CN1310596A - 治疗剂的多光子光激活用的改进方法和装置 - Google Patents

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Abstract

本发明是用于处理特定体积的材料(128)、植物或动物组织的方法和装置,包括用至少一种光敏试剂处理材料(128)、植物或动物组织的步骤,其中特定体积的材料(128)、植物或动物组织保留了至少一种光敏试剂的至少一部分;然后用足以促进保留在特定体积的材料(128)、植物或动物组织中的所述至少一种光敏试剂中的至少一种试剂的多光子激发的光(122)处理该特定体积的材料(128)、植物或动物组织,其中至少一种光敏试剂在该特定体积的材料(128)、植物或动物组织中变得有活性。

Description

治疗剂的多光子 光激活用的改进方法和装置
相关材料的交叉参考
本申请是1996年10月30日提交的名称为“改进的分子试剂光激活中选择性用的方法”的U.S.专利申请No.08/739，801的后续申请。
发明领域
本发明一般涉及用于实现具有高度空间控制的选择性光激活一种或多种治疗剂的方法和装置。所教导的用于实现选择性光激活的方法运用了非线性光激发的特殊性质，以利用高度的空间和分子特性促进试剂从一个分子能态跃迁到另一个分子能态。本方法的特性适用于处理各种类型的材料，特别在治疗人体、动物和植物的疾病方面具有特殊的优势。尤其是，非线性激发方法的使用有助于利用从可见光到红外波长的光可控和治疗性地激活组织中的试剂，所述从可见光到红外波长的光比目前所用方法和光学辐射的吸收和散射程度都要更低。
发明背景
医学领域需要可以选择性地激活各种分子试剂的适应性强的方法，所述分子试剂用于各种治疗应用，包括光动力学治疗和局部外科手术。所希望的改进包括增强对激活位置和深度在空间和时间上的控制，减少不希望的激活和对其它共存或邻近试剂、组织或结构的损害，增加所希望的分子试剂优于其它非目标试剂的激活优先性。
自从二十世纪六十年代早期发现激光以来，人们已经预料到激光能提供这种选择性和适应性。例如，已经开发了利用激光辐射的特殊性能的各种线性和非线性光化学和光物理学方法，上述方法为某些应用提供了一些改进。关于医用激光的众多用途的典型综述〔见，例如Miller,Biophotonics Intern.9/10月(1997)50-51；Boulnois,Lasers Med.Sci.1(1986)47-66〕论证了光输出范围从连续波(CW)到超短脉冲束和跨越波长从紫外线(UV)和可见光到近红外(NIR)和红外(IR)的激光在范围从去除皮肤表面病症到精密的视网膜外科的医学治疗上的应用〔例如，Fisher等，Lasers Surg.Med.17(1995)2-31；Mourou等，U.S.专利5,656,186〕。而且，对激光能量在各种组织中的非特殊损害性质〔例如，Hammer等，IEEE J.Quant.Electron.32(1996)670-678〕的进一步的认识已经使专业人员可以设计用于最新激光源的更安全和更有效的用途。然而，一般来说，目前激光治疗方法的性能和适应性还低于人们的期望。特别是，需要改进的光激活方法，该方法可用于选择性地完成各种治疗过程，同时在应用于这些过程时提供改进的性能和适应性。
多年来已知可用光辐射来探测或转化分子试剂。例如，线性单光子光激发已被广泛地用于光动力学治疗(PDT)中的分子治疗剂的激活〔例如，Fisher等，Lasers Surg.Med.17(1995)2-31〕。用于这种激活的简化Jablonski图示于图1(a)中，其中当光敏试剂吸收了某一能量E1从量子力学所允许的较低能态Sm激发到量子力学所允许的较高能态Sn时，产生单光子激发(10)，所述能量E1由单光子P1与光敏试剂的相互作用提供。一般地，随后发生系统内部交叠Ⅸ，使被激发的试剂到达长寿命的激活态Tm，在这一激活态Tm发生光化学反应R1。在光动力学治疗R1的情况下，包括细胞毒素类的产生，例如单氧。令人遗憾地是，这种激发的性能并不象所希望的那样成功。例如，有足够的证据〔见Young,J.Photochem.Photobiol.B，6(1990)237-247〕说明，在一些普通治疗领域中使用光辐射P1本身能导致疾病和其它不希望的副作用。而且，主要是由于UV或可见光激活的光辐射的光散射和吸收效应，在分子治疗剂的线性光激发上的大多数尝试均受到不能达到期望穿透深度的困扰。
在许多实验室应用中已经使用了各种多光子光激发方法，以致力于实现在用于某些应用的光激活的选择性方面的特殊的改进，并提出了许多由单光子激发所造成的局限性。在这些方法中使用了范围从单一模式、连续波激光器到蜂值功率超过1GW的脉冲Q-开关激光器的激发源。许多尝试旨在将多光子激发方法用作利用光谱方法探测激发态性能或检测在强吸收母体，例如环境样本中存在的被分析物的方法。例如，同时双光子激发已被用作刺激在光密介质中的分子发射荧光的方法〔见Wirth和Lytle,Anal.Chem.49(1977)2054-2057；Fisher等，Appl.Spectrosc.51(1997)218-226〕。这种激活的通用机理示于图1(b)中，其中当光敏试剂吸收某一能量E1被激发时，发生同时双光子激发(12)，能量E1由双光子P’1和P'2与光敏试剂的同时联合相互作用提供。注意，如果两个光子P’1和P’2的能量相同，激发过程叫做“简并”。经常用寿命在10飞秒(fs)数量级或更少的瞬时虚拟能态Ⅴ作为中介来描述双光子同时反应。如果两个光子在该寿命时间内不反应，不会发生激发，试剂不会到达Sn。一旦试剂被激发到量子力学所允许的状态Sn，它的光化学和光物理学性质将与单光子激发(10)的结果相同。已经介绍了在显微镜中使用双光子激发(例如，Denk等，U.S.专利5,034,613)和其作为薄膜性质探测器的应用(例如，Chen和Van Der Meer,Biophys.J.64(1993)1567-1575)。看起来利用单一的脉冲激发源，例如与分子相互作用的两个光子具有相同的波长，已经完成了这项工作的主要部分(简并激发情况)。而且，也论证了非简并(双色)同时双光子激发〔例如，Lakowicz等，Photochem.Photobiol.64(1996)632-635〕。
较少见地，已经描述了探测分子光谱学的同时三光子激发，分子如氨〔例如，Nieman和Colson,J.Chem.Phys.68(1978)5656-5657〕、苯〔例如，Johnson,J.Chem.Phys.,64(1976)4143-4148；Johnson和Korenowsk,Chem.Phys.Lett.97(1983)53-56；Grubb等，J.Chem.Phys.81(1984)5255-5265；Cable和Albrecht,J.Chem.Phys.85(1986)3155-3164〕、丁二烯〔例如，Johnson,J.Chem.Phys.64(1976)4638-4644〕和氧化氮〔例如，Seaver等，J.Chem.Phys.87(1983)2226-2231〕，以及甚至已经看到同时四光子光谱学在分子研究中的较多限制的应用，分子如NO2〔例如，Rockney等，J.Chem.Phys.78(1983)7124-7131〕和丁二烯〔例如，McDiarmid和Auerbach,Chem.Phys.Lett.76(1980)520-524〕。已经有人介绍过这种多光子光谱学(光子数≤4)的一般理论〔见Andrews和ghoul,J.Chem.Phys.75(1981)530-538〕。最近，Lakowicz及合作者已经介绍了利用简并、同时三光子激发研究各种荧光团在凝固相的性质〔见Gryczynski等，Biophys.J.71(1996)3448-3453；Lakowicz等，Biophys.J.72(1997)567-578〕和可能用作光谱学的成像方法〔见Gryczynski等，Photochem.Photobiol.62(1995)804-808；Szmacinski等，Biophys.J.70(1996)547-555〕。
利用多光子激发的另外的工作试图利用复杂的多光子激发方法阐明试剂的物理和化学性质〔见Xing等人，J.Chem.Phys.194(1996)826-831；Wang等人，J.Chem.Phys.,105(1996)2992-2997〕，或者利用单或多时间或光谱特定的激光脉冲对激发态反应路径施行量子控制〔见；Flam,Science266(1994)215-217；Bardeen等，Chem.Phys.Lett.,280(1997)151-158；Service,Science279(1998)1847-1848；Zare,Science279(1998)1875-1879；Clary,Science279(1998)1879-1882〕。然而，所报道的这些多光子方法，通常需要分阶段的、顺序的应用光能超过10fs，以允许分子内部发生重排。图1(c)显示了这种多光子激活的一般图像，其中，当光敏试剂吸收某一能量E1首先激发到量子力学所允许的第一较高能态Sn时，发生3+2光子激发(14)，能量E1由三光子P1”,P2”和P3”与试剂的同时联合相互作用提供(这个相互作用介于两个虚拟能态V1”和V2”之间)。吸收某一附加能量E2后发生随后的激发，以促使试剂达到量子力学所允许的第二较高能态Sp，能量E2由试剂与两个附加光子P4”和P5”的相互作用提供。典型地，在所述两个阶段E1和E2之间存在一个瞬时延迟，经常用量子力学所允许的一个或多个能态，例如So作为第二激发过程的中介。
比较而言，当试剂在几个中间能态之间顺序地往复穿梭时，发生化学反应的光诱发量子控制，利用一个或多个激光脉冲，所述几个中间能态按照电子键合转变、驰豫和分子内能量转移在整个时间坐标内发生〔见Fisher等，Appl.Spectrosc.51(1997)218-226；Draumer等人，Science275(1997)54-57；Zhong等人，J.Am.Chem.Soc.119(1997)2305-2306〕，可以确信它们发生的时间范围在约100fs和1ps之间。图1(d)表示了这种多光子量子控制过程(16)的概括的图像，其中经过三个阶段E1,E2’和E3'发生激发，这三个阶段是由三个光子P1、P2和P3与试剂的顺序相互作用引起的。在该例中，第一光子P1用于将试剂激发到能态Sn，而第二个光子P2进一步将试剂激发到能态Sr。选择光子P3的提供时机，以便去激活试剂从Sr到Tq，产生一个反应态(因此导致化学反应R1’)，该反应态不是直接从Sm达到的。是图1(c)(14)和1(d)(16)显示的这种多光子过程的特征的时间延迟和多个量子力学所允许的中间态将这种多光子过程与图1(b)(12)显示的实质上单一阶段激发过程的同时激发过程区别开。
Draumer,Zhong,Bardeen和其它人的量子控制应用和其它特殊的激发方法已经说明了化学反应的两个时间范围：(a)发生在亚-ps时间范围的快范围，涉及分子内的电子迁移；和(b)发生在超-ps时间范围的慢速范围，涉及分子内的重排、键断开和分子间的相互作用。然而，由于通常快速过程的特征时间常数，如电子激发τex比诸如热转移的驰豫τrelax低得多，所以能在快速范围发生的过程明显不同于可能在慢速范围发生的过程。这暗示如果使用适中的快速激发过程，能实现激发，并且能在显著的驰豫过程(如键断开或热转移)之前完成最终的效果(如分子内电子迁移)。近来已经开始看到这种认识在光动力学治疗和激光烧蚀外科领域的应用。已经发现在整个时间内的激发明显长于在快速范围内的相互作用的需要，这保证了与所希望的光激活相当的光激活路径。然而，超过纳秒时间范围，例如，一个被激发的光动力学试剂可能吸收额外的会导致不希望的光化学转变的光子。通过使光动力学治疗剂转变成长寿命时间的系统毒性物质〔例如，Shea等，J.Biol.Chem.265(1990)5977-5982〕，这能使试剂变得对所希望的目的完全无用。而且，在慢速范围内的激发过程趋向于使能量泄漏进周围结合物或媒介中，这已经阻碍了反应的连续量子控制(由于能量泄漏远离所希望的结合物)，并且在烧蚀激光外科中导致附带组织损伤(由于能量泄漏进周围组织)。
能常规地产生超短脉冲的激光器，如锁模钛：蓝宝石激光器的出现，使激发基本上限定在快速范围，极大地提高了传送给所希望的治疗目标的能量的效率。这种脉冲的短暂性基本排除了其它的光激活和驰豫路径的竞争，从而仅由所希望的机制产生控制激活。例如，近来，Boxer及其合作者〔Oh等，Photochem.Photobiol.65(1997)91-95〕和Wachter及其合作者〔Fisher等，Photochem.Photobiol.66(1997)141-155〕已经报导了光动力学治疗剂的同时双光子激发，前者论述了补骨脂素基试剂的双光子的光谱性质，后者论述了相关试剂的双光子激发的光促效果。在两份报告中，超短激发脉冲的使用使光激活限于所希望的机制，显然避免了其它竞争机制。
而且，Mourou等(U.S.专利5,656,186)和其它人试图使用超短激光脉冲获得用于烧蚀激光外科的激光诱发击穿〔例如，Birngruber等人，IEEE J.Quant.Electron.23(1987)1836-1844；Stern等人，Arch.Ophthal.107(1989)587-592；Watanabe等人，Photochem.Photobiol.53(1991)757-762；Frederikson等人，Arch.Derm.129(1993)989-993；Zair等，U.S.专利5,618,285〕，他们发现，由于提高了光激发位置的这种定位效果，使用脉冲持续时间小于10ps的脉冲，产生了比利用较长脉冲获得的更好的治疗范围。Mourou介绍了由多光子电离(18)引起的激光诱发击穿，说明了这种击穿的发生是由于近红外光与含水组织基质非共振相互作用的结果，如图1(e)所示。在这里，多光子Pm-Pq的共同相互作用促进水迅速通过多个虚拟中间态Vm-Vp至到电离发生(在分子能量大于或等于水的电离电势Sip时)。该过程称为非共振，因为不能得到(例如，使吸收能量或激发效率最大)允许的一级(单光子)或多级(两或多个光子)跃迁。
尽管关于多光子光谱的大量理论和实践工作和超短脉冲源的普遍可用性是令人惊奇的，根据本发明人的了解，还没有关于医疗用途的超短脉冲多光子方法的报道，所述医疗用途涉及选择性激活内部(自然存在)或外部(外部提供)分子试剂，以产生改善的光动力学或光物理学(烧蚀)结果。如前所述，迄今为止，相关的工作报导还仅限于双光子方法或基于非共振激光诱发的电介质击穿的非特异性多光子烧蚀。
这样，尽管本文举例示范的现有技术的实体清楚地阐明了多光子光激活和应用超短脉冲源实现这种光激活的许多具有吸引力的特点，但没有实现具有高度的空间控制和效率的一种或多种分子试剂的选择性光激活，不能满足医药领域的不同需要。特别是，可认为以前没有教导过用于实现对目标试剂和材料及对物理程度的控制的有用的或可行的方法，而这对于治疗应用是非常重要的。
因此，本发明的一个目的是提供一种适应性强的通用的具有高度空间选择性的处理植物或动物组织的方法。
本发明的又一个目的是提供这样的方法，其使用了多光子光激发方法。
本发明的另一个目的是提供这样的方法，其使用了单脉冲光源发射的光和内部或外部光敏试剂，以提高空间选择性并改善所述处理的效果。
本发明的另一个目的是提供这样的方法，其使用的光的波长较目前用于处理植物或动物组织的光的波长对植物或动物组织的损伤更小。
本发明的另一个目的是提供这样的方法，其使用的光较目前用于处理植物或动物组织的光的波长更不易在植物或动物组织中散射和被其吸收。
仔细考虑包括几幅附图和实施例的说明书，本领域的技术人员能确定本发明的其它目的和优点。
发明概述
本发明旨在利用多光子激发光激活在材料的特定体积中的分子试剂的方法和装置。
更具体地说，本发明利用一种或多种内部或外部治疗剂的非线性光激发的独特的物理性质，通过多光子光激活过程来实现对这种试剂的光激活的空间控制的改进。这种多光子光激活是由两个或多个光子与一种或多种内部或外部试剂基本上同时的相互作用引起的，其中所述光子由脉冲持续时间为约10ps或更短的单超短激光脉冲提供。优选地是，对于本发明，所述两个或多个光子的能量和波长是相同的，并且象这样的激发过程称为简并。
本发明的多光子光激活允许有数个治疗端点(end point)，包括由下述一种或多种过程导致的端点：一种或多种试剂跃迁到量子力学所允许的较高能态的电子激发；一种或多种试剂跃迁到量子力学所允许的较高能态的振动激发；一种或多种试剂跃迁到量子力学所允许的较高能态的电子振动激发(振动激发和电子激发的组合)；和一种或多种试剂的光电离。由这种激发态的端点，一种或多种被光激活的试剂将加速所希望的治疗效果，例如光动力学杀死病变细胞，组织变性或烧蚀去除组织。
这里教导的多光子光激活方法相对于现有方法提供了特殊的优点，包括减少沿激发路径的附带激发和损伤，减少有害光波长的照射，减少源于被激发试剂周围环境的吸收和散射过程的影响，提高治疗深度，提高治疗效率，提高对被激发的试剂的位置和专一性的控制。
附图简要说明
在优选实施例的说明中参照下列附图：
图1(a)-(e)示意了对于典型的线性和非线性光激发过程的示范能级图；
图2(a)-(d)示意了对于几种线性和非线性光激发过程的典型的改进的Jablonski能级图；
图3(a)-(b)示意了处于双光子同时激发和五光子同时激发的血卟啉-Ⅸ(Ph-Ⅸ)的改进的Jablonski能级图的一个例子；
图4表示作为相对脉冲激发能量函数的试剂的相对光化学反应和光物理学反应的比较；
图5表示作为激发功率函数的Indo-1的双光子激发响应和三光子激发响应的比较；
图6表示对于线性和非线性激发过程的空间激发性质的比较；
图7(a)-(b)示意用来局部激活存在于组织表面上或组织表面下方的试剂的空间定位的多光子激发的例子；
图8(a)-(b)表示均匀遍布在琼脂糖凝胶块上的染料分子香豆素-480的单光子和双光子激发的荧光的比较；
图9比较当利用单光子激发和双光子同时激发时对于Hp-Ⅸ的作为激发波长函数的吸收截面；
图10表示对于覆盖从紫外到红外光谱区的人体组织的光谱吸收和散射的例子；
图11表示本发明的一个对存在于待治疗组织中的试剂的选择性多光子光激活的优选实施例；
图12表示对使用聚焦光进行局部治疗的另一个实施例；
图13表示对使用非聚焦光进行局部治疗的另一个实施例；
图14表示对使用非聚焦光治疗表面下方疾患的另一个实施例。
优选实施例的详细说明
这里描述的本发明利用一或多个内部或外部治疗剂的非线性光激发的独特物理性质通过多光子光激活过程实现对这种试剂的光子激活的改进的空间控制。对本申请来说，“非线性光激发”的定义是涉及两或多个光子与一或多种试剂实质上同时相互作用的那些激发过程。对本申请来说，“实质上同时相互作用”的定义是作为一或多种试剂与由持续时间为约10ps或更短的单超短激光脉冲提供的光子相互作用的结果而发生的那些激发过程。对本申请来说，“多光子光激活”的定义是作为来自单超短激光脉冲的两或多个光子与一或多种试剂实质上同时相互作用以产生一或多种被光激活的试剂的结果而发生的非线性光激发过程。最后，对本申请来说，“内部试剂”的定义是预置在病人或其它目标中的光敏材料，例如各种蛋白质；自然发光剂，例如黑色素，血红素，叶红素；水；胶原；和其它光敏材料，例如纹身染料。“外部试剂”的定义是没有预置在病人或其它目标中的光敏材料，例如各种光动力学试剂或其它为提高光能到治疗过程的转变效率而引入的光敏试剂。
这种多光子光激活的端点可以包括以下一种或多种过程：一种或多种试剂达到量子力学所允许的较高能态的电子激发；一种或多种试剂达到量子力学所允许的较高能态的振动激发；一种或多种试剂达到量子力学所允许的较高能态的电子振动激发；和一种或多种试剂的光致电离激发。由这种激发态的端点，一种或多种被光激活的试剂将加速治疗效果，例如光动力学杀死病变细胞，组织变性或烧蚀去除组织。
本发明的线性光激发在治疗和其它试剂的光激活期间具有更多的优点，包括减少沿激发路径的附带激发和损伤，减少有害光波长的照射，减少源于被激发试剂周围环境的吸收和散射过程的影响，提高试剂激发的专一性。本发明中使用的非线性光激发方法提供了一种治疗多种疾病的优良方法。U.S.专利申请08/739,801介绍了用于获得上述治疗效果的多光子光激活方法和装置的主要构成，上述专利委托给本发明的代理人，且与本专利是相同的发明人。此处全面参考了引入的1996年10月30日提交的U.S.专利08/739,801。
多光子光激发的能级模式
本公开内容中教导的本发明的一个方面在于，利用多光子过程以高度的空间控制有选择性地、高效率地光激活一种或多种治疗剂。这种选择性光激活是通过利用促使试剂从一个分子能态到另一个能态的非线性光激发的特殊性质获得的。为了完全理解该过程的显著特征，这里发展了多光子光激活的概念模型。这可通过利用本例中的能级图方便地得到。
图2(a)-(b)示意了典型的对于几种线性和非线性光激发过程的改进的Jablonski能级图。
图2(a)示意了当试剂吸收某一能量E1从量子力学所允许的初始能态Si(一般是基态)激发到量子力学所允许的最终能态Sf时发生的单光子激发(20)，能量E1由光子P与试剂的相互作用提供。若干不同的允许的最终能态都是可能的。每一个允许的能态可以进一步细分成一组不连续的亚能态，例如各种叠加在特定电子能态上的振动能态。因此，每个允许的能态Si和Sf构成所允许能态的一个复杂光带，这反应了试剂及其周围环境的基本性质。在光动力学治疗剂的情况下，试剂从Si到Sf的跃迁能启动各种治疗反应，例如包括把诸如单氧的细胞毒素的产生限制在局部。例如，试剂血卟啉-Ⅸ(Hp-Ⅸ)在吸收400nm的单光子的能量时会产生单氧。在单光子激发(20)中，激发的可能度与入射光辐射的照射线性相关，因此认为单光子激发(20)是一种线性激发过程。
在图2(b)中，当光敏试剂吸收某一能量E1从量子力学所允许的初始能态Si激发到量子力学所允许的最终能态Sf时发生同时双光子激发(22)，能量E1由双光子P1和P2与试剂的同时相互作用提供。对于此后讨论的例子，假设激发中涉及的双(或更多)光子的能量和波长是相同的，并且这种激发过程称为简并。一旦试剂已经跃迁到量子力学所允许的最终能态Sf，其光化学性质与由单光子激发(20)得到的相同。经常用寿命在10fs或更短的瞬时虚拟能态V1作为中介来描述双光子的同时相互作用。如果两个光子在虚拟能态的寿命期间没有与试剂相互作用，则不会发生激发，试剂返回能态Si。由于超过了虚拟能态V1的短寿命，入射激发光的瞬时辐射度或Wm2必须极高，以在虚拟能态V1经过驰豫回到Si之前充分有效地吸收第二个光子P2。因此，通常要使用具有极高峰值功率的脉冲激发源以有效地激发该过程；这类光源常常是优选的，因为它们能在虚拟能态V1的短寿命期间向被激发的试剂提供大量的光子。
同时双光子激发(22)的一个例子是，通过同时吸收800nm的两个光子，从Hp-Ⅸ产生单氧的激发。在该例中，激发的可能度与第一光子P1和第二光子P2的瞬时辐射量有关。这可概括为光化学反应式，
试剂基态+2hv800nm→试剂激发态    (1)
上式显示了基态试剂在同时吸收两个800nm的光子hv800nm后跃迁到激发态。反应速率R由下式给出：R=k[试剂基态][hv800nm]2，其中k是试剂固有的反应速率常数，其中[试剂基态]和[hv800nm]分别代表基态试剂分子和激发光子的浓度。这样，由于对瞬时辐射度的二次函数，同时双光子激发(22)称为非线性激发过程。
在图2(c)中，当光敏试剂吸收某一能量E1从量子力学所允许的初始能态Si激发到量子力学所允许的最终能态Sf时发生同时三光子激发(24)，能量E1由双光子P′1、P′2和P′3与试剂的同时相互作用提供。经常用寿命在10fs或更短的两个瞬时虚拟能态V′1和V′2作为中介来描述三光子的同时相互作用。如果三个光子在虚拟能态的寿命期间没有与试剂相互作用，则不会发生激发，试剂返回能态Si。由于超过了虚拟能态V′1和V′2的短寿命，入射激发光的瞬时辐射度必须极高，以便在试剂经过驰豫回到Si之前充分有效地吸收第二个光子P′2和第三个光子P′3。同时三光子激发(24)的一个例子是，通过同时吸收1200nm的三个光子，从Hp-Ⅸ产生单氧的激发。在该例中，激发的可能度与第一光子P′1和第二光子P′2和第三光子P′3的瞬时辐射量有关。这可概括为光化学反应式，
试剂基态+3hv1200nm→试剂激发态    (2)
上式显示了基态试剂在同时吸收三个1200nm的光子hv1200nm后跃迁到激发态。反应速率R由下式给出：R=k[试剂基态][hv1200nm]3，其中[hv1200nm]代表激发光子的浓度。这样，由于对瞬时辐射度的三次函数，同时三光子激发(24)也称为非线性激发过程。
在图2(d)中，当光敏试剂吸收某一能量E1从量子力学所允许的初始能态Si激发到量子力学所允许的最终能态Sf时发生同时多光子激发(26)，能量E1由多光子与试剂的同时相互作用提供。一旦试剂已经升级到量子力学所允许的最终能态Sf，其光化学性质与由单光子激发(20)得到的相同。经常用寿命在10fs或更短的一个或多个瞬时虚拟能态的相应多重来描述双或多光子的同时相互作用。如果全部光子在虚拟能态的寿命期间没有与试剂相互作用，则不会发生激发，试剂返回能态Si。由于超过了一个或多个虚拟能态的短寿命，入射激发光的瞬时辐射度必须极高，以便在试剂经过驰豫回到Si之前充分有效地吸收所有光子。同时多光子激发(26)的一个例子是，通过同时吸收波长(λ)为(400*n)nm的n个光子(例如，如果n=2，λ=800nm；如果n=3,λ=1200nm；n≥2，以此类推)，从Hp-Ⅸ产生单氧的激发。在该例中，激发的可能度与n个光子的瞬时辐射量有关。这可概括为光化学反应式，
试剂基态+nhv→试剂激发态    (3)
上式显示了基态试剂在同时吸收n个光子后跃迁到激发态。反应速率R由下式给出：R=k[试剂基态][hv]n，其中[hv]代表激发光子的浓度。这样，由于对瞬时辐射度的非线性函数，同时多光子激发(26)也称为非线性激发过程。
比上面给出的更概括的多光子激发的定义是，两个或多个光子以基本上同时的方式与一种或多种试剂相互作用，例如在脉冲持续时间为约10ps或更短的单超短激光脉冲期间发生的任何相互作用。在这种约束下，光与一种或多种试剂的相互作用必须以极快的方式发生，基本上把直接的光激活作用限制(和局限)为分子内部过程，例如试剂的电子激发或光电离。在这种激发过程中，没有明显的时间消逝，并且也没有大量的分子重排和运动，按照平常遵守的理论，由此在一种或多种试剂中产生的任何转变均作为实质上单一的共同的步骤发生。在随后的关于多光子激发的性质和最终的治疗剂的多光子光激活的说明中将应用这种更概括的定义。
除光化学过程的特殊例子和图2表示的能级图以外，其它可能的跃迁和能级状态也是可能的，这取决于多种因素，包括分子系统的特征，其周围环境，和能的吸收和释放形式的具体能量，以及它们的时间和空间的相关性。
多光子光激活中光子能的作用和瞬时辐射度
根据前述实施例，一旦试剂吸收具体的能量E1后跃迁到量子力学所允许的最终能态，其光化学性质是相同的，而与所有的激发方式无关。所述性质由被激发试剂的固有性质和其周围环境决定。所获得的具体的最后能态Sf由提供给分子的全部能量E1的量级决定。因此，E1的量级将最终决定试剂到达Sf时的光化学或光物理学的性质。
例如，图3(a)表示经历了全部吸收能量(E1)等于3.1eV(按照关系式E1=2hv计算E1，其中E1表示2光子Pn的总能量，每个光子的波长为800nm、能量为1.55eV)的同时双光子激发(30)的一种试剂，例如Hp-Ⅸ。试剂将被激发以按照反应R+2bv→R*(其中R是非激发或基态的试剂，R*是活性的激发试剂)从其激发态进行单氧的光动力学产出。
图3(b)示意一种相同的经历了全部吸收的能量(E′1)等于7.8eV的同时五光子激发(32)的试剂。按照关系式E′1=5hv计算E′1，其中E′1表示5光子Pn的总能量，每个光子的波长也是800nm。试剂将按照反应R+5hv→R++e-(其中R+是试剂的电离式，e-是光电离过程中从试剂电离出的电子)被光电离。
因此，图3(a)-(b)示意了如何通过正确选择具体的光子能量和瞬时辐射度，控制给定试剂的激发过程的光化学和光物理学结果以获得希望的结果(例如光动力学过程或光电离)。
更一般地说，通过改变提供给试剂的瞬时辐射度(以一给定的具体光子能量)，按照关系式E=nhv能改变激发态的能量，其中n是吸收的光子的数目。随着能量的增加，例如通过增加激光激发源的脉冲能量，光与试剂相互作用的治疗结果能从基本上的光化学过程转变到基本上的光物理学过程，如图4所示。在相对低的脉冲能量，例如在200fs脉冲内提供的能量小于10nJ，一般经由双或三光子过程的光化学激发(40)将占主导地位。然而，在相对高的脉冲能量，例如在200fs脉冲内提供的能量大于100μJ，一般经由四或多光子过程的光化学激发(40)将占主导地位。在相对的中间能量，可能是组合结果(44)(部分光化学激发，在性质上的部分光物理学激发，例如热变性或高度的局部凝聚)。这样，利用本多光子方法可以使治疗过程在从光动力学到烧蚀状态之间转变。
多光子光激活中的非线性关系
一旦试剂已经跃迁到激发态，可以发生各种物理或化学过程，包括光子的发光，光化学变化，例如异构化、氧化或聚合，或光电离。激发态及其环境的基本性质决定了试剂的最终结果。当使用超短脉冲激发方法时，由于激发过程本身没有直接影响随后的激发试剂或其环境的性质，所以促使试剂到达激发态的响应机制对最终结果没有显著影响。
相应地，通过检验作为激发功率(直接与瞬时辐射度相关)的函数的这些反应中的一个或多个，能容易地评价给定试剂的多光子激发的可行性。通过测量试剂在几个激发功率的响应，能够通过绘制log10(响应)对log10(功率)的曲线确定连续的多光子激发。这会产生斜率为n的直线，其中n是试剂在特定试验条件下吸收的激发光子的数量。对于荧光探测试剂indo-1，这是容易论证的，在用300-400nm的光照射时该试剂表现出强的单光子激发(在500nm发射荧光)。当用810nm的聚焦光照射该试剂，并绘制log10(荧光信号)对log10(平均功率)的曲线，如图5所示，记录下双光子激发响应(50)(斜率m=1.96，相关系数R2=0.99994)。例如，聚焦光由76MHz重复频率的约200fs脉冲串组成，所述脉冲由锁模钛：蓝宝石激光器产生。当在910nm进行相同的测试时，indo-1表现出作为激光功率(m=2.97,R2=0.991)函数的三光子激发响应(52)。比较而言，荧光试剂香豆素-540分别在810nm和910nm表现出斜率2.01和2.00，该试剂在上述波长仅显现出双光子响应。在上述波长，如果激光没有产生脉冲，多光子信号会完全消失，这证实了多光子激发决定着观测到的响应(由于非脉冲激光束不提供足以支持上述试剂在上述波长的多光子过程的瞬时辐射度)。
另外，多光子过程的激发截面随着给定跃迁所需光子数的增加通常减小。例如，在给定试剂中，对于具体的跃迁，三光子截面通常比相应的相同跃迁的双光子截面小。这至少部分是由降低的具体多光子过程需要的所有光子以基本上同时的方式与试剂相互作用的概率引起的。当在给定的平均激发功率比较indo-1的双光子激发响应(50)和三光子激发响应(52)的数量级时，上述观点得到证实。然而，由于三光子过程的斜线比双光子过程的斜线陡，通过增加激发光的瞬时辐射度能基本上修正相对截面中的差别，例如通过减小给定平均功率的光束的脉冲宽度，或通过增加脉冲能量(例如，通过使用放大光源，诸如再生式放大器钛：蓝宝石激光器，或线性调频脉冲放大的Nd：YAG激光器)。后面的方法可以导致改变光物理学和光化学过程的相对比率，如图4所示，因此在某些环境中后面的方法是不希望的。实际上，在极高脉冲能量时，这是发生光电离和烧蚀的起因，极高脉冲能量需要相当大数量的光子，并且仅当瞬时辐射度格外高时能显著地观测到，例如当脉冲能量格外高时。同样地，如果脉冲宽度过分降低，由于激发脉冲的最终的光学带宽度变得太大，使得对试剂反应的波长的强度实质上变低了，则前面的增加多光子激发量的方法也会无效。例如，如果脉冲宽度减小得低于10fs，光学带宽度会超过100nm，光束传播的能量覆盖了太宽的波长范围而不能有效地激发具体跃迁。
多光子光激活的空间性质
由于利用瞬时辐射度的多光子光激活是非线性的，相对于线性激发过程，这类过程在空间激发性质上显示出重要的引人注目的差别。例如，如图6所示，当激光束聚焦到材料中，会得到作为穿过样品的距离的函数而变化的光束强度曲线(60)，由经典的高斯光学理论可预知强度曲线(60)在焦点的中心达到最大值。对于单光子过程，光束强度(或瞬时辐射度)和激发效率之间的线性关系产生了单光子激发效率曲线(62)，该曲线仿照光束强度曲线(60)。比较而言，对于多光子过程，光束强度(或瞬时辐射度)和激发效率之间的非线性关系产生了激发效率曲线(64)，该曲线比光束强度曲线(60)尖得多。这样，当应用多光子激发时，能利用该激发的空间定位将激发的范围基本上限制到一小的聚焦区域。比较之下，当应用线性激发时，基本上是沿整个光径发生激发，使得限定激发的空间定位程度相当低。这种空间定位可以在透明介质(例如眼睛)和光密介质(例如真皮组织)中观察到。因此，空间定位的多光子激发可以用来局部激活存在于组织(70)表面上或组织(72)表面下面的试剂，例如图7(a)和7(b)分别所示。
图8(a)和8(b)说明了在光密介质中的局部、远端光激活反应的激发。图8(a)表示均匀遍布有染料分子香豆素-480的琼脂糖凝胶块(80)的照片。图8(b)是图8(a)中照片的示意图。因为能强烈地散射可见光，琼脂糖凝胶(80)块构成一光密介质。当受到350-450nm的单光子方法激发或受到700-900nm的双光子方法激发时，香豆素-480发射蓝色荧光。
在本例中，一束光(82)由琼脂糖凝胶(80)的一侧聚焦在琼脂糖凝胶(80)中，在进入凝胶约2cm处形成一焦点(84)。特别地，利用扩束望远镜，或者一束(82)可见光(400nm)，或者近红外(NIR)光(730nm，锁模钛：蓝宝石激光器)被扩束，以产生直径约50mm的平行光束。激光器以76MHz脉冲重复频率产生730nm、＜200fs脉冲的连续串。然后，用焦距(f.l.)为250nm、直径为50mm的两面凸玻璃单透镜使扩展的光束聚焦到琼脂糖凝胶(80)中。然后放置琼脂糖凝胶(80)，使250-mmf.l.透镜的焦点(84)落在进入琼脂糖凝胶(80)2cm处。现在，从光(82)束确定的光轴的上方，由一透视图直接向下看琼脂糖凝胶(80)，图8(a)和8(b)清楚地显示了香豆素-480的荧光仅仅在NIR束(86)的焦点被激发，同时荧光沿着可见光束(88)的整个射程发射。而且，NIR光束(90)的大部分继续通过琼脂糖凝胶(80)的整个厚度，仅有轻微衰减，而可见光束(92)在通过琼脂糖凝胶(80)的整个厚度的三分之一前已经完全衰减。
在图8(a)和8(b)中观察到的特征形象地说明了用多光子激发可获得的独特的空间定位，以及NIR光相对于更短波长的光在光密介质〔诸如琼脂糖凝胶(80)或人或动物组织〕中通常改进的穿透性。由于多光子激发效率和瞬时辐射度之间的非线性关系，试剂沿光束路径在焦点前后位置的激发可以忽略。因此，在焦点区域之外几乎没有附带光激活发生。同样，由于凝胶仅微弱地吸收或散射NIR激发光，因此在穿透到凝胶块深处时仍保持着锐聚焦(实际上，通过沿光轴移动凝胶，在凝胶全部8cm厚度中都可得到锐聚焦)。由于通过高斯光学定理确定了在图8(a)和8(b)中观察到的聚焦的锐度，通过改变用于光束控制的光学参数能容易地调整聚焦区域的长度。
随着用于激发的光子数的增加，图6所示和图8(a)和8(b)证实的多光子激发效率曲线(64)变得越来越密集。因此，三光子激发将比双光子激发提供更密集的空间定位，以此类推。这暗示了能优选多光子的数量(用于具体激发的光子数)以使最终的聚焦区域的空间性质与目标相一致。例如，为了优化在组织(70)表面的试剂的选择性激活，通过使用三光子激发，聚焦区域的厚度可以更紧凑些，如图7(a)所示。
除了这种基于量子力学的光激活的空间集中外，使用超短脉冲激发获得多光子光激活在激发过程中可以基本上防止能量从目标位置泄漏，进一步集中这种激发的效果。例如，在同时双光子或三光子激发的情况下，在超短脉冲激发过程中，分子不可能重排或转变，因此所有吸收的激发能都可用来激活一或多种光敏试剂中所希望的转变。同样地，在多光子激发引起的烧蚀过程的情况下，按与超短激发脉冲相当的时间系统，不可能发生远离目标位置的激发能量的热泄漏。因此，可以保存在上述脉冲期间的所有能量，以激发所希望的转变，例如用于引起烧蚀的光电离过程。这有助于目标区域中的试剂的极快速、高度集中和高效率的光电离，并导致在能量泄漏前所述光敏试剂能在周围介质发生迅速的烧蚀-这进一步有助于光激活过程的空间定位。
多光子光激活的光谱响应性质
除了在空间激发性质上的显著不同外，作为波长的函数的调整激发效率的选择准则对于单光子和多光子激发有巨大的差别。然而，与促使试剂到达具体激发态所用的激发机制无关，所达到的具体激发态的性质是相同的。
图9提供一实例，表示当使用常规的单光子激发(94)和同时双光子激发(96)时，对于在乙醇中的Hp-Ⅸ，作为激发波长的函数的吸收截面的相对比较。另外，利用波长数值绘制了同时双光子激发(96)数据，该数据被分成两部分(98)，以反映同时双光子激发的能量等于单光子吸收的两个光子中每个光子的能量(或波长的一半)的二倍。比较单光子激发(94)和在一半波长数值(98)绘制的同时双光子激发的相对截面，表现出作为波长函数的显著差别。特别是，对于同时双光子激发(96)或(98)，对于单光子激发(94)明显存在的的突出的Sorrett光带(100)是不存在的，因为这是量子力学不允许的。
这些差别可归因于取决于激发所用机制的具体分子转变的选择准则，并且对基于多光子选择准则方面和设计具有特殊多光子性质的特殊试剂方面的差别，优化激发的效率或选择性是有用的。通常，对于中心对称的试剂(包含转化中心)，应用偶数个光子的激发过程(例如双光子激发)必须使试剂从其初始态跃迁到具有类似均势的激发电子态。与应用奇数个光子的激发过程(例如单光子激发)是完全相反的选择准则，并且Sorrett光带(100)中数量的差别响应图9中观测的Hp-Ⅸ。比较来说，不对称的试剂通常具有相同的选择准则，与激发中用的光子的个数无关。因此，对于中心对称试剂，这一般有利于仔细地确定作为波长函数的多光子光谱响应曲线，以确定最佳的激发波长，而对于非中心对称试剂，单光子激发光谱通常被用来预测作为波长函数的多光子光谱响应曲线。
多光子光激活中组织吸收和散射性质的重要性
尽管多光子激发的截面可能明显低于用单光子激发所观察到的截面，但在很多情况下，利用多光子方法可能比常规的激发方法更有利，原因在于较长波长的光辐射的基质吸收和光学散射较低。例如，图10表示对于覆盖从UV到IR光谱区的组织的典型的吸收和散射性质。由图10明显得出几个结论。
首先，利用较长波长的光可减少相对的散射作用，从而提高了光学穿透深度。因此，用多光子方法代替常规的单光子方法将减少散射对向组织中的试剂提供激活光的作用。例如，用700nm双光子激发或1050nm三光子激发来激活UV-光敏PDT试剂(例如补骨脂素，它通常是用350nm光激活的)，对于700nm和1050nm光，将导致分别减少约100倍到2000倍的散射。
第二，组织吸收的影响能降低激活光的穿透性，并导致在所希望的治疗位置之外的附带组织损伤，通过使用较长波长的光一般能减少这种影响，例如，用在所谓的组织透射窗口中传播约700nm-1300nm的NIR光。因此，用多光子方法代替常规的单光子方法通常将减少组织吸收对向组织中的试剂提供激活光的作用。例如，用700nm双光子激发或1050nm三光子激发来激活UV-光敏PDT试剂(例如补骨脂素，它通常是用350nm光激活的)，在黑素组织中，对于700nm和1050nm光，将导致分别减少约70倍到2000倍的吸收，在非黑素组织中，对于700nm和1050nm光，将分别减少约260倍到3500倍的吸收。因此，利用特征在于单光子激发波长与高组织吸收的光谱区重叠的试剂，对于在较深组织中应用多光子方法是可行的，原因在于这种方法能向较深组织位置提供激活光而没有组织吸收的影响。
由于基质的影响显著的降低了，降低的组织散射和吸收允许空间集中的激发，以便有效地实现多光子方法，如图7和8所示。进一步，降低的组织散射和吸收还产生了多光子光激活的附加的安全优势。例如，当UV光照射到人体组织上时，光能的大部分很快被最外层如表皮和真皮吸收和散射。发生吸收的原因可能是该组织的细胞中的某些分子的激发，例如那些组成细胞核中遗传物质的分子。细胞成分吸收这种高能光能引起这些细胞中各种附带光化学变化，包括不可逆的遗传损伤和诱发癌症。相比之下，组织对用于双光子或三光子方法的NIR光的吸收或散射就没有如此可观，对细胞的附带损伤的可能性也明显降低。
对于多光子光激活的激发波长的选择
前述关于组织性质在整个有效的多光子光激活中所起的作用的讨论提出一个相当重要的观点：能够选择多光子过程的级数(即，激发所用的光子数)以同时优化一或多种所希望的光敏试剂的激发波长和组织的透射性质。特别是，为了激活一种或多种外部光敏试剂，通常希望选择一具体的多光子过程，该过程允许在基质(例如组织)的透射区域利用光来激发，并且在所希望的外部试剂的光激活中是有效的。同样，为了激活一种或多种内部光敏试剂，通常希望选择一具体的多光子过程，该过程允许在基质(例如组织)的透射区域利用光来激发，并且在所希望的内部试剂的光激活中是有效的。在一种或多种内部试剂构成要被治疗的组织的主要成分的情况下，正确选择多光子过程通常允许在表面下的试剂的空间集中的光激活(由于能够减小激活光的直接线性吸收的影响)。图8(a)和8(b)清楚的表明了这点，其中利用均匀分布着试剂的样品，深刻地论证了试剂(86)的有选择的高效率的激活。比较而言，常规的激活方法产生的试剂激活(88)没有空间集中，并且在某些深度上，由于试剂沿光径对激活光的吸收，表现出较差的效率。
这里，用于同时优化光激活效率和组织透射性质的选择多光子过程级数的一个例子是，激活在非黑素组织中的补骨脂素。在该例中，相对于相应的三光子截面，补骨脂素的较大的双光子截面使利用700nm双光子激发的补骨脂素的有效的光激活相对于350nm单光子激发能将组织吸收减少约260倍。作为另一个例子，会进一步说明在黑素组织中的补骨脂素的激活。在该例中，黑色素对700nm光的较多吸收表明，利用较长的波长能更好地避免基质的影响，照这样，将优选补骨脂素的1050nm的三光子激活，因为对1050nm光的组织吸收相对于700nm减小了15倍，对1050nm光的组织吸收相对于350nm减小了3500倍。
要注意的是，通常最希望的多光子激发的波长在500nm和4000nm之间，因为较好的组织透射性质在该范围内。而且，选择具体的多光子过程的级数使操作能在所希望的光化学/光物理学范围内，如图4示意。例如，如果所希望的治疗结果是一光化学过程，如PDT，由于潜在的光物理过程的影响，需要格外高的脉冲能量的高级数过程是不希望的。
用于多光子光激活的激发源
具体的多光子激发过程的截面通常比相当的产生与多光子过程相同的激活态的单光子激发过程的截面小很多倍。这是由于双或多光子与试剂基本上同时相互作用的概率相当低。然而，能提供高瞬时辐射度的可用的光激发源，例如锁模激光器(包括钛：蓝宝石激光器和Nd：YAG激光器)和放大的锁模激光器(包括再生放大的钛：蓝宝石激光器和线性调频脉冲放大的Nd：YAG激光器)，能通过增加入射的瞬时辐射度显著地改善效率的降低，从而显著地增加多光子激发的有效性。这类激光器一般以高脉冲重复频率(范围从1kHz到100MHz)提供具有适中平均功率(范围从1mW到10W)的超短脉冲输出(脉冲宽度范围从10fs到10ps)。由于可得到的高瞬时辐射度能激发多光子过程，同时短脉冲宽度和适中的平均功率使向周围介质的不希望的能量泄漏最小，所以这种输出性能有利于选择性的有效的多光子光激活。例如，当使用连续波激发时，对于具体的试剂，三光子激发的效率可能是107倍或小于单光子激发得到的效率。然而，如果以超短脉冲串的形式发射相同的平均光功率，瞬时和平均辐射度的量的改变能够使这个比率变得接近一致。超短脉冲激发的特殊性质允许这种显著的改进而不伴随增加附带损伤。
注意，能发射相对低能量的脉冲的激发源(例如锁模钛：蓝宝石激光器，一般脉冲能量在1-10nJ范围内)最适于在聚焦照射条件下利用双或多光子光化学激活试剂(如PDT)，而能发射相对高能量的脉冲的激发源(例如再生放大的钛：蓝宝石激光器，一般脉冲能量在1-10μJ范围内)最适于在聚焦照射条件下利用双或多光子光物理激活试剂(如烧蚀)。这些高脉冲能量源也最适于在非聚焦照射条件下利用双或多光子光化学激活试剂(如PDT)，例如激活在大面积组织上的或在大体积组织中的试剂。
双光子同时激发的医疗应用
上述讨论表明，组织和细胞成分对UV和可见光的吸收和对NIR和IR光的吸收之间的根本差别，连同多光子激发的特殊非线性性质一起，在疾病治疗的改进上尤其是在PDT领域、选择性组织变性和激光外科方面应该有直接的应用。
PDT利用光能光激活施用于患病组织的试剂。这些试剂的施药途径主要是患病组织的直接用药，或通过系统给药。在理想条件下，PDT试剂会分布于或富集于患病组织。施加PDT试剂后，利用光辐射来激发在PDT试剂中的光化学变化，以达到治疗效果。这些光化学变化通常会导致细胞增殖或疾患中的细胞坏疽的局部停止。当用于激活PDT试剂时，本发明教导的多光子光激活方法，能改进要到达深处治疗区域的激活光的穿透性，能改进治疗的定位，并能相对于常规的光激活方法减少潜在的附带损伤。这种方法与现有的PDT试剂以及新型的光敏PDT试剂兼容。尤其是，本发明能提高任何PDT试剂的光激活的定位性，以及与可能使用的常规方法相比，能显著降低附带组织的损伤。
如果对光穿透深度的控制不是很严格，可以用非聚焦超短脉冲光来激发在较大照射区域或体积内的PDT试剂的多光子光激活。在这种情况下，通过改变暴露于光束中的位置、辐射度和时间来控制PDT试剂的光激活的程度。
如果对穿透深度或治疗应用的体积范围的精确控制非常严格，可以用聚焦超短脉冲光来激发多光子光激活。在这种情况下，可利用对光束辐射度、曝光时间和聚焦度的控制来调整PDT试剂的光激活的程度。而且，用NIR辐射得到的高穿透深度和用聚焦的双光子激发得到的光激活的固有定位，一起提供了一种用于光激活在皮下的PDT试剂而不损伤上方或下方的健康组织的独特方法。
组织变性是由快速加热内部或外部试剂产生的一个光化学和光物理学过程的局部组合。一种或多种内部或外部试剂(例如血)吸收了入射光能后，光能转化成热能，由此产生加热。变性能导致这种试剂或周围组织体积的改变(例如角膜系统细胞的收缩或膨胀)，物理性质的改变(例如牙釉质的硬度)，或诱发聚合(例如凝血)。当用于激活反应试剂时，本发明教导的多光子光激活方法，能改进对这种变性的位置的控制，原因在于当利用超短脉冲激发来刺激这种反应时，损失到周围组织中的激活能减少了。尤其是，本发明能提高反应试剂的光激活的定位性，以及与可能使用的常规方法相比，能显著降低潜在的附带组织损伤。
如果对光穿透深度的控制不是很严格，可以用非聚焦超短脉冲光来激发在较大照射区域内的试剂的光激活。在这种情况下，通过改变暴露于光束中的位置、辐射度和时间来控制试剂的光激活的程度。
如果对穿透深度或治疗应用的体积范围的精确控制非常严格，可以用聚焦超短脉冲光来激发光激活过程。在这种情况下，可利用对光束辐射度、曝光时间和聚焦度的控制来调整试剂的光激活的程度。而且，用NIR辐射得到的高穿透深度和光激活的固有定位，一起提供了一种用于光激活在表面下的反应试剂而不损伤上方或下方的健康组织的独特方法。该特征对于各种非入侵性治疗过程非常有用，例如通过局部修正角膜系统细胞的体积来有效的校正屈光度。
烧蚀是由内部或外部试剂的光电离诱发的局部光化学和光物理过程。当包含在很小的聚焦体积中的多种试剂分子基本上同时光电离时，上述试剂会发生剧烈的局部膨胀，导致物质从聚焦体积挤出。这种烧蚀挤出可用于各种外科应用，包括皮肤修复和角膜表面成形。当用于激活反应试剂时，本发明教导的多光子光激活方法，能改进这种试剂的激发效率，以及提高对这种烧蚀的位置的控制。后面的特征是因为当利用超短脉冲激发来刺激这种反应时，损失到周围组织中的激活能减少了的缘故。尤其是，本发明能提高反应试剂的光激活的定位性，以及与可能使用的常规方法相比，能显著降低潜在的附带组织损伤。
相对于可能使用的现有方法(例如Mourou等，U.S.专利5,656,186教导的非共振激光器引发的分离)，通过利用本发明教导的波长选择方法能特别改进烧蚀效率和选择性。更具体的是，通过选择激发波长以使基于最佳试剂光谱特征(例如，用于血红素激发的532nm，用于水激发的2000nm或3000nm，用于黑素激发的500-800nm)的激发的效率最大，烧蚀的效率可能增加超过基于其它超短脉冲光激活方法的现有可能方法的1000倍。而且，对激发波长进一步的选择能选择激活特殊的组织成分。例如，参见图10，揭示了用于黑素的光激活的700nm多光子激发提供了比用于血的提高了约100倍的选择性，原因在于这些组织的吸收性质不同。通过选择各种内部或外部试剂，例如纹身染料的光激活，类似的提高是可能的，从而提供了改进如纹身去除的治疗过程的性能的另外的方法。
而且，用NIR辐射得到的高穿透深度和光激活的固有定位，一起提供了一种用于光激活在表面区域下的反应试剂而不损伤上方或下方的健康组织的独特方法。该特征对于各种非入侵性治疗过程非常有用，例如通过从角膜表面内部的局部烧蚀角膜组织来有效的校正屈光度。
本发明的最佳实施例
因此，本发明的一个优选实施例是应用高瞬时辐射度的超短脉冲源，例如锁模钛-蓝宝石激光器或再生放大的钛-蓝宝石激光器的输出，来诱导一种或多种内部或外部光敏试剂的多光子光激活。该优选实施例示于图11中。光源(120)产生的光束(122)构成了光辐射，一般是NIR光辐射的一系列快速超短脉冲。利用标准光学装置，如反射或折射光学系统(124)，可以使光束(122)聚焦。然后，最终的聚焦光束(126)投射到待治疗组织(128)上，如癌症肿瘤。光敏试剂的多光子光激活基本上限定在聚焦光束(126)的聚焦区域(130)，因为仅在该焦点存在高瞬时辐射度。而且，无论试剂是存在于周围的健康组织(132)或皮肤(134)中，在聚焦区域(130)之外发生的附带光激活或光损伤都不明显。这是瞬时辐射度和多光子激发之间的非线性关系的结果，该结果将显著地将激发限制在聚焦区域(130)。因此，即使试剂在聚焦区域(130)外，瞬时辐射度低于产生显著光激活所需的水平。本发明的优选实施例在这方面与现有技术有明显差别，现有技术未能提供可行的方法来限定沿着光束的面积范围及其辐射路径的光激活区的范围。通过扫描整个待治疗组织(128)的体积内的聚焦区域(130)的位置，能够实现遍布待治疗组织(128)的试剂的全部光激活。通过改变聚焦区域(130)相对于待治疗组织(128)的位置，或者通过相对于固定的聚焦区域(130)的位置移动待治疗组织(128)，能够实现上述扫描行为。通过在聚焦前利用光束扩展器或其它装置预扩展光束(122)，可以提高聚焦区域(130)的空间质量。
这种多光子光激活实施例在局部位置的治疗方面有多种变化，如图12和图13所示。例如，图12显示的无损伤性质的聚焦NIR光，或图13显示的非聚焦NIR光使局部位置的试剂发生光激活，而对下层或周围组织没有伤害。
如图12所示，当使用标准光学装置，如散射或折射光学仪器(124)，将光束(122)聚焦到待治疗组织(128)上时，就发生用于局部治疗的一种或多种试剂的聚焦的多光子光激活。在这种情况下，试剂的光激活仅在聚焦区域(130)发生。由于光激活基本上限制在聚焦区域(130)，即使周围的健康组织(132)和皮肤(134)也含有试剂，在此过程中它们也不会受到影响。如前所述，可以应用扫描行为实现遍布待治疗组织(128)体积内的试剂的光激活。
如图13所示，当光源(120)发出的非聚焦或发散光束(136)投射到待治疗组织(128)上时，就发生用于局部治疗的一种或多种试剂的非聚焦的多光子光激活。光束(136)的截面积可以小于、等于或大于待治疗组织(128)的截面积。如果，例如通过PDT试剂(如局部补骨脂素乳剂)的控制给药，或通过内部试剂(如黑素)的自然富集，使试剂基本上限定在待治疗组织(128)体积内，那么治疗行为就基本限定在待治疗组织(128)体积内。由于光束(136)对不含高浓度试剂的组织无害，因此避免了对周围健康组织(132)和皮肤(134)的损伤。在不清楚待治疗组织(128)的确切位置、大小和形状时，或者另一种情况，由于精密控制光束(136)的位置对于该治疗体系的成功实施不重要，从而不希望精确控制光束(136)的应用位置时，本实施例尤其有用。当使用非聚焦光时，利用高峰值功率辐射源，如放大的激光器是有利的，这是因为这种辐射源能在大面积上提供高瞬时辐射度。
多光子光激活的优选实施例的最后一种有关的变化示于图14中，其中当光源(120)发出的非聚焦或发散光束(136)投射到皮下待治疗组织(128)上。光束(136)的截面积可以小于、等于或大于待治疗组织(128)的截面积。如果，例如通过外部试剂的控制给药，或通过内部试剂的自然富集，使试剂基本上限定在待治疗组织(128)体积内，那么治疗行为就基本限定在待治疗组织(128)体积内。由于光束(136)对不含高浓度试剂的组织无害，因此避免了对周围健康组织(132)和皮肤(134)的损伤。在不清楚待治疗组织(128)的确切位置、大小和形状时，或者另一种情况，由于精密控制光束(136)的位置对于该治疗体系的成功实施不重要，从而不希望精确控制光束(136)的应用位置时，本实施例尤其有用。与前述非聚焦实施例一样，利用高峰值功率辐射源是有利的，因为这种辐射源能在大面积上提供高瞬时辐射度。
用于标准PDT试剂和新型PDT试剂的多光子光激活方法的意义
标准PDT试剂具有组织专一性，该性质通常是基于试剂和如癌症疾患的组织的组合的化学和物理性质。例如，
●各种补骨脂素衍生物；
●各种卟啉和血卟啉衍生物；
●各种二氢卟酚衍生物；
●各种酞菁衍生物；
●各种若丹明衍生物；
●各种香豆素衍生物；
●各种苯并吩恶衍生物；
●氯丙嗪及其衍生物；
●各种叶绿素和细菌叶绿素衍生物；
●脱镁叶绿甲酯一酸a[Pheo a]；部花青540[MC 540]；维生素D；5-氨基-酮戊酸[ALA]；光敏剂(photosan)；脱镁叶绿甲酯一酸-a[Ph-a]；吩恶嗪尼罗蓝衍生物(包括各种吩恶嗪染料)
●各种电荷转移和辐射转移试剂；和
●多种其它的光敏或感光试剂，
上述试剂通常积聚在应用点或其附近，或半选择性地积聚在特殊组织内，这是由于组织的化学或物理性质的差别导致了进入组织的PDT试剂的分配。
通常利用单光子可依次双光子激活方法激活上述试剂，所述方法激发一个或多个光化学或光物理学过程，包括但不限于键合形成或分裂、加合物形成、交联、自由辐射产生、单氧产生、毒素物质产生和能量转移。用于上述试剂激活的常规方法在激活范围或深度方面提供了较小的选择性，并一般限于用在组织或疾患表面。
从前述讨论可以明确，本发明在该应用中教导的优选实施例和支持数据适用于上述列出的所有试剂和感光剂以及没有具体列出的其它PDT试剂和感光剂。具体地说，所有这些试剂均响应比单光子激发所用波长更长的波长的多光子激发，并且一旦被激发，将表现出与单光子激发得到的结果相同的性质。而且，对应用点的控制的改进和这里所讲的附带损伤的减少，为使用多光子激发代替传统的单光子或依次双光子激发提供了额外的特殊优点。这包括提高了穿透深度，提高了对应用点的空间控制，减少了PDT治疗的副作用。
正在开发许多新型的对NIR中的定向单光子激活敏感的PDT试剂。这些试剂的目的是减少与传统UV或可见光激活有关的副作用或其它限制。这类试剂的例子包括PHOTOFRIN，苯并卟啉衍生物一元酸，SnET2,Lutex，和其它的利用大于500nm波长的单光子激发能将其光激活的试剂。在该应用中教导的本发明利用这类试剂也具有特殊的益处。具体地说，与可能的单光子激活相比，应用波长在500nm-4000nm光谱带的多光子光激活能提供相当大的穿透深度，原因在于与线性激发所需的较短波长相比，在上述光谱带中的组织吸收和散射大大的降低了。另外，与单光子激活方法相比，这里教导的多光子光激活的空间定位的优点提供了对这种治疗的应用点的改进的控制。
显然，尽管前面的讨论主要集中在利用由锁模钛：蓝宝石激光器产生的超短脉冲NIR光辐射的试剂的多光子激发的实例的治疗应用上，但不限于这种激发和这类狭义的光源。实际上，当利用线性或其它非线性方法进行光激发时，本发明的各个方面都是适用的。例如，多种其它的单独或组合光源都是适用的，例如连续波和脉冲灯，二极管光源，半导体激光器；其它类型的气、液和固态连续脉冲或锁模激光器，包括：氩激光器；氪离子激光器；氦-氖激光器；氦-镉激光器；红宝石激光器；Nd:YAG,Nd:YLF,Nd:YAP,Nd:YVO4,Nd:玻璃，和Nd:CrGsGG激光器；Cr:LiSF激光器；Er:YAG激光器；F-中心激光器；Ho:YAF和Ho:YLF激光器；铜蒸气激光器；氮激光器；光学参量振荡器、放大器和发生器；再生放大激光器；线性调频脉冲放大激光器；和日光。
而且，尽管前面的讨论集中在植物和动物组织的活体处理的治疗应用上，只要是希望改进起反应的目标试剂的选择性，显然本发明也具有附加效用。具体地说，本发明在控制生物起源物质的制造或污染的生物起源物质的提纯方面的应用覆盖在本发明的范围内。一个例子是，根据预期的光敏试剂与目标实体，如HIV病毒的相互作用，预期有选择的处理或提纯生物液体，如血液或血浆。该方法在处理HIV传染病方面能起治疗作用，并能用作一种保护措施，防止HIV通过输血转移。第二个例子是，预期制造极纯的生物产品，如细胞培养，其中通过选择破坏预定污染母体来除去异源繁殖。第三个例子是，根据有选择激发目标生物试剂中的一或多个特殊的基因顺序，预期生产基因生物产品。
除了各种生物应用外，明显地，利用本发明能使多种非生物应用成为可能，或显著提高这些应用的效率，所述应用包括制造高纯日用材料，尤其在这种情况下，非线性光激发的空间性质是非常重要的。例如，通过应用本发明的各个方面能改进特殊的手性化学品，颜料，涂料，聚合材料和其它工业或商业试剂的生产或处理。具体地，独特的选择准则、选择性优点和激活定位在许多材料的生产和处理过程中提供了有利条件。事实上，从上述例子可清楚地得出，本发明实际上构成了一个普通材料处理范例，其中，在生物和非生物材料上应用非线性光激发的空间性质来实现在开始材料到产品的选择转化方面的特殊改进，无论这种转变是从肿瘤到坏死组织还是从一种分子试剂到另一种分子试剂。
同样，尽管上述例子主要集中在适合于人的治疗项目上，显然也可直接应用于微生物、植物和动物样品。例如，设想用上述方法来治疗家畜、育种牲畜的疾病或其它的兽医医治的疾病。另外，设想上述方法也可用作处理方法或方式来获得微生物或细胞培养物的选择性。例如，本发明各部分应用于异源细胞培养物的纯化和体外细胞功能的表达中。因此，本发明可应用于遗传工种、畜牧业、再生治疗、克隆和许多其它领域。
本发明的多光子光激活也能用于激活医用成像试剂。
应该理解，以上描述的每一个要素，或者两个或更多个要素一起，也可以应用于不同于上述类型的其它结构或应用中。
尽管已经图示和描述了作为改进治疗剂光激活的选择性的通常方法的具体表现的本发明，但这不意味着本发明限于已表述的细节，因为本领域的技术人员能够对图示的方法在形式和细节上及其动作上进行各种删节、改进、替换和改变，而不以任何方式背离本发明的精神。
提供的说明书仅用于说明目的，而不限制本申请中的发明，本发明则由下面的权利要求书限定。
在后附的权利要求书中，陈述了新的并期望得到专利形式的保护的各项权利要求。

Claims (138)

1．一种用于处理特定体积的植物或动物组织的方法，该方法包括下列步骤：
(a)用至少一种光敏试剂处理植物或动物组织，其中该特定体积的植物或动物组织中保留了至少一种光敏试剂的至少一部分；和
(b)用光处理该特定体积的植物或动物组织，以促进保留在特定体积的植物或动物组织中的所述至少一种光敏试剂中的至少一种试剂的多光子光激活，其中在特定体积的植物或动物组织中的至少一种被激发的光敏试剂变成光激活的。
2．如权利要求1的方法，其特征在于，促进所述多光子光激活的光是由激光器产生的激光。
3．如权利要求2的方法，其特征在于，该激光包括一或多个超短脉冲串。
4．如权利要求3的方法，其特征在于，所述一或多个超短脉冲中的每一个具有的脉冲持续时间最大为约10ps。
5．如权利要求2的方法，其特征在于包括操作该激光器以产生波长在约500nm-4000nm之间的光。
6．如权利要求1的方法，其特征在于，所述光的波长在约500nm-4000nm之间。
7．如权利要求1的方法，其特征在于，促进所述多光子激励的光是聚焦的光束。
8．如权利要求7的方法，其特征在于，该聚焦光束是聚焦的激光。
9．如权利要求1的方法，其特征在于，所述处理特定体积的植物或动物组织的步骤包括：把光束的焦点定位在一定位置范围内，使得该光束的焦平面出现在该组织的表面和基本上超过该组织表面的点之间的一个位置上，从而使所述处理特定体积的植物或动物组织的步骤可以在该组织内延伸至穿透深度。
10．如权利要求9的方法，其特征在于，还包括在该光束存在时改变焦平面在组织内的辐射位置，从而光激活在该组织表面和基本上超过该组织表面的位置之间的多个位置上的至少一种光敏试剂。
11．如权利要求1的方法，其特征在于，在基本上超过该组织表面的可控位置上，所述特定体积中的所述至少一种光敏试剂变成光激活的。
12．如权利要求11的方法，其特征在于，所述处理步骤包括向所述特定体积投射激光。
13．如权利要求12的方法，其特征在于，所述处理步骤包括向所述特定体积投射脉冲激光。
14．如权利要求13的方法，其特征在于，所述激光是脉冲的，以产生最大为约10ps的脉冲。
15．如权利要求1的方法，其特征在于，所述多光子光激活包括至少两个光子与所述试剂基本同时的相互作用，以产生被光激活的试剂。
16．如权利要求1的方法，其特征在于，所述试剂选自包括下列试剂的组：补骨脂素衍生物；卟啉和血卟啉衍生物；二氢卟酚衍生物；酞菁衍生物；若丹明衍生物；香豆素衍生物；苯并吩恶衍生物；氯丙嗪及氯丙嗪衍生物；叶绿素和细菌叶绿素衍生物；脱镁叶绿甲酯一酸a[Pheo a]；部花青540[MC 540]；维生素D；5-氨基-酮戊酸[ALA]；光敏剂(photosan)；脱镁叶绿甲酯一酸-a[Ph-a]；包括各种吩恶嗪染料的吩恶嗪尼罗蓝衍生物；PHOTOFRIN；苯并卟啉衍生物一元酸；SnET2；和Lutex。
17．如权利要求1的方法，其特征在于，所述多光子光激活是一简并过程。
18．如权利要求1的方法，其特征在于，所述处理方法用于疾病的光动力学治疗。
19．如权利要求1的方法，其特征在于，所述处理方法用于选择性组织变性。
20．如权利要求1的方法，其特征在于，所述处理方法用于激光外科。
21．如权利要求1的方法，其特征在于，所述处理方法用于纹身去除。
22．如权利要求1的方法，其特征在于，所述多光子光激活涉及n个光子，其中，n等于2或多个光子，并能够改变n，以优化所述试剂被光激活的组织体积。
23．如权利要求1的方法，其特征在于还包括通过改变所述光的位置、辐射度和持续时间控制光激活的步骤。
24．如权利要求3的方法，其特征在于还包括改变所述一或多个超短脉冲的脉冲能量以获得所希望的治疗过程的步骤。
25．如权利要求24的方法，其特征在于，设置所述脉冲能量，使得所述希望的治疗过程基本上是一光物理学过程。
26．如权利要求24的方法，其特征在于，设置所述脉冲能量，使得所述希望的治疗过程基本上是一光化学过程。
27．如权利要求1的方法，其特征在于，所述多光子激活导致所述至少一种光敏试剂跃迁到量子力学所允许的较高能态的电子激发。
28．如权利要求1的方法，其特征在于，所述多光子激活导致所述至少一种光敏试剂跃迁到量子力学所允许的较高能态的振动激发。
29．如权利要求1的方法，其特征在于，所述多光子激活导致所述至少一种光敏试剂的光电离。
30．如权利要求1的方法，其特征在于，促进光敏试剂的所述多光子激发的光是一未聚焦光束。
31．如权利要求30的方法，其特征在于，所述特定体积的组织基本上位于组织表面上。
32．如权利要求30的方法，其特征在于，所述特定体积的组织基本上位于组织表面下方。
33．如权利要求30的方法，其特征在于还包括基本上将所述试剂限制于待处理组织的特定体积的步骤。
34．一种在特定体积的材料内产生至少一种光激活试剂的方法，该方法包括用光处理该特定体积的材料，以促进保留在特定体积材料中的所述至少一种光敏试剂的多光子光激励，其中至少一种在该特定体积材料中的光敏试剂变成光激活的试剂。
35．如权利要求34的方法，其特征在于用至少一种光敏试剂预处理材料，使得在用足以促进所述至少一种光敏试剂中的至少一种试剂的所述多光子激发的光处理特定体积的材料时，材料中保留了至少一种光敏试剂的至少一部分。
36．如权利要求34的方法，其特征在于，该材料选自由植物组织和动物组织构成的组中。
37．如权利要求36的方法，其特征在于，在所述特定体积的一个可控位置，所述至少一种光敏试剂变成光激活的。
38．如权利要求36的方法，其特征在于所述试剂是一外部试剂。
39．如权利要求38的方法，其特征在于，所述外部试剂选自包括下列试剂的组中：补骨脂素衍生物；卟啉和血卟啉衍生物；二氢卟酚衍生物；酞菁衍生物；若丹明衍生物；香豆素衍生物；苯并吩恶衍生物；氯丙嗪及氯丙嗪衍生物；叶绿素和细菌叶绿素衍生物；脱镁叶绿甲酯一酸a[Pheo a]；部花青540[MC 540]；维生素D；5-氨基-酮戊酸[ALA]；光敏剂(photosan)；脱镁叶绿甲酯一酸-a[Ph-a]；包括各种吩恶嗪染料的吩恶嗪尼罗蓝衍生物；PHOTOFRIN；苯并卟啉衍生物一元酸；SnET2；和Lutex。
40．如权利要求36的方法，其特征在于，所述试剂是一内部试剂。
41．如权利要求40的方法，其特征在于，所述内部试剂选自包括下列试剂的组中：蛋白质，包括黑素、血红素和叶红素的天然发色剂，水、胶原和纹身染料。
42．如权利要求34的方法，其特征在于，促进所述光敏试剂的多光子激励的光是由激光器产生的激光。
43．如权利要求42的方法，其特征在于，该激光包括一或多个超短脉冲串。
44．如权利要求43的方法，其特征在于，所述一或多个超短脉冲中的每一个具有的脉冲持续时间最大为约10ps。
45．如权利要求42的方法，其特征在于包括操作该激光器以产生波长在约500nm-4000nm之间的光。
46．如权利要求34的方法，其特征在于，所述光的波长在约500nm-4000nm之间。
47．如权利要求34的方法，其特征在于，促进所述光敏试剂的多光子激励的光是聚焦的光束。
48．如权利要求47的方法，其特征在于，该聚焦光束是激光。
49．如权利要求34的方法，其特征在于，所述处理特定体积材料的步骤包括：把光束的焦点定位在一定位置范围内，使得该光束的焦平面出现在该材料的表面和基本上超过该材料表面的点之间的一个位置上，从而使所述处理特定体积材料的步骤可以在该材料内延伸至穿透深度。
50．如权利要求49的方法，其特征在于，在基本上超过该组织表面的可控位置上，所述特定体积中的所述至少一种光敏试剂变得光激活的。
51．如权利要求34的方法，其特征在于，所述处理步骤包括向所述特定体积投射激光。
52．如权利要求34的方法，其特征在于，所述处理步骤包括向所述特定体积投射脉冲激光。
53．如权利要求52的方法，其特征在于，所述激光是脉冲的，以产生最大为约10ps的脉冲。
54．如权利要求49的方法，其特征在于，还包括在该光束存在时改变焦平面在材料内的辐射位置，从而光激活在该材料表面和基本上超过该材料表面的位置之间的多个位置上的至少一种光敏试剂。
55．如权利要求34的方法，其特征在于，所述多光子光激活包括至少两个光子与所述试剂基本同时的相互作用，以产生被光激活的试剂。
56．如权利要求34的方法，其特征在于，所述多光子光激活是一简并过程。
57．如权利要求36的方法，其特征在于，所述处理方法用于疾病的光动力学治疗。
58．如权利要求36的方法，其特征在于，所述处理方法用于选择性组织变性。
59．如权利要求36的方法，其特征在于，所述处理方法用于激光外科。
60．如权利要求36的方法，其特征在于，所述处理方法用于纹身去除。
61．如权利要求34的方法，其特征在于，所述多光子光激活涉及n个光子，其中，n等于2或多个光子，并能够改变n，以优化所述试剂被光激活的组织体积。
62．如权利要求34的方法，其特征在于还包括通过改变所述光的位置、辐射度和持续时间控制光激活的步骤。
63．如权利要求43的方法，其特征在于还包括改变所述一或多个超短脉冲的脉冲能量以获得所希望的治疗过程的步骤。
64．如权利要求63的方法，其特征在于，设置所述脉冲能量，使得所述希望的治疗过程基本上是一光物理学过程。
65．如权利要求63的方法，其特征在于，设置所述脉冲能量，使得所述希望的治疗过程基本上是一光化学过程。
66．如权利要求34的方法，其特征在于，所述多光子激活导致所述至少一种光敏试剂跃迁到量子力学所允许的较高能态的电子激发。
67．如权利要求34的方法，其特征在于，所述多光子激活导致所述至少一种光敏试剂跃迁到量子力学所允许的较高能态的振动激发。
68．如权利要求34的方法，其特征在于，所述多光子激活导致所述至少一种光敏试剂的光电离。
69．如权利要求34的方法，其特征在于，促进所述光敏试剂的多光子激发的光是一未聚焦光束。
70．如权利要求69的方法，其特征在于，所述特定体积的材料基本上位于材料表面上。
71．如权利要求69的方法，其特征在于，所述特定体积的组织基本上位于材料表面下方。
72．如权利要求69的方法，其特征在于还包括基本上将所述试剂限制于待处理材料组织的特定体积的步骤。
73．一种用于医疗处理特定体积组织的方法，其中该组织包括至少一种光敏试剂，该方法包括下列步骤：
将光投射到该组织内感兴趣的特殊区域，包括基本上在一组织表面下方的区域，选择所述光以穿透该组织并基本上仅在焦点区域促进多光子激发；
在所述组织内，控制所述焦点区域的位置在一定深度范围内；和
利用多光子激发，在所述组织内，在所述一定深度范围内，光激活所述至少一种试剂中的至少一种，从而基本上仅在该焦点区域产生至少一种被光激活的试剂。
74．如权利要求73的方法，其特征在于，所述投射步骤包括向所述特定体积投射由一激光器产生的激光。
75．如权利要求73的方法，其特征在于，所述投射步骤包括向所述特定体积投射一或多个超短激光脉冲。
76．如权利要求75的方法，其特征在于，操作所述激光器以产生脉冲，每个所述脉冲的脉冲持续时间最大为约10ps。
77．如权利要求73的方法，其特征在于用至少一种光敏试剂预处理组织，使得在用足以促进所述至少一种光敏试剂中的至少一种试剂的所述多光子激发的光处理特定体积的组织时，组织中保留了至少一种光敏试剂的至少一部分。
78．如权利要求73的方法，其特征在于，所述试剂是一内部试剂。
79．如权利要求78的方法，其特征在于，所述内部试剂选自包括下列试剂的组中：蛋白质，包括黑素、血红素和叶红素的天然发色剂，水、胶原和纹身染料。
80．如权利要求73的方法，其特征在于，所述试剂是一外部试剂。
81．如权利要求80的方法，其特征在于，所述外部试剂选自包括下列试剂的组中：补骨脂素衍生物；卟啉和血卟啉衍生物；二氢卟酚衍生物；酞菁衍生物；若丹明衍生物；香豆素衍生物；苯并吩恶衍生物；氯丙嗪及氯丙嗪衍生物；叶绿素和细菌叶绿素衍生物；脱镁叶绿甲酯一酸a[Pheo a]；部花青540[MC 540]；维生素D；5-氨基-酮戊酸[ALA]；光敏剂(photosan)；脱镁叶绿甲酯一酸-a[Ph-a]；包括各种吩恶嗪染料的吩恶嗪尼罗蓝衍生物；PHOTOFRIN；苯并卟啉衍生物一元酸；SnET2；和Lutex。
82．如权利要求73的方法，其特征在于，促进所述光敏试剂的多光子激发的光是波长在约500nm-4000nm之间的激光。
83．如权利要求73的方法，其特征在于，促进所述光敏试剂的多光子激发的光是一聚焦光束。
84．如权利要求83的方法，其特征在于，该聚焦光束是激光。
85．如权利要求73的方法，其特征在于，促进所述光敏试剂的多光子激发的光是一未聚焦光束。
86．如权利要求85的方法，其特征在于，所述感兴趣的区域基本上位于组织表面上。
87．如权利要求85的方法，其特征在于，所述感兴趣的区域基本上位于组织表面下方。
88．如权利要求85的方法，其特征在于还包括基本上将所述试剂限制于待处理组织的特定体积的步骤。
89．如权利要求73的方法，其特征在于，所述处理特定体积的植物或动物组织的步骤包括：把光束的焦点定位在一定位置范围内，使得该光束的焦平面出现在该组织的表面和基本上超过该组织表面的点之间的一个位置上，从而使所述处理特定体积的植物或动物组织的步骤可以在组织内延伸至穿透深度。
90．如权利要求73的方法，其特征在于，在基本上超过该组织表面的可控位置上，所述特定体积中的所述至少一种光敏试剂变成光激活的。
91．如权利要求73的方法，其特征在于，还包括在该光束存在时改变焦平面在组织内的辐射位置，从而光激活在该组织表面和基本上超过该组织表面的位置之间的多个位置上的至少一种光敏试剂。
92．如权利要求73的方法，其特征在于，所述多光子光激活包括至少两个光子与所述试剂基本同时的相互作用，以产生被光激活的试剂。
93．如权利要求73的方法，其特征在于，所述多光子光激活是一简并过程。
94．如权利要求73的方法，其特征在于，所述处理方法用于疾病的光动力学治疗。
95．如权利要求73的方法，其特征在于，所述处理方法用于选择性组织变性。
96．如权利要求73的方法，其特征在于，所述处理方法用于激光外科。
97．如权利要求73的方法，其特征在于，所述处理方法用于纹身去除。
98．如权利要求73的方法，其特征在于，所述多光子光激活涉及n个光子，其中，n等于2或多个光子，并能够改变n，以优化所述试剂被光激活的组织体积。
99．如权利要求73的方法，其特征在于还包括通过改变所述光的位置、辐射度和持续时间控制光激活的步骤。
100．如权利要求75的方法，其特征在于还包括改变所述一或多个超短脉冲的脉冲能量以获得所希望的治疗过程的步骤。
101．如权利要求100的方法，其特征在于，设置所述脉冲能量，使得所述希望的治疗过程基本上是一光物理学过程。
102．如权利要求100的方法，其特征在于，设置所述脉冲能量，使得所述希望的治疗过程基本上是一光化学过程。
103．如权利要求73的方法，其特征在于，所述多光子激活导致所述至少一种光敏试剂跃迁到量子力学所允许的较高能态的电子激发。
104．如权利要求73的方法，其特征在于，所述多光子激活导致所述至少一种光敏试剂跃迁到量子力学所允许的较高能态的振动激发。
105．如权利要求73的方法，其特征在于，所述多光子激活导致所述至少一种光敏试剂的光电离。
106．如权利要求73的方法，其特征在于，所述光激活步骤包括：利用第一个光子的能量激发所述至少一种试剂中的至少一种试剂跃迁到初始态和激发态之间的一瞬时虚拟能态，并在所述试剂跃迁回到初始态之前，利用至少一个第二光子的能量激发所述试剂到达量子力学所允许的激发态。
107．一种用于处理特定体积的植物或动物组织的方法，所述组织在该特定体积内包括至少一种光敏试剂，该方法包括：
照射所述特定体积的组织，以引起所述至少一种光敏试剂中的至少一种试剂的多光子激发；
其中，在多光子激发位置的所述至少一种光敏试剂首先被激发到一瞬时虚拟能态，然后激发到量子力学所允许的激发态，其中在特定体积中的至少一个被激发的光敏试剂变成光激活的。
108．如权利要求107的方法，其特征在于，包括对基本上位于组织表面下方的特定体积植物或动物组织的处理。
109．如权利要求108的方法，其特征在于，尽管光路通过在所述表面和所述特定体积之间的其它组织部分，所述光照和所述瞬时虚拟能态基本上仅在所述特定体积上发生。
110．如权利要求109的方法，其特征在于，还包括改变在组织表面下方一定深度范围内多光子激发发生的位置。
111．如权利要求107的方法，其特征在于，所述照射步骤包括向所述特定体积投射由激光器产生的激光束。
112．如权利要求107的方法，其特征在于，所述照射步骤包括向所述特定体积投射具有一或多个脉冲持续时间最大为约10ps的脉冲的超短激光束。
113．如权利要求112的方法，其特征在于，所述脉冲激光束提供的单独的光子具有足够的能量，以便直接将试剂从基态激发到受激的电子态。
114．如权利要求107的方法，其特征在于，所述多光子光激活是一简并过程。
115．如权利要求107的方法，其特征在于，所述多光子光激活涉及n个光子，其中，n等于2或多个光子，并能够改变n，以优化所述试剂被光激活的组织体积。
116．如权利要求107的方法，其特征在于，包括处理基本上位于组织表面上的特定体积的植物或动物组织。
117．一种用于处理特定体积的植物或动物组织的装置，所述组织包含至少一种光敏试剂，该装置包括：
一光源，所述光的频率基本上足以穿透到组织，所述光适于促进包含在该组织中的试剂的多光子激发；和
聚焦装置，用于使在整个焦距范围内从所述组织表面延伸到实质上超出所述表面的深度的光聚焦，所述光源和聚焦装置共同作用，以促进试剂的多光子激发；
其中根据所述光源可调整焦点或焦平面。
118．如权利要求117的装置，其特征在于，促进所述多光子光激活的光是由激光器产生的激光。
119．如权利要求118的装置，其特征在于该激光包括一或多个超短脉冲。
120．如权利要求119的装置，其特征在于，所述一或多个脉冲中的每一个具有的脉冲持续时间最大为约10ps。
121．如权利要求118的装置，其特征在于包括操作激光器以产生波长在约500nm-4000nm之间的光。
122．如权利要求117的装置，其特征在于，所述光的波长在约500nm-4000nm之间。
123．如权利要求117的装置，其特征在于，所述试剂是外部试剂。
124．如权利要求123的装置，其特征在于，所述试剂选自包括下列试剂的组中：补骨脂素衍生物；卟啉和血卟啉衍生物；二氢卟酚衍生物；酞菁衍生物；若丹明衍生物；香豆素衍生物；苯并吩恶衍生物；氯丙嗪及氯丙嗪衍生物；叶绿素和细菌叶绿素衍生物；脱镁叶绿甲酯一酸a[Pheo a]；部花青540[MC 540]；维生素D；5-氨基-酮戊酸[ALA]；光敏剂(photosan)；脱镁叶绿甲酯一酸-a[Ph-a]；包括各种吩恶嗪染料的吩恶嗪尼罗蓝衍生物；PHOTOFRIN；苯并卟啉衍生物一元酸；SnET2；和Lutex。
125．如权利要求117的装置，其特征在于，所述试剂是内部试剂。
126．如权利要求125的装置，其特征在于，所述内部试剂选自包括下列试剂的组中：蛋白质，包括黑素、血红素和叶红素的天然发色剂，水、胶原和纹身染料。
127．一种光动力学治疗给药用的装置，包括：
光源装置，用于把受约束光射向待治疗组织并进入到组织中，选择所述光的频率和能量，以穿透组织表面下方，并实质上仅在聚焦区域促进多光子激发；和
改变聚焦区域位置的装置，用于改变光在待治疗组织中一定深度范围内聚焦区域的位置，使得利用多光子激发的组织内的试剂变成光激活的。
128．如权利要求127的装置：
其特征在于，该光源装置包括产生准直光束的装置；和
该光源装置还包括聚焦装置，用于把准直光束聚焦到在组织表面下方一点处的组织上的聚焦区域。
129．一种光动力学治疗给药用的装置，包括：
光源装置，用于把非聚焦光射向待治疗组织并进入到组织中，选择所述光的频率和能量，以促进多光子激发，使得利用多光子激发的组织内的试剂变成光激活的。
130．如权利要求129的装置，其特征在于，治疗区域基本位于组织表面上。
131．如权利要求129的装置，其特征在于，治疗区域基本位于组织表面下方。
132．如权利要求1的方法，其特征在于还包括选择所述光的波长的步骤，以促进所述多光子激活，以便优化在所述体积的组织中的所述至少一种光敏试剂的光激活的效率和选择性。
133．如权利要求34的方法，其特征在于还包括选择所述光的波长的步骤，以促进所述多光子激发，以便优化在所述体积的材料中的所述至少一种光敏试剂的光激活的效率和选择性。
134．如权利要求73的方法，其特征在于还包括选择所述光的波长的步骤，以促进所述多光子激发，以便优化在所述体积的组织中的所述至少一种光敏试剂的光激活的效率和选择性。
135．如权利要求109的方法，其特征在于还包括选择所述光的波长的步骤，以促进所述多光子激发，以便优化在所述体积的组织中的所述至少一种光敏试剂的光激活的效率和选择性。
136．如权利要求117的装置，其特征在于，选择适于促进多光子激发的所述光的波长，以便优化所述试剂的光激活的效率和选择性。
137．如权利要求127的装置，其特征在于，选择适于促进多光子激发的所述光的波长，以便优化所述试剂的光激活的效率和选择性。
138．如权利要求129的装置，其特征在于，选择适于促进多光子激发的所述光的波长，以便优化所述试剂的光激活的效率和选择性。
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