KR20020030795A - 이소옥사졸카록스아미드 및 유사체의 제조를 위한중간물질 및 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반식 (Ⅰ), 특히 일반식 (Ⅰ')의 리노바이러스 프로테아제 억제제들과 연속적인 막 반응기 뿐만 아니라 이들의 제조과정에서 필요한 주요 중간물질의 제조를 위한 효과적인 합성방법에 관한 것이다. 일반식 (Ⅰ)의 화합물과 이들의 약제학적 조성물은 하나 이상의 피코나바이러스에 감염된 환자 또는 숙주를 치료하기에 안전하다.

Description

이소옥사졸카록스아미드 및 유사체의 제조를 위한 중간물질 및 제조방법{Process and Intermediates for the Preparation of Isoxazolecaroxamides and Analogues}
피코나바이러스(picornaviruses)는 인간과 다른 동물들을 감염하는 비피막 양성-가닥 RNA 함유 바이러스(non-enveloped positive-stranded RNA-containing viruses)이다. 이러한 바이러스에는 인간의 리노바이러스(rhinoviruses), 인간의 폴리오바이러스(polioviruses), 인간의 콕사키바이러스(coxackieviruses), 인간의 에코바이러스 (echoviruses) 및 소의 엔테로바이러스(enteroviruses), 뇌심근염(腦心筋炎) 바이러스(encephalomyocarditis virus), 수막염(髓膜炎) 바이러스 (meningitis virus), 구제역 바이러스(foot and mouth viruses), 헤파티티스 A 바이러스(hepatitis A viruses) 등이 있다. 인간의 리노바이러스는 주로 일반적인 감기를 유발한다.
단백질 분해효소 3C는 피코나바이러스의 자연 성숙을 위해 필요하다. 따라서, 이 단백질 분해효소 3C의 활성을 억제하는 것은 일반적인 감기를 포함해서 자연에서의 바이러스 감염의 치유와 치료를 위해 중요하고 유용한 접근임을 말해준다.
최근 피코나바이러스 3C 프로테아제의 효소적 활성에 대한 일부 저분자 억제제(즉, 항피코나바이러스 화합물)가 발견되었다. 예를 들면 Webber et al.에 의해 1997. 5. 2 출원된 미합중국 특허출원 제08/850,398호, Dragovich et al.에 의해 1997. 12. 16 출원된 미합중국 특허출원 제08/991,282호, Webber et al.에 의해 1997. 12. 16 출원된 미합중국 특허출원 제08/991,739호 등이 있다. 본 발명에서 참고자료로 수록한 이들 미합중국 특허출원들은 항피코나바이러스 화합물들과 그들을 합성방법에 관하여 언급하고 있다.
보다 최근에는 특히 항피코나바이러스 작용제의 강력한 그룹이 Dragovich et al.에 의해 1998. 8.28 출원된 미합중국 특허출원 제60/098,354호(이하 "'354 출원"라고 한다.)에 의해 발견되었고, 이는 본 발명에서 참고자료로 수록하고 있다. 상기 출원은 일명 일반식 Ⅰ의 항피코나바이러스 작용제의 그룹을 개시하고 있다. 특히 이 그룹의 범위 안에 있으면서 가능성이 있는 화합물인 AG7088은 리노바이러스 혈청형 과다에 대한 탁월한 항바이러스성을 보이고, 현재는 인간의 임상시험 단계에 있다. 또한 상기 '354 출원은 이들 화합물의 합성에 이용되는 중간물질과 제조방법을 개시하고 있다. 예를 들어, 하기의 일반적 방법 Ⅴ에서 일반식 BB의 카르복실산이 일반식 P의 아민과 반응하여 아미드 생성 반응을 거쳐 최종적으로 생성물 CC를 생성하는 것을 포함하여 일반식 Ⅰ의 화합물을 합성하는 일반적인 방법을 개시하고 있다.
더 나아가 상기 '354 출원은 일반식 BB와 일반식 P의 중간물질을 합성하기 위한 방법을 개시하고 있고, 상기의 아미드 생성 반응을 수행하기 위한 방법을 알려준다. 그러므로 상기 '354 출원은 카르복실산 BB(아래의 일반식 Ⅱ의 화합물 범위 안에 있는)와 일반식 P의 화합물(아래의 일반식 Ⅲ의 화합물과 같은 물질)로부터 일반식 Ⅰ의 화합물을 합성하기 위한 적합한 방법을 알려주고 있다. 유사하게 Dragovich et al.에 의해 발표된 두 개의 최근 간행물은 항피코나바이러스 작용제 및 그들의 합성을 위한 적합한 제조방법을 개시하고 있다.Structure-Based Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Irreversable Human Rhinovirus 3C Protease Inhibitor. 3. Structure Activity Studies of Ketomethylene-Containing Peptidomimetics,Dragovich et al., Journal of Medicinal Chemistry, ASAP, 1999; 및Structure-Based Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Irreversable Human Rhinovirus 3C Proteases Inhibitors. 4. Incorporation ofP 1 Lactam Moieties as L-Glutamine Replacements,Dragovich et al., Journal of Medicinal Chemistry, ASAP, 1999을 참조. 이들 상기 기술들은 본 발명에서 전부 참고자료로 수록하고 있다.
그러나 아직도 항피코나바이러스 작용제 그룹의 화합물 합성에 사용하는 신규한 중간물질과 제조과정을 개량시키고 보다 효과적으로 수행할 수 있도록 하는 방법이 요구되고 있다. 특히 일반식 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ의 화합물을 합성하기 위한 개량된 방법의 필요성이 부각되었다.
본 발명에 의한 제조과정은 효소환원 단계를 포함하고 있다. 효소 촉매를 포함하는 정해진 촉매의 손실때문에 이들 고가의 촉매들을 재사용하는 과정이 필요하다. 이러한 과정은 연속적인 막 반응기의 사용으로 가능하게 된다. 연속적인 막 반응기의 개발은 화합물을 제조하는 과정에서 이들 고가의 촉매들을 경제적으로 사용할 수 있도록 만들었다. 그러나 본 발명에 이르기까지 연속적인 막 반응기들이 고가이고 촉매반응의 범위를 다양하게 변경하는 능력이 현저히 결여되어 있었다. 특히 알려진 연속적인 막 반응기들은 효소반응의 대부분에서 발생하는 반응물과 효소의 용량의 대부분이 존재하는 중공의(hollow) 섬유 필터 반응기를 이용한다. 따라서, 반응의 범위를 변경하기 위해서는 적당한 크기의 다른 중공의 섬유필터 반응기를 사용해야만 한다. 예를 들면, E. Schmidt et al.,Journal of Biotechnology, 24(1992) 315-327에서는 연속적인 막 반응기를 개시하고 있다. 상기 논문의 기술은 본 발명에서 참고로 수록하고 있다. 더 나아가 중공의 섬유 필터 반응기가 고가이기 때문에 이러한 종래의 연속적인 막 반응기들은 가격이 비싸다. 따라서, 보다 경제적이고 다양한 용도를 가지는 연속적인 막 반응기의 필요성을 느끼게 되었다.
관련출원에 대한 상호참조
본 출원은, 1999년 8월 24일자로 출원된 미국 가출원 번호 제60/150,358호의 우선권 효력을 청구한다.
또한 본 출원은 1999년 8월 24일자로 출원된 "리노바이러스 프로테이즈 억제제와 주요 중간물질의 제조를 위한 유효한 방법"이란 제목의 미국 가출원 번호 제60/150.358호(대리인 처리번호 0125.0028)의 우선권효력을 청구한다(발명자: Q. Tian, N. Nayyar, S Babu, J. Tao, T. Moran, R. Dagnino, Jr., T. Remarchuk, M. Melnick, L. Mitchell, Jr., 및 S. Bender). 또 상기 출원은 리노바이러스 프로테이즈 억제제뿐만 아니라 그 제조과정에서 사용한 주요 중간물질의 제조를 위한 합성방법에 관한 것이다.
상기 출원들은 본 발명에서 참고자료로 혼합해서 사용되었다.
본 발명의 분야
본 발명은 에틸-3-{(5'-메틸이소옥사졸(methylisoxazole)-3'-카르보닐)-L-ValΨ(COCH2)-L-(4-F-Phe(페닐알라닌))-L-((S)-피롤(pyrrol)-Ala(알라닌))}-E-프로판염(propanoate)(또한 "AG7088"이라고도 한다), 그 유사체 및 약제학적으로 허용 가능한 염을 제조하기 위한 개량된 제조방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 제조과정에서 사용되는 새로운 주요 중간 화합물 그룹에 관한 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 연속적인 막 반응기의 모식도
도 2a 및 도 2b는 본 발명에 따른 연속적인 막 반응기의 모식도
본 발명은 화합물AG7088과 같은 일반식 Ⅰ의 항피코나바이러스 작용제뿐만 아니라 이들의 합성에 사용되는 중간물질의 제조를 위한 경제적이고 효과적인 제조방법에 관한 것이다.
일반식 Ⅰ의 항피코나바이러스 작용제는
을 포함하되,
여기에서 R1은 H, F, 알킬 그룹, OH, SH 또는 O-알킬 그룹이고;
R2과 R3는 각각 독립적으로 H;
로서,
여기에서 n은 0에서 5까지의 정수이고, A1은 CH 또는 N이며, A2와 각각의 A3는 C(R41)(R41), N(R41), S, S(O), S(O)2및 O로부터 독립적으로 선택된 것이고, A4는NH 또는 R41이며, 여기에서 R41은 독립적으로 H 또는 저가 알킬이고, 둘 이상의 이종원자들은 연속적으로 A1, A2, (A3)n, A4및 C=O에 의해 형성되는 상기의 링을 가지며, R2및 R3중 적어도 하나는
이고;
R4는
이며;
R5및 R6는 각각 독립적으로 H, F, 알킬 그룹, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클로알킬 그룹, 아릴 그룹, 또는 헤테로아릴 그룹이고;
여기에서, R7및 R8은 각각 독립적으로 H, 알킬 그룹, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클로알킬 그룹, 아릴 그룹, 헤테로아릴 그룹, -OR17, -SR17, -NR17R18, -NR19NR17R18또는 -NR17OR18, 여기에서 R17, R18및 R19는 각각 독립적으로 H, 알킬 그룹, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클로알킬 그룹, 아릴 그룹, 헤테로아릴 그룹, 또는 아실 그룹이고; R7및 R8중 적어도 하나는 알킬 그룹, 아릴 그룹, 헤테로아릴그룹, -OR17, -SR17, -NR17R18, -NR19NR17R18또는 -NR17OR18이고; R9는 O, N 및 S에서 선택된 하나 내지 세 개의 이종원자들을 가지는 5환 헤테로고리이며; 및
Z와 Z1은 각각 독립적으로 H, F, 알킬 그룹, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클로알킬 그룹, 아릴 그룹, 헤테로아릴 그룹, -C(O)R21, -CO2R21, CN, -C(O)NR21R22, -C(O)NR21OR22, -C(S)R21, -C(S)NR21R22, -NO2, -SOR21, -SO2R21, -SO2NR21R22, -SO(NR21)(OR22), -SONR21, -SO3R21, -PO(OR21)2, -PO(R21)(R22), -PO(NR21R22)(OR23), -PO(NR21R22)(NR23R24), -C(O)NR21NR22R23또는 -C(S)NR21NR22R23이며, 여기에서 R21, R22, R23및 R24는 각각 독립적으로 H, 알킬 그룹, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클로알킬 그룹, 아릴 그룹, 헤테로아릴 그룹, 아실 그룹 또는 티오아실(thioacyl) 그룹이거나, 또는 Z와 Z1이 둘다 H인 것은 아니라는 조건에서 R21, R22, R23및 R24중 2개의 원자가 결합하여 헤테로사이클로알킬 그룹을 형성한다;
또는 Z1과 R1은 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 그룹을 형성할 수 없는 것임을 제외하고 상기에서 정의한 바와 같은 경우로서, Z1과 R1원자가 결합하여 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 그룹을 형한다;
또는 Z1과 Z1은 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 그룹을 형성할 수 없는 것임을 제외하고 상기에서 정의한 바와 같은 경우로서, Z와 Z1원자가 결합하여사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 그룹을 형성한다.
아래에 설명되어 있는 일반식 Ⅰ의 항피코나바이러스 작용제들은 일반식 Ⅱ의 화합물과 일반식 Ⅲ의 화합물이 적합한 아미드 생성 반응을 거쳐 합성됨을 알 수 있다. 본 발명에서는 일반식 Ⅱ와 일반식 Ⅲ의 화합물로부터 일반식 Ⅰ의 화합물을 합성하기 위한 보다 경제적이고 효과적인 제조방법을 제공하고자 한다.
또한 본 발명에서는 일반식 Ⅱ의 화합물을 합성하기 위한 보다 경제적이고 효과적인 제조방법을 제공함으로써 일반식 Ⅰ의 항피코나바이러스 작용제를 합성하기 위한 전반적으로 개량된 제조과정을 제공하고자 한다.
따라서 본 발명에서는 본 발명의 제조과정에서 사용되는 새로운 중간물질과 이들 새로운 중간물질을 제조하기 위한 새로운 제조과정을 제공하고자 한다.
또한 본 발명에서는 본 발명의 제조과정에 사용되는 연속적인 막 반응기에 관한 것이다.
본 발명의 이러한 목적들, 이점들 및 특징들은 작성된 명세서의 참고에 의해 보다 충분히 이해하고 식별할 수 있을 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어는 다음과 같이 정의하여 한정한다:
당업계에서 통상적으로 사용되는 기술에 따르면,는 여기에서 부분부착점 또는 코어(core) 또는 골결구조에서의 치환점인 결합을 표현하는 구조식으로 사용된다.
화학적 구조를 유발하는 키랄(chiral) 탄소들에서 한 부분의 방향이 표시되어 있지 않다면, 양쪽 모두 입체이성질체 형태가 둘러싸여져 있는 것을 의미한다.
"알킬 그룹"은 메틸(Me), 에틸(Et), 프로필, 이소프로필, 부틸(Bu), 이소부틸, t-부틸(t-Bu), 에테닐, 펜테닐, 부테닐, 프로페닐, 에티닐, 부티닐, 프로피닐, 펜티닐, 헥시닐 등과 같이 아래에서 정의한 대로 하나 이상의 적당한 치환체(F, Cl, Br 또는 I와 같은 하나 이상의 할로겐들, 바람직하게는 F와 Cl)에 의해 치환되거나 치환되지 않은(즉, 탄소와 수소만을 함유하는) 포화 및/또는 불포화 탄소 원자와 수소원자들의 1가 라디칼로 이루어진 직쇄 또는 측쇄를 포함하는 그룹을 의미한다. "저가 알킬 그룹"은 상기 사슬에 1 내지 4의 탄소원자를 가지는 알킬 그룹을 의미한다.
"사이클로알킬 그룹"은 치환체에 의해 치환되거나 치환되지 않은 하나 또는 그 이상의 헤테로사이클로알킬 그룹, 아릴 그룹 또는 헤테로아릴 그룹이 하나 또는 그 이상 융합되어 있고, 각각 아래에 기재한 하나 또는 그 이상의 적당한 치환체에 의해 치환되거나 치환되지 않은 포화 또는 불포화 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 탄소 고리 원자들을 함유하는 비방향족 1가 모노사이클릭, 비사이클릭 또는 트리사이클릭 라디칼을 의미한다. 이러한 사이클로알킬 그룹의 일부를 예로 들면 다음과 같다:
"헤테로사이클로알킬 그룹"은 질소, 산소, 황에서 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5 이종원자를 포함하는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 고리 원자를 함유하는 포화 또는 불포화된 비방향족 1가의 모노사이클릭, 비사이클릭, 트리사이클릭 라디칼을 의미한다. 상기 라디칼은 아래에서 정의한 것과 같이 적당한 치환체로 인해 치환되거나 치환되지 않은 것으로, 하나 또는 그 이상의 적당한 치환체로 치환되거나 치환되지 않은 사이클로알킬 그룹, 아릴 그룹 또는 헤테로아릴 그룹이 하나 또는 그 이상 융합되어 있다. 이러한 헤테로사이클로알킬 그룹의 일부를 예로 들면 다음과 같다:
"아릴 그룹"은 하나 또는 그 이상의 치환체에 의해 치환되거나 치환되지 않은 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클로알킬 그룹 또는 헤테로아릴 그룹이 하나 또는 그 이상 융합되어 있고, 아래에 기재한 하나 또는 그 이상의 적당한 치환체에 의해 치환되거나 치환되지 않은 6, 10, 14 또는 18 탄소 고리 원자들을 함유하는 방향족 1가 모노사이클릭, 비사이클릭 또는 트리사이클릭 라디칼을 의미한다. 이러한 아릴 그룹의 일부를 예로 들면 다음과 같다:
"헤테로아릴 그룹"은 질소, 산소, 황에서 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5 이종원자를 포함하는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 고리원자를 함유하는 방향족 1가의 모노사이클릭, 비사이클릭, 트리사이클릭 라디칼을 의미한다. 상기 라디칼은 하나 또는 그 이상의 적당한 치환체로 치환되거나 치환되지 않은 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클로알킬 그룹 또는 아릴 그룹이 하나 또는 그 이상 융합되어 있고, 아래에 기재한 적당한 치환체로 치환되거나 치환되지 않은 것이다. 이러한 헤테로아릴 그룹의 일부를 예로 들면 다음과 같다:
"헤테로사이클"은 헤테로아릴 또는 헤테로사이클로알킬 그룹을 의미한다(각각 상기에서 정의한 대로 임의로 치환된 것).
"아실 그룹"은 -C(O)-R 라디칼을 의미하고, 여기에서 R은 아래에서 정의한 치환체이다.
"티오아실(thioacyl) 그룹"은 -C(S)-R 라디칼을 의미하고, 여기에서 R은 아래에서 정의한 치환체이다.
"설포닐(sulfonyl) 그룹"은 -SO2-R 라디칼을 의미하고, 여기에서 R은 아래에서 정의한 치환체이다.
"히드록시 그룹"은 라디칼 -OH를 의미한다.
"아미노 그룹"은 라디칼 -NH2를 의미한다.
"알킬아미노 그룹"은 라디칼 -NHRa를 의미하고, 여기에서 Ra는 알킬 그룹이다.
"디알킬아미노 그룹"은 라디칼 -NRaRb를 의미하고, 여기에서 Ra와 Rb는 각각 독립적으로 알킬 그룹이다.
"알콕시 그룹"은 라디칼 -ORa를 의미하고, 여기에서 Ra는 알킬 그룹이다. 알콕시 그룹은 메톡시, 에톡시, 프로폭시 등과 같은 것을 포함한다.
"알콕시카르보닐(alkoxycarbonyl) 그룹"은 라디칼 -C(O)ORa를 의미하고, 여기에서 Ra는 알킬 그룹이다.
"알킬설포닐 그룹"은 라디칼 -SO2Ra를 의미하고, 여기에서 Ra는 알킬 그룹이다.
"알킬아미노카르보닐(alkylaminocarbonyl) 그룹"은 라디칼 -C(O)NHRa를 의미하고, 여기에서 Ra는 알킬 그룹이다.
"디알킬아미노카르보닐 그룹"은 라디칼 -C(O)NRaRb를 의미하고, 여기에서 Ra와 Rb는 각각 독립적으로 알킬 그룹이다.
"메르캅토(mercapto) 그룹"은 라디칼 -SH를 의미한다.
"알킬티오(alkylthio) 그룹"은 라디칼 -SRa을 의미하고, 여기에서 Ra는 알킬그룹이다.
"카르복시 그룹"은 라디칼 -C(O)OH를 의미한다.
"카르바모일(carbamoyl) 그룹"은 라디칼 -C(O)NH2를 의미한다.
"아릴옥시(aryloxy) 그룹"은 라디칼 -ORc를 의미하고, 여기에서 Rc는 아릴 그룹이다.
"헤테로아릴옥시(heteroaryloxy) 그룹"은 라디칼 -ORd를 의미하고, 여기에서 Rd는 헤테로아릴 그룹이다.
"아릴티오(arylthio) 그룹"은 라디칼 -SRc를 의미하고, 여기에서 Rc는 아릴 그룹이다.
"헤테로아릴티오(heteroarylthio) 그룹"은 라디칼 -SRd를 의미하고, 여기에서 Rd는 헤테로아릴 그룹이다.
"이탈기(Leaving group)(Lv)"는 치환반응에서 보여지는 적당한 그룹을 의미한다. 이 분야에서 통상적인 기술 중에서 강산이 염기와 접하여 이탈기로 작용할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 적당한 이탈기로는 -F, -Cl, -Br, 알킬 클로라이드, 알킬 브로마이드, 알킬 요오드, 알킬 설포네이트, 알킬 벤젠설포네이트, 알킬 p-톨루엔설포네이트, 알킬 메탄설포네이트, 트리플레이트(triflate) 및 비설페이트, 메틸 설페이트 또는 설포네이트 이온 가지는 그룹 등 제한없이 사용 가능하다.
일반적인 보호기(protecting group)들, 시약들과 용매들은 특별히 한정되지 않지만 아래 표 1에 기재하였고, 청구항과 본 명세서에서 사용되는 약자를 표기하였다. 이 분야에서 중요시되는 하나는 "반응물과 용매"로 기재된 화합물을 보호기로 사용할 수 있는 것과 같이 각 그룹 안에서 기재된 화합물들을 서로 교체하여 사용할 수 있다는 것이다. 더 나아가, 이 분야에서 알려진 다른 가능한 보호기, 반응물 및 용매를 사용할 수도 있고 이 역시 본 발명의 범위 안에 속하는 것으로 간주한다.
[표 1]
상기 용어 "적당한 유기물 부분"은 본 발명에 따른 화합물의 억제활성에 불리하게 작용하지 않는 것으로 통상적인 방법으로 정기검사(routine testing)를 통해 유기물 부분을 인식할 수 있는 것을 의미한다. 적당한 유기물 부분으로는 히드록실 그룹, 알킬 그룹, 옥소 그룹, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클로알킬 그룹, 아릴 그룹, 헤테로아릴 그룹, 아실 그룹, 설포닐 그룹, 메르캅토 그룹, 알킬티오 그룹, 알콕시 그룹, 카르복시 그룹, 아미노 그룹, 알킬아미노 그룹, 디알킬아미노 그룹, 카르바모일 그룹, 아릴티오 그룹, 헤테로아릴티오 그룹 등과 같이 제한을 받지 않고 사용한다.
용어 "치환체" 또는 "적당한 치환체"는 당업계에서 통상적인 기술에 의한 정기검사를 통해 인지되거나 선택되는 적당한 치환체를 의미한다. 적당한 치환체의 예로는 히드록시 그룹, 할로겐, 옥소 그룹, 알킬 그룹, 아실 그룹, 설포닐 그룹, 메르캅토 그룹, 알킬티오 그룹, 알킬옥시 그룹, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클로알킬 그룹, 아릴 그룹, 헤테로아릴 그룹, 카르복시 그룹, 아미노 그룹, 알킬아미노 그룹, 디알킬아미노 그룹, 카르바모일 그룹, 아릴옥시 그룹, 헤테로아릴옥시 그룹, 아릴티오 그룹, 헤테로아릴티오 그룹 등을 들 수 있다.
용어 "임의로 치환된"은 특히 하나 또는 그 이상의 적당한 치환체로 치환되거나 치환되지 않은 특정한 그룹을 가리키는 것으로, 임의의 치환체가 특별히 지정되어 있지 않다면, 지정된 치환체로 치환되거나 치환되지 않은 그룹을 가리키는 용어이다. 상기에서 정의한 바와 같이 여러 가지 그룹들이 특별한 언급이 없으면(예를 들면 지정된 그룹이 치환되지 않았다라든가 하는) 치환되거나(즉, 임의로 치환되거나) 치환되지 않은 그룹이다.
"프로드럭(prodrug)"은 어떠한 생리학적 조건하에서 또는 용매화 분해 (solvolysis) 또는 대사작용(metabolically)에 의해 그러한 화합물의 약제학적으로 활성화되는 특정한 화합물로 전환되는 화합물들을 의미한다.
"약제학적 활성화 대사산물(pharmaceutically active metabolites)"은 특정한 화합물의 체내에서 물질대사되어 생산되는 약제학적 활성화 산물을 의미한다.
"용제(solvate)"는 그 화합물의 생물학적 효능을 지니는 특정한 화합물의 약제학적 수용 가능한 용제형를 의미한다. 용제의 예로는 물, 이소프로판올, 에탄올, 메탄올, DMSO, 에틸 아세테이트, 아세트산 또는 에탄올아민과 혼합된 본 발명의 화합물을 들 수 있다.
"약제학적으로 수용 가능한 염"은 특정한 화합물의 자유 산 및 염기(free acids and bases)의 생물학적 효과가 유지되면서, 생물학적으로 또는 그외적으로 부작용이 없는 염을 의미한다. 상기 약제학적으로 수용 가능한 염의 예로는, 황산염, 피로황산염(pyrosulfates), 이황산염(bisulfates), 아황산염, 아황산수소염, 인산염, 일수소인산염(monohydrogenphosphates), 이수소인산염(dihydrogen-phosphates), 메타인산염(metaphosphates), 피로인산염(pyrophosphates), 염화물 (chlorides), 브롬화물(bromides), 요오드화물(iodides), 아세트산염(acetates), 프로피온산염(propionates), 데카노에이트(decanoates), 카프릴레이트 (caprylates), 아크릴산염(acrylates), 포름산염(formates), 이소부티레이트, 카프로에이트(caproates), 헵타노에이트(heptanoates), 프로피오레이트(propiolates), 옥살레이트(oxalates), 말로네이트(malonates), 숙신산염, 수베린산염(suberates), 세바신산염(sebacates), 푸말산염(fumarates), 말레인산염(maleates), 부티네-1,4-다이오에이트(butyne-1,4-dioates), 헥시네-1,6-다이오에이트(hexyne-1,6-dioates), 벤조산염, 클로로벤조산염(chlorobenzoates), 메틸벤조산염, 디니트로벤조산염(dinitrobenzoates), 히드록시벤조산염(hydroxybenzoates), 메톡시벤조산염 (methoxybenzoates), 프탈산염(phthalates), 설폰산염(sulfonates), 크실렌설폰산염(xylenesulfonates), 필아세테이트산염(phylacetates), 페닐프로피온산염 (phenylpropionates), 필낙산염(phylbutyrates), 시트르산염, 젖산염(lactates), γ-히드록시부티레이트(γ-hydroxybutyrates), 글리콜레이트(glycollates), 타르타르산염(tartrates), 메탄-설폰산염(methane-sulfonates), 프로판설폰산염 (propansulfonates), 나프탈렌-1-설폰산염(naphthalene-1-sulfonates), 나프탈렌-2-설폰산염(naphthalene-2-sulfonates) 및 만델레이트(mandelates)를 사용한다.
더 나아가 본 발명에서는 현재 사용되고 있는 합성단계 중의 하나로 구성된 합성방법으로 제조한다. 합성방법은 최종 합성방법의 적어도 한 부분인 합성단계인 합성단계로 구성되어 있다. 이와 같은 방법에서 합성방법은 그것과 결합하기 위해 단 하나의 합성단계 또는 부가적인 합성단계들을 가질 수 있다. 이러한 합성방법은 몇 번의 부가적 합성 단계를 거치거나 엄청나게 많은 부가적 합성단계를 거칠 수도 있다.
본 발명에서 제조한 일반식 Ⅰ의 항피코나바이러스 작용제가 염기라면, 바람직한 약제학적으로 수용 가능한 염은 염산(hydrochloric acid), 브롬화수소산 (hydrobromic acid), 황산, 질산, 인산(phosphoric acid) 등과 같은 무기산 또는 아세트산, 말레산(maleic acid), 숙신산(succinic acid), 만델산(mandelic acid), 푸마르산(fumaric acid), 말론산(malonic acid), 피루빈산(pyruvic acid), 옥살산(oxalic acid), 글리콜산(glycolic acid), 살리실산(salicylic acid), 피라노시딜산(pyranosidyl acid)과 같은 유기산, 글루코론산(glucuronic acid), 갈락투론산(galacturonic acid), 시트르산 또는 타르타르산(tartaric acid)과 같은 알파히드록시산(alphahydroxy acid) 또는 아스파르트산(aspartic acid) 또는 글루탐산(glutamic acid)과 같은 아미노산; 벤조산 또는 시나민산(cinnamic acid)과 같은 방향족산(aromatic acid), p-톨루엔설폰산(p-toluenesulfonic acid) 또는에탄설폰산(ethanesulfonic acid) 등으로 자유염기를 처리하는, 알려진 통상적인 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명에서 제조한 일반식 Ⅰ의 항피코나바이러스 작용제가 산이라면, 바람직한 약제학적으로 수용 가능한 염은 아민(일차, 이차, 또는 삼차)과 같은 무기염기 또는 유기염기, 알칼리 금속 또는 알카라인 토류금속(earth metal) 수산화물 등의 자유산을 처리하는 알려진 통상의 방법으로 제조될 수 있다. 적당한 염의 예로는 글리신과 아르기닌과 같은 아미노산, 암모니아, 일차, 이차, 삼차 아민, 및 피페리딘(piperidine), 모르폴린(morpholine) 및 피페라진 (piperazine)과 같은 사이클릭 아민으로부터 유도되는 유기염뿐만 아니라 나트륨, 칼슘, 칼륨, 마그네슘, 망간, 철, 구리, 아연, 알루미늄 및 리튬으로부터 유도되는 무기염을 들 수 있다.
화합물, 염 또는 용제가 고체인 경우, 본 발명의 합성과정에서 사용되는 일반식 Ⅰ의 화합물과 중간물질들, 염 및 용제들은 여러가지 다른 형태의 결정구조로 존재할 수 있고, 이들 모두는 본 발명의 범위 및 상기에서 특정한 일반식들의 범위 내에 의도적으로 포함될 수 있다는 것은 당업자에 의해서 이해될 수 있다.
일반식 Ⅰ의 항피코나바이러스 작용제와 본 발명의 제조과정에서 사용되는 중간물질은 단일 입체 이성질체들, 라세미체들(racemates) 및/또는, 거울상 이성질체들 및/또는 부분입체 이성질체들의 혼합물로 존재한다. 모든 단일 입체 이성질체들, 라세미체들 및 그들의 혼합물들은 본 발명의 넓은 범위 안에 속한다. 그러나 본 발명의 제조과정에서 중간에 생성되는 중간 화합물들은 가급적 광학적으로 순수한 형태를 사용하였다.
광학적으로 순수한 화합물은 거울상으로 순수한 것임을 당업자에 의해 이해될 수 있다. 여기에서 사용된 용어 "광학적으로 순수한"은 원하는 약리적 활성을 가지는 화합물을 수득하기 위해 적어도 단일 거울상 이성질체의 충분한 양에서 이루어진 화합물을 의미한다. 바람직하게는 "광학적으로 순수한"은 적어도 단일 이성질체(거울상 이성질체가 80% 이상)의 90%로 이루어진 화합물을 의미하고, 더욱 바람직하게는 적어도 최소한 95%(거울상 이성질체가 90% 이상), 보다 더욱 바람직하게는 적어도 97.5%(거울상 이성질체가 95% 이상) 및 가장 바람직하게는 적어도 99%(거울상 이성질체가 98% 이상)인 화합물을 의미한다. 바람직하게는 본 발명의 제조과정에서 생성되는 일반식 Ⅰ의 항피코나바이러스 작용제는 광학적으로 순수한 것이다.
본 발명은 하기 일반식 Ⅰ의 항피코나바이러스 작용제의 제조과정에 관한 것이다:
여기에서 R1은 H, F, 알킬그룹, OH, SH 또는 O-알킬그룹이고;
R2및 R3는 각각 독립적으로 H;
이고;
여기에서 n은 0 내지 5의 정수이고, A1은 CH 또는 N, A2와 A3는 각각 C(R41)(R41), N(R41), S, S(O), S(O)2및 O로부터 독립적으로 선택된 것이고, A4는 NH 또는 NR41, 여기에서 R41은 독립적으로 H 또는 저가 알킬이고, A1, A2, (A3)n, A4및 C=O에 의해 형성된 상기에서 표시한 링이 연속적으로 존재하는 둘이상의 이종원자들을 제조하였고, R2와 R3중의 적어도 하나는
이고;
R4는
;
R5와 R6는 각각 독립적으로 H, F, 알킬 그룹, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클로알킬 그룹, 아릴 그룹 또는 헤테로아릴 그룹이며;
R7및 R8각각 독립적으로 H, 알킬 그룹, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클로알킬 그룹, 아릴 그룹, 헤테로아릴 그룹, -OR17, -SR17, -NR17R18, -NR19NR17R18또는 -NR17OR18이고, 여기에서 R17, R18및 R19는 각각 독립적으로 H, 알킬 그룹, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클로알킬 그룹, 아릴 그룹, 헤테로아릴 그룹 또는 아실 그룹이고, R7과 R8중 적어도 하나는 알킬 그룹, 아릴 그룹, 헤테로아릴 그룹, -OR17, -SR17, -NR17R18, -NR19NR17R18또는 -NR17OR18이고; R9는 O, N 및 S에서 선택된 하나 내지 세 개의 이종원자들을 가지는 5환 헤테로고리이며; 및
Z와 Z1은 각각 독립적으로 H, F, 알킬 그룹, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클로알킬 그룹, 아릴 그룹, 헤테로아릴 그룹, -C(O)R21, -CO2R21, CN, -C(O)NR21R22, -C(O)NR21OR22, -C(S)R21, -C(S)NR21R22, -NO2, -SOR21, -SO2R21, -SO2NR21R22, -SO(NR21)(OR22), -SONR21, -SO3R21, -PO(OR21)2, -PO(R21)(R22), -PO(NR21R22)(OR23), -PO(NR21R22)(NR23R24), -C(O)NR21NR22R23또는 -C(S)NR21NR22R23이며, 여기에서 R21, R22, R23및 R24는 각각 독립적으로 H, 알킬 그룹, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클로알킬 그룹, 아릴 그룹, 헤테로아릴 그룹, 아실 그룹 또는 티오아실 그룹이거나, 또는 Z와 Z1이 둘다 H인 것이 아니라는 조건에서 R21, R22, R23및 R24중 2개의 원자가 결합하여 헤테로사이클로알킬 그룹을 형성한다;
또는 Z1과 R1은 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 그룹을 형성할 수 없는 부분임을 제외하고 상기에서 정의한 바와 같은 경우로서, Z1과 R1원자가 결합하여 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 그룹을 형성한다;
또는 Z1과 Z1은 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 그룹을 형성할 수 없는 부분임을 제외하고 상기에서 정의한 바와 같은 경우로서, Z와 Z1원자가 결합하여 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 그룹을 형성한다.
본 발명에서는 일반식 Ⅱ의 화합물과 일반식 Ⅲ의 화합물이 아미드 생성 반응을 거침으로써 일반식 Ⅰ의 화합물을 제조하는 것을 개시하고 있다.
아미드 생성 반응은 적당한 방법, 반응물 및 반응조건에 의해 이루어진다. 바람직하게는 상기 '354출원에서 개시한 방법 중의 하나를 사용하였다. 예를 들면, 원하는 일반식 Ⅰ의 화합물을 얻기 위해 일반식 Ⅱ의 화합물을 HATU, DIPEA, CH3CN 및 H2O의 존재하에 일반식 Ⅲ의 화합물과 반응시킨다. 적당한 정제방법으로 일반식 Ⅰ의 화합물을 정제한다.
보다 바람직하게는, 일반식 Ⅰ의 화합물은 하기의 단계를 포함하는 아미드 생성 반응에 의해 제조된다:
(a) N-메틸모르폴린(N-methylmorpholine) 존재하에 일반식 Ⅱ의 화합물과 일반식 ⅢA의 화합물을 반응시켜 반응 혼합물을 제조하는 단계; 및
(b) 상기 반응 혼합물에 일반식 Lv-X의 화합물을 첨가하여 일반식 Ⅰ의 화합물을 제조하는 단계. 여기에서 X는 임의의 적당한 할로겐화물이다.
바람직하게는, 아래에서 기재한 반응물들과 반응 조건들을 모두 또는 일부만 사용하여 보다 바람직한 아미드 생성 반응을 거쳐 일반식 Ⅰ의 화합물을 제조한다. 그러므로, 바람직하게는 일반식 Ⅱ의 화합물과 일반식 ⅢA의 화합물을 DMF에 용해하여 적당한 콘테이너 안에서 결합시킨다. 이 적당한 콘테이너로는 적당한 격막으로 덮여 있고, 온도 탐침을 가지는 단일목(single neck) 플라스크를 사용하는 것이 바람직하다. 질소가스로 적당한 콘테이너를 정화시킨 후 N-메틸모르폴린을 반응 혼합물에 첨가하였다. 보다 바람직하게는, N-메틸모르폴린을 한 방울씩 주입기(스포이드)를 통해 첨가하고, 반응 혼합물을 약 -5℃와 5℃ 사이로 냉각시킨다. 더욱 바람직하게는 상기 반응 혼합물을 약 0℃로 냉각시킨다. 그런다음 상기 반응 혼합물에 일반식 Lv-X의 화합물 용액을 첨가시킨다. 더욱 바람직하게는 일반식 Lv-X의 화합물 용액이 일반식 Lv-X의 화합물 용액을 DMF에 용해한 용액인 것을 사용한다. 더욱더 바람직하게는 일반식 Lv-X의 화합물이 CDMT이다. 일반식 Lv-X의 화합물 용액을 반응 혼합물의 온도를 일정하게 유지시키면서 적당한 방법에 의해 상기 반응 혼합물에 첨가한다. 예를 들면, 일반식 Lv-X의 화합물 용액을 주입기를 사용하여 상기 반응 혼합물에 한방울씩 떨어뜨려 첨가한다. 일반식 Lv-X의 화합물 용액을 모두 첨가하고 나면 상기 반응 혼합물을 상온으로 가온한다. 반응의 진행은 박층크로마토그래피(이하 "TLC"라 한다)에 의해 일반식 Ⅱ의 화합물이 소모되는 것을 모니터하여 알아볼 수 있다. 상기 반응이 실제로 완료되면 상기 반응 혼합물에 물을 천천히 첨가하여 일반식 Ⅰ의 화합물을 슬러리(slurry) 형태로 침전시킨다. 그런 다음 알려진 통상적인 방법 중 적당한 수단으로 슬러리로부터 일반식 Ⅰ의 화합물을 제거시킨다. 예를 들면, 여과를 통해 슬러리로부터 일반식 Ⅰ의 화합물을 제거시킨다. 당업계에서 통상적으로 알려진 정제방법 중의 하나로 일반식 Ⅰ의 화합물을 정제한다. 보다 바람직하게는 일반식 Ⅰ의 화합물을 재결정화하여 정제한다.
일반식 ⅢA의 화합물은 통상적으로 알려진 기술 중의 하나로 제조할 수 있다. 그러나 본 발명에서는 일반식 ⅢA의 화합물을 제조하기 위해 일반식 ⅢB의 화합물과 TFA를 반응시키는 단계로 구성된 새로운 방법을 개시하고 있다:
바람직하게는, 일반식 ⅢB의 화합물로부터 일반식 ⅢA의 화합물을 제조하기 위해 아래에 기재된 반응물과 반응조건의 일부 또는 전부를 이용한다. 따라서, 일반식 ⅢB의 화합물과 DCM을 적당한 콘테이너에 넣고 격막으로 덮는다. 그런 다음 콘테이너를 질소로 정화시키고 TFA를 첨가한다. 보다 바람직하게는 교반하면서 TFA를 주입기를 통해 첨가한다. 반응 진행을 TLC로 관찰한다. 출발물질이 사라지면 용매와 여분의 TFA를 진공증발과 같은 적당한 방법으로 제거한다. 바람직하게는 일반식 ⅢA의 화합물을 일반식 Ⅰ의 화합물을 제조하는 본 발명의 제조과정에 바로 사용한다.
또한 본 발명은 일반식 ⅡA의 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다:
일반식 ⅡA의 화합물이 일반식 Ⅱ로 정의된 부류에 속한다는 것은 당업자라면 인식할 수 있을 것이다. 따라서, 일반식 ⅡA의 화합물 또한 일반식 Ⅰ의 항피코나바이러스 작용제를 제조하기 위한 중간물질로 사용된다.
본 발명에 의한 일반식 ⅡA의 화합물의 제조과정은 다음의 단계들을 포함한다:
(a) 일반식 XⅢ의 화합물을 1,1'-카르보닐디이미다졸(1,1'-carbonyldiimidazole) 및 t-부틸 아세테이트의 리튬 에놀레이트(lithium enolate)와 반응시켜 일반식 XIV의 β-케토에스테르로 전환시키는 단계;
(b) 일반식 XIV의 화합물을 적당한 반응조건에서 일반식 XVI의 화합물과 반응시켜 일반식 XV의 에톨레이트로 전환시키는 단계;
(c) 일반식 XV의 화합물을 가수소분해(hydrogenolysis)하여 일반식 XⅦ의 화합물을 제조하는 단계;
(d) 일반식 XⅦ의 화합물을 적당한 반응조건에서 일반식 R20-X의 화합물과 반응시켜 일반식 XⅧ의 화합물을 제조하는 단계. 여기에서 X는 할로겐화물이다; 및
(e) 일반식 XⅧ의 화합물을 효소 가수분해를 통해 일반식 ⅡA의 화합물을 제조하는 단계.
바람직하게는 일반식 XⅢ의 화합물을 아래에 기재한 반응물과 반응조건의 일부 또는 전부를 이용하여 일반식 XⅣ로 전환시키는 방법으로 제조한다. 따라서, 일반식 XⅢ의 화합물을 THF에 용해된 CDI와 질소 증기하에 약 1시간동안 상온에서 교반하여 아실 이미다졸 중간물질을 생성한다. 그런 다음 먼저 -70℃로 냉각한 분리 콘테이너 안에 리튬 비스트리메틸실릴아미드(bistrimethylsilylamide) 용액(이하 "LiHMDS"라 한다)을 질소분위기에서 TFA에 넣는다. LiHMDS 용액에 반응 혼합물을 -60℃ 이하로 유지하면서 t-부틸 아세테이트를 천천히 첨가시킨다. t-부틸 아세테이트의 리튬 에놀레이트로 구성된 상기 반응 혼합물에 상기에서 제조한 아실 이미다졸 중간물질을 질소 존재하에 내부온도를 -60℃ 이하로 유지하면서 천천히 첨가시킨다. 첨가반응이 완료되면 상기 반응 혼합물을 -60℃에서 적어도 약 1시간정도 더 교반시킨다. 상기 반응 혼합물에 1M HCl을 채워넣어 반응을 중단시킨다. HCl을 내부온도를 -50℃ 이하로 유지하고 강하게 교반하면서 천천히 첨가시킨다. 중단하는 동안의 높은 온도에서 라세미화가 발생한다. 농축된 HCl을 첨가시켜 pH 6-7.5 사이가 되도록 맞춘다. 침전된 고체를 여과한다. 온도가 올라가면 불순물이 용해되므로가급적 낮은 온도에서 신속히 셀라이트로 여과한다. 그런 다음 고체를 MTBE로 세척한다. 여과물을 MTBE와 HCl로 희석하고 적어도 약 15분간 교반시킨다. pH는 1-2 사이를 유지하도록 체크한다. 유기물층을 분리한 후 키랄 HPLC로 키랄 순도를 알아본다. 키랄적으로 순수한 생성물을 원한다면 이 단계에서 키랄 순도가 약 98% 이어야 한다. 유기물층을 세척하고, 바람직하게는 1M HCl로 세척하고, 적어도 약 15분간 교반한 다음 층을 분리시킨다. 유기물을 세척하고, 바람직하게는 포화 소듐 비카르보네이트 용액으로 세척하고, 적어도 약 15분간 교반시킨 후 층을 분리시킨다. 그런 다음 유기물층을 세척, 바람직하게는 염수로 세척한다. 상분리한 후 유기물층을 건조시키고, 바람직하게는 무수 마그네슘 황산염으로 건조시킨다. 그런 다음 용매와 반응하지 않은 t-부틸 아세테이트를 여과하고 진공상태에서 제거시킨다. t-부틸 아세테이트와 실록산(siloxanes)을 제거하기 위해 적어도 약 20시간동안 고진공시킨다. 이 단계에서 생성물을 순수하게 분석할 수 있다. 특히 약 90% 미만의 순도를 가지는 생성물일 경우는 20% 에틸 아세테이트/헥산을 사용한 실리카에서 크로마토그래피를 거칠수 있다. 상기의 적당한 조건하에서 60 내지 88% 사이의 수율로 일반식 XⅣ의 화합물을 얻을 수 있다.
일반식 XⅣ의 화합물을 적당한 방법, 반응물 및 반응조건을 사용하여 일반식 Ⅵ의 화합물과 반응시켜 일반식 XV의 화합물로 전환시킨다. 이 일반적인 방법은 본 발명에서 전체 내용을 수록한 관련논문(R. V. Hoffman and J. Tao, Tetrahedron, Vol. 53, No. 21, pp. 7119-7126, 1997)에서 개시하고 있다. 바람직하게는, 아래에 기재한 제조방법 및 반응물과 반응조건의 전부 또는 일부를 사용하여 제조한다. 따라서 일반식 XⅣ의 화합물을 먼저 알칼리 금속 수소화물과 반응시킨 후, 일반식 XⅥ의 화합물과 반응시킨다. 보다 바람직하게는 알칼리 금속 수소화물로 수소화 나트륨(sodium hydride)을 사용한다. 알칼리 금속 수소화물과의 반응은 0℃에서 3℃ 사이에서 수행한다. 상기 반응 혼합물에 일반식 XⅥ의 화합물을 첨가하는 동안 반응물의 온도를 약 0℃와 5℃ 사이로 유지시킨 후 반응 혼합물을 적어도 약 2시간이상에서 서서히 주변온도로 가온시킨다.
본 발명에서는 통상적인 방법으로 일반식 XV의 화합물을 적당한 가수소분해시켜 일반식 XⅦ의 화합물로 전환시킨다. 바람직하게는 압력하에서 팔라듐 가수소분해를 수행한다.
본 발명에서는 적당한 반응조건에서 일반식 XⅦ의 화합물을 아실화시킨다. 바람직하게는 아래에 기재된 방법 및 반응물과 반응조건의 일부 또는 전부를 이용한다. 따라서 일반식 XV의 조화합물을 염화 메틸렌에 용해하고 아르곤 블랭킷(blanket) 아래의 얼음/염 욕조를 사용하는 것과 같이 적당한 수단을 이용하여 내부온도를 0℃로 냉각시킨다. 상기 용액에 액상의 일반식 R20-X 화합물을 채운다. 보다 바람직하게는 R20-X로 R20-Cl을 사용한다. 그런 다음 디이소프로필에틸 아민을 천천히 첨가한다. 상기 반응물을 천천히 상온으로 가온한다. 반응을 TLC로 모니터하고 최종족으로 HPLC를 거친다. 일반적으로 이 반응은 약 1시간 이내에 완결된다. HCl을 첨가하여 반응을 중단시키고, 수용성층을 제거한 다음 유기물을 HCl로 재추출한다. 그런다음 수용성 상을 제거하고 유기물을 포화 비카르보네이트로 추출시킨다. 유기물을 건조하고, 바람직하게는 황산나트륨으로 건조한 후 생성물을 여과하고 진공하에서 농축한다.
일반적으로 적당한 효소의 가수분해를 통해 일반식 XⅧ의 화합물을 일반식 ⅡA의 화합물로 전환시킨다. 그러나 본 발명에서는 화합물 ⅡA가 R7과 R8그룹에 결합하는 탄소에서 5% 미만의 에피머(epimer)를 생성하기 때문에 표준 반응조건에서의 가수분해와 대립되는 탁월한 효소 가수분해를 이용하는 것을 개시하고 있다. 효소 가수분해 단계에서는 적당한 기구들이 사용된다. 바람직하게는 연속적인 막 반응기를 사용한다. 보다 바람직하게는, 뒤에서 기재될 본 발명에 의한 연속적인 막 반응기를 사용한다.
바람직하게는 돼지의 췌장(pancrease) 지방분해효소(lipase)를 화합물 XⅧ의 가수분해 효소로 사용한다. 보다 바람직하게는 효소의 가수분해는 약 pH 7.2이고 37-40℃ 사이의 온도에서 수행한다.
본 발명에 의한 일반식 ⅡA의 화합물의 또 다른 제조과정은 다음의 단계들을 포함한다:
(a) 일반식 XⅨ의 화합물을 1,1'-카르보닐디이미다졸과 반응시킨 후 t-부틸 아세테이트의 리튬 에놀레이트를 처리하여 일반식 XX의 β-케토에스테르로 전환시키는 단계;
(b) 일반식 XX의 화합물을 일반식 XXⅡ와 적당한 반응조건에서 반응시켜 일반식 XXI의 화합물로 전환시키는 단계;
(c) 일반식 XXⅡ의 화합물을 수소화반응시켜 일반식 XXⅢ의 화합물을 제조하는 단계; 및
(d) 일반식 XXⅢ의 화합물을 R20-X와 적당한 조건에서 반응시켜 아실화하여 일반식 ⅡA의 화합물을 제조하는 단계. 여기에서 X는 적당한 할로겐화물이다.
바람직하게는 일반식 XIX의 화합물을 아래에 기재한 반응물 및 반응조건의일부 또는 전부를 사용하여 일반식 XX의 화합물로 전환시킨다. 따라서, 일반식 XIX의 화합물을 THF에 용해하고, 상온에서 1,1'-카르보닐디이미다졸을 첨가한다. 반응 혼합물을 상온에서 1시간동안 교반하여 아실 이미다졸 중간물질을 제조한다.
분리 콘테이너에서, THF에 LiHMDS를 용해한 혼합용액에 σ-벤질 아세테이트를 서서히 첨가시킨다. 이 반응은 발열반응이므로 온도를 -70℃이하로 유지시키는 것이 바람직하다. 상기 반응 혼합물을 30분간 교반시킨 후 아실 이미다졸 용액을 천천히 첨가시킨다. 이 반응도 발열반응이므로 반응 혼합물의 온도를 -68℃로 유지시키는 것이 바람직하다. 건조 얼음 욕조와 같은 적당한 냉각 수단으로 반응 혼합물을 냉각시킨다. 반응 혼합물을 적어도 약 55분간 교반시킨 후 냉각 수단을 제거시킨다. 그런 다음 상기 반응 혼합물에 산을 넣어 반응을 중단시킨다. 보다 바람직하게는 산으로 1M HCl을 사용하고, 이 산을 서서히 첨가하며, 산을 첨가하는 동안 반응 혼합물의 온도를 25℃로 유지시킨다. 반응이 중단된 혼합물의 유기물층을 분리하고 세척한다. 보다 바람직하게는 유기물층을 포화 소듐 비카르보네이트와 염수로 세척한다. 유기물층을 건조한 다음 농축하여 일반식 XX의 화합물을 수득한다. 보다 바람직하게는, 마그네슘 황산염을 건조제로 사용한다. 일반식 XX의 화합물의 분해를 막기 위해 생성된 화합물을 냉각장치에서 보관한다.
바람직하게는 일반식 XX의 화합물을 아래에 기재한 반응물 및 반응조건의 일부 또는 전부를 이용하여 일반식 XXI의 화합물로 전환시킨다. 따라서 일반식 XX의 화합물을 THF에 NaH를 용해한 용액에 서서히 첨가한다. 보다 바람직하게는 THF에 NaH을 용해한 용액에 일반식 XX의 화합물을 첨가하는 동안 약 -10℃로 유지해 준다. 일반식 XX의 화합물을 용액에 첨가한 후 반응 혼합물을 약 20분간 가온시킨다. 그런 다음 염화 메틸렌에 일반식 XXⅡ의 화합물을 용해한 용액을 상기 반응 혼합물에 첨가시킨다. 적당한 방법을 사용하여 출발물질이 소모되는 것을 관찰하여 반응의 진행을 모니터한다. 예를 들면, HPLC를 반응 진행을 모니터하는데 사용한다. 상기 반응 혼합물을 48시간 동안 교반한 후 MTBE를 첨가한다. 그런 다음 상기 반응 혼합물에 적당한 산을 첨가한 후 수용성층을 분리하고 MTBE로 추출한다. 보다 바람직하게는 산으로 1M HCl을 사용한다. 유기물층을 결합, 건조, 여과 및 농축하여 일반식 XXI의 화합물을 수득한다. 보다 바람직하게는 결합된 유기물층을 마그네슘 황산염으로 건조시키고 실리카겔의 짧은 패드(short pad)로 여과시킨다.
바람직하게는 일반식 XXI의 화합물을 아래에 기재한 반응물과 반응조건의 일부 또는 전부를 이용하여 일반식 XXⅢ의 화합물로 전환시킨다. 따라서, 일반식 XXI의 화합물을 가스를 제거한 THF 혼합물과 농축한 산에 용해시킨다. 보다 바람직하게는 농축한 산으로 황산을 사용한다. 반응 혼합물에 10% Pd-C를 첨가한 후 파르 셰이커(Parr shaker)에서 약 50 psi 압력하에서 약 5시간동안 교반시킨다. 그런 다음 상기 혼합물을 메탄올에 용해하고, 셀라이트로 여과하여 일반식 XXⅢ의 화합물을 수득한다.
바람직하게는 일반식 XXⅢ의 화합물을 아래에 기재한 반응물과 반응조건의 일부 또는 전부를 이용하여 일반식 ⅡA의 화합물로 전환시킨다. 일반식 XXⅢ의 화합물을 디옥산(dioxane)에 용해한 후 0℃에서 디이소프로필에틸아민을 첨가하여 현탁액을 생성한다. 같은 온도에서 디옥산에 일반식 R20-X의 화합물을 용해한 용액을 상기 현탁액에 첨가하여 반응 혼합물을 생성한다. 보다 바람직하게는 R20-X로 R20-Cl을 사용한다. 그런 다음 반응 혼합물을 적어도 약 1시간동안 교반시킨 후 상기 반응 혼합물에 염화 메틸렌을 첨가한 다음 1M HCl로 세척한 후, 포화 소듐 비카르보네이트로 세척하고, 마그네슘 황산염으로 건조한 다음 짧은 패드 실리카겔로 여과하여 일반식 ⅡA를 제조한다.
그런 다음 일반식 ⅡA의 화합물을 당업계에서 알려진 통상적인 기술로 정제한다. 예를 들면, 재결정화 및/또는 크로마토그래피를 이용하여 정제한다.
또한 본 발명은 일반식 XXⅡ의 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기에서 기재한 일반식 XXⅡ의 화합물은 일반식 ⅡA의 화합물을 제조하는 과정에서 필요한 중요한 출발물질이다. 일반식 XXⅡ의 화합물을 제조하는 과정은 다음 단계를 포함한다:
(a) 일반식 XXⅣ의 화합물을 트리에틸아민과 벤질 브로마이드와 반응시켜 일반식 XXV의 화합물을 제조하는 단계; 및
(b) 일반식 XXV의 화합물을 일반식 XXⅡ의 화합물로 전환시키는 단계.
바람직하게는 일반식 XXⅣ의 화합물을 아래에 기재한 반응물과 반응조건의 일부 또는 전부를 이용하여 일반식 XXV의 화합물로 전환시킨다. 따라서, 일반식 XXⅣ의 화합물을 아세톤에 용해한 후 30℃ 이하의 온도에서 트리에틸아민을 서서히 첨가한다. 그런 다음 상기 반응 혼합물에 벤질 브로마이드를 첨가한 후 적어도 약 65시간동안 교반시킨다. 그런 다음 상기 반응 혼합물에 MTBE를 넣고 약 5분간 교반시킨다. 상기 반응 혼합물을 짧은 패드의 실리카겔로 여과하여 반응 혼합물에서 침전된 대부분의 트리에틸렌아민염을 제거시킨다. 그런 다음 실리카겔을 MTBE로 세척한 후 여과물을 결합시킨다. 결합된 여과물을 세척한다. 보다 바람직하게는 여과물을 1M HCl, 포화 소듐 비카르보네이트 및 염수로 세척한다. 그런 다음 여과물을 마그네슘 황산염으로 건조한 후 짧은 패드 실리카겔로 여과하고 농축하여 일반식 XXV의 화합물을 얻는다. 일반식 XXV의 화합물을 재결정화하여 결정체로 제조한다.
바람직하게는 일반식 XXV의 화합물을 아래에 기재한 반응물 및 반응조건의 일부 또는 전부를 이용하여 일반식 XXⅡ의 화합물로 전환시킨다. 따라서, 일반식 XXV의 화합물을 염화 메틸렌에 용해하고 약 -10℃로 냉각시킨다. 일반식 XXV의 화합물의 히드록시 그룹을 적당한 이탈기로 치환하여 일반식 XXⅡ의 화합물을 제조한다. 이때 바람직하게는 이탈기로 -OTf를 사용한다. 보다 바람직하게는 염화 메틸렌에 일반식 XXV의 화합물을 용해한 용액에 Tf2O를 첨가한 후 2,6-루티딘(lutidine)을 서서히 첨가한다. 이때 상기 반응이 발열반응이므로 반응 혼합물의 온도를 -8℃ 이하로 유지시키는 것이 바람직하다. 2,6-루티딘을 반응 혼합물에 첨가한 후 반응 혼합물을 교반하고 1시간동안 가온한다. 상기 반응 혼합물을 하우스 진공(house vacuum)에서 농축한다. 일반적으로 오일 형태인 조생성물을 헥산에 용해하고 드라이 아이스 상에서 교반하여 루티디늄염(lutidinium salt)을 침전시킨다. 그런 다음 침전물을 실리카겔의 박층(thin layer)으로 여과한다. 여과물을 농축하여 일반식 XXⅡ의 화합물을 수득한다. 여기에서 이탈기(Lv)는 -OTf를 사용한다.
또한 본 발명은 일반식 ⅡA; XⅧ; XⅦ; XV; ⅢB 및 ⅢA의 화합물 범주안에 속하는 각각의 새로운 화합물들에 관한 것이다. 아래에 기재한 이들 각각의 화합물들은 각각 AG7088을 포함하는 일반식 Ⅰ의 항피코나바이러스 화합물을 합성하기 위한 본 발명의 제조과정에서 중간물질로 사용된다:
본 발명의 또다른 목적은 일반식 ⅡA의 화합물을 제조하기 위한 본 발명의 제조과정에서 사용한 주요 반응물인 일반식 XXⅣ와 일반식 XⅥ의 범위에 속하는 화합물들의 제조과정을 개선시키는 것이다.
먼저, 첫번째 과정은 일반식 XXⅣ의 범위에 속하는 일반식 Ⅶ의 화합물들을 제조하기 위한 과정으로, 선택적으로 일반식 Ⅶ를 일반식 XⅥ의 화합물과 겹쳐지는 범위를 가지는 일반식 XⅥA의 화합물로 전환시킬 수도 있다:
여기에서 R10은 할로겐 또는 알킬그룹이고;
단계 A : 일반식 Ⅵ의 화합물을 다음과 같은 방법으로 일반식 Ⅴ의 화합물로 전환시키는 단계:
(a) 환류 온도에서 촉매 존재하에 수용성 배지에서 일반식 Ⅵ의 R10이 치환된 벤즈알데히드를 히단토인 (hydantoin)과 반응시켜 반응 혼합물을 생성하는 단계:
(b) 환류온도에서 상기 단계 (a)에서 생성한 반응 혼합물에 충분한 양의 알칼리 금속 수산화물을 처리하여 알칼리 금속 수산화물-처리 용액을 생성하는 단계;
(c) 알칼리 금속 수산화물-처리 용액에 알칼리 금속 할로겐화물을 첨가하는 단계;
(d) 농축한 산으로 상기 단계 (c)에서 제조한 용액을 산성화하여 일반식 Ⅴ의 침전물을 제조하는 단계;
및
(e) 선택적으로 일반식 Ⅴ의 침전물을 세정제로 세척하는 단계;
단계 B: 일반식 Ⅴ의 화합물을 촉매 환원반응시켜 일반식 Ⅶ의 화합물을 생성하는 단계;를 포함하고,
선택적 단계 C: 일반식 Ⅶ의 화합물을 일반식 R"-OH의 화합물과 에스테르화 반응을 거쳐 일반식 XⅡ의 화합물을 제조하는 단계. 여기에서 R"는 알킬 또는 아릴이다; 및
선택적 단계 D: 일반식 XⅡ의 화합물을 일반식 XⅥA의 화합물로 전환시키는 단계;를 포함한다.
따라서, 본 발명에서는 수용성 배지에서 일차 또는 이차 아민의 촉매량 존재하에 적어도 4시간동안 환류하는 히단토인과 R10이 치환된 벤즈알데히드의 반응에서를 사용된 아민에 의존하여 R10이 치환된 5-벤질리덴 히단토인을 제조할 수 있음을 개시하고 있다. 이때 수용성 배지보다 높은 비등점을 가지는 아민을 사용하는 것이 바람직하다. 특히 1-아미노-2-프로판올을 사용하는 것이 바람직하다. 1-아미노-2-프로판올을 촉매로 사용할 경우, 수용액으로 물을 사용하고 R10이 치환된 벤즈알데히드와 히단토인과 촉매의 몰비율을 1:1:0.1로 하여 4시간동안 반응시킨다.
본 발명에 의한 R10이 치환된 5-벤질리덴 히단토인을 충분한 양의 알칼리 금속 수산화물로 가수분해시킬 수 있다. 바람직하게는 알칼리 금속 수산화물로 나트륨 수산화물을 사용한다. 1-아미노-2-프로판올이 촉매로 사용될 경우는 나트륨 수산화물과 히단토인의 몰비율을 각각 5:1로 하고 약 5시간동안 환류시켜 반응을 완성한다.
또한 본 발명에서는 알칼리 금속 할로겐화물을 첨가한 알칼리 금속 수산화물-처리 용액을 산성화하여 알칼리 금속 R10이 치환된 페닐피루베이트 (phenylpyruvate) 일수화물의 침전을 증가시키는 것에 관하여 개시하고 있다. 바람직하게는 알칼리 금속 할로겐화물로 염화나트륨을 사용한다. 염화나트륨을 사용할 경우, 대부분의 나트륨 페닐피루베이트가 약 pH 8.5에서 나트륨 페닐피루베이트 일수화물로 침전된다.
바람직하게는, 수집한 알칼리 금속 페닐피루베이트 일수화물 침전물을 세척하여 남아있는 불순물들을 제거하고 원하는 건조과정을 촉진시킨다. 적당한 세정제로는 당업계에서 알려진 것 중 통상적으로 이용되는 것을 사용한다. 바람직하게는 일차 알콜은 세정제로 사용한다. 보다 바람직하게는 알칼리 금속 페닐피루베이트 일수화물 침전물은 메탄올에서는 녹지않으므로 세정제로 메탄올을 사용한다.
일반식 Ⅴ의 화합물을 촉매작용 환원반응시키는 단계 B에서는 당업계에 알려진 통상적인 효소를 사용한다. 바람직하게는 포르메이트 디하이드로게나아제 (formate dehydrogenase)와 락테이트 디하이드로게나아제(lactate dehydrogenase)로 촉매작용 환원반응을 수행한다.
적당한 효소환원방법은 당업계에서 알려진 통상적인 기술을 사용한다. 바람직하게는 막-첨부 효소촉매법(membrane-enclosed enzymatic catalysis method; 이하 "MEEC법"이라 한다) 또는 보조고정법(coimmobilization method)을 사용한다. 이러한 통상적인 방벙은 당업계에서 잘 알려져 있다. 예를 들면, 막형성 효소촉매법에 관한 일반적인 논문인 Bednarski et al., J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 1283-1285을 참조하고, 보조고정법에 대해서는 Pollak et al., J. Am. Chem. Soc 1980, 102, 6234-6336 논문을 참조한다. 이들 참고자료들은 본 발명에서 전부 참고로 수록하고 있다. 한편, 단계 B의 효소환원반응이 보다 더 자세한 범위의 준비과정을 포함하는 경우, 바람직하게는 연속적인 막반응기를 사용한다. 보다 바람직하게는 본 발명에 의한 연속적인 막 반응기를 사용한다. 본 발명에 의한 연속적인 막 반응기를 사용할 경우, 다음의 반응물과 반응조건을 전부 또는 일부를 이용한다: 1% NAD, 4당량의 암모늄 포르메이트, pH 7.3-7.4인 유출물, pH 6.2-6.3인 기질, FDH/LDH=20/200(U/㎖) 및 1mM 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)을 사용한다.
보조고정법은 다음의 4단계를 거쳐 수행한다. 첫번째는 N-아크릴옥시숙신이미드(N-acryloxysuccinimide)를 제조하는 단계이다. 두번째는 보조고정법으로 공중합체(copolymer)를 제조하는 단계이다. 바람직하게는 상기 공중합체가 라디칼 공중합반응을 거쳐 제조된 PAN 500이다. 당업자라면 PAN 500이 충분한 양의 수용성 에틸아민 용액을 처리한 N-히드록시숙신이미드 1그램에 대하여 500(±25)μmol을 유리한 아크릴아미드와 N-아크릴옥시숙신이미드의 수용성 공중합체라는 것을 알 수있다. 세번째 단계는 효소의 보조고정단계이다. 바람직하게는 상기에서 기재한 대로 효소로 포르메이트 디하이드로게나아제와 락테이트 디하이드로게나아제를 사용한다. 네번째 단계는 일반식 Ⅴ의 화합물을 환원시키는 효소 환원반응을 거쳐 일반식 Ⅶ의 화합물을 생성하는 단계이다.
일반식 Ⅶ의 화합물은 이 단계에서 분리되고 일반식 ⅡA의 화합물을 제조하는 상기의 제조과정에서 사용된다. 일반식 Ⅶ의 화합물은 적당한 방법으로 분리하고 정제한다. 선택적으로, 일반식 Ⅶ의 화합물은 아래에 기재한 일반식 XⅥA의 화합물을 제조하는데 사용되기도 한다.
또한 본 발명에서는 일반식 Ⅶ의 화합물이 거울상 형성할 경우 상기 단계 B에서 D-락테이트 디하이드로게나아제를 사용하여 일반식 ⅦA의 거울상 이성질체를 생성할 수 있는 것을 개시하고 있다:
유사하게, 상기 단계 B에서 L-락테이트 디하이드로게나아제를 사용하여 일반식 ⅦB의 거울상 이성질체를 생성할 것이다:
선택적 단계 C의 에스테르화 반응은 통상적인 반응물과 반응조건을 이용하여수행한다. 바람직하게는 에스테르화 반응은 상온에서 염산과 디옥산의 존재하에 수행한다.
유사하게, 거울상 이성질체 ⅦA와 ⅦB를 상기와 동일한 에스테르화 반응을 거쳐 각각 XⅡA와 XⅡB의 거울상 이성질체들로 전환할 수 있다:
본 발명의 선택적인 단계 D에서 일반식 XⅡ를 적당한 방법으로 일반식 XⅥA로 전환시킨다. 예를 들면 Efffenberger et al., J. Liebigs. Ann. Chem, 1996, 314 논문과 "펩티도모방체 프로토콜"이라는 제목의 Hoffman et al., Human Press, NJ, U.S.A.; 1999, pp 103-124에 적당한 방법이 개시되어 있다. 이들 참고문헌은 본 발명에서 참고로 수록하고 있다.
이와 동일한 선택적 단계 D를 이용하여 거울상 이성질체 XⅡA와 XⅡB를 각각 거울상 이성질체 XⅥB와 XⅥC로 전환시킨다:
일반식 Ⅶ의 화합물과 일반식 XⅥA의 화합물을 제조하기 위한 두번째 과정은다음의 단계들을 포함한다:
단계 A': 세린(serine)을 일반식 Ⅶ의 화합물로 전환시키는 단계로서, 다음의 단계들을 포함한다:
(a) 세린을 일반적인 방법으로 포타슘 글리시데이트(potassium glycidate)로 전환시키는 단계;
(b) 선택적으로 포타슘 글리시데이트를 글리시딘산(glycidic acid)으로 전환시키는 단계; 및
(c) 일반식 R10-페닐-Q의 화합물과 위치선택적 에폭시드 고리열림 반응시키는 단계;
여기에서, Q는 활성화된 브롬화물, 황산염 또는 일차 요오드이다;
선택적 단계 B': 일반식 Ⅶ의 화합물을 일반식 R"-OH의 화합물과 반응시켜 일반식 Ⅶ의 화합물을 일반식 XⅡ의 화합물로 에스테로화시키는 단계. 여기에서 R"는 알킬 또는 아릴이다; 및
선택적 단계 C': 일반식 XⅡ의 화합물을 일반식 XⅥA의 화합물로 전환시키는 단계.
따라서, 단계 A'의 (a) 과정은 세린을 일반적인 방법으로 포타슘 글리시데이트로 전환시키는 단계이다. 상기 일반적인 방법은 당업계에서 알려진 통상적인 방법을 말한다. 예를 들면, Larcheveque et al., Tetrahedron Lett. 1987, 28, 1993-1996에서는 세린으로부터 포타슘 글리시데이트를 제조하는 방법을 개시하고 있다.이 참고자료를 본 발명에서는 전부 참고로 수록하고 있다.
바람직하게는 세린을 적당한 온도에서 질산과 반응시켜 2-브로모-3-히드록시 프로피온산(propanoic acid)을 생성한다. 보다 바람직하게는 질산나트륨과 브롬화 수소의 혼합물로 이루어진 아질산을 사용하고, 약 -10℃ 내지 상온에서 알칼리 금속 할로겐화물의 존재하에서 반응시킨다. 상기 적당한 알칼리 금속 할로겐화물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 것을 사용지만, 바람직하게는 알칼리 금속 할로겐화물로 브롬화 칼륨 또는 브롬화 나트륨을 사용하는 것이 좋다.
그런 다음 2-브로모-3-히드록시 프로피온산을 수산화 칼륨과 반응시켜 포타슘 글리시데이트로 전환시킨다. 바람직하게는 상기 반응을 -40℃ 내지 상온에서 수행한다.
본 발명에서 바람직한 반응조건과 반응물을 사용할 경우, 세린으로부터 65-70%의 수율로 포타슘 글리시데이트를 생성할 수 있다.
또한 본 발명에서는 상기 과정의 출발물질인 거울상의 L-세린 또는 D-세린을 사용하여 각각 D-포타슘 글리시데이트와 L-포타슘 글리시데이트를 생성할 수 있다.
상기 과정에 의한 포타슘 글리세데이트를 바로 일반식 Ⅶ의 화합물로 전환시킬 수 있다. 포타슘 글리시데이트와 일반식 R10-페닐-Q의 화합물과의 반응은 위치선택적 에폭시드 고리열림반응을 야기시킨다. 바람직하게는 Q가 -MgBr 그룹이고, 위치선택적 고리열림반응을 -10℃ 내지 상온에서 요오드화 구리의 존재하에 수행한다.
칼륨을 일반식 Ⅶ의 화합물로 바로 전환시키는 대신에 포타슘 글리시데이트를 먼저 글리시딘산으로 전환시킨 후 상기의 에폭시드 고리열림 반응을 거쳐 일반식 Ⅶ의 화합물로 전환시킨다. 포타슘 글리시데이트를 당업계어서 알려진 통상적인 기술로 글리시딘산으로 전환시킨다. 바람직하게는 농축된 질산과 포타슘 글리시데이트를 반응시켜 글리시딘산을 제조한다.
상기의 방법으로 거울상의 포타슘 글리시데이트를 제조하면, 일반식 Ⅶ의 화합물과 일치하는 거울상 이성질체가 합성될 것이다. 예를 들면, D-포타슘 글리시데이트를 사용하면, 일반식 ⅦA의 화합물이 생성될 것이다. 유사하게 L-포타슘 글리시데이트를 사용하면, 일반식 ⅦB의 화합물이 생성될 것이다.
이 단계에서 상기에 기재한 방법으로 일반식 ⅦA의 화합물을 제조하는데 사용하기 위한 일반식 Ⅶ의 화합물을 분리시킨다. 선택적으로, 일반식 Ⅶ의 화합물은 아래에 기재된 일반식 XⅥA의 화합물을 제조하는 과정에 사용되기도 한다.
선택적 단계 B'와 C'는 각각 일반식 Ⅵ의 화합물로부터 일반식 XⅥA의 화합물을 합성하기 위해 처음에 개시한 제조과정인 선택적인 단계 C 및 D와 일치한다. 따라서, 상기 선택적 단계 C와 D에서 기재한 바람직한 방법, 반응물 및 반응조건은 또한 선택적인 단계 B'와 C'에도 사용된다.
일반식 XⅥA의 화합물의 범위안에 속하는 화합물, 특히 일반식 XⅥB의 화합물을 제조하는 세번째 과정은 다음의 단계들을 포함한다:
단계 A": 일반식 Ⅸ의 화합물로부터 일반식 XⅡA의 화합물을 제조하는 단계로서, 다음의 단계들을 포함한다:
(a) 일반식 Ⅸ의 화합물을 비대칭 디히드록실화 반응(dihydroxylation)을 거쳐 일반식 XA의 화합물을 제조하는 단계:
(b) 일반식 Ⅸ의 화합물을 톨루엔 존재하에 1,1'-카르보닐디이미다졸과 반응시켜 일반식 XI의 화합물을 제조하는 단계; 및
(c) 일반식 XI의 화합물을 팔라듐이 중재된 환원반응시키는 단계; 및
단계 B": 일반식 XⅡA의 화합물을 일반식 XⅥB의 화합물로 전환시키는 단계.
바람직하게는, 비대칭 디히드록실화 반응은 상온에서 샤플리스(Sharpless) 비대칭 디히드록실화 반응으로 수행한다. 샤플리스 비대칭 디히드록실화 반응을 포함하는 비대칭 디히드록실화 반응은 Kolb et al., Chem. Rev. 1994, 94, 2483-2547에서 개시하고 있다. 상기 논문은 여기에서 전부 참고자료로 수록하고 있다.
바람직하게는 일반식 Ⅸ의 화합물을 약 80℃에서 톨루엔 존재하에 CDI와 반응시킨다.
바람직하게는, 팔라듐이 중재된 환원 단계인 단계 A"의 (c)는 일반식 XI의화합물을 상온에서 포름산 존재하에 수소, 팔라듐 및 탄소의 혼합물과 반응시켜 수행한다.
본 명세서의 처음에서 선택적 단계 D와 일치하는 단계 B"는 일반식 Ⅵ의 화합물로부터 일반식 XⅥA의 화합물을 합성하는 과정을 개시하고 있다. 따라서 단계 B"에서는 상기의 선택적 단계 D에서 사용한 것과 같은 제조방법, 반응물 및 반응조건을 사용한다.
또한 본 발명은 상기에서 설명한 일반식 Ⅳ로 정의된 부류의 범위에 속하는 일반식 ⅣA의 화합물에 관한 것이다. 또한, 일반식 ⅣA의 화합물은 본 발명에 의한 일반식 Ⅰ의 화합물을 제조하는 과정에서 중간물질로 사용된다.
따라서, 본 발명은 일반식 ⅣA의 화합물에 관한 것이다:
여기에서 Y는 OH, OSO2CF3, OSO2CH3, OSO2(p-톨릴), 할로겐화물 또는 다른 이탈기; 및 R'는 H, 알킬 또는 아릴그룹이다.
바람직하게는 R10은 4-플루오로 그룹, Y는 OH 또는 OTf이고 R'는 OH 또는 Me이다.
또한 상기에서도 언급한 대로 본 발명은 본 발명의 제조과정에서 사용되는 연속적인 막 반응기에 관한 것이다. 특히 본 발명에 의한 연속적인 막 반응기는 효소와 고정촉매와 같이 고분자 크기의 촉매가 사용되는 반응에 사용하기 적당하다. 이와 같은 촉매의 예를 들어보면, Rissom et al.,Tetrahyedron: Asymmetry, 1999,10, 923-928; Schmidt et al.,J. Biotechnology, 1992,24, 315-327; 및 Lin et al.,Biosci. Biotech. Biochem., 1997,61, 2029-2033에서 개시하고 있다. 상기 논문들은 여기에서 참고로 수록하고 있다. 보다 구체적으로, 본 발명에 의한 연속적인 막 반응기는 촉매순환이 요구되는 촉매반응에서 사용된다. 예를 들면, 본 발명에 의한 반응기는 에스테르 화학촉매 또는 생체촉매가 사용되는 효소 환원반응에 사용된다.
본 발명에 따른 연속적인 막 반응기는 접선 유동 여과기 유닛(tangential flow filter unit), 접선 유동 여과기를 통해 반응물을 순환시키는 반응기 루프 및 반응기 루프에 기질을 공급하기 위한 기질 공급 펌프로 구성되고, 여기에서 반응기 루프는 다음과 같이 이루어진다:
(a) 튜브; 및
(b) 순환펌프
접선 유동 유닛은 접선 유동막 여과기와 여과기 하우징(housing)을 위한 유닛으로 구성된다. 적당한 접선 유동 유닛이 사용된다. 적당한 접선 유동 유닛은 반응기 내에서 원하는 생성물을 이 유닛에 허용 또는 투과하고 고분자의 촉매는 남아있게 한다. 접선 유동 유닛의 바람직한 실시예로는 밀리포어사(Millipore Corporation)에서 상용화한 펠리콘 2 모둘(Pellicon 2 Module)이 있다. 이 펠리콘 2 모둘은 쉽게 반응비율을 증가시키기 위한 카세트 스타일의 접선 유동 여과장치를사용한다. 특히 단일 펠리칸 2 카세트도 사용되지만, 카세트의 시리즈들이 보다 넓은 범위에서 반응하기 위한 결합에서도 사용될 수 있다. 따라서, 접선 유동 카트리지 시스템의 사용은 적은 양에서 수천리터 이상에 이르는 유동량을 제조하기 위한 것이다.
대부분의 촉매반응이 일어나는 반응기 루프는 내부용량을 가진다. 내부 용량은 반응기 루프가 담을 수 있는 반응물과 촉매의 용량에 의해 결정된다. 반응기 용량은 반응기 루프와 접선 유동 유닛이 결합하여 담을 수 있는 반응물과 촉매의 용량에 의해 결정된다. 본 발명에 의한 반응기의 반응기 루프는 반응기 용량의 적어도 약 50%의 내부용량을 가진다. 바람직하게는 반응기 루프가 반응기 용량의 적어도 약 60%의 내부용량을 가지는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는 반응기 루프가 반응기 용량의 적어도 약 70%의 내부용량을 가지는 것이 좋다. 보다 더욱 바람직하게는 반응기 루프가 반응기 용량의 적어도 약 80%의 내부용량을 가지는 것이 좋다. 본 발명에서 보다 바람직한 실시를 위해서는 반응기 루프가 반응기 용량의 적어도 약 90%의 내부용량을 가지는 것이 좋다. 본 발명에서 보다 더욱 바람직한 실시를 위해서는 반응기 루프가 반응기 용량의 적어도 약 95%의 내부용량을 가지는 것이 좋다.
반응기 루프는 적당한 크기와 적당한 물질로 만들어진 튜브로 구성된다. 바람직하게는 반응기 루프는 플렉시블(flexible) 튜브로 구성되어 있다. 플랙시블 튜브는 반응기 용량을 쉽게 바꾸기 위한 도구로서 원하는 길이로 잘라서 사용한다. 적당한 튜브 물질로는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리우레탄, 폴리비닐, 비닐, 나일론, 부틸렌-폴리머(butylene-polymer), 실리콘 PTFE, ETFE, PFA, 비트론(Vitron), 스텐레스강, 유리, PVDF, 테프론(Teflon), 알킬 폴리머 및 퍼플루오로(perfluoro) 물질을 예로 들 수 있다. 비트론은 듀폰트 다우 엘라스토머스 (Dupont Dow Elastomers) LLC에서 상용화하였고, 67% 플루오리네이티드 열 세트 고무(fluorinated thermal set rubber)로 이루어진다. 테프론은 EI Dupont deNemours & Co.에서 상용화한 것이고 테트라플루오로 에틸렌(tetrafluoro ethylene)으로 구성된다. 본 발명에 의한 연속적인 막 반응기를 효소로 환원하는 본 발명의 제조과정에서 사용할 경우, PVC, 티곤(Tygon)은 염소화 폴리머 손실, 또는 효소와 부적합한 물질의 불활성화를 초래하게 된다. 더 나아가, 실리콘 튜브는 상기와 같은 문제가 발생하지 않는 반면에, 실리콘이 잔류시간에 이어지는 변화때문에 반응조건이 변동할 수 있는 본 발명의 제조과정에서 팽창하기가 쉽다.
적당한 순환 펌프와 기질 공급 펌프는 반응기 루프에 장착되어 있다. 적당한 순환펌프로는 연동식(peristaltic), 벨로스(bellows), 격막식(diaphragm), 진행 동공(prograssive cavity), 피스톤, 유연 라이너(flexible linear), 누테이팅 디스크(nutating disc), 막(membrane), 회전식 로브(rotary lobe), 연동 교반날개 (flexible impeller), 회전날개(rotary vane) 또는 저전단형(低剪斷型) 가변속 펌프(variable speed low shear type pump) 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 연동식, 유동 라이너, 누테이팅 디스크, 또는 막 펌프를 사용하는 것이 좋다. 순환펌프 또는 기질공급 펌프로 기어형 펌프는 적합하지 않다.
본 발명의 연속적인 막 반응기의 효과적인 작동을 위해 기질공급 펌프를 순환펌프보다 더 빠른 속도로 작동한다. 예를 들면, 본 발명의 제조과정에서 연속적인 막 반응기를 사용할 경우, 기질공급 펌프를 순화펌프보다 약 20배정도 더 빠르게 설정하면 가장 효과적으로 반응을 진행시킬 수 있다.
또한 본 발명의 연속적인 반응기의 바람직한 실시예로는 반응기 루프가 발포트랩(bubble trap), 압력계(pressure gage), pH 모니터, 열교환기 및 게이트 밸브 (gate valve)로 이루어진 것이다. 또 다른 바람직한 실시예로는 연속적인 막 반응기가 기질공급 펌프로 이루어진 하나 또는 그 이상의 기질공급 라인을 가지고 있고, 보다 더 바람직하게는 체크 밸브(check valve), 살균필터(sterile filter) 및 압력계로 이루어진 것이다. 추가되는 하나 이상의 공급 라인들 중 하나는 기질을 공급하기 위한 것이고, 나머지는 배수와 같은 다른 목적으로 사용된다. 각 필터 라인에 추가되는 살균 필터는 분립체(particles)와 미생물이 반응기 안으로 들어가기 전에 제거하는 것을 돕는다. 원하지 않는 분립체들은 미생물들이 정해진 효소를 전멸시키는 동안 접선 유동 필터 유닛에서 막의 공극(pores)을 막는다. 추가되는 열교환기는 반응온도를 유지하거나 변경하는데 사용한다.
도 1은 바람직한 연속적인 막 반응기를 보여준다. 도 2a 및 2b는 본 발명에 따른 보다 더 바람직한 연속적인 막 반응기를 보여준다.
[표 2]
도 2에 표시된 연속적인 막 반응기의 부호설명
번호 종 류 재 질 크 기 제조업체
1 접선 유동 필터막하우징; 펠리콘 2 316 SS Waters Millipore
2 가스켓과 클램프 실리콘과폴리프로필렌 13/16"x1/16" Waters Millipore
3 배수 티관(tee) 폴리프로필렌 3" x 1½" x 7/16" id Waters Millipore
4 캡 폴리프로필렌 1" dia Waters Millipore
5 게이트 밸브 폴리프로필렌 3" x 7/16" id Waters Millipore
6 호스 깃가지로 이어지는 어뎁터 배수플랜지 PVDF 31/32" x ½od Cole Parmer
7 여과 카트리지PLCGC 재생 셀룰로오스 0.1 sq M Waters Millipore
8 압축 감소 결합체 PVDF 3/8" od x ¼" od Cole Parmer
9 한 방향 체크밸브;1psi 시트압;최고 125psi 이면압 PVDF/Kalrez ¼" od x 1½" Cole Parmer
10 압축 결합체 PVDF ¼" od Cole Parmer
11 살균필터;공극크기 0.3㎛ PVDF/붕규산유리 ¼" od x 3 1/8" Cole Parmer
12 수(male) NPT로 연결되는 어뎁터 압축 PVDF ¼" od x ¼"NPT Cole Parmer
13 티 암 NPT ¼" NPT Cole Parmer
14 압축으로 연결되는수 NPT PVDF ¼" NPT x ¼" od Cole Parmer
15 압력지시계0-100psi; 글리세린으로 채워짐;;정확도 ±3% 316 SS ¼" NPT; 2½" face Cole Parmer
16 연동식 튜브 과산화물 경화실리콘 0.19" id Cole Parmer
17 연동식 펌프 헤드#77201-62를 가지는마스터플랙스 변속드라이브 #77200-12 316 SS 롤러 10-333㎖/min 유입(16번과 연결) Cole Parmer
18 연동식 펌프 헤드#77201-62를 가지는마스터플랙스 콘솔드라이브 316 SS 롤러 0.2-20㎖/min 유입(19번과 연결) Cole Parmer
19 연동식 튜브 백금경화 실리콘 0.06" id Cole Parmer
20 수NPT로 연결되는 어뎁터 호스 깃가지 PVDF 3/8" od x ¼" NPT Cole Parmer
21 튜브 과산화물 경화실리콘 3/8" id Cole Parmer
22 호스 깃가지로 연결되는 어뎁터 위생 플랜지 PVDF 31/32 x 3/8" od Cole Parmer
23 필터로 연결되는펌프라인 비톤(Viton) id ½" Cole Parmer
24 "T"타입 열전대 및디지털 판독기 테프론코팅304SS ¼" od J-KEM
25 삽입하는 어뎁터튜브 테프론(Teflon) ¼" od x ¼" 28 Cole Parmer
번호 종 류 재 질 크 기 제조업체
암UNF UNF
26 니플(Nipple) 수NPT PVDF ¼" NPT Cole Parmer
27 암NPT에 연결되는 어뎁터 투관 수NPT PTFE ¼" NPT x ½"NPT Cole Parmer
28 압축에 연결되는 어뎁터 암PTO PVDF ½"NPT ½od Cole Parmer
29 FMIQ시리즈 변속 밸브없는 계량기 펌프 #QV 및 #R 405 세라믹/316 SS ¼" 피스톤 dia.0-576㎖/min로 유입 Cole Parmer
30 Easyload Ⅱ 헤드를 가진 마스터플렉스 변속 연동식 펌프 #77201-62 316 SS 롤러 29-29000㎖/min로 유입(35번과 연결) Cole Parmer
31 밀톤 로이#C731-25T 변속 솔레노이드 격막 펌프 폴리프로필렌/테프론/세라믹/PFA/PTFE ¼" id port2.5-566 ㎖/min로 유입 Cole Parmer
32 고정된 튜브 폴리에틸렌 ½"od x 3/8" od Cole Parmer
33 펌프 체크밸브에 연결되는 어뎁터 압축 폴리프로필렌 ½"od x 7/8" 12(통상적) Cole Parmer
34 호스 깃가지에 연결되는 어뎁터 수NPT PVDF ¼" NPT x 3/8" od Cole Parmer
35 연동식 튜브 과산화물 경화 실리콘 0.38" id Cole Parmer
36 호스 깃가지에 연결되는 어뎁터 수UNF PVDF ¼" UNF x 1/16" od Cole Parmer
37 암NPT에 연결되는 어뎁터 투관 수NPT PTFE ½"NPT x 1"NPT Cole Parmer
38 티(Tee) 암NPT PVDF 1"NPT Cole Parmer
39 암NPT에 연결되는 어뎁터 투관 수NPT PVDF 1"NPT x ¾"NPT Cole Parmer
40 PH 지시계 탐침 PVDF/비톤/유리 2" x ¾"NPT Cole Parmer
41 냉각 및/또는 가열 배지 유입 물(또는 다른 배지) N/A N/A
42 열교환기-양끝에 튜브를 끼운 전환된 그레이암 타입 콘덴서 유리 내부 38㎝ x 전체길이 47㎝; 반응기 용량 80㎖ x 냉각용량 510㎖ San Diego Glass Tech
43 튜브 비톤 ½" id Cole Parmer
44 고정된 튜브 PTFE ¼" id x 5/16" od Cole Parmer
45 기계적 교반기 유리/테프론 필요한 만큼 Chem Glass
46 가스 살포기 유리 Coarse frit Chem Glass
47 튜브 티곤 R3603 5/16" id Fisher
48 디지털 판독에 의한 pH 탐침;pn59002-02 겔을 채워 밀폐시킴 ½" x 4½" Cole Parmer
49 튜브 비톤 ½" id Cole Parmer
50 반응기 주요 루프(튜브) 비톤 ½" id Cole Parmer
이어지는 실시예들은 단지 본 발명을 설명하기 위한 목적으로 기재된 것에 지나지 않으며, 첨부된 청구항들로 정의된 본 발명의 보호범위를 한정하는 것이 아니다.
이어지는 반응식들은 본 발명에서 제시하는 여러가지 제조과정을 거쳐 본 발명에 따른 여러가지 화합물의 제조과정을 보여주는 실시예들을 보여주는 것이다. 특히 이 반응식들은 아래의 본 발명에서 처음으로 선보이는 제조과정에 관한 실시예를 표현한다.
다음의 실시예에서 본 발명에 의한 제조방법으로 본 발명의 화합물들을 제조하는 과정을 상세히 설명한다.
실시예 1
디아조화(diazotization)에 의한 화합물1A의 제조(반응식 1에 있는1A의 구조 참조)
[표 3]
반 응 물 질 출 처 사용량 분자량 몰 수
4-플루오로-D-페닐알라닌히드로클로라이드 1443-057 380g 219.5 1.73
1M H2SO4(6.85ℓ의 물로희석한 98% 황산 389㎖) Stock 7.24ℓ - 7.24
99.99% 아질산나트륨 Aldrich 477.5g 69.0 6.92
황산 마그네슘 Fisher 100g - -
t-부틸 메틸 에스테르(MTBE) Fisher 3.6ℓ - -
염화 메틸렌 Fisher 1ℓ - -
헥산 Fisher 2ℓ - -
제조과정:
12ℓ의 반응기에서 4-플루오로-D-페닐알라닌 히드로클로라이드(4-fluoro-D-phenylalanine hydrochloride) 380g을 1M의 황산 7.24ℓ에 용해하였다. 상기 용액을 아세톤/얼음을 사용하여 -5℃로 냉각시켰다. 그런 다음 730㎖의 물에 아질산나트륨(sodium nitrite) 477.5g을 용해한 용액을 천천히 넣고, 온도를 0℃ 이하로 유지시켰다. 일반적으로 3시간정도 반응시킨다. 상기 용액을 3시간 또는 그 이상 방치시켰다. 이 부분에서 중요한 것은 적어도 상기에서 요구하는 시간만큼은 온도를 0℃로 유지시키는 것이다. 반응 혼합물을 약 5시간동안 상온으로 가온하고, 하루동안 방치시켰다. 이 과정에서 백색 고체가 생성되어 반응 혼합물에 부유하는 것을 볼 수 있다. 이 생성물을 MTBE(한번 추출할 때 1.2ℓ의 MTBE를 사용하고, 매회 적어도 15분간 혼합물을 강하게 교반하는 것에 주의한다)로 3번 추출하였다. 유기 추출물을 무수 마그네슘 황산 100g으로 건조한 후 여과하였다. 생성물을 건조시켰다(1H NMR에서 적어도 70% 이상의 순도를 보였다). 이 과정에서 380.5g 이하의 조생성물을 얻었다. 상기 조생성물1A를 1ℓ염화 메틸렌과 2ℓ헥산에 녹이고, 42℃에서 환류시켰다. 적당한 교반으로 환류시킨 후 2시간동안 방치한 다음 상온으로 냉각하였다. 그런다음 2시간동안 더 상온에서 교반하였다. 여과후 덩어리를 2:1 헥산/염화 메틸렌로 헹구어내었다. 이 반응에서 화합물1A148g(46%)을 수득하였다: 키랄 HPLC 순도 97%이상;1H NMR(CD3OD)δ7.25-7.00(m, 4H), 4.50(AB quartet, J=8 Hz, J=4 HZ, 1H), 3.15(dd, J=14 Hz, J=4 Hz, 1H), 2.95(dd, J=14 Hz, J=8 Hz,1H).
실시예 2
효소 환원반응에 의한 화합물1A의 제조
단계 A--화합물3의 제조(반응식 2에 있는 화합물3의 구조 참조)
[표 4]
반 응 물 질 출 처 사 용 량 분 자 량 몰 수
4-플루오로벤즈알데히드 Aldrich 115.92g 124.11 0.934
히단토인 Aldrich 93.53g 100.08 0.934
1-아미노-2-프로판올 Aldrich 7.01g 75.11 0.0934
수산화나트륨 Fisher 187g 40.00 4.68
염화나트륨 Fisher 108.9g 58.44 1.86
농축한 HCl(37%) Fisher 311㎖ - -
제조과정:
4-플루오로벤즈알데히드(4-fluorobenzaldehyde), 히단토인 및 1-아미노-2-프로판올(10%)을 물 235㎖에 용해한 혼합물을 130-135℃에서 4시간동안 환류시켰다. 상기 혼합물에 20% 뜨거운 수용성 수산화 나트륨 용액(NaOH 187g, 4.68mol) 935g을 넣고 50분간 환류시켰다. 상기 혼합물을 0℃로 냉각하고 염화나트륨 108.9g을 첨가하였다. 용액의 pH를 농축한 HCl(37%, ca. 311㎖)을 사용하여 약 8.5로 맞춘후 여과하였다. 모액(mother liquor)을 하루동안 놓아두고 다시 여과하였다. 침전물을 결합시키고 메탄올 약 5ℓ로 세척하여 HPLC 순도 80% 이상으로 얻었다(주의: 이 염은 이어질 효소반응을 위해 충분히 정제하지만, 메탄올의 추가량으로 세척하여 고순도로 얻을 수도 있다). 침전물을 하우스 진공에서 건조하여 백색의 일수화물 나트륨염3을 얻었다: 수율 70-75%, C9H6O3Fna·H2O로 산출한 분석비: C, 48.66; H, 3.63. 검출: C, 48.64;H, 3.74.1H NMR(D2O)δ7.02-7.19(m, 4H), 4.72(s, 2H). (주의: 이 염은 분해되는 것을 막기 위해 냉장고에 보관해야 한다).
단계 B--화합물3으로부터 화합물1A제조
MEEC법(단계 B1) 또는 보조고정법(단계 B2)를 이용하여 화합물1A를 제조한다.
단계 B1: MEEC법을 사용하는 화합물1A를 제조.
[표 5]
반 응 물 질 출처(카탈로그#) 사 용 량 분 자 량 몰 수
화합물3 - 11.1g 222 0.05
D-락테이트 디하이드로게나아제(D-LDJ) Sigma(L 9636) 1900U - -
포르메이트 디하이드로게나아제(FDH) Sigma(F 8649) 125U - -
NAD Sigma(N 7004) 334㎎ 663.4 0.0005
의산 나트륨 Sigma(S 2140) 10.25g 68.01 0.15
메르캅토에탄올 Sigma(M 6250) 39㎎ 78.13 0.0005
트리즈마 히드로클로라이드 Sigma(T 6666) 400㎎ 157.6 0.0025
EDTA Sigma(E 1644) 186㎎ 372.2 0.0005
DL-디티오트레이톨 Sigma(D 5545) - - -
투과막(MWCO 12,000-14,000) VWR(25218-435) - - -
제조과정:
화합물3, 의산나트륨, 메르캅토에탄올, 트리즈마 히드로클로라이드(Trizma hydrochloride) 및 EDTA를 탈염수 500㎖에 용해하고 아르곤으로 약 30분동안 가스를 제거하였다. 상기 용액을 NaOH(1.0M)를 사용하여 pH를 7.5로 맞추고, NAD(1%)를 첨가하였다. 4개의 투석 튜브(각각 약 4㎝ 길이)를 탈염수로 헹구어 내고 각 튜브끝에 나사산을 막았다. 상기 반응 혼합물의 8㎖ 분별액에 FDH와 D-LDH를 용해하고 에펜돌프 피펫(Eppendorf pipette)을 사용하여 상기 4개의 튜브에 옮겨 담았다. 튜브의 다른쪽 끝을 막고 반응 혼합물을 부유시켰다. (주의: 가능한한 공기를 차단하고 누출이 없도록 주의한다). CO2를 제거한 용액을 통해 아르곤을 부드럽게 발포시켰다. 그런 다음 반응 혼합물을 1M HCl(HPLC를 거쳐 95%이상 전환)을 첨가하여 조절되는 pH-염으로 pH 7.5±0.1로 유지하면서 상온에서 3일간 교반한 후 투석 튜브를 제거하였다. 50mM 트리스 완충용액(Tris buffer)(pH 7.5, 5mM 디티오트레이톨 (dithiothreitol)) 100㎖에서 약 6시간동안 계속해서 교반하였다. (주의: 효소 함유 주머니는 5mM 트리스 완충용액(pH 7.5, 5mM 디티오트레이톨) 50㎖에 넣고 4℃로 보관하여 다시 사용할 수 있다). 수용성 층들은 결합시키고 용액을 농축한 HCl을 천천히 첨가하여 pH 3.0으로 맞추었다. 상기 용액을 MTBE(50x4㎖)로 추출하고, MgSO4로 건조, 농축하여 조오일(crude oil)을 얻었다. 상기 오일을 헥산/염화 메틸렌(2:1) 250㎖에서 응고시키고 여과하였다. 여과물을 농축한 후 헥산/염화 메틸렌(2:1) 50㎖에서 다시 응고시켰다. 백색 고체를 결합시키고 하우스 진공하에서 건조하여 백색 고체인 화합물1A를 얻었다: 수율 7.2-7.4g(78-80%); HPLC 순도 95%이상.
단계 B2: 보조고정법을 사용하여 화합물1A를 제조
이 과정은 4 단계로 수행된다. 첫번째는 N-아크릴옥시숙신이미드를 제조하는 단계이다. 두번째는 라디칼 공중합반응을 통해 PAN500을 제조하는 단계이다. 세번째는 FDH와 D-LDH의 보조고정 단계이다. 마지막은 α-케토산 나트륨염3의 효소반응으로 화합물1A를 얻는 단계이다.
단계 1: N-아크릴옥시숙신이미드의 제조
[표 6]
반 응 물 질 출 처 사 용 량 분 자 량 몰 수
아크릴로일 클로라이드 Aldrich 100g 90.51 1.10
N-히드록시숙신이미드 Aldrich 115g 115.10 1.00
트리에틸아민 Aldrich 110g 101.19 1.09
2,6-디-터트-부틸-4-메틸페놀(BHT) Aldrich 50㎎ 220.36 0.00023
제조과정:
N-히드록시숙신이미드와 트리에틸아민을 0℃에서 클로로포름 1.5ℓ에 용해하였다. 아크릴로일 클로라이드를 20분간 떨어뜨려 첨가하고 0℃에서 다시 20분간 교반하였다. 상기 용액을 얼음냉각수와 포화 염수 800㎖로 세척한 다음 MgSO4로 건조하여 여과하였다. BHT(2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol) 50㎎을 클로로포름 용액에 첨가하고 300㎖ 부피로 농축하여 여과하였다. 천천히 에틸 아세테이트 30㎖와 헥산 200㎖를 교반하면서 첨가한 다음 0℃에서 2시간동안 방치하였다. 생성된 백색 고체를 여과하고 처음에는 얼음 냉각한 헥산/에틸 아세테이트(4:1) 100㎖로 세척하고 그 다음에는 헥산/에틸 아세테이트(9:1) 100㎖로, 마지막에는 헥산(100㎖x2)로 세척하였다. (주의: 이 물질은 아래에 기재한 PAN 500의 제조에 사용하기 위해 충분히 정제시킨다). 결정들을 하우스 진공하에 건조하여 N-아크릴옥시숙신이미드를 얻었다; 수율 115g(68%); mp 68-70℃.1H NMR(CDCl3)δ6.0-7.0(m, 3H), 2.85(s, 4H);FTIR(Nujol) 1800, 1775, 1735, 1260, 995, 870㎝-1.
단계 2: PAN 500의 제조
[표 7]
반 응 물 질 출 처 사 용 량 분 자 량 몰 수
N-아크릴옥시숙신이미드 - 30g 169.1 0.178
아크릴아미드 Aldrich 275g 71.08 3.85
AIBN Aldrich 1.75g 164.21 0.011
THF Fisher 2.5ℓ - -
제조과정:
아크릴아미드, N-아크릴옥시숙신이미드, AIBN 및 THF(2.5ℓ)를 5ℓ 플라스크에 넣었다. 상기 용액을 아르곤으로 30분간 강하게 교반하면서 가스제거한 후 아르곤 존재하에 50℃에서 24시간동안 환류시켰다. (주의: 이 반응은 처음 1-2 시간동안 열을 발생한다). 그런 다음 THF 1ℓ를 넣고 10분간 교반하였다. 형성된 침전물을 여과하고 THF(1ℓx4)로 세척하였다. 생성물을 하우스 진공하에 건조하여 PAN 500을 얻었다: 아주 부드러운 백색 분말을 304g 이하로 수득하였다. FTIR(Nujol) 3340, 3200, 1730, 1660, 1210, 1070㎝-1. (주의: 이 폴리머는 데시케이터 (dessicator)에 보관해야만 한다).
단계 3: FDH와 D-LDH의 보조고정
[표 8]
반 응 물 질 출 처 사 용 량 분 자 량 몰 수
트리에틸렌테트라아민(60%, TET) Aldrich - 146.24 -
MgCl2·6H2O Sigma 50㎎ 203.3 0.24mmol
나트륨 피루베이트 Sigma 50㎎ 110.0 0.45mmol
NADH Sigma 50㎎ 709.4 0.07mmol
의산나트륨 Sigma 306㎎ 68.01 4.5mmol
NAD Sigma 111㎎ 663.4 0.17mmol
FDH Sigma(F 8649) 200U - -
D-LDH Sigma(L 2395) 5000U - -
허피스 Sigma(H 9897) - - -
DL-디티오트레이톨 Sigma(D 5545) - - -
황산 암모늄 Sigma 1.32g 132.1 0.01mol
제조과정:
3.2M (NH4)2SO4에 용해한 상업용 D-LDH 5000U를 4℃에서 10분간 원심분리하였다. 생성된 침전물을 0.3M 허피스(Hepes) 완충용액(pH 7.5) 3㎖에 용해하고 4℃ 아르곤 존재하에 하루동안 교반하면서 50mM 탈산소화한 허피스 완충용액(pH 7.5) 500㎖로 다시 투석하였다. 염화 마그네슘, 나트륨 피루베이트, NADH, NAD 및 의산나트륨을 함유하는 0.3M 허피스 완충용액(pH 7.5) 42㎖가 들어있는 500㎖ 비이커에 상기 용액과 PAN 500 13.0g을 넣는다. 상기 혼합물을 1분간 강하게 교반한 후 DL-디티오트레이톨 650㎕(0.50M)과 TET 5.53㎖(0.50M)을 첨가하였다. 그런 다음 상기 혼합물을 1분간 교반한 후 D-LDH와 FDH를 첨가하였다. (주의: 상기 반응물을 약 2분정도 더 교반한 후에 겔화된다). 상기 겔을 상온에서 1시간동안 방치한 후 5mM 허피스 완충용액(pH 7.5, 1.32g (NH4)2SO4함유) 200㎖를 첨가하였다. 상기 겔을 와링블랜더(Waring blender)에서 저속으로 3분간 분해한 다음 고속에서 30초간 분해하였다. 상기 겔 조각들을 원심분리로 분리하고, 50mM 허피스 완충용액(pH 7.5) 20㎖로 세척하고 다시 원심분리하였다.
단계 4: 보조고정을 이용하여 화합물1A를 제조
[표 9]
반 응 물 질 출처(카탈로그#) 사 용 량 분 자 량 몰 수
화합물3 - 11.10g 222 0.050
D-LDH와 FDH이 보조고정된 PAN - - - -
NAD Sigma(N 7004) 167㎎ 663.4 0.00025
의산나트륨 Sigma(S 2140) 4.10g 68.01 0.060
메르캅토에탄올 Sigma(M 6250) 19.5㎎ 78.13 0.00025
트리즈마 히드로클로라이드 Sigma(T 6666) 150㎎ 157.6 0.00095
DL-디티오트레이톨 Sigma(D 5545) - - -
제조과정:
화합물3, 의산나트륨, 메르캅토에탄올 및 트리즈마 히드로클로라이드를 탈염수 500㎖에 용해하고, 아르곤으로 30분간 가스를 제거하였다. 상기 용액의 pH를 약 7.5로 맞추고 NAD(1%)를 첨가하였다. 보조고정된 FDH와 D-LDH PAN 겔을 첨가하였다. 용액을 아르곤을 부드럽게 발포시켜 CO2를 제거하고, 반응 혼합물을 1M HCl(HPLC를 거쳐 91%이상 전환)을 첨가하여 조절되는 pH-염으로 pH 7.5±0.1로 유지하면서 상온에서 5일간 교반하였다. (주의: 과다한 양의 의산나트륨을 사용은 반응시간을 단축시킨다. MEEC법 참조). 효소 함유 겔을 원심분리하여 제거하고 50㎖의 가스를 제거한 물로 두번에 걸쳐 세척하였다. (주의: 효소 함유 겔은 5mM 트리스 완충용액(pH 7.5, 5mM 디티오트레이톨) 50㎖에 넣어 4℃에서 보관하여 다시 사용할 수 있다).
수용성 층들은 결합시키고 용액에 농축한 HCl을 천천히 첨가하여 pH 3.0으로 맞추었다. 생성물을 MTBE(50x4㎖)로 추출하고 MgSO4로 건조, 농축하여 조오일을 얻었다. 상기 오일을 헥산/염화 메틸렌(2:1) 250㎖로 응고시키고 여과하였다. 여과물을 농축하고 헥산/염화 메틸렌(2:1) 50㎖로 다시 응고시켰다. 백색 고체들을 결합시키고 하우스 진공하에 건조하여 백색 고체 생성물인 화합물1A를 얻었다: 수율 7.2g(78%); HPLC 순도 95% 이상.
실시예 2A
본 발명의 연속적인 막 반응기를 사용하는 효소 환원반응에 의한 화합물1A의 제조
단계 A-화합물3의 제조
[표 10]
반 응 물 질 당 량 몰 수 화학식량 사 용 량
p-플루오로-벤즈알데히드(I) 1.0 20 124.11 2482g
히단토인 1.0 20 100.08 2002g
1-아미노-2-프로판올 0.1 2 75.11 150g
물 (I) 1mol당 0.25ℓ - - 5.0ℓ
수산화 나트륨(펠렛) 5.0 100 40.00 4000g
물 NaOH 1㎏당 5.0ℓ - - 20.0ℓ
염화 나트륨(과립상) 2.0 40 58.44 2338g
농축한 HCl 5.0 100 36.46 8.26ℓ
메탄올 (I) 1mol당 3.33ℓ - - 66.7ℓ
제조과정:
온도 탐침, 환류 콘덴서, 교반기 및 냉각 코일을 갖춘 50ℓ 반응기에 p-플루오로-벤즈알데히드 2.482㎏, 히단토인 2.002㎏ 및 1-아미노-2-프로판올 150g과 물을 넣었다. 상기 반응 혼합물을 가열하고 10시간동안 환류시켰다. p-플루오로-벤즈알데히드가 모두 소모되는 동안 상기 용액을 HPLC(254nm)와1H NMR(알데히드 양성자가 10ppm에서 7.2ppm으로 이동)로 모니터하였다. 이 반응에서 노란색 슬러리 (slurry)를 수득하였다. 상기 노란색 슬러리의 HPLC 분석결과 단지 35%만이 전환된 반면,1H NMR에서는 약 90%가 전환되었다. HPLC법이 벤즈알데히드의 강력한 발색단(chromophore)이므로 부정확하여 적게 전환된 것으로 생각된다.
물에 용해한 분리 수산화 나트륨 용액을 98℃로 가열하여 제조하였다. 그런 다음 이 용액에 노란색 슬러리를 조심스럽게 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 3시간동안 환류시킨 후 상온으로 냉각하였다. 농축된 중간물질의 피크(peak)가 완전히 사라지는 동안 다시 반응 혼합물을 HPLC(254㎚)로 모니터하였다. 상기 반응 혼합물은 투명한 오렌지/노란색 용액이 되었다
상기 혼합물을 약 20℃±5℃로 냉각한 후 염화나트륨을 첨가하여 교반하였다. 냉각수의 유동이 유지되는 동안 pH 탐침을 삽입하고 농축한 염산을 첨가하여 pH를 8.0-8.5 사이로 맞추었다. pH를 맞추는 동안 산첨가율을 조절하여 반응 온도를 약 30℃ 이하로 유지시켰다. 4시간후, 연노란색 슬러리 형태의 상기 반응 혼합물을 #1 여과지로 맞춘 탁상 흡인여과기를 통해 여과하였다. 촉촉한 덩어리를 50ℓ 반응기에서 되돌려서 세척한 후 약 33.35ℓ의 메탄올을 첨가한 다음 15분간 교반하였다. 상기 고체를 흡인여과기를 사용하여 다시 여과한 후 촉촉한 덩어리를 33.35ℓ 메탄올을 사용하여 상기와 같은 방법으로 세척하였다.
세척한 고체 생성물을 4일간 하우스 진공하에 상온의 오븐에서 건조하여 황백색 고체로 화합물3을 얻었다. 생성물의 수율은 약 75%이었고 HLPC에 의한 순도가 80% 이상이었다.1H NMR(D2O)δ7.02-7.19(m, 4H), 4.72(s, 2H).
단계 B--본 발명에 따른 연속적인 막 반응기를 사용하여 화합물1A를 제조
[표 11]
반 응 물 질 당 량 몰수(mmole) 화학식량 사 용 량
P2-히드록시산, 화합물3 1.0 1350 222.14 299.9g
메르캅토에탄올 1.0mM 6.75 78.13 527㎎+195㎎
암모늄 포르메이트 4.0 5400 63.06 340.5g
물 5.0ℓ/mol(화합물3) - - 6.75ℓ
β-NAD 0.01 13.5 663.4
포르메이트 디하이드로게나아제 20,000 U/반응기ℓ - - 4,800 유닛
락틱 디하이드로게나아제 400,000 U/반응기ℓ - - 96,000 유닛
농축한 HCl - - 36.46 A.R. ∼450㎖
MTBE 6.5ℓ/mol(화합물3) - - 8.78ℓ
염수 1.1ℓ/mol(화합물3) - - 1.49ℓ
마그네슘 황산염 -
디클로로메탄 1.46ℓ/mol(화합물3) - - 2.00ℓ
헥산 2.93ℓ/mol(화합물3) - - 3.96ℓ
제조과정:
확보한 연속적인 막 반응기(240㎖)를 도 2a 및 도 2b에서 보여주는 본 발명에서 개시된 장치로 조립한 반응기를 투과 포트(port)로부터 제거하여 총 2.5ℓ가 될 때까지 물에 과아세트산(peracetic acid)을 용해한 0.02% v/v 용액으로 세척하였다. 그런 다음 0.2μM의 여과수 2.5ℓ용액과 0.1mM 메르캅토에탄올(195㎎)를 제조하여 반응기를 발열시키는데 사용하였다.
일반적인 교반기, pH 미터 및 가스 살포기가 있는 12ℓ 둥근바닥 플라스크에 0.2μM 또는 더 미세한 필터로 여과한 물 6.75ℓ를 첨가하였다. 그런다음 플라스크를 적어도 약 30분간 아르곤으로 정제하였다.
화합물3을 12ℓ 플라스크에 넣고 암모늄 포르메이트와 메르캅토에탄올과 함께 가스를 제거한 물에 용해하였다. 아르곤 정제를 유지하면서, 생성한 용액의 모든 고체가 용해될 때까지 교반하였다. 용해가 완료되면 용액의 1N 수산화 나트륨을 사용하여 용액의 pH를 약 7.0으로 맞추었다. β-NAD를 반응용액에 첨가한 다음 고체를 용해하기 위해 교반하였다. 그런 다음 pH를 약 6.2로 맞추어 기질 용액을 수득하였다.
효소들, 포르메이트 디하이드로게나아제 및 락틱 디하이드로게나아제를 상기 기질 용액 100㎖에 용해한 다음 기질 공급 라인을 통해 기질 용액을 펌핑(pumping)하여 반응기에 첨가하였다. 펌핑 비율은 초기에 약 1.0㎖min.로 시작하였다. 기질 용액의 pH를 약 6.2로 유지시키는 것에 주의한다. HPLC(254㎚)를 통해 유출물(또는 투과물)이 전환되는 것을 모니터하였다. 또한 유출물의 pH도 수시로 체크하여 전환되는 것을 모니터하는 것을 도왔다(이때 pH=7.3-7.4이어야만 한다). 공급율(펌핑 비율)은 요구되는 전환 및/또는 생산량의 증가가 필요한 만큼에 맞춘다.
기질이 반응기를 통해 완전히 공급되어 생성한 투과물은 농축한 염산을 사용하여 약 3.0의 pH로 산성화하였다. 그런 다음 상기 생성 용액을 MTBE로 추출하고 세 부분으로 분획하였다. MTBE로 추출한 용액을 염수로 세척하고 마그네슘 황산염으로 건조하여, 여과하고 회전증발기로 농축하여 노란색 오일을 얻었다.
상기 모든 오일이 용해될 때까지 810㎖ 디클로로메탄을 첨가하였다. 천천히 상기 용액에 1.62ℓ 헥산을 첨가한 후 가열하여 환류시키고, 교반되는 동안 10℃로 냉각하였다.
고체 생성물을 여과한 다음 덩어리를 헥산:디클로로메탄=2:1인 용액 1.2ℓ로 세척하였다. 세척한 고체를 하우스 진공하에 3일간 상온에서 건조하여 백색 분말을 얻었다. 상기 반응에서의 수율은 반응기의 생산량이 280g/(dxℓ)으로 약 70%(HPLC에 의한 순도 91%)이었다.1H NMR(CD3Cl)δ7.25-7.00(m, 4H), 4.50(AB quartet, J=4, 8Hz, 1H), 3.15(dd, J=4, 14Hz, 1H), 2.95(dd, J=8.14 Hz, 1H). 샘플의 메틸 에스테르와 일치하는 거울상 이성질체 순도는 99.99% 이상이었다(Chiralpak AS, 4.6x250㎜, 10.0㎛).
실시예 2B
본 발명에 따른 연속적인 막 반응기를 사용하여 화합물3으로부터 화합물1A를 제조:
[표 12]
반 응 물 질 당 량 몰수(mmol) 화학식량 사 용 량
케토산염, 화합물3 1.0 5400 222.14 1.2㎏
메르캅토에탄올 1.0mM 27 78.13 2.1㎏
암모늄 포르메이트 4.0 21600 63.06 1.36㎏
물 5.0ℓ/mol(화합물3) - - 27ℓ
β-NAD 0.01 54 663.4 35.82g
포르메이트 디하이드로게나아제 20.000 U/ℓ(반응기) - - 30,900 유닛
락틱 디하이드로게나아제 400,000 U/ℓ(반응기) - - 618,000 유닛
농축한 HCl - - 36.46 A.R.1650㎖
MTBE 6.5ℓ/mol(화합물3) - - 35.1ℓ
염수 1.1ℓ/mol(화합물3) - - 5.94ℓ
마그네슘 황산염 -
디클로로메탄 1.46ℓ/mol(화합물3) - - 7.88ℓ
헥산 2.93ℓ/mol(화합물3) - - 15.8ℓ
제조과정:
1.545ℓ용량을 가지는 도 2a 및 도 2b에서 보여주는 본 발명에서 개시된 장치로 조립한 연속적인 막 반응기를 투과 포트(port)로부터 제거하여 총 15ℓ가 될 때까지 0.2μM로 여과한 물(예를 들어 0.2μM 또는 더 미세한 필터로 여과한 물)에 과아세트산(peracetic acid)을 용해한 0.02% v/v 용액으로 세척하였다. 그런 다음 0.2μM로 여과한 물 15ℓ로 반응기를 발열시켰다. 0.2μM로 여과한 물 용액 15ℓ와 0.1mM 메르캅토에탄올(195㎎)를 제조하여 반응기를 발열시키는데 사용하였다.
일반적인 교반기, pH 미터 및 가스 살포기가 있는 22ℓ 둥근바닥 플라스크에 0.2μM로 여과한 물 9.0ℓ를 첨가하였다. 그런다음 플라스크를 적어도 약 30분간 아르곤으로 정제하였다. 화합물3400g을 암모늄 포르메이트와 메르캅토에탄올과 함께 가스를 제거한 물에 용해하였다. 아르곤 정제를 유지하면서, 모든 고체가 용해될 때까지 교반하였다. 고체를 용해하고, 1N HCl을 사용하여 용액의 pH를 약6.26으로 맞추었다. 그런 다음 β-NAD를 반응용액에 첨가하고 모두 용해될 때까지 교반하였다. 생성된 용액의 pH를 약 6.26로 맞추어 기질 용액을 수득하였다.
효소들(포르메이트 디하이드로게나아제와 락틱 디하이드로게나아제)을 기질 용액 600㎖에 용해하였다. 그런 다음 효소들을 함유한 기질 용액을 반응기의 기질 공급 라인을 통해 반응기에 투입하였다.
기질 혼합물의 잔류물을 반응기에서 7.6㎖min.의 비율로 펌프하였다. 기질 용액의 pH를 약 6.26으로 유지시키고 적은 양의 아르곤 정제를 유지하는 것에 주의한다. HPLC(254㎚)를 통해 유출물(또는 투과물)이 전환되는 것을 모니터하였다. 또한 유출물의 pH도 수시로 체크하여 전환되는 것을 모니터하는 것을 도왔다(이때 pH=7.3-7.4이어야만 한다). 주의: 공급비율은 요구되는 전환 및/또는 생산량의 증가가 필요한 만큼에 맞춘다. HPLC를 통해 90-95%로 전환됨을 알 수 있었다.
화합물3400g을 함유하는 초기 용액을 반응기에 공급하여 반응기로 펌프하여 제조하는 상기와 동일한 방법으로 화합물3400g을 함유하는 또 다른 기질용액을 제조하였다. 화합물3의 총량이 1.2㎏이 될 때까지 이 과정을 반복하였다. 반응기에서 더 이상의 효소를 사용하지 않고 전부 1.2㎏에 이르면 화합물3이 화합물1A로 90%이상 전환되는 것을 HPLC를 통해 알 수 있었다.
실시예 3
화합물2의 제조: (반응식 1에서 화합물1A와 화합물2A의 구조 참조)
[표 13]
반 응 물 질 출 처 사 용 량 분 자 량 몰 수
화합물1A 1443-11 144g 184.2 0.781
메탄올 Fisher 950㎖ - -
4M HCl/디옥산 Aldrich 18㎖ - -
헥산 Fisher 300㎖ - -
제조과정:
화합물1A144g을 950㎖ 메탄올과 18㎖ 4M HCl/디옥산에 넣고 상온에서 20시간동안 교반하였다. HPLC로 반응이 완료된 것을 확인하였다. 반응이 완료되면, 용매를 진공상태에서 제거하였다. 농축한 생성물(이 단계에서는 오일형태)에 헥산 300㎖를 서서히 첨가하는 동안 일반적인 교반기로 강하게 교반하였다. 30분간 교반하면 이 단계에서 화합물2A가 분말형 고체가 된다. 이것을 10℃로 냉각하고 여과하여 고체 생성물을 얻었다. 더 나아가, 여과물을 농축하여 완전한 생성물 4-5g을 얻었다. 여과물이 정말 완전한 생성물인지 알아보기 위해 HPLC로 확인한 결과, 두 고체 모두 결합되었고 상온에서 진공하에서 건조하였다(주의: 선택적으로 MTBE/수용성 포화 비카르보네이트로 세척하면 화합물1A로부터 산성 불순물을 제거할 수 있다). 화합물2의 수율은 141g(95%)이었다; 키랄 HPLC 순도 97% ee 이상.1HNMR(CDCl3)δ7.25-7.00(m, 4H), 4.50(AB quartet, J=8 Hz, J=4 Hz, 1H), 3.82(s, 3H), 3.15(dd, J=13 Hz, J=4 Hz, 1H), 2.95(dd, J=14 Hz, J=7 Hz, 1H), 2.85(br. s, 1H). (주의: 효소법에 의하면 화합물2A를 99.9% ee 이상으로 생성한다)
실시예 4
화합물1C의 제조: (화합물2A와 화합물1C의 구조는 반응식 5를 참조한다)
[표 14]
반 응 물 질 출 처 사 용 량 분 자 량 몰 수
화합물2A - 200g 198.2 1.01
MTBE Fisher 4ℓ - -
99.99% 트리플릭(Triflic) 무수물 Aldrich 484g 202.1 1.71
2,6- 루티딘 Aldrich 184g 107.1 1.71
1M 시트르산 Stock 2x1ℓ - -
포화 소듐 비카르보네이트 Stock 2x1ℓ - -
무수 마그네슘 황산염 - 150g - -
제조과정:
화합물2A200g을 질소 존재하에 4ℓ MTBE에 용해하고 -10℃로 냉각하였다. 트리플릭 무수물(triflic anhydride)을 깔때기를 통해 15분이상 첨가한 후 깔때기로 2,6-루티딘을 천천히 첨가하였다. 이때 내부 온도를 3℃ 이하로 유지시켰다. 혼합물을 0℃에서 1시간동안 교반한 후 1.9ℓ물을 첨가하였다. 그런 다음 상기 용액을 15분간 더 교반하였다. 상층의 유기물층을 분리하고 1ℓ(1M) 시트르산으로 두번 세척한 후 1ℓ 포화 소듐 비카르보네이트 용액으로 두번 세척하였다. 무수 마그네슘 황산염으로 건조한 후 셀라이트로 여과하고 진공상태에서 오일을 제거하여 화합물1C를 얻었다. 화합물1C의 수율은 340g(95%)이었다;1H NMR(CDCl3)에서 화합물의 순도가 95%를 훨씬 넘는 것으로 나타났다. (주의: 전환이 완전히 이루어지지 않았다면, 전환량에 의존하는 상기 단계를 반복한다). 이 재반응 작업을 수행하여 분리한 생성물은 순도가 95%(1H NMR) 이상으로 확인되었다. 이 트리플레이트(triflat)인, 화합물1C는 분해를 방지하기 위해 차게 보관해야만 한다.
실시예 5
화합물14의 제조: (실시예 5 내지 실시예 9에서 제조하는 화합물의 구조는 반응식 6을 참조한다)
[표 15]
반 응 물 질 출 처 사 용 량 분 자 량 몰 수
Z-L-발린 Calbiochem 200g 251 0.796
카르보닐디이미다졸(CDI) Aldrich 135g 162 0.836
무수 THF Fisher 3.3ℓ - -
THF에 용해한 1M 리튬 비스-트리메틸실릴아미드(LHMDS) Aldrich 2.78ℓ 1M soln. 2.78
t-부틸 아세테이트 Aldrich 355g 116 3.06
1M HCl Stock 10ℓ - -
MTBE Fisher 8ℓ - -
포화 소듐 비카르보네이트 Stock 4ℓ - -
염수 Stock 2ℓ - -
무수 마그네슘 황산염 Fisher 300g - -
제조과정:
Z-L-발린 200g을 THF 3.3ℓ에 CDI를 용해한 용액과 질소증기 하에 1시간동안 상온에서 교반하였다. 1시간후 이미다졸의 생성으로 반응을 완료하였다. 질소 존재하에 12ℓ 반응기에 반응 혼합물과 THF에 용해한 1M 리튬 비스트리메틸실릴아미드 용액 2.78ℓ를 넣은 후 -70℃로 냉각하였다. t-부틸 아세테이트 410g을 -60℃ 이하의 온도를 유지하면서 1시간동안 천천히 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 -60℃와 -70℃ 사이에서 30분간 교반하였다. 상기 단계에서 제조한 무수물에 깔대기를 끼우고 에놀레이트를 질소하에 내부온도는 -60℃ 이하로 유지하고 적당히 교반하면서 천천히 첨가하였다. 첨가반응이 끝난 반응 혼합물을 -60℃에서 1시간동안 교반하였다. 그런 다음 내부 온도를 -50℃로 유지하고 강하게 교반하면서 4.0ℓ의 1M HCl을 천천히 넣었다. 상기 보다 높은 온도를 반응시키면 라세미화(racemization)가 발생한다. 농축한 12M HCl 200㎖를 첨가하여 pH를 6-7.5 사이로 맞추었다. 많은 고체들이 대부분 이미다졸인 용액에서 빠져나오고 유기불순물과 아민염도 빠져나왔다. 이들 고체들을 셀라이트로 여과하였다. 따뜻한 온도에서는 불순물이 용해되기 쉽기 때문에 차고 빠르게 셀라이트로 여과하였다. 고체들을 4ℓMTBE로 세척하였다. 여과물을 2ℓ MTBE와 1M HCl(2ℓ)로 희석하고 15분간 교반하였다. pH는 1-2 사이를 유지하도록 체크하였다. 그런 다음 유기물층을 분리하고 키랄 HPLC(98% 이상이어야 한다)로 확인하였다. 유기물층을 1M HCl(2x2ℓ)로 세척하고 15분간 교반하여 층 분리하였다. 유기물을 다시 2x2ℓ 포화 소듐 비카르보네이트 용액으로 세척하고 15분간 교반하여 층 분리하였다. 유기물층을 2ℓ 염수로 세척하고 상분리하여 무수 마그네슘 황산염으로 건조하였다. 건조한 유기물층을 여과하고 진공상태에서 용매와 반응하지 않은 t-부틸 아세테이트를 제거하고, t-부틸 아세테이트와 실옥산 (siloxanes)을 제거하기 위해 적어도 20시간 이상 고진공상태를 유지하였다. 작은샘플은1H NMR(CDCl3), TLC(헥산:에틸 아세테이트=1:1) 및 HPLC를 사용하여 분석하였다. 생성물 순도는 90% 가까이 되어야 한다. 그렇지 않으면, 이 화합물을 20% 에틸 아세테이트/헥산을 사용한 실리카로 크로마토그래피를 거쳐 분리할 수 있다. 대부분의 경우, 화합물을 다음 단계(아래의 실시예 6에서 기재한)에서 사용량이 증가하기 전에 먼저 10g을 흘려보내 사용-테스트 되어야 한다. 주의:1H NMR에서 아직 이미다졸 피크(7.00(s)와 7.62(s)ppm)에 있다면 2ℓ MTBE와 다시 반응시키고 1N HCl 500㎖와 포화 NaHCO3500㎖로 각각 두번씩 세척하고, 500㎖ 염수로 한번 세척한 후 MgSO4로 건조한다. 화합물14의 수율은 220g(79%)이었다. 화학적으로 순수한 최종 생성물이 발견될 경우, 화합물14의 키랄 순도가 95%를 초과하지 않으면 다음 단계로 계속 진행하지 않는 것이 좋다.
실시예 6
화합물15의 제조
[표 16]
반 응 물 질 출 처 사 용 량 분 자 량 몰 수
화합물14 - 257g 351 0.732
무수 THF Fisher 4.5ℓ - -
미네랄 오일에 용해한60% 수소화 나트륨 Aldrich 29.2g 24.1 0.732
화합물1C(90%) - 350g 330.3 0.952
1M HCl Stock 1ℓ - -
MTBE Fisher 6ℓ - -
염수 Stock 1.6ℓ - -
트리플루오로아세트산(TFA) Aldrich 210㎖ - -
포화 소듐 비카르보네이트 Stock 4ℓ - -
무수 마그네슘 황산염 Fisher 150g - -
염화 메틸렌 Fisher 500㎖ - -
제조과정:
수소화 나트륨을 아르곤 존재하에 2.5ℓ THF에 넣고 슬러리로 만들어 -5℃로 냉각하였다. 화합물14(257g)을 1ℓ THF에 용해하고 깔대기를 통해 15분동안 수소화 나트륨을 첨가하였다. 상기 용액을 내부온도를 0℃와 3℃ 사이로 유지하면서 30분간 교반하였다. 화합물1C(340g)를 1ℓ THF에 용해하고 내부온도를 0℃와 5℃ 사이로 유지하면서 상기 용액을 깔대기를 통해 첨가하여 반응 혼합물을 생성하였다. 상기 반응 혼합물을 2시간동안 상온으로 천천히 가온하고 약 20시간정도 상온에서 방치하였다. 상기 반응 혼합물에 1ℓ 1M HCl과 3ℓ MTBE를 첨가하고 15분간 교반하였다. 유기물층을 분리하고 800㎖ 염수로 두번 세척한 후 무수 마그네슘 황산염으로 건조하였다. 건조한 유기물층을 셀라이트로 여과한 후 진공상태에서 건조하여 아래에 기재한 단계에서 카르복시 이탈반응에 바로 사용되는 중간생성물 에피머 510g을 얻었다.
중간생성물 에피머를 염화 메틸렌 500㎖에 용해하고, 210㎖ 트리플루오로아세트산(TFA)를 첨가한 후 상온에서 6-20시간동안 교반하였다. 상기 용액을 TLC(20% 에틸 아세테이트/헥산과 세륨 암모늄 황산염/몰리브덴산(molybdic acid) 염색제)로 분석하였다. 주요 스팟(spot)이 화합물15(Rf 0.3)와 일치하는 것으로 관찰되었다. 용매를 진공상태에서 제거하고 농축된 오일을 2ℓ MTBE에 용해하였다. 그런 다음 오일을 포화 비카르보네이트 용액(4x1ℓ)으로 세척하였다. 세척할 때마다 최소 15분간 교반한다. (주의: TFA를 효과적으로 제거하기 위해 MTBE 추출물을 빠르게 교반하면서 수용성 비카르보네이트 용액을 넣는다). 그런 다음 유기물은 염수 500㎖로 세척하고 무수 마그네슘 황산염으로 건조하여 셀라이트로 여과하고 진공상태에서 제거하였다. 조화합물15의 수율은 492g이었다. CDCl3에 의한 조1H NMR 스펙트럼에서 순도가 약 60% 수준으로 나타났다.
조화합물15(492g)을 실리카겔(1 kilo)에 예비 흡수시켰다. 컬럼을 9:1 로딩(4 kilos, 바람직하게는 15:1)으로 채우고 10% EtOAc/헥산(2 컬럼 부피량), 15%(2 컬럼 부피량), 20%(2 컬럼 부피량)으로 용리하였다. 5-6 컬럼 부피량의 화합물을 용리한다. 원하는 화합물15와 함께 용리되는 케톤 부산물을 함유하는 순수한 화합물15∼140g을 분리하였다. 최종 UV 순도는 ∼88%로 검출되었고, 나머지 12%는 케톤 불순물이었다. 주의: 이 케톤 불순물은 아래의 실시예 9에서 효소 에스테르 가수분해를 수행한 후까지 제거하지 않았다. 화합물15의 수율은 45%이었다.
실시예 7
화합물16의 제조:
[표 17]
반 응 물 질 출 처 사 용 량 분 자 량 몰 수
화합물15 - 183g 429.4 0.364
THF(7㎖/g) Fisher 1.3ℓ - -
농축한 H2SO4 Fisher 37g 18M 0.364
10% Pd/C(10wt%) Aldrich 18g 10wt% -
화합물16 - 143g 393.15 -
제조과정:
2ℓ수소화 반응기(hydrogenator) 플라스크에서 조 화합물15(183g)를 1.3ℓ THF에 용해한 후 농축한 황산(1.0eq., 0.364mol, 20㎖) 37g을 첨가하였다. 상기 용액을 아르곤(15분간 표면하에)으로 정제하고, 팔라듐 촉매의 10 중량%(18g)를 아르곤 정제가 지속되는 반응기에 넣었다. 그런 다음 플라스크에 세번에 걸쳐 수소가스를 유입, 배출시킨 후 40psi의 압력에서 5-10시간동안 HPLC에서 반응이 완료되는 것이 확인될 때까지 교반하였다. 반응을 TLC(50% THF/헥산, 세륨 황산염, 포스포몰리브딘산 염료)와 HPLC(글루코(gluco)법)으로 모니터하였다. 촉매를 셀라이트의 패드로 여과시킨 다음 용매를 회전증발기로 진공하에 제거하였다. 노란색 오일 형태인 조화합물16의 수율은 170g(120%)이었다.
실시예 8
화합물17의 제조:
[표 18]
반 응 물 질 출 처 사 용 량 분 자 량 몰 수
화합물16 - 170g(조화합물) 393.2 0.364
CH2Cl2(ACS) Fisher 2.9ℓ - -
DIPEA (2.1eq.) d=0.742 Aldrich 133㎖ 129.3 0.764
5-메틸-3-카르복실산 Maybridge 58g 145.6 0.400
클로라이드 이소옥사졸3(1.1eq.) Chem. Co.
1N HCl Stock 0.8ℓ - -
포화 소듐 비카르보네이트 Stock 0.8ℓ - -
무수 황산 나트륨 Fisher 100g - -
화합물17 - 164g 402.18 -
제조과정:
5ℓ 둥근바닥 플라스크에서 조화합물16(170g)을 염화 메틸렌(2.9ℓ)에 용해하고 아르곤 블랭킷(blanket) 하에 얼음/염 욕조에서 0℃(내부온도)로 냉각하였다. 노란색 용액에 액상의 이소옥사졸 산 클로라이드(따뜻한 수욕조 35℃에서 녹인) 58g을 넣었다. 안전성의 문제로 인해 산 클로라이드는 차게 보관하는 것이 바람직하다. 천천히 디이소프로필에틸 아민(0.13ℓ)을 첨가 깔대기를 통해 10분간 첨가하였다. 그런 다음 반응을 TLC로 모니터링하고 최종적으로 HPLC(일반적으로 1시간 이내에 완료된다)를 거치는 동안 상기 반응 혼합물을 천천히 상온으로 가온하였다. 상기 반응을 1M HCl(400㎖)로 중단시켜, 수용성 층은 제거하고 유기물층은 1M HCl(400㎖)로 재추출하였다. 수용성 층을 제거하고 유기물층을 포화 비카르보네이트(2x400㎖)로 재추출하였다. 유기물은 황산 나트륨 100g으로 건조하고 여과, 진공상태에서 농축하여 노란색 오일 형태의 조화합물17164g(112%)을 얻었다.
실시예 9
화합물12의 제조:
[표 19]
반 응 물 질 출 처 사 용 량 분 자 량 몰 수
화합물17 - 164g(조화합물) 402.2 0.364
THF Fisher 115㎖ - -
KH2PO4완충용액 Stock 12ℓ 0.1M -
KH2PO4(>99.5%) Fluka 163g 136.1 1.2
NaOH(10N) Stock ~40㎖ 40 -
PPL-Type Ⅱ(조생성물) 0.75g/g Aldrich 123g 조생성물 -
농축한 HCl Fisher ~80㎖ - -
화합물12 - 142g 390.2 -
제조과정:
인산 이수소 칼륨 163g을 12ℓ의 이온이탈시킨 물(pH=4-5)에 넣고, 37-40℃에서 10M NaOH(∼40㎖)로 pH를 약 7.0-7.2 사이로 맞추어 완충용액 12ℓ를 제조하였다. 조화합물17(164g)을 THF 115㎖에 용해하고 37-40℃에서 상기 완충용액을 첨가하였다. 상기 용액은 반응의 출발물질에서 이상성을 나타내기도 한다. 상기 반응 혼합물에 PPL 효소(123g)를 첨가하고 37-40℃에서 교반한 후 12M HCl로 pH를 약 1-1.5 사이로 맞추어 반응을 중단시켰다. 상기 반응 생성물을 상온으로 냉각하는 동안 20분간 교반하였다. 상기 효소와 생성물 모두 수용상에서 충돌을 일으켰다. 상기 반응 혼합물을 셀라이트 패드로 여과하여 생성물과 효소를 수집하였다. 패드를 건조하고, 수납 플라스크를 깨끗한 것으로 교체하고 셀라이트 패드 슬러리의 위쪽 반을 염화 메틸렌(3x750㎖)으로 세척하였다. 유기물을 결합(많은 양이 존재할 경우 추출로 남은 물을 제거한다)시키고 마그네슘 황산염으로 건조, 여과 및 진공상태에서 농축하여 백색 고체를 얻었다. 이 백색 고체를 진공상태에서 건조하여 건조 조생성물 150g을 얻었다. 컬럼에서 1:80:20(i-PrOH: CH2Cl2: 헥산) 혼합물 4ℓ가 슬러리 형태로 1.5㎏ 실리카에서 패킹되었다. 건조 조생성물을 ∼250g 실리카로 건조 로드시키고, 헤드 스페이스(head space) 용제 ∼500㎖와 같이 컬럼으로 이동시켰다. 두 컬럼 부피량(∼2x6ℓ)에 같은 용리 혼합물을 첨가한 다음 3:80:20(i-PrOH: CH2Cl2: 헥산) ∼2x6ℓ를 첨가하였다. 조화합물12의 수율은 150g이었다. 크로마토그래피이후 세 단계 이상을 거친 결합 수율은 약 65-70% 사이, 94g(71%)이었다.
실시예 9A
화합물12의 정제
화합물12는 수용성 소듐 비카르보네이트 추출과 이어지는 산성화 반응에 의한 침전을 통해 정제하였다. 화합물을 포화 소듐 비카르보네이트 60 부피량에 어느정도 용해시키고 메틸 테스트-부틸 에스테르 10 부피량으로 추출하였다. 생성된 유기물층은 포화 소듐 비카르보네이트 용액의 10 부피량으로 두번 추출하였다. 수용성 비카르보네이트 추출물을 결합시키고 약 pH 1 정도로 산성화하였다. 탄소 디옥산의 가스를 제거하여 상기 용액을 약 20℃ 이상의 온도로 유지하였다. 상기 용액을 산성화하여 생성물 AG7172를 침전시켰다. 화합물12를 여과한 후 물 4 부피량으로 세척하여 50℃에서 질소정제하여 진공상태에서 건조하였다.
실시예 10
화합물6의 제조: (실시예 10과 실시예 11에서 제조하는 화합물의 구조는 반응식 7을 참조한다)
제조과정:
화합물1A36.80g(200㎖)을 아세톤 400㎖에 용해한 후 트리에틸아민 22.26g(220mmol)을 천천히 첨가하고 온도를 30℃ 이하로 유지하였다. 그런 다음 HPLC에서 반응이 완료된 것이 확인되는 약 65시간동안 교반하여 생성한 반응 혼합물에 벤질 브로마이드 37.6g(220mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물에 200㎖의 MTBE를 첨가하고 수분간 교반한 다음 침전된 트리에틸아민염의 대부분을 제거하기 위해 혼합물을 실리카겔의 짧은 패드로 여과하였다. 여과물을 1M HCl(200㎖), 포화 소듐 비카르보네이트(100㎖x2) 및 염수(200㎖)로 세척하였다. 그런 다음 마그네슘 황산염으로 건조하고 실리카겔의 짧은 패드로 여과 및 농축하여 화합물6을 얻었다(수율 71-75%; 35.5-37.5g; HPLC 순도는 90-95% 사이). 화합물6을 헥산/염화 메틸렌(8:1)으로 재결정화하여 결정상의 생성물을 얻었다.
실시예 11
화합물6으로부터 화합물7제조.
제조과정:
화합물61.37g(5mmol)을 40㎖ 염화 메틸렌에 용해하고 -10℃로 냉각하였다. 그런 다음 상기 용액에 0.93㎖ Tf2O(5.25mmol)을 첨가하고 2,6-루티딘(2,6-lutidine) 0.64㎖ (5.25mmol)를 천천히 첨가하였다. 상기 반응은 약한 발열반응이므로 냉각 욕조를 사용하여 -8℃ 이하로 온도를 유지시켰다. 냉각 욕조를 제거한 후 상기 반응 혼합물을 약 1시간동안 교반하고 혼합물을 가온하여 생성된 혼합물을 하우스 진공하에 농축하였다. 생성된 조오일을 헥산(100㎖)에 재용해하고 드라이 아이스 존재하에 교반하여 핑크색 고체인 루티디늄염(lutidinium salt)를 침전시켰다. 침전물을 실리카겔 박층으로 여과하고 다시 농축하여 투명한 오일인 화합물7을 얻었다.1H NMR로 정제하여 검출된 수율은 90%(1.84g)이었다.
실시예 12
Z-발린(Z-Valine)으로부터 화합물18제조. (실시예 12 내지 실시예 15에서 제조하는 화합물의 구조는 반응식 8을 참조한다).
제조과정:
Z-발린 50.26g(200mmol)과 1,1'-카르보닐디이미다졸 35.0g(210mmol)을 차례로 상온에서 THF (200㎖)에 용해하였다. 생성된 혼합물을 상온에서 1시간동안 교반하여 아실 이미다졸 중간물질 용액을 얻었다. (주의: 이 반응에서 카본 디옥산을 방출한다). 분리단계에서 LiHMDS(THF에 1M 농도로 용해, 642㎖)를 -78℃에서 THF(800㎖)에 첨가한 후 o-벤질 아세테이트(30g, 200mmol)를 천천히 첨가하였다. 이 반응은 발열반응이므로 반응온도를 -70℃ 이하로 유지시켰다. 상기 혼합물을 30분간 교반한 다음 -68℃ 이하의 온도에서 아실 이미다졸 용액을 혼합물에 천천히첨가하였다. 이 반응 또한 발열반응이어서 온도를 -68℃ 이하로 유지시켰다. 생성된 반응 혼합물을 55분간 교반한 후 드라이 아이스 욕조를 제거하였다. 온도를 25℃ 이하로 유지하면서 상기 반응 혼합물에 1M HCl(500㎖)을 천천히 첨가하였다. 유기물층을 분리하고 포화 소듐 비카르보네이트(200㎖)와 염수(200㎖)로 세척한 후 마그네슘 황산염으로 건조하고 농축하여 수율 85% 이상(72.09g 이상)이고 HPLC 순도가 90-95% 사이인 화합물18을 얻었다. 분해를 막기위해 화합물18을 냉장고에 보관하였다.
실시예 13
화합물18로부터 화합물19제조.
제조과정:
화합물18(1.38g, 3.60mmol)을 THF(10㎖)에 용해한 용액에 -10℃에서 THF (20㎖)에 NaH(60%, 158.4㎎, 3.96mmol)을 용해한 용액을 천천히 첨가하였다. 생성한 반응 혼합물에서 냉각 욕조를 제거하고 20분간 교반하면서 가온하였다. 상기 반응 혼합물에 염화 메틸렌(10㎖)에 화합물7(1.76g, 4.33mmol)을 용해한 용액을 첨가하였다. 상기 반응의 진행을 HPLC를 사용하여 출발물질이 모두 소모되는 것을 모니터하였다. 상기 반응 혼합물을 48시간 동안 교반한 다음 MTBE(50㎖)를 첨가하였다. 1M HCl(75㎖)을 천천히 첨가한 후 반응 혼합물을 분리하여 수용성층을 MTBE(50㎖x2)로 추출하였다. 결합된 유기물층은 마그네슘 황산염으로 건조한 후 실리카겔의 짧은 패드로 여과하고 농축하여 조생성물인 화합물19를 얻었다. (MS 산출 639,검출: MH+640 및 MNa+662). 헥산/에틸 아세테이트(4:1)를 사용한 크로마토그래피 분리과정에서 수율은 50-60%이었다.
실시예 14
화합물19로부터 화합물20제조.
제조과정:
화합물19(680㎎, 1.06mmol)를 가스제거한 THF와 농축한 황산(116㎎, 1.10mmol) 혼합물에 용해하였다. 상기 용액에 10% Pd-C(204㎎)을 첨가한 후 반응 혼합물을 파르 쉐이커(Parr shaker)에서 50psi의 압력으로 5시간동안 교반하였다. 상기 혼합물을 메탄올(75㎖)에 용해한 후 셀라이트로 여과하고 셀라이트를 메탄올(75㎖)로 세척하여 다음 단계에서 더이상의 정제 과정을 거치지 않고 사용되는 화합물20의 조생성물 480㎎(화합물18로부터 두단계를 연속으로 거치는 동안 전체 중량 대비 50-60% 수율로 수득하였다)을 얻었다.
실시예 15
화합물20으로부터 화합물12제조.
제조과정:
화합물20(300㎎, 0.813mmol)과 디이소프로필에틸아민(DIEPA)(0.45㎖, 2.60mmol, 3.2eq)를 0℃에서 디옥산(40㎖)에 차례로 용해하여 현탁액을 제조하였다. 0℃에서 상기 현탁액에 디옥산(10㎖)에 5-메틸-3-이소옥사졸-3-카르보닐 클로라이드(130㎎, 0.894mmol)를 용해한 용액을 첨가하였다. (주의: 이 반응은 몹시 발열되는 과정이다). 상기 반응을 TLC로 모니터하고 반응 혼합물을 1시간동안 교반하였다. 그런 다음 염화 메틸렌(20㎖)를 첨가한 후 혼합물을 1M HCl(10㎖)과 포화 소듐 비카르보네이트(10㎖)로 세척하고 마그네슘 황산염으로 건조 및 실리카겔의 짧은 패드로 여과하여 컬럼 분리(염화 메틸렌/헥산/이소프로판올=79:20:3)한 후 HPLC 순도가 95%(MS 산출 390, 검출: MNa+413)이고 수율이 65-70% 사이인 화합물12를 얻었다.
실시예 16
[표 20]
반 응 물 질 당 량 몰수(mmol) 화학식량 사 용 량
화합물10 1.5 1.8 326.39 751㎎
TFA 12.0 18.0 114.02 1.4㎖
DCM 10㎖/g(화합물10) - - 7.6㎖
n-메틸모르폴린 10.0 15.0 101.15 1.6㎖
DMF 7㎖/g(화합물12) - - 4.1㎖
CDMT 1.05 1.6 175.58 281㎎
DMF 4㎖/g(CDMT) - - 1.1㎖
물 42㎖/g(화합물12) - - 24.7㎖
화합물10으로부터 화합물11제조.
제조과정:
격막으로 덮인 단일목 둥근바닥 플라스크에서 화합물10을 DCM에 용해하였다. 상기 플라스크를 질소로 정제한 후 용액을 교반하는 동안 주입기를 통해 TFA를첨가하였다. 이 반응의 진행을 DCM에 용해한 5% MeOH를 사용하여 출발물질이 모두 소모될 때까지 약 4시간정도 TLC로 모니터하였다. 용매와 남은 TFA를 45℃, <50mTorr의 압력에서 진공상태로 제거하였다. 생성물인 화합물11은 바로 이어지는 아래의 단계에서 사용된다.
화합물11과 화합물12로부터 화합물AG7088제조.
제조과정:
격막으로 덮여있고 온도 탐침이 설치된 단일목 플라스크에서 화합물11과 화합물12를 DMF에 용해하였다. 플라스크를 질소로 정제하였다. 생성된 용액을 두 부분으로 나누었다. 첫번째 부분에는 주입기를 통해 n-메틸모르폴린을 첨가하여 0℃±5℃로 냉각하였다. 두번째 부분을 CDMT 용액에 용해하였다. 그런 다음 이 CDMT 용액을 주입기를 통해 반응온도를 0℃±5℃로 유지하면서 첫번째 용액에 떨어뜨렸다. 그런 다음 생성된 반응 혼합물을 상온으로 가온하였다. 상기 반응을 화합물12가 모두 소모될 때까지 약 1시간정도 TLC(헥산:EtOAc:IPA=7:3:1)로 모니터하였다. 반응이 완료되면 상기 반응 혼합물에 물을 천천히 첨가하여 생성물AG7088을 용액에서 침전시켰다. 생성된 슬러리를 여과하여 순도 97% 이하인 화합물AG7088의 백색 과립상 결정들을 85% 이하의 수율로 얻었다. 그런 다음 생성물을 뜨거운 MeOH:EtOAc=1:1에 용해한 후 헥산(2 부피량)을 천천히 첨가하여 재결정화하였다.
상기의 상세한 설명은 본질적으로 본 발명에 대해 예시하고 설명하기 위한 것이고 본 발명 및 바람직한 실시예를 구체적으로 보여주기 위한 것이다. 통상적인 실험을 통해, 당업자들은 본 발명의 의도에서 벗어나지 않는 자명한 변화 및 전환을 인지할 수 있다. 따라서, 본 발명은 단지 청구항 및 그에 상응하는 부분이나 상기에서 설명한 것에서만 한정되지는 않는 것이다.

Claims (51)

  1. 단계 A: 일반식 ⅡA의 화합물 제조하는 단계:
    (a) 일반식 XⅢ의 화합물을 1,1'-카르보닐디이미다졸과 반응시킨 후 일반식 XⅢA의 화합물을 처리하여 일반식 XⅣ의 β-케토에스테르로 전환시키는 단계;
    (b) 일반식 XⅣ의 β-케토에스테르를 일반식 XⅥ의 화합물과 반응시켜 일반식 XⅤ의 에놀레이트로 전환시키는 단계;
    (c) 일반식 XⅤ의 에놀레이트를 수소첨가분해하여 일반식 XⅦ의 화합물을 제조하는 단계;
    (d) 일반식 XⅦ의 화합물을 일반식 R20-X의 화합물과 반응시켜 아실화하여 일반식 XⅧ의 화합물을 제조하는 단계. 여기에서 X는 적당한 할로겐화물이다; 및
    (e) 일반식 XⅧ의 화합물을 효소첨가 가수분해하여 일반식 ⅡA의 화합물을 제조하는 단계;를 포함하는 단계 A 및
    단계 B: 일반식 ⅡA의 화합물과 일반식 Ⅲ의 화합물을 아미드 생성 반응시키는 단계;
    를 포함하는 일반식 IA의 항피코나바이러스 작용제를 제조하는 방법:
    여기에서, Lv는 적당한 이탈기이고;
    Z'는 N 원자를 위한 적당한 보호기이고;
    R1은 H, F, 알킬그룹, OH, SH 또는 O-알킬그룹이고;
    R2및 R3는 각각 독립적으로 H,
    이고;
    여기에서 n은 0 내지 5의 정수이고, A1은 CH 또는 N, A2와 A3는 각각 C(R41)(R41), N(R41), S, S(O), S(O)2및 O로부터 독립적으로 선택된 것이고, A4는 NH 또는 NR41, 여기에서 R41은 독립적으로 H 또는 저가 알킬이고, A1, A2, (A3)n, A4및 C=O에 의해 형성된 상기에서 표시한 링이 연속적으로 존재하는 둘이상의 이종원자들을 제조하였고, R2와 R3중의 적어도 하나는
    이고;
    R4는
    ;
    R5와 R6는 각각 독립적으로 H, F, 알킬 그룹, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클로알킬 그룹, 아릴 그룹 또는 헤테로아릴 그룹이며;
    R7및 R8각각 독립적으로 H, 알킬 그룹, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클로알킬 그룹, 아릴 그룹, 헤테로아릴 그룹, -OR17, -SR17, -NR17R18, -NR19NR17R18또는 -NR17OR18이고, 여기에서 R17, R18및 R19는 각각 독립적으로 H, 알킬 그룹, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클로알킬 그룹, 아릴 그룹, 헤테로아릴 그룹 또는 아실 그룹이고, R7과 R8중 적어도 하나는 알킬 그룹, 아릴 그룹, 헤테로아릴 그룹, -OR17, -SR17, -NR17R18, -NR19NR17R18또는 -NR17OR18이고; R9는 O, N 및 S에서 선택된 하나 내지 세 개의 이종원자들을 가지는 5환 헤테로고리이며;
    R20은
    ; 및
    Z와 Z1은 각각 독립적으로 H, F, 알킬 그룹, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클로알킬 그룹, 아릴 그룹, 헤테로아릴 그룹, -C(O)R21, -CO2R21, CN, -C(O)NR21R22, -C(O)NR21OR22, -C(S)R21, -C(S)NR21R22, -NO2, -SOR21, -SO2R21, -SO2NR21R22, -SO(NR21)(OR22), -SONR21, -SO3R21, -PO(OR21)2, -PO(R21)(R22), -PO(NR21R22)(OR23), -PO(NR21R22)(NR23R24), -C(O)NR21NR22R23또는 -C(S)NR21NR22R23이며, 여기에서 R21, R22, R23및 R24는 각각 독립적으로 H, 알킬 그룹, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클로알킬 그룹, 아릴 그룹, 헤테로아릴 그룹, 아실 그룹 또는 티오아실 그룹이거나, 또는 Z와 Z1이 둘다 H인 것은 아니라는 조건에서 R21, R22, R23및 R24중 2개의 원자가 결합하여 헤테로사이클로알킬 그룹을 형성한다;
    또는 Z1과 R1은 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 그룹을 형성할 수 없는 부분임을 제외하고 상기에서 정의한 바와 같은 경우로서, Z1과 R1원자가 결합하여 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 그룹을 형성한다;
    또는 Z1과 Z1은 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 그룹을 형성할 수 없는 부분임을 제외하고 상기에서 정의한 바와 같은 경우로서, Z와 Z1원자가 결합하여 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 그룹을 형성한다.
  2. (a) 일반식 XⅢ의 화합물을 1,1'-카르보닐디이미다졸과 반응시킨 후 일반식 XⅢA의 화합물을 처리하여 일반식 XIV의 β-케토에스테르로 전환시키는 단계;
    (b) 일반식 XIV의 β-케토에스테르를 일반식 XVI의 화합물과 반응시켜 일반식 XV의 에놀레이트로 전환시키는 단계;
    (c) 일반식 XV의 에놀레이트를 가수소분해(hydrogenolysis)하여 일반식 XⅦ의 화합물을 제조하는 단계;
    (d) 일반식 XⅦ의 화합물을 적당한 반응조건에서 일반식 R20-X의 화합물과 반응시켜 일반식 XⅧ의 화합물을 제조하는 단계. 여기에서 X는 할로겐화물이다; 및
    (e) 일반식 XⅧ의 화합물을 효소첨가 가수분해하여 일반식 ⅡA의 화합물을 제조하는 단계;
    를 포함하는 것을 일반식 ⅡA의 화합물을 제조하는 방법:
    여기에서, Lv는 적당한 이탈기이고;
    Z'는 N 원자를 위한 적당한 보호기이고;
    R6는 H, F, 알킬 그룹, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클로알킬 그룹, 아릴 그룹 또는 헤테로아릴 그룹이며;
    R7및 R8각각 독립적으로 H, 알킬 그룹, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클로알킬 그룹, 아릴 그룹, 헤테로아릴 그룹, -OR17, -SR17, -NR17R18, -NR19NR17R18또는 -NR17OR18이고, 여기에서 R17, R18및 R19는 각각 독립적으로 H, 알킬 그룹, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클로알킬 그룹, 아릴 그룹, 헤테로아릴 그룹 또는 아실 그룹이고, R7과 R8중 적어도 하나는 알킬 그룹, 아릴 그룹, 헤테로아릴 그룹, -OR17, -SR17, -NR17R18, -NR19NR17R18또는 -NR17OR18이고;
    R9는 O, N 및 S에서 선택된 하나 내지 세 개의 이종원자들을 가지는 5환 헤테로고리이며;
    R20은
    이다.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 효소 첨가 분해반응 과정에 사용되는 효소로 돼지의 췌장 지방분해효소를 사용하는 것을 특징으로 하는 일반식 ⅡA의 화합물을 제조하는 방법.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 일반식 XⅢ의 화합물이 Z-발린인 것을 특징으로 하는 일반식 ⅡA의 화합물을 제조하는 방법.
  5. 제 2항에 있어서, 상기 일반식 XⅥ의 화합물이
    인 것을 특징으로 하는 일반식 ⅡA의 화합물을 제조하는 방법.
  6. 제 2항에 있어서, 상기 일반식 XⅣ의 β-케토에스테르를 알칼리-금속 수소화물과 먼저 반응시킨 후 일반식 XⅥ의 화합물과 β-케토에스테르를 반응시키는 것을 특징으로 하는 일반식 ⅡA의 화합물을 제조하는 방법.
  7. 제 2항에 있어서, 상기 알칼리-금속 수소화물이 수소화 나트륨인 것을 특징으로 하는 일반식 ⅡA의 화합물을 제조하는 방법.
  8. 제 2항에 있어서, 상기 단계 (c)가 팔라듐 수소첨가분해 과정으로 이루어진 것을 특징으로 하는 일반식 ⅡA의 화합물을 제조하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 팔라듐 수소첨가분해 과정이 감압하에 수행되는 것을 특징으로 하는 일반식 ⅡA의 화합물을 제조하는 방법.
  10. 제 2항에 있어서, 상기 단계 (d)의 아실화반응의 반응물로 디이소프로필에틸 아민을 사용하는 것을 특징으로 하는 일반식 ⅡA의 화합물을 제조하는 방법.
  11. 제 2항에 있어서, 상기 일반식 ⅡA의 화합물이:
    이고;
    일반식 XⅧ의 화합물이:
    이고;
    일반식 XⅦ의 화합물이:
    이고; 및
    일반식 XV의 에놀레이트가:
    인 것을 특징으로 하는 일반식 ⅡA의 화합물을 제조하는 방법.
  12. (a) 일반식 XⅨ의 화합물을 1,1'-카르보닐디이미다졸과 반응시킨 후 일반식XIXA의 화합물을 처리하여 일반식 XX의 β-케토에스테르로 전환시키는 단계;
    (b) 일반식 XX의 화합물을 적당한 반응조건에서 일반식 XXⅡ의 화합물과 반응시켜 일반식 XXI의 화합물로 전환시키는 단계;
    (c) 일반식 XXⅠ의 화합물을 수소화반응시켜 일반식 XXⅢ를 제조하는 단계; 및
    (d) 일반식 XXⅢ의 화합물을 적당한 반응조건에서 R20-X와 반응시켜 아실화하여 일반식 ⅡA의 화합물을 제조하는 단계;
    를 포함하는 일반식 ⅡA의 화합물을 제조하는 방법:
    여기에서, X는 적당한 할로겐화물이고;
    여기에서, Lv는 적당한 이탈기이고;
    Z'는 N 원자를 위한 적당한 보호기이고;
    R6는 H, F, 알킬 그룹, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클로알킬 그룹, 아릴 그룹 또는 헤테로아릴 그룹이며;
    R7및 R8각각 독립적으로 H, 알킬 그룹, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클로알킬 그룹, 아릴 그룹, 헤테로아릴 그룹, -OR17, -SR17, -NR17R18, -NR19NR17R18또는 -NR17OR18이고, 여기에서 R17, R18및 R19는 각각 독립적으로 H, 알킬 그룹, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클로알킬 그룹, 아릴 그룹, 헤테로아릴 그룹 또는 아실 그룹이고, R7과 R8중 적어도 하나는 알킬 그룹, 아릴 그룹, 헤테로아릴 그룹, -OR17, -SR17, -NR17R18, -NR19NR17R18또는 -NR17OR18이고;
    R9는 O, N 및 S에서 선택된 하나 내지 세 개의 이종원자들을 가지는 5환 헤테로고리이며;
    R20은
    이다.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 일반식 XIX의 화합물이:
    인 것을 특징으로 하는 일반식 ⅡA의 화합물을 제조하는 방법.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 일반식 XX의 화합물이:
    인 것을 특징으로 하는 일반식 ⅡA의 화합물을 제조하는 방법.
  15. 제 12항에 있어서, 상기 일반식 XXI의 화합물이:
    인 것을 특징으로 하는 일반식 ⅡA의 화합물을 제조하는 방법.
  16. 제 12항에 있어서, 상기 일반식 XXⅡ의 화합물이:
    인 것을 특징으로 하는 일반식 ⅡA의 화합물을 제조하는 방법.
  17. 제 12항에 있어서, 상기 일반식 XXⅢ의 화합물이:
    인 것을 특징으로 하는 일반식 ⅡA의 화합물을 제조하는 방법.
  18. (a) N-메틸모르폴린 존재하에 일반식 Ⅱ의 화합물과 일반식 ⅢA의 화합물을반응시켜 반응 혼합물을 생성하는 단계;
    (b) 단계 (a)에서 생성한 반응 혼합물에 일반식 Lv-X의 화합물을 첨가하여 일반식 Ⅰ의 화합물을 제조하는 단계;
    를 포함하는 일반식 Ⅰ의 화합물을 제조하는 방법:
    여기에서 X는 적당한 할로겐화물이고;
    여기에서, Lv는 적당한 이탈기이고;
    Z'는 N 원자를 위한 적당한 보호기이고;
    R1은 H, F, 알킬그룹, OH, SH 또는 O-알킬그룹이고;
    R2및 R3는 각각 독립적으로 H,
    이고;
    여기에서 n은 0 내지 5의 정수이고, A1은 CH 또는 N, A2와 A3는 각각 C(R41)(R41), N(R41), S, S(O), S(O)2및 O로부터 독립적으로 선택된 것이고, A4는 NH 또는 NR41, 여기에서 R41은 독립적으로 H 또는 저가 알킬이고, A1, A2, (A3)n, A4및 C=O에 의해 형성된 상기에서 표시한 링이 연속적으로 존재하는 둘이상의 이종원자들을 제조하였고, R2와 R3중의 적어도 하나는
    이고;
    R4는
    ;
    R5와 R6는 각각 독립적으로 H, F, 알킬 그룹, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클로알킬 그룹, 아릴 그룹 또는 헤테로아릴 그룹이며;
    R7및 R8각각 독립적으로 H, 알킬 그룹, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클로알킬 그룹, 아릴 그룹, 헤테로아릴 그룹, -OR17, -SR17, -NR17R18, -NR19NR17R18또는 -NR17OR18이고, 여기에서 R17, R18및 R19는 각각 독립적으로 H, 알킬 그룹, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클로알킬 그룹, 아릴 그룹, 헤테로아릴 그룹 또는 아실 그룹이고, R7과 R8중 적어도 하나는 알킬 그룹, 아릴 그룹, 헤테로아릴 그룹, -OR17, -SR17, -NR17R18, -NR19NR17R18또는 -NR17OR18이고; R9는 O, N 및 S에서 선택된 하나 내지 세 개의 이종원자들을 가지는 5환 헤테로고리이며;
    R20은
    ; 및
    Z와 Z1은 각각 독립적으로 H, F, 알킬 그룹, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클로알킬 그룹, 아릴 그룹, 헤테로아릴 그룹, -C(O)R21, -CO2R21, CN, -C(O)NR21R22, -C(O)NR21OR22, -C(S)R21, -C(S)NR21R22, -NO2, -SOR21, -SO2R21, -SO2NR21R22, -SO(NR21)(OR22), -SONR21, -SO3R21, -PO(OR21)2, -PO(R21)(R22), -PO(NR21R22)(OR23), -PO(NR21R22)(NR23R24), -C(O)NR21NR22R23또는 -C(S)NR21NR22R23이며, 여기에서 R21, R22, R23및 R24는 각각 독립적으로 H, 알킬 그룹, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클로알킬 그룹, 아릴 그룹, 헤테로아릴 그룹, 아실 그룹 또는 티오아실 그룹이거나, 또는Z와 Z1이 둘다 H인 것이 아니라는 조건에서 R21, R22, R23및 R24중 2개의 원자가 결합하여 헤테로사이클로알킬 그룹을 형성한다;
    또는 Z1과 R1은 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 그룹을 형성할 수 없는 부분임을 제외하고 상기에서 정의한 바와 같은 경우로서, Z1과 R1원자가 결합하여 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 그룹을 형성한다;
    또는 Z1과 Z1은 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 그룹을 형성할 수 없는 부분임을 제외하고 상기에서 정의한 바와 같은 경우로서, Z와 Z1원자가 결합하여 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 그룹을 형성한다.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 일반식 Ⅰ의 화합물이:
    인 것을 특징으로 하는 일반식 Ⅰ의 화합물을 제조하는 방법.
  20. 제 18항에 있어서, 상기 일반식 Ⅱ의 화합물이:
    인 것을 특징으로 하는 일반식 Ⅰ의 화합물을 제조하는 방법.
  21. 제 18항에 있어서, 상기 일반식 ⅢA의 화합물이:
    인 것을 특징으로 하는 일반식 Ⅰ의 화합물을 제조하는 방법.
  22. 제 18항에 있어서, 상기 일반식 Lv-X의 화합물이 클로로디메틸트리아진 (chlorodimethyltriazine)인 것을 특징으로 하는 일반식 Ⅰ의 화합물을 제조하는 방법.
  23. 제 18항에 있어서, 상기 일반식 ⅢB의 화합물이 트리플루오로아세트산과 반응하는 단계로 구성된 과정을 거쳐 일반식 ⅢA의 화합물을 제조하는 것을 특징으로 하는 일반식 Ⅰ의 화합물을 제조하는 방법.
    여기에서, 일반식 ⅢB의 화합물은 다음과 같다:
  24. 단계 A : 다음의 단계를 포함하는 과정을 거쳐 일반식 Ⅵ의 화합물을 일반식 Ⅴ의 화합물로 전환시키는 단계:
    (a) 환류 온도에서 촉매 존재하에 수용성 배지에서 일반식 Ⅵ의 R10이 치환된 벤즈알데히드와 히단토인(hydantoin)을 반응시켜 반응 혼합물을 생성하는 단계;
    (b) 환류온도에서 상기 단계 (a)에서 생성한 반응 혼합물에 충분한 양의 알칼리 금속 수산화물을 처리하여 알칼리 금속 수산화물-처리 용액을 생성하는 단계;
    (c) 알칼리 금속 수산화물-처리 용액에 알칼리 금속 할로겐화물을 첨가하는 단계;
    (d) 농축한 산으로 상기 단계 (c)에서 제조한 용액을 산성화하여 일반식 Ⅴ의 침전물을 제조하는 단계;
    ; 및
    단계 B: 일반식 Ⅴ의 화합물을 효소 환원반응을 거쳐 일반식 Ⅶ의 화합물로 전환시키는 단계;
    단계 C: 일반식 Ⅶ을 일반식 R"-OH의 화합물과 에스테르화 반응하여 일반식 XⅡ의 화합물을 제조하는 단계. 여기에서 R"는 알킬 또는 아릴이다;
    ; 및
    단계 D: 일반식 XⅡ의 화합물을 일반식 XⅥA의 화합물로 전환시키는 단계;
    를 포함하는 일반식 XⅥA의 화합물을 제조하는 방법:
    여기에서, R10은 할로겐화물 또는 알킬 그룹이다;
  25. 제 24항에 있어서, 상기 단계 B의 환원 반응이 포름 디하이드로게나아제와 락테이트 디하이드로게나아제에 의한 촉매반응인 것을 특징으로 하는 일반식 XⅥA의 화합물을 제조하는 방법.
  26. 제 24항에 있어서, 상기 단계 B의 환원 반응이 막-첨부 효소 촉매반응(membrane-enclosed enzymatic catalysis method: MEEC)을 이용하는 것을 특징으로 하는 일반식 XⅥA의 화합물을 제조하는 방법.
  27. 제 24항에 있어서, 상기 단계 B의 환원 반응이 보조고정(coimmobilization) 효소 촉매반응을 이용하는 것을 특징으로 하는 일반식 XⅥA의 화합물을 제조하는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 보조고정 효소 촉매반응의 적당한 공중합체로 PAN 500을 사용하는 것을 특징으로 하는 일반식 XⅥA의 화합물을 제조하는 방법.
  29. 제 25항에 있어서, 상기 락테이트 디하이드로게나아제가 D-락테이트 디하이드로게나아제인 것을 특징으로 하는 일반식 XⅥA의 화합물을 제조하는 방법.
  30. 제 25항에 있어서, 상기 락테이트 디하이드로게나아제가 L-락테이트 디하이드로게나아제인 것을 특징으로 하는 일반식 XⅥA의 화합물을 제조하는 방법.
  31. 제 24항에 있어서, 상기 단계 C의 에스테르화 반응이 상온에서 염산과 디옥산의 존재하에 수행되는 것을 특징으로 하는 일반식 XⅥA의 화합물을 제조하는 방법.
  32. 제 24항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 사용되는 촉매가 일차 또는 이차 아민인 것을 특징으로 하는 일반식 XⅥA의 화합물을 제조하는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 상기 촉매가 1-아미노-2-프로판올인 것을 특징으로 하는 일반식 XⅥA의 화합물을 제조하는 방법.
  34. 단계 A': 다음의 단계를 포함하는 과정을 거쳐 세린을 일반식 Ⅶ의 화합물로 전환시키는 단계:
    (a) 세린을 통상적인 방법으로 포타슘 글리시데이트로 전환시키는 단계; 및
    (b) 일반식 R10-페닐-Q의 화합물과 위치선택적 에폭시드 고리열림 반응시키는 단계;
    단계 B': 일반식 Ⅶ의 화합물을 일반식 R"-OH의 화합물과 에스테르화 반응을 거쳐 일반식 XⅡ의 화합물을 제조하는 단계;
    ; 및
    단계 C': 일반식 XⅡ의 화합물을 일반식 XⅥA의 화합물로 전환시키는 단계;
    를 포함하는 일반식 XⅥA의 화합물을 제조하는 방법:
    여기에서 R10은 할로겐화물 또는 알킬 그룹이고;
    R"는 알킬 또는 아릴이며; 및
    Q는 활성화된 브롬화물, 황산염 또는 일차 요오드이다.
  35. 제 34항에 있어서, 상기 세린이 L-세린인 것을 특징으로 하는 일반식 XⅥA의 화합물을 제조하는 방법.
  36. 제 34항에 있어서, 상기 세린이 D-세린인 것을 특징으로 하는 일반식 XⅥA의 화합물을 제조하는 방법.
  37. 제 34항에 있어서, 상기 Q가 -MgBr인 것을 특징으로 하는 일반식 XⅥA의 화합물을 제조하는 방법.
  38. 제 34항에 있어서, 상기 R10이 파라 위치(para position)에 F가 있는 페닐고리인 것을 특징으로 하는 일반식 XⅥA의 화합물을 제조하는 방법.
  39. 제 34항에 있어서, 상기 단계 B'의 에스테르화 반응이 상온에서 염산과 디옥산의 존재하에 수행되는 것을 특징으로 하는 일반식 XⅥA의 화합물을 제조하는 방법.
  40. 제 34항에 있어서, 상기 단계 A'의 (a)에서 생성되는 포타슘 글리시데이트가 글리시딘산으로 전환된 후 단계 A'의 (b)에서 위치선택적 에폭시드 고리열림 반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 일반식 XⅥA의 화합물을 제조하는 방법.
  41. 단계 A": 다음의 단계를 포함하는 과정을 거쳐 일반식 Ⅸ의 화합물로부터 일반식 XⅡA의 화합물을 제조하는 단계:
    (a) 일반식 Ⅸ의 화합물을 비대칭 디히드록실화 반응(dihydroxylation)을 거쳐 일반식 XA의 화합물을 생성하는 단계:
    (b) 일반식 Ⅸ의 화합물을 톨루엔 존재하에 1,1'-카르보닐디이미다졸과 반응시켜 일반식 XI의 화합물을 생성하는 단계; 및
    (c) 일반식 XI의 화합물을 팔라듐-중재 환원반응을 수행하여 일반식 XⅡA의 화합물을 생성하는 단계; 및
    단계 B": 일반식 XⅡA의 화합물을 일반식 XⅥB의 화합물로 전환시키는 단계;
    를 포함하는 일반식 XⅥB의 화합물을 제조하는 방법:
    여기에서 R10은 할로겐화물 또는 알킬 그룹이고; 및
    R"은 알킬 또는 아릴이다.
  42. 제 41항에 있어서, 상기 비대칭 디히드록실화 반응이 샤플리스 비대칭 디히드록실화반응인 것을 특징으로 하는 일반식 XⅥB의 화합물을 제조하는 방법.
  43. 제 41항에 있어서, 상기 단계 (b)가 약 80℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 일반식 XⅥB의 화합물을 제조하는 방법.
  44. 제 41항에 있어서, 상기 팔라듐-중재 환원 과정이 포름산의 존재하에 상온에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 일반식 XⅥB의 화합물을 제조하는 방법.
  45. 아래의 일반식으로 표현되는 화합물:
    및 그 산첨가 염.
  46. 아래의 일반식으로 표현되는 화합물:
    및 그 산첨가 염.
  47. 아래의 일반식으로 표현되는 화합물:
    및 그 산첨가 염.
  48. 아래의 일반식으로 표현되는 화합물:
    및 그 산첨가 염.
  49. 단계 A : 다음의 단계를 포함하는 과정을 거쳐 일반식 Ⅵ의 화합물을 일반식Ⅴ의 화합물로 전환시키는 단계:
    (a) 환류 온도에서 촉매 존재하에 수용성 배지에서 일반식 Ⅵ의 R10이 치환된 벤즈알데히드를 히단토인과 반응시켜 반응 혼합물을 제조하는 단계;
    (b) 환류온도에서 상기 단계 (a)에서 제조한 반응 혼합물에 충분한 양의 알칼리 금속 수산화물을 처리하여 알칼리 금속 수산화물-처리 용액을 생성하는 단계;
    (c) 알칼리 금속 수산화물-처리 용액에 알칼리 금속 할로겐화물을 첨가하는 단계;
    (d) 농축한 산으로 상기 단계 (c)에서 제조한 용액을 산성화하여 일반식 Ⅴ의 침전물을 제조하는 단계;
    ; 및
    단계 B: 일반식 Ⅴ의 화합물을 효소 환원반응을 거쳐 일반식 Ⅶ의 화합물을 제조하는 단계;
    를 포함하는 일반식 Ⅶ의 화합물을 제조하는 방법:
    여기에서 R10은 할로겐 또는 알킬 그룹이다;
  50. (a) 세린을 일반적인 방법으로 포타슘 글리시데이트로 전환시키는 단계;
    (b) 일반식 R10-페닐-Q의 화합물과 위치선택적 에폭시드 고리열림 반응을 수행하여 일반식 Ⅶ의 화합물을 제조하는 단계;
    를 포함하는 일반식 Ⅶ의 화합물을 제조하는 방법:
    여기에서, R10은 할로겐화물 또는 알킬 그룹이고; 및
    Q는 활성화된 브롬화물, 황산염 또는 일차 요오드이다.
  51. 제 50항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 생성되는 포타슘 글리시데이트가 글리시딘산으로 전환된 후 단계(b)의 위치선택적 에폭시드 고리열림 반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 일반식 Ⅶ의 화합물을 제조하는 방법.
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