JP2003508075A - Ｏｐｇ融合タンパク質組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はＯＰＧ融合タンパク質組成物、その製造法および使用に関する。より詳細には、本発明は、ＯＰＧポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明はＯＰＧ融合タンパク質組成物ならびにその調製法および使用に関する
。

【０００２】 （発明の背景） 組換えタンパク質が治療用に利用可能になることにより、このようなタンパク
質の医薬品としての性質を向上または改良するためのタンパク質修飾が進歩する
。このような修飾によりタンパク質分解が減少し且つ除去されて、タンパク質保
護が向上し分解を減少させることができる。さらなる利点には、一定の環境下で
の安定性、循環時間、および治療タンパク質の生物学的活性の向上が含まれる。
タンパク質修飾が記載された総説論文は、Ｆｒａｎｃｉｓ、Ｆｏｃｕｓ ｏｎ
Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、３、４〜１０、Ｍａｙ １９９２（Ｍｅｄｉｓ
ｃｒｉｐｔ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫから刊行）である。

【０００３】 このような修飾の１つは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域の使用である。抗体
は、以下の２つの機能的に独立した部分を含む：抗体に結合する「Ｆａｂ」とし
て公知の可変ドメインおよび補体または食細胞などのエフェクター機能に結合す
る「Ｆｃ」として公知の定常ドメイン。免疫グロブリンのＦｃ部分は血漿半減期
が長いのに対し、Ｆａｂは短命である（Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３７、
５２５〜５３１、１９８９）。

【０００４】 治療用タンパク質産物は、より長い半減期を得るためまたはＦｃレセプター結
合、プロテインＡ結合、補体固定、および胎盤導入（全て、免疫グロブリンのＦ
ｃタンパク質Ｉｄに属する）などの機能を組込むためにＦｃドメインを用いて構
築されている。例えば、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域はＣＤ３０リガンド（ＣＤ３０
−Ｌ）のＮ末端（ホジキン病の腫瘍細胞、未熟型リンパ腫細胞、Ｔ細胞白血病細
胞、および他の悪性細胞型に発現するＣＤ３０レセプターに結合する分子）に融
合されている。米国特許第５，４８０，９８１号を参照のこと。サイトカインの
短い循環半減期を延長させるために、ＩＬ−１０（抗炎症および拒絶反応抑制剤
）がマウスＦｃγ２ａに結合されている（Ｚｈｅｎｇら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５４、５５９０〜５６００、１９９５）。
敗血症性ショック患者治療用のヒトＩｇＧ１のＦｃタンパク質と結合する腫瘍壊
死因子レセプターの使用を評価する研究も行われている（Ｆｉｓｈｅｒら、Ｎ．
Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３４、１６９７〜１７０２、１９９６、Ｖａｎ Ｚ
ｅｅら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５６、２２
２１〜２２３０、１９９６）。ＦｃをＣＤ４レセプターと融合させたＡＩＤＳ治
療用の治療タンパク質も作製されている。Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３７
、５２５〜５３１、１９８９を参照のこと。さらに、インターロイキン−２（Ｉ
Ｌ−２）のＮ末端をＩｇＧ１またはＩｇＧ３のＦｃ部分に融合させることにより
、ＩＬ−２の短い半減期およびその全身毒性が克服されている。Ｈａｒｖｉｌｌ
ら、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１、９５〜１０５、１９９５を参照の
こと。

【０００５】 オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／２３６１４に
記載されており、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの破骨細胞の形成を
負に調節することが見出されている。ＯＰＧは、卵巣切除ラットに投与した場合
、ＯＰＧポリペプチドを発現するトランスジェニックマウスの骨密度を劇的に増
大させ、骨の損失範囲を減少させる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの破骨細胞形成におけ
るＯＰＧ活性分析により、ＯＰＧは単球／マクロファージ前駆体由来の破骨細胞
の分化を阻害することが明白になった。ＯＰＧは、破骨細胞形成範囲の調節に特
異的であるようである。ＯＰＧは、骨吸収阻害の強力な因子であり、骨質量損失
の予防および治療に使用することができる。ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔ
ｒｏでの破骨細胞形成の阻害および骨損失の阻止はまた、ＯＰＧおよびＦｃドメ
インを含む融合タンパク質で認められた。

【０００６】 Ｆｃドメインなどの異種タンパク質またはペプチドへのＯＰＧポリペプチドの
融合を、得られたＯＰＧ融合タンパク質が治療薬として変化可能な生物学的性質
および潜在的に変化可能な効果を示すことができるような種々の異なる方法で行
うことができる。例えば、Ｆｃドメインを、ＯＰＧポリペプチドのアミノ末端ま
たはカルボキシ末端のいずれかで融合させることができ、Ｆｃドメインを直接ま
たは結合分子を介して融合することができ、そして／またはＦｃもしくはＯＰＧ
部分の１つまたは両方をその未変性形態から修飾することができる。これらのＯ
ＰＧ融合タンパク質構築物の変化により、発現レベル、単離および／または精製
し易さ、生物活性などが変化し得る。

【０００７】 したがって、有効な治療薬としてのＯＰＧ融合タンパク質組成物を開発するこ
とが必要である。このような組成物は、産生、単離、精製、生物活性、安定性、
および循環時間について有利な性質を示す。本発明は、このような組成物を提供
する。

【０００８】 （発明の要旨） 本発明は、ＯＰＧ融合タンパク質組成物、このような組成物の調整法およびそ
の使用を提供する。より詳細には、本発明は、ＯＰＧタンパク質またはその変異
型、フラグメント、または誘導体、およびＦｃタンパク質またはその変異型、フ
ラグメント、または誘導体を含むＯＰＧ融合タンパク質に関する。予想外に、Ｆ
ｃ領域の短縮ＯＰＧポリペプチドへの融合は非融合短縮または全長ＯＰＧポリペ
プチドでは認められない利点を示すことが認められた。このような予期せぬ利点
は、本発明のポリペプチドのより低用量および／または低頻度の投薬に寄与する
。したがって、以下により詳細に記載するように、本発明は、Ｆｃ領域のＯＰＧ
タンパク質（その変異型、フラグメント、または誘導体）への融合を介したポリ
ペプチドの修飾ならびにその特異的修飾、調製、および使用法に関する多数の態
様を有する。

【０００９】 １つの態様では、本発明は、Ｒ_１−Ｒ_２、Ｒ_２−Ｒ_１、Ｒ_１−Ｌ−Ｒ_２、およ
びＲ_２−Ｌ−Ｒ_１（式中、Ｒ_１はＦｃタンパク質またはその変異型もしくはフラ
グメントであり、Ｒ_２はＯＰＧタンパク質またはその変異型もしくはフラグメン
トであり、Ｌはリンカーである）からなる群から選択される式を有するタンパク
質を提供する。本発明はまた、本明細書中に記載のように、Ｒ_１およびＲ_２部分
のリンカーを提供する。

【００１０】 別の態様では、本発明は、Ｆｃ（またはその変異型、フラグメント、または誘
導体）がＯＰＧタンパク質（またはその変異型、フラグメント、または誘導体）
のカルボキシ末端に遺伝的に融合したＯＰＧ融合タンパク質を提供する。本発明
の別の実施形態では、Ｆｃ部分はまた、当該分野で公知のペプチドまたは化学的
リンカーによってＯＰＧタンパク質（またはその変異型、フラグメント、または
誘導体）のカルボキシ末端に結合することができる。本発明のさらなる態様には
、ＯＰＧ融合タンパク質組成物だけでなく、このようなタンパク質をコードする
核酸、関連ベクターおよびこのようなベクターを含む宿主細胞（共に本発明の融
合タンパク質産生に有用）が含まれる。

【００１１】 別の態様では、本発明は、ＯＰＧ融合タンパク質の調製法を提供する。組換え
ＤＮＡ法は、当業者に利用可能である。ＯＰＧ融合ポリペプチドの化学的合成法
および結合法もまた提供する。さらに、このような態様には、タンパク質産生お
よび精製も同様に含まれる。

【００１２】 別の態様では、本発明は、骨障害、特に骨質量の損失の治療法を提供する。こ
のような骨障害には、骨粗鬆症、腫瘍の転移に起因する溶解性骨疾患、高カルシ
ウム血症、パジェット病、慢性関節リウマチによる骨の損失などが含まれる。

【００１３】 別の態様では、本発明はまた、上記治療用のＯＰＧ融合タンパク質、その変異
型、フラグメント、および誘導体の関連医薬組成物を提供する。

【００１４】 （図面の簡単な説明） 図１（配列番号１）は、ヒトＩｇＧγ１のヒンジ、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３領域
のアミノ酸配列を示す。

【００１５】 図２（配列番号２）は、ヒトＯＰＧ［１〜４０１］のアミノ酸配列を示す。

【００１６】 図３（配列番号３）は、ＯＰＧ［２２〜１９４］−Ｆｃのアミノ酸配列を示す
。

【００１７】 図４（配列番号４）は、ＯＰＧ［２２〜２０１］−Ｆｃのアミノ酸配列を示す
。

【００１８】 図５（配列番号５）は、ＯＰＧ［２２〜１９４］−ＦｃΔＣのアミノ酸配列を
示す。

【００１９】 図６（配列番号６）は、ＯＰＧ［２２〜２０１］−ＦｃΔＣのアミノ酸配列を
示す。

【００２０】 図７（配列番号７）は、ＯＰＧ［２２〜１９４］−ＦｃＧ_１０のアミノ酸配列
を示す。

【００２１】 図８（配列番号８）は、［ｍｅｔ］ＦｃΔＣ−ＯＰＧ［２２〜１９４］のアミ
ノ酸配列を示す。

【００２２】 （発明の詳細な説明） 本発明は、ＯＰＧタンパク質組成物、このような組成物の調製法、およびその
使用に関する。より詳細には、本発明は、ＯＰＧポリペプチドへの免疫グロブリ
ンのＦｃ領域の融合に関する。予想外に、短縮ＯＰＧポリペプチドへのＦｃ領域
の融合により非融合短縮ＯＰＧポリペプチドまたは全長成熟ＯＰＧ（図２（配列
番号２）に示すように、全長成熟ＯＰＧは３８０アミノ酸（例えば、残基２２〜
４０１などを含む）を含む）では認められない利点を示すことが認められた。Ｏ
ＰＧポリペプチドのカルボキシ末端でのＦｃ領域の融合により、ＯＰＧポリペプ
チドのアミノ末端でのＦｃ領域の融合と比較して予想外の利点が得られることが
さらに認められた。したがって、ＯＰＧ融合タンパク質、その変異型、フラグメ
ント、および誘導体、ならびに関連する使用法および調製法を以下により詳細に
記載する。

【００２３】 用語「ＯＰＧ」または「ＯＰＧポリペプチド」は、図２に記載のアミノ酸配列
（配列番号２）を含むポリペプチドおよび本明細書中に記載の関連ポリペプチド
をいう。関連ポリペプチドには、対立遺伝子変異型、スプライス変異型；フラグ
メント；誘導体；置換、欠失、および挿入変異型；融合ポリペプチド；および非
ヒトホモログが含まれる。ＯＰＧポリペプチドは、本明細書中で定義するように
、成熟ポリペプチドであり得るが、調製法に依存してアミノ末端メチオニン残基
を含み得ない。

【００２４】 用語「ＯＰＧ融合タンパク質」は、異種ペプチドまたはポリペプチドに結合す
るＯＰＧタンパク質またはＯＰＧポリペプチドをいう。本発明のＯＰＧ融合タン
パク質を、ＯＰＧと異種ペプチドまたはポリペプチド部分との遺伝的または化学
的融合などによる当該分野で公知の任意の適切な手段によって調製することがで
きる。本発明の１つの実施形態では、異種ペプチドまたはポリペプチドは、免疫
グロブリン、好ましくはヒト免疫グロブリンのＦｃ領域である。異種ペプチドま
たはタンパク質を、ＯＰＧポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のい
ずれかに結合させることができる。

【００２５】 用語「成熟ＯＰＧポリペプチド」または「成熟ＯＰＧ融合ポリペプチド」は、
リーダー配列を欠くポリペプチドまたは融合ポリペプチドをいい、他の修飾（ア
ミノ末端（リーダー配列を含むか含まない）および／またはカルボキシ末端のタ
ンパク質分解プロセシング、より大きな前駆体からより小さなポリペプチドへの
切断、Ｎ結合および／またはＯ結合グリコシル化など）も含み得る。

【００２６】 用語「Ｆｃ」は、単量体または多量体における抗体の非抗原結合部分の配列を
含む分子または配列をいう。Ｆｃの元の免疫グロブリン源は、ヒト起源であるこ
とが好ましく、任意のイソ型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、また
はＩｇＤ）由来であり得る。単離Ｆｃ分子の調製法の１つには、抗体の抗原およ
び非抗原結合部分を分離するためのパパインでの抗体の消化が含まれる。単離Ｆ
ｃ分子の別の調製法は、組換えＤＮＡ発現後の発現Ｆｃ分子の精製による産生で
ある。全長Ｆｃは、以下のＩｇ重鎖領域からなる：Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ ３（Ｃ_Ｈ１およびＣ_Ｈ２領域は、典型的には、可動性ヒンジ領域で結合されてい
る）。１つの実施形態では、Ｆｃは、図１に記載の配列などのＩｇＧ１のアミノ
酸配列を有する。用語「Ｆｃタンパク質」、「Ｆｃ配列」、「Ｆｃ分子」、「Ｆ
ｃ領域」、および「Ｆｃ部分」は、「Ｆｃ」と同一の意味を有すると解釈される
。

【００２７】 ＦｃまたはＯＰＧポリペプチドもしくはその融合ポリペプチドと関連して使用
する場合、用語「フラグメント」は、ＦＣまたはＯＰＧポリペプチドの全長アミ
ノ酸配列未満を含むペプチドまたはポリペプチドをいう。このようなフラグメン
トは、例えば、アミノ末端の短縮、カルボキシ末端の短縮、および／またはアミ
ノ酸配列由来の残基の内部欠失によって得ることができる。ＯＰＧまたはＦｃフ
ラグメントは、選択的ＲＮＡスプライシングまたはｉｎ ｖｉｖｏプロテアーゼ
活性に起因し得る。

【００２８】 ＦｃもしくはＯＰＧポリペプチドまたはその融合ポリペプチドに関連して使用
される場合、用語「変異型」は、未変性のＦｃまたはＯＰＧポリペプチドのアミ
ノ酸配列と比較して、１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、および／または
付加を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドをいう。変異型は、天然に存在する
か人工的に構築され得る。本発明の変異型を、その変異型をコードする対応核酸
分子から調製することができるので、未変性のＦｃまたはＯＰＧポリペプチドの
ＤＮＡ配列と異なるＤＮＡ配列を有する。

【００２９】 ＦｃまたはＯＰＧポリペプチドもしくはその融合ポリペプチドと関連して使用
される場合、用語「誘導体」は、例えば、１つまたは複数のポリマー（水溶性ポ
リマー、Ｎ結合またはＯ結合炭水化物、糖、リン酸塩、および／または他のこの
ような分子が含まれるが、これらに限定されない）の共有結合によって化学修飾
されているＦｃまたはＯＰＧポリペプチド変異型もしくはそのフラグメントをい
う。誘導体は、ポリペプチドに結合している分子の型または位置のいずれかにお
いて未変性のＦｃまたはＯＰＧと異なる様式で修飾されている。誘導体には、さ
らに、ＦｃまたはＯＰＧポリペプチドに天然に結合した１または複数の化学基の
欠失が含まれる。

【００３０】 用語「融合」は、ペプチドまたはタンパク質セグメントの結合末端を相互に直
接調節することができるか、アミノ酸残基または他の結合基などのリンカーまた
はスペーサーによって分離することができる、遺伝的または化学的方法による異
なるペプチドまたはタンパク質の結合をいう。

【００３１】 ポリペプチド 本発明は、ＯＰＧ融合ポリペプチドおよびその組成物、より詳細には、ＯＰＧ
およびＦｃ部分を含む融合ポリペプチドを提供する。Ｆｃ領域のＯＰＧポリペプ
チドへの融合を、ＯＰＧのアミノ末端で作製することができる（すなわち、Ｆｃ
領域のカルボキシ末端をＯＰＧのアミノ末端に融合する）。本明細書中では、こ
れらの融合タンパク質（およびこれをコードする核酸）を、ＦｃＯＰＧと呼ぶ。
ＯＰＧのカルボキシ末端のＦｃ領域のアミノ末端への融合も望ましいであろう。
本明細書中では、この融合タンパク質（およびそれをコードする核酸）を、ＯＰ
ＧＦｃと呼ぶ。

【００３２】 Ｆｃまたはその変異型、フラグメント、もしくは誘導体は、Ｉｇクラス由来で
あり得る。１つの実施形態では、Ｆｃは、ＩｇＧクラス（ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、
ＩｇＧ_３、およびＩｇＧ_４など）である。別の実施形態では、ＦｃはＩｇＧ１由
来である。Ｆｃはまた、任意の２つまたはそれ以上のＩｇクラスの組み合わせ（
ＩｇＧ_１およびＩｇＧ_２由来の残基またはＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、およびＩｇＧ_３ 由来の残基）によって示されるアミノ酸残基を含み得る。１つの実施形態では、
ＯＰＧ融合タンパク質のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１のヒンジ、Ｃ_Ｈ２、およびＣ _Ｈ ３領域を含む図１に記載の配列（配列番号１）を有する。（Ｅｌｌｉｓｏｎら
、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１０、４０７１〜４０７９、１９８
２を参照のこと）。

【００３３】 Ｆｃ領域中に天然に存在する変形に加えて、Ｆｃ変異型、フラグメント、およ
び誘導体は、例えば、未変性または天然に存在するＦｃ中の残基または配列の置
換、付加、挿入、または欠失の導入、または化学修飾によるＦｃ部分の修飾など
によって構築されるＦｃの天然に存在しない変化を含み得る。一般に、Ｆｃ変異
型、フラグメント、および誘導体は、ＯＰＧへのＦｃ融合物の循環半減期の増加
がより長く維持されるように調製される。

【００３４】 本発明によれば、保存的アミノ酸置換を用いたＦｃ変異型もまた得られる。用
語、「保存的アミノ酸置換」は、置換部分でのアミノ酸残基の極性または電荷の
変化に対する影響がほとんどないか全く無い未変性アミノ酸残基の非自然残基と
の置換をいう。例えば、保存的置換は、ポリペプチド中の無極性残基の任意の他
の無極性残基との置換に起因する。保存的アミノ酸置換の原則を、表Ｉに示す。

【００３５】

【表１】

【００３６】 保存的アミノ酸置換はまた、生物系における合成よりも化学的なペプチド合成
によって典型的に組み込まれる天然に存在しないアミノ酸残基を含む。これらに
は、ペプチド模倣物およびアミノ酸部分の他の逆転または逆位形態が含まれる。
アミノ酸配列に対する保存的修飾（および対応コードヌクレオチドへの修飾）に
より、未修飾ＦｃおよびＦｃＯＰＧタンパク質と類似の機能的および化学的特徴
を有するＦｃ分子（およびＦｃＯＰＧ融合タンパク質）が産生されると予想され
る。

【００３７】 表Ｉに記載の置換に加えて、Ｆｃ領域（またはＦｃＯＰＧ融合タンパク質）中
の任意の未変性残基を、「アラニンスキャニング変異誘発」（Ｃｕｎｎｉｎｇｈ
ａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４、１０８１〜１０８５、１９８９）に以前に記
載されているように、アラニンと置換することができる。

【００３８】 Ｆｃ分子（およびＦｃＯＰＧ融合タンパク質）の機能的および／または化学的
特徴の実質的な修飾を、（ａ）置換領域中の分子バックボーン構造（例えば、シ
ートまたはらせん状の高次構造）、（ｂ）分子の標的部位の電荷または疎水性、
または（ｃ）側鎖の大部分の維持効果に有意に異なる置換の選択によって行うこ
とができる。以下の一般的な側鎖の性質に基づいて、天然に存在する残基を分類
することができる： １）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、 ２）中性で親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、 ３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、 ４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、 ５）鎖の方向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、および ６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【００３９】 非保存性置換は、これらのクラスのメンバーの１つと別のクラス由来のメンバ
ーとの交換を含み得る。このような置換残基を、非ヒトＦｃまたはＯＰＧと相同
的なＦｃまたはＯＰＧ分子領域または分子の非相同性領域に移入することができ
る。

【００４０】 ジスルフィド架橋の形成を防止するために、Ｆｃ分子中のシステイン残基を欠
失させるかまたは他のアミノ酸と置換することができる。特に、図１（配列番号
１）の第５位のシステインを、アラニンまたはセリンなどの１つまたは複数のア
ミノ酸と置換することができる。あるいは、第５位のシステイン残基を、欠失さ
せることができる。

【００４１】 Ｆｃフラグメントを、図１（配列番号１）に示した任意の部位（１、２、３、
４、および５位）での１つまたは複数のアミノ酸の欠失によって調製することが
できる。１つの実施形態では、第１位〜第５位に含まれるアミノ酸を欠失させる
。これらの位置での置換も行うことができ、これは、本発明の範囲内である。

【００４２】 抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）および補体の活性化などのエフェクター機能
を誘発するＦｃレセプターへの結合を減少させるＦｃ変異型を作製することもで
きる。このような変異型には、第２０位のロイシンの欠失またはグルタミン残基
との置換、第１０３位のグルタミン酸の欠失またはアラニン残基との置換、およ
び第１０５位および第１０７位のリジンの欠失またはアラニン残基との置換（図
１に記載の番号に従う）を含み得る。１つまたは複数のこのような置換が意図さ
れる。

【００４３】 １つの実施形態では、Ｆｃ変異型は、未変性Ｆｃと比較してＦｃレセプター（
「サルベージレセプター」）とのより強力な結合およびより長い循環半減期を示
す。このような変異型の例には、図１（配列番号１）に示した１つまたは複数の
残基３３、３５〜４２、５９、７２、７５、７７、９５〜９８、１０１、１７２
〜１７４、２１５、および２２０〜２２３でのアミノ酸置換（この置換により、
Ｆｃ変異型のＦｃＯＰＧレセプターへの結合が強化される）が含まれる。

【００４４】 他のＦｃ変異型には、１つまたは複数のチロシン残基の例えばフェニルアラニ
ン残基との置換が含まれる。さらに、他の変異型アミノ酸の挿入、欠失、および
／または置換もまた意図され、これは本発明の範囲内である。例として、ＷＯ９
６／３２４７８およびＷＯ９７／３４６３０（本明細書中で参考として援用され
る）に開示のＦｃ変異型が含まれる。さらに、あるいは、改変アミノ酸（ペプチ
ド模倣物またはＤ−アミノ酸など）の形態であり得る。

【００４５】 Ｆｃタンパク質は、化学薬品または種々の長さのアミノ酸である「リンカー」
部分によってＯＰＧタンパク質と結合させることができる。このような化学的リ
ンカーは、当該分野で周知である。アミノ酸リンカー配列には以下が含まれるが
、これらに限定されない： （ａ）ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ、 （ｂ）ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ、 （ｃ）ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ、 （ｄ）ｇｌｙ−ｇｌｙ、 （ｅ）ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ、 （ｆ）ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ、 （ｇ）ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ、 （ｈ）ｇｌｙ−ｐｒｏ−ｇｌｙ、 （ｉ）ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｐｒｏ−ｇｌｙ−ｇｌｙ、 （ｊ）ｖａｌ、 （ｋ）ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−
ｇｌｙ、 （ｌ）ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ａｌａ−ｇｌｙ−
ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−
ｇｌｙ−ｇｌｙ、 （ｍ）化学的部分、および （ｎ）（ａ）から（ｍ）までの下位部分の任意の組み合わせ。

【００４６】 本発明によって、ＯＰＧ変異型、フラグメント、および誘導体も得られ、これ
には、一般に、本明細書中に記載のように、修飾アミノ酸残基の特定の位置を除
いたＦｃ分子である。ＯＰＧ変異型、フラグメント、および誘導体は、ＰＣＴ
ＷＯ９７／２３６１４（本明細書中で参考として援用される）に記載されている
。

【００４７】 好ましい実施形態では、ＯＰＧ融合タンパク質のＯＰＧ部分は、ＯＰＧのカル
ボキシ末端を切断した形態である。ＯＰＧのカルボキシ末端を切断した形態は、
図２の１８６〜４０１の位置から１つ以上のアミノ酸が除去されたものである。
例えば、ＯＰＧ断片は、アミノ酸配列２２〜Ｘを含み、ここでＸは１８５〜４０
０までの任意の残基であり、別の実施形態では、ＯＰＧ断片はアミノ酸配列２２
〜Ｘを含み、Ｘは１８５〜２７８の任意の残基であり、または１８５〜２９３の
任意の残基、または１９４〜２７８の任意の残基、または１９４〜２９３の任意
の残基である。本明細書に記載されるＯＰＧの切断されたポリペプチドを含む融
合タンパク質は、直接またはスペ−サーまたはリンカー分子を介したＯＰＧおよ
び異種ペプチドまたはポリペプチド部分の結合を含み、ここでスペ−サーまたは
リンカーは１つ以上のアミノ酸残基を任意に含む。本明細書に記載されるＯＰＧ
の切断された形態の変異体または誘導体も本発明に包含される。

【００４８】 本発明の好ましい融合タンパク質としては、Ｆｃ領域に融合したＯＰＧ部分が
アミノ酸配列２２〜Ｘを含むものが挙げられ、ここでＸは、図２（配列番号２）
に示される番号で１９４〜２０１までの位置の任意の残基である。このような融
合タンパク質の例としては以下のものが挙げられる： ＯＰＧ［２２−１９４］−Ｆｃ（図３および配列番号３） ＯＰＧ［２２−２０１］−Ｆｃ（図４および配列番号４） ＯＰＧ［２２−１９４１−ＦｃΔＣ（図５および配列番号５） ＯＰＧ［２２−２０１］−ＦｃΔＣ（図６および配列番号６） ＯＰＧ［２２−１９４］−ＦｃＧ_１０（図７および配列番号７） ｍｅｔＦｃΔＣ−ＯＰＧ［２２−１９４］（図８および配列番号８） 上述の好ましいポリペプチドにおいて、用語「Ｆｃ」は図１に示すヒトＩｇＧ _１ の配列（配列番号１）を意味し、用語「ＦｃΔＣ」はアミノ酸残基１〜５が欠
けた図１の配列（配列番号１）を意味し、用語「ＦｃＧ」はアミノ酸残基１〜９
を欠きｓｅｒ−（ｇｌｙ）_８リンカーを有するＦｃ部分を意味する。

【００４９】 核酸分子 ＯＰＧ融合タンパク質、あるいはその変異体、フラグメント、または誘導体を
コードする核酸分子が本発明によって提供される。本発明の核酸分子は、指定部
位突然変異誘発、ＰＣＲ増幅、または他の好適な方法を使用して生成することが
でき、この場合プライマーは所望の変異を有する。突然変異生成法に関しては、
サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験マニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ）、コールド・スプリングス・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コール
ド・スプリングス・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ）、ニ
ューヨーク（１９８９））、およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（最新分子
生物学プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ワイリー・アンド・サンズ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ
Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク（１９９４））を参照されたい。エンゲルス（Ｅｎｇ
ｅｌｓ）ら（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．２８，７１６−７３４（
１９８９））の開示する方法を使用する化学合成もこのような変異体の調製に使
用することができる。当業者に公知である他の方法も使用することができる。

【００５０】 一部の実施形態では、核酸変異体は、所与の宿主細胞においてＯＰＧ融合ポリ
ペプチドの発現が最適となるように変更したコドンを含む。特定のコドンの変更
は、発現のために選択したＯＰＧ融合ポリペプチドおよび宿主細胞に依存する。
このような「コドンの最適化」は、例えば、所与の宿主細胞で高率で発現される
遺伝子に使用することが好ましいコドンを選択する、などの種々の方法によって
行うことができる。「Ｅｃｏｈｉｇｈ．Ｃｏｄ」などの細菌遺伝子でよく発現さ
れるコドン優先傾向のコドン頻度分布表を含むコンピューターアルゴリズムを使
用することができ、これはウィスコンシン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）パッケージ・バージョン９．０（Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒ
ｓｉｏｎ ９．０）、ジェネティック・コンピューター・グループ（Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）（マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウ
ィスコンシン）より提供される。他の有用なコドン頻度分布表としては、「Ｃｅ
ｌｅｇａｎｓ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｌｏｗ．ｃｏｄ」、
「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏ
ｄ」、「Ｍａｉｚｅ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、および「Ｙｅａｓｔ＿ｈｉｇｈ．ｃ
ｏｄ」が挙げられる。実施形態の１つでは、コドン最適化は、融合ポリペプチド
のＯＰＧまたはＦｃ部分のいずれかで行うことができる。

【００５１】 別の実施形態では、核酸分子は、前述の定義の保存的アミノ酸置換を有するＯ
ＰＧ融合タンパク質変異体をコードする。例えば、保存的アミノ酸置換は、融合
タンパク質のＯＰＧおよび／またはＦｃ部分で行われる。１つ以上のＮ−連結ま
たはＯ−連結グリコシル化部位の付加および／または欠失を含むＦｃまたはＯＰ
Ｇ変異体、または前述のＦｃまたはＯＰＧポリペプチドフラグメントを含むＦｃ
またはＯＰＧ変異体も提供される。本発明の核酸分子は、本明細書に記載される
Ｆｃおよび／またはＯＰＧ変異体、フラグメント、および融合ポリペプチドの任
意の組み合わせをコード可能であることを理解されたい。

【００５２】 ベクターおよび宿主細胞 ＯＰＧ融合タンパク質をコードする核酸分子は、標準的な連結技術を使用して
適当な発現ベクターに挿入される。通常、ベクターは使用する特定の宿主細胞に
対して機能的であるように選択される（すなわち、ベクターは、遺伝子の増幅お
よび／または遺伝子の発現が起こりうるように宿主細胞の機構と適合性がある）
。Ｆｃ−ＯＰＧタンパク質をコードする核酸分子は、原核生物、酵母、昆虫（バ
キュロウイルス系）および／または真核生物の宿主細胞において増幅／発現が可
能である。宿主細胞の選択は、ＯＰＧ融合タンパク質が翻訳後修飾（例えば、グ
リコシル化および／またはリン酸化）されるかどうかに部分的には依存する。そ
のようなことが起こる場合には、酵母、昆虫、または哺乳動物の宿主細胞が好ま
しい。

【００５３】 通常、任意の宿主細胞に使用される発現ベクターは、プラスミドの維持のため
の配列、および外因性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列
を含む。一部の実施形態において一括して「フランキング配列」と呼ばれるこの
ような配列は、以下のヌクレオチドの１つ以上を通常含む：プロモーター、１つ
以上のエンハンサー配列、複製開始点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプタ
ースプライシング部位を含む完全イントロン配列、分泌のリーダー配列、リボゾ
ーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現させるポリペプチドをコードする核酸
を挿入するためのポリリンカー領域、および選択可能なマーカー要素。

【００５４】 フランキング配列は、ＯＰＧおよび／またはＦｃタンパク質発現を調節する機
能を通常有する同種（すなわち宿主細胞と同じ種および／または株）、異種（す
なわち宿主細胞の種または株と異なる種）、雑種（すなわち２つ以上の起源のフ
ランキング配列の組み合わせ）、合成、または天然の配列であってよい。従って
、フランキング配列の供給源は、宿主細胞機構においてフランキング配列が機能
的であり活性化が可能であるのならば、任意の原核生物または真核生物、任意の
脊椎動物または無脊椎動物、または任意の植物であってよい。

【００５５】 宿主細胞外にＯＰＧ融合ポリペプチドを導くために、リーダー配列またはシグ
ナル配列を使用することができる。シグナル配列は、ＯＰＧ融合ポリペプチドコ
ード領域の５’末端に直接配置することが最も一般的である。多くのシグナル配
列が同定されており、そのうちの選択した宿主細胞において機能的である任意の
ものをＯＰＧ融合タンパク質をコードする核酸配列と併せて使用することができ
る。例えば、シグナル配列は、ＯＰＧまたはＦｃ遺伝子またはｃＤＮＡに対して
同種（天然）でも異種でもよい。さらに、シグナル配列は前述の方法を使用して
化学的に合成することができる。ほとんどの場合、シグナルペプチドの存在によ
って宿主からＯＰＧ融合ポリペプチド、特にＯＰＧとＦｃ部分の融合体が分泌さ
れると、融合ポリペプチドからシグナルペプチドが除去される。

【００５６】 シグナル配列はベクターの構成要素であってもよいし、あるいはベクターに挿
入されるＯＰＧ融合ポリペプチドをコードする核酸配列の一部であってもよい。
例えば、天然のＯＰＧＤＮＡは、タンパク質のアミノ末端のシグナル配列をコー
ドし、分子の翻訳後プロセッシング中に切断されて成熟タンパク質が形成される
。天然のシグナル配列を有するＯＰＧヌクレオチド、ならびに天然のシグナル配
列が除去され異種のシグナル配列で置き換えられたＯＰＧヌクレオチドも本発明
の範囲内に含まれる。選択される異種のシグナル配列は、宿主細胞によるシグナ
ルペプチダーゼによって認識されプロセッシングすなわち切断が行われるもので
あるべきである。本発明の一部は、ＷＯ９７／２３６１４号に記載されるＯＰＧ
シグナル配列であるシグナル配列に対して提供される。天然ＯＰＧシグナル配列
の認識およびプロセッシングが行われない原核生物宿主細胞の場合、シグナル配
列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定性エンテ
ロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列で置き換えら
れる。酵母分泌の場合、天然ＯＰＧシグナル配列を酵母インベルターゼ、α因子
、または酸性ホスファターゼリーダーによって置換することができる。哺乳動物
細胞の発現の場合、天然シグナル配列で十分であるが、他の哺乳動物のシグナル
配列も好適となりうる。

【００５７】 本発明の実施のために好ましいベクターは、細菌、昆虫、および哺乳動物の宿
主細胞と適合性のベクターである。このようなベクターとしては、特に、ｐＣＲ
ＩＩ、ｐＣＲ３、およびｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン・カンパニー（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）、サン・ディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ
）、カリフォルニア）、ｐＢＳＩＩ（ストラタジーン・カンパニー（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ラ・ホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ）、カリフォル
ニア）、ｐＥＴ１５ｂ（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）、マディソン（Ｍａｄｉ
ｓｏｎ）、ウィスコンシン）、ｐＧＥＸ（ファルマシア・バイオテック（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、
ニュージャージー）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、
パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）、カリフォルニア）、ｐＥＴＬ（ブルーバッ
クＩＩ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ）；インビトロジェン）、ｐＤＳＲα２（ＰＣＴ公
報第ＷＯ９０／１４３６３号）およびｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（ギブコ／ＢＲ
Ｌ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、グランド・アイランド（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ
）、ニューヨーク）が挙げられる。

【００５８】 さらなる可能なベクターとしては、限定するものではないが、コスミド、プラ
スミド、または変性ウイルスが挙げられるが、ベクター系は選択した宿主細胞と
適合性でなければならない。このようなベクターとしては、限定するものではな
いが、ブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）（登録商標）プラスミド誘導
体（高コピー数ＣｏｌＥ１系ファージミド、ストラタジーン・クローニング・シ
ステムズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．
）、ラ・ホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ）、カリフォルニア）、Ｔａｇ増幅ＰＣＲ生
成物のクローニング用に設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えば、Ｔ
ＯＰＯ（商標）ＴＡクローニング（Ｃｌｏｎｉｎｇ）（登録商標）キット（Ｋｉ
ｔ）、ＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体、インビトロジェン（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ）、カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、カリフォルニア）な
どのプラスミド、ならびに哺乳動物、酵母、またはウイルスのベクター、例えば
バキュロウイルス発現系（ｐＢａｃＰＡＫプラスミド誘導体、クロンテック（Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ）、パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）、カリフォルニア）が挙
げられる。組み換え分子は、形質転換、トランスフェクション、感染、電気穿孔
法、または他の公知の技術によって宿主細胞に導入することができる。ベクター
が構成され、ＯＰＧポリペプチドをコードする核酸分子がベクターの適切な部位
に挿入された後で、完成したベクターは、増幅および／またはポリペプチド発現
に好適な宿主細胞に挿入することができる。

【００５９】 宿主細胞は、原核生物宿主細胞（Ｅ．ｃｏｌｉなど）または真核生物宿主細胞
（酵母菌、昆虫細胞、または脊椎動物細胞など）でもよい。適切な条件で培養し
た場合、宿主細胞はＯＰＧポリペプチドを合成し、このポリペプチドは培地から
後で集めたり（宿主細胞が培地に分泌する場合）、産生する宿主細胞から直接集
めたりすることができる（分泌されない場合）。適当な宿主細胞の選択は、所望
の発現量、グリコシル化またはリン酸化などの活性に望ましいまたは必要なポリ
ペプチドの修飾、および生物学的活性分子への折り畳まれやすさなどの種々の要
因に依存する。

【００６０】 好適な宿主細胞または細胞株は、哺乳動物細胞でもよく、例えばチャイニーズ
ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１、およびウルラウブ（
Ｕｒｌａｕｂ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７，４
２１６−４２２０（１９８０））、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３または２９３Ｔ
細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、または３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ
１６５８）が挙げられる。好適な哺乳動物宿主細胞の選択、ならびに形質転換、
培養、増幅、スクリーニングおよび生成物の生成、および精製の方法は当技術分
野において公知である。他の好適な哺乳動物細胞株は、サルＣＯＳ−１およびＣ
ＯＳ−７細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、およびＣＶ−１細胞株（ＡＴ
ＣＣ番号ＣＣＬ７０）である。哺乳動物宿主細胞のさらなる例としては、形質転
換細胞株を含む霊長類細胞株および囓歯類細胞株が挙げられる。正常二倍体細胞
、一次組織のインビトロ培養由来の細胞株、ならびに一次外植片も好適である。
候補となる細胞は、選択遺伝子において遺伝子型が不完全であってもよいし、あ
るいは有意に作用する選択遺伝子を含んでいてもよい。他の好適な細胞株として
は、限定するものではないが、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウ
スＬ−９２９細胞、スイス由来の３Ｔ３細胞系、Ｂａｌｂ−ｃまたはＭＩＨマウ
ス、ＢＨＫまたはＨａＫハムスター細胞株が挙げられる。これらの細胞株のそれ
ぞれは当業者には公知であり入手可能である。

【００６１】 本発明に好適な宿主細胞として同様に有用なものは細菌細胞である。例えば、
Ｅ．ｃｏｌｉの種々の株（例えば、ＨＢ１０１、ＤＨ５ａ、ＤＨ１０、およびＭ
Ｃ１０６１）はバイオテクノロジーの分野において公知の宿主細胞である。Ｂ．
ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、他のＢａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．などの種々の細胞株もこの方
法で使用することができる。

【００６２】 当業者に公知の酵母細胞の多くの株も、本発明のポリペプチドの発現のための
宿主細胞として使用することができる。好ましい酵母細胞としては、例えばＳａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅが挙げられる。

【００６３】 さらに、希望するのであれば、昆虫細胞系も本発明の方法で使用することがで
きる。このような系は、例えばキッツ（Ｋｉｔｔｓ）ら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ，１４，８１０−８１７（１９９３））、ラックロウ（Ｌｕｃｋｌｏｗ）
（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４，５６４−５７２（１９９
３））およびラックロウ（Ｌｕｃｋｌｏｗ）ら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７，４５
６６−４５７９（１９９３））に記載されている。好ましい昆虫細胞はＳｆ−９
およびＨｉ５（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールズバッド（
Ｃａｒｌｓｂａｄ）、カリフォルニア）である。

【００６４】 選択した宿主細胞にＯＰＧ融合ポリペプチドを送るための発現ベクターの形質
転換またはトランスフェクションは、塩化カルシウム法、電気穿孔法、マイクロ
インジェクション法、リポフェクション法、またはＤＥＡＥ−デキストラン法な
どの公知の方法によって行うことができる。選択した方法は、使用する宿主細胞
の種類に一部依存する。これらの方法および他の好適な方法は当業者に公知であ
り、前述のサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らの文献などに記載されている。

【００６５】 ポリペプチド生成 形質転換またはトランスフェクションによってＯＰＧ発現ベクターを含む宿主
細胞は、当業者に公知の標準的培地を使用して培養することができる。培地は通
常、細胞の増殖および生存に必要なすべての栄養素を含む。Ｅ．ｃｏｉｌ細胞の
培養に好適な培地としては、例えば、ルリア・ブロス（Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ
）（ＬＢ）および／またはテリフィック・ブロス（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔ
ｈ）（ＴＢ）が挙げられる。真核生物細胞の培養に好適な培地は、ＲＰＭＩ １
６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥＭであり、これらのすべては培養する特定の細胞株によ
って要求される血清および／または増殖因子を加えることができる。昆虫の培養
に好適な培地は、イーストレート（ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）、ラクトアルブミン
加水分解物、および／またはウシ胎児血清を必要に応じて加えたグレース（Ｇｒ
ａｃｅ）培地（ギブコ・ライフ・テクノロジーズ（Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メ
リーランド）である。

【００６６】 通常、トランスフェクションまたは形質転換した細胞の選択的増殖に有用な抗
生物質または他の化合物が、サプリメントとして培地に加えられる。使用される
化合物は、宿主細胞の形質転換に使用したプラスミドに存在する選択マーカー要
素によって決まる。例えば、選択マーカー要素がカナマイシン耐性である場合は
、培地に加えられる化合物はカナマイシンであり、選択マーカー要素がアンピシ
リン耐性である場合は、培地に加えられる化合物はアンピシリンである。

【００６７】 宿主細胞の産生するＯＰＧ融合ポリペプチド量は、当技術分野で公知の標準的
方法を使用して評価することができる。このような方法としては、限定するもの
ではないが、ウエスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動、非変性ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分離、免疫沈降法、および／またはＤＮＡ結
合ゲルシフトアッセイなどの活性分析法が挙げられる。

【００６８】 タグを結合させずにＯＰＧ融合ポリペプチドが生成され、抗体も使用されない
場合は、他の公知の精製手順を使用することができる。このような手順としては
、限定するものではないが、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマ
トグラフィー、ＨＰＬＣ、ゲル溶離と組み合わせた未変性ゲル電気泳動、および
分取等電点電気泳動（「イソプライム（Ｉｓｏｐｒｉｍｅ）」装置／技術、フー
ファー・サイエンティフィック（Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））が挙
げられる。場合によっては、これらの方法の２つ以上を組み合わせて純度を増大
させることができる。

【００６９】 ＯＰＧ融合ポリペプチドが細胞内に産生される場合、この細胞内物質（グラム
陰性菌の場合は封入体が含まれる）は、当業者には公知である任意の標準的な技
術を使用して宿主細胞から抽出することができる。例えば、宿主細胞を溶解させ
て、フレンチプレス、均質化、および／または超音波処理の後の遠心分離などに
よってペリプラズム／細胞質の内容物を放出させることができる。

【００７０】 ＯＰＧ融合ポリペプチドがサイトゾル中の封入体を形成した場合、封入体は内
部および／または外部細胞膜と結合することが多く、従って遠心後のペレット状
物質中に主として存在する。次にこのペレット状物質の、極端なｐＨ値での処理
、またはアルカリｐＨでのジチオスレイトールまたは酸性ｐＨでのトリスカルボ
キシエチルホスフィンなどの還元剤の存在下で界面活性剤、グアニジン、グアニ
ジン誘導体、尿素、または尿素誘導体などのカオトロピック剤での処理によって
、封入体の放出、分解、および可溶化が可能となる。こうして溶解性形態となっ
たＯＰＧポリペプチドは次に、ゲル電気泳動法、免疫沈降法などを使用して分析
することができる。ＯＰＧ融合ポリペプチドの単離を希望する場合は、後述の方
法およびマーストン（Ｍａｒｓｔｏｎ）ら（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８２，２６
４−２７５（１９９０））の方法などの標準的方法を使用して単離することがで
きる。

【００７１】 場合によっては、ＯＰＧ融合ポリペプチドは、単離後に生物学的に活性となら
ない場合がある。「リフォールディング」すなわちポリペプチドの三次構造への
転化およびジスルフィド結合の形成のための種々の方法を使用して、生物学的活
性を回復させることができる。このような方法としては、可溶化したポリペプチ
ドを、カオトロープの特定濃度での存在下で通常７より大きいｐＨに曝露するこ
とが挙げられる。カオトロープの選択は、封入体の可溶化の場合に行われる選択
と非常に類似しているが、通常カオトロープはより低濃度で使用され、可溶化で
使用したカオトロープと必ずしも同一である必要はない。ほとんどの場合、タン
パク質のシステイン架橋を形成するジスルフィドシャッフリングが行われる特定
の酸化還元電位を発生させるために、リフォールディング／酸化溶液は還元剤、
または特定の比率の還元剤とその酸化形態を含むことができる。一般的に使用さ
れる酸化還元対の一部としては、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳ
Ｈ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）／ジチア
ンＤＴＴ、および２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）が
挙げられる。多くの場合、リフォールディングの効率を上昇させるために共溶媒
を使用したりあるいは必要となる場合があり、この目的のために使用されるより
一般的な試薬としては、グリセロール、種々の分子量のポリエチレングリコール
、アルギニンなどが挙げられる。

【００７２】 誘導体 本発明のＯＰＧ融合タンパク質、ならびにそれらの変異体およびフラグメント
は、１つ以上の化学的部分を結合させることによって誘導体化される。一例とし
て、ＯＰＧとＦｃポリペプチドの融合は、ＯＰＧまたはＦｃ部分のいずれかまた
はその両方を誘導体化することができる。これらの化学修飾された誘導体は、後
述するように動脈内、腹膜内、筋肉内、皮下、静脈内、経口、経鼻、肺、局所、
または他の投与経路のためにさらに調剤することができる。生物学的に活性のタ
ンパク質の化学修飾によって、治療タンパク質の安定性および循環時間の増加、
および免疫原性の低下など、ある状況ではさらなる利点が得られることが分かっ
た。米国特許第４，１７９，３３７号を参照されたい。レビューとしては、アブ
コフスキー（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ）らの「薬物としての酵素（Ｅｎｚｙｍｅｓ
ａｓ Ｄｒｕｇｓ）」を参照されたい。（Ｊ．Ｓ．ホルサーバーグ（Ｈｏｌｃ
ｅｒｂｅｒｇ）およびＪ．ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）編著、ｐｐ．３６７−３
８３（１９８１））；前述のフランシス（Ｆｒａｎｃｉｓ）ら。

【００７３】 このような誘導体化に好適な化学的部分は、種々の水溶性ポリマーから選択す
ることができる。当業者であれば、ポリマー／タンパク質複合体を治療に使用さ
れるかどうか、さらにそうである場合には所望の投与量、循環時間、タンパク質
加水分解に対する耐性、およびその他について考慮することによって所望のポリ
マーを選択することができる。本発明のタンパク質の場合、誘導体の有効性は、
所望の形態で（すなわち、浸透圧ポンプによって、より好ましくは注射または注
入によって、さらには例えば経口、肺、または経鼻送達用に調剤することによっ
て）誘導体を投与し、本明細書に記載のように生物学的効果を観察することによ
って確認することができる。

【００７４】 水溶性ポリマーは、例えば、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／
プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン
、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン
、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポ
リアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキ
ストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピ
レングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポ
リマー、ポリオキシエチル化ポリオール、およびポリビニルアルコールからなる
群より選択することができる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは
、水に対して溶解性であるために製造において有利となりうる。また、スクシネ
ートおよびスチレンも使用することができる。さらに、ポリアミノ酸は、血清ア
ルブミン（ヒト血清アルブミンなど）、または他のポリアミノ酸、例えばリシン
からなる群より選択することができる。

【００７５】 ポリマーは任意の分子量であってよく、分岐があってもなくてもよい。ポリエ
チレングリコールの場合、好ましい分子量は、取り扱いおよび製造の容易さから
約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａである（用語「約」は、ポリエチレングリコールの
調製の場合、一部の分子は記載の分子量よりも大きくなったり小さくなったりす
ることを示している）。

【００７６】 ＯＰＧ融合ポリペプチドと結合させるポリマー分子数は変動させることができ
、当業者であれば機能に対する影響を確認することができる。一誘導体化するこ
とができるし、あるいは同種または異種の化学的部分（例えば、ポリエチレング
リコールの分子量が異なるなどのポリマー）によって二、三、四またはその他の
誘導体化の組み合わせを得ることもできる。ポリマー分子とタンパク質（または
ペプチド）分子の比率は反応混合物の濃度に応じて変動する。一般に、最適な比
（過剰のタンパク質またはポリマーが存在しないと言う点における反応効率に関
して）は、所望の誘導体化の程度（例えば、一、二、三誘導体化など）、選択し
たポリマーの分子量、ポリマーが分岐しているかしていないか、および反応条件
などの要因によって決定される。

【００７７】 化学的部分は、タンパク質の機能的領域または抗原性領域への影響を考慮して
ＯＰＧ融合タンパク質と結合させるべきである。当業者であれば多数の結合方法
を利用することができる（欧州特許第０４０１３８４号（この記載内容を本明細
書に引用する）（ＰＥＧとＧ−ＣＳＦのカップリング）；マリク（Ｍａｌｉｋ）
ら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０，１０２８−１０３５（１９９２）（塩化ト
レシルを使用したＧＭ−ＣＳＦのＰＥＧ化が報告されている））。例えば、ポリ
エチレングリコールは、遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基（例えば、リシン
、アルギニン、またはＮ−末端残基）または遊離のカルボキシル基（例えば、グ
ルタミン酸、アスパラギン酸、またはＣ−末端残基）と共有結合することができ
る。遊離のスルフヒドリル基を有するアミノ酸残基（例えば、システイン）も使
用することができる。治療目的では、アミノ基との結合、例えばＮ−末端または
リシン基との結合が好ましい。受容体の結合に重要な残基での結合は、受容体の
結合が望ましい場合には避けるべきである。

【００７８】 Ｎ−末端化学修飾ＯＰＧ融合タンパク質が特に望ましくなりうる。化学的部分
の一例としてポリエチレングリコールを使用する場合、実質的にＮ−末端がＰＥ
Ｇ化されたＯＰＧ融合ポリペプチドの調製は、ポリペプチドを遊離アミノ基で誘
導体化し、ＰＥＧ化されたタンパク質分子の集団からＮ−末端がＰＥＧ化された
物質を分離することによって得ることができる。あるいは、特定のタンパク質の
誘導体化に使用できる異なる種類の１級アミノ基（リシンとＮ−末端）の反応性
の違いを利用する還元的アルキル化によって選択的にＮ−末端を化学修飾するこ
とができる。適当な反応条件下では、タンパク質のＮ−末端においてカルボニル
基含有ポリマーによる実質的に選択的な誘導体化が実現される。１つの反応性ア
ルデヒドを含有するポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドを使用するこ
とができる。

【００７９】 Ｎ−末端モノＰＥＧ化誘導体が、治療薬の製造の容易さのため好ましい。Ｎ−
末端ＰＥＧ化の場合は、ジ−、トリ−、または他の高次ＰＥＧ化生成物に対して
生成物の性質が単純であるために生成物の均一性が保証される。Ｎ−末端生成物
の調製のために還元的アルキル化を使用することは、工業的製造が容易であるた
めに好ましい。

【００８０】 ポリペプチドの使用 本発明の融合ポリペプチドは、骨質量の損失の予防および／または治療に使用
される。骨損失は以下のものを含む種々の症状で現われる： 骨粗鬆症、例えば原発性骨粗鬆症、内分泌性骨粗鬆症（甲状腺機能亢進症、上
皮小体機能亢進症、クッシング症候群、および先端巨大症）、骨粗鬆症の遺伝的
および先天的形態（骨形成不全症、ホモシスチン尿症、メンケス症候群、および
ライリー−デイ症候群）および四肢の固定化による骨粗鬆症；成人性および若年
性骨ページェット病（変形性骨炎）、または骨損失につながる骨の伝染性障害；
充実性腫瘍（乳房、肺、および腎）が原因の高カルシウム血症および悪性血液疾
患（多発性骨髄腫、リンパ腫、および白血病）、特発性高カルシウム血症、なら
びに甲状腺機能亢進症、上皮小体機能亢進症、類肉腫、および腎機能障害に関連
する高カルシウム血症；ステロイド投与で誘発され、小腸および大腸の疾患、な
らびに慢性肝臓および腎臓疾患と関連する手術後のオステオペニア；外傷と関連
する骨壊死、または骨細胞死、またはゴーシェ病、鎌状赤血球貧血、全身性エリ
テマトーデス、および他の症状と関連する非外傷性壊死；リウマチ様動脈炎によ
る骨損失；歯周骨損失；溶骨性転移；溶骨性関節炎；および補綴弛緩。

【００８１】 本発明の実施形態の１つでは、活性と循環半減期が増大するために、ＯＰＧ融
合ポリペプチドは、骨損失、特に悪性または転移性腫瘍が原因の骨の溶骨性破壊
による骨損失の治療に使用すると好都合である。本発明のＯＰＧ融合ポリペプチ
ドは、乳房、前立腺、甲状腺、腎、肺、食道、直腸、膀胱、頚部、卵巣、および
肝の癌、ならびに消化管の癌に関連する骨損失の治療に使用することができる。
多発性骨髄腫などのある種の悪性血液疾患、およびホジキン病などのリンパ腫と
関連する骨損失も含まれる。

【００８２】 医薬組成物 本発明は、ＯＰＧ融合タンパク質、ならびにそれらの変異体、フラグメント、
および誘導体の医薬組成物も提供する。このような医薬組成物は、注入、または
経口、肺、経鼻、経皮による投与用であってもよく、他の投与形態であってもよ
い。一般に、有効量の本発明のＯＰＧ融合タンパク質に、医薬上許容できる希釈
剤、保存剤、安定剤、乳化剤、賦形剤および／または担体を合わせたものを含む
医薬組成物も本発明に包含される。ＯＰＧ融合タンパク質の有効量または治療的
有効量は、後述の分析および手順によって測定される骨損失量または骨損失速度
を低下させるために十分な量である。

【００８３】 本発明の医薬組成物は、種々の緩衝成分（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩
、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤；界面活性剤および可溶化剤など
の添加剤（例えば、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０、ポリソルベート（Ｐｏｌｙ
ｓｏｒｂａｔｅ）８０）、酸化防止剤（例えば、アスクルビン酸、メタ重亜硫酸
ナトリウム）、保存剤（例えば、チメルソール（Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）、ベンジ
ルアルコール）および充填剤（例えば、ラクトース、マンニトール）；ポリ乳酸
、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の粒子状製剤に混入される物質、また
はリポソームに混入される物質を含む。ハイラウロン酸（ｈｙｌａｕｒｏｎｉｃ
ａｃｉｄ）も使用することができ、これは循環時間の持続を促進する効果が得
られる場合がある。このような組成物は、本発明のタンパク質および誘導体の物
理状態、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度に与える
場合がある。例えばレミントン薬学第１８版（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．）マック・パブ
リッシング（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）、イーストン、ペンシ
ルバニア（１９９０）、１４３５〜１７１２ページ（この記載内容を本明細書に
引用する）を参照されたい。本発明の組成物は液体の形態で作製することができ
るし、あるいは凍結乾燥形態などの乾燥粉末にすることもできる。移植可能な徐
放性製剤、および経皮的製剤も意図している。

【００８４】 経口用固体剤形も本発明での使用を意図しており、これらはレミントン薬学第
１８版（１９９０年）（マック・パブリッシング、イーストン、ペンシルバニア
１８０４２）の第８９章に概論が記載されており、この記載内容を本明細書に引
用する。固体剤形としては、錠剤、カプセル剤、丸剤、トローチまたはロゼンジ
、カシェ剤、またはペレット剤が挙げられる。また、リポソームまたはプロテイ
ノイドカプセル化も本発明の組成物の調剤に使用することができる（米国特許第
４，９２５，６７３号に開示されるプロテイノイドミクロスフィアなどとして）
。リポソームカプセル化を使用することができ、リポソームは種々のポリマーで
誘導体化することができる（例えば、米国特許第５，０１３，５５６号）。実現
可能な固体剤形の説明は、マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ），Ｋ．によって現代
製剤学（Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ）、Ｇ．Ｓ．バンカー（Ｂ
ａｎｋｅｒ）およびＣ．Ｔ．ローデス（Ｒｈｏｄｅｓ）編著、第１０章、１９７
９年、に記載されており、この記載内容を本め最初に引用する。一般に、製剤は
、ＯＰＧ融合タンパク質、あるいはそれらの変異体、フラグメント、または誘導
体と、胃環境で保護され腸で生物学的活性物質を放出することができる不活性成
分とを含む。

【００８５】 ＯＰＧ融合タンパク質は、誘導体の経口送達を効果的にするために任意に化学
修飾することができる。一般に、意図される化学修飾は、タンパク質（またはペ
プチド）分子自身への少なくとも１つの部分の結合であり、該部分によって（ａ
）タンパク質加水分解の防止、および（ｂ）胃または腸から血流への取込みが可
能となる。タンパク質全体の安定性の増大、および体内での循環時間の延長も望
まれる。このような部分の例としては、ポリエチレングリコール、エチレングリ
コールとプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デ
キストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、およびポリプロリ
ンが挙げられる。アブコフスキー（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ）およびデービス（Ｄ
ａｖｉｓ）、可溶性ポリマー−酵素付加体（Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ−
Ｅｎｚｙｍｅ Ａｄｄｕｃｔｓ）。「薬物としての酵素（Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｓ
Ｄｒｕｇｓ）」、ホーセンバーグ（Ｈｏｃｅｎｂｅｒｇ）およびロバーツ（Ｒ
ｏｂｅｒｔｓ）編著、ワイリー−インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−ｉｎｔｅｒ
ｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク、ニューヨーク州、（１９８１）、３６７〜３
８３ページ；ニューマーク（Ｎｅｗｍａｒｋ）ら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．４：１８５−１８９（１９８２）。使用可能な他のポリマーは、ポリ−１，
３−ジオキソランおよびポリ−１，３，６−チオキソカン（ｔｉｏｘｏｃａｎｅ
）である。前述のように医薬用途で好ましいものはポリエチレングリコール部分
である。

【００８６】 経口投与後の胃での分解に対する耐性を得るためには、少なくともｐＨ５．０
でのコーティング層不浸透性が重要である。経口製剤用の腸溶性コーティング層
として使用されるより一般的な不活性成分の例としては、酢酸トリメリット酸セ
ルロース（ＣＡＴ）、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ
Ｐ）、ＨＰＭＣＰ ５０、ＨＰＭＣＰ ５５、ポリビニルアセテートフタレート
（ＰＶＡＰ）、オイドラギット（Ｅｕｄｒａｇｉｔ）Ｌ３０Ｄ、アクアテリック
（Ａｑｕａｔｅｒｉｃ）、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、オイドラギット
Ｌ、オイドラギットＳ、およびシェラック（Ｓｈｅｌｌａｃ）が挙げられる。こ
れらのコーティング材料は混合フィルムとして使用することができる。

【００８７】 ＯＰＧ融合タンパク質は、粒子径約１ｍｍの顆粒またはペレットの形態の微小
複数粒子としての製剤に混入することができる。カプセル投与のための材料の製
剤は、粉末、軽く圧縮したプラグ、または錠剤であってもよい。

【００８８】 本発明の医薬組成物は、炭水化物、特にマンニトール、α−ラクトース、無水
ラクトース、セルロース、スクロース、変性デキストラン、およびデンプンなど
の希釈剤を含む。ある種の無機塩も無機塩として使用することができ、例えば三
リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム、および塩化ナトリウムなどが挙げられる
。市販の希釈剤の一部として、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ、エムデックス（Ｅｍｄｅｘ）
、ＳＴＡ−Ｒｘ １５００、エンコンプレス（Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ）、および
アビセル（Ａｖｉｃｅｌｌ）が挙げられる。

【００８９】 崩壊剤を固体製剤に混入することができる。崩壊剤として使用することができ
る材料としては、限定するものではないが、市販のデンプン系崩壊剤エクスプロ
タブ（Ｅｘｐｌｏｔａｂ）などのデンプンが挙げられる。グリコール酸デンプン
ナトリウム、アンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）、カルボキシメチルセルロ
ースナトリウム、ウルトラアミロペクチン（ｕｌｔｒａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ）
、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸性カルボキシメチルセ
ルロース、海綿、およびベントナイトもすべて使用することができる。他の形態
の崩壊剤としては、不溶性陽イオン交換樹脂が挙げられる。粉末ゴムも崩壊剤お
よび結合剤として使用することができ、寒天、カラヤゴム、またはトラガカント
ゴムなどの粉末ゴムを挙げることができる。アルギン酸およびそのナトリウム塩
も崩壊剤として有用である。

【００９０】 硬質錠剤用に結合剤を使用することができ、結合剤としてはアラビアゴム、ト
ラガカントゴム、デンプン、およびゼラチンなどの天然生成物による材料が挙げ
られる。他の物質としては、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（Ｅ
Ｃ）、およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が挙げられる。ポリビニル
ピロリドン（ＰＶＰ）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）
の両方は、治療薬の顆粒化のためのアルコール溶液に使用することができる。

【００９１】 製剤に加えることができる滑沢剤としては、限定するものではないが、ステア
リン酸のマグネシウム塩およびカルシウム塩を含めたステアリン酸、ポリテトラ
フルオロエチレン（ＰＴＰＥ）、流動パラフィン、植物油、および蝋が挙げられ
る。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、種々の分子量のポリ
エチレングリコール、カーボワックス（Ｃａｒｂｏｗａｘ）４０００および６０
００などの溶解性滑沢剤も使用することができる。

【００９２】 製剤時の薬物の流動特性を向上させ圧縮時の再構成を促進することができる流
動促進剤を加えることができる。流動促進剤としては、デンプン、タルク、火成
シリカ、および水和アルミノケイ酸が挙げられる。

【００９３】 ＯＰＧ融合タンパク質組成物の溶解を促進するために、界面活性剤を湿潤剤と
して加えることができる。界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、スル
ホコハク酸ジオクチルナトリウム、およびスルホン酸ジオクチルナトリウムなど
の陰イオン界面活性剤が挙げられる。陽イオン界面活性剤も使用することができ
、塩化ベンズアルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムを挙げることができる。界
面活性剤として使用することができる非イオン性界面活性剤としては、ラウロマ
クロゴール４００、ポリオキシル４０ステアレート、ポリオキシエチレン水素化
ヒマシ油１０、５０、および６０、グリセロールモノステアレート、ポリソルベ
ート４０、６０、６５、および８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロ
ース、およびカルボキシメチルセルロースが挙げられる。これらの界面活性剤は
、タンパク質または誘導体の製剤中に単独または異なる比率の混合物で存在する
ことができる。

【００９４】 ポリペプチドの取込みを向上させる可能性のある添加剤としては、例えば、脂
肪酸のオレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸が挙げられる。

【００９５】 制御放出製剤が望まれる場合もある。ＯＰＧ融合タンパク質は、拡散または浸
出機構のいずれかで放出されるゴムなどの不活性マトリックス中に混入すること
ができる。アルギン酸塩、多糖類などのゆるやかに劣化するマトリックスを製剤
に加えることもできる。この治療薬の制御放出の他の形態としては、オロス（Ｏ
ｒｏｓ）治療システム（アルザ（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐ．））、すなわち浸透圧効
果によって水が流入し小さな１つの開口部から薬物が放出される半透膜に薬物を
封入することによる方法が挙げられる。一部の腸溶性コーティング層も徐放効果
を有する。

【００９６】 製剤に他のコーティング剤を使用することができる。例えば、フィルムコーテ
ィング錠剤は、２つの異なる群からなる材料を含むことができる。第１の群は、
メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒ
ドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピ
ルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、プロビドン（ｐ
ｒｏｖｉｄｏｎｅ）、およびポリエチレングリコールなどの非腸溶性材料を含む
。第２の群は、一般にはフタル酸のエステルである腸溶性材料からなる。フィル
ムコーティングを最適に行うために混合した材料を使用することができる。フィ
ルムコーティングは、パンコーター、または流動床、または圧縮コーティングに
よって行うことができる。

【００９７】 本発明のタンパク質（またはそれらの誘導体）の肺送達も本発明で意図してい
る。タンパク質（または誘導体）は、吸入され肺上皮内層を通過することによっ
て哺乳動物の肺に送達される。この種類の他の報告としては、アジェイ（Ａｄｊ
ｅｉ）ら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７：５６５−５
６９（１９９０）；アジェイ（Ａｄｊｅｉ）ら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ６３：１３５−１４４（
１９９０）（酢酸ロイプロリド）；ブラケット（Ｂｒａｑｕｅｔ）ら、Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １
３（ｓｕｐｐｌ．５）：ｓ．１４３−１４６（１９８９）（エンドセリン−１）
；ハバード（Ｈｕｂｂａｒｄ）ら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍ
ｅｄｉｃｉｎｅ ３：２０６−２１２（１９８９）（α１−抗トリプシン）；ス
ミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１１４５−１１４
６（１９８９）（α１−プロテイナーゼ）；オスウェイン（Ｏｓｗｅｉｎ）ら、
「タンパク質のエアロゾル化（Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ）」、呼吸器薬物送達シンポジウム予稿集（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ
ｏｆ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ
ｉｖｅｒｙ）ＩＩ、キーストーン（Ｋｅｙｓｔｏｎｅ）、コロラド（Ｃｏｌｏｒ
ａｄｏ）、１９９０年３月（組み換えヒト成長ホルモン）；デブス（Ｄｅｂｓ）
ら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４０：３４８２
−３４８８（１９８８）（インターフェロンγおよび腫瘍壊死因子α）、および
米国特許第５，２８４，６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）が挙げられる。

【００９８】 本発明の実施において、治療用生成物の肺送達のために設計された広範囲の機
械装置も考慮しており、限定するものではないが、噴霧器、定量吸入器、および
粉末吸入器が挙げられ、これらのすべては当業者には公知である。

【００９９】 本発明の実施に好適な市販装置の具体例の一部としては、マリンクロット（Ｍ
ａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ．Ｉｎｃ．）（セント・ルイス、ミズーリ）製造のウル
トラバレント（Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ）噴霧器；マークエスト・メディカル・プロ
ダクツ（Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（エングルウ
ッド（Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ）、コロラド）製造のエイコーン（Ａｃｏｒｎ）ＩＩ
噴霧器；グラクソ（Ｇｌａｘｏ Ｉｎｃ．）（リサーチ・トライアングル・パー
ク（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ）、ノースカロライナ）製
造のベントリン（Ｖｅｎｔｏｌｉｎ）定量吸入器；およびフィソン（Ｆｉｓｏｎ
ｓ Ｃｏｒｐ．）（ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ）、マサチューセッツ）製
造のスピンハーラー（Ｓｐｉｎｈａｌｅｒ）粉末吸入器が挙げられる。

【０１００】 このような装置のすべては、ポリペプチドまたはポリペプチド製品の供給に適
した製剤の使用が必要である。通常、各製剤は、使用する装置の種類に固有のも
のであり、治療に有用な希釈剤、賦形剤、および／または担体以外に適当な噴射
剤を使用することもできる。

【０１０１】 ＯＰＧ融合タンパク質（または誘導体）は、肺末梢まで最も効率的に送達する
ためには平均粒径が１０μｍ未満、最も好ましくは０．５〜５μｍの粒子形態に
製剤すると最も好都合となる。

【０１０２】 担体としては、トレハロース、マンニトール、キシリトール、スクロース、ラ
クトース、およびソルビトールなどの炭水化物が挙げられる。製剤に使用される
他の成分としてはＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、およびＤＯＰＣを挙げること
ができる。天然または合成の枚面活性剤を使用することができる。ポリエチレン
グリコールを使用することができる（ＯＰＧ融合タンパク質の誘導体化に使用さ
れるもの以外で）。シクロデキストランなどのデキストランを使用することがで
きる。胆汁酸塩および他の関連賦活薬を使用することができる。セルロースおよ
びセルロース誘導体を使用することができる。アミノ酸を、緩衝液の成分などと
して使用することができる。リポソーム、マイクロカプセル、またはミクロスフ
ィア、それらの複合体、または他の種類の担体の使用も考慮している。

【０１０３】 ＯＰＧ融合タンパク質の経鼻送達も考慮している。経鼻送達によって、治療生
成物を鼻から投与した後で直接血流にタンパク質を送る経路ができるので、肺に
生成物を付着させる必要がない。経鼻投与用製剤としては、デキストランまたは
シクロデキストランを使用する製剤が挙げられる。他の粘膜を通過する送達も考
慮される。

【０１０４】 投与量 本発明ＯＰＧ融合ポリペプチドは、転移性骨疾患に関連する骨損失の予防およ
び／または治療のための治療的有効量が投与される。ＯＰＧ融合ポリペプチドの
「治療的有効量」は、骨質量の損失速度および／または程度を低下させる量であ
る。骨質量は、単一光子吸光法（ＳＰＡ）、二重光吸光法（ＤＰＡ）、二重エネ
ルギーＸ線吸光法（ＤＥＸＡ）、定量コンピュータ断層撮影法（ＱＣＴ）、およ
び超音波検査などの種々の公知の方法で測定される（ジョンストン（Ｊｏｈｎｓ
ｔｏｎ）ら執筆の、代謝性骨障害および鉱質代謝疾患入門第２版（Ｐｒｉｍｅｒ
ｏｎ ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｂｏｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｄ
ｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，２ｎｄ ｅ
ｄ．）Ｍ．Ｊ．ファブス（Ｆａｖｕｓ）編著、レイブン・プレス、１３７〜１４
６ページを参照されたい）。当業者であれば、これらの方法を使用してＯＰＧ融
合ポリペプチドの治療的有効量を求めることができる。血清オステオカルシン、
血清アルカリホスファターゼ、血清プロコラーゲンＩ延長ペプチド、尿または血
清コラーゲンのＣ−末端またはＮ−末端テロペプチド、尿カルシウム、ヒドロキ
シプロリン、ならびに尿ピリジノリンおよびデオキシピリジノリンなどの骨代謝
回転の生化学的マーカーの変化を測定することによって治療的有効量を求めるこ
ともできる。上記生化学的マーカーの量の損失が、骨の再吸収の損失と骨損失の
低下を示すと一般に理解されている。あるいは、ＯＰＧ融合ポリペプチドの治療
的有効量は、骨の機械的強度の変化、特に骨のねじり（ひねり）強さの増加を測
定することによって求めることもできる。

【０１０５】 一般に、ＯＰＧ融合ポリペプチドの治療的有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約
１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。ＯＰＧ
融合ポリペプチド、特にＯＰＧと免疫グロブリンＦｃ領域の融合体は半減期が延
長されたため、投与回数は、成熟未削除ＯＦＧポリペプチドなどの未修飾ＯＰＧ
よりも少ない。ＯＰＧ融合ポリペプチドは、１か月に約１回投与され、あるいは
、２か月ごとに１回、または３か月ごとに１回投与される。厳密な投与量および
投与回数は、製剤、投与経路、治療を行う症状などのいくつかの要因に依存し、
当業者であれば容易に決定可能であることは理解できるであろう。

【０１０６】 投与されたＯＰＧ融合タンパク質の量は、融合タンパク質に関する診断分析に
よって求めることができる。このような診断分析は抗体サンドイッチ分析などの
抗体分析の形態であってよく、この場合の抗体はＯＰＧ融合タンパク質と特異的
に結合するが内因性でもともと循環するＯＰＧとは結合しない。ＯＰＧ融合タン
パク質の量を測定するための抗体系分析は、当業者に公知の種々の方式で行うこ
とができる。

【０１０７】 以下の実施例は本発明のより詳細な説明のために提示されるが、本発明の範囲
を限定するために構成されるものではない。

【０１０８】 実施例１ ＯＰＧポリペプチドおよびＯＰＧ融合ポリペプチドの構築および発現 図２（配列番号２）に記載のＯＰＧ［１〜４０１］をコードする組換えプラス
ミドの構築は、ＷＯ９７／２３６１４（本明細書中で参考として援用される）に
記載されている。このプラスミドを哺乳動物宿主細胞中で使用して、図２（配列
番号２）に含まれるアミノ酸残基２２〜４０１を含む成熟全長ＯＰＧポリペプチ
ドを産生した。ＯＰＧ［１〜２０１］およびＯＰＧ［１〜２０１］−Ｆｃをコー
ドするプラスミドを、一般にＷＯ９７／２３６１４に記載のように構築した。こ
れらのプラスミドを使用して、ＯＰＧ［２２〜２０１］およびＯＰＧ［２２〜２
０１］−Ｆｃポリペプチドを産生した。

【０１０９】 ＯＰＧ［１〜１９４］を、オリゴヌクレオチド１７４５−９２および１７８９
−０４ならびにテンプレートとしてＯＰＧ ｃＤＮＡを使用してＰＣＲによって
構築した。センスプライマー（１７４５−９２）は、イニシエーターＡＴＧの前
にクローニング用のＸｂａＩ部位およびコンセンサスコザック配列を作製した。
アンチセンスプライマー（１７８９−０４）を、アミノ酸１９４およびクローニ
ング用のＳａｌＩ制限部位の後ろの終止コドンに置いた。このＰＣＲ産物を、ｐ
ＤＳＲα１９にクローン化して、ＯＰＧ［２２〜１９４］ポリペプチドの哺乳動
物発現用のｐＤＳＲα１９−ｈｕＯＰＧ［１〜１９４］を作製した。

【０１１０】 ＯＰＧ［１〜２９３］を、オリゴヌクレオチド１７４５−９２および１７４５
−９４ならびにテンプレートとしてＯＰＧ ｃＤＮＡを使用してＰＣＲによって
構築した。センスプライマー（１７４５−９２）は、イニシエーターＡＴＧの前
にクローニング用のＸｂａＩ部位およびコンセンサスコザック配列を作製する。
アンチセンスプライマー（１７８９−９４）を、アミノ酸２９３およびクローニ
ング用のＳａｌＩ制限部位の後ろの終止コドンに置いた。このＰＣＲ産物を、ｐ
ＤＳＲα１９にクローン化して、ＯＰＧ［２２〜１９３］の哺乳動物発現用のｐ
ＤＳＲα１９：ｈｕＯＰＧ［１〜１９３］を作製した。

【０１１１】

【化１】

【０１１２】 ＯＰＧ［１〜１９４］−ＦｃΔＣの構築 プラスミドｐＤＳＲα１９：ＯＰＧ［１〜１９４］−ＦｃΔＣを、ＯＰＧセグ
メントの３’末端の不対システインおよびＦｃセグメントの５’末端の不対シス
テインを取り除くために、ＰＣＲ法を用いてプラスミドｐＤＳＲα２：ＯＰＧ［
１〜２１０］−Ｆｃから構築した。次いで、このクローンを、ＰＣＲ用のテンプ
レートとして使用してＯＰＧドメインを得た。５’ＯＰＧプライマーには、イニ
シエーターＭｅｔコドン前にクローニング用のＸｂａＩ部位（ＴＣＴＡＧＡ）お
よび「ＣＣＡＣＣ」コザック配列を組み込んだ。３’ＯＰＧプライマーには、Ｆ
ｃドメインのクローニング用のＳａｌＩ部位（ＧＴＣＧＡＣ）を組み込んだ。Ｐ
ＣＲにより、ＯＰＧタンパク質の最初の１９４アミノ酸残基をコードする５９２
ｂｐのＯＰＧ遺伝子フラグメントが作製された。ＰＣＲ産物を、ＸｂａＩおよび
ＳａｌＩで切断し、ｐＤＳＲα１９にクローン化して最終構築物を作製し、これ
をプラスミドｐ６１５と呼ぶ。

【０１１３】

【化２】

【０１１４】 クローンｐＤＳＲα２／ＯＰＧ［１〜２０１］−Ｆｃをテンプレートとして使
用してＦｃドメインを得た。ＰＣＲにより、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメイ
ンを含むＦｃカルボキシ末端の２２７アミノ酸を作製した。５’Ｆｃプライマー
にはＳａｌＩ部位（「ＶＤ」をコードする）を組み込み、３’Ｆｃプライマーに
はＦｃ終結コドンの後ろにＸｈｏＩ部位（ＣＴＣＧＡＧ）を組み込んだ。Ｆｃ
ＰＣＲ産物をｐ６１５のＳａｌＩ部位にクローン化して、哺乳動物細胞中での発
現の際にＯＰＧ［２２〜１９４］−ＦｃｄＣを産生するｐＤＳＲα１９：ＯＰＧ
［１〜１９４］−ＦｃΔＣを得た。融合タンパク質は、Ｆｃ−ＯＰＧ接合部に余
剰バリンを含む。ＸｈｏＩ部位は、ライゲーション中に失われた。

【０１１５】

【化３】

【０１１６】 ＯＰＧ［１〜１９４］−ＦｃＧ１０の構築 Ｇ１０ヒンジ（１つのセリンおよび８つのグリシン残基）を有するＦｃ領域を
、プライマー１７７５−３０および１５０４−６３ならびにテンプレートとして
ＯＰＧ［１〜２０１］−Ｆｃ ｃＤＮＡを用いたＰＣＲによって構築した。産物
をｐＣＲｓｃｒｉｐｔ（ｐＣＲｓｃｒｉｐｔＦｃＧ１０ＢｓｐＥ）にサブクロー
ン化し、配列決定した。プライマー１７４５−９２および１７９０−７２ならび
にテンプレートとしてＯＰＧ［１〜２０１］−Ｆｃ ｃＤＮＡを使用したＰＣＲ
によって、ＯＰＧ［１〜１９４］を得た。ＰＣＲ産物をｐＣＲｓｃｒｉｐｔにサ
ブクローン化し、配列決定した。次いで、ＯＰＧ［１〜１９４］配列を含むＸｂ
ａＩ／ＢｓｐＥＩフラグメントおよびＧ１０ヒンジを有するＦｃを含むＥｓｐＥ
Ｉ／ＸｈｏＩフラグメントを、ｐＤＳＲα１９にサブクローン化した。このプラ
スミドは、哺乳動物細胞中での発現の際にＯＰＧ［２２〜１９４］−ＦｃＧ１０
を賛成する。アミノ酸配列を、図７に示す。

【０１１７】

【化４】

【０１１８】 ＦｃΔＣ−ＯＰＧ［２２〜１９４］の構築 ＦｃΔＣ−ＯＰＧ［２２〜１９４］をコードするＤＮＡ分子を、テンプレート
としてｐＤＳＲα２［１〜２０１］−Ｆｃ ｃＤＮＡを使用した標準的なＰＣＲ
によって作製した。Ｆｃ部分を、オリゴヌクレオチド１７５７−２２および１７
５７−２３を用いて作製した。１７５７−２２プライマーは、エリスロポイエチ
ンシグナル配列（このシグナル配列は、米国特許第４，７０３，００８号に記載
されている）より下流にＦｃを置くために、インフレームでＥｐｏ ＢｓｓＨＩ
Ｉシグナルを含む。１７５７−２３プライマーは、ヒトＯＰＧのアミノ酸残基２
２にＦｃドメインの最後のアミノ酸を融合させている。オリゴヌクレオチド１７
５７−２４および１７８９−０４を用いて、ＯＰＧ部分を作製した。１７８９−
０４プライマーを、ヒトＯＰＧのアミノ酸１９４およびクローニング用のＳａｌ
Ｉ部位の後ろの終止コドンに置く。次いで、これら２つの精製産物をテンプレー
トとして使用して、プライマー１７５７−２２および１７８９−０４を有するＦ
ｃ／ＯＰｇ融合分子を作製した。得られたＰＣＲ産物を、ＢｓｓＨＩＩおよびＳ
ａｌＩで消化し、精製し、ＢｓｓＨＩＩ／ＳａｌＩ消化ｐＤＳＲα１９にクロー
ン化した。このプラスミドの哺乳動物細胞中での発現により、アミノ末端メチオ
ニンがアミノ酸ａｌａ−ｐｒｏで置換された修飾を有する図８（配列番号８）に
示すＦｃΔＣ−ＯＰＧ［２２〜１９４］が産生される。

【０１１９】

【化５】

【０１２０】 ベクターｐＤＳＲα２は、以前に記載されている（ＷＯ９０／１４３６３およ
び本明細書中では図１２（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）
。ベクターｐＤＳＲα２１９は、ｐＤＳＲα２の修飾形態で、ｐＤＳＲα２と機
能的に類似しているが以下が異なる： １）αＦＳＨポリＡが３’末端から約１４００ｂｐ短かった。これは、８８５ｂ
ｐであり、ＮｄｅＩ部位の末端である。 ２）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）プロモーターを、５’から約１ｋｂ短く
し、２０９ｂｐのみを含む。 ３）ＤＨＦＲポリＡ中の約５５０ｂｐのＢｇｌＩＩフラグメントが欠失していた
。

【０１２１】 馴化培地からの短縮および融合ポリペプチドの精製条件は、一般に、ＷＯ９７
／２３６１４に記載されている。

【０１２２】 ｍｅｔ ＦｃΔＣ−ＯＰＧ［２２〜１９４］の構築 ｍｅｔ ｈｕＯＰＧ［２２〜１９４］コード配列を、以下の手順で構築した。
ＯＰＧのＤＮＡコード配列の上部および下部の全ての鎖を含む重複５０量体から
なる合成オリゴヌクレオチドを構築した。内部５０量体オリゴを、リン酸化し、
アニーリングし、一晩ライゲーションを行った。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ
）のプライマーとして外側のオリゴ（３４量体）を使用して、全長遺伝子を増幅
した。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびキット形態（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で供給されるさらなる反応成分を用いて、ＰＣＲ反応を行っ
た。得られた５８４塩基対のＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル電気泳動で精製
し、ＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム法（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲルから切り出
した。次いで、ゲル精製フラグメントを、制限酵素ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ（
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で消化した。上記フラグメントおよ
び同一の制限酵素を用いて消化したプラスミドベクターｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣ
受諾番号９８１１３）を用いて、ライゲーション反応を行った。ライゲートした
ＤＮＡを、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ３９３株に形質転換し
た。クローンをカナマイシン抗生物質耐性について選択し、プラスミドを単離し
、コード領域配列をＤＮＡ配列決定でチェックした。選択した最初のクローン（
プラスミドＡという）は、ＤＮＡ配列決定により遺伝子の中央に有意なエラーを
有することが示された。遺伝子配列を、制限酵素ＳｐｅＩおよびＨｐａＩでのプ
ラスミドＡの消化および得られた産物のベクターフラグメントとしての使用によ
って修復した。新規のインサートフラグメントを、ポリメラーゼ連鎖反応におけ
るＰＣＲプライマーとして内部オリゴヌクレオチド１４６６−９１および１４６
７−０３を用いた最初にライゲートしたオリゴヌクレオチドの混合物のＰＣＲに
よって調製した。インサートフラグメントを、ＳｐｅＩおよびＨｐａＩで消化し
、プラスミドＡベクターにライゲートして、エラーを含むＤＮＡフラグメントと
置換した。上記のように、形質転換、選択、およびプラスミドの単離を行った。
クローン（プラスミドＢ）は、ＤＮＡ配列決定によって、ヒトＯＰＧ［２２〜１
９４］の正確な配列を有することが確認された。

【０１２３】

【化６】

【０１２４】 上記のヒトＯＰＧ［２２〜１９４］ＤＮＡ配列のヒトＩｇＧ_１ ＦｃΔＣへの
融合を、以下のように行った。プラスミドｐＦｃ−Ａ３のＦｃ領域への上記のＯ
ＰＧ ＤＮＡコード配列のインサートを含むそのアミノ末端で融合したプラスミ
ドＤＮＡを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＳｐｅＩで消化した。プラスミドｐＦｃ−
Ａ３は、ＷＯ９７／２３６１４に記載されている。得られたプラスミドベクター
フラグメントは、最初の１４個の遺伝子コドン（ＳｐｅＩ部位まで）を差し引い
たＯＰＧコード配列を含んだ。これを、ベクターＣと呼ぶ。インサートを、ＷＯ
９８／２８４２７に記載の配列番号１３および配列番号１４に示したＤＮＡ配列
をテンプレートとして使用するポリメラーゼ連鎖反応によって作製した。プラス
ミドｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣ受諾番号９８１１３）の普遍５’プライマー（＃１
２０９−９５）を使用して、Ｆｃ配列の５’末端をプライムした（ＮｄｅＩ部位
は、Ｆｃ配列の最初に既に存在していた）。２つのオリゴヌクレオチドプライマ
ーを、Ｆｃコード配列の３’末端でプライムする一方でオステオプロテゲリン遺
伝子の５’末端と同一の重複領域を添加するように設計した。第１のプライマー
１５９５−１８を、Ｆｃコード配列の３’末端をプライムし、オステオプロテゲ
リン配列の５’末端の第１のコドンを添加するように設計した。第２のプライマ
ー１５８５−１６には、先に記載のプライマーの３’末端をプライムし、コドン
１４でＳｐｅＩを介してさらなるＯＰＧコード配列を添加した。テンプレートと
してＷＯ９８／２８４２７の配列番号１３および配列番号１４の配列を有するＤ
ＮＡ分子ならびに先に記載のＴａｑポリメラーゼを含むプライマー１２０９−８
５および１５９５−１８を用いて、ＰＣＲの最初のラウンドを行った。この反応
の７９９塩基対のＰＣＲ産物をゲル精製し、プライマー１２０９−８５および１
５８５−１６を用いる第２のＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。８２５
塩基対の第２のＰＣＲ反応産物をゲル精製し、ＮｄｅＩおよびＳｐｅＩで消化し
、上記のベクターＣにライゲートした。ライゲーション混合物をＥ．ｃｏｌｉに
形質転換し、クローンを単離し、ＤＮＡ配列決定によって正確なＯＰＧコード配
列を有していることを確認した。得られたプラスミドは、図８（配列番号８）に
示すアミノ酸配列を有する［ｍｅｔ］ＦｃΔＣ−ｈｕＯＰＧ［２２〜１９４］を
コードする。

【０１２５】

【化７】

【０１２６】 ｐＡＭＧ２１中の［ｍｅｔ］ＦｃΔＣ−ｈｕＯＰＧ［２２〜１９４］をコード
するＤＮＡ配列の発現を、一般にＷＯ９７／２３６１４に記載のように行った。
融合ポリペプチドを、従来の手順によって精製した。

【０１２７】 実施例２ ＯＰＧポリペプチドの活性 実施例１に記載の選択したＯＰＧポリペプチドおよびＯＰＧ融合ポリペプチド
のｉｎ ｖｉｖｏ活性を、以下のように同定した。ＯＰＧ調製物を、４〜５週齢
の雄ＢＤＦ１マウスに４日間皮下（ＳＣ）注射し、５日目にマウスの放射線透過
写真を撮影した。近位脛骨骨幹端における放射線密度が増加した正の結果を、賦
形剤治療コントロールと比較した。異なるコントロール脛骨と比較した各脛骨を
有するのは群あたり４動物であり、得られた結果に１〜８の番号を付けた。８つ
の結果のうち少なくとも５つは生物学的応答が起こったと結論付けるために正で
あることが必要であった。生物学的応答が得られた最低用量を、ｉｎ ｖｉｖｏ
効力の指標とみなす。全ての用量を、ｍｇ／ｋｇ／日で示す。短縮および全長Ｏ
ＰＧポリペプチドを用いた一日量実験を、表２に示す。ＯＰＧ融合タンパク質を
用いた一日量実験を、表３に示す。Ｎ末端メチオニン残基を有するＯＰＧポリペ
プチドおよびＯＰＧ融合ポリペプチドをＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞中で発現させた一
方で、Ｎ末端メチオニンを含まないＯＰＧポリペプチドおよびＯＰＧ融合ポリペ
プチドをＣＨＯ細胞中で発現させた。

【０１２８】

【表２】

【０１２９】

【表３】

【０１３０】 単回用量実験では、３〜４週齢の雄ＢＤＦ１マウスに、以下に示した種々の用
量のＯＰＧ融合タンパク質のキャリア（ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ）溶液を０日目
に単回皮下注射し、７日目（または５日目）にマウスをＸ線撮影した。各治療で
は、治療群およびＰＢＳ／０．１％ＢＳＡコントロール群の全てのマウスを、１
枚のフィルムにＸ線撮影した。上記のように正の結果を記録した。用量を、ｍｇ
／ｋｇで示す。結果を表４に示す。

【０１３１】

【表４】

【０１３２】 Ｆｃ領域に融合させたＯＰＧ短縮ポリペプチドは非融合ＯＰＧ短縮または全長
ポリペプチドよりも低い用量でｉｎ ｖｉｖｏ活性を示すことが明らかである。
さらに、ＯＰＧ［２２〜１９４］−ＦｃΔＣ（ＯＰＧ［２２〜１９４］ポリペプ
チドのカルボキシ末端でのＦｃ融合）は、ＦｃΔＣ−ＯＰＧ［２２〜１９４］（
ＯＰＧ［２２〜１９４］のアミノ末端でのＦｃ融合）よりも高いｉｎ ｖｉｖｏ
効力を示す。

【０１３３】 本発明は好ましい実施形態という点に関して記載しているが、変形形態および
修正形態が存在することが当業者に理解される。したがって、添付の特許請求の
範囲は、請求された本発明の範囲内で生じるこのような全ての等価な変形形態を
対象とすることが意図される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒトＩｇＧγ１のヒンジ、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３領域のアミノ酸配列（配列番
号１）を示す。

【図２Ａ】 ヒトＯＰＧ［１〜４０１］のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。

【図２Ｂ】 ヒトＯＰＧ［１〜４０１］のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。

【図３Ａ】 ＯＰＧ［２２〜１９４］−Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号３）を示す。

【図３Ｂ】 ＯＰＧ［２２〜１９４］−Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号３）を示す。

【図４Ａ】 ＯＰＧ［２２〜２０１］−Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号４）を示す。

【図４Ｂ】 ＯＰＧ［２２〜２０１］−Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号４）を示す。

【図５Ａ】 ＯＰＧ［２２〜１９４］−ＦｃΔＣのアミノ酸配列（配列番号５）を示す。

【図５Ｂ】 ＯＰＧ［２２〜１９４］−ＦｃΔＣのアミノ酸配列（配列番号５）を示す。

【図６Ａ】 ＯＰＧ［２２〜２０１］−ＦｃΔＣのアミノ酸配列（配列番号６）を示す。

【図６Ｂ】 ＯＰＧ［２２〜２０１］−ＦｃΔＣのアミノ酸配列（配列番号６）を示す。

【図７Ａ】 ＯＰＧ［２２〜１９４］−ＦｃＧ_１０のアミノ酸配列（配列番号７）を示す。

【図７Ｂ】 ＯＰＧ［２２〜１９４］−ＦｃＧ_１０のアミノ酸配列（配列番号７）を示す。

【図８Ａ】 ［ｍｅｔ］ＦｃΔＣ−ＯＰＧ［２２〜１９４］のアミノ酸配列（配列番号８）
を示す。

【図８Ｂ】 ［ｍｅｔ］ＦｃΔＣ−ＯＰＧ［２２〜１９４］のアミノ酸配列（配列番号８）
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 19/00 Ａ６１Ｐ 19/08 19/02 19/10 19/08 Ｃ０７Ｋ 14/47 19/10 16/46 Ｃ０７Ｋ 14/47 19/00 16/46 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ウツデン，スコツト・ケイ アメリカ合衆国、カリフオルニア・91362、 サウザンド・オークス、スウイート・ブラ イア・プレイス・1668 (72)発明者 マン，マイクル・ベンジヤミン アメリカ合衆国、カリフオルニア・91360、 サウザンド・オークス、ラグビイ・サーク ル・1506 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA04 CA10 GA11 HA01 4B064 AG01 CA19 CC24 DA01 4B065 AB01 BA02 CA24 CA44 4C084 AA02 AA07 BA01 BA08 BA22 BA23 CA62 DC50 NA14 ZA512 ZA672 ZA962 ZA972 4H045 AA10 AA20 AA30 BA41 CA40 EA28 FA74

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｒ_１−Ｒ_２、Ｒ_２−Ｒ_１、Ｒ_１−Ｌ−Ｒ_２及びＲ_２−Ｌ−Ｒ _１ （式中、Ｒ_１はＦＣタンパク質又はその変種若しくはフラグメントであり、Ｒ _２ はＯＰＧタンパク質又はその変種若しくはフラグメントであり、そしてＬはリ
   ンカーである）から成る群から選択される式で表されるタンパク質。
2. 【請求項２】 式Ｒ_２−Ｌ−Ｒ_１で表される請求項１に記載のタンパク質。
3. 【請求項３】 Ｆｃタンパク質が、 （ａ）図１に示すＦｃアミノ酸配列、 （ｂ）次に挙げる一つ又は複数の位置で異なるアミノ酸が置換されるか欠失し
   た部分配列（ａ）のアミノ酸配列（配列の位置番号は図１に従う）： （ｉ）一つ又は複数のシステイン残基、 （ｉｉ）一つ又は複数のチロシン残基、 （ｉｉｉ）５位のシステインを欠失させるかアラニンで置換、 （ｉｖ）２０位のロイシンを欠失させるかグルタミンで置換、 （ｖ）１０３位のグルタミン酸を欠失させるかアラニンで置換、 （ｖｉ）１０５位のリシンを欠失させるかアラニンで置換、 （ｖｉｉ）１０７位のリシンを欠失させるかアラニンで置換、 （ｖｉｉｉ）１、２、３、４及び５位の一つまたは複数のアミノ酸を欠失ま
   たは置換、 （ｉｘ）Ｆｃレセプター結合部位を除くために、一つまたは複数の残基を置
   換または欠失、 （ｘ）補体（Ｃ１ｑ）結合部位を除くために、一つまたは複数の残基を置換
   または欠失、及び （ｘｉ）部分配列ｉ〜ｘの組み合わせ、 （ｃ）Ｎ−末端にメチオニル残基を有する部分配列（ａ）又は（ｂ）のアミノ
   酸配列、 （ｄ）タンパク質構造に結合した化学的部分を含む部分構造（ａ）ないし（ｃ
   ）のいずれかのＦｃタンパク質又はその変種、フラグメント若しくは誘導体、 （ｅ）前記化学的部分が水溶性のポリマー構造である部分構造（ｄ）の誘導体
   、 （ｆ）前記水溶性ポリマー構造が、ポリエチレングリコールである部分構造（
   ｅ）の誘導体、及び （ｇ）前記水溶性ポリマー構造が、前記タンパク質構造のＮ−末端にのみ結合
   している部分構造（ｅ）の誘導体 から成る群から選択される請求項１に記載のタンパク質。
4. 【請求項４】 ＯＰＧタンパク質又はその変種、フラグメント若しくは誘導
   体が、 （ａ）図２（配列番号２）に示すように、Ｘが位置１８５ないし４０１までの
   いずれかの残基であるアミノ酸配列２２−Ｘ、 （ｂ）図２（配列番号２）に示すように、Ｘが位置１８５ないし２９３までの
   いずれかの残基であるアミノ酸配列２２−Ｘ、 （ｃ）Ｎ−末端にメチオニル残基を有する部分配列（ａ）及び（ｂ）のアミノ
   酸配列、 （ｃ）タンパク質構造に結合した化学的部分を含む部分構造（ａ）、（ｂ）及
   び（ｃ）のいずれかのＯＰＧタンパク質又はその変種、フラグメント若しくは誘
   導体、 （ｄ）前記化学的部分が水溶性のポリマー構造である部分構造（ｃ）の誘導体
   、 （ｅ）前記水溶性ポリマー構造が、ポリエチレングリコールである部分構造（
   ｄ）の誘導体、 （ｆ）前記水溶性ポリマー構造が、ポリアミノ酸構造である部分構造（ｄ）の
   誘導体、及び （ｇ）前記水溶性ポリマー構造が、前記タンパク質構造のＮ−末端にのみ結合
   している部分構造（ｄ）の誘導体 から成る群から選択される請求項１に記載のタンパク質。
5. 【請求項５】 リンカーが、グリシン、アスパラギン、セリン、スレオニン
   及びアラニンから成る群から選択される一つまたは複数のアミノ酸である請求項
   １に記載のタンパク質。
6. 【請求項６】 リンカーが： （ａ）ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ、 （ｂ）ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ、 （ｃ）ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ、 （ｄ）ｇｌｙ−ｇｌｙ、 （ｅ）ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ、 （ｆ）ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ、 （ｇ）ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ、 （ｈ）ｇｌｙ−ｐｒｏ−ｇｌｙ、 （ｉ）ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｐｒｏ−ｇｌｙ−ｇｌｙ、 （ｊ）ｖａｌ、 （ｋ）ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−
   ｇｌｙ、 （ｌ）ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ａｌａ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−
   ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−
   ｇｌｙ、 （ｍ）化学的部分、及び （ｎ）部分構造（ａ）ないし（ｍ）のいずれかの組み合わせ から成る群から選択される請求項１に記載のタンパク質。
7. 【請求項７】 図５、６、７又は８に示すアミノ酸配列（それぞれ配列番号
   ５、６、７、８）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む融合タンパク質
   。
8. 【請求項８】 Ｒ_１−Ｒ_２、Ｒ_２−Ｒ_１、Ｒ_１−Ｌ−Ｒ_２及びＲ_２−Ｌ−Ｒ _１ （式中、Ｒ_１はＦＣタンパク質又はその変種若しくはフラグメントであり、Ｒ_２ はＯＰＧタンパク質又はその変種若しくはフラグメントであり、そしてＬはリン
   カーである）から成る群から選択される式で表されるタンパク質をコードする核
   酸配列。
9. 【請求項９】 （ａ）図１（配列番号１）に示すＦｃアミノ酸配列、 （ｂ）次に挙げる一つ又は複数の位置で異なるアミノ酸が置換されるか欠失し
   た部分配列（ａ）のアミノ酸配列（配列の位置番号は図１に従う）： （ｉ）一つ又は複数のシステイン残基、 （ｉｉ）一つ又は複数のチロシン残基、 （ｉｉｉ）５位のシステインを欠失させるかアラニンで置換、 （ｉｖ）２０位のロイシンを欠失させるかグルタミンで置換、 （ｖ）１０３位のグルタミン酸を欠失させるかアラニンで置換、 （ｖｉ）１０５位のリシンを欠失させるかアラニンで置換、 （ｖｉｉ）１０７位のリシンを欠失させるかアラニンで置換、 （ｖｉｉｉ）１、２、３、４及び５位の一つまたは複数のアミノ酸を欠失ま
   たは置換、 （ｉｘ）Ｆｃレセプター結合部位を除くために、一つまたは複数の残基を置
   換または欠失、 （ｘ）補体（Ｃ１ｑ）結合部位を除くために、一つまたは複数の残基を置換
   または欠失、及び （ｘｉ）部分配列ｉ〜ｘの組み合わせ、 （ｃ）Ｎ−末端にメチオニル残基を有する部分配列（ａ）又は（ｂ）のアミノ
   酸配列、 （ｄ）タンパク質構造に結合した化学的部分を含む部分構造（ａ）ないし（ｃ
   ）のいずれかのＦｃタンパク質又はその変種、フラグメント若しくは誘導体、 （ｅ）前記化学的部分が水溶性のポリマー構造である部分構造（ｄ）の誘導体
   、 （ｆ）前記水溶性ポリマー構造が、ポリエチレングリコールである部分構造（
   ｅ）の誘導体、及び （ｇ）前記水溶性ポリマー構造が、前記タンパク質構造のＮ−末端にのみ結合
   している部分構造（ｅ）の誘導体 から成る群から選択されるＦｃタンパク質、変種、フラグメント又は誘導体部分
   を含むタンパク質をコードする請求項８に記載の核酸配列。
10. 【請求項１０】 （ａ）図２（配列番号２）に示すように、Ｘが位置１８５
    ないし４０１までのいずれかの残基であるアミノ酸配列２２−Ｘ、 （ｂ）図２（配列番号２）に示すように、Ｘが位置１８５ないし２９３までの
    いずれかの残基であるアミノ酸配列２２−Ｘ、 （ｃ）Ｎ−末端にメチオニル残基を有する部分配列（ａ）及び（ｂ）のアミノ
    酸配列、 （ｄ）タンパク質構造に結合した化学的部分を含む部分構造（ａ）、（ｂ）及
    び（ｃ）のいずれかのＯＰＧタンパク質又はその変種、フラグメント若しくは誘
    導体、 （ｅ）前記化学的部分が水溶性のポリマー構造である部分構造（ｄ）の誘導体
    、 （ｆ）前記水溶性ポリマー構造が、ポリエチレングリコールである部分構造（
    ｅ）の誘導体、 （ｇ）前記水溶性ポリマー構造が、ポリアミノ酸構造である部分構造（ｅ）の
    誘導体、及び （ｈ）前記水溶性ポリマー構造が、前記タンパク質構造のＮ−末端にのみ結合
    している部分構造（ｄ）の誘導体 から成る群から選択されるＯＰＧタンパク質、変種、フラグメント又は誘導体部
    分を含むタンパク質をコードする請求項８に記載の核酸配列。
11. 【請求項１１】 グリシン、アスパラギン、セリン、スレオニン及びアラニ
    ンから成る群から選択される一つ又は複数のアミノ酸のリンカーを含むタンパク
    質をコードする請求項８に記載の核酸配列。
12. 【請求項１２】 （ａ）ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ、 （ｂ）ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ、 （ｃ）ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ、 （ｄ）ｇｌｙ−ｇｌｙ、 （ｅ）ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ、 （ｆ）ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ、 （ｇ）ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ、 （ｈ）ｇｌｙ−ｐｒｏ−ｇｌｙ、 （ｉ）ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｐｒｏ−ｇｌｙ−ｇｌｙ、 （ｊ）ｖａｌ、 （ｋ）ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−
    ｇｌｙ、 （ｌ）ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ａｌａ−ｇｌｙ−
    ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−
    ｇｌｙ−ｇｌｙ、 （ｍ）化学的部分、及び （ｎ）部分構造（ａ）ないし（ｍ）のいずれかの組み合わせ から成る群から選択されるリンカーを有するタンパク質をコードする請求項８に
    記載の核酸配列。
13. 【請求項１３】 図５、６、７又は８に示すアミノ酸配列（それぞれ配列番
    号５、６、７、８）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む融合タンパク
    質をコードする核酸配列。
14. 【請求項１４】 請求項８ないし１３のいずれかに記載の核酸配列を含むベ
    クター。
15. 【請求項１５】 請求項１４に記載のベクターを含む原核宿主細胞または真
    核宿主細胞。
16. 【請求項１６】 適切な条件の下で、請求項１５に記載の宿主細胞を培養し
    、そして産生されたタンパク質を分離する工程から成る請求項１又は６に記載の
    タンパク質を製造する方法。
17. 【請求項１７】 さらに、産生されたタンパク質を精製する工程を含む請求
    項１６に記載の方法。
18. 【請求項１８】 製薬的に許容できる希釈剤、アジュバント又は担体に、請
    求項１または６に記載のタンパク質の有効量を含む製薬組成物。
19. 【請求項１９】 請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質の治療上効果
    的な量を投与することを含む哺乳動物の骨の損失を予防は治療する方法。
20. 【請求項２０】 骨の損失が、骨粗鬆症、ページェット病、骨髄炎、高カル
    シウム血症、外科手術又はステロイド剤の投与に関係する骨減少症、骨壊死、慢
    性関節リューマチによる骨損失、歯周骨損失、骨溶解性転移及び補綴弛緩（ｐｒ
    ｏｓｔｈｅｔｉｃ ｌｏｏｓｅｎｉｎｇ）から成る群から選択される請求項１９
    に記載の方法。