CN1335888A - Opg融合蛋白组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及OPG融合蛋白组合物、这种组合物的制备方法及其应用。更具体地讲,本发明涉及包含OPG多肽和免疫球蛋白Fc区的融合蛋白。

Description

OPG融合蛋白组合物和方法
发明领域
本发明涉及OPG融合蛋白组合物及其制备方法和应用。
发明背景
重组蛋白有效用于治疗用途使得增强蛋白质修饰以增强或改善这种蛋白质作为药物的特性。这样的修饰可以通过还原或消除蛋白酶解达到增强蛋白质的保护并减少其降解。其它的优点还包括：在某些情况下，增加所述治疗蛋白的稳定性、循环时间和生物活性。描述蛋白质修饰的综述文章有Francis，Focus on Growth Factors 3：4-10(1992年5月)(由Mediscript，London，UK出版)。
一种这样的修饰是应用免疫球蛋白分子的Fc区。抗体包含两个功能独立的部分，即称为“Fab”的可变结构域和称为“Fc”的恒定结构域，可变结构域结合抗原而恒定结构域连接效应子功能物例如补体或吞噬细胞。免疫球蛋白的Fc片段具有长的血浆半寿期，而Fab却存在时间短。(Capon等，Nature 337，525-531(1989))。
采用Fc区已经制备出治疗性蛋白制品，以使半寿期延长或掺入以下功能：例如免疫球蛋白的Fc蛋白具有的Fc受体结合、A蛋白结合、补体结合和胎盘转移功能。同上。例如，已经将IgG1抗体的Fc区融合到CD30配体(CD30-L)的N-末端，CD30配体是结合在以下细胞上表达的CD30受体的分子：何杰金氏病肿瘤细胞、退行性发育淋巴瘤(anaplastic lymphoma)细胞、T细胞白血病细胞和其它恶性肿瘤细胞类型。参见，美国专利第5,480,981号。已经将IL-10(一种消炎药和抗排斥剂)融合到鼠Fcγ2a中以增加循环半寿期短的细胞因子的半衰期。(Zheng等，TheJournal of Immunology，154，5590-5600(1995))。也已经评价了应用和人IgG1的Fc蛋白连接的肿瘤坏死因子受体治疗败血症性休克患者的研究。(Fisher等，N.Engl.J.Med.，334：1697-1702(1996)；Van Zee等，The Journal of Immunology，156，2221-2230(1996))。也已经将Fc和CD4受体融合以生产治疗性蛋白用于治疗AIDS。参见，Capon等，Nature 337，525-531(1989)。另外，也已经将白细胞介素-2(IL-2)的N末端融合到IgG1或IgG3的Fc片段以克服IL-2短的半寿期及其系统毒性。参见，Harvill等，Immunotechnology，1，95-105(1995)。
PCT公开第WO97/23614号描述了osteoprotegerin(OPG)并发现它在体外和体内负调节破骨细胞的形成。在表达OPG多肽的转基因小鼠中，OPG显著地增加骨密度，而如果给予卵巢切除的大鼠则OPG减少骨丢失的程度。分析OPG在体外破骨细胞形成中的活性揭示，OPG阻断来自单核细胞/巨噬细胞前体的破骨细胞的分化。看来OPG在调节破骨细胞形成的程度方面具有特异性。OPG是阻断骨吸收的有效因子，可以用于预防和治疗骨质量的丢失。用包含OPG和Fc结构域的融合蛋白也观察到抑制破骨细胞形成和阻止骨丢失的体外和体内活性。
以各种不同的方法可将OPG多肽与异源蛋白或肽诸如Fc结构域融合，以使产生的OPG融合蛋白可具有作为治疗药物的可变生物特性和潜在的可变功效。例如，可将Fc结构域与OPG多肽的氨基端或羧基端融合，可直接融合或通过连接分子融合，和/或根据其天然形式可修饰的Fc或OPG部分之一或二者。这些不同的OPG融合蛋白构成物可以在表达水平、易于分离和/或纯化、生物活性等方面的各不相同。
因此，需要研制OPG融合蛋白组合物作为有效治疗药物。这样的组合物会表现出与生产、分离、纯化、生物活性、稳定性和循环时间有关的有利特性。本发明提供这样的组合物。
发明概述
本发明提供OPG融合蛋白组合物、这种组合物的制备方法及其应用。更具体地讲，本发明涉及包含OPG蛋白、或其变体、片段或衍生物以及Fc蛋白、或其变体、片段或衍生物的OPG融合蛋白。意想不到的是，已经观察到Fc区与截短的OPG多肽的融合证实在未融合截短的OPG多肽或全长OPG多肽中没有观察到的优势。这种意外的优势归因于本发明多肽的较低剂量和/或较低频率的给药。因此，如以下更详细的描述，本发明具有与通过Fc区与OPG蛋白(或其变体、片段或衍生物)融合后的多肽修饰，以及其特异性的修饰、制备和应用方法有关的许多方面。
一方面，本发明提供具有选自R1-R2、R2-R1、R1-L-R2和R2-L-R1形式的蛋白，其中R1为Fc蛋白、或其变体或片段，R2为OPG蛋白、或其变体或片段，而L为接头。本发明还提供本文所述的R1和R2部分的接头。
另一方面，本发明提供OPG融合蛋白，其中将Fc(或其变体、片段或衍生物)通过遗传工程融合到OPG蛋白(或其变体、片段或衍生物)的羧基端。在本发明的另一方面，也可以将Fc部分通过本领域已知的肽接头或化学接头连接到OPG蛋白(或其变体、片段或衍生物)的羧基端。本发明的其它方面不仅包括OPG融合蛋白组合物，而且包括编码这种蛋白的核酸序列、相关载体和含有这种载体的宿主细胞，两者均可用于生产本发明的融合蛋白。
另一方面，本发明提供制备OPG融合蛋白的方法。采用本领域技术人员可用的重组DNA方法。也提供用于合成和连接OPG融合多肽的化学方法。此外，这些方面包括蛋白生产以及纯化的方法。
另一方面，本发明提供用于治疗骨病、特别是骨质量的丢失的方法。这样的骨病包括骨质疏松症、肿瘤转移引起的溶解性骨病(lyticbone diseases)、血钙过多(hypercalcemia)、佩吉特病(Paget’s desease)、类风湿性关节炎引起的骨丢失等。
另一方面，本发明还提供用于以上疗法的OPG融合蛋白、其变体、片段及衍生物的相关药用组合物。
附图的描述
图1(SEQ ID NO：1)显示人IgGγ1的铰合区、CH2区和CH3区的氨基酸序列。
图2(SEQ ID NO：2)显示人OPG[1-401]的氨基酸序列。
图3(SEQ ID NO：3)显示OPG[22-194]-Fc的氨基酸序列。
图4(SEQ ID NO：4)显示OPG[22-201]-Fc的氨基酸序列。
图5(SEQ ID NO：5)显示OPG[22-194]-FcΔC的氨基酸序列。
图6(SEQ ID NO：6)显示OPG[22-201]-FcΔC的氨基酸序列。
图7(SEQ ID NO：7)显示OPG[22-194]-FcG10的氨基酸序列。
图8(SEQ ID NO：8)显示[met]FcΔC-OPG[22-194]的氨基酸序列。
发明详述
本发明涉及OPG融合蛋白组合物、这种组合物的制备方法及其应用。更具体地讲，本发明涉及免疫球蛋白Fc区与OPG多肽的融合物。意想不到的是，已经观察到Fc区与截短的OPG多肽的融合物具有用未融合截短的OPG多肽或用全长成熟OPG没有观察到的优势。(其中全长成熟OPG具有380个氨基酸，例如图2(SEQ ID NO：2)所示的包括残基22-401)。还观察到，与Fc区在OPG多肽的氨基端的融合相比，Fc区在OPG多肽的羧基端的融合具有意想不到的优势。因此，以下更详细地描述OPG融合蛋白、及其变体、片段和衍生物，以及相关应用和制备的方法。
术语“OPG”或“OPG多肽”是指包含图2(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序列的多肽以及本文所述的相关多肽。相关多肽包括等位基因变体；剪接变体；片段；衍生物；取代型、缺失型和插入型变体；融合多肽；和非人类同系物。OPG多肽可以是本文定义的成熟多肽，以及根据制备方法可能具有或可能不具有氨基端甲硫氨酸残基。
术语“OPG融合蛋白”是指被连接到异源肽或多肽的OPG蛋白或OPG多肽。采用本领域已知的任何合适的方法，诸如经OPG与异源肽或多肽部分的基因融合或化学融合，可以制备本发明的OPG融合蛋白。在本发明的一个实施方案中，所述异源肽或多肽是免疫球蛋白的Fc区、最好是人免疫球蛋白的Fc区。可以将异源肽或蛋白或者连接到OPG多肽的氨基端或者连接到OPG多肽的羧基端。
术语“成熟OPG多肽”或“成熟OPG融合多肽”是指缺乏前导序列的多肽或融合多肽，并还可以包括其它修饰诸如蛋白酶解加工的氨基端(具有或不具有前导序列)和/或羧基端、由较大前体剪接的较小多肽、N-联糖基化和/或O-联糖基化等。
术语“Fc”是指包含抗体的非抗原结合部分的序列的分子或序列，或者为单体形式或者为多聚体形式。Fc的原始免疫球蛋白来源最好是人源的Fc，并可以是来自任何同种型例如IgG、IgA、IgM、IgE或IgD。分离的Fc分子的一种制备方法包括用木瓜蛋白酶消化抗体以分离所述抗体的抗原和非抗原结合部分。分离的Fc分子的另一种制备方法是，重组DNA表达后，再经纯化这样表达的Fc分子来制备。全长Fc包含以下Ig重链区：CH1、CH2和CH3，其中CH1区和CH2区通常由柔性铰合区连接。在一个实施方案中，Fc具有IgG1的氨基酸序列，诸如图1所示氨基酸序列。术语“Fc蛋白”、“Fc序列”、“Fc分子”、“Fc区”和“Fc部分”和“Fc”具有相同的含义。
术语“片段”如果与Fc或OPG多肽或其融合多肽一起使用时，是指包含少于Fc或OPG多肽的全长氨基酸序列的肽或多肽。例如在所述氨基酸序列的氨基端截短、在羧基端截短和/或内部残基缺失可产生这样的片段。可变RNA剪接或体内蛋白酶活性也可产生OPG或Fc片段。
术语“变体”如果与Fc或OPG多肽或与其融合多肽一起使用时，是指与天然Fc或OPG多肽氨基酸序列相比，包含具有一个或多个氨基酸序列取代、缺失和/或添加的氨基酸序列的多肽。变体可以是天然存在的变体或人工构建的变体。本发明的变体可以从编码所述变体的相应核酸分子制备，所述核酸分子是具有不同于天然Fc或OPG多肽的相应DNA序列的DNA序列。
术语“衍生物”如果与Fc或OPG多肽或与其融合多肽一起使用时，是指其化学修饰的Fc或OPG多肽变体或片段，例如所述修饰为共价连接一个或多个多聚体，包括但不限于水溶性聚合物、N-联或O-联碳水化合物、糖、磷酸盐和/或其它这样的分子。以所述分子与所述多肽连接的类型或者位置不同于天然Fc或OPG的方法修饰所述衍生物。衍生物还包括缺失天然连接Fc或OPG多肽的一个或多个化学基团。
术语“融合”是指经基因或化学方法连接不同的肽或蛋白区段，其中所述肽或蛋白区段的连接末端可以是相互直接连接或可以是由接头或间隔部分(诸如氨基酸残基或其它连接基团)分隔开。多肽
本发明提供OPG融合多肽及其组合物，更详细地讲，提供包含OPG和Fc部分的融合多肽。在OPG的氨基端可以制备Fc区与OPG多肽的融合物，也就是将Fc区的羧基端融合到OPG的氨基端。这些融合蛋白(和其编码核酸)本文命名为FcOPG。此外，可能最好将OPG的羧基端融合到Fc区的氨基端。其融合蛋白(和编码它们的核酸)本文命名为OPGFc。
Fc、或其变体、片段或衍生物可以来自一种Ig类。在一个实施方案中，Fc来自IgG类，诸如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在另一个实施方案中，Fc来自IgG1。Fc也可以包含通过所述Ig类中的任何两个或多个的组合的氨基酸残基，诸如IgG1和IgG2的残基；或IgG1、IgG2和IgG3的残基等。在一个实施方案中，OPG融合蛋白的Fc区具有包含人IgG1的铰合部、CH2和CH3区的图1(SEQ ID NO：1)所示序列。(参见Ellison等，Nucleic Acids Res.10，4071-4079(1982))。
除了Fc区的天然变异外，Fc变体、片段和衍生物还可以含有通过以下方法构建的Fc非天然变异，例如在天然或天然存在的Fc中引入残基或序列的取代、添加、插入或缺失，或通过化学修饰法修饰所述Fc部分等。一般而言，制备Fc变体、片段和衍生物以便主要使OPG的Fc融合物的循环半寿期增加。
本发明还提供具有保守氨基酸取代的Fc变体。术语“保守氨基酸取代”是指用非天然残基取代天然氨基酸残基以便几乎没有或没有影响该位置氨基酸残基的极性或电荷。例如，由用任何其它非极性残基取代多肽中的非极性残基产生保守取代。用于保守氨基酸取代的通用规则见表I。
                   表I
               保守氨基酸取代原始残基  典型取代                             优选取代Ala       Val，Leu，Ile                        ValArg       Lys，Gln，Asn                        LysAsn       Gln，His，Lys，Arg                   GlnAsp       Glu                                  GluCys       Ser                                  SerGln       Asn                                  AsnGlu       Asp                                  AspGly       Pro，Ala                             AlaHis       Asn，Gln，Lys，Arg                   ArgIle       Leu，Val，Met，Ala，Phe，正亮氨酸    LeuLeu       正亮氨酸，Ile，Val，Met，Ala，Phe    IleLys       Arg，Gln，Asn                        ArgMet       Leu，Phe，Ile                        LeuPhe       Leu，Val，Ile，Ala，Tyr              LeuPro       Ala                                  AlaSer       Thr                                  ThrThr       Ser                                  SerTrp       Tyr，Phe                             TyrTyr       Trp，Phe，Thr，Ser                   PheVal       Ile，Met，Leu，Phe，Ala，正亮氨酸    Leu
保守氨基酸取代还包括非天然存在的氨基酸残基，即通常通过化学肽合成而不是通过生物系统合成掺入。这些包括肽模拟物(Peptidomimetics)及其它相反或反向形式的氨基酸部分。预期对所述氨基酸序列的保守修饰(和对所述编码核苷酸的相应修饰)产生具有功能和化学特征类似于未修饰Fc和FcOPG蛋白的Fc分子(和FcOPG融合蛋白)。
除了表I所述的取代之外，Fc区(或FcOPG融合蛋白)的任何天然残基也可以用丙氨酸取代，与以前关于“丙氨酸扫描诱变”(Cunningham等，Science 244，1081-1085(1989))的一样。
在方面相当大的修饰可以通过选择明显不同于其对保持以下特征的作用显著不同的取代来达到明显改进Fc分子(和FcOPG融合蛋白)的功能和/或化学特征：(a)在所述取代区中的分子主链的结构，例如，像折叠或螺旋构象；(b)在所述靶位点处分子的电荷或疏水性；或(c)大部分的侧链。根据共同的侧链特性可以对天然残基进行分类：
1)疏水性氨基酸：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
2)中性亲水性氨基酸：Cys、Ser、Thr；
3)酸性氨基酸：Asp、Glu；
4)碱性氨基酸：Asn、Gln、His、Lys、Arg；
5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和
6)芳族氨基酸：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代基可以包括这些类之一的一个成员变换为另一类中的一个成员。可以将这样的取代残基引入与非人Fc或OPG同源的Fc或OPG分子的各区中或引入所述分子的非同源区中。
可以缺失或用其它氨基酸取代Fc分子中的半胱氨酸残基以防止形成二硫化交联。特别是，可以用一种或多种氨基酸诸如丙氨酸或丝氨酸取代图1(SEQ.ID.NO.1)的位置5上的半胱氨酸残基。或者，可以缺失位置5上的半胱氨酸残基。
可以通过如图1(SEQ.ID.NO.1)所示的位置1、2、3、4和5的任何位置上的一个或多个氨基酸的缺失来制备Fc片段。在一个实施方案中，缺失包括位置1-5上的氨基酸残基。也可以进行这些位置上的取代，并且它们在本发明的范围内。
也可以制备Fc变体，所述Fc变体与Fc受体的结合性降低，而所述结合触发效应子功能诸如依赖抗体的细胞毒性(ADCC)和补体活化。这样的变体可以包括缺失或用谷氨酰胺残基取代位置20的亮氨酸，缺失或用丙氨酸残基取代位置103的谷氨酸，以及缺失或用丙氨酸残基取代位置105和107的赖氨酸(按照图1所示的编号)。设计一个或多个这样的取代。
在一个实施方案中，与天然Fc比较，Fc变体更强地结合FcRn受体(“补救受体”)和循环半寿期更长。这种变体的实例包括图1(SEQ.ID.NO.1)所示残基33、35-42、59、72、75、77、95-98、101、172-174、215和220-223的一个或多个中的氨基酸取代，其中所述取代使Fc变体更紧密结合到所述FcRn受体。
其它Fc变体包括用例如苯丙氨酸残基取代一个或多个酪氨酸残基。另外，也设想其它变体的氨基酸插入、缺失和/或取代，并且它们在本发明的范围内。实例包括公开于WO96/32478和WO97/34630(其通过引用结合到本文中)的Fc变体。此外，改变可以是改变氨基酸的形式，例如肽模拟物(peptidomimetics)或D-氨基酸。
也可以通过或者化学或者改变长度的氨基酸的“接头”部分，将Fc蛋白连接到OPG蛋白上。这样的化学接头是本领域众所周知。氨基酸接头序列可以包括但不限于：
(a)  ala-ala-ala；
(b)  ala-ala-ala-ala；
(c)  ala-ala-ala-ala-ala；
(d)  gly-gly；
(e)  gly-gly-gly；
(f)  gly-gly-gly-gly-gly；
(g)  gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly；
(h)  gly-pro-gly；
(i)  gly-gly-pro-gly-gly；
(j)  val；
(k)  ser-gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly；
(l)  gly-gly-ser-gly-ser-gly-ala-gly-ser-gly-ser-gly-gly-gly-ser-
     gly-ser-gly-gly；
(m)  化学部分；和
(n)  组成部分(subparts)(a)-(m)的任何组合
本发明还提供OPG变体、片段和衍生物，一般与本文上面关于Fc分子的所述相同，不同的是修饰氨基酸残基的具体部位。OPG变体、片段和衍生物描述于PCT WO97/23614，其通过引用结合到本文中。
在一个优选实施方案中，OPG融合蛋白的OPG部分是羧基端截短形式的OPG。羧基端截短形式的OPG缺失图2位置186-401中的一个或多个氨基酸。例如，OPG截短物包含所述氨基酸序列22-X，其中X为包括185-400的任何残基。在另一个实施方案中，OPG截短物包含所述氨基酸序列22-X，其中X为包括185-278、或包括185-293、或者包括194-278、或包括194-293的任何残基。包含本文所述的OPG截短的多肽的融合蛋白包括直接地或通过间隔或接头分子连接所述OPG和异源肽或多肽部分，其中所述间隔物或接头任选地包含一个或多个氨基酸残基。本发明也包括本文所述的OPG截短形式的变体和衍生物。
本发明优选的融合蛋白包括其中融合到Fc区的OPG部分包含所述氨基酸序列22-X的那些融合蛋白，其中采用图2(SEQ ID NO：2)所示编号，X为包括位置194-201的任何残基。这样的融合蛋白实例包括下列多肽：
OPG[22-194]-Fc       (图3和SEQ ID NO：3)
OPG[22-201]-Fc       (图4和SEQ ID NO：4)
OPG[22-194]-FcΔC    (图5和SEQ ID NO：5)
OPG[22-201]-FcΔC    (图6和SEQ ID NO：6)
OPG[22-194]-FcG10   (图7和SEQ ID NO：7)
metFcΔC-OPG[22-194] (图8和SEQ ID NO：8)
关于以上列举的优选多肽，术语“Fc”是指图1(SEQ ID NO：1)所示的人IgG1序列，术语“FcΔC”是指图1(SEQ ID NO：1)所示的缺乏包括氨基酸残基1-5的序列，而术语“FcG10”是指缺乏包括氨基酸残基1-9而具有一个ser-(gly)8接头的Fc部分。核酸分子
本发明提供编码OPG融合蛋白、或其变体、片段或衍生物的核酸分子。采用定点诱变、PCR扩增或其它合适的方法，可以产生本发明的核酸分子，其中所述引物具有所需的突变。关于诱变技术的描述，参见Sambrook等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSprings Harbor Laboratory Press，Cold Springs Harbor，N.Y.(1989))和Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology，Wiley and Sons，N.Y.(1994))。采用Engels等(Angew.Chem.Intl.Ed.28，716-734(1989))描述的方法的化学合成法也可以用来制备这样的变体。也可以采用本领域技术人员已知的其它方法。
在某些实施方案中，核酸变体含有用于在给定的宿主细胞中最适表达OPG融合多肽而改变的密码子。具体的密码子改变取决于OPG融合多肽和选定用于表达的宿主细胞。可以通过各种方法实现这种“密码子最优化”，例如，通过选择在给定的宿主细胞中高度表达基因的最佳密码子。可使用结合用于最适高度表达细菌基因的密码子的密码子频率表(例如“Ecohigh.Cod”)的计算机算法，该算法由Wisconsin大学Package Version 9.0，Genetics Computer Group，Madison，WI提供。其它有用的密码子频率表包括“Celegans_high.cod”、“Celegans_loW.cod”、“Drosophila_high.cod”、“Human_high.cod”、“Maize_high.cod”和“Yeast_high.cod”。在一个实施方案中，可以对所述融合多肽的OPG部分或者Fc部分进行密码子优化。
在另一个实施方案中，核酸分子编码具有本文上述定义保守氨基酸取代的OPG融合蛋白变体。例如，在融合蛋白的OPG部分中和/或Fc部分中产生保守氨基酸取代。本发明也提供包含添加和/或缺失一个或多个N-联或O-联糖基化位点、或包含上述的Fc或OPG多肽片段的Fc或OPG变体。不用说，本发明的核酸分子可以编码Fc和/或OPG变体、片段的任何组合和本文所述的融合多肽。载体和宿主细胞
采用标准连接技术，将编码OPG融合蛋白的核酸分子插入到合适表达载体中。通常所选的载体是在所用的特定宿主细胞中有功能的(即所述载体适合于所述宿主细胞器以便可扩增和/或表达所述基因的)。编码Fc-OPG蛋白的核酸分子可以在原核、酵母、昆虫(杆状病毒系统)和/或真核宿主细胞中扩增/表达。宿主细胞的选择将部分取决于OPG融合蛋白是否翻译后修饰(例如糖基化和/或磷酸化)。如果这样的话，优选酵母、昆虫或哺乳动物宿主细胞。
通常，在任何宿主细胞中所用的表达载体将含有用于质粒保持及克隆和表达外源核苷酸序列的序列。在某些实施方案中统称为“侧翼序列”的这种序列通常包括一个或多个以下核苷酸序列：一个启动子、一个或多个增强子序列、一个复制起点、一个转录终止序列、一个含有供体和受体剪接位点的完全内含子序列、一个用于分泌的前导序列、一个核糖体结合位点、一个聚腺苷酸化序列、一个用于插入编码需要表达的多肽的核酸的多接头区和一个选择标记元件。
侧翼序列可以是同源的(即来自与所述宿主细胞相同的物种和/或菌株)、异源的(即来自物种不是所述宿主细胞的物种或菌株)、杂种(即一种以上来源的侧翼序列的组合)、合成的或天然序列，所述侧翼序列通常的作用是调节OPG和/或Fc蛋白的表达。因此，侧翼序列的来源可以是任何原核或真核生物、任何脊椎动物或无脊椎动物生物、或任何植物，前提是所述侧翼序列在所述宿主细胞器中有功能并能被所述宿主细胞器活化。
前导序列或信号序列可以用来控制OPG融合多肽泌出宿主细胞。该信号序列最常见直接位于OPG融合多肽编码区的5’端。已经鉴定出许多信号序列，其中在选定宿主细胞中有功能的任一种可与编码OPG融合蛋白的核酸序列一起使用。例如，信号序列可以是与OPG或Fc基因或cDNA同源(天然存在)或异源。另外，可以采用以上所述方法化学合成信号序列。在大多数情况下，所述宿主细胞通过存在的信号肽分泌OPG融合多肽、更具体为OPG和Fc部分的融合物将导致将所述信号肽多从所述融合多肽中去除。
信号序列可以是载体的一个组分，或它可以是插入到所述载体中的编码OPG融合多肽的核酸序列的一部分。例如，天然OPG DNA编码所述蛋白氨基端的一个信号序列，所述信号序列在翻译后加工所述分子期间被剪切形成成熟蛋白。本发明范围包括具有天然信号序列的OPG核苷酸以及其中缺失或用异源信号序列取代所述天然信号序列的OPG核苷酸。选定的异源信号序列应是被所述宿主细胞识别和加工(即被号肽酶剪切)的序列。本发明部分提供为描述于WO97/23614的OPG信号序列的信号序列。关于不识别和加工天然OPG信号序列的原核宿主细胞，用选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶或热稳定肠毒素II前导序列的原核信号序列取代所述信号序列。关于酵母分泌，可用酵母转化酶、α-因子或酸性磷酸酶前导序列取代天然OPG信号序列。在哺乳动物细胞表达，尽管其它哺乳动物信号序列可能是适合的，但是所述天然信号序列是最好的。
用于实施本发明的优选载体是适合于细菌、昆虫和哺乳动物宿主细胞的那些载体。这样的载体尤其包括pCRII、pCR3和pcDNA3.1(Invitrogen Company，San Diego，CA)、pBSII(Stratagene Company，LaJolla，CA)、pET15b(Novagen，Madison，WI)、pGEX(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)、pEGFP-N2(Clontech，Palo Alto，CA)、pETL(BlueBacII；Invitrogen)、pDSRα2(PCT公开号WO90/14363)和pFastBacDual(Gibco/BRL，Grand Islald，NY)。
其它可能的载体包括但不限于粘粒、质粒或修饰的病毒，但是所述载体系统必须适合于所选定的宿主细胞。这样的载体包括但不限于质粒诸如Bluescript质粒衍生物(基于ColEl的高拷贝数噬菌粒，Stratagene Cloning SystemsInc.，La Jolla CA)、设计用于克隆Taq扩增的PCR产物的PCR克隆质粒(例如，TOPOTMTA克隆试剂盒(CloningKit)，PCR2.1质粒衍生物，Invitrogen，Carlsbad，CA)、以及哺乳动物、酵母或病毒载体诸如杆状病毒表达系统(pBacPAK质粒衍生物，Clontech，Palo Alto，CA)。通过转化、转染、感染、电穿孔或其它已知技术，可以将重组分子引入宿主细胞。在构建所述载体并将编码OPG多肽的核酸分子插入到所述载体合适的位点后，可以将所述完全载体插入到合适宿主细胞用于扩增和/或多肽表达。
宿主细胞可以是原核宿主细胞(例如大肠杆菌)或真核宿主细胞(例如酵母细胞、昆虫细胞或脊椎动物细胞)。当在合适条件下培养时，所述宿主细胞合成OPG多肽，然后可从所述培养基中收集(如果所述宿主细胞将其分泌到培养基中时)或直接从产生它的宿主细胞中收集(如果不分泌时)所述OPG多肽。合适宿主细胞的选择将取决于各种因素，例如所需的表达水平、活性需要或必需的多肽修饰诸如糖基化或磷酸化、以及易于折叠成生物活性分子。
合适的宿主细胞或细胞系可以是哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(ATCC#CCL61和Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77，4216-4220(1980))、人胚肾(HEK)293或293T细胞(ATCC#CRL1573)或3T3细胞(ATCC#CRL1658)。合适的哺乳动物宿主细胞的选择及用于转化、培养、扩增、筛选和产物生产及纯化的方法是本领域已知的。其它合适的哺乳动物细胞系是猴COS-1和COS-7细胞系(ATCC#CRL1651)、和CV-1细胞系(ATCC#CCL70)。典型的哺乳动物宿主细胞还包括灵长类细胞系和啮齿类动物细胞系，包括转化的细胞系。正常二倍体细胞、得自原代组织体外培养的细胞株以及原代外植块也适用。候选细胞可以是所述选择基因遗传缺陷型的或可以含有一个显性作用选择基因。其它合适的哺乳动物细胞系包括但不限于小鼠成神经细胞瘤N2A细胞、HeLa、小鼠L-929细胞、得自Swiss的3T3系、Balb-c或NIH小鼠、BHK或HaK仓鼠细胞系。这些细胞系中每一种都是本领域技术人员已知并可使用的。
同样适合本发明的有用宿主细胞是细菌细胞。例如，大肠杆菌的各种菌株(例如，HB101、DH5α、DH10和MC1061)是生物技术领域熟知的宿主细胞。枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)、假单胞菌(Pseudomonasspp.)、其它芽孢杆菌(Bacillu spp.)、链霉菌(Streptomyces spp.)等也可以用于本方法。
本领域技术人员已知的酵母细胞的许多菌株也可用作表达本发明多肽的宿主细胞。优选的酵母细胞包括例如酿酒酵母(Saccharomyces cerivisae)。
此外，如果需要，昆虫细胞系统可以用于本发明的方法中。这样的系统例如描述于Kitts等(Biotechniques，14，810-817(1993))、Lucklow(Curr.Opin.Biotechnol.，4，564-572(1993))和Lucklow等(J.Virol.，67，4566-4579(1993))。优选的昆虫细胞是Sf-9和Hi5(Invitrogen，Carlsbad，CA)。
根据众所周知的方法，包括诸如氯化钙、电穿孔、微注射、脂转染或DEAE-葡聚糖方法的方法，可以实现将用于OPG融合多肽的表达载体转化或转染到选定的宿主细胞中。所选定的方法部分随将使用的宿主细胞类型而变。这些方法和其它合适的方法是本领域技术人员熟知的，并陈述于例如Sambrook等，参见上文。多肽生产
可以采用本领域技术人员熟知的标准培养基，培养包含经转化或转染OPG表达载体的宿主细胞。所述培养基通常含有所述细胞生长和存活的所有必需营养素。用于培养大肠杆菌的合适培养基是例如Luria液体培养基(LB)和/或Terrific液体培养基(TB)。用于培养真核细胞的合适培养基是RPMI 1640、MEM、DMEM，根据培养的特定细胞系的需要，所有这些培养基都可补充血清和/或生长因子。用于昆虫培养的合适培养基是补充必需yeastolate、乳白蛋白水解物和/或胎牛血清的Grace培养基(Gibco Life Technologies，Gaithersburg，MD)。
作为所述培养基的补充物，通常加入可用来选择性转染或转化细胞生长的抗生素或其它化合物。所使用的化合物取决于存在于用其转化宿主细胞的质粒中的选择标记元件。例如，当选择标记元件是卡那霉素抗性时，则加入到培养基中的化合物是卡那霉素；当选择标记元件是氨苄青霉素抗性时，则加入到培养基中的化合物是氨苄青霉素。
采用本领域已知的标准方法，可以评价宿主细胞所产生的OPG融合多肽的量。这样的方法包括但不限于蛋白质印迹分析、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、非变性凝胶电泳、HPLC分离、免疫沉淀法和/或活性分析诸如DNA结合凝胶移位试验。
当制备OPG融合多肽而无连接标记(a tag attached)及得不到抗体时，可以采用其它众所周知的纯化方法。这样的方法包括但不限于离子交换层析、分子筛层析、HPLC、联合凝胶洗脱的非变性凝胶电泳和制备型等电聚焦(“Isoprime”machine/technique，HoeferScientific)。在某些情况下，可以联合这些技术中的二种或多种以达到提高纯度。
如果OPG融合多肽产生在细胞内，则可以采用本领域技术人员已知的任何标准技术，从所述宿主细胞提取所述细胞内物质(对于革兰氏阴性细菌而言包括内含体)。例如，可以通过弗氏压碎器(Frenchpress)、匀浆和/或超声处理，然后通过离心，使所述宿主细胞裂解以释放周质/胞质内容物。
如果OPG融合多肽在所述细胞溶胶中形成内含体，则所述内含体通常可结合到内和/或外细胞膜，因此主要存在于离心后的沉淀物。然后将所述沉淀物于极端pH或用以下条件处理释放、裂解和溶解所述内含体：在还原剂诸如碱性pH的二硫苏糖醇或酸性pH的三羧乙基膦(tris carboxyethyl phosphine)存在下的离液剂诸如洗涤剂、胍、胍衍生物、尿素或尿素衍生物。然后可以采用凝胶电泳或免疫沉淀法等，分析在其现在可溶形式OPG多肽。如果需要分离OPG融合多肽，则可以采用诸如下文所述和Marston等(Meth.Enz.，182，264-275(1990))所述的标准方法实施分离。
在某些情况下，OPG融合多肽分离后没有生物活性。用于“重折叠”或使所述多肽形成其四级结构并产生二硫键的各种方法，可以用来恢复生物活性。这样的方法包括将所述溶解的多肽暴露于pH通常7以上并在特定浓度的离液剂存在下。离液剂的选择非常类似于内含体溶解所用的选择方法，但通常使用较低浓度的离液剂，并且所用离液剂不一定与用来溶解的离液剂一样。在大多数情况下，所述重折叠/氧化溶液也含还原剂或还原剂加特定比率的其氧化形式，以产生特定氧化还原电位，使二硫化物改变(shufflind)形成所述蛋白的半胱氨酸桥。某些常用氧化还原偶包括半胱氨酸/胱胺、谷胱甘肽(GSH)/二硫代双(dithiobis)GSH、氯化铜、二硫苏糖醇(DTT)/二噻烷DTT和2-巯基乙醇(bME)/二硫代-b(ME)。在许多情况下，助溶剂可以用来或可能需要来增强重折叠的效力，用于该目的的较常见试剂包括甘油、各种分子量的聚乙二醇、精氨酸等。衍生物
通过连接一个或多个化学部分衍生本发明OPG融合蛋白及其变体和片段。例如，可用OPG部分或者Fc部分或者两者制备OPG和Fc多肽的融合物。还可以将这些化学修饰的衍生物配制用于下文讨论的动脉内、腹膜内、肌内、皮下、静脉内、口、鼻、肺、局部或其它给药途径。已经发现生物活性蛋白的化学修饰在某些情况下还提供更多的优点，诸如增加所述治疗蛋白的稳定性和循环时间以及减少免疫原性。参见，美国专利第4,179,337号。关于综述，参见，Abuchowski等，载于Enzymes as Drugs。(J.S.Holcerberg和J.Roberts编著，第367-383页，(1981))；Francis等，参见上文。
适合于这种衍生化作用的化学部分可以选自各种水溶性聚合物。根据诸如所述聚合物/蛋白质缀合物是否作治疗用途的这种考虑，如果是这样的话，则考虑所需剂量、循环时间、对蛋白酶解的抗性及其它考虑，本领域技术人员能够选择所需聚合物。关于本发明蛋白，可通过以下方法确定所述衍生化作用的有效性：以所需形式(即例如通过渗透泵或更优选通过注射或输注或进一步配制用于例如口、肺或鼻传递)给予所述衍生物，观察本文所述的生物效应。
水溶性聚合物可以选自例如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酐共聚物、聚氨基酸(或者均聚物或者无规共聚物)、和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚丙烯氧化物/乙烯氧化物共聚物、聚氧乙基化多元醇和聚乙烯醇。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性，所以在制备方面可能有许多优点。此外，也可使用琥珀酸和苯乙烯。另外，聚氨基酸可以选自血清白蛋白(例如人血清白蛋白)或其它聚氨基酸例如赖氨酸。
聚合物可以是任何分子量的聚合物并可以是直链或支链聚合物。关于聚乙二醇，为了便于加工和生产，优选分子量为约2kDa-约100kDa(术语“约”是指在聚乙二醇制品中有些分子的分子量比所述分子量高，而有些则较小)。
连接到OPG融合多肽的聚合物分子的数目可以变化，本领域技术人员能够确定其对功能的影响。人们可用相同或不同化学部分(例如诸如不同分子量的聚乙二醇的聚合物)进行单衍化，或可以提供二、三、四衍化作用或某种组合。聚合物分子与蛋白(或肽)分子的比例随其在反应混合物中的浓度而变化。一般而言，根据诸如所需衍化程度(一、二、三等)、所选定的聚合物的分子量、所述聚合物是直链还是支链以及反应条件等因素，确定最适比率(以没有过量的未反应蛋白或聚合物的反应效率表示)。
考虑到对所述蛋白的功能域或抗原结构域的影响，所述化学部分应连接到OPG融合蛋白。有许多本领域技术人员可用的连接方法。(EP 0401384，其通过引用结合到本文中，(PEG偶联到G-CSF)；Malik等，Exp.Hematol.20，1028-1035(1992)(报道采用tresyl chloride使GM-CSF pegylation))。例如，通过具有游离氨基(例如赖氨酸、精氨酸或N端残基)或游离羧基(例如谷氨酸、天冬氨酸或C端残基)的氨基酸残基，可以使聚乙二醇共价结合。也可以使用具有游离巯基的氨基酸残基(例如半胱氨基)。用于治疗目的优选连接为氨基连接例如在N端或赖氨基残基连接。如果需要结合受体，则应避免在受体结合的重要残基上的连接。
人们可能特别需要N端化学修饰的OPG融合蛋白。采用聚乙二醇作为所述化学部分的实例，通过在游离氨基衍化所述多肽，从PEG化(pegylated)蛋白分子群体中分离N端PEG化物质，可以获得基本上N端PEG化的OPG融合多肽制品。或者，通过利用可用于衍化特定蛋白不同类型伯氨基(赖氨酸与N端)的不同活性的还原性烷基化，可以实现选择性N端化学修饰。在合适的反应条件下，实现以含羰基的聚合物基本上在N端选择性衍化所述蛋白。可以使用含有单一活性醛的聚乙二醇丙醛。
为了便于治疗药物的生产，优选N端单PEG化衍生物。N端PEG化确保制品均一，因为相对于二、三或其它多PEG化产物而言，所述制品的表征鉴定简单。为了便于工业生产，优选应用还原烷基化制备N端制品。所述多肽的用途
本发明的融合多肽用于预防和/或治疗骨量丢失(loss of bonemass)。包括以下的各种病症表现为骨丢失(bone loss)：
骨质疏松症，诸如原发性骨质疏松症、内分泌性骨质疏松症(甲状腺功能亢进、甲状旁腺功能亢进、库欣综合征(Cushing’s syndrome)和肢端肥大症)、遗传和先天性骨质疏松症(成骨不全、高胱氨酸尿、门克士综合征(Menkes’syndrome)和赖利-戴综合征(Piley-Daysyndrome))和由于肢体固定引起的骨质疏松症；成年和青少年的佩吉特骨病(Paget’s disease of bone)(变形性骨炎)；导致骨丢失的骨髓炎或感染性骨病变；由实体瘤(胸、肺和肾)和血癌(多发性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病)引起的血钙过多、特发性血钙过多和与甲状腺功能亢进、甲状旁腺功能亢进、肉样瘤和肾功能障碍相关的血钙过多；手术后、服用类固醇药物引起的、与小肠和大肠疾病以及慢性肝脏疾病和慢性肾脏疾病相关的骨质减少；与外伤性损伤相关的骨坏死或骨细胞死亡或与戈谢病(Gaucher’s disease)、镰状细胞性贫血、系统性红斑狼疮和其它疾病相关的非创伤性坏死；由于类风湿性关节炎引起的骨丢失；牙周骨丢失；溶骨性转移；溶骨性关节炎和假肢松动。
在本发明的一个实施方案中，由于活性和循环半寿期增加，OPG融合多肽有助于用来治疗骨丢失，特别是由于恶性肿瘤或转移瘤引起的骨的溶骨性破坏产生的骨丢失。本发明的OPG融合多肽可用来治疗与乳腺、前列腺、甲状腺、肾、肺、食管、直肠、膀胱、宫颈、卵巢和肝癌以及胃肠道癌相关的骨丢失。也包括与某些血液性肿瘤诸如多发性骨髓瘤和淋巴瘤诸如霍奇金病(Hodgkin’s Disease)相关的骨丢失。药用组合物
本发明也提供OPG融合蛋白及其变体、片段和衍生物的药用组合物。这样的药用组合物可注射给予、或口、肺、鼻、经皮或其它形式的给药。一般而言，本发明包括的药用组合物包含有效量的本发明OPG融合蛋白以及药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、辅助剂和/或载体。OPG融合蛋白的有效量或治疗有效量是根据以下所述的分析和方法的测定，足以减少骨丢失的量或速率的量。
本发明的药用组合物包括各种缓冲内含物(例如Tris-HCl、乙酸、磷酸)、pH和离子强度的稀释剂；添加剂诸如洗涤剂和增溶剂(例如吐温80、Polysorbate 80)；抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如硫柳汞(Thimersol)、苄醇)和填充剂(例如乳糖、甘露糖醇)；将所述物质掺入到多聚化合物诸如聚乳酸、聚乙醇酸等的颗粒制剂中或掺入到脂质体中。也可以使用Hylauronic acid，它可能具有提高循环持续时间的作用。这样的组合物可以影响本发明蛋白和衍生物的物理状态、稳定性、体内释放率和体内清除率。参见，例如，Remingtoh’s Pharmaceutical Sciences，18th Ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1990)，第1435-1712页，其通过引用结合到本文中。可以以液体形式制备或可以以干粉形式例如冻干形式制备所述组合物。也可以设想可植入的缓释制剂，同样可设计经皮制剂。
设计用于本发明用途的口服固体剂型，Remington’sPharmaceutical Sciences，18th Ed.，1990(Mack Publishing Co.Easton，PA18042)，第89章(其通过引用结合到本文中)全面描述了固体剂型。固体剂型包括片剂、胶囊、丸剂、锭剂、扁囊剂或小丸剂。此外，脂质体或类蛋白质(proteinoid)包胶囊可以用来配制本发明组合物(例如，美国专利第4,925,673号报道的类蛋白质微球体)。可以使用脂质体包胶囊并可用各种聚合物衍生所述脂质体(例如，美国专利第5,013,556号)。Marshall，K.描述了可能的固体剂型，载于由G.S.Banker和C.T.Rhodes编著的Modern Pharmaceutics中的第10章，1979，其通过引用结合到本文中。一般而言，所述制剂包含所述OPG融合蛋白、或其变体、片段或衍生物和用于保护以抗胃酸环境的而在肠中释放所述生物活性物质的惰性成分。
可以任选地化学修饰OPG融合蛋白以有效便口服传递所述衍生物。一般而言，所设计的化学修饰是连接至少一个部分到所述蛋白(或肽)分子本身，其中所述部分允许(a)抑制蛋白酶解；和(b)从胃和肠吸收进血流中。所需的也是增加所述蛋白的总体稳定性并增加机体内的循环时间。这种部分的实例包括聚乙二醇、乙二醇和丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。Abuchowski和Davis，可溶性聚合物-酶加成化合物(SolublePolymer-Enzyme Adducts)。载于“Enzymes as Drugs”，Hocenberg和Roberts编著，Wiley-Interscience，New York，NY，(1981)，第367-383页；Newmark等，J.Appl.Biochem.4：185-189(1982)。可能应用的其它聚合物是聚-1，3-二氧戊环和聚-1，3，6-三氧杂环己烷。如上所述，药物用途优选聚乙二醇部分。
为了保证在口服给药后不在胃中的被降解，至少pH5.0不透水性包衣是必需的。用作口服制剂的肠溶衣的更常用惰性成分的实例有乙酸苯三酸纤维素(CAT)、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素(HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP 55、聚乙酸邻苯二甲酸乙烯酯(PVAP)、Eudragit L30D、Aquateric、乙酸邻苯二甲酸纤维素(CAP)、Eudragit L、Eudragit S和Shellac。这些包衣可用作混合膜(mixedfilms)。
在制剂中包含的OPG融合蛋白可以为粒子大小约1mm的颗粒或小丸的形式的精细多颗粒(fine multiparticulates)。胶囊给药的所述物质的制剂也可以为粉、略微压制的填料(lightly compressed plugs)或甚至为片剂。
本发明的药用组合物包括稀释剂诸如碳水化合物，特别是甘露醇、α-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、修饰的葡聚糖和淀粉。某些无机盐也可以用作填充剂，包括三磷酸钙、碳酸镁和氯化钠。某些商业上可得到的稀释剂有Fast-Flo、Emdex、STA-Rx1500、Emcompress和Avicell。
在固体剂量制剂中可以包括崩解剂。用作崩解剂的物质包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的市售崩解剂Explotab。羟基乙酸淀粉钠、Amberlite、羧甲基纤维素钠、超支链淀粉(ultramylopectin)、藻酸钠、明胶、橙皮、酸性羧甲基纤维素、天然海绵和皂土所有都可以用。另一种形式的崩解剂是不溶性阳离子交换树脂。粉状树胶可以用作崩解剂和粘合剂，并且这些可以包括粉状树胶诸如琼脂、梧桐胶或西黄蓍胶。藻酸及其钠盐也可用作崩解剂。
粘合剂可以用于硬片剂(hard tablets)，包括天然产物物质诸如金合欢胶、西黄蓍胶、淀粉和明胶的。其它粘合剂包括甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)和羧甲基纤维素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)两者都可以用于乙醇溶液中以使所述治疗药物成粒。
可以加入到所述制剂的润滑剂包括但不限于包括其镁和钙盐的硬脂酸、聚四氟乙烯(PTFE)、液体石蜡、植物油和蜡。也可使用可溶性润滑剂诸如十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁、各种分子量的聚乙二醇、Carbowax 4000和6000。
可以加入增进药物配制期间的流动特性并有助于压片重排的助流剂。助流剂可以包括淀粉、滑石粉、热解硅胶和水合铝酸硅。
为了有助于OPG融合蛋白组合物的溶解，可以加入作为润湿剂的表面活性剂。表面活性剂可以包括阴离子洗涤剂诸如十二烷基硫酸钠、琥珀酸二辛酯磺酸钠和二辛基硫酸钠。可使用阳离子洗涤剂，包括苯扎氯铵或苄索氯铵。潜在的可用作表面活性剂的非离子型洗涤剂包括lauromacrogol 400、聚氧化乙烯40硬脂酸、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、甘油单硬脂酸酯、吐温40、60、65和80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。这些表面活性剂可以单独或者作为不同比率的混合物存在于所述蛋白或衍生物的制剂中。
潜在增强多肽吸收的添加剂例如为脂肪酸油酸、亚油酸和亚麻酸。
控释制剂可能最好。可以将OPG融合蛋白掺入到通过扩散或者沥滤机制释放的惰性基质例如树胶。也可以将缓慢变性基质掺入到所述制剂中，例如藻酸盐、多糖。控释该治疗剂的另一种形式是采用基于Oros治疗系统(Alza Corp.)的方法，即将所述药物封入一个半透膜中，所述半透膜由于渗透效应允许水通过单一小孔进入而使药物渗出。某些肠溶衣也具有延迟释放作用。
所述制剂可以使用其它包衣。例如，膜包衣片剂可以包含两种不同类型的材料。第一种类型包括非肠溶性材料诸如甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、甲基羟基乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、providone和聚乙二醇。第二种类型包含通常为邻苯二甲酸的酯的肠溶性材料。可以使用多种材料的混合物以提供最适膜包衣。可以在包衣锅(pan coater)或在流化床中或通过压片包衣进行膜包衣。
本文还设计肺传递本发明蛋白(或其衍生物)。所述蛋白(或衍生物)吸入传递到哺乳动物的肺，并经过肺上皮内衬到血流中。(该方法的其它报道包括Adjei等，Pharmaceutical Research7：565-569(1990)；Adjei等，Intemational Journal of Pharmaceutics 62，135-144(1990)(leuprolide acetate)；Braquet等，Journal of Cardiovascular Pharmacology13，(增刊5)：第143-146页(1989)(内皮缩血管肽-1)；Hubbard等，Annals of Internal Medicine 3：206-212(1989)(α1-抗胰蛋白酶)；Smith等，J.Clin.Invest.84：1145-1146(1989)(α1-蛋白酶)；Oswein等，“Aerosolization of Proteins”，Proceedings of Symposium on RespiratoryDrug Delivery II，Keystone，Colorado，1990年3月(重组人生长激素)；Debs等，The Journal of Immunology140：3482-3488(1988)(干扰素γ和肿瘤坏死因子α)和美国专利第5,284,656号(粒细胞集落刺激因子)。
用于实施本发明为设计用于肺传递治疗性制品的各式各样的机械装置，包括但不限于雾化器、计量剂量吸入器和粉末吸入器，所有这些都是本领域技术人员熟悉的。
某些适合实施本发明的商业上可得到的装置的具体实例为Mallinckrodt，Inc.，St.Louis，Missouri制造的Ultravent雾化器；MarquestMedical Products，Englewood，Colorado制造的AcomII雾化器；GlaxoInc.，Research Triangle Park，North Carolina制造的沙丁胺醇计量剂量吸入器和Fisons Corp.，Bedford，Massachusetts制造的Spinhaler粉末吸入器。
所有这些装置需要应用适合于分散多肽或多肽制品的制剂。通常，每种制剂对所用的装置类型是特异性的，而除了可用于治疗的稀释剂、辅助剂和/或载体以外，还可包括应用合适的抛射剂物质。
最好制备平均粒子大小小于10μm、最优选0.5-5μm的颗粒形式的OPG融合蛋白(或衍生物)，，以最有效地传递到远侧肺。
载体包括碳水化合物，诸如海藻糖、甘露醇、木糖醇、蔗糖、乳糖和山梨糖醇。用于制剂的其它成分可以包括DPPC、DOPE、DSPC和DOPC。可以使用天然或合成的表面活性剂。可以使用聚乙二烯(除外其用于衍化OPG融合蛋白)。可以使用葡聚糖例如环状葡聚糖。可以使用胆汁盐和其它相关增强剂。可以使用纤维素和纤维素衍生物。可以使用氨基酸，例如用于缓冲制剂中。设计应用脂质体、微胶囊或微球体、包藏复合物或其它类型的载体。
也设计了OPG融合蛋白的鼻传递。鼻传递使所述蛋白在将所述治疗性制品给予到鼻后直接进入到血流中，而不需要所述制品沉积到肺中。用于鼻传递的制剂包括采用葡聚糖或环状葡聚糖的那些制剂。也设计通过经其它粘膜转运的传递。剂量
以治疗有效量给予本发明的OPG融合多肽，以预防和/或治疗与转移性骨病有关的骨丢失。OPG融合多肽的“治疗有效量”是减少骨量丢失的速率和/或程度的量。通过各种已知的方法测量骨量，例如单光子吸收测定法(SPA)、双光子吸收测定法(DPA)、双能量X射线吸收测定法(DEXA)、定量计算机X射线断层摄影术(QCT)和超声波检查法(参见Johnston等，载于Primer on the Metabolic Bone Diseaseand Disorders of Mineral Metabolism，第2版，M.J.Favus编著，RavenPress第137-146页)。本领域技术人员可以应用这些方法以确定OPG融合多肽的治疗有效量。也可以通过测量骨转换的生化标记变化，确定治疗有效量，例如血清骨钙蛋白、血清碱性磷酸酶、血清原胶原I伸展肽、尿或血清胶原蛋白的C端或N端端肽、尿钙、羟脯氨酸和尿吡啶啉(pyrridnoline)和脱氧吡啶啉(deoxypyridinoline)。人们一般认为，前述生化标记水平降低表明骨吸收减少而骨丢失也减少。或者，也可以通过测量骨机械强度变化、特别是骨扭转强度增强，确定OPG融合多肽的治疗有效量。
一般而言，OPG融合多肽的治疗有效量为约0.1mg/kg-约10mg/kg，最好是约1mg/kg-约10mg/kg。鉴于OPG融合多肽、特别是OPG与免疫球蛋白Fc区的融合物的半寿期增加，给药的频率将少于未修饰的OPG，诸如成熟全长OPG多肽。给予OPG融合多肽约每月1次，或者每两个月1次，或者每三个月1次。应该指出的是，给药的准确剂量和频率将取决于几个因素，包括制剂、给药途径、所治疗的病症等等，并可以由技术人员容易地确定。
采用所述OPG融合多肽的诊断测定，可以确定已经给予的融合蛋白量。这种诊断测定可以是抗体测定形式，诸如抗体夹层测定(antibody sandwich assay)，其中所述抗体特异性地结合到OPG融合蛋白而不结合到内源性、天然循环的OPG。以本领域技术人员已知的各种方法，可以进行测定OPG融合蛋白水平的基于抗体的测定。
提供以下实施例以更全面地说明本发明，但不解释用其限制本发明的范围。
                   实施例1
       OPG多肽和OPG融合多肽的构建和表达
WO97/23614描述了编码图2(SEQ ID NO：2)所示OPG[1-401]的重组质粒的构建，其通过引用结合到本文中。将该质粒用于哺乳动物宿主细胞以产生具有如图2(SEQ ID NO：2)中所示的包括氨基酸残基22-401的成熟全长OPG多肽。基本上按照WO97/23614所述构建编码OPG[1-201]和OPG[1-201]-Fc多肽的质粒。这些质粒用来产生OPG[22-201]和OPG[22-201]-Fc多肽。
采用寡核苷酸1745-92和1789-04以及OPG cDNA作为模板，通过PCR构建OPG[1-194]。有义引物(1745-92)产生用于克隆的XbaI位点和起始密码子ATG之前的共有Kozak序列。反义引物(1789-04)接入氨基酸残基194之后的一个终止密码子和用于克隆的SalI限制位点。将该PCR产物克隆到pDSRα19中，产生用于哺乳动物表达OPG[22-194]多肽的pDSRα19-人OPG[1-194]。
经采用寡核苷酸1745-92和1745-94以及OPG cDNA作为模板的PCR，构建OPG[1-293]。有义引物(1745-92)产生用于克隆的XbaI位点和起始密码子ATG之前的共有Kozak序列。反义引物(1745-94)接入氨基酸残基293之后的一个终止密码子和用于克隆的SalI限制位点。将该PCR产物克隆到pDSRα19中以产生pDSRα19：人OPG[1-293]，用于哺乳动物表达OPG[22-293]。1745-92(SEQ ID NO：9)    5’-AAG TCTAGA CCACC ATG AACAAG TTG CTG T-3’
          XbaI Kozak OPG编码1745-94(SEQ ID NO：10)   5’-GCTA GTCGA CTA CTC GAA GGTGAG GTT AGC AT-3’
           SalI  *  OPG编码1789-04(SEQ ID NO：11)   5’-ATCT GTCGA CTA TTT TTG AGTTGA TTC AC-3’
           SalI  *  OPG编码0PG[1-194]-FcΔc的构建
采用PCR方法从质粒pDSRα2：OPG[1-201]-Fc中构建质粒pDSRα19：OPG[1-194]-FcΔC，去除于OPG区段3’末端的不成对半胱氨酸以及Fc区段5’末端的不成对半胱氨酸，。然后将该克隆用作PCR的模板以获得OPG结构域。5’OPG引物掺入用于克隆的XbaI位点(TCTAGA)和起始Met密码子之前的一个“CCACC”Kozak序列。3’OPG引物掺入一个用于克隆Fc结构域的SalI位点(GTCGAC)。所述PCR产生编码OPG蛋白的最初194个氨基酸残基的OPG基因的592bp片段。所述PCR产物用XbaI和SalI切下，并克隆到pDSRα19中以产生称为质粒p615的终构成物。有义OPG引物(1745-92)(SEQ ID NO：12)：5’-AAG TCTAGA CCACC ATG AAC AAG TTG CTG T-3’
   XbaI位点 Kozak OPG编码反义OPG引物(1775-27)(SEQ ID NO：13)：5’-CACGC GTCGAC TTT TTG AGT TGA TTC ACT GTT TCC-3’
      SalI位点  OPG编码
用克隆pDSRα2/OPG[1-201]-Fc作为模板以获得Fc结构域。所述PCR产生包括铰合、CH2和CH3结构域的Fc羧基端的227个氨基酸。5’Fc引物掺入一个SalI位点(编码“VD”)，而3’Fc引物在Fc终止密码子之后掺入一个XhoI位点(CTCGAG)。将所述Fc PCR产物克隆到p615的SalI位点以产生pDSRα19：OPG[1-194]-FcΔC，该质粒在哺乳动物细胞中表达产生OPG[22-194]-FcdC。该融合蛋白在Fc-OPG接点含有一个额外的缬氨酸。在所述连接反应中丢失XhoI位点。有义Fc引物(1476-25)(SEQ ID NO：14)：5’-AATCT GTCGAC AAA ACT CAC ACA TGC-3’
      SalI位点  Fc编码反义Fc引物(1504-63)(SEQ ID NO：15)：5’-CCATG CTCGAG TTA TCA TTT ACC CGG AGA CAG G-3’
      XholI位点 *  Fc编码OPG[1-194]-FcG10的构建
经用引物1775-30和1504-63和OPG[1-201]-Fc cDNA作为模板的PCR，构建具有G10铰合部(1个丝氨酸和8个甘氨酸残基)的Fc区。将所述产物亚克隆到pCRscript(pCRscriptFcG10BspE)中并测序。经用引物1745-92和1790-72和OPG[1-201]-Fc cDNA作为模板的PCR获得OPG[1-194]。将所述PCR产物亚克隆到pCRScript中并测序。然后将含有OPG[1-194]序列的Xba/BspEI片段和含有具有G10铰合部的Fc的BspEI/XhoI片段亚克隆到pDSRα19中。该质粒在哺乳动物细胞中表达后产生OPG[22-194]-FcG10。所述氨基酸序列示于图7中。G10-Fc5’引物：(SEQ ID NO：16)：
              BspEI        Gly接头       KpnI   Fc结构域 →1775-30    5’-AA TCCGGA GGAGGTGGTGGAGGTGGG GGTACC TGCCCACCGTGC-3’
              S  G   G  G  G  G  G  G   G  T   C  P  P  CG10-Fc3’引物：(SEQ ID NO：17)：
                  XhoI1504-63    5’-CCATG CTCGAG TTA TCA TTT ACC CGG AGA CAG G-3’
                         *   *   K   G   P   S   LOPG5’引物：(SEQ ID NO：18)：
                XbaI  Kozak opg Coding→1745-92    5’-AAG TCTAGA CCACC ATG AAC AAG TTG CTG T-3’
                            M   N   K   L   LOPG3’引物：(SEQ ID NO：19)：
              BspEI1790-72    5’-CC TCCGA TTT TTG AGT TGA TTC ACT GTT TCC AGA-3’
                     K  Q   T   S   E   S   N   G   SFcΔC-OPG[22-194]的构建
采用pDSRα2：OPG[1-201]-Fc DNA作模板通过标准PCR技术，产生编码FcΔC-OPG[22-194]的DNA分子。用寡核苷酸1757-22和1757-23产生所述Fc部分。1757-22引物具有一个符合读框的EpoBssHII信号信号，以使Fc位于促红细胞生成素信号序列(该信号序列描述于美国专利第4,703,008号)的下游。1757-23引物将所述Fc结构域的最后一个氨基酸融合到人OPG的氨基酸残基22。用寡核苷酸1757-24和1789-04产生OPG部分。1789-04引物植入在人OPG氨基酸194之后的一个终止密码子和用于克隆的SalI位点。然后将这两个纯化的产物用作模板以产生含有引物1757-22和1789-04的Fc/OPG融合分子。将产生的PCR产物用BssHII和SalI消化、纯化、然后克隆到BssHII/SalI消化的pDSRα19中。该质粒在哺乳动物宿主细胞中表达产生FcΔC-OPG[22-194]，如图8(SEQ ID NO：8)所示，具有用氨基酸ala-pro取代氨基端的甲硫氨酸的修饰。有义Fc引物(1757-22)：(SEQ ID NO：20)
  5’-TTG GCGCGC CCA AAT CTT GTG  ACA AAA CT-3’
          BssHII反义Fc/OPG引物(1757-23)：(SEQ ID NO：21)5’-CTT TGG AGG AAA CGT TTC TTT ACC CGG AGA CAG GGA-3’
             OPG     →|←Fc有义Fc/OPG引物(1757-24)：(SEQ ID NO：22)5’-TCC CTG TCT CCG GGT AAA GAA ACG TTT CCT CCA AAG-3’
             Fc      →|←OPG反义OPG引物(1789-04)：(SEQ ID NO：23)
  5’-ATCT GTCGA CTA TTT TTG AGT TGA TTC AC-3’
           SalI   *    OPG编码
以前已经描述了载体pDSRα2(参见WO90/14363和其中的图12，其通过引用结合到本文中)。载体pDSRα19是功能相似、但含有pDSRα2的以下变化的修饰形式pDSRα2：
1)从3’末端减少αFSH polyA大约1400bp。它现在为885bp而
在NdeI位点结束。
2)二氢叶酸还原酶(DHFR)启动子被从5’末端减少大约1kb，而
现在仅含有209bp。
3)缺失DHFR polyA中的大约550bpBglII片段。
WO97/23614全面描述了从条件培养基纯化截短多肽和融合多肽的条件。met FcAc-OPG[22-194]的构建
采用以下方法构建methuOPG[22-194]编码序列。构建合成的寡核苷酸，它含有OPG DNA编码序列的完整全上链和下链构成的重叠50-mer。将内部50-mer寡核苷酸磷酸化、退火然后连接过夜。将外部寡核苷酸(34-mers)用作聚合酶链式反应(PCR)的引物以扩增所述全长基因。采用TaqDNA聚合酶和以试剂盒形式(Boehringer Mannheim)提供的其它反应组分，进行所述PCR反应。产生的584碱基对PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳纯化，然后采用QIAquick旋转柱方法(spincolumn method)(Qiagen)，从所述凝胶提取出来。然后将所述凝胶纯化的片段用限制酶XbaI和BamHI(Boehringer Mannheim)消化。用上述片段和用相同限制酶消化的质粒载体pAMG21(ATCC保藏号98113)进行连接反应。经电穿孔将所述连接的DNA转化到大肠杆菌株#393中。选择卡那霉素抗生素抗性的克隆，分离质粒，并经DNA序列测定验证所述编码区的序列。DNA序列测定显示最初选定的克隆(称为质粒A)在所述基因中间存在明显错配碱基。通过用限制酶SpeI和HpaI消化质粒A并用产生的产物作为所述载体片段，修复该基因序列。采用内部寡核苷酸1466-91和1467-03作为聚合酶链式反应的PCR引物，通过最初连接的寡核苷酸混合物的PCR，制备一条新的插入片段。将所述插入片段用SpeI和HpaI消化，然后连接到质粒A载体中以取代含有错配碱基的DNA片段。如上所述进行转化、选择和质粒分离。经DNA序列测定证实含有人OPG[22-194]的正确序列的克隆(质粒B)。上链寡核苷酸1466-90至1467-01：1466-90(SEQ ID NO：24)：5’AACAAACTCTAGATTTGTTTTAACTAATTAAAGG-3’1466-91 (SEQ ID NO：25)：5’AGGAATAACATATGGAAACTTTTCCACCTAAATATCTTCATTATGATGAA-3’1466-92 (SEQ ID NO：26)：5’GAAACTAGTCACCAGCTGCTGTGCGACAAATGTCCTCCGGGTACCTACCT-3’1466-93 (SEQ ID NO：27)：5’GAAACAGCACTGCACCGCTAAATGGAAAACCGTTTGCGCTCCTTGTCCGG-3’1466-94 (SEQ ID NO：28)：5’ACCACTACTACACCGACTCCTGGCACACCTCCGACGAATGCCTGTACTGC-3’1466-95 (SEQ ID NO：29)：5’TCACCGGTTTGCAAGGAGCTGCAGTACGTTAAACAGGAATGCAACCGTAC-3’1466-96 (SEQ ID NO：30)：5’GCACAACCGTGTTTGCGAATGCAAAGAAGGTCGTTACCTGGAGATCGAAT-3’1466-97 (SEQ ID NO：31)：5’TCTGCCTGAAACACCGTTCCTGTCCGCCTGGTTTCGGTGTTGTACAGGCT-3’1466-98 (SEQ ID NO：32)：5’GGTACCCCGGAACGTAACACCGTTTGCAAACGTTGCCCGGACGGTTTCTT-3’1466-99 (SEQ ID NO：33)：5’CTCCAACGAAACCTCGAGCAAAGCTCCGTGCCGTAAACACACCAACTGCT-3’1467-00 (SEQ ID NO：34)：5’CCGTTTTCGGTCTCCTGTTAACCCAGAAAGGTAACGCTACCCACGACAAC-3’1467-01 (SEQ ID NO：35)：5’ATCTGCTCCGGTAACTCCGAGTCGACCCAGAAATAATGGATCCCAAACAA-3’下链寡核苷酸1476-02至1476-13：1467-02 (SEQ ID NO：36)：5’-TTGTTTGGGATCCATTATTTCTGGGTCGACTCGG-3’1467-03 (SEQ ID NO：37)：5’AGTTACCGGAGCAGATGTTGTCGTGGGTAGCGTTACCTTTCTGGGTTAAC-3’1467-04 (SEQ ID NO：38)：5’AGGAGACCGAAAACGGAGCAGTTGGTGTGTTTACGGCACGGAGCTTTGCT-3’1467-05 (SEQ ID NO：39)：5’CGAGGTTTCGTTGGAGAAGAAACCGTCCGGGCAACGTTTGCAAACGGTGT-3’1467-06 (SEQ ID NO：40)：5’TACGTTCCGGGGTACCAGCCTGTACAACACCGAAACCAGGCGGACAGGAA-3’1467-07 (SEQ ID NO：41)：5’CGGTGTTTCAGGCAGAATTCGATCTCCAGGTAACGACCTTCTTTGCATTC-3’1467-08 (SEQ ID NO：42)：5’GCAAACACGGTTGTGCGTACGGTTGCATTCCTGTTTAACGTACTGCAGCT-3’1467-09 (SEQ ID NO：43)：5’CCTTGCAAACCGGTGAGCAGTACAGGCATTCGTCGGAGGTGTGCCAGGAG-3’1467-10 (SEQ ID NO：44)：5’TCGGTGTAGTAGTGGTCCGGACAAGGAGCGCAAACGGTTTTCCATTTAGC-3’1467-11 (SEQ ID NO：45)：5’GGTGCAGTGCTGTTTCAGGTAGGTACCCGGAGGACATTTGTCGCACAGCA-3’1467-12 (SEQ ID NO：46)：5’GCTGGTGACTAGTTTCTTCATCATAATGAAGATATTTAGGTGGAAAAGTT-3’1467-13 (SEQ ID NO：47)：5’TCCATATGTTATTCCTCCTTTAATTAGTTAAAACAAATCTAGAGTTTGTT-3’
如下进行上述人OPG[22-194]DNA序列与人IgG1FcΔC的融合。将包含在其氨基端与质粒pFc-A3的Fc区融合的上述OPG DNA编码序列的插入片段的质粒DNA，用限制酶NdeI和SpeI消化。质粒pFc-A3已经描述于WO97/23614。产生的质粒载体片段含有除去所述基因的前14个密码子(直到SpeI位点)的OPG编码序列。该载体命名为载体C。采用WO98/28427陈述的SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的DNA序列作为模板，经进行聚合酶链式反应，产生所述插入片段。将用于质粒pAMG21(ATCC保藏号98113)的通用5’引物(#1209-85)用来引发(prime)所述Fc序列(一个NdeI位点已经存在于所述Fc序列的起点)的5’端。设计两条寡核苷酸引物引发Fc编码序列的3’端，同时加入与osteoprotegerin基因的5’端相同的一个重叠区。设计第一引物(1595-18)去引发Fc编码序列的3’端，并加入osteoprotegerin序列的5’端的第一密码子。第二引物(1585-16)在上述引物的3’端引发并通过第14个密码子的SpeI位点加入其它OPG编码序列。采用具有WO98/28427的SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14序列的DNA分子作为模板，引物为1209-85和1595-18，以及采用上述Taq聚合酶进行第一轮PCR。将该反应的799个碱基对PCR产物凝胶纯化并用作第二轮PCR反应的模板，其引物为1209-85和1585-16。将第二轮PCR反应的825个碱基对产物凝胶纯化、用NdeI和SpeI消化，然后连接到上述载体C中。将连接反应混合物转化到大肠杆菌中，然后分离克隆，并经DNA序列测定证实具有正确OPG编码序列。产生的质粒编码具有图8(SEQ ID NO：8)中所示的氨基酸序列的[met]FcΔC-人OPG[22-194]。引物1209-85：(SEQ ID NO：48)5’-CGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGG-3’引物1585-16：(SEQ ID NO：49)5’ACAAACACTAGTTTCTTCATCATAATGAAGATATTTAGGTGGAAACGT3’引物1595-18：(SEQ ID NO：50)5’GAAGATATTTAGGTGGAAACGTTTCTTTACCCGGAGACAGGGAG-3’
基本上按照WO97/23614所述，进行在pAMG21中的编码[met]FcdC-人OPG[22-194]的DNA序列的表达。通过常规方法纯化所述融合多肽。
                 实施例2
              OPG多肽的活性
如下测定描述于实施例1中的选定OPG多肽和OPG融合多肽的体内活性。将OPG制剂持续4天皮下(SC)注射给予4-5周龄雄性BDF1小鼠，然后在第5天对所述小鼠进行放射照相。与媒介物处理的对照相比，阳性结果为胫骨干骺近端的X射线密度增加。每组4只动物，将每个胫骨与不同对照胫骨相比，得到编号1-8的结果。需要8个结果中至少5个为阳性结果，以得出产生了生物反应的结论。人们认为产生生物反应的最低剂量说明其体内效力。所有剂量以mg/kg/天表示。截短的OPG多肽和全长OPG多肽的日用量实验示于表2中。OPG融合多肽的日用量实验示于表3中。在大肠杆菌宿主细胞中表达具有N端甲硫氨酸残基的OPG多肽和OPG融合多肽，而在CHO细胞中表达不具有N端甲硫氨酸的OPG多肽和OPG融合多肽。
              表2
第5天进行X射线照相的日用量实验
因子 剂量 1  2  3  4  5  6  7  8 结果
metOPG[22-194] 10.0 -  -  +  +  +  +  +  - 阳性5/8
metOPG[22-194] 5.0 -  -  -  -  -  +  -  - 阴性1/8
metOPG[22-194] 1.0 -  -  -  -  -  -  -  - 阴性0/8
  metOPG[22-201]   1.5   -  +  -  +  +  +  +  +   阳性6/8
  metOPG[22-201]   0.5   -  -  -  +  -  -  -  +   阴性2/8
  metOPG[22-201]   0.15   -  -  -  -  -  +  -  -   阴性1/8
  OPG[22-293]   1.5   +  +  +  +  +  +  +  +   阳性8/8
  OPG[22-293]   0.5   +  +  +  +  +  +  +  +   阳性8/8
  OPG[22-293]   0.15   -  -  -  -  -  -  -  -   阴性0/8
  OPG[22-401]   10   -  +  +  +  +  +  -  -   阳性5/8
  OPG[22-401]   4.2   -  -  -  -  -  +  +  -   阴性2/8
               表3
第5天进行X射线照相的日用量实验
因子 剂量 1  2  3  4  5  6  7  8 结果
met FcΔC-22-194 0.05 +  +  +  +  +  +  +  + 阳性8/8
met FcΔC-22-194 0.015 -  -  +  -  +  +  -  - 阴性3/8
met FcΔC-22-194 0.005 -  -  -  -  -  -  -  - 阴性0/8
FcΔC-OPG[22-194] 0.15 +  +  +  +  +  +  +  + 阳性8/8
FcΔC-OPG[22-194] 0.05 +  -  -  -  +  +  +  + 阳性5/8
FcΔC OPG[22-194] 0.015 -  -  +  -  +  -  +  - 阴性3/8
因子 剂量 1  2  3  4  5  6  7  8 结果
OPG[22-201]-Fc 0.05 +  +  +  +  +  +  +  + 阳性8/8
OPG[22-201]-Fc 0.015 -  +  -  -  +  +  +  + 阳性5/8
OPG[22-201]-Fc 0.005 -  -  -  -  -  -  -  - 阴性0/8
OPG[22-194]-FcΔC 0.05 +  +  +  +  +  +  +  + 阳性8/8
OPG[22-194]-FcΔC 0.015 -  +  -  +  +  -  +  + 阳性5/8
OPG[22-194]-FcΔC 0.005 -  -  -  -  -  -  -  - 阴性0/8
在单剂量实验中，周龄3-4周的雄性BDF1小鼠在第0天(或第1天)用载体(PBS/0.1％BSA)经单次皮下注射，接受以下所示的不同剂量的OPG融合蛋白，然后将小鼠在第7天(或第5天)进行x射线照射。对于每次处理，一个组的所有小鼠和PBS/0.1％BSA对照组的所有小鼠都在一个胶片上(on a single film)进行x射线照相。如上所述记录阳性结果。剂量以mg/kg表示。所述结果示于表4中。
           表4
在第5天进行X射线照相的单剂量实验
因子 剂量 1  2  3  4  5  6  7  8 结果
met FcΔC-22-194 0.3 +  +  +  +  +  +  +  + 阳性8/8
met FcΔC-22-194 0.1 -  +  -  -  -  -  +  + 阴性3/8
met FcΔC-22-194 0.03 -  -  -  -  -  -  -  - 阴性0/8
FcΔC-OPG[22-194] 0.3 +  +  +  +  -  +  +  + 阳性7/8
FcΔC-OPG[22-194] 0.1 -  -  -  -  -  -  -  - 阴性0/8
FcΔC-OPG[22-194] 0.03 -  -  -  -  -  -  -  - 阴性0/8
因子 剂量 1  2  3  4  5  6  7  8 结果
OPG[22-201]-Fc 0.3 +  +  +  +  +  +  +  + 阳性8/8
OPG[22-201]-Fc 0.1 +  +  +  +  +  +  +  + 阳性8/8
OPG[22-201]-Fc 0.03 +  -  +  +  -  -  -  - 阴性3/8
OPG[22-194]-FcΔC 0.3 +  +  +  +  +  +  +  + 阳性8/8
OPG[22-194]-FcΔC 0.1 +  +  +  +  +  +  +  + 阳性8/8
OPG[22-194]-FcΔC 0.03 -  -  +  +  -  -  +  + 阴性4/8
在第7天进行X射线照相的单剂量实验
因子 剂量 1  2  3  4  5  6  7  8 结果
met FcΔC-22-194 3.0 +  +  +  +  +  +  +  + 阳性8/8
met FcΔC-22-194 1.0 -  -  +  +  +  -  +  + 阳性5/8
met FcΔC-22-194 0.3 -  -  -  -  -  -  -  - 阴性0/8
met FcΔC-22-194 0.1 -  -  -  -  -  -  -  - 阴性0/8
OPG[22-194]-FcΔC 3.0 +  +  +  +  +  +  +  + 阳性8/8
OPG[22-194]-FcΔC 1.0 +  +  +  +  +  +  +  + 阳性8/8
OPG[22-194]-FcΔC 0.3 +  +  +  +  +  +  +  + 阳性8/8
OPG[22-194]-FcΔC 0.1 -  +  -  -  +  -  +  - 阴性3/8
显而易见的是，融合到Fc区的OPG截短多肽显示较低剂量的体内活性比未融合的OPG截短多肽或全长多肽高。此外，OPG[22-194]-FcΔC(在OPG[22-194]多肽的羧基端的Fc融合物)显示其体内效力比FcΔC-OPG[22-194](在OPG[22-194]的氨基端的Fc融合物)高。
*    *    *
虽然通过优选实施方案描述了本发明，但不用说本领域技术人员会想到各种变化和修改。因此，所附权利要求书覆盖所有这样的属于要求保护的本发明范围的等同变化。
           序列表<110>AMGEN INC.<120>OPG融合蛋白组合物和方法<130>A-604<140><141><160>50<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>232<212>PRT<213>人类<400>1Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala1               5                  10                  15Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
         20                  25                  30Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
     35                  40                  45Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
 50                  55                  60Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln65                  70                  75                  80Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
             85                  90                  95Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
        100                 105                 110Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
    115                 120                 125Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130                 135                 140Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser145                 150                 155                 160Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
            165                 170                 175Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
       180                  185                 190Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
    195                 200                 205Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210                 215                 220Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys225                 230<210>2<211>401<212>PRT<213>人类<400>2Met Asn Lys Trp Leu Cys Cys Ala Leu Leu Val Leu Leu Asp Ile Ile1               5                  10                  15Glu Trp Thr Thr Gln Glu Thr Leu Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp
         20                  25                  30Pro Glu Thr Gly His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Ala Pro Gly Thr
     35                  40                  45Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Val Arg Arg Lys Thr Leu Cys Val Pro
 50                  55                  60Cys Pro Asp His Ser Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys65                  70                  75                  80Val Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Ser Val Lys Gln Glu
             85                  90                  95Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Glu Glu Gly Arg Tyr
        100                 105                 110Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Ser
    115                 120                 125Gly Val Val Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Lys
130                 135                 140Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Gly Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys145                 150                 155                 160Ile Lys His Thr Asn Cys Ser Thr Phe Gly Leu Leu Leu Ile Gln Lys
            165                 170                 175Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Val Cys Ser Gly Asn Arg Glu Ala Thr
        180                 185                 190Gln Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg
    195                 200                 205Phe Ala Val Pro Thr Lys Ile Ile Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val
210                 215                 220Asp Ser Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile225                 230                 235                 240Lys Arg Arg His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys Leu
            245                 250                 255Trp Lys His Gln Asn Arg Asp Gln Glu Met Val Lys Lys Ile Ile Gln
        260                 265                 270Asp Ile Asp Leu Cys Glu Ser Ser Val Gln Arg His Leu Gly His Ser
    275                 280                 285Asn Leu Thr Thr Glu Gln Leu Leu Ala Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly
290                 295                 300Lys Lys Ile Ser Pro Glu Glu Ile Glu Arg Thr Arg Lys Thr Cys Lys305                 310                 315                 320Ser Ser Glu Gln Leu Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn
            325                 330                 335Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu Met Tyr Ala Leu Lys His Leu
        340                 345                 350Lys Thr Ser His Phe Pro Lys Thr Val Thr His Ser Leu Arg Lys Thr
    355                 360                 365Met Arg Phe Leu His Ser Phe Thr Met Tyr Arg Leu Tyr Gln Lys Leu
370                 375                 380Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys385                 390                 395                 400Leu<210>3<211>407<212>PRT<213>人类<400>3Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His1               5                  10                  15Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His
         20                  25                  30Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr
     35                  40                  45Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro
 50                  55                  60Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His65                  70                  75                  80Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe
             85                  90                  95Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala
        100                 105                 110Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe
    115                 120                 125Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn
130                 135                 140Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr His145                 150                 155                 160Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ala Ala
            165                 170                 175Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
        180                 185                 190Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
    195                 200                 205Lys Asp Thr Leu Mer Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
210                 215                 220Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val225                  230                  235               240Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
            245                 250                 255Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
        260                 265                 270Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
    275                 280                 285Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
290                 295                 300Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr305                 310                 315                 320Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
            325                 330                 335Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
        340                 345                 350Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
    355                 360                 365Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
370                 375                 380Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys385                 390                 395                 400Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
            405<210>4<211>413<212>PRT<213>人类<400> 4Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His1               5                  10                  15Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His
         20                  25                  30Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr
     35                  40                  45Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro
 50                  55                  60Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His65                  70                  75                  80Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe
             85                  90                  95Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala
        100                 105                 110Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe
    115                 120                 125Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn
130                 135                 140Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr His145                 150                 155                 160Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Cys Gly Ile
            165                 170                 175Asp Val Thr Ala Ala Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
        180                 185                 190Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
    195                 200                 205Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
210                 215                 220Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val225                 230                 235                 240Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
            245                 250                 255Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
        260                 265                 270Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
    275                 280                 285Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
290                 295                 300Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro305                 310                 315                 320Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
            325                 330                 335Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
        340                 345                 350Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
    355                 360                 365Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
370                 375                 380Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His385                 390                 395                 400Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
            405                 410<210>5<2u>400<212>PRT<213>人类<400>5Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His1               5                  10                  15Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His
         20                  25                  30Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr
     35                  40                  45Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro
 50                  55                  60Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His65                  70                  75                  80Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe
             85                  90                  95Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala
        100                 105                 110Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe
    115                 120                 125Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn
130                 135                 140Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr His145                 150                 155                 160Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Val Asp Lys
            165                 170                 175Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
        180                 185                 190Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
    195                 200                 205Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
210                 215                 220Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn225                 230                 235                 240Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
            245                 250                 255Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
        260                 265                 270Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
    275                 280                 285Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
290                 295                 300Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr305                 310                 315                 320Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
            325                 330                 335Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
        340                 345                 350Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
    355                 360                 365Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn ValPhe Ser Cys Ser Val Met His Glu
370                 375                380Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly385                 390                 395                 400<210>6<211>406<212>PRT<13>人类<400>6Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His1               5                  10                  15Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His
         20                  25                  30Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr
     35                  40                  45Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro
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370                 375                 380Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser385                 390                 395                 400Leu Ser Leu Ser Pro Gly
            405<210>7<211>404<212>PRT<213>人类<400>7Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His  1               5                  10                  15Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His
         20                  25                  30Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr
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             85                  90                  95Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala
        100                 105                 110Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe
    115                 120                 125Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn
130                 135                 140Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr His145                 150                 155                 160Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Ser Gly Gly
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290                 295                 300Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln305                 310                 315                 320Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
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    355                 360                 365Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
370                 375                 380Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser385                 390                 395                 400Leu Ser Pro Gly<210>8<211>401<212>PRT<13>人类<400>8Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu1               5                  10                  15Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
         20                  25                  30Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
     35                  40                  45His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
 50                  55                  60Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr65                  70                  75                  80Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
             85                  90                  95Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asu Lys Ala Leu Pro Ala Pro
        100                 105                 110Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
    115                 120                 125Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
130                 135                 140Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val145                 150                 155                 160Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
            165                 170                 175Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
        180                 185                 190Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
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210                 215                 220Ser Pro Gly Lys Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu225                 230                 235                 240Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr
            245                 250                 255Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys
        260                 265                 270Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu
    275                 280                 285Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys
290                 295                 300Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu305                 310                 315                 320Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly
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    355                 360                 365Lys His Thr Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly
370                 375                  380Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln385                 390                 395                 400Lys<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>9aagtctagac caccatgaac aagttgctgt                                  30<210>10<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>10gctagtcgac tactcgaagg tgaggttagc at                               32<210>11<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>11atctgtcgac tatttttgag ttgattcac                                   29<210>12<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>12aagtctagac caccatgaac aagttgctgt                                  30<210>13<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>13cacgcgtcga ctttttgagt tgattcactg tttcc                            35<210>14<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>14aatctgtcga caaaactcac acatgc                                      26<210>15<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>15ccatgctcga gttatcattt acccggagac agg                              33<210>16<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><23>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>16aatccggagg  aggtggtgga  ggtgggggta  cctgcccacc  gtgc                    44<210>17<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>17ccatgctcga gttatcattt  acccggagac  agg                                  33<210>18<211>30<212>DNA<13>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>18aagtctagac caccatgaac aagttgctgt                                        30<210>19<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>19cctccggatt  tttgagttga  ttcactgttt  ccaga                               35<210>20<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>20ttggcgcgcc  caaatcttgt  gacaaaact                                       29<210>21<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>21ctttggagga aacgtttctt tacccggaga caggga                          36<210>22<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>22tccctgtctc cgggtaaaga aacgtt tcct ccaaag                         36<210>23<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>23atctgtcgac tatttttgag ttgattcac                                  29<210>24<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>24aacaaactct agatttgttt taactaatta aagg                            34<210>25<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><23>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>25aggaataaca tatggaaact tttccaccta aatatcttca ttatgatgaa            50<210>26<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>26gaaactagtc accagctgct gtgcgacaaa tgtcctccgg gtacctacct            50<210>27<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>27gaaacagcac tgcaccgcta aatggaaaac cgtttgcgct ccttgtccgg            50<210>28<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><23>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>28accactacta caccgactcc tggcacacct ccgacgaatg cctgtactgc            50<210>29<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>29tcaccggttt gcaaggagct gcagtacgtt aaacaggaat gcaaccgtac            50<210>30<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>30gcacaaccgt gtttgcgaat gcaaagaagg tcgttacctg gagatcgaat            50<210>31<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>31tctgcctgaa acaccgttcc tgtccgcctg gtttcggtgt tgtacaggct            50<210>32<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>32ggtaccccgg aacgtaacac cgtttgcaaa cgttgcccgg acggtttctt            50<210>33<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>33ctccaacgaa acctcgagca aagctccgtg ccgtaaacac accaactgct           50<210>34<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>34ccgttttcgg tctcctgtta acccagaaag gtaacgctac ccacgacaac            50<210>35<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>35atctgctccg gtaactccga gtcgacccag aaataatgga tcccaaacaa            50<210>36<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>36ttgtttggga tccattattt ctgggtcgac tcgg                             34<210>37<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>37agttaccgga gcagatgttg tcgtgggtag cgttaccttt ctgggttaac            50<210>38<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>38aggagaccga aaacggagca gttggtgtgt ttacggcacg gagctttgct            50<210>39<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>39cgaggtttcg ttggagaaga aaccgtccgg gcaacgtttg caaacggtgt            50<210>40<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>40tacgttccgg ggtaccagcc tgtacaacac cgaaaccagg cggacaggaa            50<210>41<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>41cggtgtttca ggcagaattc gatctccagg taacgacctt ctttgcattc            50<210>42<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>42gcaaacacgg ttgtgcgtac ggttgcattc ctgtttaacg tactgcagct            50<210>43<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>43ccttgcaaac cggtgagcag tacaggcatt cgtcggaggt gtgccaggag            50<210>44<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>44tcggtgtagt agtggtccgg acaaggagcg caaacggttt tccatttagc           50<210>45<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>45ggtgcagtgc tgtttcaggt aggtacccgg aggacatttg tcgcacagca           50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                 序列表<110>Wooden，Scott K.
 Mann，Michael B.
 Dunstan，Colin R.<120>OPG融合蛋白组合物和方法<130>A-604<140><141><160>50<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>232<212>PRT<213>人类<400>1Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala1               5                  10                  15Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
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 50                  55                  60Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln65                  70                  75                  80Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
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210                 215                 220Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys225                 230<210>2<211>401<212>PRT<213>人类<400>2Met Asn Lys Trp Leu Cys Cys Ala Leu Leu Val Leu Leu Asp Ile Ile1               5                  10                  15Glu Trp Thr Thr Gln Glu Thr Leu Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp
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 50                  55                 60Cys Pro Asp His Ser Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys65                  70                  75                  80Val Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Ser Val Lys Gln Glu
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    115                 120                 125Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn
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        180                 185                 190Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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        100                 105                 110Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe
    115                 120                 125Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn
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            165                 170                 175Asp Val Thr Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
        180                 185                 190Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
    195                 200                 205Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
210                 215                 220Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp225                 230                 235                 240Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
            245                 250                 255Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
        260                 265                 270Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
    275                 280                 285Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
290                 295                 300Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys305                 310                 315                 320Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
            325                 330                 335Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
        340                 345                 350Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
    355                 360                 365Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
370                 375                 380Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser385                 390                 395                 400Leu Ser Leu Ser Pro Gly
            405<210>7<211>404<212>PRT<213>人类<400>7Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His1               5                  10                  15Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His
         20                  25                  30Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr
     35                  40                  45Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro
 50                  55                  60Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His65                  70                  75                  80Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe
             85                  90                  95Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala
        100                 105                 110Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe
    115                 120                 125Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn
130                 135                 140Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr His145                 150                 155                 160Asp Asn lle Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Ser Gly Gly
            165                 170                 175Gly Gly Gly Gly Gly Gly Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
       180                  185                 190Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
    195                 200                 205Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
210                 215                 220Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val225                 230                 235                 240Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
            245                 250                 255Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
        260                 265                 270Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
    275                 280                 285Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
290                 295                 300Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln305                 310                 315                 320Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
            325                 330                 335Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
        340                 345                 350Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
    355                 360                 365Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
370                 375                 380Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser385                 390                 395                 400Leu Ser Pro Gly<210>8<211>401<212>PRT<213>人类<400>8Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu1               5                  10                  15Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
         20                  25                  30Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
     35                  40                  45His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
 50                  55                  60Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
                 70                  75                  80Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
             85                  90                  95Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
        100                 105                 110Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
    115                 120                 125Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
130                 135                 140Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val145                 150                 155                 160Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
            165                 170                 175Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
        180                 185                 190Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
    195                 200                 205Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210                 215                 220Ser Pro Gly Lys Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu225                 230                 235                 240Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr
            245                 250                 255Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys
        260                 265                 270Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu
    275                 280                 285Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys
290                 295                 300Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu305                 310                 315                 320Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly
            325                 330                 335Val Val Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys
        340                 345                 350Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg
    355                 360                 365Lys His Thr Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly
370                 375                 380Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln385                 390                 395                 400Lys<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>9aagtctagac caccatgaac aagttgctgt                                 30<210>10<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>10gctagtcgac tactcgaagg tgaggttagc  at                             32<210>11<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>11atctgtcgac tatttttgag ttgattcac                                   29<210>12<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>12aagtctagac caccatgaac aagttgctgt                                  30<210>13<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>13cacgcgtcga ctttttgagt tgattcactg tttcc                            35<210>14<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>14aatctgtcga caaaactcac acatgc                                      26<210>15<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>15ccatgctcga gttatcattt acccggagac agg                              33<210>16<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>16aatccggagg aggtggtgga ggtgggggta cctgcccacc gtgc                  44<210>17<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>17ccatgctcga gttatcattt acccggagac agg                              33<210>18<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>18aagtctagac caccatgaac aagttgctgt                                 30<210>19<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>19cctccggatt tttgagttga ttcactgttt ccaga                           35<210>20<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>20ttggcgcgcc caaatcttgt gacaaaact                                  29<210>21<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>21ctttggagga aacgtttctt tacccggaga caggga                          36<210>22<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>22tccctgtctc cgggtaaaga aacgtttcct ccaaag                          36<210>23<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>23atctgtcgac tatttttgag ttgattcac                                  29<210>24<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>24aacaaactct agatttgttt taactaatta aagg                            34<210>25<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>25aggaataaca tatggaaact tttccaccta aatatcttca ttatgatgaa           50<210>26<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>26gaaactagtc accagctgct gtgcgacaaa tgtcctccgg gtacctacct           50<210>27<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>27gaaacagcac tgcaccgcta aatggaaaac cgtttgcgct ccttgtccgg            50<210>28<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>28accactacta caccgactcc tggcacacct ccgacgaatg cctgtactgc            50<210>29<221>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>29tcaccggttt gcaaggagct gcagtacgtt aaacaggaat gcaaccgtac            50<210>30<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>30gcacaaccgt gtttgcgaat gcaaagaagg tcgttacctg gagatcgaat            50<210>31<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>31tctgcctgaa acaccgttcc tgtccgcctg gtttcggtgt tgtacaggct            50<210>32<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>32ggtaccccgg aacgtaacac cgtttgcaaa cgttgcccgg acggtttctt            50<210>33<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>33ctccaacgaa acctcgagca aagctccgtg ccgtaaacac accaactgct            50<210>34<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>34ccgttttcgg tctcctgtta acccagaaag gtaacgctac ccacgacaac            50<210>35<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>35atctgctccg gtaactccga gtcgacccag aaataatgga tcccaaacaa            50<210>36<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>36ttgtttggga tccattattt ctgggtcgac tcgg                             34<210>37<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>37agttaccgga gcagatgttg tcgtgggtag cgttaccttt ctgggttaac            50<210>38<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>38aggagaccga aaacggagca gttggtgtgt ttacggcacg gagctttgct            50<210>39<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>39cgaggtttcg ttggagaaga aaccgtccgg gcaacgtttg caaacggtgt            50<210>40<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>40tacgttccgg ggtaccagcc tgtacaacac cgaaaccagg cggacaggaa            50<210>41<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>41cggtgtttca ggcagaattc gatctccagg taacgacctt ctttgcattc            50<210>42<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>42gcaaacacgg ttgtgcgtac ggttgcattc ctgtttaacg tactgcagct           50<210>43<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>43ccttgcaaac cggtgagcag tacaggcatt cgtcggaggt gtgccaggag           50<210>44<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>44tcggtgtagt agtggtccgg acaaggagcg caaacggttt tccatttagc            50<210>45<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸<400>45ggtgcagtgc tgtttcaggt aggtacccgg aggacatttg tcgcacagca            50<210>46<211>50<212>DNA<213>人工序列<22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Claims (20)

1.具有选自以下组成形式的蛋白：R1-R2、R2-R1、R1-L-R2和R2-L-R1，其中R1为Fc蛋白、或其变体或片段，R2为OPG蛋白、或其变体或片段，而L为接头。
2.权利要求1的所述蛋白，具有式R2-L-R1。
3.按照权利要求1的所述蛋白，其中所述Fc蛋白选自以下：
(a)图1所示的Fc氨基酸序列；
(b)亚部分(a)的氨基酸序列，在以下一个或多个位置(采用按照图1的编号)具有取代或缺失的不同氨基酸：
(i)一个或多个半胱氨酸残基；
(ii)一个或多个酪氨酸残基；
(iii)缺失或用丙氨酸取代位置5的半胱氨酸；
(iv)缺失或用谷氨酰胺取代位置20的亮氨酸；
(v)缺失或用丙氨酸取代位置103的谷氨酸；
(vi)缺失或用丙氨酸取代位置105的赖氨酸；
(vii)缺失或用丙氨酸取代位置107的赖氨酸；
(viii)缺失或取代位置1、2、3、4和5中的一个或多个氨基酸；
(ix)取代或缺失一个或多个残基以消除所述Fc受体结合位点；
(x)取代或缺失一个或多个残基以消除所述补体(Clq)结合位点的；和
(xi)亚部分i-x的组合；
(c)亚部分(a)或(b)的氨基酸序列，在N端具有一个甲硫氨酰残基；
(d)亚部分(a)至(c)中任何一种的Fc蛋白、或其变体、片段或衍生物，包含连接到所述蛋白部分的化学部分；
(e)亚部分(d)的一种衍生物，其中所述化学部分为水溶性聚合物部分；
(f)亚部分(e)的一种衍生物，其中所述水溶性聚合物部分为聚乙二醇；和
(g)亚部分(e)的一种衍生物，其中所述水溶性聚合物部分连接在所述蛋白部分的唯一N端。
4.按照权利要求1的所述蛋白，其中所述OPG蛋白、或其变体、片段或衍生物选自以下：
(a)氨基酸序列22-X，其中X为图2(SEQ ID NO：2)所示的包括位置185-401的任何残基；
(b)氨基酸序列22-X，其中X为图2(SEQ ID NO：2)所示的包括位置185-293的任何残基；
(c)亚部分(a)和(b)的氨基酸序列，在N端具有一个甲硫氨酰残基。
(c)任何亚部分(a)、(b)和(c)的OPG蛋白、或其变体、片段或衍生物，包含连接到所述蛋白部分的化学部分；
(d)亚部分(c)的一种衍生物，其中所述化学部分为水溶性聚合物部分；
(e)亚部分(d)的一种衍生物，其中所述水溶性聚合物部分为聚乙二醇；
(f)亚部分(d)的一种衍生物，其中所述水溶性聚合物部分为聚氨基酸部分；和
(g)亚部分(d)的一种衍生物，其中所述水溶性聚合物部分连接在所述蛋白部分的唯一N端。
5.权利要求1的所述蛋白，其中所述接头是选自甘氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸的一个或多个氨基酸。
6.权利要求1的所述蛋白，其中所述接头选自以下：
(a)   ala-ala-ala；
(b)  ala-ala-ala-ala；
(c)  ala-ala-ala-ala-ala；
(d)  gly-gly；
(e)  gly-gly-gly；
(f)  gly-gly-gly-gly-gly；
(g)  gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly；
(h)  gly-pro-gly；
(i)  gly-gly-pro-gly-gly；
(j)  val；
(k)  ser-gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly；
(l)  gly-gly-ser-gly-ser-ala-gly-ser-gly-ser-gly-gly-gly-ser-gly- ser-
     gly-gly；
(m)  化学部分；和
(n)  亚部分(a)-(m)的任何组合。
7.一种融合蛋白，它包含选自图5、6、7或8(分别为SEQ ID NO：5、6、7、8)所示氨基酸序列的氨基酸序列。
8.一种核酸序列，它编码具有选自R1-R2、R2-R1、R1-L-R2和R2-L-R1的组成式的蛋白，其中R1为Fc蛋白、或其变体或片段，R2为OPG蛋白、或其变体或片段，而L为接头。
9.权利要求8的所述核酸序列，编码包含选自以下的Fc蛋白、变体、片段或衍生物部分的蛋白：
(a)图1(SEQ ID NO：1)所示的Fc氨基酸序列；
(b)亚部分(a)的氨基酸序列，具有在以下一个或多个位置(用按照图1的编号)中取代或缺失的不同氨基酸：
(i)一个或多个半胱氨酸残基；
(ii)一个或多个酪氨酸残基；
(iii)缺失或用丙氨酸取代位置5的半胱氨酸；
(iv)缺失或用谷氨酰胺取代位置20的亮氨酸；
(v)缺失或用丙氨酸取代位置103的谷氨酸；
(vi)缺失或用丙氨酸取代位置105的赖氨酸；
(vii)缺失或用丙氨酸取代位置107的赖氨酸；
(viii)缺失或取代位置1、2、3、4和5中的一个或多个氨基酸；
(ix)取代或缺失一个或多个残基以消除所述Fc受体结合位点；
(x)取代或缺失一个或多个残基以消除所述补体(Clq)结合位点；和
(xi)亚部分i-x的组合；
(c)亚部分(a)或(b)的氨基酸序列，在N端具有一个甲硫氨酰残基；
(d)亚部分(a)至(c)中任何一种的Fc蛋白、或其变体、片段或衍生物，包含连接到所述蛋白部分的化学部分；
(e)亚部分(d)的一种衍生物，其中所述化学部分为水溶性聚合物部分；
(f)亚部分(e)的一种衍生物，其中所述水溶性聚合物部分为聚乙二醇；和
(g)亚部分(e)的一种衍生物，其中所述水溶性聚合物部分连接在所述蛋白部分的唯一N端。
10.按照权利要求8的所述核酸序列，编码包含选自以下的OPG蛋白、变体、片段或衍生物部分的蛋白：
(a)氨基酸序列22-X，其中X为图2(SEQ ID NO：2)所示的包括位置185-401的任何残基；
(b)氨基酸序列22-X，其中X为图2(SEQ ID NO：2)所示的包括位置185-293的任何残基；
(c)亚部分(a)和(b)的氨基酸序列，在N端具有一个甲硫氨酰残基。
(d)任何亚部分(a)、(b)和(c)的OPG蛋白、或其变体、片段或衍生物，包含连接到所述蛋白部分的化学部分；
(e)亚部分(d)的一种衍生物，其中所述化学部分为水溶性聚合物部分；
(f)亚部分(e)的一种衍生物，其中所述水溶性聚合物部分为聚乙二醇；
(g)亚部分(e)的一种衍生物，其中所述水溶性聚合物部分为聚氨基酸部分；和
(h)亚部分(e)的一种衍生物，其中所述水溶性聚合物部分连接在所述蛋白部分的唯一N端。
11.权利要求8的所述核酸序列，编码包含接头的蛋白，所述接头是选自甘氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸的一个或多个氨基酸。
12.权利要求8的所述核酸序列，编码具有选自以下接头的蛋白：
(a)  ala-ala-ala；
(b)  ala-ala-ala-ala；
(c)  ala-ala-ala-ala-ala；
(d)  gly-gly；
(e)  gly-gly-gly；
(f)  gly-gly-gly-gly-gly；
(g)  gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly；
(h)  gly-pro-gly；
(i)  gly-gly-pro-gly-gly；
(j)  val；
(k)  ser-gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly；
(l)  gly-gly-ser-gly-ser-gly-ala-gly-ser-gly-ser-gly-gly-gly-ser-gly-
     ser-gly-gly；
(m)  化学部分；和
(n)  亚部分(a)-(m)的任何组合。
13.编码融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白包含选自以下的氨基酸序列：图5、6、7或8(分别为SEQ ID NO：5、6、7、8)所示的氨基酸序列。
14.一种载体，它包含按照权利要求8-13中的任一项的核酸序列。
15原核或真核宿主细胞，含有权利要求14的所述载体。
16.用于生产权利要求1或6的蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：在合适条件下培养权利要求15的宿主细胞和分离所产生的蛋白。
17.权利要求16的方法，还包括纯化所产生的蛋白的步骤。
18.一种药用组合物，它包含在药学上可接受的稀释剂、辅助剂或载体中的有效量权利要求1或6的蛋白。
19.预防或治疗哺乳动物骨丢失的方法，该方法包括给予有效量的权利要求1-6任一项的所述蛋白。
20.权利要求19的方法，其中所述骨丢失选自骨质疏松症、佩吉特病、骨髓炎、血钙过多、与手术或服用类固醇相关的骨质减少、骨坏死、由类风湿性关节炎引起的骨丢失、牙周骨丢失、溶骨性转移和假肢松动(prosthetic loosening)。
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