO3 10.0g，琼脂10.0g，用蒸馏水500ml混匀，PH6.5，以此作为培养基，0.1MPa灭菌30min，立即接种上述原种斜面培养物，于37℃下厌氧培养3-7d，长满斜面后于厌氧下存放备用；
(2)一级菌种液体培养
培养基配方，各项操作，灭菌同上述原种斜面培养，只是不加琼脂；接种上述原种斜面培养物，于37℃±1℃厌氧培养3-4d，待细胞数达10亿CFU/ml时终止培养。室温下保存备用。
(3)二级菌种液体培养
培养基配方及各项操作和灭菌同一级菌种。培养液冷至40℃时接种一级菌种，每个三角瓶中接种一级培养物为25％，于35-37℃下厌氧培养3-4d，每隔2h摇动1min。待细胞数达10亿CFU/ml时终止培养。室温下保存备用。
(4)三级菌种液体培养
培养基配方，各项操作，灭菌、接种、培养同二级菌种。接种二级菌种，接种量为10％，培养容器为玻璃瓶。细胞数达10亿CFU/ml时终止培养。室温下保存备用。
(5)固体培养
取脱脂大豆粉30.0g，玉米粉25.0g，大米粉8.0g，脱脂乳粉3.0g，麸皮10.0g，小麦粉2.0g，白砂糖0.3g，NaHCO3 0.3g，固体粉料用25-32％水混匀，在0.1MPa下灭菌120min，该培养基冷至50℃时，无菌下接种20％三级菌种，置于无菌无毒不透气塑料袋中，然后抽真空，向前述的塑料袋中回灌无菌无氧N2“回灌”同两歧双歧杆菌固体培养中所描述的操作过程。于30-35℃无菌兼性厌氧培养2-3d，待干基细胞数80亿CFU/g终止培养，用45℃热风干燥至含水量为8.0％，粉碎过60目筛备用。
3、嗜热链球菌(Streptococus Salivarius subsp thermophilus)各阶段培养基配方及各项操作方法、细胞数量均同嗜酸乳杆菌。
4、按两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌培养物重量比为80∶10∶10，分别准确称取所需重量，无菌下装入胶囊，计数压板包装。
实施例2-3
两歧双歧杆菌，嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌各阶段培养操作等同实施例1，其各自培养基组成，最终微生态制剂中上述三菌种配比分别见表9-15。
                   表9  两歧双歧杆菌原种培养基组成(g)
大豆蛋白胨 胰胨 酵母浸膏 葡萄糖              40ml(实施例2)、50ml(实施例3)微量盐溶液     蒸留水ml PH
  CaCL2 MgSO4·7H2O     K2HPO4     KH2PO4    NaHCO3     NaCl
  实例施2     5.0  5.0   10.0   10.0     0.2     0.5     1.0     1.0    10.0     2.0     1000   7.0
  实施例3     7.0  7.0   12.0   12.0     0.4     0.8     2.0     2.0    20.0     3.0     2000   7.5
                   表10  两歧双歧杆菌一级菌种培养基组成(g)
蛋白胨 酵母浸膏 葡萄糖   低聚异麦芽糖                  40ml(实施例2)、50ml(实施例3)微量盐溶液     蒸留水ml PH
  CaCL2   MgSO4·7H2O     K2HPO4     KH2PO4   NaHCO3   NaCl
  实施例2   8.0     5.0   10.0   10.0   0.2     0.5     1.2     1.2     1.2     2.0     1000     6.9
  实施例3   10.0     7.0   12.0   12.0   0.4     0.8     2.0     2.0     2.0     3.0     2000     7.0
                   表11  两歧双歧杆菌固体培养基组成(g)
  脱脂大豆粉 麸皮 小麦粉 脱脂乳粉     低聚异麦芽糖 葡萄糖 酵母浸膏 VB1 VB2 生物素 自来水
  实施例2   30.0   55.0     10.0     2.0     2.0     1.2    0.1  2mg/kg    4.0mg/kg  1.2mg/kg   22.0％
  实施例3   40.0   65.0     12.0     3.0     2.5     2.0    0.2mg/kg  3mg/kg    6.0mg/kg  2.0mg/kg   25.0％
                   表12  嗜酸乳杆菌原种培养基组成(g)
  酷蛋白胨   牛肉浸膏   酵母浸膏   葡萄糖 柠檬酸二胺  吐温80(Tween80) K2HPO4 MgSO4·7H2O MnSO4·H2O CaCO3 琼脂  蒸馏水ml PH
  实施例2   10.0   10.0   5.0   5.0   2.0    10.0     2.0     0.2     0.05   20.0   15.0   1000   6.8
  实施例3   12.0   12.0   7.0   7.0   3.0    15.0     3.0     0.3     0.07   30.0   20.0   2000   7.5
                   表13  嗜酸乳杆菌一级菌种培养基组成(g)
  酷蛋白胨   牛肉浸膏   酵母浸膏  葡萄糖   柠檬酸二胺    吐温80(Twecn80) K2HPO4 MgSO4·7H2O MnSO4·H2O CaCO3 琼脂  蒸馏水ml PH
实施例2   10.0   10.0    5.0     5.0     2.0     10.0     2.0     0.2     0.05   20.0   -   1000   6.8
实施例3   12.0   12.0    7.0     7.0     3.0     15.0     3.0     0.3     0.07   30.0   -   2000   7.5
                   表14  嗜酸乳杆菌固体培养基组成(g)
    脱脂大豆粉     玉米粉     大米粉     脱脂乳粉     麦皮     小麦粉     白砂糖     NaHCO3
实施例2     35.0     30.0     10.0     5.0     15.0     4.0     0.5     0.5
实施例3     40.0     35.0     12.0     7.0     20.0     6.0     0.7     0.7
                   表15  本发明微生态制剂中三种菌粉重量比
    两歧双歧杆菌     嗜酸乳杆菌     嗜热链球菌
    实施例2     65     12     10
    实施例3     80     15     16

Claims (1)

1、以两歧双杆菌为主微生态制剂的液——固结含发酵工艺，其特征在于该工艺主要包括下列过程：
(1)两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)种培养：
①原种液体培养：
取大豆蛋白胨3.0-7.0g，胰胨3.0-7.0g，酵母浸膏8.0-12.0g，葡萄糖8.0-12.0g，微量盐溶液30-50ml，其中CaCl2 0.1-0.4g，MgSO4·7H2O 0.3-0.8g，K2HPO4 0.5-2.0g，KH2PO4 0.5-2.0g，NaHCO3 5.0-20.0g，NaCl 1.0-3.0g，蒸馏水500-2000ml，调PH6.5-7.5以此作为原种液体培养基；0.1Mpa下灭菌30min，厌氧下速冷至45℃后，立即接种体积百分比为5％的原种溶液，倒在上述培养基上一层0.5-1.0cm厚度的无菌食用植物油，在(专性)厌氧下37℃培养24-48h后，终止培养，于厌氧0-4℃保存备用；
②一级菌种培养：
取蛋白胨6.0-10.0g，酵母浸膏3.0-7.0g，葡萄糖8.0-12.0g，低聚异麦芽糖8.0-12.0g，微量盐溶液30-50ml，其中CaCl2 0.1-0.4g，MgSO4·7H2O 0.3-0.8g，K2HPO4 0.5-2.0g，KH2PO40.5-2.0g，NaHCO3 5.0-20.0g，NaCl 1.0-3.0g，蒸馏水500-2000ml，PH6.8-7.0，以此作为培养基，0.1MPa下灭菌40min，灌满无色透明的细口瓶，立即在培养基上倒一层0.5cm厚度的无菌食用植物油，冷至42℃，立即接种5％原种培养物，以磨口瓶盖封口，并于37-38℃恒温下培养24-96h，每隔3h摇动1min，细胞数达2亿CFU/ml时，终止培养，厌氧下保存备用；
③二级菌种培养：
培养基及操作同一级菌种，只是用无色透明试剂瓶，接种一级菌种10％后，每隔4h摇动1min，培养24-96h，待细胞数达2.0亿CFU/g，终止培养；
④三级菌种培养：
培养基及各项操作同二级菌种，接种二级菌种10％，细胞达1.8亿CFU/ml时终止培养，室温下保存备用；
⑤固体培养：
取脱脂大豆粉20.0-40.0g、麸皮45.0-65.0g小麦粉8.0-12.0g、脱脂乳粉1.0-3.0g、低聚异麦芽糖1.5-2.5g、葡萄糖0.5-2.0g、酵母浸膏0.05-0.2g。另外加入VB1 1.0-3.0mg/Kg、VB2 2.0-6.0mg/Kg生物素0.5-2.0mg/kg，用自来水20-25ml混匀，0.1MPa下灭菌120min，以此作为培养基，冷至42℃无菌下立即接种20％-30％三级菌种，培养物置于无菌无毒不透气塑料袋中，然后向该塑料袋中回灌无氧无菌N2，于37℃进行厌氧培养24-48h，至干基细胞数达4.5亿CFU/g，后终止培养，向该培养物中加入经165℃灭菌的相当于上述固体重量的5-10％葡萄糖、5％淀粉，拌匀后料温控制在30-40℃冷冻真空下干燥或真空下干燥，使含水量≤9.0％，粉碎过60目筛备用；
(2)嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)种培养
①斜面培养：
取酪蛋白胨8.0-12.0g，牛肉浸膏8.0-12.0g，酵母浸膏3.0-7.0g，葡萄糖3.0-7.0g，柠檬酸二胺1.0-3.0g，吐温-80(Tween-80)5.0-15.0ml，K2HPO4 1.0-3.0g，MgSO4·7H2O0.1-0.3g，MnSO4·H2O 0.03-0.08g，CaCO3 10.0-30.0g，琼脂10.0-20.0g，加蒸馏水1000ml，调节PH6.5-7.5以此作为培养基，0.1MPa灭菌30min，立即接种原种培养物，于37℃厌氧培养3-7d，长满斜面后于厌氧下存放备用；
②一级菌种培养：
培养基、灭菌同上述原种斜面培养，只是不加琼脂，接种上述原种斜面培养物，于37±1℃下厌氧培养3-4d，至细胞数≥10亿CFU/ml终止培养，室温下保存备用；
③二级菌种培养：
培养基及操作方法和灭菌同一级菌种培养，培养液冷至40℃接种一级25％，于35-37℃下厌氧培养3-4d，每隔2h摇动1min，至细胞数达10亿CFU/ml时终止培养，室温下保存备用；
④三级菌种培养：
培养基及灭菌、接种同二级菌种，接种二级菌种10％，至细胞达10亿CFU/ml时终止培养，室温下保存备用：
⑤固体培养：
取脱脂大豆粉30.0-40.0g，玉米粉25.0-35.0g，大米粉8.0-12.0g，脱脂乳粉3.0-7.0g，麸皮10.0-20.0g，小麦粉2.0-6.0g，白砂糖0.3-0.7g，NaHCO3 0.3-0.7g，固体粉料加25-32％水混匀，在0.1MPa下灭菌120min，该培养基冷至50℃时，无菌下接种20％三级菌种，培养物置于无菌无毒不透气塑料袋中，然后抽真空，并向该塑料袋中回灌无菌无氧N2，于30-35℃无菌下厌氧培养2-3d，待干基细胞数＞80亿CFU/g终止培养，然后用45℃热风干燥至含水量为8.0％，粉碎过60目筛备用；
(3)嗜热链球菌(Streptococus Salivarius subsp thermophilus)种培养各阶段培养基及操作方法、细胞数均同嗜酸乳杆菌；
(4)两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌培养物重量比为50-80∶10-15∶5-16，分别准确称取所需重量，无菌下装入胶囊，计数压板包装。
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