CN1382139A - 制备异a噁唑甲酰胺及其类似物的方法和中间体 - Google Patents

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Abstract

制备通式(I),尤其是式(I’)的鼻病毒蛋白酶抑制剂的有效的合成路线,用于这些合成路线的关键中间体,以及可用于这些合成路线的连续膜反应器。这些通式(I)的化合物,以及含有这些化合物的药物组合物,适合于治疗感染一种或多种细小核糖核酸病毒的患者或宿主。

Description

制备异噁唑甲酰胺 及其类似物的方法和中间体
相关申请数据：
本申请涉及于1999年8月24日提交的序列号为60/150，365的美国临时专利申请。
本申请还涉及美国临时专利申请No.60/150，358(代理人签条No.：0125.0028)名称为“制备鼻病毒蛋白酶抑制剂和关键中间体的有效的合成路线”，发明人为：Q.Tian，N.Nayyar，S.Babu，J.Tao，T.Moran，R.Dagnino，Jr.，T.Remarchuk，M.Melnick，L.Mitchell，Jr.，和S.Bender.上述申请还涉及制备用于其中的鼻病毒蛋白酶抑制剂和关键中间体的合成路线。
上述参考申请是可靠的，并在此引入作为参考。
技术领域和工业实用性
本发明涉及制备3-{(5’-甲基异噁唑-3’-羰基)-L-Valψ(COCH2)-L-(4-F-Phe)-L-((S)-吡咯-Ala)}-E-丙酸乙酯，其类似物和它们的药学可接受盐的改进的方法。本发明还包括用于上述方法的一组新的中间体化合物。另外，本发明包括用于本发明的方法的连续膜反应器。
发明背景：
细小核糖核酸病毒为一族感染人类及其它动物的微小的非包膜丝状体阳性的含RNA病毒。这些病毒包括人类鼻病毒，人类脊髓灰质炎病毒，人类柯萨奇病毒，人类艾柯病毒，人类和牛肠道病毒，脑心肌炎病毒，脑膜炎病毒，脚和口病毒，甲型肝炎病毒，等等。人类鼻病毒为普通感冒的主要原因。
细小核糖核酸病毒的天然成熟需要分解蛋白3C酶。因此，抑制分解蛋白3C酶的活性将代表一种治疗和治愈这些自然病毒感染，包括普通感冒的重要和有效的方法。
近来人们已经发现了一些细小核糖核酸病毒3C蛋白水解酶的酶活性的小分子抑制剂(即抗细小核糖核酸病毒化合物)。见，例如：由Webber等人于1997年5月2日提交的美国专利申请No.08/850，398；由Dragovich等人于1997年12月16日申请的美国专利申请No.08/991，282；和由Webber等人于1997年12月16日申请的美国专利申请No.08/991，739；这些美国专利申请描述了某些抗细小核糖核酸病毒的化合物和它们的合成方法，这些专利的公开内容在此引入作为参考。
新近，Dragovich等人于1998，8，28申请的美国专利申请No.60/098，354(第’354申请)中宣布已经发现了一组特别有效的抗细小核糖核酸病毒剂，该申请在此引入作为参考。本申请特别公开了一组通式I的抗细小核糖核酸病毒剂。属于该组范围内的一种特别有前途的化合物，AG7088，显示出对于鼻病毒血清型多血症的极好的抗病毒的性质，目前正处于人类临床试验中。该’354申请还公开了可用于合成这些化合物的方法和中间体。例如，其中一般方法V公开了一种合成通式I的化合物的一般方法，该方法涉及将通式BB的羧酸与通式P的胺通过酰胺形成反应提供最终产品CC，如下所示。
Figure A0081201100311
该’354申请公开了合成通式BB和P的中间体的方法，并给出了进行上述酰胺形成反应的方法。因此，该’354申请给出了从羧酸BB(在以下通式II化合物的范围内)和通式P的化合物(与下文通式III的化合物相同)合成通式I化合物的适宜的方法。
类似地，由Dragovich等人在近期的两个出版物中公开了抗细小核糖核酸病毒试剂和它们的适宜合成方法。见“不可逆人类鼻病毒3C蛋白酶抑制剂的基于结构的设计、合成和生物评价3.含酮基亚甲基的肽类似物的结构活性研究”，Dragovich等人，Journal of MedicinalChemistry，ASAP，1999；以及“不可逆人类鼻病毒3C蛋白酶抑制剂的基于结构的设计、合成和生物评价4.P1内酰胺类似物作为L-谷氨酰胺的替代物的掺入”，Dragovich等人，Journal of MedicinalChemistry，ASAP，1999。上述的文章在此全部引入作为参考。
然而，人们仍需要发现合成该组抗细小核糖核酸病毒试剂化合物的改进的更有效的方法和新的中间体。尤其需要合成通式I、II和III的化合物的改进方法。
本发明的方法涉及酶催化还原步骤。由于某些催化剂的花费，包括酶催化的催化剂，人们需要将这些昂贵催化剂重复利用。该问题尤其可通过使用连续膜反应器解决。连续膜反应器的研制可在制备化合物中经济可行的利用这些昂贵的催化剂。然而，直到本发明，连续膜反应器一直是昂贵的，且在显著地改变催化反应规模时缺乏多方面适合性。具体地说，已知的连续膜反应器使用中空纤维滤器反应器，其中大量的试剂和酶存在于大多数酶促反应发生的地方。
因此，为改变反应的规模，必须使用适当尺寸的不同中空纤维滤器反应器。见，例如，E.Schmidt等人，Journal of Biotechnology，24(1992)315-327，其公开了一种连续膜反应器。上述的文章在此引入作为参考。进一步，由于中空纤维滤器反应器的费用，造成已知的连续膜反应器是昂贵的。因此，需要一种更经济的和通用的连续膜反应器。
发明概述：
本发明涉及一种制备通式I的抗细小核糖核酸病毒剂的经济实用的和效率高的方法，例如制备化合物AG7088，以及可用于此合成的中间体。
该通式I的抗细小核糖核酸病毒剂包含：其中R1为H、F、烷基、OH、SH、或O-烷基；
R2和R3每个独立地为H；其中n为0到5的整数，A1为CH或N，A2和每个A3独立地选自C(R41)(R41)、N(R41)、S、S(O)、S(O)2、和O，且A4为NH或NR41，其中每个R41独立地为H或低级烷基，条件是上述由A1、A2、(A3)n、A4和C＝O形成的环上不存在超过两个相连的杂原子，且至少R2和R3之一为R4为
Figure A0081201100334
R5和R6各自独立地为H、F、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基；
R7和R8各自独立地为H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、-OR17、-SR17、-NR17R18、-NR19NR17R18、或-NR17OR18，其中R17、R18、和R19各自独立地为H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、或酰基，条件是至少R7和R8之一为烷基、芳基、杂芳基、-OR17、-SR17、-NR17R18、-NR19NR17R18、或-NR17OR18；
R9为具有一到三个选自O、N、和S的杂原子的五元杂环；且
Z和Z1各自独立地为H、F、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、-C(O)R21、-CO2R21、CN、-C(O)NR21R22、-C(O)NR21OR22、-C(S)R21、-C(S)NR21R22、-NO2、-SOR21、-SO2R21、-SO2NR21R22、-SO(NR21)(OR22)、-SONR21、-SO3R21、-PO(OR21)2、-PO(R21)(R22)、-PO(NR21R22)(OR23)、-PO(NR21R22)(NR23R24)、-C(O)NR21NR22R23、或-C(S)NR21NR22R23，其中R21、R22、R23和R24各自独立地为H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、酰基、或硫代酰基，或其中R21、R22、R23、和R24的任意两个，连同与它们连接的原子一起形成杂环烷基，条件是Z和Z1两个不都是H；
或Z1和R1，与其连接的原子一起形成环烷基或杂环烷基，其中Z1和R1为上述的定义，除外那些不能形成环烷基或杂环烷基的部分；
或Z和Z1，与其连接的原子一起形成环烷基或杂环烷基，其中Z和Z1为上述的定义，除外那些不能形成环烷基或杂环烷基的部分。
正如以上的讨论，这些通式I的抗细小核糖核酸病毒剂可以由将通式II的化合物与通式III的化合物一起进行适宜的酰胺形成反应来合成。本发明的方法提供了一种从式II和III的化合物合成式I化合物的更经济合算的和效率高的方法。
本发明的方法还提供了一种合成通式II的化合物的更经济而有效的方法，从而，提供了一种全面改进的合成通式I的抗细小核糖核酸病毒剂的方法。
另外，本发明提供了用于本发明方法的新的中间体，和用于制备那些新中间体的新方法。
本发明还涉及用于本发明方法的连续膜反应器。
本发明这些目的、优点和特征将参考说明书得以更全面的理解和评价。本发明的优选实施方案的详细说明
在本申请中，应用以下定义：
根据本领域的惯例，用于结构式，在此表示一种位于组成部分或取代基与母核或主链结构相连接的点的键。
当化学结构中包括手性碳时，除非描述了特别的排列方向，规定为包括两个立体异构体形式。
“烷基”用来指饱和和/或不饱和的碳原子和氢原子的直链或支链单价基团，例如甲基(Me)、乙基(Et)、丙基、异丙基、丁基(Bu)、异丁基、叔丁基(t-Bu)、乙烯基、戊烯基、丁烯基、丙烯基、乙炔基、丁炔基、丙炔基、戊炔基、己炔基等等，它们可以是未取代的(即仅仅含有碳和氢)或被一个或多个以下定义的适宜取代基所取代(例如，一个或多个卤素，例如F，Cl，Br，或I，优选为F和Cl)。“低级烷基”是指在其链中具有1到4个碳原子的烷基。
“环烷基”是指含有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个碳环原子的非芳香的一价的单环，二环，或三环基团，其每一个可以是饱和或不饱和的，且可以是未取代的或被一个或多个以下定义的适宜取代基取代，而且可与一个或多个杂环烷基，芳基，或杂芳基稠合，其中它们本身可以是未取代或被一个或多个取代基取代的。环烷基的举例说明的例子包括下列部分：“杂环烷基”是指含有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个环原子的非芳香的一价的单环，二环，或三环基团，其可以是饱和或不饱和的，包含选自氮、氧、和硫的1、2、3、4或5个杂原子，其中该基团可以是未取代的或被一个或多个以下定义的适宜取代基取代，而且可与一个或多个环烷基，芳基，或杂芳基稠合，其中它们本身可以是未取代或被一个或多个适宜取代基取代的。杂环烷基的举例说明的例子包括以下部分：
Figure A0081201100361
“芳基”是指含有6、10、14、或18个碳环原子的芳香的一价的单环，二环，或三环基团，其可以是未取代的或被一个或多个以下定义的适宜取代基取代，而且可与一个或多个环烷基，杂环烷基，或杂芳基稠合，其中它们本身可以是未取代或被一个或多个适宜的取代基取代的。因此，术语“芳基”包含苄基(Bzl)。
芳基的举例说明的例子包括以下部分：
Figure A0081201100362
“杂芳基”是指含有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个环原子的芳香的一价单环，二环，或三环基团，包含选自氮、氧、和硫的1、2、3、4、或5个杂原子，其中该基团可以是未取代的或被一个或多个以下定义的适宜取代基取代，而且可与一个或多个环烷基，杂环烷基，或芳基稠合，其中它们本身可以是未取代或被一个或多个适宜取代基取代的。杂芳基的举例说明的例子包括以下部分：
“杂环”是指杂芳基或杂环烷基(每个如上所述，为任选被取代的)。
“酰基”是指-C(O)-R基团，其中R为以下定义的取代基。
“硫代酰基”是指-C(S)-R基团，其中R为以下定义的取代基。
“磺酰基”是指-SO2R基团，其中R为以下定义的取代基。
“羟基”是指基团-OH。
“氨基”是指基团-NH2。
“烷基氨基”是指基团-NHRa，其中Ra为烷基。
“二烷基氨基”是指基团-NRaRb，其中Ra和Rb各自独立地为烷基。
“烷氧基”是指基团-ORa，其中Ra为烷基。典型的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、等等。
“烷氧羰基”是指基团-C(O)ORa，其中Ra为烷基。
“烷基磺酰基”是指基团-SO2Ra，其中Ra为烷基。
“烷基氨基羰基”是指基团-C(O)NHRa，其中Ra为烷基。
“二烷基氨基羰基”是指基团-C(O)NRaRb，其中Ra和Rb各自独立地为烷基。
“巯基”是指基团-SH。
“烷硫基”是指基团-SRa，其中Ra为烷基。
“羧基”是指基团-C(O)OH。
“氨基甲酰基”是指基团-C(O)NH2。
“芳氧基”是指基团-ORc，其中Rc为芳基。
“杂芳氧基”是指基团-ORd，其中Rd为杂芳基。
“芳硫基”是指基团-SRc，其中Rc为芳基。
“杂芳硫基”是指基团-SRd，其中Rd为杂芳基。
“离去基团”(Lv)是指任何适宜通过取代反应被取代的基团。普通技术人员将知道那些可以作为离去基团的强酸的共轭碱。适宜的离去基团的例子包括，但不局限于，-F，-Cl，-Br，烷基氯，烷基溴，烷基碘，烷基磺酸基团，烷基苯磺酸基团，烷基对甲苯磺酸基团，烷基甲磺酸基团，三氟甲磺酸基团，和任何具有硫酸氢根，甲基硫酸根，或磺酸根离子的基团。
典型的保护基，试剂和溶剂例如，但并不限于，下列的表1中列出的，在此和在权利要求中使用的具有以下缩写的那些。本领域技术人员将可以理解在表中所列的每个基团可以交换使用；例如，列在“试剂和溶剂”下的化合物可以用作保护基等。而且，本领域技术人员将知道其它可能的保护基，试剂和溶剂；这些都规定为在本发明的范围内。
表1
保护基
Ada              金刚烷乙酰基
Alloc            烯丙氧基羰基
Allyl            烯丙酯
Boc              叔丁氧羰基
Cbz              苄氧羰基
Fmoc             芴基甲氧羰基
OBzl             苄基酯
OEt              乙酯
OMe              甲酯
Tos(Tosyl)       对甲苯磺酰
Trt              三苯甲基
                 试剂和溶剂
ACN              乙腈
AcOH             乙酸
Ac2O            乙酸酐
AdacOH           金刚烷乙酸
AIBN             2，2-偶氮二异丁腈
Alloc-Cl         烯丙氧基羰基氯
BHT              2，6-二叔丁基-4-甲酚
Boc2O           碳酸二叔丁酯
CDI              1，1’-羰基二咪唑
CDMT             氯二甲基三嗪
DCM              二氯甲烷
DIEA             二异丙基乙胺
DIPEA            N，N-二异丙基乙胺
DMA              二甲基乙酰胺
DMF              N，N-二甲基甲酰胺
DMSO            二甲亚砜
EDTA            乙二胺四乙酸
Et3N           三乙胺
EtOAc           乙酸乙酯
FDH             甲酸脱氢酶
FmocOSu         9-芴基甲氧基羰基N-羟基琥珀酰亚胺酯
HATU            N-[(二甲基氨基)-1H-1，2，3-三唑[4，5-b]吡啶
                基亚甲基]-N-甲基甲铵六氟磷酸N-氧化物
HOBT            1-羟基苯并三唑
HF              氢氟酸
LDH             乳酸脱氢酶
LiHMDS          双三甲基甲硅烷基氨化锂
MeOH            甲醇
Mes(Mesyl)      甲基磺酰基
MTBE            甲基叔丁基醚
NAD             烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
NADH            过氧化氢氧化还原酶
NaHMDS          双三甲基甲硅烷基氨化钠
NMP             1-甲基-2-吡咯烷酮
nin.            茚三酮
i-PrOH          异丙醇
Pip             哌啶
PPL             脂酶
pTSA            对甲苯磺酸一水合物
Pyr             吡啶
TEA             三乙胺
TET             三亚乙基四氨
TFA             三氟乙酸
THF             四氢呋喃
Triflate(Tf)    三氟甲磺酰基
术语“适宜的有机部分”是指任何对本领域技术人员来说例如通过常规测试，可识别出没有相反地影响本发明的化合物的抑制活性的有机部分。适宜的有机部分的例子包括，但不局限于羟基、烷基、氧代、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、酰基、磺酰基、巯基、烷硫基、烷氧基、羧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、氨基甲酰基、芳硫基、杂芳硫基等等。
术语“取代基”或“适宜的取代基”是指任何对本领域技术人员来说例如通过常规测试，可以识别或选择的适宜的取代基。适宜的取代基的例子包括，但不局限于，羟基、卤素、氧代、烷基、酰基、磺酰基、巯基、烷硫基、烷氧基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、羧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、氨基甲酰基、芳氧基、杂芳氧基、芳硫基、杂芳硫基等等。
术语“任选取代的”是用来清楚地表明那些具体基团是未取代的或被一个或多个适宜的取代基取代的，除非该任选取代基被清楚地指定，在这样情况下这一术语表明该基团为未取代的或被该指定的取代基取代。如上所述，各种基团可以是未取代或取代的(即，它们为任选取代的)，除非在此另有说明(即，说明该具体基团为未取代)。
“前体药物”是指一种化合物，该化合物在生理条件下转化或通过溶剂解或代谢为一药学活性的具体化合物。
“药学活性的代谢物”是指一具体化合物通过在身体内新陈代谢产生药理学活性产物。
“溶剂化物”是指由具体化合物形成，并保持此种化合物的生物有效性的可药用溶剂化物。溶剂化物的例子包括本发明的化合物与水，异丙醇，乙醇，甲醇，二甲亚砜，乙酸乙酯，乙酸，或乙醇胺结合。
“可药用盐”是指保持具体化合物的游离酸和碱的生物有效性的盐，而且该盐不是生物学上的或不是不受欢迎的。可药用盐的例子包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、已酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、乙二酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1，4-二酸盐、己炔-1，6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯基丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、乙醇酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、和扁桃酸盐。
本发明进一步提供了包括本发明公开的合成步骤之一的合成方法。当合成步骤至少为最终的合成方法的一部分时，合成方法包括合成步骤。在这种形式下，该合成方法可以是唯一的合成步骤或具有与之有关的其它合成步骤。这种合成方法可以具有几个其它合成步骤或可以具有众多的其它合成步骤。
如果由本发明的方法形成的通式I的抗细小核糖核酸病毒试剂是一种碱，则所需要的盐可以通过任何本领域已知的适宜的方法制备，包括将游离碱用无机酸，例如盐酸；氢溴酸；硫酸；硝酸；磷酸；等等处理，或用有机酸，例如乙酸；马来酸；琥珀酸；扁桃酸；富马酸；丙二酸；丙酮酸；草酸；羟基乙酸；水杨酸；吡喃糖苷酸(pyranosidylacid)，例如糖醛酸或半乳糖醛酸；α-羟基酸，例如柠檬酸或酒石酸；氨基酸，例如天门冬氨酸或谷氨酸；芳香酸，例如苯甲酸或肉桂酸；磺酸，例如对甲苯磺酸或乙磺酸；等等处理。
如果由本发明的方法形成的通式I的抗细小核糖核酸病毒剂是一种酸，则所需要的盐可以通过任何本领域已知的适宜的方法制备，包括将该游离酸用无机的或有机碱处理，例如一种胺(一级的，二级的，或三级的)；碱金属或碱土金属氢氧化物；等等。适宜的盐的说明的例子包括来源于氨基酸例如甘氨酸和精氨酸；氨水；一级的，二级的，和三级胺；和环胺，例如哌啶、吗啉、和哌嗪的有机盐；以及来源于钠、钙、钾、镁、锰、铁、铜、锌、铝和锂的无机盐。
在化合物、盐或溶剂化物是固体的情况下，本领域技术人员可以知道用于本发明方法的通式I的化合物和中间体、盐和它们的溶剂化物，可能以不同的结晶形式存在，所有这些形式都规定为在本发明和具体通式的范围内。
用于本发明方法的通式I的抗细小核糖核酸病毒试剂、中间体，可能以单一的立体异构体、消旋物和/或对映体的混合物和/或非对映体的形式存在。所有这些单一的立体异构体、消旋物和它们的混合物规定为在本发明的宽的范围内。然而优选用于本发明方法的中间体化合物以旋光纯的形式使用。
如本领域技术人员通常认为的，旋光纯的化合物为对映体纯化合物。在此使用的术语“旋光纯”是指为得到具有所需药理活性的化合物而含有至少足够量的单一对映体的化合物。优选地，“旋光纯”是指化合物包含至少90％的单一异构体(80％对映体过量)，更优选至少95％(90％对映体过量e.e.)，甚至更优选97.5％(95％e.e.)且最优选至少99％(98％e.e.)。优选由本发明方法形成的通式I的抗细小核糖核酸病毒试剂为旋光纯。
本发明涉及一种制备式I的抗细小核糖核酸病毒试剂的方法：其中R1为H、F、烷基、OH、SH、或O-烷基；
R2和R3各自独立地为H；其中n为0到5的整数，A1为CH或N，A2和每个A3独立地选自C(R41)(R41)、N(R41)、S、S(O)、S(O)2、和O，且A4为NH或NR41，其中每个R41独立地为H或低级烷基，条件是上述由A1、A2、(A3)n、A4和C＝O形成的环上存在不超过两个相连的杂原子，且至少R2和R3之一为
Figure A0081201100441
R4为
R5和R6各自独立地为H、F、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基；
R7和R8各自独立地为H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、-OR17、-SR17、-NR17R18、-NR19NR17R18、或NR17OR18，其中R17、R18、和R19各自独立地为H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、或酰基，条件是至少R7和R8之一为烷基、芳基、杂芳基、-OR17、-SR17、-NR17R18、-NR19NR17R18、或NR17OR18；
R9为具有一到三个选自O、N、和S的杂原子的五元杂环；且
Z和Z1各自独立地为H、F、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、-C(O)R21、-CO2R21、CN、-C(O)NR21R22、-C(O)NR21OR22、-C(S)R21、-C(S)NR21R22、-NO2、-SOR21、-SO2R21、-SO2NR21R22、-SO(NR21)(OR22)、-SONR21、-SO3R21、-PO(OR21)2、-PO(R21)(R22)、-PO(NR21R22)(OR23)、-PO(NR21R22)(NR23R24)、-C(O)NR21NR22R23、或-C(S)NR21NR22R23，其中R21、R22、R23和R24各自独立地为H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、酰基、或硫代酰基，或其中R21、R22、R23、和R24的任意两个，连同与它们连接的原子一起形成杂环烷基，条件是Z和Z1两个不都是H；
或Z1和R1与其连接的原子一起形成环烷基或杂环烷基，其中Z1和R1为上述的定义，除外那些不能形成环烷基或杂环烷基的部分；
或Z和Z1与其连接的原子一起形成环烷基或杂环烷基，其中Z和Z1如上述的定义，除外那些不能形成环烷基或杂环烷基的部分；
本发明公开了通式I的化合物可以由将通式II的化合物与通式III的化合物一起进行适宜的酰胺形成反应来制备。
Figure A0081201100451
酰胺形成反应可以通过任何适宜的方法、试剂和反应条件实现。优选使用任何在所述’354申请中公开的方法。例如，通式II的化合物可以与通式III的化合物在HATU、DIPEA、CH3CN和H2O的存在下反应来得到目标的通式I的化合物。任何适合的纯化方法可用来进一步纯化通式I的化合物。
更优选，通式I的化合物由酰胺形成反应制备，该反应包含以下步骤：
(a)式II的化合物与式IIIA的化合物在N-甲基吗啉的存在下反应形成反应混合物；及
(b)向反应混合物中加入式Lv-X的化合物以形成通式I的化合物，其中X为任何适宜的卤化物。
优选使用更可取的酰胺形成反应制备通式I的化合物的方法利用了以下公开的一些或全部试剂及反应条件。因此，优选式II的化合物和式IIIA的化合物在DMF中在适宜的容器中化合。适宜的容器优选为单颈烧瓶，然后用任何适宜的隔膜板覆盖并用温度传感器覆盖。氮气用来在向反应混合物中加入N-甲基吗啉之前清洗适宜的容器。更优选，N-甲基吗啉通过注射器一次加入，并且反应混合物冷却到约-5℃到5℃之间。更优选反应混合物冷却到约0℃。然后向反应混合物中加入式Lv-X的化合物溶液。更优选，式Lv-X的化合物溶液为式Lv-X的化合物的DMF溶液。更优选式Lv-X的化合物为CDMT。式Lv-X的化合物溶液可通过任何可使反应混合物保持在恒温的适宜的方法加入到反应混合物中。例如，式Lv-X的化合物溶液可以利用注射器滴加到反应混合物中。式Lv-X的化合物溶液加入完成后，将反应混合物升温至大约室温。反应的进程可以通过用薄层色谱法(在下文中为“TLC”)监控式II化合物的消失加以跟踪。当反应至少基本上完成时，式I的化合物可以通过慢慢地向反应混合物中加入水从溶液中沉淀出来，形成淤浆。式I的化合物可通过任何为本领域普通技术人员所知的任何合适的方法从淤浆中分离出。例如，式I的化合物可通过过滤从淤浆中分离出。任何为本领域普通技术人员所知的适合的纯化方法可能用来纯化式I的化合物。更优选式I的化合物通过重结晶纯化。
任何为本领域普通技术人员所知的方法可用来制备式IIIA的化合物。然而，本发明还公开了一种制备式IIIA化合物的新方法，包括通式IIIB的化合物与TFA反应的步骤：
Figure A0081201100461
优选，从式IIIB的化合物制备式IIIA的化合物的方法使用以下公开的一些或全部试剂及反应条件。因此，优选，将式IIIB和DCM的化合物投入适宜的容器并用一隔膜板覆盖。该容器然后用氮气吹扫随后加入TFA。更优选，TFA在搅拌下通过注射器加入。反应的进程可以通过TLC跟踪。一旦起始物料基本消失后，通过任何合适的方法除去溶剂和过量的TFA。例如，溶剂和过量的TFA可以通过真空蒸馏除去。优选，式IIIA的化合物立即被用于本发明的过程中以制备通式I的化合物。
本发明还涉及制备式IIA的化合物的方法。
Figure A0081201100471
本领域普通技术人员将承认式IIA的化合物落在式II所定义的范围内。因此，式IIA的化合物还是用于制备通式I的抗细小核糖核酸病毒剂的有效的中间体。
本发明公开了制备式IIA的化合物的方法，包含以下步骤：
(a)将式XIII的化合物通过其与1，1’-羰基二咪唑和乙酸叔丁酯的烯醇锂反应，转化为式XIV的β-酮酯；
(b)将式XIV的化合物通过其与通式XVI化合物在适宜的反应条件下反应，转化为式XV的烯醇酯(enolate)；
Figure A0081201100481
(c)氢解通式XV的化合物得到通式XVII的化合物；
Figure A0081201100482
(d)将式XVII的化合物通过其与式R20-X的化合物(其中X为卤化物)在适宜的条件下反应进行酰化；及
(e)酶水解通式XVIII的化合物得到通式IIA的化合物；
优选，从式XIII的化合物转化为式XIV的化合物的方法使用以下公开的一些或全部试剂及反应条件。因此，优选，式XIII的化合物与CDI在THF中在氮气流下于室温搅拌至少约1小时，得到酰基咪唑中间体。然后在一单独的容器中，在氮气下向THF中加入双三甲基甲硅烷基氨基锂溶液(LHMDS)，然后冷却到-70℃。向LHMDS溶液中慢慢地加入乙酸叔丁酯，保持温度低于约-60℃以形成反应混合物。在氮气下，向包含乙酸叔丁酯的烯醇锂的反应混合物中慢慢地加入如上述的已制备了的酰基咪唑中间体，保持内部温度等于或低于约-60℃。一旦加入完成，反应混合物在-60℃下至少再搅拌1小时。然后用1M HCl处理反应混合物以结束反应。在剧烈的搅拌下，慢慢地加入HCl，保持反应混合物的内部温度低于约-50℃。在结束反应期间较高的温度导致外消旋化。加入浓HCl调节pH值到约6-7.5之间。滤出沉淀出的任何固体。因为较高的温度将使杂质溶解，所以更优选在冷的温度下并用硅藻土迅速地过滤。然后固体用MTBE洗涤。滤液用MTBE和HCl稀释，并搅动至少约15分钟。应该检测pH值以保证pH值在大约1-2之间。分出有机层后，通过手性HPLC检查手性纯度。如果要求得到手性纯产品，则在此步骤手性纯度应该为约98％。优选用1M HCl洗涤有机层，搅动约15分钟分出并该层。优选用饱和碳酸氢钠溶液洗涤有机物，搅动至少约15分钟并分出该层。然后有机层优选用盐水洗涤。分出有机层，然后优选用无水硫酸镁干燥、过滤并在真空下汽提除去溶剂和未反应的乙酸叔丁酯。保持高真空至少约20小时以确保乙酸叔丁酯和硅氧烷的除去。在此步骤中，可以分析产品的纯度。如果产品纯度明显地小于约90％纯，产品可以使用20％乙酸乙酯/己烷用硅胶色谱分离。在这些优选条件下，可得到收率在60和88％之间的化合物XIV。
将式XIV的化合物通过其与式XVI化合物反应转化为式XV化合物可以通过使用任何适宜的方法试剂和反应条件进行反应；该一般方法的例子在下文中公开：R.V.Hoffman and J.Tao，Tetrahedron，Vol.53，No.21，pp.7119-7126，1997，其在此全部引入作为参考。优选，使用以下公开的方法和全部或一些试剂和反应条件。如此，优选式XIV的化合物首先与碱金属氢化物起反应，更优选该碱金属氢化物为氢化钠，然后再与式XVI的化合物反应。与碱金属氢化物的反应在约0℃和3℃之间实施。在向反应混合物中加入式XVI的化合物期间保持试剂在约0-5℃，然后经过至少约2小时的时间将反应混合物慢慢地升温至室温。
任何适宜的氢解方法可用来将化合物XV转化为化合物XVII。优选，使用在压力下的钯氢解。
任何适合的反应条件可用于化合物XVII的酰化作用。优选，使用的在下文中公开的方法和一些或全部试剂和反应条件。因而，优选将式XV的化合物粗品溶于二氯甲烷，并通过任何合适的方法冷却至约0℃(内部温度)，例如在氩气覆盖下使用冰/盐浴。该溶液用在液体状态下的式R20-X的化合物处理。更优选，R20-X为R20-Cl。然后慢慢地加入二异丙基乙基胺。将反应慢慢地升温至室温。该反应可以通过TLC并最终通过HPLC监控。通常该反应应该在约1小时之内完成。用HCl处理反应，除去水层，有机物用HCl反萃取。除去水相，然后有机物用饱和碳酸氢盐萃取。有机物优选用硫酸钠干燥。然后过滤产品并在真空下浓缩。
任何适宜的酶水解方法可用来将化合物XVIII转化为化合物IIA。然而，本发明公开了与在标准条件下的水解相反，使用酶水解是重要的，因为它可产生在与R7和R8基团连接的碳上小于5％差向异构体的化合物IIA。任何适合的仪器可用于酶水解步骤。优选使用一种连续膜反应器。更优选，使用在下文中公开的本发明的连续膜反应器。
优选，使用猪的胰脏的脂酶作为水解化合物XVIII的酶。更优选，在pH值约7.2，在约37-40℃的温度下进行酶水解。
本发明另一方面公开了式IIA的化合物的制备方法，该方法包含以下步骤：
(a)将通式XIX的化合物通过其与1，1’-羰基二咪唑反应随后用乙酸叔丁酯的烯醇锂处理，转化为通式XX的β-酮酯；
(b)将式XX的化合物通过其与式XXII的化合物在适宜的反应条件下反应，转化为式XXI的化合物；
Figure A0081201100511
(c)氢化通式XXII的化合物得到通式XXIII的化合物；以及
(d)将通式XXIII的化合物通过其与通式R20-X的化合物(其中X为任何合适的卤原子)在适宜的条件下反应进行酰化，得到通式IIA的化合物。
优选，用于通式XIX的化合物至通式XX的化合物转化的方法使用以下公开的一些或全部试剂及反应条件。因而，优选在室温下将通式XIX的化合物溶于THF，然后向该溶液中加入1，1’-羰基二咪唑。得到的混合物于室温搅拌约1小时，得到酰基咪唑中间体溶液。
在单独的容器中，慢慢地将邻乙酸苄酯加到LiHMDS在THF的溶液中形成一混合物。反应为放热的，因此温度优选保持在低于-70℃。搅拌混合物约30分钟后，慢慢地向其中加入酰基咪唑溶液形成反应混合物。反应为放热的，因而，反应混合物的温度优选保持在低于约-68℃。可以使用任何合适的方法冷却反应混合物。例如，冷却方法可以是干冰浴。搅拌至少约55分钟后，将反应混合物从冷却装置处移走。向反应混合物加入一种酸以终止该反应。更优选，该酸为1M HCl，慢慢地加入该酸，在加入酸期间反应混合物的温度保持在低于约25℃。然后分出终止反应的反应混合物的有机层并洗涤。更优选，有机层用饱和碳酸氢钠和盐水洗涤。然后干燥有机层并浓缩以得到通式XX的化合物。更优选，使用硫酸镁作干燥剂。为防止通式XX的化合物分解，该化合物更优选保存在冰箱中。
优选，通式XX的化合物至通式XXI的化合物转化的方法使用以下公开的一些或全部试剂及反应条件。因而，优选将通式XX化合物慢慢地加到NaH在THF中的溶液中。更优选，当向其中加入通式XX的化合物时NaH在THF中的溶液保持在约-10℃。通式XX的化合物向溶液加入完成后，将反应混合物温热大约20分钟。然后向反应混合物中加入通式XXII的化合物的二氯甲烷溶液。反应的进程可以通过使用任何适宜的方法观测起始原料的消失来监控。例如，反应的进程可以通过HPLC监控。搅拌反应混合物约48小时，然后向其中加入MTBE。向反应混合物加入适宜的酸，然后分出水层，并用MTBE提取。更优选，酸为1M HCl。然后合并有机层，干燥，过滤并浓缩以得到通式XXI的化合物。更优选，合并的有机层用硫酸镁干燥，并用短硅胶塞过滤。
优选，通式XXI的化合物转化为通式XXIII的化合物的方法使用以下公开的一些或全部试剂及反应条件。因而，优选将通式XXI化合物溶于THF和浓酸的脱气混合物中。更优选，浓酸为硫酸。向反应混合物中加入10％Pd-C，然后在大约50 psi压力下在Parr搅拌器中搅拌混合物约5小时。然后将混合物溶于甲醇，通过硅藻土滤过，得到通式XIII的化合物。
优选，通式XXIII的化合物转化为通式IIA的化合物的方法使用以下公开的一些或全部试剂及反应条件。因而，优选将通式XXIII的化合物溶于二氧六环，随后在0℃下加入二异丙基乙胺形成悬浮液。在类似的温度下将通式R20-X的化合物的二氧六环溶液加入到该悬浮液中形成反应混合物。更优选，R20-X为R20-Cl。然后将反应混合物搅拌至少约1小时。然后，向反应混合物中加入二氯甲烷，依次用1M HCl、饱和碳酸氢钠洗涤反应混合物，用硫酸镁干燥并通过一短的硅胶塞过滤得到通式IIA的化合物。
然后，通式IIA的化合物可用为本领域普通技术人员所知的任何方法纯化。例如，该化合物可以用重结晶和/或色谱法纯化。
本发明还涉及制备通式XXII化合物的改进方法。如上述所公开，通式XXII的化合物为用于制备通式IIA的化合物的方法中使用的一种重要的原料。制备通式XXII的化合物的方法包含：
(a)通式XXIV的化合物与三乙胺和溴化苄反应得到通式XXV的化合物；以及
(b)将通式XXV的化合物转化为通式XXII的化合物。
优选，通式XXIV的化合物转化为通式XXV的化合物的方法使用以下公开的一些或全部试剂及反应条件。因而，优选将通式XXIV的化合物溶于丙酮，随后在低于约30℃的温度下缓慢加入三乙胺形成反应混合物。然后向反应混合物中加入溴化苄，搅拌至少约65小时。然后向反应混合物中加入MTBE，并搅拌约5分钟。通过一短的硅胶垫过滤反应混合物以除去从反应混合物中沉淀出的大部分三乙胺盐。然后用MTBE洗涤硅胶，合并滤液。然后洗涤合并的滤液。更优选，滤液用1M HCl，饱和碳酸氢钠和盐水洗涤。
然后用硫酸镁干燥滤液，用短的硅胶垫过滤并浓缩得到通式XXV的化合物。式XXV的化合物可以重结晶得到结晶的产品。
优选，通式XXV的化合物转化为通式XXII的化合物的方法使用以下公开的一些或全部试剂及反应条件。因而，优选将通式XXV的化合物溶于二氯甲烷并冷却至约-10℃。尽管任何适宜的离去基团可以被通式XXV化合物的羟基取代以得到通式XXII的化合物，优选该离去基团为-OTf。因此，更优选向通式XXV的化合物的二氯甲烷溶液中加入Tf2O，随后缓慢的加入2，6-二甲基吡啶。因为反应为放热的，因而，反应混合物的温度优选保持在低于约-8℃的温度。一旦向反应混合物加完2，6-二甲基吡啶，搅拌反应混合物并将其温热大约1小时。然后反应混合物在房间真空(house vacuum)下浓缩。然后将通常以油的形式存在的粗产品溶于己烷并在干冰上搅拌沉淀出二甲基吡啶鎓盐。然后通过一薄层硅胶过滤除去沉淀。然后浓缩滤液以得到通式XXII的化合物，其中离去基团Lv为-OTf。
本发明还涉及分别落在通式IIA；XVIII；XVII；XV；IIIB和IIIA范围的新的化合物。以下所述的这些特别化合物是本发明方法中特别有用的中间体，以合成通式I的特别有效的抗细小核糖核酸病毒化合物，包括AG7088：
本发明的另一方面涉及制备落于通式XXIV和XVI范围内的化合物的改进的方法，涉及在本发明方法中用于制备通式IIA的化合物的关键试剂。
这些的第一种是用于制备落于通式XXIV化合物范围内的通式VII化合物的方法和任选地将通式VII的化合物转化为通式XVIA的化合物的方法，这些化合物的范围与通式XVI的化合物相重叠：
Figure A0081201100551
其中R10是卤素或烷基；该方法包含以下步骤：
步骤A：将通式VI的化合物转化为通式V的化合物，包含以下子步骤：
(a)通式VI的R10取代的苯甲醛：
Figure A0081201100552
与乙内酰脲在水介质中、在催化剂的存在下于回流温度下反应形成反应混合物；
(b)将该反应混合物在回流温度下用过量碱金属氢氧化物处理，形成碱金属氢氧化物处理的溶液；
(c)向碱金属氢氧化物处理的溶液中加入碱金属卤化物得到溶液；
(d)用浓酸酸化该溶液得到通式V的沉淀；
以及
(e)任选地用洗涤试剂洗涤通式V的沉淀；
步骤B：酶催化还原通式V的化合物得到通式VII的化合物；
任选的步骤C：通过通式VII的化合物与通式R”-OH的化合物反应(其中R”是烷基或芳基)酯化通式VII的化合物得到通式XII化合物；以及
任选的步骤D：转化通式XII的化合物得到通式XVIA的化合物。
因而，本发明公开了R10取代的苯甲醛与乙内酰脲在水介质中，在催化量的一级或二级胺的存在下，在回流下反应至少约4小时(取决于所使用的胺)得到R10取代的5-苯亚甲基乙内酰脲。优选胺具有高于所用的水介质的沸点。特别优选的胺是1-氨基-2-丙醇。当使用1-氨基-2-丙醇胺作为催化剂时，使用水作为水性溶液，R10取代的苯甲醛与乙内酰脲及催化剂的摩尔比是1∶1∶0.1，反应在约4小时完成。
根据本发明，R10取代的5-苯亚甲基乙内酰脲可以被过量的碱金属氢氧化物水解。优选，使用的碱金属氢氧化物为氢氧化钠。当1-氨基-2-丙醇用作催化剂时，氢氧化钠与乙内酰脲各自的摩尔比为5∶1，且反应在回流下进行，该反应在约50分钟内完成。
本发明还公开了向碱金属氢氧化物处理的溶液中加入碱金属卤化物可增加R10取代的苯丙酮酸碱金属盐一水合物在酸化下的沉淀。优选地，使用的碱金属卤化物为氯化钠。当使用氯化钠时，在pH值约8.5的情况下，几乎所有的苯丙酮酸钠都以苯丙酮酸钠一水合物的形式沉淀出来。
优选地，洗涤收集的苯丙酮酸碱金属盐一水合物沉淀以除去过量杂质，且便于所要求的干燥过程。可以选择任何本领域已知的适合的洗涤试剂，优选选择伯醇作为洗涤试剂，更优选洗涤试剂为甲醇，因为苯丙酮酸碱金属盐一水合物沉淀微溶于其中。
任何本领域已知的适宜的酶可以用于步骤B以催化通式V的化合物的还原反应。优选还原反应由甲酸脱氢酶和乳酸脱氢酶催化。
可以使用任何本领域已知的适宜的酶催化还原法。优选使用膜-密封酶催化方法(“MEEC方法”)或共固定化方法。这些一般方法为本领域已知的。例如，见Bednarski等人，J.Am.Chem.Soc.1987，109，1283-1285，关于膜-密封酶催化的综述。还可见Pollak等人，J.Am.Chem.Soc.1980，102，6324-6336，关于共固定化方法的综述。这些文章在此全部引入作为参考。然而，当酶催化还原反应的步骤B的规模超过小规模制备，优选使用连续膜反应器。更优选使用本发明的连续膜反应器。当使用本发明的连续膜反应器时，优选使用全部或部分以下的试剂和条件：1％NAD，4当量甲酸铵，用于流出物时pH值为7.3-7.4和用于底物时pH值为6.2-6.3，FDH/LDH＝20/200(U/mL)和使用1mM巯基乙醇。
如果使用共固定化方法，优选分四步进行。第一步为N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺的制备。第二步为用于共固定化方法中的共聚物的制备。优选该共聚物为PAN 500，其可以通过游离基共聚制备。本领域普通技术人员应认识到PAN 500为丙烯酰胺和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺的水溶性共聚物，当用过量乙胺水溶液处理干燥的聚合物时每克可释放500(±25)μmol的N-羟基琥珀酰亚胺。第三步为酶的共固定化。优选如上述公开的，该酶为甲酸脱氢酶和乳酸脱氢酶。第四步为酶催化还原通式V的化合物，得到通式VII的化合物。
通式VII化合物可以在该方法的此步骤中分离，并用于上述公开的通式IIA的化合物的制备方法中。任何适合的方法可用来分离和纯化通式VII的化合物。任选地，可如以下公开的，用通式VII的化合物来制备通式XVIA的化合物。
本发明还公开了，如果需要通式VII的化合物的对映体形式，在步骤B中使用D-乳酸脱氢酶可得到通式VIIA的对映体：
类似地，在如上所述的步骤B中使用L-乳酸脱氢酶将得到通式VIIB的对映体：
任选的步骤C的酯化反应可以用任何适宜的试剂和条件进行。优选该酯化在大约室温、在盐酸和二氧六环的存在下进行。
类似地，对映体VIIA和VIIB可以通过相同的酯化方法分别转变为对映体XIIA和XIIB：
任何适宜的方法可能用来在本方法的可选择的步骤D中将通式XII的化合物转化为通式XVIA的化合物。例如适宜的方法公开在以下文献中：Efffenberger等人，J.Liebigs.Ann.Chem.1996，314，和“Peptidomimetics Protocols”，Hoffman等人，Human Press，NJ，U.S.A；1999，pp 103-124。这些文献在此引入作为参考。
利用前述的任选步骤D，可将对映体XIIA和XIIB分别转变为对映体XVIB和XVIC：
Figure A0081201100591
用于制备通式VII和XVIA的化合物的第二种方法包含以下步骤：
步骤A’将丝氨酸转化为通式VII的化合物，包含以下子步骤：
(a)通过标准方法将丝氨酸转化为缩水甘油酸钾盐；
(b)任选地将缩水甘油酸钾盐转化为缩水甘油酸；以及
(c)用通式R10-苯基-Q的化合物进行区域选择性环氧化物开环反应；其中Q为活化的溴化物，硫酸盐(酯)，或一级碘化物；
任选的步骤B’：通式VII的化合物到通式XII的化合物的酯化通过通式VII的化合物与通式R”-OH的化合物反应进行，其中R”为烷基或芳基；以及
任选的步骤C’：将通式XII的化合物转化为通式XVIA的化合物。
因此，此方法步骤A’的子步骤(a)要求通过标准方法将丝氨酸转化成缩水甘油酸钾盐。可以使用任何本领域已知的标准方法。例如：Larcheveque等人，Tetrahedron Lett.1987，28，1993-1996，公开了从丝氨酸制备缩水甘油酸钾盐。此参考文献在此全部引入作为参考。
优选丝氨酸与硝酸在适宜的温度起反应得到2-溴-3-羟基丙酸。更优选亚硝酸包含硝酸钠和溴化氢的混合物，且该反应在约-10℃和室温之间，在碱金属卤化物的存在下进行。可以使用任何本领域已知的适宜的碱金属卤化物。然而，优选碱金属卤化物为溴化钾或溴化钠。
然后2-溴3-羟基丙酸通过与氢氧化钾反应转变为缩水甘油酸钾盐。优选该反应在约-40℃到室温之间的温度进行。
当按本发明使用优选条件和试剂时，用丝氨酸可得到收率65-70％的缩水甘油酸钾盐。
本发明还公开了在如上所述的方法中使用对映体的L-丝氨酸或D-丝氨酸为起始物料将分别得到D-缩水甘油酸钾和L-缩水甘油酸钾。
用上述公开的方法得到的缩水甘油酸钾可以直接地转化为通式VII的化合物。缩水甘油酸钾与通式R10-苯基-Q的化合物反应将导致区域选择性环氧化物开环反应。优选Q为-MgBr基团，区域选择性开环反应在约-10℃到室温下在碘化铜的存在下进行。
钾没有直接地转化到通式VII的化合物中，而是缩水甘油酸钾可能在通过如上所述的环氧化物开环方法转变为通式VII的化合物之前首先转变为缩水甘油酸。
缩水甘油酸钾可以通过任何为本领域普通技术人员所知的方法转变为缩水甘油酸。优选缩水甘油酸通过缩水甘油酸钾与浓硝酸反应制备。
如果在如上所述的方法中使用对映体的缩水甘油酸钾，将合成相应的通式VII的对映体化合物。例如，如果使用D-缩水甘油酸钾，将形成通式VIIA的化合物。类似地，如果使用L-缩水甘油酸钾，将形成通式VIIB的化合物。
在此步骤中，通式VII的化合物可以被分离用于以上公开的方法，用于制备通式IIA的化合物。或者，通式VII的化合物可以被用于以下公开的方法，以用于制备通式XVIA的化合物。
任选步骤B’和C’分别相当于用于从通式VI的化合物合成通式XVIA的化合物的第一种公开方法的任选步骤C和D。因而，以上用于任选步骤C和D所公开的优选方法，试剂和反应条件同样优选用于任选步骤B’和C’。
用于制备落在通式XVIA范围内的化合物，特别是通式XVIB的化合物的第三种方法包含以下步骤：
步骤A″：从通式IX的化合物制备通式XIIA的化合物包含以下子步骤：
(a)通式IX的化合物不对称二羟基化形成通式XA的化合物：
Figure A0081201100611
(b)通式IX的化合物与1，1’-羰基二咪唑在甲苯的存在下反应形成通式XI的化合物；及
(c)通式XI的化合物的钯-催化还原；以及
步骤B″将通式XIIA的化合物转化为通式XVIB的化合物。
优选不对称的二羟基化在大约室温下进行的Sharpless不对称二羟基化。不对称二羟基化，包括Sharpless不对称二羟基化在以下文献中有论述：Kolb等人，Chem.Rev.1994，94，2483-2547。此参考文献在此全部引入作为参考。
优选通式IX的化合物与CDI在甲苯的存在下的反应在大约80℃进行。
优选钯催化还原步骤，步骤A″(c)，在甲酸的存在下在大约室温下通过通式XI的化合物与氢、钯和碳的混合物反应进行。
步骤B″相当于用于从通式VI的化合物合成通式XVIA的化合物的第一种公开方法的任选步骤D。因而，用于任选步骤D所公开的相同的方法，试剂和反应条件同样优选用于步骤B″。
本发明还涉及以上所述的属于通式IV定义的范围内的通式IVA的化合物。因此，通式IVA的化合物还将是用于制备通式I的化合物的本发明方法的有用中间体。
因而，本发明涉及通式IVA的化合物：Y为OH、OSO2CF3、OSO2CH3、OSO2(对甲苯基)，卤化物或其它任何离去基团；且R’为H，烷基或芳基。
优选R10为4-氟代基团，Y为OH或OTf，且R’为OH或Me。
正如以上的讨论，本发明还涉及可用于本发明的方法的连续膜反应器。特别地，本发明的连续膜反应器适用于其中使用比较大的分子的催化剂的任何反应，例如酶和固定催化剂。这样的催化剂的实例公开在：Rissom等人，Tetrahyedron：Asymmetry，1999，10，923-928；Schmidt等人，J.Biotechnology，1992，24，315-327；和Lin等人，Biosci.Biotech.Biochem.，1997，61，2029-2033。上述的参考文献在此公开作为参考。更特别地，本发明的连续膜反应器可用于其中需要重复利用催化剂的那些催化反应中。例如，本发明的反应器可用于使用化学的或者生物催化剂的酶催化还原反应。
具有反应器体积的本发明的连续膜反应器包含一个切向流动过滤装置，一个反应器环型管道以循环试剂通过切向流动过滤器，和一个底物进料泵用于将底物进料到反应器环型管道中，其中反应器环型管道包含：
(a)管道；和
(b)循环泵。
切向流动装置包含切向流动膜过滤器和用于安置过滤器的装置。可以使用任何适宜的切向流动设备。适宜的切向流动装置为允许目标产品经过或渗透通过它，而将催化剂的大分子保留在反应器中的装置。切向流动装置的优选实例为可由Millipore公司商购的Pellicon 2Module。Pellicon 2 Module使用盒式切向流过滤装置，可容易地扩大反应规模。具体地说，即可以使用单一的Pellican 2盒，也可以将一连串盒结合使用以便运行大规模的反应。因而，使用切向流动盒体系允许流体体积从小于一升到高至数千升。
大多数催化反应发生在其中的反应器环型管道，具有一内容积。内容积通过反应器环型管道可以容纳的试剂和催化剂的体积定义。反应器体积通过反应器环型管道与切向流动装置结合可以容纳的试剂和催化剂的体积定义。本发明反应器的反应器环型管道的内容积至少为约50％反应器体积。优选反应器环型管道的内容积至少为约60％反应器体积。更优选反应器环型管道的内容积至少为约70％反应器体积。更加优选反应器环型管道的内容积至少为约80％反应器体积。在本发明的一个更优选实施方案中，反应器环型管道的内容积至少为约90％反应器体积。在本发明的一个更优选实施方案中，反应器环型管道的内容积至少为约95％反应器体积。
反应器环型管道包含任何适宜尺寸的管道，并由任何适宜的材料制造。优选反应器环型管道包含挠性的管路。挠性管路允许将管路切割到任何需求长度，作为容易地改变反应器体积的一种方法。适宜的管路材料的实例包括聚乙烯、聚丙烯、聚氨酯、聚乙烯、乙烯树脂、聚酰胺、丁烯聚合物、聚硅氧烷PTFE、ETFE、PFA、Viton、不锈钢、玻璃、PVDF、Teflon、烷基聚合物、和全氟材料。Viton可从DupontDow Elastomers LLC商购，包含67％氟化热定型橡胶。Teflon可从EIDupont deNemours & Co.商购的，并包含四氟乙烯。当本发明连续膜反应器用于本发明的方法进行酶催化还原时，已发现PVC、Tygon和任何氯化聚合物破坏或钝化酶，因此为不适宜的材料。而且，虽然聚硅氧烷管路没有发现因相同的问题而使酶损害，可是聚硅氧烷当用于本发明的方法时易于膨胀，这将导致由于驻留时间的改变而造成的反应条件的波动。
任何适宜的循环泵和底物进料泵可以用于反应器环型管道。适宜的循环泵的实例包括蠕动泵、波纹管泵、隔膜泵、渐进腔泵、活塞泵、挠性直线泵、下垂圆盘泵、膜式泵、旋转叶型泵、挠性推动器、转动叶片泵、或任何变速低剪切型泵。优选使用蠕动泵、挠性直线泵、下垂圆盘泵、或隔膜泵。循环泵或底物进料泵不宜为齿轮泵。
为了本发明的连续膜反应器的有效运行，底物进料泵在比循环泵更大的速度下运行。例如，当连续膜反应器和本发明的方法一起使用时，如果底物进料泵设置在快于循环泵约二十倍的速度，反应可最有效地进行。
在本发明的连续膜反应器的一个优选实施方案中，反应器环型管道还包含以下的任一项：泡沫阱，压力计，pH值监控器，热交换器，和闸阀。在另一优选实施方案中，连续膜反应器包含一个或多个包含底物进料泵的底物进料管线，以及更优选包含一个止回阀，一个无菌过滤器，和一个压力计。增加超过一个的进料管线允许一个用于底物的进料，及其它管线用于其它目的，例如卫生的目的。对每个进料管线增加一个无菌过滤器帮助在它们进入反应器之前除去微粒和微生物。不需要的微粒可以阻塞切向流动过滤装置中的膜孔，而微生物可以杀死某些酶。增加热交换器可用于保持或改变反应温度。
在图表1中描述了一种优选的连续膜反应器。本发明一个更优选的连续膜反应器在图2(部分1和2)中描述。
表1：图2中描述的连续膜反应器的部件列表
Figure A0081201100651
psi；甘油填充；精密度±3％
    16 蠕动管路 过氧化物处理的聚硅氧烷 0.19”内径  Cole Parmer
    17 带有蠕动泵头#77201-62的挠性控制变速驱动#77200-12 316 SS滚子 流速10-333mL/min(与#16配套)  Cole Parmer
    18 带有蠕动泵头的挠性控制仪表板驱动#77201-60 316 SS滚子 流速0.2-20mL/min(与#19配套)  Cole Parmer
    19 蠕动管 铂处理的聚硅氧烷 0.06”内径  Cole Parmer
    20 水管倒钩到插入式NPT的接头 PVDF 3/8”外径×”NPT  Cole Parmer
    21 管路 过氧化物处理的聚硅氧烷 3/8”内径  Cole Parmer
    22 卫生法兰到水管倒钩的接头 PVDF 31/32”×3/8”外径  Cole Parmer
    23 到过滤器的泵管线 合成橡胶 ”内径  Cole Parmer
    24 T型热电偶和数字显示装置 Teflon涂覆的304SS ”外径  J-KEM
    25 插入内螺纹UNF的适配管 Teflon ”外径×”28UNF  Cole Parmer
    26 外螺纹NPT的内接头 PVDF ”NPT  Cole Parmer
    27 外螺纹NPT到内螺纹NPT的接头衬套 PTFE ”NPT×”NPT  Cole Parmer
Figure A0081201100671
    42 热交换器-在两头带有管配件的改进的graham型冷凝器 玻璃 38cm内部×47cm总长；反应器体积80mL×冷却体积510mL San     DiegoGlass Tech
    43 管 合成橡胶 ”内径 Cole Parmer
    44 刚性管 PTFE ”内径×5/16”外径 Cole Parmer
    45 机械搅拌器 玻璃/聚四氟乙烯 按需要 Chem Glass
    46 气体扩散器 玻璃 Coarse frit Chem Glass
    47 管 Tygon R3603 5/16”内径 Fisher
    48 带数字显示的PH探针；pn 59002-02 密封硅胶填充 ”×4” Cole Parmer
    49 管 合成橡胶 ”内径 Cole Parmer
    50 反应器主要环形管(管子) 合成橡胶 ”内径 Cole Parmer
以下提供的实施例是以说明本发明为目的，并不用于限制如附加的权利要求所定义的本发明的保护范围。
实施例：
以下反应路线图描述了使用本发明的各种方法制备本发明的各种化合物。特别地，这些反应路线描述了以下实施例的制备方法。反应路线1反应路线2
Figure A0081201100692
反应路线3反应路线4
Figure A0081201100702
反应路线5
Figure A0081201100703
反应路线6反应路线7反应路线8
Figure A0081201100721
反应路线9
Figure A0081201100722
反应路线10反应路线11
Figure A0081201100731
以下实施例更充分地描述了使用本发明的方法制备本发明的化合物。
实施例1
通过重氮化作用制备化合物1A。(见反应路线1的结构1A)原料                    来源      数量     MW      Moles4-氟-D-苯丙氨酸盐酸盐   1443-057  380g     219.5   1.731M H2SO4(389mL 98％硫酸在6.85L水中)            Stock     7.24L    --      7.2499.99％亚硝酸钠         Aldrich   477.5g   69.0    6.92硫酸镁                  Fisher    100g     --      --甲基叔丁基醚(MTBE)      Fisher    3.6L     --      --二氯甲烷                Fisher    1L       --      --己烷                    Fisher    2L       --      --
方法：
在12L反应器中，将4-氟-D-苯丙氨酸盐酸盐(380克)溶于7.24升1M硫酸中。该溶液用丙酮/冰冷却到-5℃。然后向溶液中慢慢地加入亚硝酸钠(477.5克，溶于730毫升水中)，保持温度等于或低于0℃。加入时间一般为3小时。将该溶液在0℃持续3小时以上。在加料期间和以后保持0℃至少规定的时间是很重要的。反应混合物然后用约5小时升温到室温并存放过夜。在此步骤中可见白色固体产物漂浮在反应混合物中。该产物用MTBE萃取三次(每次萃取使用1.2升MTBE，记住每次有力地搅动混合物至少15分钟)。将有机提取液用100g无水硫酸镁干燥，然后过滤。将产物汽提干燥(1H NMR表明至少70％纯度)。在此步骤中，得到～380.5克粗产品。将粗品固体1A在1升二氯甲烷和2升己烷中处理并使其回流(42℃)。在良好的搅动下回流2小时，然后冷却到环境温度。然后在环境温度下另外搅拌2小时。过滤后用2∶1己烷/二氯甲烷淋洗滤饼。该反应得到148克(46％)化合物1A；手性HPLC纯度＞97％；1H NMR(CD3OD)δ7.25-7.00(m，4H)，4.50(AB四重峰，J＝8Hz，J＝4Hz，lH)，3.15(dd，J＝14Hz，J＝4Hz，1H)2.95(dd，J＝14Hz，J＝8Hz，1H)。
实施例2
酶催化还原制备1A：
步骤A-化合物3的制备。(见反应路线2的结构3)原料            来源      数量      MW        Moles4-氟-苯甲醛     Aldrich   115.92g   124.11    0.934乙内酰脲        Aldrich   93.53g    100.08    0.9341-氨基-2-丙醇   Aldrich   7.01g     75.11     0.0934氢氧化钠        Fisher    187g      40.00     4.68氯化钠          Fisher    108.9g    58.44     1.86浓HCl(37％)     Fisher    311mL     --        --
方法：
将4-氟苯甲醛、乙内酰脲和1-氨基-2-丙醇(10％)在水(235毫升)中的混合物回流4小时(130-135℃)。该混合物用935克20％热的氢氧化钠水溶液(187克NaOH，4.68摩尔)处理并回流50分钟。然后将该混合物冷却到0℃并加入108.9克氯化钠。在0℃使用浓HCl(37％，大约311毫升)调节溶液的pH值至约8.5，然后过滤。将母液放置过夜并再次过滤。合并得到的沉淀并用甲醇(约5L)洗涤，得到HPLC纯度＞80％。(注解：此盐的纯度对接下去的酶促反应是足够的，但可以用过量甲醇洗涤以得到更高的纯度)。将该沉淀在真空箱中干燥得到白色一水合物钠盐3：产率70-75％。元素分析C9H6O3Fha.H2O计算值：C，48.66；H，3.63.实测：C，48.64；H，3.74。1H NMR(D2O)δ7.02-7.19(m，4H)，4.72(s，2H)(注解：此盐应该保存在冰箱中以防止分解)。
步骤B-由3制备1A
可以使用MEEC方法(方法B1)，也可以使用共固定化方法(方法B2)来制备1A。
方法B1：使用MEEC方法制备1A原料                       来源(编号)       数量     MW      Moles化合物3                    --               11.1g    222     0.05D-乳酸脱氢酶(D-LDH)        Sigma(L 9636)    1900U    --      --甲酸脱氢酶(FDH)            Sigma(F 8649)    125U     --      --NAD                        Sigma(N 7004)    334mg    663.4   0.0005甲酸钠                     Sigma(S 2140)    10.25g   68.01   0.15巯基乙醇                   Sigma(M 6250)    39mg     78.13   0.0005Trizma盐酸盐               Sigma(T 6666)    400mg    157.6   0.0025EDTA                       Sigma(E 1644)    186mg    372.2   0.0005DL-二硫苏糖醇              Sigma(D 5545)    --       --      --透析膜(MWCO12,000-14,000)  VWR(25218-435)   --       --      --
方法：
将3、甲酸钠、巯基乙醇、Trizma盐酸盐和EDTA溶于去离子水(500毫升)中，该溶液用氩气脱气约30分钟。用NaOH(1.0M)调节该溶液pH值为约7.5，并加入NAD(1％)。将四个透析管(每个大约4厘米长)用去离子水淋洗，且每个管子的一端用线结扎。将FDH和D-LDH溶于8毫升等分的反应混合物中，并用Eppendorf移液管转入4个管子中(每个大约2毫升)。扎紧管子的另一端，并悬浮在反应混合物中。(注解：小心的尽可能地排除空气，并保证没有渗漏)。将氩气平缓的吹入溶液以除去CO2。然后在室温下搅拌混合物3天，通过pH值-稳定仪控制地加入1M HCl保持pH值为7.5±0.1(通过HPLC测定，转化率＞95％)。然后除去透析管，继续在100毫升50mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液中搅拌约6小时(pH值7.5，5mM二硫苏糖醇)。(注意：装有酶的袋子可以在4℃在50毫升5mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH值7.5，5mM二硫苏糖醇)中存储再次使用)。将水层合并，通过慢慢地加入浓HCl调节溶液的pH值为3.0。该溶液用MTBE萃取(50×4毫升)，用MgSO4干燥并浓缩为粗品油。该油在250毫升己烷/二氯甲烷(2∶1)中固化并过滤。然后浓缩滤液，并在50毫升己烷/二氯甲烷(2∶1)中再次固化。合并白色固体并在真空箱中干燥得到白色固体1A：产量7.2-7.4克(78-80％)；HPLC纯度＞95％。
方法B2：使用共固定化方法制备1A
该方法分4步骤进行。第一步制备N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺。第二步通过游离基共聚合制备PAN 500。第三步为FDH和D-LDH的共固定化。最后一步为酶催化还原α-酮酸钠盐3得到1A。
步骤1：制备N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺。原料                      来源     数量    MW       Moles丙烯酰氯                  Aldrich  100g    90.51    1.10N-羟基琥珀酰亚胺          Aldrich  115g    115.10   1.00三乙胺                    Aldrich  110g    101.19   1.092，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)                     Aldrich  50mg    220.36   0.00023
方法：
在0℃下将N-羟基琥珀酰亚胺和三乙胺溶于1.5升氯仿中。于20分钟内滴加加入丙烯酰氯，并在0℃下另外搅拌20分钟。该溶液分次用冰冷的800毫升水和饱和盐水洗涤，然后用MgSO4干燥并过滤。向该氯仿溶液中加入50毫克BHT，浓缩至体积为300毫升并过滤。慢慢地，在搅拌下向溶液中加入30毫升乙酸乙酯和200毫升己烷，然后在0℃下放置2小时。过滤得到的白色固体，首先用冰冷的100毫升己烷/乙酸乙酯(4∶1)洗涤，然后用100毫升己烷/乙酸乙酯(9∶1)洗涤，最终用己烷(100毫升×2)洗涤。(注意：该材料对于在以下公开的PAN 500的制备中纯度是足够的)。结晶在真空箱中干燥得到N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺；产量115克(68％)；熔点68-70℃。1H NMR(CDCl3)δ6.0-7.0(m，3H)，2.85(s，4H)；FTIR(液体石蜡)1800，1775，1735，1260，995，870cm-1。
步骤2：PAN500的制备原料                    来源     数量    MW      MolesN-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺  ---      30g     169.1   0.178丙烯酰胺                Aldrich  275g    71.08   3.85AIBN                    Aldrich  1.75g   164.21  0.011THF                     Fisher   2.5L    ----    ----
方法：
向5升烧瓶中加入丙烯酰胺、N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺、AIBN和THF(2.5升)。该溶液在强烈搅拌下用氩气脱气30分钟，而后在50℃在氩气下回流24小时。(小心：反应在第1-2小时为放热的反应)。然后将其用1升THF处理并搅拌10分钟。滤出形成的沉淀并用THF洗涤(1升×4)。产品在真空箱中干燥得到PAN 500：产量～304克，极松散白色粉末。FTIR(液体石蜡)3340，3200，1730，1660，1210，1070cm-1。(注意：此聚合物应该保存在干燥器中)。
步骤3：FDH和D-LDH的共固定化。原料            来源     数量    MW      Moles三亚乙基四胺(60％，TET)     Aldrich  ---     146.24  ---MgCl2·6H2O  Sigma    50mg    203.3   0.24mmol丙酮酸钠        Sigma    50mg    110.0   0.45mmolNADH            Sigma    50mg    709.4   0.07mmol甲酸钠          Sigma    306mg   68.01   4.5mmolNAD            Sigma          111mg   663.4  0.17mmolFDH            Sigma(F 8649)  200U    ---    ---D-LDH          Sigma(L 2395)  5000U   ---    ---Hepes          Sigma(H 9897)  ---     ---    ---DL-二硫苏糖醇  Sigma(D 5545)  ---     ---    ---硫酸铵         Sigma          1.32g   132.1  0.01mol
方法：
在4℃下将5000U商购D-LDH在3.2M(NH4)2SO4中离心10分钟。将得到的沉淀溶于3毫升0.3M Hepes缓冲液(pH值7.5)，并在氩气下用500毫升50mM脱氧Hepes缓冲液(pH值7.5)在4℃下搅拌透析过夜。向在500毫升烧杯中的该溶液中加入13.0克PAN500，向其中加入42毫升含有氯化镁、丙酮酸钠、NADH、NAD和甲酸钠的0.3M Hepes缓冲液(pH值7.5)。将混合物激烈搅拌1分钟，然后向混合物中加入DL-二硫苏糖醇(650μL，0.50M)和TET(5.53毫升，0.50M)。搅拌混合物1分钟，然后加入D-LDH和FDH。(注意：在大约再搅拌两分钟后混合物成凝胶)。该凝胶在室温下保持1小时，然后加入大约200毫升5mM Hepes缓冲液(pH值7.5，含有1.32克(NH4)2SO4)。将该凝胶在一韦林氏搅拌器中以低速破碎3分钟，而后以高速破碎30秒。离心分出凝胶颗粒，用20毫升50mMHepes缓冲液(pH值7.5)洗涤，并再次通过离心分离。
步骤4：使用共固定化方法制备1A原料               来源(编号)     数量    MW     Moles化合物3            --             11.10g  222    0.050PAN共固化的D-LDH和FDH                ---            ----    --     --NAD                Sigma(N 7004)  167mg   663.4  0.00025甲酸钠             Sigma(S 2140)  4.10g   68.01  0.060巯基乙醇           Sigma(M 6250)  19.5mg  78.13  0.00025Trizma盐酸盐       Sigma(T 6666)  150mg   157.6  0.00095DL-二硫苏糖醇      Sigma(D 5545)  ---     ---    ---
方法：
将3、甲酸钠、巯基乙醇、和Trizma盐酸盐溶于去离子水(500毫升)中，用氩气脱气该溶液30分钟。调节溶液pH值为约7.5，并加入NAD(1％)。加入FDH和D-LDH共固定化的PAN凝胶。向溶液中缓慢通入氩气鼓泡以除去CO2，然后将混合物在室温下搅拌5天，通过pH值-稳定仪控制地加入1MHCl保持pH值为7.5±0.1(通过HPLC测定，转化率＞91％)。(注意：使用过量的甲酸钠将导致较短的反应时间，见MEEC方法.)含有酶的凝胶通过离心分出，并用50ml份的脱气水洗涤两次。(注意：含有酶的凝胶可以在4℃在50毫升5mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH值7.5，5mM二硫苏糖醇)中存储再次使用)。
合并水层，通过缓慢地加入的浓HCl调节溶液的pH值为3.0。用MTBE萃取(50×4毫升)产物，用MgSO4干燥并浓缩得到油状粗产品。该油在250毫升己烷/二氯甲烷(2∶1)中固化并过滤。然后浓缩滤液，并在50毫升己烷/二氯甲烷(2∶1)中再次固化。合并白色固体，并在真空箱中干燥得到白色固体产物，化合物1A：产量7.2克(78％)；HPLC纯度＞95％。
实施例2A
用本发明的连续膜反应器通过酶催化还原制备1A：
步骤A-化合物3的制备。原料             当量           摩尔数  F.W.    量对氟苯甲醛(I)    1.0            20      124.11  2482g乙内酰脲         1.0            20      100.08  2002g1-氨基-2-丙醇    0.1            2       75.11   150g水               0.25L/mol的(I) ---     ---     5.0L氢氧化钠(小球)   5.0            100     40.00   4000g水               NaOH 5.0L/kg   ---     ---     20.0L氯化钠(颗粒)     2.0            40      58.44   2338gHCl(浓)          5.0            100     36.46   8.26L甲醇             3.33L/mol(I)   ---     ---     66.7L
万法：
向装有温度传感器、回流冷凝器、搅拌器和冷却盘管的50升反应器中加入2.482公斤对氟苯甲醛、2.002公斤乙内酰脲和150克1-氨基-2-丙醇的水溶液。加热得到的混合物并回流约10小时。该溶液通过HPLC(254nm)和1H NMR(醛的质子从10ppm移动到7.2ppm)同时监控对氟苯甲醛的消失。反应得到黄色的淤浆。该黄色淤浆的HPLC分析显示仅仅35％的转化率，然而，1H NMR显示90％的转化率。我们认为HPLC方法显示一种不正确的低转化率是由于苯甲醛的强发色团。
然后另外制备氢氧化钠在水中的溶液并加热至约98℃。然后将该溶液小心地加到该黄色的淤浆中。然后回流反应混合物约3小时，再将其冷却到室温。反应混合物再次通过HPLC(254nm)监控缩合中间体峰的完全消失。得到的反应混合物为透明的橙色/黄色溶液。
一旦反应混合物冷却至约20℃±5℃，加入氯化钠并搅动反应混合物。保持冷却水流量，同时插入一pH探针，向其中加入浓盐酸调节pH值至约8.0-8.5。当调节pH值时，通过调节酸加入的速度维持反应温度低于约30℃。约4小时后，得到的反应混合物为浅黄色淤浆，通过装有1号滤纸的平顶布氏漏斗过滤。然后将湿滤饼返回至50升反应器，向其中加入约33.35升甲醇进行洗涤，将其搅拌15分钟。再次用布氏漏斗滤出固形物，湿滤饼用相同的方法用约33.35升甲醇再次洗涤。
然后将得到的洗涤后的固体在恒温箱中于室温、房间真空度下干燥约四天，得到白色至近于纯白固体，化合物3。产品的HPLC(254nm)纯度＞80％，收率约75％。1H NMR(D2O)δ7.02-7.19(m 4H)，4.72(s，2H)。
步骤B-用本发明的连续膜反应器制备1A。原料          当量             微摩尔数  F.W.    量P2-羟基酸，3  1.0              1350      222.14  299.9g巯基乙醇      1.0mM            6.75      78.13   527mg+195mg甲酸铵        4.0              5400      63.06   340.5g水            5.0L/mol 3       ---       ---     6.75Lβ-NAD        0.01             13.5      663.4甲酸脱氢酶    20000 U/L反应物  ---       ---     4800单位  乳酸脱氢酶  400000U/L反应物  ---    ---    96000单位HCl(浓)     ----             ---    36.46  A.R.～450mLMTBE        6.5L/mol 3       ---    ---    8.78L盐水        1.1L/mol 3       ---    ---    1.49L硫酸镁                       ---    ---二氯甲烷    1.46L/mol 3      ---    ---    2.00L己烷        2.93L/mol 3      ---    ---    3.96L
方法：
确保连续膜反应器(240毫升)如图2(部分1和2)所示按照本公开所述组装，反应器用0.02％v/v过乙酸的水溶液洗涤，直至总共从渗透阀口除去2.5升洗液。然后，制备2.5升0.2μM过滤水和0.1mM巯基乙醇(195毫克)的溶液，并用于冲洗该反应器。
向12升带有塔顶搅拌器、酸度计和气体扩散管的圆底烧瓶中加入6.75升已经通过0.2μM或更细的过滤器滤过的水。然后用氩气吹扫烧瓶至少约30分钟。
然后向12升烧瓶中加入化合物3，并将其与甲酸铵和巯基乙醇一起溶解到脱气水中。保持氩气吹扫，搅拌所得溶液直至固形物全部溶解。一旦溶解后，用1N氢氧化钠调节溶液的pH值至约7.0。然后向反应溶液中加入β-NAD，并搅拌至固体溶解。调节pH值至约6.2以得到底物溶液。
然后用100毫升底物溶液溶解酶(甲酸脱氢酶和乳酸脱氢酶)，然后通过泵将它们通过底物进料管线加入到反应器中。泵送速度开始约为1.0毫升/分钟。小心地保持底物溶液的pH值在大约6.2。流出物(或渗透物)通过HPLC(254 nm)监控转化率。还经常检测流出物的pH值，这也有助于转化率的监测(应该为pH值＝7.3-7.4)。加料速度(泵送速度)根据需要调节以增加转化率和/或按照需要调节流量。
一旦底物已经完全进料通过反应器，得到的渗透液通过用浓盐酸酸化至pH值约3.0。得到的溶液然后用分成独立的三份MTBE萃取。MTBE萃取溶液用盐水洗涤，用硫酸镁干燥，过滤并在旋转蒸发仪上浓缩得到黄色油。
向该油中加入810毫升二氯甲烷直至该油全部溶解。向溶液中慢慢地加入1.62升己烷，然后加热溶液至回流，在搅动下冷却至10℃。
然后滤出固体产物并用1.2升2∶1的己烷∶二氯甲烷溶液洗涤滤饼。洗涤后的固体然后在房间真空度下于室温干燥三天，得到白色粉末。产率大约70％(HPLC纯度91％)，反应器生产能力为280g/(d×L)。
1H NMR(CD3Cl)δ7.25-7.00(m，4H)，4.50(AB四重峰，J＝4，8 Hz，1H)，3.15(dd，J＝4，14Hz，1H)，2.95(dd，J＝8，14Hz，1H)。相应样品的甲酯的对映体纯度为＞99.99％。(Chiralpak AS，4.6×250mm，10.0μm)。
实施例2B
用本发明的连续膜反应器由3制备1A：原料         当量               微摩尔数  F.W.    量酮酸盐，3    1.0                5400      222.14  1.2kg巯基乙醇     1.0mM              27        78.13   2.1g甲酸铵       4.0                21600     63.06   1.36kg水           5.0L/mol 3         ---       ---     27 Lβ-NAD       0.01               54        663.4   35.82g甲酸脱氢酶   20,000U/L反应物    ---       ---     30,900单位乳酸脱氢酶   400,000U/L反应物   ---       ---     618,000单位HCl(浓)      ---                ---       36.46   A.R.1650mLMTBE         6.5L/mol 3         ---       ---     35.1L盐水         1.1 L/mol 3        ---       ---     5.94L硫酸镁                          ---       ---二氯甲烷     1.46L/mol 3        ---       ---     7.88L己烷         2.93L/mol 3        ---       ---     15.8L
方法：
一旦具有1.545升容量的连续膜反应器按图2(部分1和2)所示组装完，该反应器用0.02％ v/v过乙酸的0.2μM滤过水的溶液洗涤，即水已经通过0.2μM或更细的过滤器滤过，直至约15升溶液从渗透阀口除去。然后该反应器用15升0.2μM滤过水冲洗。制备2.5升0.2μM过滤水和0.1mM巯基乙醇的溶液用于冲洗反应器。
向22升装有塔顶搅拌器、酸度计和气体扩散管的圆底烧瓶中加入9.0升0.2μM滤过水。然后用氩气吹扫烧瓶至少约30分钟。将400克的3溶解到含有甲酸铵和巯基乙醇的脱气水中。保持吹扫氩气，搅拌溶液直至固形物全部溶解。一旦固体溶解后，用1N HCl调节溶液的pH值至约6.26。然后向溶液中加入β-NAD，并搅拌溶液直至其溶解。保持得到的底物溶液pH值为约6.26。
然后将酶(甲酸脱氢酶和乳酸脱氢酶)溶于600毫升底物溶液中。然后将含有酶的底物溶液通过反应器的底物进料管线加料进入反应器。
将剩余的底物混合物以7.6毫升/分钟的速度泵送入反应器。小心地保持底物溶液的pH值在大约6.26，并保持轻微的氩气吹扫。流出物通过HPLC(254nm)监控转化率。还经常检测流出物的pH值，这也有助于转化率的监测(pH值应为7.3-7.4)。注意：加料速度可以根据需要调节以依照要求改变转化率或通过量。通过HPLC检测转化率为90-95％。
一种含有400克3的初始溶液已经装进反应器，用和如上所述一样的方法制备另一种含有400克3的底物溶液并泵送入反应器。重复上述制备直至总共使用了1.2公斤的3。在整个1.2公斤运行中，不必在反应器中使用另外的酶，且通过HPLC检测发现3到1A的转化率大于90％。
实施例3
2的制备：(见反应路线1，1A和2A的结构)
Figure A0081201100831
原料            来源      量       MW       摩尔数1A              1443-111  144g     184.2    0.781甲醇            Fisher    950mL    --       --4MHCl/二氧六环  Aldrich   18mL     --       --己烷            Fisher    300mL    --       --
方法：
将144g化合物1A在950mL甲醇和18mL 4M HCl/二氧六环中于常温下搅拌20小时。通过HPLC确定反应的完成。一旦反应完成，减压蒸出溶剂。浓缩的产物(在此步为油)用塔顶搅拌器剧烈搅动，同时向其中慢慢加入300mL己烷。维持搅拌30分钟。在此步骤中化合物2A为粉状的固体。将其冷却至10℃并过滤得到固体产物。而且，浓缩滤液后还得到4-5克纯净的产品。通过HPLC证实浓缩的滤液确实为纯净的产品，合并两种固体并在室温、真空下干燥(注意：另外，可用MTBE/饱和碳酸氢盐水溶液洗涤以除去从1A中携带的酸性杂质)，得到化合物2，141克(95％)；手性HPLC纯度＞97％ee。1H NMR(CDCl3)δ7.25-7.00(m 4H)，4.50(AB四重峰，J＝8Hz，J＝4Hz，1H)，3.82(s，3H)，3.15(dd，J＝13Hz，J＝4Hz，1H)，2.95(dd，J＝14Hz，J＝7Hz，1H)，2.85(br.s，1H)。(注：酶催化法导致化合物2A的纯度＞99.9％ ee)。
实施例4
1C的制备：(见反应路线5，2A和1C的结构)原料                 来源     量       MW       摩尔数2A                   --       200g     198.2    1.01MTBE                 Fisher   4L       ---      ---99.99％三氟甲磺酸酐  Aldrich  484g     202.1    1.712，6-二甲基吡啶      Aldrich  184g     107.1    1.711M柠檬酸             Stock    2×1L    ---      ---饱和碳酸氢钠         Stock    2×1L    ---      ---无水硫酸镁           ---      150g     ---      ---
方法：
在氮气氛下将200g化合物2A溶于4L MTBE并冷却至-10℃。通过加料漏斗于15分钟内加入三氟甲磺酸酐，随后慢慢的通过加料漏斗加入2，6-二甲基吡啶，期间保持内部温度低于3℃。然后在0℃搅拌混合物一小时，然后搅拌下加入1.9L水。再搅拌溶液15分钟。然后分出上面的有机层，并用1L(1M)柠檬酸洗涤两次，而后用1L饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次。然后用无水硫酸镁干燥，经硅藻土过滤，并在减压下汽提至得到化合物1C油，得到340g 1C(95％)；1H NMR(CDCl3)表明化合物纯度大于95％。(注：如果不是完全转化，根据转化的程度重复上述步骤)。在此重新操作进行完后分离产品，纯度＞95％(1H NMR确证)。该三氟甲磺酸盐(化合物1C)应该冷藏以防止分解。
实施例5
制备14的方法：(关于实施例5-9的化合物的结构见反应路线6)。原料              来源        量     MW      摩尔数Z-L-缬氨酸        Calbiochem  200g   251     0.796羰基二咪唑(CDI)   Aldrich     135g   162     0.836无水THF           Fisher      3.3L   ---     ---1M双三甲基甲硅烷基氨化锂的THF溶液(LHMDS的THF溶液)  Aldrich     2.78L  1M溶液  2.78乙酸叔丁酯        Aldrich     355g   116     3.061M HCl            Stock       10L    ---     ---MTBE              Fisher      8L     ---     ---饱和碳酸氢钠      Stock       4L     ---     ---盐水              Stock       2L     ---     ---无水硫酸镁        Fisher      300g   ---     ---
方法：
将200g Z-L-缬氨酸与CDI在3.3LTHF中于室温、氮气吹扫下搅拌约1小时。一小时后，咪唑酰胺形成完全。在12L反应器中，该反应混合物用2.78L 1M双三甲基甲硅烷基氨化锂的THF溶液在氮气处理，然后冷却至-70℃。然后在约1小时慢慢地加入乙酸叔丁酯(410g)并保持温度低于-60℃。然后将反应混合物在-60至-70℃搅拌30分钟。在氮气和良好的搅拌下并保持内部温度等于或低于-60℃，将以上步骤中制备的酸酐通过一加料漏斗慢慢地加入到烯醇酯中。一旦加料完全，将反应混合物在-60℃搅拌1小时。然后在剧烈搅拌下，保持内部温度低于-50℃慢慢地加入4.0L 1M HCl。在终止反应期间较高的温度将引起外消旋作用。向其中加入200毫升12M浓HCl调节pH值至6-7.5。从溶液中沉降出许多固体-主要为咪唑、夹杂的有机杂质和胺盐。用硅藻土滤出固形物。因为升高温度易于溶解杂质，过滤在冷却下进行并迅速地通过硅藻土。固形物用4L MTBE洗涤。滤液用2L MTBE和1M HCl(2L)稀释，并搅动15分钟。检测pH值确保其在1-2之间。然后分离有机层，用手性HPLC检测(应该＞98％)。有机层用1M HCl(2×2L)洗涤，并搅动15分钟，分出该层。有机物用2×2L饱和碳酸氢钠溶液再次洗涤，并搅动15分钟，并分出该层。有机相用2L盐水洗涤，分离该相，有机层用无水硫酸镁干燥。过滤干燥的有机层，在减压下汽提除去溶剂和未反应的乙酸叔丁酯，保持高真空(泵)至少20小时以确保除去乙酸叔丁酯和硅氧烷。少量样品用1H NMR(CDCl3)，TLC(1∶1己烷/乙酸乙酯)和HPLC分析。产品纯度应该接近于90％。否则，化合物用硅胶用20％乙酸乙酯/己烷进行色谱分离。在大多数情况下，化合物应该在规模扩大之前用10g的量在下一步之前进行使用试验(如以下实施例6所述)。注意：如果1H NMR检测仍然含有咪唑峰(在7.00(s)和7.62(s)ppm)，重新用2L MTBE处理，并用500mL 1N HCl洗涤两次，用500mL饱和NaHCO3洗涤两次，用500毫升盐水洗涤一次，并用MgSO4干燥。得到14,220g(79％)。如果要求得到化学纯的最终产品，最好不要着手下一步反应，除非化合物14的手性纯度超过95％。
实施例6
15的制备原料                  来源       量      MW      摩尔数14                    ---        257g    351     0.732无水THF               Fisher     4.5L    ---     ---60％氢化钠在矿物油中  Aldrich    29.2g   24.1    0.7321C(90％)              ---        350g    330.3   0.9521M HCl                Stock      1L      ---     ---MTBE                  Fisher     6L      ---     ---盐水                  Stock      1.6L    ---     ---三氟乙酸(TFA)         Aldrich    210mL   ---     ---  饱和碳酸氢钠    Stock    4L     ---    ---无水硫酸镁      Fisher   150g   ---    ---二氯甲烷        Fisher   500mL  ---    ---
方法：
在氩气保护下将氢化钠悬浮在2.5L THF中并冷却至-5℃。将14(257g)溶于1L THF中并通过加料漏斗于15分钟加入到氢化钠中。将溶液搅拌30分钟，并保持内部温度在0℃和3℃之间。将化合物1C(340g)溶于1L THF，并通过加料漏斗加入到上述溶液中，保持内部温度在0和5℃之间，形成反应混合物。然后用2小时慢慢地将反应混合物升温到环境温度并在室温下放置约20小时。加入1L 1M HCl和3L MTBE，并搅动反应混合物15分钟。分出有机层，用800毫升盐水洗涤两次，并用无水硫酸镁干燥。然后用硅藻土过滤干燥的有机层，并在真空下汽提至干燥得到510克中间体差向异构体，其可直接用于下面的脱羧步骤。
在环境温度下将中间体差向异构体溶于500毫升二氯甲烷，向其中加入210毫升三氟乙酸(TFA)，然后在环境温度下搅拌6-20小时。得到的溶液通过TLC分析(20％乙酸乙酯/己烷，带有硫酸铵铈/钼酸染色剂)。观察到的一个主要的色斑相当于化合物15(Rf 0.3)。真空除去溶剂，并将浓缩的油溶于2L MTBE中。然后该油用饱和碳酸氢钠溶液(4×1L)洗涤。每次洗涤搅动最少15分钟。(注意：为有效除去TFA，将MTBE萃取液倒入快速搅拌的碳酸氢盐水溶液中。)然后用500毫升盐水洗涤有机物，用无水硫酸镁干燥，硅藻土过滤，并在减压下汽提。得到粗品15，492g。粗品的1H NMR光谱在CDCl3中进行，表明纯度在约60％的水平。
将粗品15(492g)预吸附在硅胶(1千克)上。按9∶1装填柱(4千克，优选15∶1)并用10％ EtOAC/己烷(2柱体积)，15％(2柱体积)，20％(2柱体积)洗脱。在5-6柱体积后化合物被洗脱出来。分出与所需的15共同洗脱下来的含有酮类副产品的～140g纯的15。最终UV纯度为～88％，其中残余12％的为酮类杂质。注意：酮类杂质直至以下实施例9的酶催化酯水解后才除去。得到15，收率45％。
实施例7
16的制备：   原料              来源    量     MW       摩尔数15                ---     183g   429.4    0.364THF(7mL/g)        Fisher  1.3L   ---      ---H2SO4(浓)       Fisher  37g    18M      0.36410％Pd/C(10wt％)  Aldrich 18g    10wt.％  ---16                ---     143g   393.15   ---
方法：
在2L氢化器烧瓶中将粗品15(183g)溶于1.3L THF，随后加入按重量计算37g浓硫酸(1.0eq.，0.364摩尔，20mL)。然后用氩气吹扫溶液(表面下，15分钟)。在保持氩气吹扫下向反应器中加入10％按重量计算的钯催化剂(18g)。然后将烧瓶充入氢气，排空三次，然后在压力下(40psi)搅拌5-10小时，直至通过HPLC检测反应完全。该反应通过TLC(50％THF/己烷，带有硫酸高铈，磷钼酸染色剂)和HPLC(gluco方法)监测。然后通过硅藻土衬垫滤出催化剂，用旋转蒸发器上在真空下除去溶剂。得到16的粗品170g(120％)，为黄色油状物。
实施例8
17的制备：
原料 来源  量 MW 摩尔数
16 ---  170g粗品 393.2 0.364
二氯甲烷(ACS) Fisher  2.9L --- ---
DIPEA(2.1eq.)d＝0.742 Aldrich  133mL 129.3 0.764
5-甲基-3-甲酸 Maybridge  58g 145.6 0.400
氯化异噁唑3(1.leq.) Chem.Co.
1N HCl Stock  0.8L --- ---
饱和碳酸氢钠 Stock  0.8L --- ---
无水硫酸钠 Fisher  100g --- ---
17 ---  164g 402.18 ---
方法：
在5L圆底烧瓶中，将粗品16(170g)溶于二氯甲烷(2.9L)中，用冰/盐浴冷却至0℃(内部温度)，同时用氩气保护。该黄色溶液用液体的异噁唑酰基氯(在温水浴中在35℃下熔化)处理。考虑到稳定性，最好在冷却下储存酰基氯。通过加料漏斗于10分钟慢慢地加入二异丙基乙基胺(0.13L)。然后将反应混合物慢慢地升温至室温，同时通过TLC和最终通过HPLC监测反应(通常在1小时之内反应完全)。该反应用1M HCl(400毫升)终止，除去水层且有机物用1M HCl(400mL)反萃取。除去水层，有机层用饱和碳酸氢盐(2×400ml)反萃取。有机层用硫酸钠(100g)干燥，过滤并在真空中浓缩得到164g(112％)化合物17，为粗品黄色油状物。
实施例9
12的制备：
原料 来源  量  MW 摩尔数
17 ---  164g(粗品)  402.2 0.364
THF Fisher  115mL  --- ---
KH2PO4缓冲液 Stock  12L  0.1M ---
KH2PO4(＞99.5％) Fluka  163g  136.1 1.2
NaOH(10N) Stock  ～40mL  40 ---
PPL-Type II(粗品)0.75g/g Aldrich  123g  粗品 ---
HCl(浓) Fisher  ～80mL  --- ---
12 ---  142g  390.2 ---
方法：
为制备12L缓冲液，在37-40℃的温度下向12L去离子水中加入163g磷酸二氢钾(pH值＝4-5)，用10M NaOH(～40ml)调节pH值至约7.0-7.2之间。在37-40℃下将17(164g)溶于THF(115mL)中并加入到缓冲溶液中。在反应起始时溶液可能出现两相。向反应混合物中加入PPL酶(123g)并在37-40℃下搅拌，然后用12M HCl终止反应至pH值在约1-1.5之间。搅拌得到的混合物20分钟同时冷却至室温。酶和产品都进入水相。反应混合物用硅藻土衬垫过滤，收集产品和酶。干燥衬垫。将接收器烧瓶换一个干净的，将硅藻土衬垫顶部的淤浆用二氯甲烷洗涤(3×750ml)。合并有机层(如果出现大量的水时，通过萃取除去过量水分)，用硫酸镁干燥，过滤并在真空中浓缩得到白色固体。在真空中干燥该白色固体得到150g粗的干燥产品。用1.5Kg硅胶在4L 1∶80∶20(i-PrOH∶CH2Cl2∶己烷)混合物中的淤浆装柱。将粗的干燥产品与～250g硅胶干法加载在柱上并用～500mL顶端空间溶剂转移至柱上。加入两柱体积的相同洗脱液混合物(～2×6L)，然后加入～2×6L的3∶80∶20(异丙醇∶二氯甲烷∶己烷)。得到粗品12，150g。在柱色谱后将三步合并得到的收率为约65-70％，94g(71％)。
实施例9A
12的提纯
12通过用碳酸氢钠水溶液萃取而后酸化沉淀而纯化。将化合物部分地溶于60体积的饱和碳酸氢钠中，并用10体积的甲基叔丁基醚萃取。得到的有机层用10体积的饱和碳酸氢钠溶液萃取两次。然后合并碳酸氢盐水萃取溶液并酸化至约pH值1。得到的的二氧化碳废气使溶液保持在温度约20℃以上。产品AG7172，通过酸化该溶液沉淀出。然后滤出12，用4体积的水洗涤，并在氮气吹扫下于50℃真空干燥。
实施例10
制备化合物6的方法：(关于实施例10和11化合物的结构见反应路线7)。
方法：
将36.80g(200mL)化合物1A溶于丙酮(400ml)中，然后慢慢地加入22.26g(220mmol)三乙胺并保持温度低于30℃。然后加入37.6g(220mmol)溴化苄形成反应混合物，将反应混合物搅拌约65小时，这时HPLC显示反应完成。向反应混合物中加入200毫升MTBE，随后搅拌几分钟，然后混合物用短硅胶塞过滤除去其中大部分三乙胺盐沉淀。然后用MTBE(200毫升)洗涤硅胶，合并滤液。然后用1M HCl(200mL)，饱和碳酸氢钠(100毫升×2)及盐水(200毫升)洗涤滤液。然后用硫酸镁干燥，通过一短的硅胶塞过滤并浓缩得到化合物6(收率71-75％；35.5～37.5g；HPLC纯度在90-＞95％之间)。化合物6在己烷/二氯甲烷(8∶1)中重结晶得到结晶的产品。
实施例11
由化合物6制备化合物7。
方法：
将1.37g(5mmol)化合物6溶于40毫升二氯甲烷中并冷却至-10℃。然后向该溶液中加入0.93毫升Tf2O(5.25mmol)随后慢慢的加入0.64毫升(5.25mmol)2，6-二甲基吡啶。因为反应是相当放热的，用冷却浴保持温度低于-8℃。
除去冷却浴后，搅拌反应混合物约1小时使混合物升温，在真空下浓缩得到的混合物。然后将得到的粗品油溶于己烷(100毫升)并于干冰上搅拌至沉淀出粉红色固体，二甲基吡啶鎓盐。该沉淀通过薄层硅胶过滤并再次浓缩得到无色油，化合物7。收率90％(1.84g)，通过1H NMR测定为纯品。
实施例12
由Z-缬氨酸制备化合物18的方法。(关于实施例12-15的化合物的结构见反应路线8)。
方法：
在室温下将50.26g(200mmol)Z-缬氨酸和35.0克(210mmol)1，1’-羰基二咪唑溶于THF(200毫升)中。将得到的混合物在室温下搅拌1小时得到在溶液中的酰基咪唑中间体。(注意：该反应释放二氧化碳)。在一独立的容器中，于-78℃向THF(800毫升)中加入LiHMDS(1M在四氢呋喃中，642毫升)，随后慢慢的加入乙酸邻苄酯(30g，200mmol)。因为反应是放热的，温度保持在低于-70℃。搅拌混合物30分钟，而后在-68℃的温度下向该混合物中慢慢地加入酰基咪唑溶液。该反应也是十分放热的，因而，温度应保持在低于-68℃。搅拌得到的反应混合物55分钟，然后除去干冰浴。向反应混合物中慢慢地加入1M HCl(500毫升)并保持温度低于25℃。然后分出有机层，用饱和碳酸氢钠(200毫升)和盐水(200毫升)洗涤，用硫酸镁干燥并浓缩得到化合物18，收率＞85％(＞72.09g)，HPLC纯度在90-95％之间。为防止分解，化合物18应在冰箱中保存。
实施例13
由18制备19的方法。
方法：
于-10℃向NaH(60％，158.4毫克，3.96mmol)在THF(20毫升)的溶液中慢慢地加入化合物18(1.38克，3.60mmol)在THF(10毫升)中的溶液。将得到的反应混合物移离冷却浴，搅拌20分钟使温度升高。然后向反应混合物中加入化合物7(1.76g，4.33mmol)的二氯甲烷(10毫升)溶液。反应的进程使用HPLC通过观测起始原料的消失加以监测。然后搅拌反应混合物48小时，而后加入MTBE(50毫升)。慢慢地加入1MHCl(75毫升)后，分离反应混合物，水层用MTBE(50毫升×2)萃取。然后用硫酸镁干燥合并的有机层，通过短硅胶塞过滤并浓缩得到粗产品化合物19。(计算值：MS 639，实测：MH+640和MNa+662)。使用己烷/乙酸乙酯(4∶1)色谱分离后，该制备方法得到50-60％的产率。
实施例14
由化合物19制备化合物20。
方法：
将化合物19(680毫克，1.06mmol)溶于脱气的THF(10毫克)和浓硫酸(116毫克，1.10mmol)的混合物中。向该溶液中加入10％Pd-C(204毫克)，然后将得到的反应混合物在Parr振荡器中在50psi的压力下搅拌5小时。然后将该混合物溶于甲醇(75毫升)中，通过硅藻土过滤，且硅藻土用甲醇(75毫升)洗涤得到480毫克化合物20的粗品(得到按重量计算定量的收率，从化合物18开始两步总收率50-60％)，该粗品可不经提纯直接用于下一步反应。
实施例15
由化合物20制备12的方法。
方法：
在0℃下，将化合物20(300mg，0.813mmol)以及二异丙基乙胺(DIEPA)(0.45毫升，2.60mmol，3.2当量)溶于二氧六环(40毫升)中得到一悬浮液。在0℃下向该溶液中加入5-甲基-3-异噁唑-3-甲酰基氯(130mg，0.894mmol)的二氧六环(10毫升)溶液。(注意：该反应为十分放热的)。该反应用薄层色谱法监测并搅拌反应混合物1小时。加入二氯甲烷(20毫升)，而后用1M HCl(10毫升)和饱和碳酸氢钠(10毫升)洗涤混合物，用硫酸镁干燥并通过短硅胶塞过滤得到化合物12，收率在65-70％之间，柱分离后(二氯甲烷/己烷/异丙醇＝79∶20∶3)，HPLC纯度为95％(计算值：MS 390，实测：MNa+413)。
实施例16
原料  当量  Mmol  FW  量
10  1.5  1.8  326.39  751mg
TFA  12.0  18.0  114.02  1.4mL
DCM  10mL/g 10  --  --  7.6mL
N-甲基吗啉  10.0  15.0  101.15  1.6mL
DMF  7mL/g 12  --  --  4.1mL
CDMT  1.05  1.6  175.58  281mg
DMF  4mL/g CDMT  --  --  1.1mL
水  42mL/g 12  --  --  24.7mL
由化合物10制备化合物11。
方法：
在1颈圆底烧瓶中将化合物10溶于DCM并用隔膜覆盖。然后将该烧瓶用氮气吹扫，随后在搅拌下通过注射器加入TFA。反应的进程用5％MeOH的DCM溶液通过TLC监测，直至约4小时后起始物料消失。在45℃、压力＜50 mTorr减压下除去溶剂和过量TFA。将产品，化合物11，立即用于以下步骤。由化合物11和12制备化合物AG7088。方法：
在1颈圆底烧瓶中将化合物11和12溶于DMF并用隔膜覆盖，并安装温度传感器。用氮气吹扫烧瓶。将得到的溶液分成两份。一份通过注射器加入N-甲基吗啉，并冷却至0℃±5℃。在第二份溶液中溶解CDMT。然后将此CDMT溶液通过注射器滴加到第一份溶液中，保持反应温度为0℃±5℃。然后将得到的反应混合物升温至室温。该反应通过TLC(7∶3∶1己烷：EtOAc：IPA)监测约一小时，直至化合物12消失。一旦反应完全，通过向反应混合物中慢慢的加入水使产品AG7088从溶液中沉淀出来。得到的悬浮液经过滤得到收率＞85％的白色颗粒状结晶化合物AG7088，纯度＞97％。产品可随后通过溶解在热的甲醇：EtOAc 1∶1中随后慢慢的加入己烷(2体积)而加以重结晶。
要理解上述说明在本质上是示范性的和说明性的，是用来说明本发明和其优选实施方案的。通过常规实验，技术人员可以在不脱离本发明实质的情况下进行明显的修饰和改变。因而，本发明不是通过上述说明书加以限定，而是通过以下权利要求和其等同部分加以限定。

Claims (63)

1.一种用于制备通式IA的抗细小核糖核酸病毒剂的方法：包括：步骤A：通式IIA化合物的制备：
Figure A0081201100022
包含以下子步骤：(a)通过所述通式XIII的化合物与1，1’-羰基二咪唑反应，随后用通式XIIIA的化合物处理将通式XIII的化合物转化为通式XIV的β-酮酯；
Figure A0081201100031
(b)通过所述通式XIV的β-酮酯与通式XVI的化合物反应，将通式XIV的β-酮酯转化为通式XV的烯醇酯；
Figure A0081201100032
(c)氢解通式XV的烯醇酯得到通式XVII的化合物；
Figure A0081201100033
(d)通过所述通式XVII的化合物与通式R20-X的化合物反应，将通式XVII的化合物酰化得到通式XVIII的化合物，其中X为任何适宜的卤化物；且
Figure A0081201100041
(e)酶催化水解通式XVIII的化合物得到通式IIA的化合物；以及步骤B：将通式IIA的化合物与通式III的化合物进行酰胺-形成反应：其中Lv为任何适宜的离去基团；Z’为任何适宜的N原子保护基；R1为H、F、烷基、OH、SH或O-烷基；R2和R3各自独立的为H、
Figure A0081201100043
其中n为0到5的整数，A1为CH或N，A2和每个A3独立地选自：C(R41)(R41)、N(R41)、S、S(O)、S(O)2、和O，且A4为NH或NR41，其中每个R41独立地为H或低级烷基，条件是上述由A1、A2、(A3)n、A4和C＝O形成的环上不存在超过两个相连的杂原子，且至少R2和R3之一为
Figure A0081201100051
R4为R6为H、F、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、或杂芳基；R7和R8各自独立地为H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、-OR17、-SR17、-NR17R18、-NR19NR17R18、或-NR17OR18，其中R17、R18、和R19各自独立地为H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、或酰基，条件是至少R7和R8之一为烷基、芳基、杂芳基、-OR17、-SR17、-NR17R18、-NR19NR17R18、或-NR17OR18；R9为具有一到三个选自O、N、和S的杂原子的五元杂环；R20为以及Z和Z1各自独立地为H、F、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、-C(O)R21、-CO2R21、CN、-C(O)NR21R22、-C(O)NR21OR22、-C(S)R21、-C(S)NR21R22、-NO2、SOR21、-SO2R21、-SO2NR21R22、-SO(NR21)(OR22)、-SONR21、-SO3R21、-PO(OR21)2、-PO(R21)(R22)、-PO(NR21R22)(OR23)、-PO(NR21R22)(NR23R24)、-C(O)NR21NR22R23、或-C(S)NR21NR22R23，其中R21、R22、R23和R24各自独立地为H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、酰基、或硫酰基，或其中R21、R22、R23、和R24的任意两个，连同与它们连接的原子一起形成杂环烷基，条件是Z和Z1两个不都是H；或Z1和R1与其连接的原子一起形成环烷基或杂环烷基，其中Z1和R1为上述的定义，除外那些不能形成环烷基或杂环烷基的部分；或Z和Z1与其连接的原子一起形成环烷基或杂环烷基，其中Z和Z1如上述的定义，除外那些不能形成环烷基或杂环烷基的部分；
2.一种用于制备通式IIA的化合物的方法：包括：(a)通过所述通式XIII的化合物与1，1’-羰基二咪唑反应，随后用通式XIIIA的化合物处理将通式XIII的化合物转化为通式XIV的β-酮酯；
Figure A0081201100062
(b)通过所述通式XIV的β-酮酯与通式XVI的化合物反应，将通式XIV的β-酮酯转化为通式XV的烯醇酯；(c)氢解通式XV的烯醇酯得到通式XVII的化合物；
Figure A0081201100072
(d)通过所述通式XVII的化合物与通式R20-X的化合物的反应，将通式XVII的化合物酰化得到通式XVIII的化合物，
Figure A0081201100073
其中X为任何适宜的卤化物；以及(e)酶催化水解通式XVIII的化合物得到通式IIA的化合物；其中Lv为任何适宜的离去基团；Z’为任何适宜的N原子保护基；R6为H、F、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、或杂芳基；R7和R8各自独立地为H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、-OR17、-SR17、-NR17R18、-NR19NR17R18、或-NR17OR18，其中R17、R18、和R19各自独立地为H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、或酰基，条件是至少R7和R8之一为烷基、芳基、杂芳基、-OR17、-SR17、-NR17R18、-NR19NR17R18、或-NR17OR18；R9为具有一到三个选自O、N和S的杂原子的五元杂环；且R20为
Figure A0081201100081
3.根据权利要求2的方法，其中在酶催化水解步骤使用猪胰脏脂肪酶作为酶。
4.根据权利要求2的方法，其中通式XIII的化合物为Z-缬氨酸。
5.根据权利要求2的方法，其中通式XVI的化合物为：
6.根据权利要求2的方法，其中在通式XIV的β-酮酯与通式XVI的化合物反应之前首先与碱金属氢化物起反应。
7.根据权利要求2的方法，其中碱金属氢化物为氢化钠。
8.根据权利要求2的方法，其中步骤(c)包括钯氢解。
9.根据权利要求8的方法，其中钯氢解是在压力下进行的。
10.根据权利要求2的方法，其中二异丙基乙基胺在酰化作用步骤(d)中用作试剂。
11.根据权利要求2的方法，其中通式IIA的化合物为：
Figure A0081201100091
通式XVIII的化合物为：
Figure A0081201100092
通式XVII的化合物为：通式XV的烯醇酯为：
Figure A0081201100094
12.一种用于制备通式IIA的化合物的方法：
Figure A0081201100101
包括以下步骤：(a)通过所述通式XIX的化合物与1，1’-羰基二咪唑反应，随后用通式XIXA的化合物处理，将通式XIX的化合物转化为通式XX的β-酮酯；(b)通过将所述通式XX的化合物与通式XXII的化合物在适宜的反应条件下反应，将通式XX的化合物转化为通式XXI的化合物；(c)氢化通式XXI的化合物得到通式XXIII的化合物；以及
Figure A0081201100111
(d)将通式XXIII的化合物通过其与通式R20-X的化合物在适宜的条件下反应进行酰化，得到通式IIA的化合物；其中X为任何适宜的卤化物；其中Lv为任何适宜的离去基团；Z’为任何适宜的N原子保护基；R6为H、F、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、或杂芳基；R7和R8各自独立地为H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、-OR17、-SR17、-NR17R18、-NR19NR17R18、或NR17OR18，其中R17、R18、和R19各自独立地为H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、或酰基，条件是至少R7和R8之一为烷基、芳基、杂芳基、-OR17、-SR17、-NR17R18、-NR19NR17R18、或-NR17OR18；R9为具有一到三个选自O、N、和S的杂原子的五元杂环；且R20为
Figure A0081201100112
13.根据权利要求12的方法，其中通式XIX的化合物为：
14.根据权利要求12的方法，其中通式XX的化合物为：
15.根据权利要求12的方法，其中通式XXI的化合物为：
Figure A0081201100122
16.根据权利要求12的方法，其中通式XXII的化合物为：
Figure A0081201100123
17.根据权利要求12的方法，其中通式XXIII的化合物为：
18.一种用于制备通式I的化合物的方法，包括以下步骤：
Figure A0081201100132
(a)通式II的化合物与通式IIIA的化合物在N-甲基吗啉的存在下反应形成反应混合物；(b)向反应混合物中加入通式Lv-X的化合物以形成通式I的化合物，其中X为任何适宜的卤化物；Lv为任何适宜的离去基团；R1为H、F、烷基、OH、SH或O-烷基；R2和R3每个独立地为H；其中n为0到5的整数，A1为CH或N，A2和每个A3独立地选自C(R41)(R41)、N(R41)、S、S(O)、S(O)2、和O，且A4为NH或NR41，其中每个R41独立地为H或低级烷基，条件是上述由A1、A2、(A3)n、A4和C＝O形成的环上不存在超过两个相连的杂原子，且至少R2和R3之一为
Figure A0081201100142
R4为R5和R6各自独立地为H、F、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、或杂芳基；R7和R8各自独立地为H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、-OR17、-SR17、-NR17R18、-NR19NR17R18、或NR17OR18，其中R17、R18、和R19各自独立地为H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、或酰基，条件是至少R7和R8之一为烷基、芳基、杂芳基、-OR17、-SR17、-NR17R18、-NR19NR17R18、或-NR17OR18；R9为具有一到三个选自O、N、和S的杂原子的五元杂环；R20为
Figure A0081201100151
Z和Z1各自独立地为H、F、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、-C(O)R21、-CO2R21、CN、-C(O)NR21R22、-C(O)NR21OR22、-C(S)R21、-C(S)NR21R22、-NO2、SOR21、-SO2R21、-SO2NR21R22、-SO(NR21)(OR22)、-SONR21、-SO3R21、-PO(OR21)2、-PO(R21)(R22)、-PO(NR21R22)(OR23)、-PO(NR21R22)(NR23R24)、-C(O)NR21NR22R23、或-C(S)NR21NR22R23，其中R21、R22、R23和R24各自独立地为H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、酰基、或硫酰基，或其中R21、R22、R23、和R24的任意两个连同与它们连接的原子一起形成杂环烷基，条件是Z和Z1两个不都是H；或Z和R1与其连接的原子一起形成环烷基或杂环烷基，其中Z和R1如上述定义，除外那些不能形成环烷基或杂环烷基的部分；或Z和Z1与其连接的原子一起形成环烷基或杂环烷基，其中Z和Z1如上述定义，除外那些不能形成环烷基或杂环烷基的部分。
19.根据权利要求18的方法，其中通式I的化合物为：
20.根据权利要求18的方法，其中通式II的化合物为：
Figure A0081201100161
21.根据权利要求18的方法，其中通式IIIA的化合物为：
Figure A0081201100162
22.根据权利要求18的方法，其中通式Lv-X的化合物为氯二甲基三嗪。
23.根据权利要求18的方法，其中通式IIIA的化合物是通过一种包括将通式IIIB的化合物与三氟乙酸反应的步骤的方法制备的，其中通式IIIB的化合物为：
Figure A0081201100163
24.一种用于制备通式XVIA的化合物的方法：其中R10为卤素或烷基；包括：
步骤A：将通式VI的化合物转化为通式V的化合物
包含以下子步骤：
(a)将通式VI的R10取代的苯甲醛：
Figure A0081201100172
与乙内酰脲在水介质中在催化剂的存在下于回流温度下反应形成反应混合物；
(b)用过量碱金属氢氧化物在回流温度下处理该反应混合物形成一种碱金属氢氧化物处理的溶液；
(c)向碱金属氢氧化物处理的溶液中加入碱金属卤化物得到一种溶液；
(d)用一种浓酸酸化该溶液得到通式V的沉淀以及步骤B：酶催化还原通式V的化合物，得到通式VII的化合物；
步骤C：通过通式VII的化合物与通式R″-OH的化合物反应将通式VII的化合物酯化成通式XII的化合物，其中R″为烷基或芳基；
以及
步骤D：将通式XII的化合物转化为通式XVIA的化合物。
25.根据权利要求24的方法，其中步骤B的还原反应用甲酸脱氢酶和乳酸脱氢酶催化。
26.根据权利要求24的方法，其中步骤B的还原反应用膜密封的酶催化。
27.根据权利要求24的方法，其中步骤B的还原反应用共固定化酶催化。
28.根据权利要求27的方法，其中共固定化酶催化使用PAN 500作为适宜的共聚物。
29.根据权利要求25的方法，其中乳酸脱氢酶为D-乳酸脱氢酶。
30.根据权利要求25的方法，其中乳酸脱氢酶为L-乳酸脱氢酶。
31.根据权利要求24的方法，其中步骤C的酯化在大约室温下在盐酸和二氧六环的存在下进行。
32.根据权利要求24的方法，其中步骤(a)中使用的催化剂为伯胺或仲胺。
33.根据权利要求32的方法，其中催化剂为1-氨基-2-丙醇。
34.一种制备通式XVIA的化合物的方法：包括：步骤A’将丝氨酸转化为通式VII的化合物：
Figure A0081201100192
包含以下子步骤：
(a)通过标准方法将丝氨酸转化为缩水甘油酸钾；和
(b)与通式R10-苯基-Q的化合物进行区域选择性环氧化物开环反应；
步骤B’：通过通式VII的化合物与通式R″-OH的化合物反应将通式VII的化合物酯化成通式XII的化合物；
步骤C’：将通式XII的化合物转化为通式XVIA的化合物；其中R10为卤素或烷基；R″为烷基或芳基；且Q为活化的溴化物、硫酸酯、或一级碘化物。
35.根据权利要求34的方法，其中丝氨酸为L-丝氨酸。
36.根据权利要求34的方法，其中丝氨酸为D-丝氨酸。
37.根据权利要求34的方法，其中Q为-MgBr。
38.根据权利要求34的方法，其中R10为在苯环对位的氟。
39.根据权利要求34的方法，其中步骤B’的酯化在大约室温下在盐酸和二氧六环的存在下进行。
40.根据权利要求34的方法，其中在进行步骤A’(b)的区域选择性环氧化物开环反应之前，将由步骤A’(a)形成的缩水甘油酸钾转变为缩水甘油酸。
41.一种制备通式XVIB的化合物的方法：包括：步骤A″：由通式IX的化合物制备通式XIIA的化合物包括以下子步骤：(a)将通式IX的化合物不对称二羟基化形成通式XA的化合物：
Figure A0081201100211
(b)通式IX的化合物与1，1’-羰基二咪唑在甲苯的存在下反应形成通式XI的化合物；及(c)将通式XI的化合物进行钯-介导的还原形成通式XIIA的化合物；以及步骤B″将通式XIIA的化合物转化为通式XVIB的化合物；其中R10为卤素或烷基；且R″为烷基或芳基。
42.根据权利要求41的方法，其中不对称的二羟基化为Sharpless不对称二羟基化。
43.根据权利要求41的方法，其中步骤(b)在大约80℃进行。
44.根据权利要求41的方法，其中钯-介导还原步骤在大约室温、甲酸的存在下进行。
45.一种通式IVA的化合物：其中，R10为卤素或烷基；X为OH、OSO2CF3、OSO2CH3、OSO2(对甲苯基)、卤化物或任何其它离去基团；且R’为H、烷基或芳基。
46.根据权利要求45的化合物，其中R10为F。
47.根据权利要求46的化合物，其中F为在苯环对位取代的。
48.根据权利要求45的化合物，其中X为OH。
49.根据权利要求45的化合物，其中R’为甲基。
50.下式的化合物及其酸加成盐：
Figure A0081201100222
51.下式的化合物及其酸加成盐：
52.下式的化合物及其酸加成盐：
53.下式的化合物及其酸加成盐：
54.一种制备式VII的化合物的方法：
Figure A0081201100233
其中R10为卤素或烷基；包括：
步骤A：将式VI的化合物转化为式V的化合物
包含以下子步骤：
(a)将式VI的R10取代的苯甲醛：
Figure A0081201100234
与乙内酰脲在水介质中、在催化剂的存在下于回流温度反应形成反应混合物；
(b)在回流温度下用过量碱金属氢氧化物处理该反应混合物形成一种碱金属氢氧化物处理的溶液；
(c)向碱金属氢氧化物处理的溶液中加入碱金属卤化物得到一种溶液；
(d)用一种浓酸酸化该溶液得到式V的沉淀：
Figure A0081201100241
以及步骤B：将式V的化合物酶催化还原为式VII的化合物。
55.一种制备式VII的化合物的方法：包含以下步骤：(a)通过标准方法将丝氨酸转化为缩水甘油酸钾盐；(b)与式R10-苯基-Q的化合物进行区域选择性环氧化物开环反应得到式VII的化合物，其中R10为卤素或烷基；且Q为活化的溴化物、硫酸酯、或一级碘化物。
56.根据权利要求55的方法，其中在进行步骤(b)的区域选择性环氧化物开环反应之前，将步骤(a)形成的缩水甘油酸钾转变为缩水甘油酸。
57.一种进行大催化剂催化反应的方法，包括：(a)将试剂和大催化剂置于一个具有反应器体积的连续膜反应器中；(b)使大催化剂在连续膜反应器中发生催化反应；以及(c)从连续膜反应器收集产品，其中连续膜反应器包括一个切向流动过滤装置，一个反应器环型管道以通过切向流动过滤装置循环试剂和大催化剂，和一个用于将试剂向反应器环型管道进料的底物进料泵，其中反应器环型管道具有反应器环型管道体积且包括：
(i)管道；和
(ii)循环泵。
58.根据权利要求57的方法，其中大催化剂为酶。
59.根据权利要求57的方法，其中大催化剂为固定化的催化剂。
60.根据权利要求57的方法，其中大催化剂的分子体积大于产品的分子体积。
61.根据权利要求57的方法，其中反应器环型管道体积至少为反应器体积的50％。
62.根据权利要求57的方法，其中反应器环型管道体积至少为反应器体积的80％。
63.根据权利要求57的方法，其中反应器环型管道体积至少为反应器体积的95％。按照条约第19条的修改
Figure A0081201100261
(b)通式IX的化合物与1，1’-羰基二咪唑在甲苯的存在下反应形成通式XI的化合物；及(c)将通式XI的化合物进行钯-介导的还原形成通式XIIA的化合物；以及步骤B″将通式XIIA的化合物转化为通式XVIB的化合物；其中R10为卤素或烷基；且R″为烷基或芳基。
42.根据权利要求41的方法，其中不对称的二羟基化为Sharpless不对称二羟基化。
43.根据权利要求41的方法，其中步骤(b)在大约80℃进行。
44.根据权利要求41的方法，其中钯-介导还原步骤在大约室温、甲酸的存在下进行。
45.下式的化合物及其酸加成盐：
Figure A0081201100271
46.下式的化合物及其酸加成盐：
Figure A0081201100272
47.下式的化合物及其酸加成盐：
Figure A0081201100273
48.下式的化合物及其酸加成盐：
49.一种制备式VII的化合物的方法：其中R10为卤素或烷基；包括：
步骤A：将式VI的化合物转化为式V的化合物
包含以下子步骤：
(a)将式VI的R10取代的苯甲醛：与乙内酰脲在水介质中、在催化剂的存在下于回流温度反应形成反应混合物；
(b)用过量碱金属氢氧化物在回流温度下处理反应混合物形成一种碱金属氢氧化物处理的溶液；
(c)向碱金属氢氧化物处理的溶液中加入碱金属卤化物得到一种溶液；
(d)用一种浓酸酸化该溶液得到式V的沉淀：以及步骤B：将式V的化合物酶催化还原为式VII的化合物。
50.一种制备式VII的化合物的方法：
Figure A0081201100291
包含以下步骤：(a)通过标准方法将丝氨酸转化为缩水甘油酸钾盐；(b)用通式R10-苯基-Q的化合物进行区域选择性环氧化物开环反应得到式VII的化合物，其中R10为卤素或烷基；且Q为活化的溴化物、硫酸酯、或一级碘化物。
51.根据权利要求50的方法，其中在进行步骤(b)的区域选择性环氧化物开环反应之前，将步骤(a)形成的缩水甘油酸钾转变为缩水甘油酸。
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