CN1313487C - 具有抗菌作用的免疫活性肽（Trpi） - Google Patents

Abstract

利用胰蛋白酶水解牛乳酪蛋白，筛选出具有抗菌活性的免疫活性肽，其分离纯化方法为：酶解液→加热灭酶→80%乙醇沉淀→离心→透析→两次SephadexG凝胶柱层析。因其酪氨酸含量较高，命名为“富含酪氨酸多肽(Try-rich polypeptide，简写为Trpi)，分析确定了其氨基酸序列。其工艺过程为：酪蛋白→粉碎→60目过筛→溶解→调整pH值为7.5→加热恒温45℃→加酶水解→水解液调整pH值为4.5→离心→上清液→调整pH值为7.5→加无水乙醇沉淀→上清液→薄膜真空浓缩→冷冻真空干燥→粉碎→包装。

Description

具有抗菌作用的免疫活性肽(Trpi)

技术领域    乳品生物技术

背景技术    乳是新生哺乳动物的主要食物来源，也是成年人饮食的一个重要组成部分。长期以来，乳蛋白仅仅被人们视为一种营养蛋白，为新生哺乳动物提供充足的能量和各种氨基酸，然而，近年来的研究结果表明，乳蛋白除其营养价值外，还是生物活性肽的重要来源。这些生物活性肽，均以无活性的状态存在于乳蛋白前体物中，只有用适当的酶水解后，它们的活性才被释放出来，从而才能发挥其生理功能。

乳蛋白生物活性肽的研究始于1979年。1979年，德国的Brantl.等人通过酶解牛乳酪蛋白得到了一些多肽产物，并证明它们具有类吗啡活性，从此，人们展开了生物活性肽方面的研究。经过20多年的逐步探索，到目前为止，人们已经发现了多种生物活性肽，如：类吗啡活性肽(Opioid peptides)，是研究最早的一类生物活性肽，具有类吗啡受体配体活性，能与机体内的类吗啡受体结合，具有止痛、止泻、抑制胃肠蠕动、增强机体对氨基酸和其它营养物质的吸收的功能；免疫活性肽(Immunopeptides)，能够增强机体免疫力，刺激机体淋巴细胞的增殖，增强巨嗜细胞的吞噬功能，提高机体抵御外界病原物质感染的能力，降低机体发病率，并具有抗肿瘤功能；抗血栓活性肽(Antithromboticpeptides)，能抑制血纤维蛋白原与血小板表面的特异性受体结合，具有抗凝血、抑制血栓形成的生理功能；酪蛋白磷酸肽(Caseinphosphopeptides，简称CPP)，能与多种矿质元素结合形成可溶性的有机磷酸盐，充当许多矿质元素特别是钙离子在体内运输的载体，促进小肠对钙离子和其他矿质元素的吸收；抗菌肽(Antimicrobial peptides)，是近年来发现并开始研究的一类生物活性肽，体外条件下能抑制细菌的生长，在体内具有类似抗生素的活性，能抑制小鼠感染致病的金黄色葡萄球菌；抗血栓转化酶抑制剂(Inhibitors ofantigiotensin-converting enzyme，简称CEI)，是一种多功能肽，具有调节血压、免疫防御和调节神经系统功能的活性。此外，近几年还有抗高血压肽(Antihypertensive peptides)、抗遗忘肽(Antiamnestic peptides)等生物活性肽的报道。

免疫活性肽是继类吗啡活性肽发现后首次从乳中获得并证明其生理活性的一类生物活性肽，免疫活性肽的研究始于1981年。1981年，Jolles.等首次报道，用胰蛋白酶水解人乳蛋白，从水解物中分离得到一种具有免疫活性的肽段，它的氨基酸序列是Val-Glu-Pro-Ile-Pro-Tyr，相当于人乳β-酪蛋白54-59的氨基酸残基序列，这个短肽，在体外试验中能增强小鼠腹腔巨噬细胞对绵羊红细胞的吞噬作用，静脉注射，则能增强小鼠抵抗肺炎克氏杆菌(Klebsiella.Pneumoniae)感染的能力。此后，科学家进行了大量免疫活性肽方面的研究。据报道，已从牛乳、人乳及植物蛋白中获得了39种不同序列的免疫活性肽，其中，牛乳蛋白来源的免疫活性肽有9种，其序列及来源如下：

氨基酸序列	来源及所在位置
		Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn	β-CNf63-68
Gly-Leu-Phe	α-LAf51-53
		Leu-Leu-Tyr	β-CNf191-193
Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp	αs1-CNf194-199
		Tyr-Gln-Gln-Pro-Val-Leu-Gly-Pro-Val-Arg	β-CNf193-202
Tyr Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile	β-CNf60-66
		Tyr-Gly	α-Lactorphin
Tyr-Gly-Gly	κ-CN氮末端
		Tyr-Gln-Gln-Pro-Val-Leu-Gly-Pro-Val-Arg-Gly-Pro-Phe-Pro-Ile-Ile-Val	β-CNf194-209

(备注：CN代表酪蛋白，LA代表乳清蛋白)

从广义上讲，免疫活性肽不仅指免疫活性肽(Immunopeptids)，还应该包括具有免疫活性的其他类生理活性肽，例如类吗啡肽，它是一种多功能肽，除了具有类吗啡活性外，它还具有免疫刺激活性，能够刺激机体淋巴细胞的增殖，增强机体免疫功能，此外，抗菌肽、乳转铁蛋白B、抗血栓转换酶抑制剂等生物活性肽也具有较强的免疫活性。

免疫活性肽发挥其生理功能的浓度极低，例如，二肽Tyr-Gly，在10^-11mol/L的浓度下，就能显著增强小鼠腹腔巨噬细胞对绵羊红细胞的吞噬作用，刺激淋巴细胞的增殖，提高小鼠抵抗肺炎克氏杆菌(Klebsiella.pneumoniae)感染的能力；Tyr-Gly-Gly作用的浓度更低，仅为10^-12mol/L。

自免疫活性肽被发现和得到系统研究以来，由于其活性检测方法比较麻烦，需要大做量的动物试验才能得出结论，而做动物试验的首要条件是要获得足够量的纯品。但是，到目前为止，免疫活性肽的研究仍处于实验水平，还没有一套较为有效的制备方法。所以，二十年来，免疫活性肽方面的研究进展比较缓慢。德国以Hans Meisel为首的联邦乳品研究中心(Federal Diary ResearchCenter)物化研究所(Institute for Chemistry and Physics)在这方面做了大量工作，发现了多种免疫活性肽并对其部分生物活性做了一定的检测，目前，正在进行深入研究。本发明专利利用胰蛋白酶水解牛乳酪蛋白，在此复合多肽中经超滤、冷乙醇提取、色谱等技术分离出一种具有抗菌作用，同时具有免疫活性的生物活性肽，对其序列进行了分析，经查询属于新型生物活性肽。

发明内容    本发明采用蛋白酶水解牛乳酪蛋白的方法制备免疫活性肽。在研究中，首先对不同蛋白酶(胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶)水解酪蛋白的规律进行研究。通过测定不同的底物浓度下，水解度随酶解时间的不同，绘制出不同底物浓度下酪蛋白的酶解曲线，然后通过对所绘出的曲线的分析，来寻找酪蛋白酶解底物浓度与水解度的关系，从而得出水解底物浓度与水解度的关系曲线。通过研究发现：(1)蛋白质类底物的水解与小分子类的底物的水解是不同的。因为蛋白质类底物水解的部分是肽键。(2)当底物浓度高时，粘度增加，蛋白质的活度降低。(3)识别的位点不同(蛋白质有许多个水解位点)，而和酶是多位点结合的，因而需要很多的酶来作用与底物，因而底物浓度要低一些。(4)通过酶的水解曲线来寻找最佳的底物浓度，该实验结果可为水解营养蛋白、贮藏蛋白并由此生产生物活性肽提供理论依据。

在免疫活性肽的制备、分离研究中，探索了多种蛋白酶如：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶和这几种蛋白酶的不同组合来筛选具有免疫刺激作用的酶解液，找到了具有免疫刺激作用的酶解液即酪蛋白的胰蛋白酶酶解液，进一步比较了不同酪蛋白浓度的胰蛋白酶酶解液抑菌活性大小，筛选出了最合适的底物浓度，结果表明，当酪蛋白的底物浓度为9％(w/v)，E∶S＝1∶120时，酶解液的抑菌作用最强。确定了具有免疫刺激作用的免疫活性肽肽分离纯化方法：酶解液→加热灭酶→80％乙醇沉淀→离心→透析→两次SephadexG凝胶柱层析。通过该方法可分离纯化到了具有免疫刺激作用的免疫活性肽，并经电泳证明了其纯度为单一组分。通过氨基酸组成分析，根据该免疫活性肽酪氨酸含量较高的特征，将此免疫活性肽命名为“富含酪氨酸多肽(Try-rich polypeptide，简写为Trpi)。本发明的免疫活性肽的氨基酸序列为：

Cys-Glu-Lys-Asp-Glu-Arg-Phe-Phe-Ser-Asp-Lys-Ile-Ala-Lys-Tyr-Ile-Pro-Ile-Gln-Tyr-Val-Leu-

Ser-Arg-Tyr-Pro-Ser-Tyr-Gly-Leu-Asn-Tyr-Tyr-Gln-Gln-Lys-Pro-Val-Ala-Leu-Ile-Asn-Asn-Gln-

Phe-Leu-Pro-Tyr-Pro-Tyr-Tyr-Ala-Lys

从本发明的免疫活性肽的氨基酸序列及其来源来看，这个免疫活性肽与以前所报导的过各种免疫活性肽序列不同，是一种新的免疫活性肽。另外，该免疫活性肽同时还具有抗菌作用，体外条件下能够较强地抑制大肠杆菌等细菌的生长。

具体实施方式  通过对酪蛋白酶解液中分离Trpi条件研究，找出最佳的除杂条件，并研究了乙醇提纯Trpi方法。其工艺过程为：

酪蛋白→粉碎→60目过筛→溶解→调整pH值为7.5→加热恒温45℃→加酶水解→水解液调整pH值为4.5→离心→上清液→调整pH值为7.5→加无水乙醇沉淀→上清液→薄膜真空浓缩→冷冻真空干燥→粉碎→包装

工艺参数：酪蛋白纯度    ≥90％以上

          粉碎粒度      ≤60目

          溶解液浓度    10％(w/v)

          酶与底物之比  1∶120

          水解温度      45℃

          水解时间      90-120min

Claims (3)

1、一种具有抗菌功能的免疫活性肽-Trip，其氨基酸序列为：Cys-Glu-Lys-Asp-Glu-Arg-Phe-Phe-Ser-Asp-Lys-Ile-Ala-Lys-Tyr-Ile-Pro-Ile-Gln-Tyr-Val-Leu-Ser-Arg-Tyr-Pro-Ser-Tyr-Gly-Leu-Asn-Tyr-Tyr-Gln-Gln-Lys-Pro-Val-Ala-Leu-Ile-Asn-Asn-Gln-Phe-Leu-Pro-Tyr-Pro-Tyr-Tyr-Ala-Lys。

2、权利要求1所述的免疫活性肽的制备方法，其特征是包括下述步骤：牛乳酪蛋白→胰蛋白酶酶解→加热灭酶→80％乙醇沉淀→离心→透析→两次SephadexG凝胶柱层析。

3、权利要求1所述的免疫活性肽的生产方法，其特征是包括下述步骤：酪蛋白→粉碎→60目过筛→溶解→调整pH值为7.5→加热恒温45℃→加酶水解→水解液调整pH值为4.5→离心→上清液→调整pH值为7.5→加无水乙醇沉淀→上清液→薄膜真空浓缩→冷冻真空干燥→粉碎→包装。