KR20000035894A - 광-활성화에서 선택성을 향상시키는 방법 및 분자 진단제의 검색방법 - Google Patents

광-활성화에서 선택성을 향상시키는 방법 및 분자 진단제의 검색방법 Download PDF

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Abstract

한 가지 이상의 광-활성 분자 제제를 함유하는 식물 또는 동물 조직의 특정 용적을 조영하는 방법을 제공한다. 이 방법은 식물 또는 동물 조직의 특정 용적에 함유된 광-활성 분자 제제의 동시적인 이-광자 여기를 촉진하는 데 충분한 광선으로 식물 또는 동물 조직의 특정 용적을 처리하고; 식물 또는 동물 조직의 특정 용적 중 한가지 이상의 광-활성 분자 제제를 광-활성화시킴으로써, 한 가지 이상의 광-활성화된 분자 제제를 생산하고, 이때, 한 가지 이상의 광-활성화된 분자 제제가 에너지를 방출하며; 적어도 하나의 광-활성화된 분자 제제에 의해 방출된 에너지를 검색한 다음; 식물 또는 동물 조직의 특정 용적에 특징적인 검색된 에너지 신호를 발생시키는 단계로 이루어진다. 본 발명은 또한, 한 가지 이상의 광-활성 분자 제제를 함유하는 특정 용적의 물질을 조영하는 방법을 제공하기도 한다.

Description

광-활성화에서 선택성을 향상시키는 방법 및 분자 진단제의 검색 방법{METHOD FOR IMPROVED SELECTIVITY IN PHOTO-ACTIVATION AND DETECTION OF MOLECULAR DIAGNOSTIC AGENTS}
지금까지, 다양한 분야, 특히 의약 진단 분야에서 활성화 과정으로부터 야기되는 부작용이 거의 발생하지 않으며, 다양한 분자 제제의 원거리 활성화를 선택적으로 조절할 수 있는 방법이 절실히 요구되어 왔다. 활성화 단계에서 바람직한 개선에는 활성화의 위치 및 공간에 비해 공간적이거나 일시적인 조정을 향상시키고, 기타 공존하거나 인접한 분자 제제 또는 구조들의 바람직하지 못한 활성화를 감소시키고, 목적하지 않은 분자 제제의 활성화에 대한, 목적하는 분자 제제의 활성화의 선택성을 향상시키는 것이 포함된다. 다양한 선형 및 비선형 광학 방법들이 매우 특화된 조건 하에서 몇몇 이러한 제제들에 대한 일부 이러한 향상성을 제공할 수 있도록 개발되어 왔다. 하지만, 일반적으로 이러한 방법들의 실행 및 적용성이 그리 바람직하지 못하다. 특히, 광-활성 방법에서 이러한 광-활성화의 적용을 조정하는 데 향상된 수행성을 제공하며, 다양한 분자 진단제를 선택적으로 광-활성화하는 데 사용될 수 있는 방법이 요망되고 있다.
분자 소식자(probes)를 원거리 활성화하는 방법으로서 빛을 방사하는 것을 이용하는 것은 이미 공지된 바이다. 특히, 선형 광학 여기 현상의 방법들은 분자 진단제의 세미-선택적 활성화를 달성하는 방법으로서 광범위하게 사용되어 왔다. 선형 광학 여기 현상은, 분자 진단제와 같은 표적제(a target agent)를 단일 광자에 의해 제공되는 에너지 흡수에 대한 형광 발산과 같은 특정 광화학적 또는 광역학적 공정을 수행하는 경우에 발생한다. 이러한 공정들은 다양한 경우에 있어서, 매우 유용하게 이용될 수 있으며, 많은 경우에 있어서, 이러한 공정들을 이용하는 것이 유리하다. 하지만, 이러한 선형 방법들의 수행이 언제나 목적하는 정도까지 성공하는 것은 아니다. 예를 들면, 일부 분자 소식자들의 여기 현상에 이용하는 자외선 조사는 다른 바람직하지 못한 부작용과 함께 인체 및 동물들에게 있어서, 피부암을 유발시키는 등과 같은 질병을 야기시킬 수 있다는 것이 명백한 단점을 나타내는 것이다. 또한, 바람직한 투과 정도에 미달되어, 주로 이러한 제제의 선형 흡수대(absorption band) 근처 파장에서 투사 소식자 방사의 흡수 및 광학 산란 효과의 결과로서, 분자 제제의 선형 광학 여기 현상 정도에서 좀더 많은 노력이 투여되어야 하므로 귀찮게 된다. 예를 들면, Wachter 및 Fisher(E.A. Wachter 및 W.G. Fisher, "Method and Apparatus for Evaluationg Structureal Weakness in Polymer Matrix Composites," 미국특허 제 5,483,338 호)에는 소식자 분자 제제에서 화학적 변형을 선택적으로 조영할 수 있는 신속한 광학적 방법이 개시되어 있긴 하지만, 투사 소식자 방사의 산란 및 흡수 때문에, 이 방법은 단지 국부 분석에만 적합하다. Vo-Dinh 및 그외의 발명자들(T. Vo-Dinh, M. Panjehpour, B.F. Overholt, C. Farris, F.P. Buckley III 및 R. Sneed, "In-Vivo Cancer-Diagnosis of the Esophagus Using Differential Normalized Fluorescence(Dnf) Indexes," Laseres in Surgery and Medicine, 16(1995) 41-47; 및 M. Panjehpour, B.F. Overholt, J.L. Schmidhammer, C. Farris, P.F. Buckley 및 T. Vo-Dinh, "Spectroscopiec Diagnosis of Esophageal Cancer: New Classfication Model, Improved Measurement System," Gastrointestinal Endoscopy, 41(1995) 577-581)에는 인체내에서 질병에 걸린 조직의 유사한 선형 광학 소식자 검색 방법을 이용하는 것이 개시되어 있지만, 이들 또한 목적하는 투과 깊이에 미달되어 귀찮은 단점이 있으며, 입사 소식자 조사의 산란 및 흡수 때문에 표면 손상의 검색에만 국한된다. 또한, 이러한 유형의 여기 현상은 여기 전력과 선형 관계를 갖기 때문에, 이러한 방법들은 광학 경로에 따라 소식자 여기 현상의 위치를 한정하는 효과적인 수단을 제공하지는 못한다. 사실, 선형 광학 여기 현상을 이용하는 실제 모든 예들은 주변 세포간질, 소식자 분자 종의 여기 현상에서의 좋지 않은 특정성 및, 활성화 범위와 깊이에서의 정확한 조정에 대한 적절한 역학적 메카니즘이 존재하지 않음에 의해 입사 광조사의 바람직하지 못한 흡수 및 산란에 기여할 수 있는 기본적인 실행 한계에 의한 단점을 감수해야만 했다.
다양한 비선형 공학 여기 현상 방법들은 어떠한 적용에서의 광-활성에 대한 선택성을 특히 개선시키며, 선형 여기 방법들에 의해 도출된 다수의 한계들을 처리하고자 하는 데 사용되어 왔다. 실제로, 두 광자의 에너지 두 배를 갖는, 단일 광자의 흡수 결과와 동일한 여기 현상을 일으키는 분자에 의한 두 광자의 동시 흡수로 이루어진 비선형 공정은 이미 공지된 바이며, 세포간질에 의한 광자의 여기 현상의 흡수 및 산란을 감소시키고, 여기 현상 범위에 대한 공간 조정성을 향상시키고, 샘플에 대한 광화학적 및 광역학적 손상을 현저히 감소시킨다는 점에서 이러한 공정의 특정적인 장점이 있다는 것도 잘 알려져 있다. 단일-모드, 연속파(CW: continuous wave) 레이저들로부터 1 GW를 초과하는 피크 파워(peak power)를 갖는 펄스화된 Q-스위치드 레이저들까지가 포함되는 여기 현상의 광원들은 이-광자 여기 현상법의 다양한 예에 사용되어 왔다. 예를 들면, Wirth 및 Lytle(M.J. Wirth 및 F.E. Lytle, "Two-Photon Ecited Molecular Fluorescence in Optically Dense Media," Analytical Chemistry, 49(1977) 2054-2057)에는 광학적으로 조밀한 매질내에 존재하는 표적 분자들에 대한 모의 실험용 방법으로서 비선형 광학 여기 현상을 이용하는 것이 개시되어 있는데, 이 방법은 소식자 조사와 매질 자체간의 바람직하지 못한 직접적인 간섭을 한정하는 데 유용한 것으로 개시되어 있으며, 강력한 흡수 또는 산란 세포간질내에 존재하는 표적 분자 제제를 효과적으로 여기시키는 방법을 제공한다. 활성 영역에 대한 향상된 공간 조정성은 Wirth(M.J. Wirth 및 H.O. Fatunmbi, "Very High Detectability in Two-Photon Spectroscopy," Analytical Chemistry, 62(1990) 973-976)에 의해 더욱 개발되었으며, 특히 Wirth는 현미경적 조영 시스템을 이용하여 표적 분자 제제의 여기 현상에서 매우 큰 공간적 선택성을 달성하는 방법을 개시하였다.
유사한 조정이, 세포 또는 서브-세포 단위에 대한 다양한 분자 형광단 제제의 광-활성에서의 본질적인 고도의 3 차원 조정성을 확보할 수 있도록 비선형 레이저 여기 현상을 이용한, 특별한 에피-발광 공초점 레이저 주사 현미경(epi-illumination confocal laser scanning microscope)을 개시한 Denk 등(W. Denk, J.P. Strickler 및 W.W. Webb, "Two-Photon Laser Microscopy," 미국특허 제 5,034,613 호)에 의해 추가로 적용되어 왔다. 하지만, Denk는 현미경에 특정한 것으로서, 현미경은 슬라이드상의 샘플을 관찰하는 데 사용하는 것이다. 이러한 현미경은 광학적으로 조밀한 매질로 이루어진 생물학적 표본에 분자 형광단 제제를 여기시키는 데 사용된다. Denk에 따르면, 레이저로부터의 빛은 거울에 의한 반사 결과로서 대상면상을 목적으로 하여 아래쪽으로 이동한다. 이후에, 형광 빛은 동일한 광학 경로를 따라, 대물 렌즈, 다수의 거울 및 최종 광증폭 튜브를 통해 역이동한다. 그러므로, 빛은 단지 슬라이드의 대상면상에 초점이 맞춰지고 뒤쪽으로 반사된다. 비선형 이-광자 여기 현상의 특정 성질들은 실질적으로 여기 현상을 한정시키고, 대물 렌즈의 초점에서 생성되는 공초점 영역까지 이에 의해 생성된 형광 시그날의 검색을 한정하여, 초점의 깊이를 정밀하게 조정함으로써 3-차원 조영에 반하여 증진시키는 데 이용된다. 방사되는 형광 빛은 에피-일루미네이션 배열을 이용하여 물체를 여기시킴으로써 모아진다. 세포 및 서브-세포 레벨에서 발광-기초 영상들의 생성에 대한 광-여기 현상의 조정은 임의의 상태에 기초한 표적 샘플내에서 나타난다. 또한, Denk는 초점 면에 위치한 세포들의 광-유발성 회저내에서의 감소가, 자외선 여기 현상 방사를 좀더 손상이 적은 근적외선 여기 현상 방사로 대체하는 것을 기초로 하는, 이 현미경적 접근법의 주요 장점이라고 개시하고 있다.
Denk 등(W. Denk, D.W. Piston and W.W. Webb, "Two-Photon Molecular Excitation in Laser-Scanning Microscopy," in Handbook of Biological Confocal Microscopy, Second Edition, J.B. Pawley, ed., Plenum Press, New York, 1995, pp. 445-458)의 최근 연구에서는, 외부 전체 영역 검색 방법이 이-광자 여기 형광 태그(tags)로부터 생성된 현미경적 조영 데이타 수집용으로 개시되어 있다. 발명자들은 "아직 시도되지 않은 것으로서(as yet untried)"라고 발명자들이 진술한 이 방법은 에피-일루미네이션을 이용하여 역산란된 형광 빛을 모을 필요가 없다(참조, p.452). Denk는 이러한 시도가 현미경 대상물이 방사되는 형광 파장을 투과하지 않는다면 유용하게 될 것이지만, 이는 "대기 실내광에 의해 오염되기 쉬울" 것이라고 기재하고 있다. 이같은 연구 및 초기 Denk의 특허(5,034,613)에서는, 대기광이나 산란 여기광에 의한 배경 간섭(background interference)의 감소용으로 이용하거나 이를 예측할 수 있는 명확한 방법은 없다.
실재로, 이-광자 여기 공정의 공지된 저효율성은 형광 발산에 대한 산란되는, 비흡수성의 여기 광의 매우 높은 비율로 변형할 수 있다. 산란된 여기으로부터 간섭, 및 대기광과 다른 환경 및 장치 배경원으로부터의 간섭을 감소시키고자 하는 다양한 변조 방법들의 사용은 다수가 공지된 바이다. 이-광자 여기 형광의 분야에서, Lytle 및 그외의 발명자들(R.G. Freeman, D.L. Gilliland 및 F.E. Lytle, "Second Harmonic Detection of Sinusoidally Modulated Two-Photon Excited Fluorescence," Analyticl Chemistry, 62(1990) 2216-2219; 및 W.G. Fisher 뭉 F.E. Lytle, "Second Harmonic Detection of Spatially Filtered Two-Photon Excited Fluorescence," Analytical Chemistry, 65(1993) 631-635)은 이차-조화성 검색 방법을 사용함으로써 산란되는 레이저 여기 광을 배제하는 매우 복잡한 방법들을 개시하였는데, 여기 광의 시누소이드성 변형이 하나의 주파수에서 수행되고, 이-광자 여기 형광의 검색이 그 주파수의 2 배에서 수행되는(여기 변형 주파수의 이차 조화) 경우, 산란되는 여기 광의 간섭이 실제로 제거된다. 또한, 전자 및 다른 소음 주파수를 회피할 수 있도록 하는 변형 주파수의 적절한 선택에 의해 장치 및 주위 환경적 간섭은 매우 크게 배제된다.
그러므뢰, 형광의 이-광자 여기 현상이 실험실 조건 하에서 선형 단일-광자 여기 현상에 사용하는 것에 약 2 배되는 파장에서의 빛을 사용하여 분자 형광단을 여기시키게 하는 데 사용할 수 있으며, 이로부터 야기되는 여기 현상이 여기 현상의 위치에대한 3-차원 공간 조정을 향상시킬 수 있으며, 광학적으로 조밀한 매질에서 여기 광의 산란 및 흡수로부터의 간섭을 감소시킬 수 있고, 현미경 검사를 수행하는 살아있는 세포 샘플에 대한 여기 경로에 따른 부대적인 손상을 감소시킬 수 있다는 것이 공지되어 있다.
그래도, 이러한 인용 일례들을 통해 예시된 종래 기술의 실체는 진단 및 다른 생체내의 현미경 조영 용도에 적용할 수 있는 다양한 광-활성화 방법의 다수 장점 측면을 명확히 입증하는 반면에, 한 가지 이상의 분자 제제의 의약 진단 산업의 다른 필요에 부합되는 고도의 공간 조정으로의 선택적인 광-활성화를 달성하는 일반적인 방법은 어디에도 개시된 바 없다. 특히, 의약 진단 적용에 현저한 단위로 이러한 조정을 유효화한 실제적인 방법은 전혀 개시된 바 없다.
따라서, 본 발명의 목적은 한 가지 이상의 분자 제제의 고도의 공간 조정으로의 선택적인 광학-활성화를 달성하는 일반적인 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 의약 진단 산업에서의 다양한 요구에 부합될 수 있도록 하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.
또한, 본 발명의 추가적인 목적은 의약 진단 분야에서 명확한 단위로 이러한 조정을 유효화하는 실제적인 방법을 제공하고자 하는 것이다.
발명의 요약
상기 및 기타 목적 및 장점들을 가질 수 있도록, 본 발명은 일반적으로 특정 용적의 식물이나 동물의 조직을 조영하는 방법을 제공하는데, 이 식물 또는 동물의 조직은 한 가지 이상의 광-활성 분자 제제를 함유한다. 이 방법은 특정 용적의 식물 또는 동물의 조직을 이 특정 용적의 식물 또는 동물 조직내에 함유되어 있는 광-활성 분자 제제의 동시 이-광자 여기 반응을 촉진하기에 충분한 빛으로 처리하고, 특정 용적의 식물 또는 동물의 조직내에 있는 적어도 한 가지 이상의 광학-활성 분자 제제를 광-활성화시켜, 적어도 한 가지 이상의 광-활성화된 분자 제제를 생성시키는 것으로 이루어지는데, 적어도 이 한 가지 이상의 광-활성화된 분자 제제는 에너지를 방출하여, 적어도 이 한 가지 이상의 광-활성화된 분자 제제에 의해 방출되는 에너지를 검색하고, 특정 용적의 식물 또는 동물 조직의 특성이 되는 검색된 에너지의 시그날을 생성시키는 것으로 이루어진다. 본 발명은 또한, 특정 용적의 물질을 조영하는 방법을 제공하는데, 물질들은 적어도 한 가지 이상의 광-활성 분자 제제를 함유한다.
본 발명의 바람직한 일례에서, 적어도 한 가지 이상의 광-활성 분자 제제의 동시 이-광자 여기 반응을 촉진하기에 충분한 빛은 레이제광이 된다. 또한, 광-활성 분자 제제의 동시 이-광자성 여기 반응을 촉진하기에 충분한 빛은 초점화된 광빔(a focused beam of light)이 바람직하고, 초점화된 광빔이 초점화된 레이저광인 것이 좀더 바람직하다.
본 발명의 다른 바람직한 일례에는, 물질, 식물 조직이나 동물 조직을 적어도 한 가지 이상의 광-활성 분자 제제로 처리하는 일차 단계가 추가로 포함되는데, 특정 용적의 물질, 식물 조직이나 동물 조직은 적어도 한 가지 이상의 광-활성 분자 제제의 일부분 이상을 함유한다. 적어도 하나 이상의 광-활성 분자 제제(photo-active molecular agent)가 소랄렌, 5-메톡시소랄렌 (5-MOP), 8-메톡시소랄렌 (8-MOP), 4,5',8-트리메틸소랄렌 (TMP), 4'-아미노메틸-4,5',-8-트리메틸소랄렌 (AMT), 5-클로로메틸-8-메톡시소랄렌 (HMT), 안젤리신 (이소소랄렌), 5-메틸안젤리신 (5-MIP), 3-카르복시소랄렌, 포르피린, 헤마토포르피린 유도체 (HPD), 포토프린 II, 벤조포르피린 유도체 (BPD), 프로토포르피린 IX (PpIX), 염료 헤마토포르피린 에테르 (DHE), 폴리헤마토포르피린 에스테르 (PHE), 프로토포르피린의 13,17-N,N,N-디메틸에틸에탄올아민 에스테르 (PH1008), 테트라(3-히드록시페닐)-포르피린 (3-THPP), 테트라페닐포르피린 모노설포네이트 (TPPS1), 테트라페닐포르피린 디설포네이트 (TPPS2a), 디헤마토포르피린 에테르, 메조테트라페닐포르피린, 메조테트라(4N-메틸피리딜)포르피린 (T4MpyP), 옥타(4-tert-부틸페닐)테트라피라지오포르피라진 (OPTP), 프탈로시아닌, 테트라-(4-tert-부틸)프탈로시아닌 (t4-PcH2), 테트라-(4-tert-부틸)프탈로시아나토마그네슘, (t4-PcMg), 클로로알루미늄 설폰화 프탈로시아닌 (CASPc), 클로로알루미늄 프탈로시아닌 테트라설페이트 (AlPcTS), 모노-설폰화 알루미늄 프탈로시아닌 (AlSPc), 디-설폰화 알루미늄 프탈로시아닌 (AlS2Pc), 트리-설폰화 알루미늄 프탈로시아닌 (AlS3Pc), 테트라-설폰화 알루미늄 프탈로시아닌 (AlS4Pc), 실리콘 프탈로시아닌 (SiPcIV), 아연 II 프탈로시아닌 (ZnPc), 비스(디-이소부틸 옥타데실옥시)실리콘 2,3-나프탈로시아닌 (이소BOSINC), 게르마늄 IV 옥타부톡시프탈로시아닌 (GePc), 로다민 101 (Rh-101), 로다민 110 (Rh-110), 로다민 123 (Rh-123), 로다민 19 (Rh-19), 로다민 560 (Rh-560), 로다민 575 (Rh-575), 로다민 590 (Rh-590), 로다민 610 (Rh-610), 로다민 640 (Rh-640), 로다민 6G (Rh-6G), 로다민 700 (Rh-700), 로다민 800 (Rh-800), 로다민 B (Rh-B), 설포로다민 101, 설포로다민 640, 설포로다민 B, 쿠마린 1, 쿠마린 2, 쿠마린 4, 쿠마린 6, 쿠마린 6H, 쿠마린 7, 쿠마린 30, 쿠마린 47, 쿠마린 102, 쿠마린 106, 쿠마린 120, 쿠마린 151, 쿠마린 152, 쿠마린 152A, 쿠마린 153, 쿠마린 311, 쿠마린 307, 쿠마린 314, 쿠마린 334, 쿠마린 337, 쿠마린 343, 쿠마린 440, 쿠마린 450, 쿠마린 456, 쿠마린 460, 쿠마린 461, 쿠마린 466, 쿠마린 478, 쿠마린 480, 쿠마린 481, 쿠마린 485, 쿠마린 490, 쿠마린 500, 쿠마린 503, 쿠마린 504, 쿠마린 510, 쿠마린 515, 쿠마린 519, 쿠마린 521, 쿠마린 522, 쿠마린 523, 쿠마린 535, 쿠마린 540, 쿠마린 540A, 쿠마린 548, 5-에틸아미노-9-디에틸아미노벤조[a]페녹사지늄 (EtNBA), 5-에틸-아미노-9-디에틸-아미노벤조[a]페노티아지늄 (EtNBS), 5-에틸아미노-9-디에틸아미노벤조[a]페노셀레나지늄 (EtNBSe), 클로르프로마진, 클로르프로마진 유도체, 클로로필 유도체, 박테리오클로로필 유도체, 금속-리간드 착화합물, 트리스(2,2'-비피리딘)루테늄 (II) 디클로라이드 (RuBPY), 트리스(2,2'-비피리딘)로듐 (II) 디클로라이드 (RhBPY), 트리스 (2,2'-비피리딘)플라티늄 (II) 디클로라이드 (PtBPY), 페오포르바이드, 메로시아닌 540, 비타민 D, 5-아미노-레불린산, 포토산, 클로린 e6, 클로린 e6 에틸렌디아미드, 모노-L-아스파르틸 클로린 e6, 페녹사진 Nile 블루 유도체, 스틸벤, 스틸벤 유도체, 및 4-(N-(2-히드록시에틸)-N-메틸)-아미노페닐)-4'-(6-히드록시설포닐)스틸벤 (APSS)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것이 좀더 바람직하다. 또한, 적어도 하나 이상의 광-활성 분자 제제가 특정 용적 물질, 식물 조직 또는 동물 조직내에서의 특정 물질이나 조직에 특정적인 적어도 한 가지 이상의 생물학적 광-활성 분자 제제인 것이 좀더 바람직하고, 적어도 한 가지 이상의 생물학적 광-활성 분자 제제가 DNA, RNA, 아미노산, 단백질, 항체, 리간드, 합텐, 탄수화물 수용체 또는 복합제(complexing agents), 리피드 수용체 또는 복합제, 단백질 수용체 또는 복합제, 킬레이트제, 및 캡슐화 담체으로 이루어진 군 중에서 선택된 것이 바람직하며, 적어도 한 가지 이상의 생물학적 광-활성 분자 제제가 동시의 이-광자 여기 반응을 촉진하기에 충분한 빛을 가하는 경우에 광-활성화되는 단편을 추가로 포함하는 것이 더욱더 바람직하다.
또다른 바람직한 본 발명의 일례에서, 이 특정 용적의 물질, 식물 조직 또는 동물 조직을 이 특정 용적의 물질, 식물 조직 또는 동물 조직의 특정 용적에 포함된 적어도 한 가지 이상의 광-활성 분자 제제의 동시 이-광자성 여기 반응을 촉진하기에 충분한 빛으로 처리하는 단계는 특정 타입의 변조으로 광원으로부터의 빛을 보듈레이팅함으로써, 변조된 빛을 생성시키는 단계와, 이 특정 용적의 물질, 식물 조직 또는 동물 조직을 이 특정 용적의 물질, 식물 조직 또는 동물 조직의 특정 용적에 포함된 적어도 한 가지 이상의 광-활성 분자 제제의 동시 이-광자성 여기 반응을 촉진하기에 충분한 상기 변조된 빛으로 처리하는 단계를 추가로 포함한다. 또한, 본 발명은 특정 타입의 변조으로 검색된 에너지 시그날을 탈변조(demodulating)하여, 특정 용적의 물질, 식물 조직 또는 동물 조직의 특성을 나타내는 탈변조된 에너지 시그날을 생성시키는 단계를 추가로 포함한다.
검색된 에너지 시그날을 특정 타입의 변조로 탈변조하는 단계에 검색된 에너지 시그날을 특정 타입의 변조 주파수의 2 배되는 주파수로 탈변조함으로써, 이 특정 타입의 변조의 이차 하모닉(harmonic)을 검색하는 것을 포함하는 것이 좀더 바람직하다. 또한, 특정 용적의 물질, 식물 조직 또는 동물 조직의 특성을 나타내는 탈변조된 에너지 시그날이 이 특정 용적의 물질, 식물 조직 또는 동물 조직에 존재하는 한 가지 이상의 광-활성화된 분자 제제의 수명을 변화시키는 것을 나타내는 것이 좀더 바람직하다.
본 발명은 미국 에너지성(U.S. Department of Energy)이 록히드 마틴 에너지 시스템, 인코포레이티드(Lockheed Martin Energy Systems, Inc. Lockheed Martin Energy Systems)과 행한 Contract No. DE-AC05-84OR21400 하에서 미국 정부 지원으로 이루어졌으며, 오크 리지 어소시에티드 유니버시티(Oak Ridge Associated Universities)가 본 발명에 대한 권리를 상기 발명자에게 부여하였다. 미국 정부는 미국 에너지성에 의한 Contract No. DE-AC05-84OR21400에 따라 본 발명에 대한 정당한 권리를 갖는다.
본 발명은 일반적으로 한 가지 이상의 분자 제제(molecular agents)의 원거리 효과적인 공간 선택적 광-활성화 방법 및 그의 장치와, 이에 의해 생성되는 검색 시그날의 향상된 측정 방법 및 장치에 관한 것이다. 광-활성화를 유효화하는 방법은 하나의 분자 에너지 레벨로부터 다른 레벨까지 원거리 및 분자 공간 정도가 크게 반응제를 자극하는 비선형 광학 여기 현상의 특정 성질을 이용한 것이다. 이 방법의 공간적 특성은 다양한 내인성 및 외인성 조영 제제를 활성화하는 데 적용할 수 있으며, 특히 인체 및 동물들의 질병 진단에 탁월한 장점을 제공한다. 특히, 비선형 여기 현상의 방법을 사용하는 것은, 현재 통용되는 방법 및 그 방사 정도보다 작은 정도에서 흡수되고 산란되는 근적외선에서 적외선까지를 이용한 심조직(deep tissue)에서의 진단제의 활성화 현상의 조정을 용이하게 한다. 시그날 코드화 및 프로세싱 방법과 이 비선형 여기 방법의 조합은 일반적으로 진단 시그날 검색에서의 감도를 향상시킨다.
상기한 바와 같은, 및 기타 본 발명의 특징 및 장점은 다음과 같은 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 일례의 하기 상세한 설명으로부터 좀더 잘 알 수 있을 것이다.
도 1은 선형 및 비선형 광학 여기 현상의 에너지 레벨 다이어그램의 일례를 도시한 것이다.
도 2는 단일 광자 및 이-광자 여기 현상의 입사 파워(incident power) 분포와 여기 효율 사이의 상관 관계를 도시한 것이다.
도 3은 자외선에서 근적외선 스펙트럼 영역까지에 이르는 동물 조직의 흡수 스펙트럼의 일례를 도시한 것이다.
도 4는 자외선에서 근적외선 스펙트럼 영역까지에 이르는 동물 조직의 산란 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 5는 입사 단파장광 및 장파장광에 대한 조직의 광학적 흡수 및 산란 특성에서의 일반적인 경향성을 도시한 것이다.
도 6은 단일-광자 및 이-광자 여기 방법이 사용되는 경우에 조직내에서의 광학-유도성 여기 범위를 비교하여 나타낸 것이다.
도 7은 용액내에서의 진단제의 선형 여기의 전형적인 특성들을 나타낸 것이다.
도 8은 용액내에서의 진단제의 비선형 여기의 전형적인 특성들을 나타낸 것이다.
도 9는 조직 팬텀(tissue phantom)을 통해 고르게 분포된 염료 분자 쿠마린(coumarine) 480의 이-광자 여기 형광의 사진을 도시한 것이다.
도 10은 종양 표본을 통해 고르게 분포된 염료 분자 쿠마린 480의 이-광자 여기 형광의 사진을 도시한 것이다.
도 11은 내인성 또는 외인성 진단 조영 제제를 영상화하는 본 발명의 특정적인 바람직한 일례의 다이어그램을 나타낸 것이다.
도 12는 조영 성능을 향상시키기 위해 변조를 사용하는, 내인성 또는 외인성 진단 조영 제제를 영상화하는 본 발명의 다른 바람직한 일례의 다이어그램을 나타낸 것이다.
도 13은 표면상의 특징을 비디오 영상화하는 본 발명의 또다른 바람직한 일례의 다이어그램을 나타낸 것이다.
도면의 상세한 설명:
본문에 기재된 본 발명은 분자 제제의 비선형 광학 여기 현상의 고유한 물리적 특성을 이용하여, 이 분자 제제의 광-활성화에 비한 공간 조정을 향상시키는 효과를 갖도록 한다. 또한, 비선형 광학 여기 현상은 여기 경로에 다른 부대적으로 발생하는 여기 현상과 손상을 감소시키고, 여기 상태의 제제의 주변 환경으로부터 야기되는 흡수 및 산란 공정으로부터의 간섭을 감소시키는 것을 포함하여, 의약 진단 및 기타 제제의 광-활성화 동안에 추가 장점을 갖는 것으로 나타난다.
본문에서 기술하고자 하는 본 발명의 기본적인 요지는 고도의 공간 조정 및 개선된 투과 깊이로 한 가지 이상의 분자 진단제를 원거리 광-활성화시키는데 비선형의, 동시 이-광자성 광학 여기 반응을 이용한다는 데 있다. 이러한 분자 제제들은 검사 하의 시스템에 첨가되는 외인성 제제이거나, 이 시스템의 내인성 성분일 수 있다. 외인성 진단제의 일례에는 다양한 프소라렌(psoralen) 유도체가 포함되며, 내인성 진단제의 일례에는 방향족 아미노산 및 핵산이 포함된다. 이-광자성 여기 현상은 해당 단일 광자 흡수 밴드의 약 2 배 정도의 파장으로 수행된다. 검사되는 표본으로 광학적 조사빔의 초점을 맞춤으로써, 진단제는 실질적으로 초점이 맞춰진 빔의 공초점 영역으로 한정되는 범위에서 여기될 수 있다. 공초점 영역, Zc는 2πW02/λ(여기서, W0는 최소 빔 허리(beam waist)의 직경이며, λ는 광조사 파장임)의 거리를 연장한 영역으로서 정의된다. 대조적으로, 선형 여기 방법을 이용하는 경우, 여기는 실질적으로 전체 광학 경로에 따라 발생되어, 여기의 공간 위치가 현저하게 감소되어 한정된다. 따라서, 이-광자 여기 공정을 이용하면, 광학 경로를 따라 여기 분석능(resolution)이 크게 증가된다. 또한, 여기가 해당 선형 여기 공정에 비해 장파장에서 수행되기 때문에, 여기 에너지의 산란 및 흡수가 큰 폭으로 감소된다. 인체 조직과 같은 두껍고, 광학적으로 조밀한 샘플의 경우, 이는 이-광자 여기가 선형 여기 방법을 사용할 수 있는 것보다 훨씬 큰 깊이에서 일어날 수 있음을 의미하는 것이다. 진단제로부터의 방사되는 빛의 근원에 관한 공간 정보가 여기 초점과 상관 관계를 가지며, 이에 의해 코드화될 수 있기 때문에, 이 방사되는 빛을 산란없이 직접 검색하거나 조영할 필요가 없다. 이 표본고 관련하여 이러한 초점의 위치를 이동함으로써, 상기 방사되는 빛의 이차원 또는 삼차원의 영상이 개발될 수 있다. 또한, 여기광을 변조하고, 검색 장치상에서의 적절한 탈변조 방법을 이용함으로써, 산란되는 여기광 및 기타 간섭의 배제가 현저히 개선될 수 있다.
본 발명은 인체의 유방암과 같은 조직의 질환 및 기타 특성들을 생체내 검색 및 조영하고자 하는 것이 주요 목적이다. 하지만, 본 발명의 전문이 개시되면, 이러한 방법 및 장치가 다수의 부가적인 적용법을 가지며, 이러한 방법 및 장치는 Denk등이 개시한 바와 같은 이-광자 레이저 주사 현미경의 분야에 적용되어 이러한 장비들의 성능 특성을 실질적으로 개선할 수 있다는 것은 명백한 바이다. 이러한 전문 기술을 시작하기 위해서는, 선형 및 비선형 광학 여기에 기초가 되는, 기본적인 물리학적 검토가 유용하게 될 것이다.
선형 및 비선형 여기 - 에너지 레벨 다이어그램 공식의 비교:
도 1은 선형 및 비선형 광학 여기 공정에 대한 전형적인 분자 에너지 레벨 다이어그램을 나타낸 것이다. 단순화된 Jablonski 다이어그램으로 이루어진 이 도면에서, 종축은 에너지 변화에 해당하는 것이고, 횡축은 왼쪽에서 오른쪽으로 진행하는 것으로 사건들의 순서를 나타낸 것이다. 수평의 실선들은 양자역학적으로 허여되는 분자 에너지 레벨을 나타내며, 수평의 점선들은 비허여된 가상의 에너지 레벨을 나타낸다. 양자역학적으로 허여된 분자 에너지 레벨은 비교적 오래 동안 지속되며, 적절한 에너지의 광자를 흡수함으로써 제공되는 바와 같은 에너지 흡수에 따른 분자의 여기 가능성이 높다. 가상 에너지 레벨들은 다양한 여기 공정들을 통해서 다다를 수 있지만, 허여된 분자 전이와는 반대로, 이들은 매우 짧은 수명을 가져(Heisenberg 불확정성 원리에 의해 제시된 바에 따르면, 약 10-15s 정도), 특정 여기 조건 하에서만 명백해진다. Jablonski 다이어 그램에서 직선 화살표는 방사 에너지 전이 공정들을 나타내는데, 상방향의 화살표는 에너지 흡수를 나타내는 것이며, 하방향의 화살표는 광자의 형광 또는 인광 방사와 같은 발광 방사를 나타낸 것이다. 지그재그선의 화살표는 진동 이완과 같은 비-발광성 에너지 전이 과정을 나타낸 것이다. 직선 또는 지그재그선의 화살표의 세로 길이는 주어진 과정에서 흡수되거나 방출되는 에너지에 비례하는 것이다.
도 1에 나타낸 바와 같은 일차 Jablonski 다이어그램의 경우, 허여된 에너지 레벨 2까지의 단일-광자 여기는 알처 허여된 전자 에너지 레벨 6(일반적으로, 가장 낮은 전자 에너지 레벨, 또는 바닥 상태, 이하, S0이라 함)로부터 좀더 큰 전체 에너지 레벨을 갖는 이차 허여된 전자 에너지 레벨 8(이하, S1상태라 함)까지로 분자를 직접 자극하기에 cd분한 에너지를 갖는 광자 4의 흡수에 의해 야기될 수 있다. 다중 허여되는 좀더 큰 전자 에너지 레벨까지의 여기가 가능하며, 이들은 전형적으로 그들의 에너지 증가에 따라 S1, S2등이라 한다. S1이라 함은 Pauli 배타 원리에 부합되는 단일항(singlet)의 전자 에너지 레벨을 나타내는 것으로, 모든 전자들의 스핀은 짝지워져 있으며, 이 짝진 전자 스핀들은 서로 반대가 된다. 또한, 하나 이상의 삼중항(triplet) 여기 상태 10은 T1으로 예시된 바와 같이 몇몇 분자 시스템들이 가능하다. 삼중항 상태는 모든 전자들의 스핀이 둘을 제외하고는 짝지워져 있다는 점에서 단일항 상태와 구별된다. 각각 허여된 전자 에너지 레벨(단일항이나 삼중항)은 불연속 진동 레벨 12의 세트(ensemble)로 세분될 수 있으며, 이 불연속 진동 레벨 12 각각은 다시 불연속 회전 에너지 레벨들의 세트로 추가 세분될 수도 있다. 그러므로, 각각의 허여된 전자 에너지 레벨, S0, S1, T1등은 다수의 가능한 진동 및 회전 가능성이 있기 때문에, 허여된 레벨들의 복합 밴드(complex band)로 이루어진다. 광자 4로부터 에너지 흡수에 따라, 분자들은 때때로 전자 진동 레벨로서 언급되는, 특정적인 고유 전자 및 진동 레벨 14로 자극된다. 이 다음에, 이 들든 상태에서, 분자는 신속한 내부 전환 16을 진행할 수 있으며, 예컨대 이차 허여된 전자 에너지 레벨 8에서 허여된 여기 진동 에너지 레벨 중 가장 낮은 레벨인 18까지 에너지 변환될 수 있다. 이 내부 전환 16은 전형적으로 매우 빠른데, 약 10-12내지 10-15sec 정도의 시간 단위에서 발생한다. 최종적으로, 여기 상태의 분자는 충돌 비활성화 20을 통해서와 같은 추가 이완 작용을 수행하여, 초기, 일차 에너지 레벨 16으로 돌아온다. 또다른 이완 과정으로는 광자 21의 형광 방사가 포함되는데, S으로부터 S가지 직접 발생하며, 이후에 단일항 상태에서부터 삼중항 상태 10으로의 계내 교차(intersystem crossing) 22가 발생한다. S1→ S0로 나타내는 바와 같은 단일항에서 단일항으로의 전자 전이는 파울리(Pauli) 배타 원리에 따라 양자역학적으로 허여되는 전이들로 이루어진다. 이와는 달리, S1→ T1로 나타내는 바와 같은 단일항에서 삼중항 상태 10으로의 전이는 전자 스핀이 짝진 채로 남지 않기 때문에 양자역학적으로 금지된 것이다. 하지만, 내부 전환의 가능성이 일부 분자계에서는, 이 계에 대해서 일정한 계내 교차 속도에 비해 S1상태의 수명이 긴 결과로서, 0 이상이 된다. T1→ S0와 같은 삼중항 상태 10으로부터 다시 단일항 상태로의 전이는 광자 24의 인광 방사로서 알려진 방사 과정 통해 일어날 수 있다. 인광은 일반적으로, 이 과정의 비-허여된 특성 때문에 형광에 비해 비교적 긴 방사 수명을 특징으로 한다. 허여된 에너지 레벨 2로의 단일-광자 여기의 일례로는, 400 nm에서의 단일 광자 4의 흡수를 통해 바닥 전자 상태로부터 여기 전자 상태로 염료 분자 쿠마린의 촉진화, 이후의 내부 전환 16 및 480 nm에서의 광자 21의 후속 형광 방사를 들 수 있다. 이 일례에서, 여기 현상의 확률은 입사 광학 조사 출력과 선형적인 상관 관계가 있으므로, 허여된 에너지 레벨 2로의 단일-광자 여기 현상은 선형 여기(excitation) 과정으로서 언급된다.
도 1에 도시한 두 번째 Jablnski 다이어그램에서는, 가상 에너지 레벨 26으로의 단일-광자 여기가, 좀더 큰 허여된 전자 에너지 레벨 8로 분자를 직접 자극하기에는 불충분한 에너지를 갖는 광자 28의 흡수에 따라 발생한다. 대신에, 분자는 아주 짧은 수명의 가상 에너지 레벨 30으로 자극된다. 이 가상 에너지 레벨 30은 전형적으로 약 10-15sec 정도의 수명을 가질 것이다. 사실상, 이 가상 레벨 30으로부터의 흡수된 광자 28의 순간적인 재-방사(re-emission) 32가 탄성 산란(elastic scatter)과 같은 공정들을 통해 전형적으로 발생된다. 이 과정의 중요한 예로는, 800 nm에서의 빛으로의 여기에 따른 쿠마린으로부터 800 nm에서의 Rayleigh 산란을 들 수 있다. 다른 예로서는 Raman 산란을 들 수 있는데, 이는 바닥 상태와 관련된 다양한 진동 레벨로 되돌아오는 경우 발생한다. 이러한 과정의 예에서, 여기의 확률은 또한, 입사 조사광의 출력에 선형적인 관계가 있으므로, 가상 에너지 레벨 26으로의 단일 광자 여기 또한, 선형 여기 과정으로서 언급된다.
도 1에 도시된 마지막 Jablonski 다이어그램의 경우, 허여된 에너지 레벨 34로의 동시 이-광자 여기가, 두 광자들 36으로의 일차 및 두 광자들 38의 이차 동시 흡수에 따라 일어난다. 이 경우에, 두 광자들 36의 일차 및 두 광자들 38의 이차의 에너지 합은 일차 허여된 에너지 레벨 6으로부터 이차 허여된 에너지 레벨 8으로 분자를 자극하기에 충분하다. 전형적으로, 두 광자들 36의 일차 또는 두 광자들 38의 이차의 그 어떠한 것의 개별 에너지들도 이 또는 어떠한 다른 허여된 전자 전이를 직접 촉진하기에는 충분하지 않다. 대신에, 일차 두 광자 36은 분자를 매우 짧은 수명의 가상 에너지 레벨 30으로 자극한다. 이는 두 번째 Jablonski 다이어그램에서 도시한 바와 같은 가상 에너지 레벨고 동일하다. 이 가상 에너지 레벨 32로부터 재-방사 32가 발생하기 전에, 이차 두 광자 38이 즉시 분자를 이차 허여된 전자 에너지 레벨 8로 자극한다. 이 결과, 허여된 에너지 레벨 2로의 선형 단일 광자 여기를 이용하여 달성되는 바와 동일하게 여기된다. 일차 두 광자 36 및 이차 두광자 38은 동일한 에너지이거나 동일하지 않은 에너지일 수 있다. 또한, 입사 여기광의 Wm-2, 또는 순간적인 광조사는, 가상 에너지 레벨 30이 원래 일차 허여된 전자 에너지 레벨 6로의 이완 작용 32를 진행하기 전에 이차 두 광자 38의 흡수에서의 현저한 효율을 생성시키기 위해서는 비교적 큰 값이어야만 한다. 사실, 가상 에너지 레벨 30의 수명은 약 10-5sec 정도이기 때문에, 매우 큰 피크 출력을 갖는 펄스 여기 광원이 이러한 공정들을 효율적으로 자극하는 데 통상적으로 사용되며, 이러한 광원들은 다수의 광자들을 가상 에너지 레벨 30의 짧은 수명 동안의 여기 분자에 제공할 수 있기 때분에 통상적으로 바람직하다. 분자들이 이차 허여된 전자 에너지 레벨 8로 자극되면, 신속한 내부 전환 16이 수행되며, 이후에 충돌 활성 감소화 20, 광자 21의 형광 방사 또는 삼중항 상태 10으로의 계내 교차 22를 통해서와 같은 추가 이완 작용이 수행될 수 있다. 마지막 경우에서, 삼중항 상태 10으로부터 단일항 바닥 상태 6으로의 역전이가 광자 24의 인광 방사를 통해 일어날 수 있다. 동시의 이-광자 여기는 허여된 에니지 레벨 2로의 두 단일-광자 여기와 가상 에너지 레벨 26으로의 단일 광자 여기의 장점을 공유한 것으로, 특히, 가상 에너지 레벨 30이 분자를 바닥 상태로부터 들든 상태로 자극하는 데 주요한 역할을 하며, 여기 상태 레벨로 자극되면, 분자는 허여된 에너지 레벨 2로의 단일 고아자 여기로부터 얻어지는 것과 동일한 광화학적 및 광역학적 과정을 수행한다는 점이 주목되는 바이다. 동시의 이-광자 여기 공정의 예로서는, 800 nm에서의 두 광자들의 동시 흡수를 통해 바닥 전자 상태에서부터 여기 전자 상태로 염료 분자 쿠마린을 자극화하고, 480 nm에서 형광 광자를 방사하는 것을 들 수 있다. 공지된 동시 광조사에 대한 이차 의존성 때문에, 허여된 에너지 레벨 50으로의 동시 이-광자 여기는 또한, 비선형 여기 과정으로서 언급된다. 선형 및 비선형 여기 과정 사이에서의 명백한 차이는 다음 섹션에 나타낸 바와 같다.
도 1에 나타낸 바와 같은 에너지 레벨 다이어그램 일례에 더하여, 그의 시간적 및 공간적 상관 관계와 함께, 분자계의 특성, 그의 환경 및 에너지의 방출되는 형태의 특정 에너지를 포함한 다수의 인자들에 따라, 다른 다수의 가능한 전이들 및 에너지 레벨 조건들이 가능하게 된다. 분자가 들든 상태로 자극되기만 하면, 다양한 역학적 도는 화학적 과정들이 일어날 수 있는데, 여기에는 광자의 발광 방사, 광화학적 변형, 예컨대 이성질화 반응이나 산화 반응, 또는 광-이온화 반응이 포함된다. 그래도 여기 상태 및 그의 환경의 기초적 특성들이 분자의 최종 운명을 결정하는 데 중요한 것이다. 여기 과정 자체가 여기 분자 또는 그의 환경의 후속 특성들에 직접적인 영향을 미치지 않기 때문에, 여기 상태가 되기만 하면, 분자를 여기 상태까지로 자극하는 메카니즘은 이 운명에 현저한 영향을 미치지 않는다. 그러므로, 단일 광자 여기 조건 하에서 잘 수행되는 분자 진단제가 이-광자 여기 조건 하에서 유사한 행동을 나타낼 것이라고 기대할 수 있다.
선형 및 비선형 여기 현상의 비교 - 출력 의존성 및 공간적 효과:
빛이 분자계와 상호작용을 할 때, 빛은 적용된 전기장의 크기가 곱해진 선형 민감도(susceptiblity)에 비례하는 편광을 유도한다. 이러한 전기장이 매우 강할 때, 상기 분자계는 쉽게 설명할 수 없고 유도된 편광을 설명할 때 더 높은 크기(term)의 상호 작용 용어가 포함되어야 한다. 이-광자의 동시 여기는 두 광자로부터의 전자기장이 더 높은 크기의 용어, 특히 삼차 민감도 χ(3)"의 가상의 부분을 매개로 하여 결합하여 전자 전이를 유도하기 때문에, 두-광자 동시여기는 비선형 과정이라고 불린다. 이것은 두-광자 동시흡수의 비선형을 설명하는 또다른 방식이다. 즉, 분자계는 강한 전자기장과 비선형적으로 반응하고 있다. 이와 대조적으로, 단일-광자 여기 과정은 선형 감수성으로 설명될 수 있으며, 여기 파워와 선형적인 관계에 있다. 이-광자의 동시 여기의 교차 단면은 동일한 단일-광자 여기 과정에 대한 것보다 전형적으로 약 10 만 배 정도로 작다. 이는 매우 짧은 가상 에너지 레벨의 수명 동안에 이 광자들이 동시에 상호 작용할 확률이 적기 때문이다. 그러나, 모드-록 레이저(mode-locked laser)와 같은 매우 높은 피크 파워를 제공할 수 있는 광학 여기원의 이용 가능성은 순간적인 입사 파워를 증가시킴으로써 이-광자의 동시 여기의 효과적인 효율성을 극적으로 증가시켜 이러한 낮은 효율성의 효과를 실질적으로 향상시켰다. 예를 들면, 연속파 여기를 사용할 때 특별한 분자 시스템에 대한 이-광자 여기의 효율성은 단일-광자 여기로 달성된 값보다도 105이나 더 작았다. 그러나, 동일한 평균 광학 파워가 일련의 매우 짧은 펄스의 형태로 방출된다면, 피크 파워와 평균 파워의 생성물 상에서의 이동으로 인해 단일성에 가깝도록 이러한 비율을 변화시킬 수 있을 것이다.
이-광자의 동시 여기 및 선형 여기의 공간적인 여기 특성상의 중요한 차이를 달성하기 위해서 두-광자 동시 여기의 비선형 성질을 이용할 수도 있다. 예를 들면, 도 2에 나타낸 바와 같이, 레이저빔 46의 초점 48을 물질 50에 맞추었을 때 빔의 강도 프로필 44의 함수로서 단일-광자 여기 효율성 프로필 42와 이-광자 동시 여기 효율성 프로필 40은 매우 다르게 할 수도 있다. 이 물질 50은 큐벳 52의 벽 사이에 담겨진 레이저 염료 용액일 수 있다. 고전 가우스 광학 이론에 의해 예측되는 것과 같이, 렌즈 54로 레이빔 46의 초점 48을 맞추어 샘플 50을 거쳐 최고 수준의 초점 중심 56에 이르는 거리의 함수로서 다양한 광선 강도 프로필 44을 생성한다. 단일-광자 과정에서, 빔 강도(또는 입사 파워)와 여기 효율 사이의 선형 관계는 빔 강도 프로필 44를 선형적으로 따르는 단일-광자 여기 효율성 프로필 40의 결과를 가져온다. 이와 대조적으로, 이-광자의 동시 과정에서는, 빔 강도(또는 입사 파워)와 여기 효율성간의 비선형 관계는 빔 강도 프로필 44의 제곱을 따르는 이-광자 동시 여기 효율성 프로필 42의 결과를 가져온다. 따라서, 이-광자 동시 여기를 사용하는 경우에, 레이저 빔 46의 초점화 48을 작은 초점 영역으로 여기 정도를 실질적으로 제한하기 위해서 사용할 수 있다. 이와 대조적으로, 선형 여기를 사용하는 경우에, 여기는 전체 광학 경로를 따라 실질적으로 일어나고, 여기의 공간적 국소화가 상당히 덜 한정된다.
선형 및 비선형 여기의 비교 - 흡수 및 산란 효과:
이-광자 동시 여기에 대한 단면적이 단일-광자 여기에서 관찰되는 것보다 더 낮은 수 있으나, 이-광자 동시 방법의 용도가 더 낮은 기질 흡수성과 더 긴 파장의 광학 조사의 더 낮은 광학 분산성 때문에 단일-광자 여기법보다 많은 상황에서 더 유용할 수도 있다. 예를 들면, 도 3은 사람 표피와 같은 동물 조직에 대한 자외선(UV)에서 근적외선(NIR) 스펙트럼 영역에 이르기까지의 흡수 스펙트럼 58을 보여주고 있다. 도 4는 사람 표피와 같은 동물 조직에 대하여 유사한 조건 하에서 분산 스펙트럼 66을 보여주고 있다. 특히, 도 3은 어떻게 더 높은 에너지 광자 60이 더 낮은 광자보다 조직 흡수가 상당히 더 큰지를 설명하고 있다. 예를 들면, 사람의 피부는 400 nm에서 더 큰 에너지 광자를 강하게 흡수하나, 800 nm에서 더 낮은 광자에 대해서는 상대적으로 투명하다. 이는 피부의 천연 구성 성분 중에서 안료, 단백질 및 유전적 물질에 의한 더 높은 에너지 광자 60을 자연적으로 흡수한 결과이다. 또한, 여기 에너지와 진단제의 방사 파장 64 사이의 상관 관계 또한 주지되어야할 것이다. 좀더 큰 에너지 광자 60 또는 좀더 작은 에너지 광자 62가 진단제를 여기시키는 데 사용되는지와 무관하게, 방사 파장 64는 진단제에 적용되는 방사 파장이 아닌, 진단제에 의해 검색되는 에너지로 야기될 것이다. 도 4는 추가로 어떻게 더 큰에너지 광자 68가 더 작은 에너지 광자 70보다 현저히 큰 조직 분산을 경험하게 되는지를 설명하고 있다. 어떠한 광학적으로 조밀한 매질, 예를 들면 사람의 피부 등은 가시광선 또는 자외선 파장에서, 예컨대 400 nm에서 좀더 큰 에너지 광자 68을 강하게 산란시킬 것이나, NIR이나 적외선(IR) 파장, 예컨대 800 nm에서 좀더 작은 에너지 광자 70에 대해서는 훨씬 낮은 분산을 나타낼 것이다. 도 3에서 앞서 나타낸 바와 같이, 도 4는 진단제의 방사 파장 72가 전형적으로 좀더 큰 에너지 광자 60과 좀더 작은 에너지 광자 62 사이의 것에 전형적으로 포함될 것임을 나타낸다는 것이 주지된다.
이러한 광학적 특성의 차이는 두 가지 중요한 의미를 갖는다. 첫째, 조직에 의한 좀더 큰 에너지 광자 60의 단파장의 흡수 결과로 자외선이나 다른 고에너지 빛에 노출시에 바람직하지 못한 조직 손상을 가져올 수 있다. 이와 대조적으로, 심지어 NIR 빛의 광 파워가 자외선 조사보다 수배 정도로 클지라고, NIR 광과 같은 낮은 에너지 광자 62의 조사 하에서 약간의 효과가 있을 수도 있다. 둘째, 조직에 의한 좀더 큰 에너지 광자 68의 본질적으로 좀더 높은 흡수 및 분산의 결과로 조직 투과 깊이가 매우 얕게될 수 있으며, 좀더 작은 에너지 광자 70은 일반적으로 훨씬 더 큰 투과 깊이를 갖는다. 산란되는 좀더 큰 에너지 광자 60이 그 산란 경로에 따라 진단제로부터의 방사를 유도할 것이기 때문에, 조직을 투과하도록 이용되는 좀더 큰 에너지 광자 60은 여기 깊이까지 수직적으로 연장되는 방사 영역을 생성시키는 경향성을 가질 것이지만, 이-광자 여기에 대한 이차 의존성 때문에, 좀더 작은 에너지 광자 62으로의 광조사는 산란되는 좀더 낮은 에너지 광자 62의 존재에 의해 현저히 흐려지지 않는 좀더 정밀하게 한정된 여기 패턴을 생성시킬 것이다. 그러므로, 발광 및 이후의 표면 특성의 후속 검색은 UV나 가시광선 스펙트럼 영역내의 것과 같은 큰 에너지 광자 68을 이용하는 경우에는 거의 또는 전혀 불가능한 반면에, NIR이나 IR 스펙트럼 영역에서의 것과 같은 저에너지 광자 70을 이용하는 경우, 발광 및 후속의 표면 특징 검색이 훨씬더 용이하게 된다. 또한, 진단제로부터 방사되는 빛은 검사 하의 조직이나 기타 광학적으로 조밀한 매질에 의해 강하게 흡수되거나 산란될 수 있다는 것도 주지되는 바이다. 그러나, 방사되는 빛의 만족할 만한 검색을 위해서는, 이러한 빛의 작은 단편이 검색기로 전달되도록 하는 것만 필요하다. 이와 같이 방사되는 빛이 큰 폭으로 산란될 수 있는 것은, 산란되는 빛으로부터, 또는 기타 광학적이나 장치적인 간섭원(noise sources)로부터 여기된 진단제에 의해 생성되는 방사광을 분화하는 데 복잡한 방법이 필요하다는 것을 내포한다. 이같은 후자의 논의는 다음 섹션에서 다시 고려된다.
더 높은 에너지와 더 낮은 에너지 빛에 대한 흡수 및 통과 깊이 특성상의 이같은 중요 차이점을 개략적으로 도 5에 나타내었다. UV나 자외선광 74, 예컨대 400 nm에서이 빛을 사람 조직 76에 조사할 경우에, 대부분의 광 에너지는 표피나 진피 등의 최외층 82에서 즉시 흡수되고(78) 분산된다(80). 세포내 핵에 있는 유전적 물질을 이루는 것 등과 같이 이러한 조직 76의 세포에 존재하는 어떤 분자의 여기 때문에 흡수(78)가 일어날 수 있으며, 이같은 흡수(78) 부위에서의 세포들에서 다양한 부대적인 광화학적 변화들이 개시될 수 있다. 이같은 이차 광화학적 변화들에는 비가역적인 유전학적 손상 및 암의 유발 등이 포함된다. 그러므로, 통상적으로 진단제의 선형 여기에 사용되는 바와 같은, UV 또는 가시광선 74에 의한 여기의 경우, 광 투과 깊이는 작고 이차 손상의 유발에 대한 가능성은 크다. 이와는 달리, NIR 또는 IR 광 84, 예컨대 800 nm에서의 빛은 조직 76에 의해 흡수 또는 산란 80이 좀더 적게 될 것이다. 또한, 전체 투과 깊이는 훨씬 커지고, 세포에 대한 이차 손상의 정도는 실질적으로 적어질 것이다. 따라서, 장-파장의 여기광을 이-광자 여기 공정에 사용하여 큰 에너지의 단일-광자 여기를 대체한다면, 고-투과 깊이를 갖는 비교적 비-손상성 파장을 이용하여 깊은 조직내에 존재하는 특정 진단제를 광-활성화시킬 수 있게 된다.
게다가, 도 2에 나타낸 바와 같은 비선형 여기의 현저한 특성들은, NIR 광의 사용으로 가능한 고-투과 깊이 및 고유의 비-손상성 특성과 부합되는 경우에, 추가적인 용도 제기가 가능하다. 예를 들면, 도 6은 피하 종약 90에 존재하는 제제를 조영하는 데 단일-광자 여기 86과 이-광자 NIR의 동시 여기 88로 예측도는 투과 깊이 및 공간 위치 특성을 비교하여 도시한 것이다. 단일 광자 여기 86은 실질적으로 전체 광학 경로에 따라 연장되고, 현저한 특이성이 없는 여기 영역 92를 생성시킨다. 단일-광자 여기 86은 흡수 및 산란 때문에 광학 경로와 함께 변화될 것인데, 가장 크게는 광조사 주입 지점 부근 94이며 광학 경로에 따라 96에서 급격히 떨어진다. 또한, 이차 광손상의 유도에 대한 가능성이 이같은 경향으로 수반된다는 것을 주지해야한다. 따라서, 단일-광자 여기는 특히, 깊은 조직내에서 한정된 용적에 효과적으로 국한될 수 없는 큰 여기 영역 92을 생성시킨다. 또한, 주변 조직 98 전반 및 특히 표면 조직 100에서 심각한 이차 손상을 유발시킬 수 있다. 단일-광자 여기 86이 초점된다면, 여기 영역 92는 초점 102에서 약간 증가될 것이다. 그러나, 단일 광자 여기 86에 사용되는 UV 또는 가시광선이 종양 90에 이르기 전에 상당량 흡수도거나 산란된다면, 이 여기 영역 92는 종양 90으로 언제나 연장될 수 없을 수도 있다는 것이 주지된다. 이와는 달리, NIR 동시 이-광자 여기 88을 사용하면, 실질적으로 초점 106에 위치한 정확하게 한정된 원거리의 여기 영역 104를 생성시킨다. 더우기, NIR 광의 흡수가 감소되기 때문에,주변 조직 98 및 특히 표피 조직 100에 대한 이차 손상이 감소된다. 또한, NIR 광의 적은 흡수 및 산란을 함께 적용한 결과로서, UV나 자외선 파장을 이용하여 실행할 수 있는 것보다 훨씬더 깊은 위치를 효과적으로 검색할 수 있다.
전형적인 진단 조영 제제의 선형 및 비선형 여기 현상의 실시예
용액내에서 진단제의 선형 여기 현상은 도 7에 나타내었다. 본 실시예에서는, 메탄올 용매 하에서의 염료 분자 FITC의 묽은 용액을 여기시키는 데 442 nm의 레이저 방사를 사용하였다. 지속파(continuous wave) 헬륨-카드뮴 레이저로부터 방사되는 레이저 빔은 20x 현미경 대물렌즈를 통해 염료 용액을 함유하는 큐베트(cuvette)로 초점을 맞추고, 염료 용액내에서 산란성의 연장된 방사 형태를 모사하였다. 본 실시예를 통해, 방사가 전체 광학 경로를 따라 일어나고, 산란되는 레이저 광에 의해 염료의 자극을 야기시킬 수 있는 산란성 할로(halo)가 일차 여기 경로를 둘러싸는 것이 명백히 나타난다. 이와는 달리, 도 8은 크게 국소화된, 동시성의 이-광자 여기 현상을 이용한 진단제의 원거리 광-활성화를 나타낸다. 본 실시예에서는, 730 nm에서의 레이저 방사를 사용하여, 메탄올 용매 하에서의 염료 분자 쿠마린 480의 묽은 용액을 여기시켰다. 특히, 빔 직경 약 1 mm으로 78 MHz 펄스 반복 주파수에서의 빛의 <200 fs 펄스, 730 nm 파장의 지속파를 방사하는 모드-락킹된(mode-locked) 티타늄:사파이어 레이저의 NIR 출력은 상기 20x 현미경 대물 렌즈를 통해 염료 용액을 함유하는 큐베트로 초점을 맞추었다. 도 8은 염료 분자로부터의 형광 반응이 NIR 빔의 초점에 한정되는 것을 명확히 보여준다. 이-광자 여기 반응과 순간 레이저 출력 사이의 이차 상관 관계 때문에, 초점 전후의 여기 경로상의 위치에서의 여기는 무시할 정도가 된다. 또한, 사진 필름의 과노출을 야기할 수 있는 약간의 인위 구조가 방사 영역 주변의 이 사진에서 관찰되긴 하지만, 할로는 관찰되지 않는다.
광학적으로 조밀한 매질을 통해 존재하는 진단제의 국소화가 현저한 원거리 광-활성화 반응은 도 9에 도시되었다. 이는 아가로스 젤라틴 블록으로 이루어진 조직 팬텀(phantom) 전반에 골고루 분포된 염료 분자 쿠마린 480의 이-광자 여기 형광의 사진을 나타낸다. 모드-락킹된 티타늄:사파이어 레이저(이는 일련의 연속적인 730nm의 파장을 방출하며, 빔 직경 약 1 mm으로 78 MHz 펄스 반복 진동수에서 빛의 <200 fs 펄스의 빛을 방출)의 NIR 출력은 빔 연장성 망원경을 이용하여 시준된 빔 직경 약 50 mm을 생성시킬 수 있도록 연장되었다. 이 후에, 이 연장된 빔은 100 mm의 초점 길이(f.l.), 50 mm 직경의 양면 볼록 단일 글래스 렌즈를 사용하여 젤라틴 블록으로 초점을 맞추었다. 이 다음에, 젤라틴 블록은 이 100 mm f.l. 렌즈의 초점이 블록으로 40 mm 위치에서 떨어지도록 배치하였다. 도 9는 쿠마린 480으로부터의 형광 반응이 오직 NIR 광선의 초점에서만 여기된다는 것을 분명히 보여준다. 이-광자 여기 현상과 순간 레이저 출력 사이의 이차 상관 관계 때문에, 초점 전후의 빔 경로상의 위치에서 분자 여기는 무시할 수 있을 정도가 된다. 따라서, 손상성 여기 현상이나 이차적인 광-활성화가 초점 영역 밖에서는 거의 또는 전혀 없다. 또한 NIR 여기광이 젤라틴에 의해 미약하게 산란되기 때문에, 정확한 초점이 블록내의 깊은 투과 깊이에서 유지된다. 초점의 정밀도는 Gaussian 광학 특성에 의해 결정되므로, 공초점 영역의 길이는 빔 확장 및 후속 재-초점화(re-focusing)으로 사용되는 광학 인자를 변화시킴으로써 용이하게 조정된다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 동일한 여기 공정을 표지된 종양 표본에 적용하면 마찬가지의 결과가 얻어진다. 이는 마우스 종양 조직의 블록 전반에 고르게 분포된 염료 분자 쿠마린 480의 이-광자 여기 형광의 사진을 나타낸 것이다. 도 9에서와 같이, 이러한 샘플이 광학적으로 매우 조밀함에도 불구하고, 활성화 부위가 매우 국소화되었음을 알 수 있다.
진단성 조영 제제의 이-광자 여기 현상의 여기 광원
전형적으로 동일한 단일-광자 여기 공정에 비해 약 10 만 배 작은, 동시성의 이-광자 여기 현상의 교차면이 비교적 작다는 것은, 진단제를 효율적으로 여기시키는 데에 전형적으로 특정 여기 광원이 사용되어야함을 의미한다. 큰 피크 출력을 제공하는 광원은 적당한 평균 출력 레벨을 유지하는 동안 순간 초기 출력을 증가시킴으로써, 이러한 낮은 효율성의 충격을 실질적으로 개선시키는 데 사용될 수 있다. 실제로, 준-지속파(quasi-continuous wave) 모드-락킹된 레이저, 예컨대 모드-락킹된 티타늄:사파이어 레이저가, 생물학적 조직과 같이, 광학적으로 조밀한 표본에서 분자 진단제를 여기시키는 데 전형적인 것이다. 특히, 이러한 레이저들은 NIR 피크 출력을 10 kW 이상으로 전달하나, 매우 큰 반복 속도(> 25 MHz 펄스 반복 속도), 초단파(∼200 fs 펄스 기간)의 저에너지(펄스당 ∼1 nJ) 펄스 형태로 전달하는데; 평균 레이저 출력을 초단파 펄스의 고주파수 흐름으로 분획화하여 매우 효율적으로 이-광자 여기 형광을 여기시키면서 실질적으로 생물학적 물질을 손상시키지 않는 여기 빔을 생성시킨다. 모드-락킹된, 또는 기타 큰 반복 속도의 레이저들의 준-지속 출력은 또한, 다양한 변조 방법에 적합한데, 특히 광원의 펄스화된 특성이 후속 탈변조 공정에서 무시될 수 있기 때문에, 변조가 레이저의 펄스 반복 주파수보다 상당히 적은 주파수에서 수행되는 경우에, 적합하다.
모드-락킹된 티타늄: 사파이어 레이저의 특정 예로서, 약 690 nm에서 1080 nm까지로 연장된 파장 밴드에 걸쳐 연속적으로 조절될 수 있는데, 이는 생물학적 표본의 최소 산란 및 흡수 영역과 잘 일치하는 것이다. 이러한 밴드내에서의 이-광자 흡수는 또한, 다수의 가능한 진단 조영 제제에 대한 주요 단일-광자 흡수 범위, 345 내지 540 nm와 일치하는데; 이-광자 선택 법칙은 경우에 따라, 해당 단일-광자 선택 법칙과 매우 상이하며, 단일-광자 공정에 대한 강한 흡수는 단일-광자 파장의 약 2 배 정도의 파장에서 현저한 이-광자 흡수를 나타낼 수 있다.
모드-락킹된 티타늄:사파이어 레이저에 더하여, 다양한 기타 광원이 진단 조영 제제를 여기시키는 데 사용될 수 있다. 다이오드 레이저, 예컨대 Nd:YAG 및 Nd:YLF 레이저와, 광학 인자 진동자(opticla parametric oscillators), 증폭기 및 제너레이터가 특히 중요하다. 펄스 다이오드 레이저는 매우 우수한 작동 효율의 결과로서 눈에 띠는 성능을 제공하며, NIR내에서 다양한 파장으로 이용할 수 있다. 모드-락킹된 광학 인자 진동자, 증폭기 및 제너레이터들은 약 500 nm에서부터 3000 nm 이상까지의 밴드에 걸친 광방사를 제공할 수 있으며; 1000 nm에서부터 1800 nm까지의 파장의 이용 가능성은 매우 적은 조직 산란 및 흡수의 대역의 빛을 이용하여 진단제를 여기시키는 실제적인 방법을 제공하고, NIR 진단제(즉, 500 nm 이상의 파장에서 단일-광자 흡수 대역을 갖는 것들)의 활성화에 특히 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 다양한 기타 펄스 또는 모드-락킹된 레이저들을 사용할 수 있으며, 여기에는 다음과 같은 것들이 포함된다: 아르곤 이온 레이저; 크립톤 이온 레이저; 헬륨-네온 레이저; 루비 레이저; Nd:YAP, Nd:YVO4, Nd:Glass 및 Nd:CrGsGG 레이저들; 재생 증폭 레이저(regeneratively amplified laser); Cr:LiSF 레이저; Er:YAG 레이저; F-센터 레이저; Ho:YAF 및 Ho:YLF 레이저; 및 구리 증착 레이저(copper vapor lasers). 다양한 지속파 레이저들이 또한 사용될 수 있지만, 펄스 레이저를 사용하여 달성되는 것보다 상당히 낮은 효율을 갖는다.
진단성 조영 제제로부터의 이-광자 여기 방사의 검색
이-광자 여기 진단성 조영 제제로부터 방사된 빛의 근원에 관한 공간 정보가 코드화되며 여기 초점과 연관성을 갖는 것일 수 있다. 이는 검색성 조영 시그날을 전 여기 경로에 따라 생성된 방사광, 및 산란된 여기광에 의해 생성된 방사로부터 조심스럽게 풀어야만 하는, 광자 이동에 기초한 것을 포함하는, 단일-광자 여기 조영 방법과는 완전히 대조적인 것이다. 따라서, 이-광자 여기 진단제로부터 방사된 빛을 산란기 없이 직접 검색하거나 조영할 필요가 없다. 실제로, 빛을 모으고 검색하는 과정을 통해 근본 방사 지점과 검색된 시그날 사이의 상관 관계가 일그러지지 않는 방법으로, 이같은 방사된 빛의 일부를 모아서 검색할 필요가 있을 뿐이다.
이-광자 여기 방사 근원 지점과 시그날 검색 사이의 상관 관계에서의 명확성을 이해하기 위해서는, 방사 초기 직후의 방사된 빛에서 어떤 일이 일어나는지를 생각하는 것이 유용하다. 생물학적 조직과 같이 광학적으로 조밀한 표본에서 조영하는 경우, 이-광자 여기 검색 조영 제제로부터의 빛이 실질적으로 등방의 방식으로 방사될 것이다. 이러한 방사광의 일부 단편이 방사 지점에서 멀리 떨어져 장착된 검색기 장치에 직접 전달될 것이며, 그외의 일부 단편은 방사 및 검색 사이에서 일어나는 하나 이상의 산란 현상의 결과로서 검색기 장치까지의 순환 경로를 경유할 것이다. 생물학적 표본내의 깊이 10 cm에서 조영을 수행하고자한다면, 비산란된, 또는 비행성의 방사된 광자로부터의 전이 시간은 약 0.3 ns가 될 것이며; 큰 산란성으로 방사된 광자의 경우에 전이 시간은 3-10 ns로 커질 것이다. 따라서, 본 실시예에서 최대 효율을 얻기 위해서는, 비행성 광자나 산란성이 큰 광자의 대부분 또는 전부를 포획하기에 충분한 시간 동안 방사된 모든 빛을 통합하는 것이 바람직하다. 이는 10 cm 이하의 깊이에서 조영하는 데에는 약 10 ns 정도의 통합 시간이 적절하다는 것을 의미한다.
만약 표본에 비례하여 여기 초점의 위치를 이동하거나 스캐닝함으로써 영상이 생성된다면, 전술한 바와 같은 분석은 여기 지점이 한 번에 매 10 ns보다 좀더 자주 이동되어야만 한다는 것을 의미한다. 실제로, 변 조 방법의 부가적으로 가능한 용도 및 최소 휴지 기간에 관한 시그날 대 노이즈 논쟁과 결합된, 스캐닝 프로세스 및 메카니즘에 대한 실제적인 한계는 최소 휴지 기간에 대한 스캐닝이 1 ㎲를 초과하는 휴지 기간을 이용하여 수행되어야만 한다는 것을 지시하는 것이다. 따라서, 1 ㎲을 초과하는 휴지 기간 및 1 MHz 이하의 가능한 변조 주파수로 강도에 기초한 조영하는 경우, 비행성 및 산란성의 방사되는 빛의 명확한 부분을 모을 수 있도록 자리잡을 수 있을 만큼 검색기가 얼마나 멀리 배치되는지에 대한 차이가 거의 없다(근원 방사 지점에 비례한 검색기의 위치 선택, 및 이에 따른 광학 지연 때문에 유도되는 시간 길이는 기타 측정 인자들에 비례하여 짧은 전이 시간 때문에 그의 근원 지점과 검색된 시그날의 상관 관계를 가질 수 있는 가능성에 대한 효과가 거의 또는 전혀 없음). 따라서, 여기 빔으로의 에피-일루미네이션(epi-illumination) 배열로 구성될 수 있도록 하는 방식으로 검색기가 배치되거나, 이 여기 빔과 떨어진 외부에 배치될 수 있다는 것이 명백해질 것이다. 에피-일루미네이션 배열(또는 기타 가능한 공선형 여기 및 검색 배열)은 표면 또는 인접 표명 대상의 검색에 대한 위치적 패럴랙스 감손을 최소화하지만, 이러한 배열이 탄력적으로 산란되거나 반사되는 여기광으로부터 간섭받기 쉽다는 것이 주지된다. 패럴랙스 감손은 외부 검색 배열에 대해, 검색 시스템을 여기 지점과 일정한 거리를 유지하도록 능동적으로 배침함으로써, 또는 이 표본내의 다양한 영역으로부터 방사되는 빛을 모으기에 각각 적절하게 조절된 다중 검색 어셈블리를 사용하거나, 패럴랙스 감손이 최소화될 수 있을 정도로 충분히 표본으로부터 떨어지도록 검색 시스템을 배치함으로써 최소화될 수도 있다. 이-광자 여기된 진단성 조영 제제로부터 방사되는 빛의 검색에 대한 논의는 강도를 기초로 하는 방법에 대한 견지에 집중되는 데, 표본 전반에 걸쳐 다중 여기 반응에 대한 여기 위치와 검색된 방사 강도를 연관지음으로써 영상이 구성될 수도 있다. 하지만, 강도 기초 방법은 다음과 같이, 다수의 복잡한 인자에 영향받기 쉽기 때문에, 언제나 적절한 것은 아니다:
· 표본내에서의 불균질 성분에 기인한 여기광의 산란 및 흡수에서의 편차 - 여기 광원과 목적하는 여기 지점 사이에 위치한, 이상 광학 밀도 영역과 같은 불균질 성분은 목적하는 여기 지점에서 효과적인 여기 레벨에서의 예측되지 않는 차이로 전사될 수 있다. 이러한 현상에 의해 야기된 인위적 결과들은 이러한 불균일 성분들에 의한 차이 정도에 영향을 미치는 몇몇 여기 경로에 따라 데이타를 얻은 후에, 얻어진 다수의 데이타 세트를 해석함으로써 개선될 수 있지만, 이는 일부 표본에서는 거의 또는 전혀 불가능할 수도 있다.
· 표본내에서의 불균일 성분에 기인한 여기광의 산란 및 흡수에서의 편차 - 여기 지점과 검색 시스템 사이에 위치한, 이상 광학 밀도 영역과 같은 불균질 성분은 여기 지점으로부터 방사되는 빛을 효율적으로 모으는 데 예기치 못한 차이로 전사될 수 있다. 이러한 현상에 의해 야기된 인위적 결과들은 이러한 불균일 성분들에 의한 차이 정도에 영향을 미치는 몇몇 수집 경로에 따라 데이타를 얻은 후에, 얻어진 다수의 데이타 세트를 해석함으로써 개선될 수 있지만, 이는 일부 표본에서는 거의 또는 전혀 불가능할 수도 있다.
· 형태나 기능과 직접적으로 관련되지 않은 진단성 조영 제제의 농도나 국부 환경에서의 변이 - 강도 기초 조영에서, 표본 전반에 걸치 방사 레벨에서의 변화들은 표본의 구조적 또는 생리학적 구조와 관련될 수 있다. 하지만, 조영 제제가 표본 전반에 걸쳐 적절하게 분산되지 않거나, 기타 인자들, 예컨대 표본내에서의 국부 환경내에서의 불균일성 등이 형태나 기능과 연관될 수 없는 방식으로 조영 제제의 방사에 영향을 미친다면, 표본으로부터 유의한 데이타를 얻기 더욱 어려워진다. 이러한 현상에 의해 야기된 인위적 결과들은 이러한 인자들에 영향을 쉽게 받지 않는 조영을 사용하거나 고안함으써 개선될 수 있지만, 이는 일부 표본에서는 거의 또는 전혀 불가능할 수도 있다.
표본의 광학적 불균일성에 의한 영향을 좀더 적은 검색 방법으로는, 방사 강도에 기초한 것보다는 여기 상태 수명(excited stat lifetime)에서의 변화를 측정하는 것으로 기초로 한 것이 시도될 수 있다. 여기 상태 수명은 분자 제제의 여기 상태 및 그의 순간 환경의 고유한 특성이며, 우연하게 수명의 정확한 측정은 여기 상태 및 수집 효율에서의 전체적인 변이에 영향을 받지 않는다. 여기 상태 수명을 측정하는 데 편리한 방법은 변조된 여기광원과 얻어진 수명의 방사 시그날 사이에서 상전이(phase shift)와 관련된 상 광도 측정 방법을 이용하는 것이다. 특히, 광자 전이 시간에 대한 전술한 바와 같이, 상 광도 측정 방법이 광학적으로 조밀한 매질내에서 조영하는데, 특히 1-10 ns를 포과하는 수명의 제제에 대해서 적용할 수 있다. 따라서, 구조내에서 조영 제제의 농도 또는 산소의 존재 하에서의 조영 제제 형광의 퀀칭과 같이, 표본내에서의 형태 또는 기능과 관련하여 방사 수명을 갖는 진단성 조영 제제가 사용된다면, 방사 강도에 기초한 것보다는 수명 변화에 기초한 조영이 실제적이게 될 것이다. 이러한 수명 기초 방법은 레이저 주사 현미경에, 및 인체의 종양과 같이 확장된 대상을 원거리 조영하는 데 동일하게 적용할 수 있을 것이다.
강도 또는 상 기초 방사 데이타의 변환에 적합한 수집 장치에는, 광전 배증관, 마이크로채널 플레이트 장치, 포토다이오드, 애벌런치 포토다이오드, 전하 짝지움 장치와 전하 짝지움 장치 어레이, 전하 주입 장치와 전하 주입 장치 어레이, 및 사진 필름이 포함되는데, 이에 국한되는 것은 아니다.
진단성 조영 제제로부터 이-광자 발산되는 방사의 회수에 대한 노이즈 감소 방법 - 변조 및 이차 하모닉(harmonic) 검색:
이-광자 여기 공정의 고유의 저효율성은 이-광자 여기되는 형광 방사에 대해 산란되는 비흡수성 여기 광의 매우 큰 비율로 전사할 수 있다. 또한,
대기광 및 기타 광학 또는 전자적 노이즈 광원으로부터의 간섭을 제거할 필요화 함께 검사 조건 하에서의 표본내에서 존재하는 제제나 다른 종들의 단일-광자 여기 형과, 라만 산란, 및 기타 현상들을 포함한, 이같이 매우 큰 여기 레벨에 기여할 수 있는 기타 가능한 선형 간섭의 중요성은, 모두 검색기 시그날의 적절한 탈변조로 짝지워진 변조된 여기 방법은 분석 시그날의 향상된 회수 및 간섭에 대한 적절한 차별을 제공해야만 한다는 것을 나타내는 것이다. 실제로, Denk 등(U.S. 특허 No. 5,304,613)에 의해 개시된 배경으로부터의 간섭은 레이저의 펄스 반복 주파수에서의 탈변조를 포함하여, 적절한 변조 및 탈변조 방법을 사용한다면, 큰 폭으로 배제할 수 있으며; 이러한 방법을 사용함으로써 현미경의 시그날 대 노이즈(SNR: signal to noise) 성능이 현저히 향상될 수 있다. 일반적으로, 변조는 다음과 같은 방식 한 가지 이상으로 실질적으로의 그어떤 측정 방법에 대한 검색 성능을 향상시킬 수 있다:
(1) 연속적 배경 또는 노이즈 소스(sources)의 배제 - Denk의 이-광자 레이저 주사 현미경의 예에서, 락-인 증폭기(LIA: lock-in amplifier) 또는 헤테로다인 탈변조기와 같은 장치를 이용한, 검색기 시그날의 탈변조가 후속되는 여기 광원의 변조는 검색 시스템 반응을 변조 주파수와 밀접하게 관련되는 주파수 대역에 한정할 것이다. 이러한 변조의 상 감도를 조절함으로써, 변조 패턴과 근사하게 일치하지 않거나, 연결되지 않은 시그날에 대하여 부차적인 차별이 달성될 수 있을 것이다. 따라서, 변조 주파수와 탈변조 상을 적절하게 선택함으로써, 예컨대 부근의 전기 모터와 같이 특정 주파수에서의 전자 노이즈나 실내광 등의 노이즈 소스로부터의 간섭을 현저히 제거할 수 있다. 이러한 방법은 인체의 종양과 같이 확장된 대상을 원거리 조영하는 데에도 마찬가지로 유의하다.
(2) 광대역(broadband) 또는 "핑크 노이즈(pink noise)" 소스의 배제 - 그 어떤 측정에 사용되는 기타 장치 및 일렉트로닉스에 따른 측정 환경은, 그 어떤 측정 방법에 광대역 노이즈, 때로는 소위 핑크 노이즈를 야기시킨다. 이같은 고유 노이즈의 영향은 대역폭-한정된 검색 방법을 사용함으로써 크게 감소시킬 수 있다. 특히, 주어진 광측정법에 대해, 측정 시그날 전압, VSIGNAL은 다음 수학식 1에서와 같이, 검색기와 상호 작용하는 광자에 의해 생성된 검색기 입력 전류량, iINPUT에 입력 임피던스 ZINPUT및 검색 시스템의 게인(gain), G를 곱한 것이며:
측정된 노이즈 전압, VNOISE는 다음 수학식 2에서와 같이, 입력 노이즈 전류량, iNOISE, 입력 임피던스, 검색 시스템의 전자 또는 광학적 대역폭의 제곱근, 및 게인의 계산 결과에 의해 근사치가 될 수도 있다:
따라서, SNR은 이러한 두 전압(VSIGNAL/VNOISE)의 비로부터 산측될 수도 있다. 광전 배증관(PMT)와 같은 전형적인 광학 검색기를 변조되지 않은 형광 시그날을 검색하는 데 사용하는 경우, 이 검색기는 노이즈 전류에 다른 임의의 시그날 레벨을 생성시킬 것이다. Hamamatsu R928(7.4×105A/W 레디언트 애노드 감도)과 같은 PMT의 일례에서, 10 pW 레벨에서의 광입력은 7.4 ㎂iSIGNAL을 생성시킨다. 이같은 시그날 전류를 게인 100, 입력 임피던스 50 Ω, 입력 노이즈 레벨 5 ㎵/√㎐ 및 대역폭 1 M㎐을 갖는 저-노이즈 증폭기에서의 전압으로 전환시키면, 다음과 같은 시그날이 생성된다:
오옴의 법칙, 또는 V = i·R 로 상기 수학식 2에 나타낸 바와 같은 노이즈 전류 및 임피던스를 대체할 수 있다는 것이 주지된다. 따라서, 이 광대역의 예에서는 SNR은 23이다. 이같은 여기 에너지가 예컨대, 100% 깊이의 변조로 1 M㎐에서 시노소이드적으로 변조된다면, VSIGNAL값은 대략 18.5 ㎷ 정도로 감소될 것이다(이 변조가 피크 여기 출력 변화 없이 평균 출력에서 50% 정도의 총감손을 야기시키는 사이클릭 감쇠(attenuation) 또는 기타 감손-기초 변조 방법에의해 유도된 것으로 추정함). 그러나, 검색 시스템이 1 kHz의 대역폭을 갖는 1 MHz에서 대역폭 한정된 탈변조를 사용한다면, 핑크 노이즈는 다음과 같이 이 시그날보다 훨씬 더 빨리 감소되며:
전체 SNR은 약 1200으로 증가된다. 따라서, 다양한 형태의 변조를 사용하는 경우에 일부 시그날 강도가 상실되긴 하지만, SNR에서의 전체 증가는 이러한 상실을 보상하고도 남는다. 또한, 예를 들어 대기광의 검색기로의 누출과 같은 검색기 반응에서의 그어떤 선형 간섭이 있다면, 광대역 검색 장치에서는 부차적인 노이즈 소스로서 이를 검색할 것이지만, 변조된 대역폭 한정 장치에서는 이 간섭을 배제시킬 것이다. 대기광 누수는 PMT 상에서 1 ㎂의 배경 시그날을 생성시켜, 5 mV의 배경 시그날로 전사한다고 추정된다. 변조되지 않은 경우에, 이같은 배경, B로부터의 광학 숏(shot) 노이즈는 검색되는 전체 광자의 제곱근과 동일하고, SNR ?? S/(S+B)1/2이며; 이로부터 약 5.7 정도의 산측된 SNR을 얻어진다. 특히, 변조된 경우의 SNR은 실질적으로 변화되지 않는다. 이같은 분석은 레이저 주사 현미경에 동일하게 적용할 수 있으며, 인체의 종양과 같은 확장된 대상을 원거리 조영하는 데 적용할 수 있다.
(3) 변조 주파수에서 선형 간섭의 배제 - 이-광자 들듬의 본래의 저효율성의 결과로서, 산란된 비흡수성 여기광의 이-광자 여기 형광 방사에 대한 비는 일반적으로 매우 크다. 여기에는 탄력적 및 비탄력적 산란으로부터 및 단일-광자 들듬 형과으로부터 일어나는 변조 주파수에서의 선형 간섭이 포함된다. 광학적 필터링은 대개, 이같은 광학 배경 현상들로부터 이-광자 방사를 스펙트럼적으로 구별하고자하는 데 사용된다. 하지만, 이같은 간섭들은 스펙트럼적 방법만을 사용하여 제거하기에는 매우 어렵우며, 거의 불가능하다. 이같은 잔류 간섭 소스를 무시할 수 있도록 하는 또다른 방법으로서, 순수한 이-광자 시그날을 회수하는 통상적인 방법에서 여기 출력 레벨에 대하여 일부 여기 출력 레벨에서 검색되는 시그날의 퇴화를 이용하여, 부차적인 이-광자 여기 형광 성분을 선형 간섭으로부터 제외할 수 있도록 하며; 이는 다음 수학식 3과 같이 주어지는 전체 형광 반응, Iβ의 모델을 사용할 수 있는데:
여기서, IL은 순간 여기 강도이며, α는 이-광자 여기 형광에 대한 비례 상수이다. 이같은 퇴화(regression)-기초 방법은 시간 단위당 필요 측정 수치가 작은 실험실용에 적합한 반면에, 다중 초점 스캔닝되는 광학 조영의 경우에서와 같이, 전체 데이타 수집 시간을 최소화해야 할 때마다 너무 많은 시간을 소비하고 복잡하며 비실제적이다. 몇몇 출력 레벨에서 다수의 측정을 수행할 필요가 없는, 이차 하모닉 검색과 같은 임시적인 배제법을 사용함으로써 훨씬 빠른 결과를 얻을 수 있다. Freeman 등(R.G. Freeman, D.L. Gilliland and F.E. Lytle, "Second Harmonic Detection of Sinusoidally Modulated Two-Photon Excited Fluorescece," Analytical Chemistry, 62 (1990) 2216-2219)은 화학적 샘플의 분석에 유용한 이차 하모닉 검색법을 개시하였는데, 이 방법은 여기 소스의 시누소이드 변조가 이-광자 여기 형광에만 관련된 2 배의 변조 주파수에서 시그날을 생성시키는 데 사용된다. 변조 주파수와 관련하여 락-인 증폭기는 변조 주파수의 이차 하모닉에서 순수한 이-광자 시그날을 회수하는 데 사용된다. 이차 하모닉 형광 시그날이 생성되는 전체 이-광자 형광의 약 12% 정도뿐인 반면에, 선형 간섭의 개선된 배제는 순수한 시그날 레벨에서의 감손을 보상하고도 남으며, 전체 SNR에서의 증가를 초래한다. 따라서, 이차 하모닉 검색 방법은 큰 데이타 대역폭 포텐셜 및 산란 배제에서의 고유한 효용성의 결과로서, 레이저 주사 현미경에 이상적으로 적용할 수 있으며, 인체의 종양과 같은 확장된 대상을 원거리 조영하는 데 적용할 수 있다. 이같은 장점들은 이차 하모닉 검색을 이용한 조영 시스템이 각 지점에서 가각의 측정에 대한 최대 여기 출력의 사용 및 각 지점에서 최소한의 휴지 기간으로 순수한 이-광자 여기 방사 시그날을 확실하게 얻을 수 있다는 것을 의미한다.
전술한 바와 같이, 이-광자 여기 진단성 조영에 변조 방법을 사용하는 다수의 장점들은, 데이타를 방사 강도 또는 여기 상태 수명의 측정을 기초로 하여 얻든지 동일하게 적용한다. 실제로, 수명 측정은 변조 파형 및 검색 시그날 사이의 상전이를 측정함을 기초로하는 상 광도 측정법을 이용하여 가장 서서히 감도 높게 측정된다. 따라서, 이차-하모닉 검색을 기초로 한 것을 포함하는, 변조 방법이 대기와 장치적 노이즈 소스로부터 및 검사를 수행하는 표본내에서 일어나는 산란과 기타 현상들로부터의 간섭을 제거하여, 이-광자 여기 형광의 효율적인 검색에서 중요한 유용성을 갖는다는 것은 분명하다. 인체 조직과 같은 광학적으로 조밀한 매질에 대해, 이-광자 여기 형광 방사에 대한 산란되는 비흡수된 여기 빛의 매우 큰 비율이 이러한 방법들의 용도를 중요한 것으로 만든다. 따라서, 임상적 조영 용법이나 이-광자 레이저 주사 현미경의 경우, 본문에 기재된 변조 방법을 이용하는 것이 언제나 유리하다.
이-광자 여기 조영에서의 대조 제제 - 내인성 및 외인성 제제:
전술한 바에 따르면, 비선형 이-광자 여기가 광학적으로 조밀한 매질내에 존재하는 광학적으로 여기 가능한 분자 제제에 대한 투과의 특정성 및 깊이에서 주요하게 개선시키는 데 사용될 수 있으며, 검색 성능은 각각의 여기 및 검색 공정에 대한 코드화 및 코드 해석(decoding) 방법을 사용함으로써 개선할 수 있다는 것을 알 수 있다. 이-광자 방법을 사용하는 경우 가능한 여기의 뛰어난 공간적 국소화는, 여기 지점에서 대조를 현저히 개선하는 역할을 할 수 있다. 이같이 국부적으로 여기시키기만 하면, 이에 방사되는 분석광은 다양한 검색 수단을 사용하여 검색될 수 있다. 이 여기 지점이 예컨대, 표본에 비례하여 초점의 위치를 주사함으로써, 또는 초점에 비례하여 표본의 위치를 주사함으로써 검사되는 표본에 따라 움직이게 된다면, 이에 의해 생성되는 방사광과 여기 지점의 위치 사이를 연관시킴으로써 표본의 2-차원 또는 3-차원의 영상을 생성시킬 수 있다. 하지만, 이같은 영상에 유용한 대조 또한, 분자 제제 또는 방사에 대한 제제의 농도 또는 국부 환경에서 차이의 존재에 따라 좌우된다. 이같은 제제들은 표본에 대해 내인성 또는 외인성일 수도 있으며, 조영은 궁극적으로 표본내에서의 구조 또는 기능에서의 불균일성과 연관될 수 있는 그의 국부화된 방사 특성에서의 대조에 기초한다. 따라서, 비선형 진단성 조영에서 이같은 대조 제제의 역할을 주의깊게 고려하는 것 또한 중요하다.
다양한 내인성 염료제가 진단성 조영에, 특히 이상 조직의 조영에 유용하게 사용될 수 있다. 이상 조직과 정상 조직 사이, 다양한 내부 기초 구조 및 고등 동물에서의 기관 사이, 또는 건강한 또는 덜 건강한 조직의 다양한 범위 사이의 구조적 또는 생리학적 차이 때문에, 방향족 아미노사, 프로테인, 핵산, 세포간 에너지 교환 저장고(아데노신 트리포스페이트 등), 효소, 호르몬 또는 기타 제제와 같은 천연 염료제의 농도 또는 국부 환경은 구조적이나 기능적인 불균일성을 입증하는 데 유용한 방식으로 다양하게 변화될 수 있다. 따라서, 불균일성의 이같은 내인성 지시제들은 이-광자 여기 반응을 이용하여 비-침해적으로 입증될 수 있다.
하지만, 다수의 경우에서, 이러한 제제로 가능한 특정성은 유의한 진단성 조영을 달성하는 데 부적절하여서, 표본에 외인성 제제가 첨가되어야만 한다. 통상적인 외인성 제제는 투여후에 반-선택적으로(semi-selectively) 표본의 특정 조직, 기관 또는 기타 구조 단위들로 나뉜다. 이같은 제제들의 투여 경로는 전형적으로 국부 투여나 전신 투여를 통해서 이루어진다. 이상적인 조건 하에서, 이같은 제제들은 목적하는 구조에 나뉘거나, 그렇지 않으면 농축될 것이며, 혹은 이같은 구조들로부터 선택적으로 배제될 수도 있다. 이같은 농도는 이 제제를 구조에 분배하는 구조의 물리학적 또는 화학적 특성에서의 고유한 차이를 통해서, 또는 표면상의 구조에 직접적인, 분리된 국부 적용의 결과가 될 수 있다. 이에 따라 고농도 및 저농도 영역 사이의 현저한 차이가 구조적 또는 생리학적 불균일성을 입증하는 기초로서 사용될 수 있다. 또는, 외인성 제제가 표본 전반에 스미게 할 수도 있으며, 색채 전이, 퀀칭 또는 수명과 같은 이들의 방사 특성이 생리학적 불균일성에 감작성을 갖는다면, 대조제의 이러한 인자들을 조영에서 현저한 대조를 위한 기초로서 사용될 수 있다.
분자 제제의 방사 특성이 여기 상태의 기초적인 특성 및 그의 환경에 의해 결정되기 때문에, 제제를 여기 상태로 여기시키는 데 대한 메카니즘은 여기 상태의 방사 특성이 중요한 영향이 없다. 따라서, 단일-광자 여기 조건 하에서 잘 작용하는 분자 진단성 제제 또는 대조제는 이-광자 여기 조건 하에서도 유사한 행동을 나타낼 것이라고 여겨진다. 일반적으로, 단일-광자 여기 반응에 유용한 어떠한 대조제라도 이-광자 여기 반응에 사용될 수 있는데, 여기 부위에 걸쳐 향상된 통제가 영상 분해능을 향상시킬 것이다. 적절한 대조제에는, 생물학적 염료 또는 안료로서 사용되는 다수의 분자 제제 및, 광역학 요법(PDT)에 사용되는 것들이 포함된다. 표준 PDT 제제들은 일반적으로 제제와 조직, 예컨대 암 손상부가 부합되는 화학적 및 역학적 성질에 기초한 조직 특정성을 갖는다. 이같은 제제들은 광학 에너지의 효율적인 흡수제이며, 대부분의 경우 발광제이다. 예를 들면, 다음과 같다:
· 소랄렌 및 그의 유도체 (5-메톡시소랄렌 [또는 5-MOP]; 8-메톡시소랄렌 [8-MOP]; 4,5',8-트리메틸소랄렌 [TMP]; 4'-아미노메틸-4,5',-8-트리메틸소랄렌 [AMT], 4'-히드록시메틸-4,5',8-트리메틸소랄렌 [HMT]; 5-클로로메틸-8-메톡시소랄렌, 안젤리신 [이소소랄렌]; 5-메틸안젤리신 [5-MIP]; 및 3-카르복시소랄렌을 포함);
· 다양한 테트라아자포르피린류 (옥타(4-tert-부틸페닐)테트라피라지오포르피라진 [OPTP]; 테트라-(4-tert-부틸)프탈로시아닌 [t4-PcH2]; 및 테트라-(4-tert-부틸)프탈로시아나토마그네슘 [t4-PcMg]을 포함)와 함께, 다양한 포르피린 및 헤마토포르피린 유도체 (헤마토포르피린 유도체 [HPD]; 포토프린 II; 벤조포르피린 유도체 [BPD]; 프로토포르피린 IX [PpIX]; 염료 헤마토포르피린 에테르 [DHE]; 폴리헤마토포르피린 에스테르 [PHE]; 프로토포르피린의 13,17-N,N,N-디메틸에틸에탄올아민 에스테르 [PH1008]; 테트라(3-히드록시페닐)-포르피린 [3-THPP]; 테트라페닐포르피린 모노설포네이트 [TPPS1]; 테트라페닐포르피린 디설포네이트 [TPPS2a]; 디헤마토포르피린 에테르; 메조테트라페닐포르피린; 및 메조테트라(4N-메틸피리딜)포르피린 [T4MpyP]을 포함);
· 다양한 프탈로시아닌 유도체 (클로로알루미늄 설폰화 프탈로시아닌 [CASPc]; 클로로알루미늄 프탈로시아닌 테트라설페이트 [AlPcTS]; 모노-, 디-, 트리- 및 테트라-설폰화 알루미늄 프탈로시아닌 [AlSPc, AlS2Pc, AlS3Pc 및 AlS4Pc를 포함]; 실리콘 프탈로시아닌 [SiPcIV]; 아연(II) 프탈로시아닌 [ZnPc]; 비스(디-이소부틸 옥타데실옥시)실리콘 2,3-나프탈로시아닌 [이소BOSINC]을 포함); 및 Ge(IV)-옥타부톡시프탈로시아닌;
· 다양한 로다민 유도체 (로다민 101 [Rh-101]; 로다민 110 [Rh-110]; 로다민 123 [Rh-123]; 로다민 19 [Rh-19]; 로다민 560 [Rh-560]; 로다민 575 [Rh-575]; 로다민 590 [Rh-590]; 로다민 610 [Rh-610]; 로다민 640 [Rh-640]; 로다민 6G [Rh-6G]; 로다민 700 [Rh-700]; 로다민 800 [Rh-800]; 로다민 B [Rh-B]; 설포로다민 640 또는 101; 및 설포로다민 B을 포함);
· 다양한 쿠마린 유도체 (쿠마린 1, 2, 3, 6, 6H, 7, 30, 47, 102, 106, 120, 151, 152, 152A, 153, 311, 307, 314, 334, 337, 343, 440, 450, 456, 460, 461, 466, 478, 480, 481, 485, 490, 500, 503, 504, 510, 515, 519, 521, 522, 523, 535, 540, 540A, 548을 포함);
· 다양한 벤조페녹사진 유도체 (5-에틸아미노-9-디에틸아미노벤조[a]페녹사지늄 [EtNBA]; 5-에틸-아미노-9-디에틸-아미노벤조[a]페노티아지늄 [EtNBS]; 및 5-에틸아미노-9-디에틸아미노벤조[a]페노셀레나지늄 [EtNBSe]을 포함);
· 클로르프로마진 및 그의 유도체;
· 다양한 클로로필 및 박테리오클로로필 유도체 (막테리오클로린 a [BCA] 포함);
· 다양한 금속-리간드 착화합물, 예컨대 트리스(2,2'-비피리딘)루테늄(II) 디클로라이드 (RuBPY);
· 페오포르바이드 a [Pheo a]; 메로시아닌 540 [MC 540]; 비타민 D; 5-아미노-레불린산 [ALA]; 포토산; 클로린 e6, 클로린 e6 에틸렌디아미드, 및 모노-L-아스파르틸 클로린 e6; 페오포르바이드-a [Ph-a]; 페녹사진 Nile 블루 유도체 (다양한 페녹사진 염료 포함);
· 다양한 전하 전이 및 방사 정이 제제, 예컨대 스틸벤, 스틸벤 유도체, 4-(N-(2-히드록시에틸)-N-메틸)-아미노페닐)-4'-(6-히드록시설포닐)스틸벤 (APSS); 및
· 다수의 기타 광-활성화제.
일반적으로, 이들은 PDT 제제를 조직으로 분배하는 조직의 역학적 또는 화학적 특성에서의 차이에 기인하는 특정 조직내에 반-선택적으로, 또는 적용 지점에서나 부근에서 집적될 것이며; 집적되면 이러한 제제들은 이-광자 여기 반응을 수행하기 쉬울 것이고, 이들의 발광 또는 기타 방사 특성들은 영상 데이타를 얻는 데 사용될 수 있다. 빛을 흡수한 후에 하나 이상의 다른 제제에게 에너지를 전달할 수 있는 기타 광-활성제 또한, 단독으로 또는 이렇게 전이되는 에너지를 받아들여 이를 방사 발산으로 전환할 수 있는 반응제 한 가지 이상과 배합하여 사용할 수도 있다.
이-광자 여기 조영에서 생물학적 대조제:
이상적 조건 하에서, 표준 대조제는 특정 조직에 대한 화학적 또는 역학적 친화성에 기초한 표적 특정성을 유도한다. 이러한 방식으로, 대조제는 목적하는 조직내에 분배되거나 그 조직에 농축된다. 하지만, 이같은 표적 특정성이 언제나 완벽한 것은 아니다. 실제로, 제제의 용도를 표적화하는 데에서 특정성을 증가시키는 방법을 개선시키는 것이 바람직하다. 이같이 특정성을 개선시키는 방법은 구조, 기능 또는 질병에 특정적인 생물학적 특징을 이용하는 것을 기초로 한다. 예를 들면, FITC와 같은, 하나 이상의 광-활성부분에 안티-센스 올리뉴클레오티드 제제를 짝지음으로써, 새로운 생물학적 대조제가 유적자면에서 상보적으로 코드화를 포함하는, 암 세포와 같은 특정 세포에만 선택적으로 태그(tag)될 수 있도록 생성된다. 게다가, 이 기초적 방법은 생물학적 소식자에 사용되는 올리고머적 코드를 변형시킴으로써 다수의 유전자적 기초 질병 또는 기타 질환들에게 용이하게 확장 적용된다. 이-광자 활성화를 이용함으로써, 여기성 이-광자 광-활성화 공정에 공유한 특정 공간적 위치 및 생무학적 소식자의 조합된 생물학적-특정성을 이용하여 이같은 강력한 방법을 적용할 수 있다. 따라서, 매우 현저히 차이가 나며, 매우 분해능이 좋은 영상을 특정 기관, 조직 또는 손상부에 특정적으로 표적화되는 제제를 사용하여 유적자적 레벨에서 얻을 수 있다.
생물학적 소식자의 적절한 디자인은 생물학적 제제와 표적 부위 사이의 착물 형성에 대해 변화되는 방사 특성을 갖는 광-활성부 한 가지 이상을 이용한다. 특히, 착물 형성에 대한 방사 파장 또는 수명에서 변화를 일반적인 방법의 감도를 향상시키는 데 사용할 수 있는데, 이는 이러한 변화들이 활물화된 제제를 함유하는 영역과 비착화된 제제를 함유하는 것 사이에 차이를 증가시킬 수 있기 때문이다. 방사 발생이 퀀칭되지 않으며, 착물이 형성될 때까지 퀀칭되는 광-활성화부에 기초한 생물학적 제제를 예로 들 수 있다. 또다른 예로서는, 안티-센서 유전자 서열에 고정된 소랄렌과 같이 삽입된 광-활성화부에 기초한 제제를 들 수 있는데, 안티-센스 서열과 그의 표적 서열의 착화합물 형성에서, 광-활성화부의 상호 작용이 가능하다. 광-활성화부의 방사 특서에서 색채 전이을 일으킬 수 있는 광-활성화부의 삽입이 가능하다.
전술한 바로부터, 유전자적 방법만으로보다는, 면역학적 방법과 같은, 기타 생물학적 특정 방법에 기초한 표적화 방법 또한 본 발명의 범위내에 포함된다는 것이 명백하다. 특히, 항체 소식자가 광-활성기와 짝을 이루는, 항원-항체 방법에 기초한 제제 특정은 질병 및 감염을 진단하는 강력한 신규 방법을 제공한다. 제제 표적화에서 생물학적 특정성에 대한 부가적인 수단에는, 리간드, 합텐, 탄수화물, 리피드 또는 단백질 수용체 또는 착화합물제, 킬레이터 및 캡슐화 담체, 예컨대 리포좀, 풀러렌스(fullerence), 크라운 에테르 및 사이클로덱스트린이 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 제 1 구체예
따라서, NIR 광원 출력을 이용하여, 통상적인 단일-광자 활성화에 필요한 파장의 약 2배의 파장의 빛을 이용하여 표본에 존재하는 내인성 또는 외인성 진단 조영제의 이-광자 활성화를 동시에 유도하는 것이 본 발명에서 특히 바람직한 구체예이다. 이러한 바람직한 구체예는 도 11에 도시되어 있다. NIR 광원 108은 NIR 조사의 고피크 파워 펄스의 급속한 시리즈로 이루어진 NIR 조사 110의 빔을 내보낸다. 예컨대, 흔히 이용가능한 표준 모델-잠금 티타늄:사파이어 레이저는 75 MHz 초과의 펄스 반복 주파수에서 약 20 nJ의펄스 에너지와 < 200 fs의 기간에서 모드-잠금 펄스를 출력할 수 있다; 이 광원은 약 690-1080 nm의 NIR 파장 밴드 범위에서 연속적으로 튜닝가능한 비교적 낮은 평균 파워 (수 Watts 이하)와 높은 피크 파워 (대략 100 kW)를 갖는 광선의 준-유사 빔을 발산한다. NIR 광원 108에 의해 방출되는 펄스 행렬 (train)은 반사성 또는 굴절성 광학기(optics) 112와 같은 표준 광학 장치를 이용하여 쉽게 초점을 맞출 수 있다. 초점이 맞춰진 NIR 빔 114는 조영될 표본 116상에 지향될 수 있다. 진단 조영제의 동시적인 2-포톤 광-활성화는 실제로 초점에만 존재하는 높은 즉시적 조사로 인해, 초점이 맞춰진 빔 114의 공초점 영역 118에 한정될 것이다. 표본 116에 의해 산란된 여기 광선 120은 공초점 영역 118 외부 영역에 존재할 수 있는 진단 조영제의 유의적인 여기를 위한 충분한 즉각 조사 수준을 갖지 못할 것이다. 공초점 영역 118에 존재하는 진단용 조영제 분자에 의해 방출된 광선 122는 실제로 등방적인 방식으로 공초점 영역 118로부터 빠져나올 것이다. 방출된 광선 124의 일부는 표본 116의 내부 또는 외부 위치에 장착된 광증폭 튜브와 같은 검출 수단 126에 의해 포획된다. 이 검출 수단 126은 선택 수단 128이 진단제로부터의 방출에 주로 특징적인 것에 해당하는 파장 또는 파장들에서 빛의 주요 분획을 통과하는 한편 탄성적으로 산란된 빛의 주요 분획을 거부하는 방식으로, 방출된 빛 124의 포획 부분을 예비-프로세싱하는 역할을 하는 광학 밴드 패스 필터와 같은 파장 선택 수단 128에 맞추어져 있다. 검출 수단 126으로부터 이렇게 발생된 신호 130은 공초점 영역 118의 위치의 함수로서 진단조영제로부터의 방출 응답을 기록하는 것을 주요 목적으로 하는 프로세서 수단 132에 의해 포획된다. 표본 116의 용적을 통해 스캐닝될 공초점 영역 118을 국소화시킴으로써, 공초점 영역 118의 위치 함수로서 프로세서 수단 132의 내용을 검사함으로써 표본 116의 완전한 영상이 얻어질 수 있다.
본 발명의 제 2 구체예
이 바람직한 구체예의 대체예로서, 변조 수단을 도 11에 도시된 일반적인 구체예에 인코포레이션시킬 수 있다; 이러한 변조 수단은 환경적 또는 기구적인 소음 광원의 거부를 증진시켜, 제 2의 고조파(harmonic)에서 순수한 이-광자 여기 방출의 회수를 가능케 하고, 또는 상 광도 측정 장치를 이용하여 방출된 빛의 검색을 용이하게 하는 것과 같이, 조영 시스템의 전체적인 성능을 개선시키는데 사용될 수 있다. 특히, 도 12는 전자-광학 또는 어쿠스토-광학 변조기, 쵸퍼, 또는 기타 수단과 같은, NIR 광원 108에 의해 방출된 NIR 조사 110의 광선과 상호 작용하도록 위치된 변조 수단 136이, 드라이브 신호 140을 변조 수단 136에 제공시키는 변조기 드라이버 138의 출력에 기록된 변조 패턴에 NIR 조사 110의 빔을 코딩하는데 이용될 수 있음을 보여준다. 이렇게 생성된 NIR 조사 142의 조절된 빔 116은 도 11을 참고로 설명한 바와 같이 표본 116 상에 지향된다. 그에 따라 발생된 이-광자 방출 광선 144는 기본적으로 등방적인 방식으로 공초점 영역 118을 빠져나올 것이다. 그러나, 앞서 도 11의 경우 설명된 유사한 방출 광선 122의 경우와는 대조적으로, 이 방출 광선 144는 NIR 조사 142의 조절된 빔의 변조와 기본적으로 동시적으로 일어나는 변조를 나타낼 것이고, 이는 다시 변조기 드라이버 138에 의해 발생된 드라이브 신호 140과 동시적일 것이다. 변조된 방출 광선 136의 일부는 표본 116의 내부 또는 위부 위치에 장착된 광증폭 튜브와 같은, 검출 수단 126에 의해 포획된다. 이러한 검출 수단 126은 선택 수단 128이 진단제로부터의 방출에 주로 특징적인 것에 해당하는 파장 또는 파장들에서 빛의 주요 분획을 통과하는 한편 탄성적으로 산란된 빛의 주요 분획을 거부하는 방식으로, 변조된 방출 광선 146의 포획 분획을 프로세싱하는 역할을 하는 광학 밴드 패스 필터와 같은 파장 선택 수단 128에 맞추어져 있다. 검출 수단 126으로부터 이렇게 발생된 변조된 신호 148은 프로세서 수단 150에 의해 포획된다. 프로세서 수단 150은 2가지 주요 목적을 달성하기 위한 것으로서, 그 첫 번째는 변조기 드라이더 138에 의해 발생된 탈변조 (demodulation) 레퍼런스 출력 152를 이용하여 검출 수단 126으로부터 발생된 변조된 신호 148을 탈변조시키기 위한 것이고, 두 번째 목적은 공초점 영역 118의 위치 함수로서 진단 조영제로부터의 탈변조 방출 응답을 기록하기 위한 것이다. 따라서, 표본 116의 부피를 통해 스캐닝될 공초점 영역 118의 국소화를 일으킴으로써, 공초점 영역 118의 국소화 함수로서 프로세서 수단 150의 내용을 검사함으로써 표본 116의 완전한 영상을 얻을 수 있다. 이러한 영상은 피하 종양이나 기타 병소와 같은 표적 부위 134의 대역을 동정하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 제 3 구체예
바람직한 이 구체예의 두 번째 대체예로서, 직접적인 검출의 조영 수단을 제공하기 위해 표본의 피상적인 특징을 밝히는데, NIR 조사의 초점이 맞춰지지 않은 빔을 이용할 수 있다. 도 13에 이를 나타내었다. 특히, 모드-잠금 티타늄:사파이어 레이저와 같은 NIR 광원의 출력을 이용하여 통상적인 단일-포톤 광-활성화에 필요한 파장의 대략 2배되는 빛을 이용하여 표본의 표면상에 존재하거나 또는 그 근방에 존재하는 내인성 또는 외인성 진단용 조영제의 동시적인 이-광자 광-활성화를 유도할 수 있다. NIR 광원 108은 NIR 조사의 고피크 파워 펄스의 급속한 시리즈로 이루어진 NIR 조사 110의 빔을 발생시킨다. 이 빔은 NIR 광원 108에 의해 방출된 NIR 조사 110의 빔과 상호 작용하도록 위치된 변조기 수단 136을 이용하여 변조된다. 이 변조기 수단 136은 변조기 수단 136에 드라이브 신호 140을 제공하는 변조기 드라이버 138의 출력에 기록된 변조 패턴과 함께 NIR조사 110의 빔을 코딩한다. 이렇게 발생된 NIR 조사 142의 변조된 빔은 반사 또는 굴절 광학기 154와 같은 표준 광학 수단을 이용하여 초점을 흐리게 함 (defocusing)으로써, 조영될 표본 116상에 지향되는 산개성 (divergent) 여기 빔 156을 발생시킨다. 표본 116의 표면상에 또는 그 근방에 존재하는 진단용 조영제의 동시적인 이-광자 광-활성화는 NIR 조사 142의 변조된 빔의 변조와 기본적으로 동기적인 변조를 갖는 변조된 이-광자 여기 방출 광선 144를 발생시키며, 이것은 이번엔 변조기 드라이버 138에 의해 발생된 드라이브 신호 140과 동시적이다. 변조된 방출 광선 146의 일부는 표본 116의 외부 위치에 장착된 전하 커플링된 장치 어레이와 같은 영상 검출 수단 158에 의해 포획된다. 이 영상 검출 수단 158은 선택 수단 128이 탄성적으로 산란된 빛의 주요 분획은 거부하는 한편 진단제로부터의 방출의 주로 특징적인 것에 해당하는 파장 EH는 파장들에서의 빛의 주요 분획은 통과시키는 방식으로 변조된 방출 광선 146의 포획된 부분을 프로세싱하는 역할을 하는, 광학 밴드 패스 필터와 같은 파장 선택 수단 128에 맞춰지게 된다. 영상 검출 수단 158로부터 이와 같이 발생된 변조된 신호 160은 프로세서 수단 162에 의해 포획된다. 프로세서 수단 162는 2가지 주요 목적을 갖는데, 그 첫 번째는 변조기 드라이버 138에 의해 발생된 탈변조 레퍼런스 출력 152를 이용하여 영상 검출 수단 158로부터 발생된 변조된 신호 160을 탈변조시키는 것이고, 두 번째는, 방출의 국소화 함수로서 진단용 조영제로부터의 탈변조된 방출 응답을 기록하는 것이다. 따라서, 이러한 대체적인 구체예는 피부암 병소와 같은 표면 특성 164를 직접 비디오그래프적으로 조영할 수 있게 하여, 표본 116의 표면을 조명할 이-광자 여기 방출의 공간적 차이에 기초하여 수행된다.
상술한 각각의 요소들, 또는 2 가지 이상의 요소들은 전술한 유형과 다른 종류의 용도나 구조에도 유용할 수 있음을 이해하여야 한다.
이제까지 분자의 진단 조영제의 광-활성화에 있어서의 선택성 개선을 위한 일반적인 방법을 들어 구체예에서와 같이 본 발명을 설명하였으나, 본 발명의 정신으로부터 벗어남이 없이 당업자에 의해 본문에 설명된 방법의 형태와 그 상세에 있어서 여러 가지 생략, 변형, 치환 및 변화가 가능할 것이므로, 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 제 3 구체예에 있어서, 비록 이 예시적인 변형이 조영 성능에 전체적인 감소를 초래할 수 있겠지만, 보다 단순한 조영 장치를 생산하기 위해 변조와 탈변조의 상세를 생략할 수 있다.
추가적인 분석 없이, 전술한 내용은 본 발명의 요지를 충분히 드러냄으로써, 본 발명의 일반적 측면 또는 특수한 측면의 기본적인 특징들을 구성하는 특성들을 생략함 없이, 당업자가 종래 기준의 관점에서 현상의 지식을 적용함으로써 여러 가지 응용을 쉽게 가능하게 할 수 있음을 보여주는 것이다.
허권에 의해 보호받고자 하는 신규한 소망 사항들을 첨부된 청구범위에 제시하였다.

Claims (48)

  1. (a) 식물 또는 동물 조직의 특정 용적에 함유된 광-활성 분자 제제의 동시적인 이-광자 여기를 촉진하는 데 충분한 광선으로 식물 또는 동물 조직의 특정 용적을 처리하고;
    (b) 식물 또는 동물 조직의 특정 용적 중 한가지 이상의 광-활성 분자 제제를 광-활성화시킴으로써, 한 가지 이상의 광-활성화된 분자 제제를 생산하고, 이때, 한 가지 이상의 광-활성화된 분자 제제가 에너지를 방출하며;
    (c) 적어도 하나의 광-활성화된 분자 제제에 의해 방출된 에너지를 검색한 다음;
    (d) 식물 또는 동물 조직의 특정 용적에 특징적인 검색된 에너지 신호를 발생시키는 단계로 이루어짐을 특징으로 하는, 적어도 하나의 광-활성 분자 제제를 함유하는 동식물 조직의 특정 용적을 조영하기 위한 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 적어도 하나의 광-활성 분자 제제의 동시적인 이-광자 여기를 촉진하는 데 충분한 광선이 레이저 광선인 것이 특징인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 광-활성 분자 제제의 동시적인 이-광자 여기를 촉진하는 데 충분한 광선이 초점이 맞추어진 광선 빔인 것이 특징인 방법.
  4. 제 4 항에 있어서, 초점이 맞추어진 광선 빔이 초점이 맞춰진 레이저 광선인 것이 특징인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 적어도 하나의 광-활성 분자 제제로 식물 또는 동물 조직을 처리하는 제 1 단계에서 식물 또는 동물 조직의 특정 용적이 적어도 하나의 광-활성 분자 제제의 적어도 한 부분을 유지하는 것이 특징인 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 적어도 하나의 광-활성 분자 제제가 소랄렌, 5-메톡시소랄렌 (5-MOP), 8-메톡시소랄렌 (8-MOP), 4,5',8-트리메틸소랄렌 (TMP), 4'-아미노메틸-4,5',-8-트리메틸소랄렌 (AMT), 5-클로로메틸-8-메톡시소랄렌 (HMT), 안젤리신 (이소소랄렌), 5-메틸안젤리신 (5-MIP), 3-카르복시소랄렌, 포르피린, 헤마토포르피린 유도체 (HPD), 포토프린 II, 벤조포르피린 유도체 (BPD), 프로토포르피린 IX (PpIX), 염료 헤마토포르피린 에테르 (DHE), 폴리헤마토포르피린 에스테르 (PHE), 프로토포르피린의 13,17-N,N,N-디메틸에틸에탄올아민 에스테르 (PH1008), 테트라(3-히드록시페닐)-포르피린 (3-THPP), 테트라페닐포르피린 모노설포네이트 (TPPS1), 테트라페닐포르피린 디설포네이트 (TPPS2a), 디헤마토포르피린 에테르, 메조테트라페닐포르피린, 메조테트라(4N-메틸피리딜)포르피린 (T4MpyP), 옥타(4-tert-부틸페닐)테트라피라지오포르피라진 (OPTP), 프탈로시아닌, 테트라-(4-tert-부틸)프탈로시아닌 (t4-PcH2), 테트라-(4-tert-부틸)프탈로시아나토마그네슘, (t4-PcMg), 클로로알루미늄 설폰화 프탈로시아닌 (CASPc), 클로로알루미늄 프탈로시아닌 테트라설페이트 (AlPcTS), 모노-설폰화 알루미늄 프탈로시아닌 (AlSPc), 디-설폰화 알루미늄 프탈로시아닌 (AlS2Pc), 트리-설폰화 알루미늄 프탈로시아닌 (AlS3Pc), 테트라-설폰화 알루미늄 프탈로시아닌 (AlS4Pc), 실리콘 프탈로시아닌 (SiPcIV), 아연 II 프탈로시아닌 (ZnPc), 비스(디-이소부틸 옥타데실옥시)실리콘 2,3-나프탈로시아닌 (이소BOSINC), 게르마늄 IV 옥타부톡시프탈로시아닌 (GePc), 로다민 101 (Rh-101), 로다민 110 (Rh-110), 로다민 123 (Rh-123), 로다민 19 (Rh-19), 로다민 560 (Rh-560), 로다민 575 (Rh-575), 로다민 590 (Rh-590), 로다민 610 (Rh-610), 로다민 640 (Rh-640), 로다민 6G (Rh-6G), 로다민 700 (Rh-700), 로다민 800 (Rh-800), 로다민 B (Rh-B), 설포로다민 101, 설포로다민 640, 설포로다민 B, 쿠마린 1, 쿠마린 2, 쿠마린 4, 쿠마린 6, 쿠마린 6H, 쿠마린 7, 쿠마린 30, 쿠마린 47, 쿠마린 102, 쿠마린 106, 쿠마린 120, 쿠마린 151, 쿠마린 152, 쿠마린 152A, 쿠마린 153, 쿠마린 311, 쿠마린 307, 쿠마린 314, 쿠마린 334, 쿠마린 337, 쿠마린 343, 쿠마린 440, 쿠마린 450, 쿠마린 456, 쿠마린 460, 쿠마린 461, 쿠마린 466, 쿠마린 478, 쿠마린 480, 쿠마린 481, 쿠마린 485, 쿠마린 490, 쿠마린 500, 쿠마린 503, 쿠마린 504, 쿠마린 510, 쿠마린 515, 쿠마린 519, 쿠마린 521, 쿠마린 522, 쿠마린 523, 쿠마린 535, 쿠마린 540, 쿠마린 540A, 쿠마린 548, 5-에틸아미노-9-디에틸아미노벤조[a]페녹사지늄 (EtNBA), 5-에틸-아미노-9-디에틸-아미노벤조[a]페노티아지늄 (EtNBS), 5-에틸아미노-9-디에틸아미노벤조[a]페노셀레나지늄 (EtNBSe), 클로르프로마진, 클로르프로마진 유도체, 클로로필 유도체, 박테리오클로로필 유도체, 금속-리간드 착화합물, 트리스(2,2'-비피리딘)루테늄 (II) 디클로라이드 (RuBPY), 트리스(2,2'-비피리딘)로듐 (II) 디클로라이드 (RhBPY), 트리스 (2,2'-비피리딘)플라티늄 (II) 디클로라이드 (PtBPY), 페오포르바이드, 메로시아닌 540, 비타민 D, 5-아미노-레불린산, 포토산, 클로린 e6, 클로린 e6 에틸렌디아미드, 모노-L-아스파르틸 클로린 e6, 페녹사진 Nile 블루 유도체, 스틸벤, 스틸벤 유도체, 4-(N-(2-히드록시에틸)-N-메틸)-아미노페닐)-4'-(6-히드록시설포닐)스틸벤 (APSS) 및 표준 생물학적 염료 및 색소 중에서 선택된 것이 특징인 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 적어도 하나의 광-활성 분자 제제가 식물 또는 동물 조직의 특정 용적에서 특정 조직에 특이적인, 적어도 하나의 생물기원의 광-활성 분자 제제인 것이 특징인 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 적어도 하나의 생물기원의 광-활성 분자 제제가 DNA, RNA, 아미노산, 단백질, 항체, 리간드, 합텐, 탄수화물 수용체 또는 복합 제제, 지질 수용체 또는 복합 제제, 단백질 수용체 또는 복합 제제, 킬레이터 및 캡슐화 담체 중에서 선택된 세그먼트를 포함하는 것이 특징인 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 적어도 하나의 생물기원의 광-활성 분자 제제가 동시적인 이-광자 여기를 촉진하는 데 충분한 광선에 노출될 경우 광-활성화되는 세그먼트를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 식물 또는 동물 조직의 특정 용적에 함유된 적어도 하나의 광-활성 분자 제제의 동시적인 이-광자 여기를 촉진하는 데 충분한 광선으로 식물 또는 동물 조직의 특정 용적을 처리하는 단계가
    (a1) 광원으로부터의 광선을 특정 종류의 변조에 의해 변조시킴으로써 변조된 광선을 발생시키고;
    (a2) 식물 또는 동물 조직의 특정 용적에 함유된 적어도 하나의 광-활성 분자 제제의 동시적인 이-광자 여기를 촉진하는데 충분한 변조된 광선으로 식물 또는 동물 조직의 특정 용적을 처리하고; 추가로
    (e) 검출된 에너지 신호를 특정 유형의 변조에 의해 탈변조시킨 다음;
    (f) 식물 또는 동물 조직의 특정 용적의 특징인 탈변조된 에너지 신호를 발생시키는 단계로 이루어지는 것이 특징인 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 특정 유형의 변조에 의해 검출된 에너지 신호를 탈변조시키는 단계가 특정 유형의 변조의 2배 주파수에서 검출된 에너지 신호를 탈변조시키는 단계롤 포함함으로써, 특정 유형의 변조의 제 2 고조파를 검출하는 것이 특징인 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 식물 또는 동물 조직의 특정 용적에 특징적인 탈변조된 에너지 신호가 식물 또는 동물 조직의 특정 용적에 존재하는 적어도 하나의 광-활성화된 분자 제제의 수명의 변화를 나타내는 것이 특징인 방법.
  13. (a) 물질의 특정 용적에 함유된 적어도 하나의 광-활성 분자 제제의 동시적인 이-광자 여기를 촉진하는 데 충분한 광선으로 물질의 특정 용적을 처리하고;
    (b) 물질의 특정 용적에 함유된 적어도 하나의 광-활성 분자 제제를 광-활성화시킴으로써, 적어도 하나의 광-활성화된 분자 제제가 에너지를 발생시키는 적어도 하나의 광-활성화된 분자 제제를 생산한 다음;
    (c) 적어도 하나의 광-활성화된 분자 제제에 의해 방출된 에너지를 검출하고;
    (d) 물질의 특정 용적에 특징적인 검출된 에너지를 발생시키는 단계로 이루어짐을 특징으로 하는, 적어도 하나의 광-활성 분자 제제를 함유하는 물질의 특정 용적을 조영하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 물질이 식물 조직과 동물 조직 중에서 선택된 것이 특징인 방법.
  15. 제 13 항에 있어서, 적어도 하나의 광-활성 분자 제제의 동시적인 이-광자 여기를 촉진시키는 데 충분한 광선이 레이저 광선인 것이 특징인 방법.
  16. 제 13 항에 있어서, 적어도 하나의 광-활성 분자 제제의 동시적인 이-광자 여기를 촉진시키는 데 충분한 광선이 초점이 맞춰진 광선 빔인 것이 특징인 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 초점이 맞춰진 광선 빔이 초점이 맞춰진 레이저 광선인 것이 특징인 방법.
  18. 제 13 항에 있어서, 적어도 하나의 광-활성 분자 제제로 식물 또는 동물 조직을 처리하는 제 1 단계에서 식물 또는 동물 조직의 특정 용적이 적어도 하나의 광-활성 분자 제제의 적어도 한 부분을 유지하는 것이 특징인 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 적어도 하나의 광-활성 분자 제제가 소랄렌, 5-메톡시소랄렌 (5-MOP), 8-메톡시소랄렌 (8-MOP), 4,5',8-트리메틸소랄렌 (TMP), 4'-아미노메틸-4,5',-8-트리메틸소랄렌 (AMT), 5-클로로메틸-8-메톡시소랄렌 (HMT), 안젤리신 (이소소랄렌), 5-메틸안젤리신 (5-MIP), 3-카르복시소랄렌, 포르피린, 헤마토포르피린 유도체 (HPD), 포토프린 II, 벤조포르피린 유도체 (BPD), 프로토포르피린 IX (PpIX), 염료 헤마토포르피린 에테르 (DHE), 폴리헤마토포르피린 에스테르 (PHE), 프로토포르피린의 13,17-N,N,N-디메틸에틸에탄올아민 에스테르 (PH1008), 테트라(3-히드록시페닐)-포르피린 (3-THPP), 테트라페닐포르피린 모노설포네이트 (TPPS1), 테트라페닐포르피린 디설포네이트 (TPPS2a), 디헤마토포르피린 에테르, 메조테트라페닐포르피린, 메조테트라(4N-메틸피리딜)포르피린 (T4MpyP), 옥타(4-tert-부틸페닐)테트라피라지오포르피라진 (OPTP), 프탈로시아닌, 테트라-(4-tert-부틸)프탈로시아닌 (t4-PcH2), 테트라-(4-tert-부틸)프탈로시아나토마그네슘, (t4-PcMg), 클로로알루미늄 설폰화 프탈로시아닌 (CASPc), 클로로알루미늄 프탈로시아닌 테트라설페이트 (AlPcTS), 모노-설폰화 알루미늄 프탈로시아닌 (AlSPc), 디-설폰화 알루미늄 프탈로시아닌 (AlS2Pc), 트리-설폰화 알루미늄 프탈로시아닌 (AlS3Pc), 테트라-설폰화 알루미늄 프탈로시아닌 (AlS4Pc), 실리콘 프탈로시아닌 (SiPcIV), 아연 II 프탈로시아닌 (ZnPc), 비스(디-이소부틸 옥타데실옥시)실리콘 2,3-나프탈로시아닌 (이소BOSINC), 게르마늄 IV 옥타부톡시프탈로시아닌 (GePc), 로다민 101 (Rh-101), 로다민 110 (Rh-110), 로다민 123 (Rh-123), 로다민 19 (Rh-19), 로다민 560 (Rh-560), 로다민 575 (Rh-575), 로다민 590 (Rh-590), 로다민 610 (Rh-610), 로다민 640 (Rh-640), 로다민 6G (Rh-6G), 로다민 700 (Rh-700), 로다민 800 (Rh-800), 로다민 B (Rh-B), 설포로다민 101, 설포로다민 640, 설포로다민 B, 쿠마린 1, 쿠마린 2, 쿠마린 4, 쿠마린 6, 쿠마린 6H, 쿠마린 7, 쿠마린 30, 쿠마린 47, 쿠마린 102, 쿠마린 106, 쿠마린 120, 쿠마린 151, 쿠마린 152, 쿠마린 152A, 쿠마린 153, 쿠마린 311, 쿠마린 307, 쿠마린 314, 쿠마린 334, 쿠마린 337, 쿠마린 343, 쿠마린 440, 쿠마린 450, 쿠마린 456, 쿠마린 460, 쿠마린 461, 쿠마린 466, 쿠마린 478, 쿠마린 480, 쿠마린 481, 쿠마린 485, 쿠마린 490, 쿠마린 500, 쿠마린 503, 쿠마린 504, 쿠마린 510, 쿠마린 515, 쿠마린 519, 쿠마린 521, 쿠마린 522, 쿠마린 523, 쿠마린 535, 쿠마린 540, 쿠마린 540A, 쿠마린 548, 5-에틸아미노-9-디에틸아미노벤조[a]페녹사지늄 (EtNBA), 5-에틸-아미노-9-디에틸-아미노벤조[a]페노티아지늄 (EtNBS), 5-에틸아미노-9-디에틸아미노벤조[a]페노셀레나지늄 (EtNBSe), 클로르프로마진, 클로르프로마진 유도체, 클로로필 유도체, 박테리오클로로필 유도체, 금속-리간드 착화합물, 트리스(2,2'-비피리딘)루테늄 (II) 디클로라이드 (RuBPY), 트리스(2,2'-비피리딘)로듐 (II) 디클로라이드 (RhBPY), 트리스 (2,2'-비피리딘)플라티늄 (II) 디클로라이드 (PtBPY), 페오포르바이드, 메로시아닌 540, 비타민 D, 5-아미노-레불린산, 포토산, 클로린 e6, 클로린 e6 에틸렌디아미드, 모노-L-아스파르틸 클로린 e6, 페녹사진 Nile 블루 유도체, 스틸벤, 스틸벤 유도체, 4-(N-(2-히드록시에틸)-N-메틸)-아미노페닐)-4'-(6-히드록시설포닐)스틸벤 (APSS) 및 표준 생물학적 염료 및 색소 중에서 선택된 것이 특징인 방법.
  20. 제 18 항에 있어서, 적어도 하나의 광-활성 분자 제제가 식물 또는 동물 조직의 특정 용적에서 특정 조직에 특이적인, 적어도 하나의 생물기원의 광-활성화 분자 제제인 것이 특징인 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 적어도 하나의 생물기원의 광-활성 분자 제제가 DNA, RNA, 아미노산, 단백질, 항체, 리간드, 합텐, 탄수화물 수용체 또는 복합 제제, 지질 수용체 또는 복합 제제, 단백질 수용체 또는 복합 제제, 킬레이터 및 캡슐화 담체 중에서 선택된 세그먼트를 포함하는 것이 특징인 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 적어도 하나의 생물기원의 광-활성 분자 제제가 동시적인 이-광자 여기를 촉진하는 데 충분한 광선에 노출될 경우 광-활성화되는 세그먼트를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  23. 제 13 항에 있어서, 물질의 특정 용적에 함유된 적어도 하나의 광-활성 분자 제제의 동시적인 이-광자 여기를 촉진하는데 충분한 광선으로 물질의 특정 용적을 처리하는 단계가
    (a1) 광원으로부터의 광선을 특정 종류의 변조에 의해 변조시킴으로써 변조된 광선을 발생시키고;
    (a2) 물질의 특정 용적에 함유된 적어도 하나의 광-활성 분자 제제의 동시적인 이-광자 여기를 촉진하는데 충분한 변조된 광선으로 물질의 특정 용적을 처리하고; 추가로
    (e) 검출된 에너지 신호를 특정 유형의 변조에 의해 탈변조시킨 다음;
    (f) 물질의 특정 용적의 특징인 탈변조된 에너지 신호를 발생시키는 단계로 이루어지는 것이 특징인 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 특정 유형의 변조에 의해 검출된 에너지 신호를 탈변조시키는 단계가 특정 유형의 변조의 2배 주파수에서 검출된 에너지 신호를 탈변조시키는 단계를 포함함으로써, 특정 유형의 변조의 제 2 고조파를 검출하는 것이 특징인 방법.
  25. 제 23 항에 있어서, 물질의 특정 용적에 특징적인 탈변조된 에너지 신호가 물질의 특정 용적에 존재하는 적어도 하나의 광-활성화된 분자 제제의 수명의 변화를 나타내는 것이 특징인 방법.
  26. 제 1 항에 있어서, 처리 단계가 광선 빔을 초점 길이 범위에 맞추어 광선 빔의 초점 평면을 조직 표면과 조직 표면 이외의 점 사이의 위치로 확장시킴으로 해서, 처리 단계가 조직 내로 깊이 침투하도록 확장되는 것을 포함하는 것이 특징인 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 광선 빔이 잔존하는 동안, 조직 내의 초점 길이 위치를 변화시킴으로써, 상기 광-활성화, 검색 및 검출된 에너지 신호의 발생 단계들이 조직 표면과 조직 표면 이외에 위치된 위치 사이를 따라 발생함으로써, 영상이 3 차원적이 되도록 하는 것이 특징인 조영 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 처리 단계가 약 75 메가헤르쯔 이상의 펄스 반복 주파수와 서브-나노초 펄스 기간을 갖는 펄스된 출력을 생산하는 레이저를 작동시키는 것을 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 레이저를 작동시켜 근적외선을 발생시키는 것이 특징인 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 레이저가 약 20 나노주울의 펄스 에너지를 생산하는 것이 특징인 방법.
  31. 제 29 항에 있어서, 광-활성화 단계가 적어도 하나의 광-활성 분자 제제의 동시적인 이-광자 여기를 수행하는 것을 포함하는 것이 특징인 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 검출 단계가 레이저로부터의 입사 광선의 광학적 경로를 다시 추적하지 않는 방출된 광선을 검출하는 것으로 이루어진 것이 특징인 방법.
  33. 제 31 항에 있어서, 상기 처리 단계가 레이저 빔을 변조시키고;
    이 때, 검출 단계와 발생 단계 중에서 선택된 단계가 파장 선택 단계를 이용하는 것을 포함하는 것이 특징인 방법.
  34. 제 31 항에 있어서, 상기 처리 단계와 광-활성화 단계가 조직 중의 분자 제제로부터 유래하고 레이저 광선의 변조와 기본적으로 동시적인 방출된 광선을 발생시키도록 조정된 것이 특징인 방법.
  35. 실질적으로 조직 내로 침투하는 데 효과적인 주파수를 갖고, 조직 내에 함유된 분자 제제의 동시적인 이-광자 여기 (TPE)를 촉진하도록 적응된, 시준된 (collimated) 광원:
    상기 조직 표면으로부터 상기 표면의 실질적인 깊이까지 연장된 조점 길이 범위를 통해, 시준된 광선의 초점을 맞추기 위한 초점 장치 (여기서 상기 광원과 초점 장치는 함께 분자 제제의 TPE를 촉진시키고, 이때, 초점 포인트 또는 초점 평면은 상기 조직에 적용될 수 있는 것임): 및
    조직 근처에 위치하고, 분자 제제에 의해 방출된 상기 광선을 검출할 수 있도록 위치하며, 조직 상에 입사된 광선의 광학적 경로를 재추적하지 않는 경로를 따라 통과하고, 광원의 초점이 맞추어진 특정 용적에 특징적인 검출된 신호를 생산하도록 배열된 검출기를 포함함을 특징으로 하는, 적어도 하나의 광-활성 분자 제제를 함유하는 식물 또는 동물 조직의 특정 용적을 조영하기 위한 조영 장치.
  36. 제 35 항에 있어서, 상기 광원이 약 75 메가헤르쯔 이상의 펄스 반복 주파수와 서브-나노초 펄스 기간을 갖는 펄스된 출력을 생산하는 것이 특징인 장치.
  37. 제 36 항에 있어서, 상기 광원이 근적외선을 발산하는 것이 특징인 장치.
  38. 제 37 항에 있어서, 상기 광원이 약 20 나노주울의 펄스 에너지를 발생하는 것이 특징인 장치.
  39. 제 37 항에 있어서, 상기 광원이 레이저로 된 것이 특징인 장치.
  40. 제 35 항에 있어서, 프로세서가 상기 검출기에 커플링된 것이 특징인 장치.
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 광원과 연계된 변조 시스템을 추가로 포함하고, 상기 프로세서는 상기 변조 시스템에 커플링되어 있는 것이 특징인 장치.
  42. 목적하는 조직의 특이성에 따라 선택되고, 이-광자 여기 (TPE)에 민감한 광-활성 분자 제제를 조직에 도입하고,
    상기 제제가 목적하는 특정 조직에 축적되도록 하고,
    실제로 공초점 영역에서만 TPE를 촉진하고 조직에 침투되는 에너지와 주파수에서 선택된 광선을, 조직 표면 하부의 영역을 비롯한, 조직 내의 목적하는 특정 영역에 지향시킨 다음,
    상기 조직 내의 깊이 범위의 공초점 영역의 국소화를 제어하고;
    TPE를 이용하여, 상기 제제를 조직 내의 상기 깊이 범위에 걸쳐 광-활성화시킴으로써, 에너지를 방출하는 광-활성화된 제제를 공초점 영역에서 생성시키고;
    방출된 에너지를 검색한 다음;
    공초점 영역에서 조직에 특징적인 것으로 검색된 에너지 신호를 발생시키는 단계로 이루어짐을 특징으로 하는 의학적 진단 조영법.
  43. 제 42 항에 있어서, 광선을 지향시키는 상기 단계가 짧은 펄스 폭과 높은 펄스 반복률에서 작동하는 펄스된 에너지를 이용하여 근적외선을 발생시키고, 상기 레이저를 상기 조직에 초점맞추는 것을 포함하는 것이 특징인 방법.
  44. 제 42 항에 있어서, 국소화를 제어하는 상기 단계가 검사 하에 공초점 영역의 위치를 조직에 대해 상대적으로 변화시키거나 또는 검사 하에 조직의 위치를 고정된 공처점 영역에 대해 상대적으로 변화시키는 것으로 이루어지는 것이 특징인 방법.
  45. 제 42 항에 있어서, 상기 방법이 광선이 조직 상에 입사되기 전에 광선을 변조시키고 방출된 광선으로부터 검출된 신호를 탈변조시키는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  46. 공초점 영역에서만 TPE를 촉진시키고 조직 표면 아래로 침투하는 에너지와 주파수대에서 선택된, 한정된 광선을 조영될 깊은 조직상 및 조직 아래로 지향시키기 위한 광원 수단;
    조영될 조직의 깊이 범위 내에서 광선의 공초점 영역의 위치를 변화시키기 위한 수단; 및
    상기 제제가 이-광자 여기를 이용하여 여기된 후 조직 내에서 상기 광-활성화된 분자 제제에 의해 방출된 등방성 조사를 수용 및 검색하기 위해 위치된 검색 수단을 포함하는 것이 특징인 의학적 진단 조영 장치.
  47. 제 46 항에 있어서, 광원 수단은 시준된 광선 빔을 발산하기 위한 수단을 포함하고;
    이 때, 광원 수단은 조직 표면 아래의 지점에서 조직과 함께 위치하는 공초점 영역으로 시준된 광선 빔의 초점을 맞추기 위한 초점 수단을 포함하는 것이 특징인 장치.
  48. 제 47 항에 있어서, 시준된 광선 빔을 발산시키기 위한 수단이 근적외선 스펙트럼에서 작동하는 펄스된 레이저를 포함하는 것이 특징인 장치.
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