CN1226148A

CN1226148A - 改进分子试剂光激活选择性的方法

Info

Publication number: CN1226148A
Application number: CN97196827A
Authority: CN
Inventors: W·G·费歇尔; E·A·沃彻特; H·C·德斯
Original assignee: Photogen Inc
Current assignee: Photogen Inc
Priority date: 1996-10-30
Filing date: 1997-10-28
Publication date: 1999-08-18
Also published as: WO1998018399A1; NO991492D0; CA2252783A1; IL128355A0; US5829448A; KR20000035893A; IL128355A; IN186854B; EP0977592A4; EP0977592A1; JP2000511929A; AU5152898A; IS5006A; BR9712599A; US6042603A; NZ334190A; US5998597A; NO991492L; AU716507B2

Abstract

一种处理植物或动物组织的特定体积的方法,包括以下步骤:用至少一种光敏分子试剂处理所述植物或动物组织,其中该植物或动物组织的该特定体积中保留了所述至少一种光敏分子试剂中的至少一部分,然后用足以促进保留于该植物或动物组织的该特定体积中的所述至少一种光敏分子试剂中的至少一种发生同时双光子激发的光处理该植物或动物组织的该特定体积,其中所述至少一种光敏分子试剂在该植物或动物组织的该特定体积中变得有活性。还公开了一种治疗植物或动物组织内癌症的方法,以及在材料的特定体积中产生至少一种被光激活的分子试剂的方法。

Description

改进分子试剂光激活选择性的方法

本发明是在美国政府的支持下，依据美国能源部授予LockheedMartin能源系统联合公司的DE-AC05-84OR21400号协议书完成的。Lockheed Martin能源系统联合公司和Oak Ridge联合大学向本发明人放弃了本发明的权利。依据美国能源部授予的DE-AC05-84OR21400号协议，美国政府享有该发明的权利。

发明领域

本发明普遍涉及用于高度空间控制地选择性光激活一种或多种分子试剂的方法和仪器。所讲授的用于达到选择性光激活的方法运用了非线性光能的特殊性质，即以高度的空间和分子专一性激发或促进试剂从一个分子能级跃迁到另一个能级。本方法的特性适用于处理各种类型的材料，特别是在治疗人和动物疾病中有独特优势。尤其是，非线性激发方法的使用有助于用近红外到红外辐射可控地治疗性激活深部组织中的光促(photodynamic)治疗试剂，所述近红外到红外辐射比目前所用方法和辐射的吸收和散射程度都要更低。

发明背景

许多领域都迫切需要一种能选择性控制各种分子试剂激活的方法。在激活方面所需的改进包括增强对激活位置和深度的空间或时间控制，减少对其它共存或近旁的分子试剂或结构的不希望的激活，增强所需分子试剂相对于不需要的分子试剂的激活的优先性。已开发出了多种线性和非线性光化学和光物理学方法，以对某些这类试剂作些这类改进。然而，总的说来，这些方法的效果和实用性都不尽人意。具体地说，很需要几种改进的光激活方法，它们可用于选择性光激活各种分子治疗试剂，同时在控制这种光激活的应用中有较好效果。

多年来已知光辐射可用于探测或转化分子试剂。线性光激发作为达到分子治疗试剂半选择性激活的途径已有广泛研究。例如，Tessman等(J.W.Tessman,S.T.Isaacs和J.E.Hearst,“DNA螺旋中呋喃侧8-甲氧基补骨脂素-胸苷单加成物的光化学，转变为二加成物和吡喃酮侧单加成物”，生物化学，24(1985):1669-1676)讲到可利用特定能级的光作为获得目标分子试剂和DNA(脱氧核糖核酸)之间分子键形成的部分选择性的途径。Kennedy等(J.C.Kennedy,R.H.Pottier和D.C.Ross，“基于内源性原卟啉Ⅸ的光促治疗：基本原理和目前的临床经验”，光化学和光生物学杂志，B：生物学，6(1990)143-148)综述了用于疾病临床治疗的各种光敏感分子试剂的开发和应用进展。而且Teuchner等(K.Teuchner,A.Pfarrherr,Ⅱ.Stiel,W.Freyer和D.Lsupold的“用于通过两步激发电子态的各种新的光促治疗起始机制的诸潜在激活剂的光谱性质”，光化学和光生物学，57(1993)465-471)讲授了用光谱学性质筛选出待用的光敏试剂。然而这些试剂的效果特别是用于激活这些试剂的诸方法不象预期那样成功。例如，Young(A.R.young，“用于PUVA治疗的补骨脂素的光致癌性：在小鼠和人中的现状”，光化学和光生物学杂志，B：生物学，6(1990)237-247)提供了有力的证据说明基于光敏分子试剂线性光激发而用于普通治疗方法中的光辐射，本身能导致疾病和其它不希望的副作用。而且，主要由于在这些试剂线性吸收波段附近的波长处的入射探测辐射的光散射和吸收效应，在分子治疗试剂的线性光激发上的尝试受不能达到期望的穿透深度所困扰。实际上，几乎所有用线性光激发进行分子转化的例子都受困于基本的效果限制，原因在于周围基质对入射光辐射的不希望的吸收和散射，对探测器分子种类的激发专一性较低，并且缺乏适当的物理机制来精确控制激活的范围和深度。

各种非线性光激发方法已被用来尝试提高某些应用中光激活的选择性，以及阐明由线性激发方法引起的许多限制。这些方法中利用了从单一模式、连续波(CW)激光器到有超过1GW峰值功率的脉冲Q-开关的激光器作为激发源。例如，Wirth和Lytle(M.J.Wirth和F.E.Lytle，“在光密介质中双光子激发的分子荧光”，分析化学，49(1977)2054-2057)中提出用非线性光激发作为刺激光密介质中目标分子的手段。该方法被证明适于用来限制探测辐射与介质自身之间不希望的直接相互作用，并提供了一条可有效激发强吸收或散射基质中存在的目标分子试剂的途径。Yeung等进一步提出可将非线性光激发用于很小体积内存在的目标分子的高度专一性激发(M.J.Sepaniak和E.S.Yeung，“用于高压液相色谱的激光双光子激发荧光检测”，分析化学，49(1977)1554-1556；M.J.Sepaniak和E.S.Yeung，“用基于激光的探测器进行碳液的高效液相色谱”，色谱学杂志，211(1981),95-102；和W.D.Pfeffer和E.S.Yeung，“用于微内径液相色谱的激光双光子激发的荧光探测器”，分析化学，58(1986)2103-2105)。这些工作讲授了在复合基质中诸目标分子试剂的非线性光激发的诱人效能优势，特别是由非线性方法而导致的背景激发减少，低探测体积，以及由非线性方法所提供的互补选择法则有助于提高该分析的选择性。在活性区内改进的空间调控已由Wirth进一步发展(M.J.Wirth和H.O.Fatunmbi，“双光子光谱学中的超高检测”，分析化学，62(1990)973-976)；专门地，Wirth讲授了使用显微成像系统在目标分子试剂的激发中实现极高空间选择性的方法。

Denk等还应用了类似的控制(W.Denk,J.P.Strickler和W.W.Webb，“双光子激光显微术”，美国专利第5034613号)，他们提出了一种特殊的共焦激光扫描显微镜，其中利用非线性激光激发在细胞或亚细胞水平上对多种分子荧光团试剂的光激活达到内部高度三维控制。然而，Denk特别致力于显微术，其中使用显微镜来观察载玻片上的样品。该显微镜是用来激发被添加到生物标本中构成光密介质的分子荧光团试剂的。在Denk看来，源于激光器的光因反射镜反射而下行至物平面。然后荧光沿相同光路返回，穿过物镜及一系列反射镜而最终进入光电倍增管。利用非线性光激发的特性来将激发基本限于物镜焦点处的共焦区，从而通过精确控制焦点的深度可使三维成像成为可能。控制光激发以在细胞和亚细胞水平产生基于发光的图象已示于置于载物台上的目标样品中。这种显微镜也可用于载物台上单个细胞中锁定的效应器分子的局部光解释放，据称这种显微镜可用来诱导这类细胞中的进一步光化学反应。然而，据称位于焦平面上的细胞的光诱导坏死的减少是这种显微术的最大优点，这是由于用近红外辐射代替了紫外激发辐射。Denk的方法和仪器似乎不适于用来处理躯体上基本位于组织表面下的组织的特定体积。相反，光仅聚集于载玻片的物平面上并反射回来。

美国专利4,822,335(Kwai等)公开了一种依次双光子激发的方法。Kwai利用第一个光电二极管来将一种光敏物质从基态激发至高能级的单线态，然后用第二个光电二极管将已由单线态跃迁到三线态的光敏物质从一个能级激发到更高能级。如以下所述，依次双光子激发相比于同时双光子激发有大量缺点和劣势。

这些举例示范的现有技术的实体清楚地阐明了光激活方法的许多吸引人的特点，但以前未讲过一种能满足工业不同需要的通用方法，用以高度空间控制性地选择性光激活一种或多种分子试剂。特别地，以前一直未讲授过在治疗应用或一般材料加工应用中比较重要的水平上达到这类控制的实用方法。

因此，本发明的目的之一是提供一种可高度空间选择性地处理植物或动物组织的方法。

本发明的另一目的是提供这样一种方法，其中使用一种光源和各光敏材料以强化这种高度空间选择性。

本发明的又一目的是提供这样一种方法，其中所用光的波长较目前用于处理植物或动物组织的光的波长对该植物或动物组织的损伤更小。

本发明还有一目的是提供这样一种方法，其中所用光较目前用于处理植物或动物组织的光波长更不易在植物或动物组织中散射和被其吸收。

根据本说明书，包括下述的几个附图和实施例，本领域技术人员能够确定本发明的其它目的和优势。

发明概述

考虑到以上及其它目的和优势，总的说来本发明提供了一种处理植物或动物组织的特定体积的方法，包括以下步骤：用至少一种光敏分子试剂处理该植物或动物组织，其中所述植物或动物组织的该特定体积保留了所述至少一种光敏分子试剂的至少一部分，然后用足以促进保留于植物或动物组织的特定体积中的至少一种光敏分子试剂中的至少一种试剂发生同时双光子激发的光处理该植物或动物组织的该特定体积，其中该至少一种光敏分子试剂在该植物或动物组织的该特定体积中变得有活性。

本发明也提供了一种用于治疗植物或动物组织中恶性肿瘤的方法，包括以下步骤：用至少一种光敏分子试剂处理该植物或动物组织，其中该植物或动物组织中的恶性肿瘤内保留了该至少一种光敏分子试剂中的至少一种的至少一部分，然后用足以促进保留于该植物或动物组织中的恶性肿瘤内的该至少一种光敏分子试剂发生同时双光子激发的光来处理该植物或动物组织，其中该至少一种光敏分子试剂在该植物或动物组织中的恶性肿瘤内变得有活性。

本发明还提供了用于在一块材料的特定体积中产生至少一种被光激活的分子试剂的方法。该方法包括用足以促进该材料的该特定体积中所包含的至少一种光敏分子试剂发生同时双光子激发的光来处理该材料的该特定体积，从而所述至少一种光敏分子试剂在该材料的特定体积中成为已被光激活的分子试剂。在本发明优选的实施方案中，所述材料选自植物组织或动物组织，该材料已预先用至少一种光敏分子试剂处理，从而在足以促进该光敏分子试剂发生同时双光子激发的光处理该材料的特定体积时该材料中会保留至少一部分光敏试剂。

本发明还提供了在一种材料的特定体积中产生至少一种已被光激活的分子试剂的方法，包括用足以促进该材料的特定体积中至少一种光敏分子试剂发生光激发的光来处理该材料的该特定体积，其中所述至少一种光敏分子试剂在该材料的特定体积中成为一种已被光激活的分子试剂。

在本发明的另一个优选实施方案中，足以促进光敏分子试剂发生同时双光子激发的光是激光，且最好是脉冲激光。

在本发明另一个优选实施方案中，足以促进光敏分子试剂发生同时双光子激发的光是一束聚焦光束，优选是聚焦激光束，更优选是聚焦过的脉冲激光。

在本发明另一个优选实施方案中，所述光敏分子试剂选自下述成员：补骨脂素、补骨脂素衍生物，卟啉衍生物，血卟啉衍生物，四氮杂卟啉(tetraazaporphyrin)衍生物，酞菁衍生物，若丹明衍生物，香豆素衍生物，苯并吩噁嗪衍生物，氯丙嗪，氯丙嗪衍生物，叶绿素衍生物，细菌叶绿素衍生物，金属-配基络合物，脱镁叶绿甲酯一酸a，部花青540，维生素D,5-氨基-γ-酮戊酸，photosan，二氢卟酚e6，二氢卟酚e6亚乙基二酰胺，单-L-天冬氨酰二氢卟酚e6，以及吩噁嗪尼罗蓝衍生物。

更优选光敏分子试剂选自下列成员：补骨脂素，5-甲氧基补骨脂素(5-MOP),8-甲氧基补骨脂素(8-MOP),4,5′,8-三甲基补骨脂素(TMP),4′-氨甲基-4,5′,8-三甲基补骨脂素(AMT),5-氯甲基-8-甲氧基补骨脂素(HMT)，当归根素(异补骨脂素)，5-甲基当归根素(5-MIP)，以及3-羧基补骨脂素。

同样更优选光敏分子试剂选自下列成员：卟啉，血卟啉衍生物(HPD),photofrinⅡ，苯并卟啉衍生物(BPD)，原卟啉Ⅸ(PpⅨ)，染料血卟啉醚(DHE)，多血卟啉酯类(PHE)，原卟啉的13,17-N,N,N-二甲基乙基乙醇胺酯(PH1008)，四(3-羟基苯基)卟啉(3-THPP)，四苯基卟啉单磺酸盐(TPPS1)，四苯基卟啉二磺酸盐(TPPS2a)，二血卟啉醚，meso-四苯基卟啉，meso-四(4N-甲基吡啶基)卟啉(T4MpyP)，以及八(4-叔丁基苯基)四吡嗪紫菜嗪(octa-(4-tert-butylphenyl)tetrapyrazinoporphyrazine，OPTP)。

还要更优选的光敏分子试剂选自下述成员：酞菁，四(4-叔丁基)酞菁(t₄PcH₂)，四(4-叔丁基)酞菁镁(t₄PcMg)，氯化铝酞花青磺化的酞菁(CASPc)，氯化铝酞花青酞菁四硫酸盐(AlPcTs)，单磺化的铝酞菁(AlSPc)，二磺化的铝酞菁(AlS2Pc)，三磺化的铝酞菁(AlS3Pc)，四磺化的铝酞菁(AlS4Pc)，硅酞菁(SiPc Ⅳ)，锌Ⅱ酞菁(ZnPc)，双(二异丁基十八烷基甲硅烷氧基)硅2,3-萘酞菁(naphthalocyanine)(isoBOSINC)，以及锗Ⅳ八丁氧基酞菁(GePc)。

进一步优选的光敏分子试剂选自下述成员：

若丹明101(Rh-101)，若丹明110(Rh-110)，若丹明123(RH-123)，若丹明19(Rh-19)，若丹明560(Rh-560)，若丹明575(Rh-575)，若丹明590(Rh-590)，若丹明610(Rh-610)，若丹明640(Rh-640)，若丹明6G(Rh-6G)，若丹明700(Rh-700)，若丹明800(Rh-800)，若丹明B(Rh-B)，磺基若丹明101(sulforhodamine 101)，磺基若丹明640以及磺基若丹明B。

还要进一步优选的光敏分子试剂选自下述成员：香豆素1，香豆素2，香豆素4，香豆素6，香豆素6H，香豆素7，香豆素30，香豆素47，香豆素102，香豆素106，香豆素120，香豆素151，香豆素152，香豆素152A，香豆素153，香豆素311，香豆素307，香豆素314，香豆素334，香豆素337，香豆素343，香豆素440，香豆素450，香豆素456，香豆素460，香豆素461，香豆素466，香豆素478，香豆素480，香豆素481，香豆素485，香豆素490，香豆素500，香豆素503，香豆素504，香豆素510，香豆素515，香豆素519，香豆素521，香豆素522，香豆素523，香豆素535，香豆素540，香豆素540A以及香豆素548。

本发明另一个优选实施方案中，所述光敏分子试剂选自下述成员：5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]-吩噁嗪鎓盐(EtNBA),5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]吩噻嗪鎓盐(EtNBS)和5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]吩硒嗪鎓盐。此外，还优选光敏分子试剂选自下述成员：二氯化三(2,2′-双吡啶)钌(Ⅱ)(RuBPY)，二氯化三(2,2′-双吡啶)铑(Ⅱ)(RhBPY)，以及二氯化三(2,2′-双吡啶)铂(Ⅱ)(PtBPY)。

此外，更优选光敏分子试剂选自下述成员：芪，芪衍生物以及4-(N-(2-羟乙基)-N-甲基)-氨基苯基)-4′-(6-羟基己基磺酰基)芪(APSS)。

而且，更优选所述至少一种光敏分子试剂包括至少一种生物源性光敏分子试剂，其中所述至少一种生物源性试剂包括选自下述成员的片段：DNA,RNA，氨基酸，蛋白质，抗体，配体，半抗原，糖受体或络合试剂，脂类受体或络合试剂，蛋白质受体或络合试剂，螯合剂以及被囊载体，所述至少一种生物源性光敏分子试剂还要更优选包括一个片段，该片段在受到足以促进同时双光子激活的光照下会被光激活。

附图简介

参考示范性实施方案的下述详细描述可有助于更好地解释本发明。结合附图理解说明书，其中：

图1展示了线性和非线性光激发的能级图例；

图2展示了用于单光子与双光子激发的入射光功率与激发效率之间的关系；

图3展示了单光子和双光子光电离的简要描述；

图4展示了单光子和双光子光电离的激发态行为；

图5比较了单光子激发和同时双光子激发时RuBPY分子发光性质作为发射波长的函数；

图6是发光寿命作为激发态猝灭剂浓度函数的Stern-Volmer图；

图7比较了使用单光子激发和同时双光子激发时1,4-萘二酚吸收截面作为激发波长的函数；

图8给出了动物组织从紫外到近红外光谱范围内的吸收光谱图例；

图9给出了动物组织从紫外到近红外光谱范围内的散射光谱；

图10显示了动物组织对短波长和长波长光的光吸收性质的一般趋势；

图11比较了用单光子和双光子激发方法时光诱导的组织损伤；

图12显示了均匀分布于一块琼脂糖凝胶中的染料分子香豆素480的双光子激发的荧光照片；

图13显示了均匀分布于一块肿瘤标本中的染料分子香豆素480的双光子激发的荧光照片；

图14展示了本发明用于PDT试剂的选择性双光子NIR(近红外)光激活的第一个优选实施方案；

图15显示了第一个优选实施方案的一种变更，其中用聚焦过的NIR光进行局部光促治疗；

图16显示了第一个优选实施方案的一种变更，其中用非聚焦的NIR光进行局部光促治疗；

图17显示了第一个优选实施方案的一种变更，其中用非聚焦的NIR光来光促治疗皮下损伤；

图18显示了长期暴露于连续的365nm UV辐射中，添加的AMT(4′-氨甲基-4,5′8-三甲基补骨脂素)的发光带的典型逐步偏移；

图19显示长期暴露于364nm的紫外光的亚微微秒脉冲时，添加的AMT的荧光带位置的逐步偏移；

图20显示了暴露于室内荧光时添加的AMT的对照结果；

图21显示了长期暴露于728nm的近红外光的亚微微秒脉冲时，添加的AMT的荧光带位置的逐步偏移；

图22显示了遗传性PDT试剂的细胞内光激活；和

图23显示了本发明用于诸生物源性PDT试剂的第二个优选实施方案。

附图详述

此处所述发明利用诸分子试剂的非线性光激发的独特物理性质来有效地改进对那些试剂进行光激活的空间控制。此外，在医药试剂及其它试剂的光激活中，非线性光激发已显示有更多优势，包括减少沿着激发途径的附属激发和损伤，减少有害光波长的照射，减少由于被激发试剂的周围环境的吸收和散射过程而引起的干扰，增强试剂激发中的分子专一性。用于本发明的非线性光激发方法，即同时双光子激发，显示出能提供一种治疗许多疾病的较好方法。线性和非线性光激活过程的能级模型：

本公开内容所讲授的发明的基本意义在于用非线性光激发方法来高度空间控制性地选择性地光激活一种或多种分子试剂。这种选择性的光激活是通过利用一种试剂从一个分子能级到另一个能级的非线性光激发的特殊性质来达到的。为充分理解这个过程的显著特征，有必要发展一种非线性的同时双光子激发以及用于相关的线性和非线性过程的概念模型。这可用能级图形式很方便地说明。

图1显示了几种线性和非线性光激发过程的典型分子能级图。在这个简化的Jablonski图表中，垂直方向对应于能量的变化，而水平方向代表从左到右事件发生的次序。水平实线代表量子力学允许的分子能级，而水平虚线代表不允许的虚拟能级。量子力学允许的分子能级相对长寿，且通过吸收能量而使分子激发的概率，如通过吸收一个适当能量的光子而激发分子的概率较高。虚拟能级可通过多种激发过程达到，但与允许的分子跃迁相比，它们的寿命极短(在10^-15秒数量级，根据Heisenberg的不确定原理所估测)，使它们仅在特定的激发条件下有意义。Jablonski简图中直线箭头代表辐射能量转移过程：向上的箭头表示吸收能量，而向下的箭头代表辐射发射，如光子的荧光发射。曲线箭头代表非辐射能量转移过程，如振动弛豫。直线或曲线箭头的垂直长度与给定过程中吸收或发射的能量成比例。

对图1中第一个Jablonski简图表示，吸收了具有足够能量而能直接促进该分子从一允许的电子能级6(一般为最低电子能级，或基态，称为S₀)跃迁到另一允许的具有较高总能级的电子能级8(此处用S₂态表示)的光子4后，就发生单光子激发至一个允许的能级2的情形。注意有可能向多个允许的较高电子能级发生激发，如第二允许电子能级8和第三允许电子能级10所代表的那些能级。随着能量增加，它们通常被称为S₁,S₂，等等。而且，每一允许的电子能级可进一步细分为不连续的振动能级群12；这些不连续的振动能级12中的每个能级同样可进一步细分为不连续的旋转能级群。因此，每个允许的电子能级：S₀、S₁、S₂等，由于可能存在大量的振动和旋转态，从而构成了多个允许能级的复杂带。通过吸收光子4的能量，分子被激发至一具体的独特电子振动能级14，有时称作电子振动能级。然后该分子可从这一激发态进行快速内部转换16，例如转换到第三允许电子能级10的最低允许的被激发的电子振动能级18，此处以S₁态表示。这一内部转换16通常很快，进行的时间范围在10^-12秒到10^-15秒数量级。最后，被激发的分子可通过诸如发射光子20进一步发生弛豫，从而回复到初态，即第一能级6；可能的弛豫过程包括碰撞失活，发荧光和磷光。这一过程的一个例子是通过吸收400nm的一个光子，将染料分子香豆素从基电子态激发至激发电子态，随后发射一个480nm的荧光光子。这一实例中激发的概率与入射光辐射的功率线性相关，因此称单光子激发至一个允许能级2为线性激发过程。

在图1第二个Jablonski简图中，吸收了不具有足够能量以直接激发该分子至一个允许电子能级26的一个光子24时，就出现单光子激发至一个虚拟能级22的情形。然而，该分子被激发至一个寿命极短的虚拟能级28。此虚拟能级28的寿命通常是10^-15秒的数量级。通过诸如弹性散射这类过程，吸收的光子24通常从此虚拟能级28发生实质上瞬时的再发射。这一过程的重要例子是在用800nm的光激发香豆素时，香豆素在800nm处发生的Rayleigh散射过程。另一个例子是Raman散射，当分子回复到与基态相关的各种振动能级时即发生这种散射。在这些示例性的过程中，激发概率也与入射光辐射的功率线性相关，故单光子激发至一个虚拟能级22的过程也称为线性激发过程。

示于图1的第三个Jablonski简图中，在依次吸收了第一个光子34和第二个光子36后，即发生依次双光子激发至一个允许能级32的情形，所述两个光子都有足够能量来直接激发该分子从一个允许能级跃迁至另一个允许能级。吸收第一个光子34后，分子从第一允许电子能级6，如基态S₀，被激发至第二允许电子能级38，如激发态S₁，该分子一般能从这一能级进行快速内部转换42至一相对长寿的最低允许的被激发的电子振动能级44，其寿命通常在10^-7秒至10^-9秒数量级。当分子仍在最低允许的被激发的电子振动能级44时再吸收第二个光子36，将激发该分子至第三允许电子能级40，如激发态S₂。第二个光子36与第一个光子34的能量可能相同，也可能不同。激发至第三允许能级40后，该分子可进行一系列过程，包括进一步的内部转换46及能量的再发射48。另一种情形是，若第二个光子36有足够能量，它可通过光电离子化过程电离该分子。这一过程的一个例子是染料香豆素经过440nm光的极强激发产生离子化分子的光电离作用，其中该香豆素分子依次吸收了440nm光的两个光子。在这第三个实例中，激发的概率不再与入射光辐射的功率线性相关，而与第一个光子34和第二个光子36的功率的乘积有关；因此，依次双光子激发至一允许能级32被称为是非线性激发过程。

图1所示最后一个Jablonski简图中，当同时吸收双光子中的第一个光子52和双光子中的第二个光子54时，就发生同时双光子激发至一允许能级50的情形。此情形下双光子中的第一个光子52和双光子中的第二个光子54的组合能量足以激发该分子从第一允许能级6跃迁至第二允许能级56。通常双光子中的第一个光子52和双光子中的第二个光子54各自的能量均不足以直接激发这个或者任何其它允许的电子跃迁。然而，双光子中的第一个光子52激发该分子至一寿命极短的虚拟能级58，这一能级与第二个Jablonski简图中所示的虚拟能级相同。在弛豫发生前，双光子中的第二个光子54立即激发该分子跃迁至第二允许电子能级56。其结果是发生与用线性单光子激发至一个允许能级2时等效的激发。注意双光子中的第一个光子52和双光子中的第二个光子54的能量可以相同，也可以不同。而且，入射激发光的瞬时辐照度，或Wm^-2，必须极高，以便在虚拟能级58发生弛豫回复到最初的第一允许电子能级6之前，能够足够有效地吸收双光子中的第二个光子54。实际上，因虚拟能级58的寿命在10^-15秒数量级，故常用峰值功率很高的脉冲激发源来有效激发这些过程；这类光源常常是优选的，因为它们能在虚拟能级58的短寿命期间提供大量光子给激发过的分子。这种同时双光子激发过程的一个实例是通过同时吸收800nm的两个光子而激发染料分子香豆素从基电子态跃迁至激发电子态，随后发射出480nm的一个荧光光子。在这第四个实例中，激发概率与双光子中的第一个光子52和双光子中的第二个光子54的瞬时或峰值功率的乘积有关。这可用光化学反应的形式表示出来：

分子_基态+2hν_800nm→分子_激发态 (1)这一式子表示一个基态分子在同时吸收2个800nm的光子-hν_800nm后将跃迁至一激发态。反应速率R由下式计算：R=k[分子_基态][hν_800nm]²，其中k是速率常数，而[分子_基态]和[hν_800nm]分别代表基态分子和激发光子的浓度。这样，由于众所周知的对瞬时光子辐照度的二次方的相关性，同时双光子激发至一允许能级50也被称为非线性激发过程。

明确依次双光子激发至一允许能级32和同时双光子激发至一允许能级50之间的主要区别非常重要。在依次双光子激发至一允许能级32中，第一个光子34和第二个光子36各自的能量均必须足以激发分子直接跃迁至第二允许电子能级38和第三允许电子能级40，然而，同时双光子激发至一允许能级50则更为广泛，因它只须双光子中的第一个光子52和双光子中的第二个光子54的组合能量足以激发分子跃迁至第二允许电子能级56即可。

此处所讲授的发明利用了非线性同时双光子激发到一允许能级50的过程。在此公开内容的后续部分，同时双光子激发至一允许能级50的过程称为“同时双光子激发”。当需要区分“同时双光子激发”和依次双光子激发至允许能级32过程时，用术语“依次双光子激发”来表示后者。依次双光子激发可用于诱导诸分子试剂的光电离作用，特别是在实验室条件下，但其商业应用的价值很小，这是由于它具有若干缺点，包括难于对应用进行空间控制，且需要可提供多种必需光子能量的激发光源。单光子激发和同时双光子激发的比较：

当光与一个分子系统相互作用时，它诱导一个极化过程，该极化过程与线性极化率和所施加的电场强度的乘积成正比例。当该电场很强时，系统不能简单描述，描述诱导的极化作用时必须引入较高阶的相互作用的项。同时双光子激发被称为一种非线性过程，这是因为它出现在来自两个光子的电磁场通过这些高阶项，特别是三阶极化率的虚部X⁽³⁾”，组合在一起，从而引起一次电子能级跃迁的时候。这是描述同时双光子吸收的非线性的另一途径。即，该分子系统非线性地与强电磁场反应。与之相比，单光子激发过程可用线性极化率描述，它们与激发功率成线性关系。单光子激发60和同时双光子激发62的入射功率与激发效率之间完全不同的关系示于图2。注意同时双光子激发的截面一般约比等效的单光子激发过程的截面小10万倍。这是由于双光子在极短的虚拟能级寿命期内同时与一个分子相互作用的概率较低。然而，获得能提供极高峰值功率的光学激发源，如锁模激光器，就能通过增大瞬时入射功率而极大地提高同时双光子激发的有效效率，从而大大改善这种低效率。例如，用连续波激发时，对特定分子系统，双光子激发效率可能比单光子激发的效率小10⁵倍。然而，若以一系列极短脉冲的形式发出同样的平均光功率，则该峰值与平均功率的换算关系将改变这个比值，使之接近于1。

同时双光子激发的非线性性质可导致同时双光子激发和线性激发在空间激发性质上的重要差别。例如，图3表明，当激光束70聚焦72到样品74时，单光子激发效率曲线64和同时双光子激发效率曲线66作为该光束亮度曲线68的函数可完全不同。该样品74可以是盛于比色杯76壁之间的激光染料溶液。用透镜78聚焦72激光束70，产生一光束亮度曲线68，它作为穿过样品74的距离的函数而变化，根据经典Gaussian光学理论推测其在焦点80的中心达到最大值。对单光子激发过程而言，由光束亮度(或入射功率)与激发效率之间的线性关系得到单光子激发效率曲线64，它与光束亮度曲线68成线性关系。相比之下，对同时双光子激发过程而言，光束亮度(或入射功率)与激发效率之间的非线性关系产生的同时双光子激发效率曲线66与光束亮度曲线68的平方相关。因此，当用同时双光子激发时，对激光束70进行聚焦72能基本上将激发范围限制在一个小的焦点区。这有时被称作共焦区，定义为延伸距离为2πW₀ ²/λ的区域，其中W₀是最小光束腰部的直径，而λ是光辐射的波长。相比之下，用线性激发时，基本上沿着整条光径发生激发，使激发的空间定位相当不确定。

一旦一个分子已被激发至激发态，则可发生各种物理和化学过程，包括光子的光发射，光化学转化，如异构化或氧化，或者光电离。重要的是，是由激发态及其环境的基本性质决定该分子的最终命运。导致分子跃迁至激发态的机制对其命运无显著影响，这是由于激发过程本身并不直接影响被激发的分子或其环境的随后性质。

分子试剂如全氯乙烯的单光子光电离82和同时双光子光电离84的激发态行为的等同形式简要示于图4(以Jablonski简图方式)。在单光子光电离82中，吸收单光子86的能量可激发一个分子从其基态88跃迁至相当于或高于该分子的电离电位90的一个能级。此电离电位90应高于一般的激发态能级92。当通过吸收单光子86而跃迁至相当于或高于该电离电位90的能级时，该分子将发生光电离94，此处以反应：R→R⁺表示，其中R为该分子的最初形式，而R⁺为该分子的离子化形式。对全氯乙烯分子而言，当吸收254nm的单光子86(4.88ev)时会发生光电离94。在同时双光子光电离84中，将同时吸收双光子中的第一个光子96和双光子中的第二个光子98的能量。如果双光子中的第一个光子96和双光子中的第二个光子98的合并能量等于单光子光电离82实例中所吸收的单光子86的能量，则对该分子的效果是相同的。双光子中的第一个光子96激发该分子至一虚拟能级100后，经吸收双光子中的第二个光子98提供的附加能量可立即激发分子由该虚拟能级100跃迁至相当于或高于该电离电位90的能级。一旦发生激发，光电离94即以与单光子激发82中所示的相同方式进行。对全氯乙烯这一例子而言，同时吸收508nm的双光子中的第一个光子96(2.44ev)和508nm的双光子中的第二个光子98(2.44ev)会导致光电离94，这与吸收254nm的单光子(4.88eV)时发生的光电离相同。

注意除图示于图1和图4中的例举能级简图以外，许多其它可能的跃迁和能级状态也是可能的，这取决于大量因素，包括该分子系统的特性，其环境，以及吸收和释放形式的能的具体能量，还有它们的时间和空间相关性。例如，为了简洁，图1和图4中略去了从单线激发态到三线激发态的系统间跨越这个重要的跃迁。这一跃迁在发光过程和许多光化学过程中尤为重要。示于图1和图4中的单线电子跃迁，如S₀→S₂，依据Pauli不相容原理，构成了在量子力学中允许的跃迁，其中所有电子的自旋都是成对的，且这些成对的电子自旋均方向相反。三线态不同于单线态之处在于其中高能级电子与低能能级电子的自旋方向相同。虽然这种单线-三线跃迁在量子力学中是不允许的，但对于某些分子系统，由于其S₁态的寿命相比于系统间跨越的速率常数相对要长一些，因此这种内部转换的概率要大于0。由于从三线态回复到单线态的跃迁也是不允许的，如T₁→S₀，因此三线激发态的寿命可能特别长，一般在10^-6到10¹秒之间。这很重要，因为这么长的三线态寿命可允许被激发的分子进行各种化学反应，特别是那些涉及将能量转移至另一分子的那些反应。涉及三线态中间产物的反应在许多大的有机或生物有机分子的光化学中特别重要，且在很多用于光促治疗的分子试剂的光激活中可作为主要的动力学步骤。

前述关于激发态行为等价的讨论可扩展到涉及三线激发态的那些情形，原因在于分子激发、反应与发射的途径，包括那些涉及三线态的过程，都是由该分子及其环境所决定的。因此，在激发至三线态时发生特定光化学和光物理转变的分子将经历相同的转化，不管它是由单光子过程激发的还是由同时双光子过程激发的。例如，我们已显示，金属-配基络合物二氯化三(2,2′-双吡啶)钌(Ⅱ)(RuBPY)在发生390nm单光子激发或780nm同时双光子激发(其中780nm的双光子的合并能量与390nm的单光子等同)时表现出相同的激发态性质。图5比较了经390nm单光子激发102以及经780nm同时双光子激发104后，RuBPY的发光性质作为发射波长的函数，前者以圆圈表示，后者以实线表示。这两种方法中三线激发态的发射性质相同，表明激发态及其随后的性质相同，而与激发方法无关。

作为这种激发态行为等同的进一步证实，图6显示，若测量用386.5nm的单光子激发106时RuBPY的发光寿命(以圆圈表示)及用782nm的同时双光子激发108时RuBPY的发光寿命(以方块表示)，则再次观察到相同的激发态性质。特别地，图6是发光寿命作为激发态淬灭剂浓度的函数的Stern-Volmer曲线。若一分子跃迁至激发态，则该分子在激发态的停留时间长短ι由该分子的基本性质决定，可定义为τ=τ₀。若向系统中加入一种激发态淬灭剂，则其寿命将变至不同τ值。众所周知，若将τ₀/τ的比值作为激发态淬灭剂浓度的函数作图，则可得到线性关系。这就是Stern-Volmer图。图6显示，对于添加了不同量的Fe³⁺淬灭剂的RuBPY水溶液而言，单光子激发106和同时双光子激发108的Stern-Volmer曲线是相同的。这进一步证实了分子的激发态性质是相同的，并且这些性质与跃迁至激发态的机理无关。

对单光子和同时双光子激发而言，激发过程的选择定则和截面也许相去甚远，但是分子的特定激发态的属性是相同的，而与用于激发该分子跃迁到激发态的机理无关。图7给出了单光子激发112和同时双光子激发114的吸收截面的相对比较，这些吸收截面是用于1,3-萘二酚110的激发波长的函数。要注意的是，用于代表同时双光子激发114的数据的波长范围已经过了调整，以反映出同时双光子吸收在能量上等效于对一个能量两倍于双光子中每个光子能量(或波长的一半)的单光子的吸收。比较1,4-萘二酚110的单光子激发112和同时双光子激发114的相对截面，可以看出它们作为波长的函数的明显差别。这些在截面上的差异可归因于用于特定分子跃迁的单光子和双光子的选择定则不同，并且可基于单、双光子选择定则的差异，利用在截面方面的这些差异来优化激发的选择性，或者用来设计具有特殊双光子吸收属性的特定分子试剂。然而，总之，虽然特定分子试剂的选择定则和截面可能存在也可能不存在显著差异，但这些特定分子试剂的激发态属性在每个有效激发波长都基本一样，而与激发方法无关。

单光子和同时双光子过程中吸收和散射性质的重要性：

尽管同时双光子激发的截面可能明显低于在单光子激发中所观察到的截面，但在很多情况下，利用同时双光子激发方法可能会比单光子激发更有利，原因在于较长波长的光辐射的基质吸收和光散射较低。例如，图8表示动物组织如人真皮从紫外(UV)到近红外(NIR)光谱区的吸收光谱116。图9表示动物组织如人真皮在相似条件下的散射光谱122。特别地，图8表明高能光子118怎样经历比低能光子120明显更强的组织吸收。例如，人类皮肤强烈吸收400nm的高能光子118，但对800nm的低能光子比较通透。这是皮肤中色素、蛋白质、遗传物质以及其它天然成分对高能光子118的天然吸收结果。图9进一步显示高能光子124怎样经历比低能光子126明显更强的组织散射。任何光密介质，例如人皮肤，都会强烈散射高能光子124，比如说600nm的光子，但对1200nm的低能光子126，其散射却低得多。这些光学性质上的不同导致两个重要结果。第一，当暴露在UV或其它高能光时，组织会吸收短波长、高能量光子118，造成不期望的组织损伤。相比之下，在低能光子120如NIR光的照射下，即使NIR光的光功率比UV辐射的光功率高许多倍，但其效果仍是可忽略的。第二，组织对高能光子118所固有的强吸收和散射会导致组织穿透深度很浅，而低能光子120的穿透深度通常要深得多。

高能和低能光在吸收和穿透深度性质上的这些重要差别图示于图10中。若将UV光128，例如400nm的光照射到人组织130上，光能中的大部分很快被最外层132如表皮和真皮吸收和散射，该组织的细胞中某些分子，比如那些组成细胞核中遗传物质的分子的激发可能是吸收的原因。细胞成分吸收这种高能光可以起始这些细胞中的多种附带的光化学变化134。由于对UV光128的吸收引起的这些附带光化学变化134可以包括不可逆的遗传损伤和癌症的诱导。相比之下，组织130对NIR光136如800nm的光的吸收或散射就没有如此可观。穿透的总深度会深得多，对细胞的附带损伤也会明显减弱。因此，如果用长波长的激发光代替高能的单光子激发光，就有可能利用相对来说无损伤、具高穿透深度的同时双光子激发方法来光激发特定分子。

此外，与NIR光固有的无损伤属性和低吸收性联系起来后，图3所示的非线性激发的性质具有其它意义。例如，利用单光子激发138和同时双光子NIR激发140方法照射皮下肿瘤142时，组织中光诱导损伤范围的比较如图11所示。单光子激发138造成了一个光损伤区144，其范围基本上沿着整条光路，并且没有明显的生物特异性。这样，除了在肿瘤142中诱导期望的光损伤外，整个周围组织都会受到附带损伤，例如表皮146和周围的真皮148。如果单光子激发138被聚焦，在焦点150处的光损伤区144会稍微增强。然而值得一提的是，如果UV或可见光未到达肿瘤142之前就被表皮146和真皮148吸收掉，那么这一光损伤区144甚至不会延伸到肿瘤142。这是由于组织对短波长的固有高吸收所造成的。相比之下，利用NIR同时双光子激发140时，由于这一激发方法的非线性属性所致，将引起窄范围的远程光损伤区152，该区基本定位于焦点154处。此外，由于组织不会大量吸收NIR光，因而对其周围表皮146和真皮148的附带损伤能减到最小程度。

图12表示在光密介质中，一种定位的远程光激活响应的激发。该图给出了均匀分布于琼脂糖凝胶块中的染料分子香豆素480经双光子激发后的荧光照片。以78MHz的脉冲重复频率、在一个直径约为1mm的光束中，发出波长为730mm、光脉冲(宽度)短于200fs的连续序列的锁模钛蓝宝石激发器的近红外输出，用一个扩散光束的望远镜将其扩散，以便产生一个直径约为50mm的准直光束。然后使用一块100mm焦距、50mm直径的双凸单玻璃透镜，将这个已扩散的光束聚焦到该凝胶块上。然后调整凝胶块的方位，使得100mm焦距的透镜的焦点落在凝胶块内40mm处。图12明确表明香豆素480的荧光只有在NIR光束的焦点才被激发。由于双光子激发和瞬时激光功率之间的二次方关系，光路中焦点前后各位置的分子激发是可以忽略的。因此在焦点区域外，仅有少量或没有附带光激活发生。而且，由于NIR激发光仅被凝胶微弱散射，因此在凝胶中较深的穿透深度仍能维持清晰的焦点。由于焦点的清晰度是由Gaussian光学性质所决定的，那么可以通过改变用于光束扩散和随后聚焦的光学参数来方便地调节焦区的长度。如果以等效的方法作用于标记的肿瘤样品，可以得到相似的结果，如图13所示。该图给出了均匀分布于整块小鼠癌组织中的染料分子香豆素480经双光子激发后的荧光照片。象图12中一样，该图也表明了激活的严格定位。

同时双光子激发在医疗上的应用：

上述讨论表明组织和细胞成分对UV和NIR光吸收的根本差别，与同时双光子激发的特殊非线性性质一起在疾病治疗的改进上尤其是在光促治疗(photodynamic therapy,PDT)领域中应该有直接应用。传统的PDT，或者最近发展起来的“双光子”PDT方法中利用光能对施用于患病组织的光敏药物制剂进行半选择性光激活。这些制剂的施药途径主要是患病组织的局部施药，或通过系统施药途径。在理想条件下，PDT试剂会分布于或者富集于患处。这种富集可能是对浅层患处直接局部施药的结果，或者是由于患处的物理或化学性质不同而导致PDT试剂分布于患处。PDT试剂施加后，利用光辐射来激发PDT试剂的光化学变化，达到治疗效果。另一种方法是，将两种或多种试剂施于患病组织，其中至少有一种试剂可以通过与光的相互作用而直接激发，且这些被激发的试剂可以通过能量转移过程(例如电荷转移或光的再发射)将捕获的光能传递到一种或多种其它的共存试剂，从而产生治疗效果。一个实例是联合使用一种染料分子和一种PDT试剂，其中该染料分子捕获激活光，随后把能量传递给该PDT试剂，由此引发生物学效应。就一切情况而论，使用PDT的医疗人员希望这些光化学变化可以导致患处局部的细胞增殖中止或细胞坏死。

已有的PDT激发方法是基于基本上与图1所示方法等效的多种方法，其中利用直接单光子激发2或依次双光子激发32；后者是在技术和专利文献中的所有在前所述“双光子”PDT方法的基础。这两大类激发方法都依赖于相对高能量、短波长光，从而导致穿透深度较浅，并且附带组织损伤的可能性较高。例如，利用PDT治疗食道癌，对于表层病灶的治疗很有效，但对于未局部暴露的病灶，其效果要差得多。再如基于8-甲氧基补骨脂素(8-MOP)的PDT治疗牛皮癣，已证明当用波长为大约250到400nm的UV辐射来激发8-MOP时它是有效，但这一UV辐射与周围部分皮肤癌的发生密切相关。正在开发可利用NIR光进行光激活的新型PDT试剂，以避免与UV辐射相关的危害。多数情况下，已证明这些试剂不太稳定，且常常有毒。这可能部分由于这些试剂的激活阈值较低，使它们对目的治疗区外的自发或不希望的反应更加敏感。常规PDT方法的其它缺点还有施药位点的特异性较低，并且有可能使激发通路上的健康组织坏死。

本发明讲述的同时双光子激发PDT方法可以避免传统PDT方法的局限性和复杂性，并且可以与现有的PDT药物试剂和新型NIR激活的PDT试剂兼容。尤其是，本发明能够提高PDT试剂的光激活的定位，而且与传统方法相比，可以显著降低附带组织损伤的可能性。如果对于穿透的控制不是很严格，则未聚焦的NIR光可以用来刺激位于较大辐照范围内的PDT试剂发生同时双光子光激活。这种情况下，通过改变暴露于NIR光束中的位置、亮度和时间来控制PDT试剂的光激活范围。如果需要对穿透深度或药物施加的体积范围进行精确控制，可用聚焦的NIR光来刺激同时双光子光激活过程。这种情况下，可利用光束辐射、暴露时间和聚焦程度来控制PDT试剂的光激活范围。上述两种情况下，可利用高辐照度NIR辐射来达到最高效率。而且，NIR辐射所达到的高穿透深度和光激活的固有定位(聚焦的同时双光子激发使其成为可能)一起提供了一种用于光激活皮下病灶中的PDT试剂而不伤及上方或下方健康组织的独特方法。

发明的第一个具体实施方案

因此本发明一个特别优选的实施方案就是应用NIR光源，如锁模的钛-蓝宝石激光器的输出，使用波长大约两倍于传统的单光子光激活所必需的波长的光来诱导PDT试剂发生同时双光子光激活。这个优选的实施方案如图14所示。NIR光源156生成的一束NIR辐射158由一系列快速的NIR辐射的高峰值功率的脉冲组成。例如，标准的市售锁模钛-蓝宝石激光器能够发射出锁模脉冲，脉冲持续时间小于200fs，脉冲重复频率超过75MHz，脉冲能量大约20nJ；这一光源发出准连续光束，该光束具有较低的平均功率(上至几瓦)，但都有高的峰值功率(在大约100kW的数量级)，在NIR的波长范围由约690nm到1080nm连续可调。来自NIR光源156的脉冲串形成NIR辐射光束158，应用标准的光学方法，如反射或折射光学系统160，可以方便地聚焦。聚焦过的NIR光束162随后可被直接投射到患病组织164上。PDT试剂的同时双光子光激活基本上被限定在聚焦光束162的共焦区166，因为只有在焦点处才表现高的瞬时辐照水平。而且，不管PDT试剂是否存在于周围的健康组织168或皮肤170中，发生在共焦区166之外的附带光激活或光损伤都不显著。这是瞬时光功率和同时双光子激发之间非线性关系的结果，这使得显著的激发仅限于共焦区166范围内；即使PDT试剂存在于共焦区166之外，激活功率水平也不足以形成明显的光激活。本发明的优选实施方案在这方面与现有技术有明显差别，在现有技术中未能提供可行的途径来严格限定沿着光束的面积范围及其辐射通路的光激活区的范围。通过扫描整个患病组织164的体积内光束162的焦点的位置，遍布其中的PDT试剂便全部被光激活。扫描的实现可以通过改变焦点162相对于患病组织164的位置，或使患病组织164相对于固定的焦点162的位置发生移动。在用标准光学方法聚焦之前使用光束扩展器或其它设备，对NIR辐射158的光束进行预光扩散，可以使聚焦的NIR光束162的共焦区166质量得到提高。

这种同时双光子光激活的实施方案在治疗局部患病组织方面有不同的形式，如图15和图16所示。例如，图15中的聚焦NIR光，或图16中的未聚焦的NIR光的无损伤性使得局部位点的PDT试剂可发生光激活，同时对下层或周围组织没有危害。

如图15所示，当使用标准光学装置，如散射或折射光学仪器，将来自NIR光源的一束NIR辐射光束158聚焦162到患病组织164上时，就可使用于局部治疗的PDT试剂发生聚焦的NIR同时双光子光激活。这种情况下，PDT试剂的光激活仅发生在共焦区166。即使周围的健康组织168和皮肤170也含有PDT试剂，在此过程中它们也不会受到影响，因为光激活基本上被限制在共焦区166。如前文所述，可以通过扫描来达到整个患病组织164全部体积内的PDT试剂的光激活。

如图16所示，当将NIR源156发出的非聚焦或发散光束172投射到患病组织164上时，就可使用于局部治疗的PDT试剂发生未聚焦的NIR同时双光子光激活。光束172的截面积可以小于、等于或大于患病组织164的面积。如果通过施药控制或应用优先的系统性富集的方法使PDT试剂基本上限定在患病组织164的该体积内，那么治疗就基本上限定在患病组织164的该体积中。由于光束172对不含高浓度PDT试剂的组织无害，故避免了对周围健康组织168和皮肤170的损伤。在对患病组织164的确切位置，大小和形状不清楚，或由于精细控制光束172的定位对于治疗方法的成功实施不是很重要，从而没必要精确控制光线172的定位的情况下，这一实施方案尤其有用。使用非聚焦的光束时，利用极高峰值功率的激发源如Q-开关激光器或再生放大的锁模激光器可能会有利，因为其具有独特的高峰值辐射功率(在GW范围内)，能够在大面积内提供高的瞬时辐照。

同时双光子光激活的优选实施方案的最后一种有关的变更如图17所示，其中将NIR源156发出的非聚焦或发散光束172投射到皮下患病组织164上。光束172的截面积可能会小于、等于或大于患病组织164。如果通过施药控制或应用优先的系统性富集方法，使PDT试剂基本上限定在患病组织164的体积内，那么治疗就基本限定在该患病组织164的该体积内。由于光束172对不含高浓度PDT试剂的组织无害，故避免了对周围健康组织168和皮肤170的损伤。在对患病组织164的确切位置、大小和形状不清楚，或由于精细控制光束172的定位对于治疗方法的成功实施不很重要，从而没必要精确控制光束172的定位的情况下，这一实施方案尤其有用。象前面非聚焦的实施方案中一样，利用极高峰值功率激发源可能较为有利，因为其具有特别高的峰值辐射功率，可能对大面积有很高的瞬时辐照。

单光子和同时双光子激发在医疗应用中的比较：

补骨脂素类衍生物AMT(4′-氨甲基-4,5′,8-三甲基补骨脂素)是已知的DNA双螺旋嵌入剂，暴露于UV照射后，嵌入形式会逐步出现加成物形成和交联现象。嵌入的补骨脂素类的加成物形成和交联主要是暴露在320-400nm光中时由单光子诱导造成的。这些反应导致嵌入的AMT在加成物形成和交联时在发光性质上发生光谱移动。因此可通过测量这些发光性质的光谱移动来检测加成物形成和交联现象。图18表示在连续的365nm UV照射中暴露不同的累加时间，插入的AMT的荧光带位置发生的典型逐步移动。具体地说，随着暴露于UV而形成加成物，AMT荧光带的位置会从450nm移到390nm。如果波长364nm UV光的亚微微秒脉冲(由频率两倍于锁模钛：蓝宝石激光器的728nm NIR输出而生成)被用来照射类似被嵌入的AMT样品，可得到等效的结果，如图19所示。用于图18和图19所示数据的平均光子流被调整到相似水平，因此说明AMT分子基本上对激发脉冲宽度不敏感，而与累加光子剂量有关。图20所示的对照实验确证了插入的AMT暴露于后并未出现明显的加成物形成。用728nm NIR光的亚皮秒脉冲(由锁模钛：蓝宝石激光生成)照射类似被嵌入的AMT样品，得到与暴露于UV光时等效的结果，如图21所示。因此利用直接单光子激发或同时双光子激发模型化合物AMT，能等效激发PDT作用。

技术文献中的报道表明需要相对较长的激发脉冲来最有效地刺激一些PDT试剂的完全激活。尤其是在依次多步激活过程中，例如加成物形成后再交联，以合适的间隔为后继步骤提供光能很重要。例如，Hearst及其同事(J.E.Hearst,T.T.Isaacs,d.Kane,H.Rapoport,和K.Straub,“补骨脂素类和脱氧核糖核酸的反应”，Quarterly Review of Biophysics,17(1984)1-44)用多脉冲激光激发方法和嵌入的补骨脂衍生物来表明最有效的交联发生在加成物形成的最初刺激后延迟大约1μs的时间后时提供光能时。这已被归因为动力学延迟，其与加成物形成步骤和交联步骤之间必要的缓慢的构象变化有关。锁模激光器如锁模钛：蓝宝石激光器的输出的准连续性质与上述要求很吻合，因为这种激光器通常以10-20ns的间隔发射连续的脉冲串；被激发的分子有许多机会从这列脉冲串中吸收后继光激活步骤所必需的能量。然而再生放大锁模激光器如再生放大锁模钛-蓝宝石激光器更有效地符合上述要求。这些激光器以1-10μs为间隔发射短而极强的光脉冲；通常，这一间隔在脉冲间延迟的较大范围内可调。因此所能达到的极高的峰值功率(与标准锁模激光器相比)以及微秒级的脉冲频率一起使这种光源成为激发依次的多步骤同时双光子光激活过程的理想工具。通过AmesⅡ试验来确认PDT试剂的同时双光子激发：

补骨脂素衍生的PDT试剂AMT(4′-氨甲基-4,5′,8-三甲基补骨脂素)通过DNA的光激活的加成物形成和交联可以产生治疗效果。这些反应综合起来可以使受处理细胞如肿瘤细胞的增殖和生理过程减缓或停止。通常在UV波长(也就是365nm)利用单光子激发可使AMT光激活；由于AMT与DNA形成加成物和交联使DNA发生突变。这样，为了进一步评价同时双光子光激活作为PDT试剂光激活的改进方法的性质，可以应用AmesⅡ致突变力分析法。具体而言，就是利用AMAX GTA-225基因毒性分析(源自Xenometrix,Boulder,CO)来检测730nm双光子激活引起的AMT的致突变力。

AMAX GTA-225试验通过检测鼠伤寒沙门氏杆菌组氨酸(His)操纵子中的突变来分析一种试剂或过程的致突变力。试验菌株是组氨酸营养缺陷型(His-)，这是由于His操纵子中存在特定点突变，会使细菌不能合成组氨酸；如果不向它们提供组氨酸，这种His-有机体就不能生长。这样，当处于不合组氨酸的环境时，那些His-营养缺陷型只有经历了回复突变(变成His⁺)方可存活。在非细胞毒条件下，应用诱变剂可以提高试验菌株回复体的数量，使其高于自发回复体基线。AMAX GTA-225分析中使用的试验菌株有碱基对替代突变(TA7001-TA7006株)，也有移框突变(品系TA98株)。试验在两类试验菌株中独立实施，条件有五种：(1)负对照(无菌水)；(2)正对照；(3)光照射加上无菌水；(4)只有AMT；和(5)AMT加上光照射。用于碱基对替换和移框突变的正对照分别是N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG,Sigma，检测中用0.25μM)和2-硝基芴(2-NF,Aldrich，检测中0.5μM)。每种条件的试验重复三次，15种试验中的每一个分布到48孔板上进行原养型生长，随后计数分析。

分别测定两类试验菌株的适宜AMT浓度。将AMT滴入特定的试验菌株类型中，然后在37℃于掺入了组氨酸的培养基中培养90分钟，轻微振荡。在无细胞毒性的AMT浓度下，营养缺陷型生长发生在培养过程中。基于培养后测量600nm的光密度，将检测中所用AMT浓度选定为最大的非细胞毒性剂量。检测中用于碱基对替换和移框突变的AMT浓度分别为720μM和390μM。为了使必需的照射体积降到最小，只把试验化学物质(水，AMT或正对照)和试验菌株混合达到64μL的总样品体积。将要接受后继照射的样品转移到石英比色皿，利用来自锁模钛-蓝宝石激光器的730nm NIR激光束照射这些样品30分钟，该激光束沿着比色皿的纵轴被聚焦。在不照射时，每个64μl的样品在环境条件下，加盖保存在防UV的小瓶中。

在起始光照后(对正或负对照，AMT，光，或AMT和光)，每个64μl样品中加入440μl掺入了组氨酸的培养基，然后在37℃培养90分钟，并轻微振荡。此培养基中稀释的组氨酸浓度允许营养缺陷型细胞有限增殖，并因此通过His⁺回复突变表达致突变力。培养后，大约5x不含组氨酸的指示培养基加入每一样品，接着每一样品分成50μl的等分试样加入48孔板中。这些微样品在37℃培养大约40小时，不用振荡。由于第二种培养基不含组氨酸，在这一步培养只支持His⁺菌的原养型生长，它是在起始培养期间发生的回复突变菌发展起来的。因此原养型生长可以指示致突变力。指示培养基中含有pH指示剂，可用来估计原养型生长的程度。给定试验条件的相对突变的检测是通过对每个条件下的阳性微孔的计数来实现的。碱基对替换和移框突变的结果如表Ⅰ、Ⅱ所示。表Ⅰ．培养35小时的鼠伤寒沙门氏菌中碱基对替换突变的AmesⅡ试验结果。AMT浓度，720μM；负对照，无菌蒸馏水；正对照，MNNG(N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍，检测中0.25μM)。

	试验结果
	试验结果				试验条件	试验1	试验2	试验3	均值±σ_n
负对照	6	8	7	7.0±0.6	试验条件	试验1	试验2	试验3	均值±σ_n
负对照	6	8	7	7.0±0.6	双光子激发	13	9	17	13.0±2.3
AMT处理，无光照	7	6	5	6.0±0.6	双光子激发	13	9	17	13.0±2.3
AMT处理，无光照	7	6	5	6.0±0.6	AMT处理+双光子激发	0	0	0	0.0±0.0
正对照	9	7	10	8.7±0.9	AMT处理+双光子激发	0	0	0	0.0±0.0

表Ⅱ．培养40小时的鼠伤寒沙门氏杆菌中移框突变的AmesⅡ试验结果。AMT浓度，390μM；负对照，无菌蒸馏水；正对照，2-NF(2-硝基芴，检测中0.5μM)。

	试验结果
	试验结果				试验条件	试验1	试验2	试验3	均值±σ_n
负对照	3	5	2	3.3±0.9	试验条件	试验1	试验2	试验3	均值±σ_n
负对照	3	5	2	3.3±0.9	双光子激发	3	4	3	3.3±0.3
AMT处理，无光照	9	2	4	5.0±2.1	双光子激发	3	4	3	3.3±0.3
AMT处理，无光照	9	2	4	5.0±2.1	AMT处理+双光子激发	0	0	2	0.7±0.7
正对照	42	45	44	43.7±0.9	AMT处理+双光子激发	0	0	2	0.7±0.7

表Ⅰ、Ⅱ的结果表明只进行AMT处理和不存在光激活试剂(如AMT)的双光子激发对试验菌无明显效果。相比之下，AMT处理的同时进行双光子激发产生很低的原养型生长计数，似乎表明碱基对突变和移框突变试验中产生很少的突变或不产生突变。然而当这些样品随后在富含组氨酸的培养基中培养时并未表现出生长。因此，这些试验表明AMT处理，并施加同时双光子激发不仅使试验菌发生突变，而且实际上完全将其杀死。这表明了利用同时双光子激发的PDT治疗的效能，因为这种激发不仅产生了治疗效果所必需的试剂激活，而且也能够杀死接受处理的细胞。此外，只进行双光子激发所观察到的低致突变力表明在没有光激活物质的情况下，这种光激活方法对细胞没有损伤。

标准PDT试剂和新PDT试剂的同时双光子激活方法的应用：

标准PDT试剂具有组织特异性，这主要基于试剂和组织(如癌症患处)两方面结合的化学和物理特性。例如，

·补骨脂素及其衍生物(包括5-甲氧基补骨脂素[或5-MOP]；8-甲氧基补骨脂素[8-MOP]；4,5′,8-三甲基补骨脂素[TMP]；4′-氨甲基-4,5′,8-三甲基补骨脂素[AMT]；4′-羟甲基-4,5′,8-三甲基补骨脂素[HMT]；5-氯甲基-8-甲氧基补骨脂素，当归根素[异补骨脂素]；5-甲基当归根素[5-MIP]；和3-乙氧甲酰基补骨脂素)；

·各种卟啉和血卟啉衍生物(包括血卟啉衍生物[HPD]；PhotofrinⅡ；苯并卟啉衍生物[BPD]；原卟啉Ⅸ[PpⅨ]；染料血卟啉醚[DHE]；多血卟啉酯类[PHE]；原卟啉的13,17-N,N,N-二甲基乙基乙醇胺酯[PH1008]；四(3-羟基苯基)卟啉[3-THPP]；四苯基卟啉单磺酸盐[TPPS1]；四苯基卟啉二磺酸盐[TPPS2a]；二血卟啉醚；meso-四苯基卟啉；和meso-四[4N-甲基吡啶基)卟啉[T4MPyP])以及多种四氮杂卟啉类(包括八(4-叔丁基苯基)-四吡嗪基紫菜嗪[OPTP]；四(4-叔丁基)酞菁[t₄-PcH₂]；和四(4-叔丁基)酞菁镁[t₄-PcMg])；

·各种酞菁衍生物(包括氯化铝酞花青磺化的酞菁[CASPc]；氯化铝酞花青酞菁四硫酸盐[AlPcTS]；单-，双-，三-和四-磺酸化的铝酞菁[包括AlSPc,AlS2Pc,AlS3Pc和AlS4Pc]；硅酞菁[SiPcⅣ]；锌(Ⅱ)酞菁[ZnPc]；双(二异丁基十八烷基甲硅烷氧基)硅2,3-萘酞菁(isoBOSINC])；和锗(Ⅳ)八丁氧基酞菁。

·各种若丹明衍生物(包括若丹明101[Rh-101]；若丹明110[Rh-110]；若丹明123[Rh-123]；若丹明19[Rh-19]；若丹明560[Rh-560]；若丹明575[Rh-575]；若丹明590[Rh-590]；若丹明610[Rh-610]；若丹明640[Rh-640]；若丹明6G[Rh-6G]；若丹明700[Rh-700]；若丹明800[Rh-800]；若丹明B[Rh-B]；磺基若丹明640或101；和磺基若丹明B)；

·各种香豆素衍生物(包括香豆素1,2,4,6,6H,7,30,47,102,106,120,151,152,152A,153,311,307,314,334,337,343,440,450,456,460,461,466,478,480,481,485,490,500,503,504,510,515,519,521,522,523,535,540,540A,548)；

·各种苯并吩噁嗪衍生物(包括5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]-吩噁嗪鎓盐[TtNBA]；5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]-吩噻嗪鎓盐[EtNBS]；和5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]吩硒嗪鎓盐[EtNBSe])；

·氯丙嗪及其衍生物；

·各种叶绿素和细菌叶绿素衍生物(包括细菌二氢卟酚a[BCA])；

·各种金属-配基络合物，例如二氯化三(2,2′-二吡啶)钌(Ⅱ)(RuBPY)；

·脱镁叶绿甲酯一酸a[Pheo a]；部花青540[MC540]；维生素D；5-氨基-γ-酮戊酸[ALA]；photosan；二氢卟酚e6，二氢卟酚e6亚乙基二酰胺，和单-L-天冬氨酰基二氢卟酚e6；脱镁叶绿甲酯一酸-a[Ph-a]；吩噁嗪尼罗蓝衍生物(包括各种吩噁嗪染料)；

·各种电荷转移和辐射转移试剂，如芪，芪衍生物和4-(N-(2-羟乙基)-N-甲基)-氨基苯基)-4′-(6-羟基己基磺酰基)芪(APSS)；和

·许多其它光激活或光敏试剂，

这些试剂通常会聚集在施药点或其附近，或者半选择性地位于特定组织内，这是由于该组织的物理或化学性质的不同导致该PDT试剂掺入该组织中。而且，通常利用单光子或依次双光子激活的方法来激活这些PDT试剂，该方法会促进一个或多个光化学或光物理过程，包括键的生成或裂解，加成物形成，交联，自由基的产生，单一氧的产生，有毒物质的生成，和能量转移，但并不限于上述几种。传统激活方法在激活的范围或深度上所提供的选择性很小，应用通常局限在浅层的组织或患处。诱导PDT作用的机制可能是单一试剂的直接激活(如AMT光激活后刺激形成加成物形成)，或间接光激活(如光吸收剂如APSS的光激活，它可以随后将能量传递到邻近的生物活性剂，如photofrin)。然而，上文的第一个优选实施方案以及支持性论述和效能数据清晰地表明，本申请中所讲授的发明对于所有这些列出的及其它未特别列出的PDT试剂和光敏剂均适用。具体说，所有这些试剂都会对波长约为单光子激发中所用波长两倍的同时双光子激发产生响应，并且一旦被激发，它们所表现出的行为与单光子激发中表现的行为等效。具体而言，本申请中用于证明单光子激发和同时双光子激发的激发态行为在光物理和光化学性质上等效的不同例证中所出示的结果(如RuBPY的光化学，DNA中的AMT加成物形成，以及DNA和细胞活力的AmesⅡ检测效果)证明了同时双光子激发适用于所有PDT试剂的成功激活和试剂激活机理。而且，利用同时双光子激发在施药点的控制上和减少附带损伤方面的改进比传统的单光子或依次双光子激活具有特殊的优势。这包括穿透深度的提高，对施药点空间控制的提高，和PDT治疗副作用的减少。

正在开发许多新的对NR的直接单光子激活敏感的PDT试剂；这些试剂的意义在于减少伴随常规UV和可见光激活的副效应及其它限制。一个例子是PhotofrinⅡ及相关试剂，它们可用波长大于500nm的单光子激发光激活。本申请所教导的发明中这类PDT试剂一样有特定的优势。特别地，1.0到2.0μm光谱带内波长的同时双光子激活的使用能提供比单光子激活相对较深的穿透深度，因该谱带内波长的光较之0.5到1μm谱带大幅度降低了组织吸收和散射，而且，与单光子激活方法相比，此处提出的同时双光子激活的空间定位优势能在这类治疗应用上提供更好的调控。NIR激光器光源如锁模光参数振荡器和其它类似仪器可方便地用来提供适用于同时双光子激活NIR PDT试剂的光能。同时双光子激活的方法对高级生物源性PDT试剂的意义

在理想条件下，标准PDT试剂基于对患病组织的化学或物理亲和而获得目标专一性。通过这种方法，PDT试剂将分散于患病组织或者集中在患病组织的表面或内部。遗憾的是这种目标专一性常常不是很精确。事实上，有必要产生一种能够提高PDT试剂目标瞄准和激活专一性的改进方法。一种提高PDT试剂目标专一性的方法源于疾病的特殊生物学特征的应用。特别地，通过反义寡聚核苷酸试剂和一个或更多光敏部分如补骨脂素或其衍生物相耦合，就会生成能够选择性攻击病变细胞的新型生物源性PDT试剂。另外，通过改变用于生物源性探针的寡聚物密码，这种基础的方法可很容易扩展到大量基于遗传的疾病或紊乱。同时双光子激活的使用，使得这种强有力的方法依靠该生物源性探针的生物专一性与同时双光子光激活过程固有的高空间定位相结合而得到了应用。这样，基于遗传和光子特异性相结合的一种新的PDT疗法就可以非常专一地瞄准特定的器官，组织或病灶。

例如，一个生物源性探针可以被一个能够承受有效的同时双光子激活的光敏基团如异硫氰酸荧光素(或FITC)所“化学标记”。如图22所示，以一段和人p53肿瘤抑制基因互补(反义)的DNA序列作为模型。之所以选用这个基因是因为它在人类和小鼠的胸部肿瘤的发展中起着很重要的作用。大部分人类胸部肿瘤的发展都是由于这个关键的生长抑制基因的缺失或者突变。既然p53的变化是在肿瘤发展之前发生的，可利用一种基于改变这个基因的治疗方法在肿瘤发展之前破坏癌前细胞。分化和生长促进基因(原癌基因)的改变对于肿瘤毒性的发生和发展也起着很关键的作用。通过反义DNA治疗以抑制生长促进活性被认为是一种潜在的治疗癌症的方法。然而，对于正常的细胞，这些基因的不受控制的反义抑制是高毒性的。利用精确瞄准的双光子光激活对反原癌基因(anti-oncogene)探针的激活位点的二级调控使这种方法用于活体治疗癌症成为可能。图22显示生物源性PDT试剂的细胞内光激活可通过杂交174或去阻遏176实现。特别地，对于杂交174后的生物源性PDT试剂激活，将经耦联剂180耦联至光敏试剂182的反义基因探针178与DNA或RNA188中所含的目标基因序列186杂交184。杂交前探针的传递通过引导该生物源性PDT探针进入细胞的转染方法或其它方式实现。在被光激活前，用于杂交的探针190不会影响细胞的行为，基因转录或其它细胞过程。利用光能192辐照杂交探针190来激活。利用光能192照射而光激活杂交探针190能导致细胞遗传物质的一系列修饰194，包括交联，切割和碱基取代，这将影响细胞的功能，再生或生活力。或者，利用光能192照射对杂交探针190的光激活能通过启动毒性反应或产生毒性物质198(如自由基化合物和单态氧)而导致细胞坏死196。一个基因探针200因通过耦联剂204耦联于该反义基因探针200上的光敏试剂202的存在而被阻遏，在该反义基因探针200被利用光能206光激活该光敏试剂202而去阻遏176时，即通过去阻遏176实现PDT试剂的激活。注意去阻遏176前，被阻遏的反义基因探针200不能与其目标基因序列186杂交或相互作用。这可能是因为光敏试剂202的存在而产生的位阻，极性及三级或四级构象的变化或其它效应。因去阻遏，反义基因探针200可自由地与目标基因序列186杂交208或相互作用，导致细胞功能、再生或生活力的变化。

在图22所显示的实例中用了原核或真核细胞的遗传物质作为例子。但是，必须说明的是这里所讲授的发明并不仅限于细胞遗传物质，它还可以应用于组成或源于病毒或其它来源的遗传物质。同样必须说明的是，基于免疫学或其它生物特定方法而不是遗传学方法的瞄准方法可以被替换而不会失去本发明的效力。值得一提的是，基于抗原-抗体法的试剂的特异性为疾病和感染的治疗提供了一种极为有效的新方法，这里的抗体探针结合了一个光敏基团。获得试剂瞄准生物特异性的其它方法还包括但限于利用配基、半抗原、糖类、脂类，或者蛋白质受体或络合试剂，螯合剂，和被囊载体，例如脂质体，富勒烯(fullerenes)，冠醚和环糊精。不管探针试剂靶向的机制如何，同时双光子激活探针试剂的使用使得对应用位点的进一步调控成为可能，它基于对非线性光激活位点进行控制的内在精确性。这种通过空间特异的光激活而进行的二级水平调控对于许多基于生物源性的治疗是极其重要的，因为这类治疗在正常细胞中有潜在毒性。因而，同时双光子激活的应用在这类治疗的成功使用中很关键。

本发明的第二个示范性实施方案：

这是本发明中用生物源性PDT试剂以改进PDT用药的目标专一性和效力的一个特别优选实施方案，尤其是当这类试剂与双光子光激活的独特性质结合使用时。这一优选实施方案示于图23。生物源性PDT试剂210局部用于212或系统用于212病灶214，如瘤生长区或微生物感染区；该病灶214也可位于其它健康组织216之上或之内。该生物源性PDT试剂210基于病灶性生物目标序列218达到对病灶214的特异性，该目标序列基本上是病灶214的特异序列，且与试剂性生物目标序列220互补。所述试剂性生物目标序列220带有光敏基团222。该试剂性生物目标序列220与病灶性生物目标序列218的结合224产生一基本局限于病灶214位点的目标试剂226。通过与光辐射228相互作用，目标试剂226的光敏基团222随后转变为已被激活的光敏基团230；这种转变源于入射光辐射228对光敏基团222内光化学或光物理转变过程的激发。光敏基团222转变为被激活的光敏基团230导致局部细胞坏死或其它期望的治疗过程232。光敏基团222的这种转变可通过双光子激活过程的应用而空间定位，此激发过程源于高辐射度光源如锁模钛：蓝宝石激光器产生的聚焦或未聚焦光束对光敏基团222的照射。通过这种方式，治疗过程232作用的位点可通过试剂性生物目标序列220的特异性与对入射光辐射228作用位点的控制的特异性相结合来调控。

象癌症和继承性遗传缺陷这样的疾病可用基于生物源性PDT的疗法选择性地治疗，尤其是这个方法本身能够非侵犯性地修饰遗传物质。一个有目标的、非侵犯性的专门用于破坏或修饰异常生长基因的方法可大大提高癌症治疗的有效性，而且治疗仅局限于癌症细胞。事实上，在特定组织中由于继承或自发的遗传事件引起的任何遗传因子的异常表达都可以用这种方法治疗。这种方法还可用于治疗传染性疾病，尤其是但不限于由逆转录病毒感染因子引起的那些疾病(包括AIDS)，以及微生物感染(例如局部的或系统性细菌感染)。

可选择或设计特殊的发色光敏基团，这种基团可通过同时双光子激活而为所选择的转换如键的断裂或自由基的形成提供更好的截面和更高的效率。这样的分子可作为高级PDT试剂单独使用，或者掺入到生物源性PDT试剂中。例如，通过使用可选择性结合目标序列从而被光辐射激活的这种试剂，可破坏、修饰特殊基因序列，或者改变它们的体内表达水平。

必须清楚的是，尽管前面的公开内容集中于使用锁模钛：蓝宝石激光器产生的脉冲NIR光辐射以及同时双光子激活PDT试剂进行治疗性应用的实例，但本发明并不仅限于这样的双光子激发或者这种狭义上的光源。事实上，本发明的各个方面在利用线性或其它非线性方法光进行激发时都是适用的。例如，这里所描述的生物源性PDT试剂对线性光激发过程也是有反应的。同样，各种其它光源也是适用的，它们可单独或联合使用，例如连续波和脉冲灯，二极管光源，半导体激光器；其它类型的气体、染料和固态的连续的、脉冲的或锁模激光器，包括：氩离子激光器；氪离子激光器；氦氖激光器；氦镉激光器；红宝石激光器；Nd:YAG,Nd:YLF,Nd:YAP,Nd:YVO4,Nd:Glass,和Nd:CrGsGG激光器；再生放大激光器；Cr:LiSF激光器；Er:YAG激光器；F中心激光器；Ho:YAF和Ho:YLF激光器；铜蒸气激光器；氮激光器；光参量振荡器，放大器和发生器；和太阳光。

另外，尽管前文公开内容集中于疾病的活体治疗的应用，但必须说明的是，在期望选择性修饰标记试剂或有反应性目标试剂的任何时候，本发明都有进一步应用。尤其是在对生物物质制备或纯化或者生物物质污染的控制中，本发明的应用都包含在本发明范围之内。例如，基于光敏试剂和目标实体如HIV病毒之间的靶向相互作用，选择性地处理或纯化生物流体，如血液或原生质，都是在预料之中的。这种方法能在HIV感染的治疗中起治疗作用，也可作为保护手段来防止HIV通过输血感染。第二个例子是可以应用于极纯的生物制品如细胞培养物的制备中，其中通过目标污染试剂的破坏来提纯异源亲本培养物。第三个例子是有可能用于选择性激发目标生物试剂中一种或多种特定基因序列的遗传诱导生物产品的生产中。

除了各种生物学上的应用，还需要说明的是许多非生物学的应用也是可能的，或者通过利用本发明可使其效率得到显著提高，包括高纯度的产品或者商品的生产，尤其是在非线性光激发的特殊性质很重要的地方。例如，特征手性化合物，颜料，油漆，聚合物材料和其它工业或商业试剂的生产或加工都可以通过本发明各方面的应用而得到改进。特别是，独特的选择定则、选择优势和定位激活给许多物质生产或加工步骤提供了便利。事实上，这些例子说明本发明的确构成了一个通用的物质加工范例，其中非线性光激发的特殊性质被用到生物或非生物材料上以特别改进由原材料到产品的选择性转变，而不管这种转变是从肿瘤到坏死组织还是从一种分子试剂到另一种。

还要说明的是，在一些特殊情况下，非线性光激发的独特性质会有用处，即使没有添加特定响应试剂至系统中。例如，可见或NIR波长的非线性光辐射的定位应用也许对定位过程的激活有用，它在很多方面都和通常用UV波长直接处理达到的效果不相上下。又例如，对于表面或表面下癌症患处的治疗，也可利用可见的或NIR非线性激发来引起局部的坏死，这和线性UV激发可能达到的效果一样，但能够更有效定位。这种方法还有望延展至其它的光波段，例如，10μm的光可用来对眼睛或皮肤的病灶进行高度定位的切除。

同样，上述例子主要集中于对人进行治疗，而对于微生物、植物和动物样品的直接应用也是很明显的。例如，预计上述方法对家畜、育种牲畜的疾病的治疗或对其它动物的疾病的治疗同样有效。另外，估计上述方法也能作为处理方法或方式来获得微生物或细胞培养物的选择性。例如，本发明各部分可以应用于异源细胞培养物的纯化和体外细胞功能的表达中。因此，本发明可应用于遗传工程、畜牧业、再生疗法、克隆和许多其它领域。

应理解以上描述的每一个要素，或者两个或更多个要素一起，在不同于上述类型的其它工作或应用中同样可能有用。

虽然本发明作为一种用于改进治疗试剂光激活的选择性的通用方法已被图解和描述过了，但这并不意味着本发明仅限于已叙述的那些细节，这是因为本领域技术人员能够对本发明中图示的方法在形式和细节上及其运作上进行各种删节、修改、替换和改变，而同时并不以任何方式背离本发明的精神。

没有进一步的分析，前述也能够充分揭示本发明的主旨，使他人可通过利用现有知识，轻而易举地将它用于各种应用中，而不用忽略从现有技术的角度看还能构成本发明普通或特定方面的基本特性的那些性质。

后附的权利要求书中，给出了据称是新的并期望得到专利保护的各项权利要求。

Claims

1．一种处理植物或动物组织的特定体积的方法，该方法包含以下步骤：

(a)用至少一种光敏分子试剂处理所述植物或动物组织，其中该植物或动物组织的该特定体积中保留了所述至少一种光敏分子试剂的至少一部分；和

(b)用光来处理该植物或动物组织的该特定体积，所用光应足以激发促进该植物或动物组织的该特定体积中所保留的该至少一种光敏分子试剂中的至少一种分子发生同时双光子激发，其中该至少一种被激发的光敏分子试剂在该植物或动物组织的该特定体积中变得有活性。

2．按照权利要求1的方法，其中所述足以促进该至少一种光敏分子试剂发生同时双光子激发的光是一种激光。

3．按照权利要求2的方法，其中所述激光是一种脉冲激光。

4．按照权利要求1的方法，其中所述足以促进该至少一种光敏分子试剂发生同时双光子激发的光是聚焦光束。

5．按照权利要求4的方法，其中所述聚焦光束是聚焦激光。

6．按照权利要求5的方法，其中所述聚焦激光是脉冲激光。

7．按照权利要求1的方法，其中所述至少一种光敏分子试剂选自以下成员：补骨脂素，5-甲氧基补骨脂素(5-MOP),8-甲氧基补骨脂素(8-MOP),4,5′,8-三甲基补骨脂素(TMP),4′-氨甲基-4,5′,8-三甲基补骨脂素(AMT),5-氯甲基-8-甲氧基补骨脂素(HMT)，当归根素(异补骨脂素)，5-甲基当归根素(5-MIP),3-羧基补骨脂素，卟啉，血卟啉衍生物(HPD)，photofrinⅡ，苯并卟啉衍生物(BPD)，原卟啉Ⅸ(PpⅨ)，染料血卟啉醚(DHE)，多血卟啉酯类(PHE)，原卟啉的13,17-N,N,N-二甲基乙基乙醇胺酯(PH1008)，四(3-羟基苯基)卟啉(3-THPP)，四苯基卟啉单磺酸盐(TPPS1)，四苯基卟啉二磺酸盐(TPPS2a)，二血卟啉醚，meso-四苯基卟啉，meso-四(4N-甲基吡啶基)卟啉(T4MpyP)，以及八(4-叔丁基苯基)四吡嗪紫菜嗪(OPTP)，酞菁，四(4-叔丁基)酞菁(t₄PcH₂)，四(4-叔丁基)酞菁镁(t₄PcMg)，氯化铝酞花青磺化的酞菁(CASPc)，氯化铝酞花青酞菁四硫酸盐(AlPcTs)，单磺化的铝酞菁(AlSPc)，二磺化的铝酞菁(AlS2Pc)，三磺化的铝酞菁(AlS3Pc)，四磺化的铝酞菁(AlS4Pc)，硅酞菁(SiPcⅣ)，锌Ⅱ酞菁(ZnPc)，双(二异丁基十八烷基甲硅烷氧基)硅2,3-萘酞菁(isoBOSINC)，以及锗Ⅳ八丁氧基酞菁(GePc)，若丹明101(Rh-101)，若丹明110(Rh-110)，若丹明123(RH-123)，若丹明19(Rh-19)，若丹明560(Rh-560)，若丹明575(Rh-575)，若丹明590(Rh-590)，若丹明610(Rh-610)，若丹明640(Rh-640)，若丹明6G(Rh-6G)，若丹明700(Rh-700)，若丹明800(Rh-800)，若丹明B(Rh-B)，磺基若丹明101,磺基若丹明640，磺基若丹明B，香豆素1，香豆素2，香豆素4，香豆素6，香豆素6H，香豆素7，香豆素30，香豆素47，香豆素102，香豆素106，香豆素120，香豆素151，香豆素152，香豆素152A，香豆素153，香豆素311，香豆素307，香豆素314，香豆素334，香豆素337，香豆素343，香豆素440，香豆素450，香豆素456，香豆素460，香豆素461，香豆素466，香豆素478，香豆素480，香豆素481，香豆素485，香豆素490，香豆素500，香豆素503，香豆素504，香豆素510，香豆素515，香豆素519，香豆素521，香豆素522，香豆素523，香豆素535，香豆素540，香豆素540A，香豆素548,5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]-吩噁嗪鎓盐(EtNBA),5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]吩噻嗪鎓盐(EtNBS),5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]吩硒嗪鎓盐，氯丙嗪，氯丙嗪衍生物，叶绿素衍生物，细菌叶绿素衍生物，金属-配基络合物，二氯化三(2,2′-双吡啶)钌(Ⅱ)(RuBPY)，二氯化三(2,2′-双吡啶)铑(Ⅱ)(RhBP)，二氯化三(2,2′-双吡啶)铂(Ⅱ)(PtBPY)，脱镁叶绿甲酯一酸a，部花青540，维生素D,5-氨基-γ-酮戊酸，photosan，二氢卟酚e6，二氢卟酚e6亚乙基二酰胺，单-L-天冬氨酰二氢卟酚e6，吩噁嗪尼罗蓝衍生物，芪，芪衍生物以及4-(N-(2-羟乙基)-N-甲基)-氨基苯基)-4′-(6-羟基己基磺酰基)芪(APSS)。

8．按照权利要求1的方法，其中所述至少一种光敏分子试剂包括至少一种生物源性光敏分子试剂，它对于植物或动物组织的特定体积中的特定组织是特异的。

9．按照权利要求8的方法，其中所述至少一种生物源性光敏分子试剂包括选自下列成员的一个片段：DNA,RNA，氨基酸，蛋白质，抗体，配基，半抗原，糖受体或络合剂，脂类受体或络合剂，蛋白质受体或络合剂，螯合剂和被囊载体。

10．按照权利要求9的方法，其中所述至少一种生物源性光敏分子试剂还包括在受到足以促进发生同时双光子激发的光照射下能被光激活的一个片段。

11．一种治疗植物或动物组织中癌症的方法，它包含以下步骤：

(a)用至少一种光敏分子试剂处理该植物或动物组织，其中该植物或动物组织中的癌变部分保留了该至少一种光敏分子试剂中的至少一部分；和

(b)用光处理该植物或动物组织，这种光应足以促进保留于该植物或动物组织中癌变部分内的该至少一种光敏分子试剂中的至少一种发生同时双光子激发，其中所述至少一种光敏分子试剂在该植物或动物组织的癌变部分变得有活性。

12．按照权利要求11的方法，其中所述足以促进至少一种光敏分子试剂发生同时双光子激发的光是一种激光。

13．按照权利要求12的方法，其中所述激光是脉冲激光。

14．按照权利要求11的方法，其中所述足以促进至少一种光敏分子试剂发生同时双光子激发的光是聚焦光束。

15．按照权利要求14的方法，其中所述聚焦光束是一种聚焦激光。

16．按照权利要求15的方法，其中所述聚焦激光是一种脉冲激光。

17．按照权利要求11的方法，其中所述至少一种光敏分子试剂选自下列成员：补骨脂素，5-甲氧基补骨脂素(5-MOP),8-甲氧基补骨脂素(8-MOP),4,5′,8-三甲基补骨脂素(TMP),4′-氨甲基-4,5′,8-三甲基补骨脂素(AMT),5-氯甲基-8-甲氧基补骨脂素(HMT)，当归根素(异补骨脂素)，5-甲基当归根素(5-MIP),3-羧基补骨脂素，卟啉，血卟啉衍生物(HPD)，photofrinⅡ，苯并卟啉衍生物(BPD)，原卟啉Ⅸ(PpⅨ)，染料血卟啉醚(DHE)，多血卟啉酯类(PHE)，原卟啉的13,17-N,N,N-二甲基乙基乙醇胺酯(PH1008)，四(3-羟基苯基)卟啉(3-THPP)，四苯基卟啉单磺酸盐(TPPS1)，四苯基卟啉二磺酸盐(TPPS2a)，二血卟啉醚，meso-四苯基卟啉，meso-四(4N-甲基吡啶基)卟啉(T4MpyP)，以及八(4-叔丁基苯基)四吡嗪紫菜嗪(OPTP)，酞菁，四(4-叔丁基)酞菁(t₄PcH₂)，四(4-叔丁基)酞菁镁(t₄PcMg)，氯化铝酞花青磺化的酞菁(CASPc)，氯化铝酞花青酞菁四硫酸盐(AlPcTs)，单磺化的铝酞菁(AlSPc)，二磺化的铝酞菁(AlS2Pc)，三磺化的铝酞菁(AlS3Pc)，四磺化的铝酞菁(AlS4Pc)，硅酞菁(SiPcⅣ)，锌Ⅱ酞菁(ZnPc)，双(二异丁基十八烷基甲硅烷氧基)硅2,3-萘酞菁(isoBOSINC)，以及锗Ⅳ八丁氧基酞菁(GePc)，若丹明101(Rh-101)，若丹明110(Rh-110)，若丹明123(RH-123)，若丹明19(Rh-19)，若丹明560(Rh-560)，若丹明575(Rh-575)，若丹明590(Rh-590)，若丹明610(Rh-610)，若丹明640(Rh-640)，若丹明6G(Rh-6G)，若丹明700(Rh-700)，若丹明800(Rh-800)，若丹明B(Rh-B)，磺基若丹明101，磺基若丹明640，磺基若丹明B，香豆素1，香豆素2，香豆素4，香豆素6，香豆素6H，香豆素7，香豆素30，香豆素47，香豆素102，香豆素106，香豆素120，香豆素151，香豆素152，香豆素152A，香豆素153，香豆素311，香豆素307，香豆素314，香豆素334，香豆素337，香豆素343，香豆素440，香豆素450，香豆素456，香豆素460，香豆素461，香豆素466，香豆素478，香豆素480，香豆素481，香豆素485，香豆素490，香豆素500，香豆素503，香豆素504，香豆素510，香豆素515，香豆素519，香豆素521，香豆素522，香豆素523，香豆素535，香豆素540，香豆素540A，香豆素548,5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]-吩噁嗪鎓盐(EtNBA),5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]吩噻嗪鎓盐(EtNBS),5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]吩硒嗪鎓盐，氯丙嗪，氯丙嗪衍生物，叶绿素衍生物，细菌叶绿素衍生物，金属-配基络合物，二氯化三(2,2′-双吡啶)钌(Ⅱ)(RuBPY)，二氯化三(2,2′-双吡啶)铑(Ⅱ)(RhBP)，二氯化三(2,2′-双吡啶)铂(Ⅱ)(PtBPY)，脱镁叶绿甲酯一酸a，部花青540，维生素D,5-氨基-γ-酮戊酸，photosan，二氢卟酚e6，二氢卟酚e6亚乙基二酰胺，单-L-天冬氨酰二氢卟酚e6，吩噁嗪尼罗蓝衍生物，芪，芪衍生物以及4-(N-(2-羟乙基)-N-甲基)-氨基苯基)-4′-(6-羟基己基磺酰基)芪(APSS)。

18．按照权利要求11的方法，其中所述至少一种光敏分子试剂包括对植物或动物组织的该特定体积内的特殊组织特异的至少一种生物源性光敏分子试剂。

19．按照权利要求18的方法，其中所述至少一种生物源性光敏分子试剂包含选自下列成员的一个片段：DNA,RNA，氨基酸，蛋白质，抗体，配基，半抗原，糖受体或络合剂，脂类受体或络合剂，蛋白质受体或络合剂，螯合剂和被囊载体。

20．按照权利要求19的方法，其中所述至少一种生物源性光敏分子试剂还包括在受到足以促进发生同时双光子激发的光照射时能被光激活的一个片段。

21．一种用于在材料的特定体积中产生至少一种被光激活的分子试剂的方法，这种方法包括用足以促进包含于该材料的该特定体积中的至少一种光敏分子试剂发生同时双光子激发的光处理该材料的该特定体积，其中所述至少一种光敏分子试剂在该材料的该特定体积中变成一种被光激活的分子试剂。

22．按照权利要求21的方法，其中所述材料选自由植物和动物组织组成之组。

23．按照权利要求21的方法，其中所述足以促进该光敏分子试剂发生同时双光子激发的光是激光。

24．按照权利要求23的方法，其中所述激光是脉冲激光。

25．按照权利要求21的方法，其中所述足以促进该光敏分子试剂发生同时双光子激发的光是聚焦光束。

26．按照权利要求25的方法，其中所述聚焦光束是激光。

27．按照权利要求26的方法，其中所述激光是脉冲激光。

28．按照权利要求21的方法，其中所述材料用至少一种分子试剂进行预处理，以便在用足以促进所述至少一种光敏分子试剂发生同时双光子激发的光处理该材料的该特定体积时，该材料会保留所述至少一种光敏分子试剂的一部分。

29．按照权利要求28的方法，其中所述至少一种光敏分子试剂选自以下成员：补骨脂素，5-甲氧基补骨脂素(5-MOP),8-甲氧基补骨脂素(8-MOP),4,5′,8-三甲基补骨脂素(TMP),4′-氨甲基-4,5′,8-三甲基补骨脂素(AMT),5-氯甲基-8-甲氧基补骨脂素(HMT)，当归根素(异补骨脂素)，5-甲基当归根素(5-MIP),3-羧基补骨脂素，卟啉，血卟啉衍生物(HPD)，photofrinⅡ，苯并卟啉衍生物(BPD)，原卟啉Ⅸ(PpⅨ)，染料血卟啉醚(DHE)，多血卟啉酯类(PHE)，原卟啉的13,17-N,N,N-二甲基乙基乙醇胺酯(PH1008)，四(3-羟基苯基)卟啉(3-THPP)，四苯基卟啉单磺酸盐(TPPS1)，四苯基卟啉二磺酸盐(TPPS2a)，二血卟啉醚，meso-四苯基卟啉，meso-四(4N-甲基吡啶基)卟啉(T4MpyP)，以及八(4-叔丁基苯基)四吡嗪紫菜嗪(OPTP)，酞菁，四(4-叔丁基)酞菁(t₄PcH₂)，四(4-叔丁基)酞菁镁(t₄PcMg)，氯化铝酞花青磺化的酞菁(CASPc)，氯化铝酞花青酞菁四硫酸盐(AlPcTs)，单磺化的铝酞菁(AlSPc)，二磺化的铝酞菁(AlS2Pc)，三磺化的铝酞菁(AlS3Pc)，四磺化的铝酞菁(AlS4Pc)，硅酞菁(SiPcⅣ)，锌Ⅱ酞菁(ZnPc)，双(二异丁基十八烷基甲硅烷氧基)硅2,3-萘酞菁(isoBOSINC)，以及锗Ⅳ八丁氧基酞菁(GePc)，若丹明101(Rh-101)，若丹明110(Rh-110)，若丹明123(RH-123)，若丹明19(Rh-19)，若丹明560(Rh-560)，若丹明575(Rh-575)，若丹明590(Rh-590)，若丹明610(Rh-610)，若丹明640(Rh-640)，若丹明6G(Rh-6G)，若丹明700(Rh-700)，若丹明800(Rh-800)，若丹明B(Rh-B)，磺基若丹明101，磺基若丹明640，磺基若丹明B，香豆素1，香豆素2，香豆素4，香豆素6，香豆素6H，香豆素7，香豆素30，香豆素47，香豆素102，香豆素106，香豆素120，香豆素151，香豆素152，香豆素152A，香豆素153，香豆素311，香豆素307，香豆素314，香豆素334，香豆素337，香豆素343，香豆素440，香豆素450，香豆素456，香豆素460，香豆素461，香豆素466，香豆素478，香豆素480，香豆素481，香豆素485，香豆素490，香豆素500，香豆素503，香豆素504，香豆素510，香豆素515，香豆素519，香豆素521，香豆素522，香豆素523，香豆素535，香豆素540，香豆素540A，香豆素548,5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]-吩噁嗪鎓盐(EtNBA),5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]吩噻嗪鎓盐(EtNBS),5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]吩硒嗪鎓盐，氯丙嗪，氯丙嗪衍生物，叶绿素衍生物，细菌叶绿素衍生物，金属-配基络合物，二氯化三(2,2′-双吡啶)钌(Ⅱ)(RuBPY)，二氯化三(2,2′-双吡啶)铑(Ⅱ)(RhBPY)，二氯化三(2,2′-双吡啶)铂(Ⅱ)(PtBPY)，脱镁叶绿甲酯一酸a,部花青540，维生素D,5-氨基-γ-酮戊酸，photosan，二氢卟酚e6，二氢卟酚e6亚乙基二酰胺，单-L-天冬氨酰二氢卟酚e6，吩噁嗪尼罗蓝衍生物，芪，芪衍生物以及4-(N-(2-羟乙基)-N-甲基)-氨基苯基)-4′-(6-羟基己基磺酰基)芪(APSS)。

30．按照权利要求28的方法，其中所述至少一种光敏分子试剂包括至少一种生物源性的对该材料的该特定体积中的一种特定物质特异的光敏分子试剂。

31．按照权利要求30的方法，其中所述至少一种生物源性光敏分子试剂包括选自下列成员的一个片段：DNA,RNA，氨基酸，蛋白质，抗体，配基，半抗原，糖受体或络合剂，脂类受体或络合剂，蛋白质受体或络合剂，螯合剂和被囊载体。

32．按照权利要求31的方法，其中所述至少一种生物源性光敏分子试剂还包括在受到足以促进发生同时双光子激发的光照射时能被光激活的一个片段。

33．一种用于在一种材料的一个特定体积中产生至少一种被光激活的分子试剂的方法，这种方法包括用足以促进包含于该材料的该特定体积中的至少一种光敏分子试剂发生光激发的光处理该材料的该特定体积，其中所述至少一种光敏分子试剂在该材料的该特定体积中变成一种被光激活的分子试剂。

34．按照权利要求33的方法，其中所述至少一种光敏分子试剂包括至少一种生物源性的对材料的该特定体积中的一种特定物质特异的光敏分子试剂。

35．按照权利要求34的方法，其中所述至少一种生物源性光敏分子试剂包含选自下列成员的一个片段：DNA,RNA，氨基酸，蛋白质，抗体，配体，半抗原，糖受体或络合剂，脂类受体或络合剂，蛋白质受体或络合剂，螯合剂和被囊载体。

36．按照权利要求35的方法，其中所述至少一种生物源性光敏分子试剂还包括在受到足以促进发生光激发的光照射时能被光激活的一个片段。

37．按照权利要求1的方法，其中所述处理该植物或动物组织的该特定体积的步骤包括将一束光聚焦在一定焦距范围内，以使光束的焦平面介于组织表面和一个基本上在组织表面之外的点之间的一个位置，由此所述处理植物或动物组织的特定体积的步骤也能够扩展至深入到组织的深部。

38．权利要求37的方法，它还包括在光束存在时改变组织内的焦距位置，以便沿着组织表面和基本上位于组织表面之外的位置之间的诸位置光激活该至少一种光敏分子试剂。

39．按照权利要求38的方法，其中所述第二个处理步骤包括控制激光器来产生脉冲重复频率大约在75兆赫兹以上，脉冲宽度是次纳秒的输出脉冲。

40．按照权利要求39的方法，其中所述激光器产生的脉冲能量大约是20纳焦耳。

41．按照利要求39的方法，它包括控制激光器来产生近红外光。

42．按照权利要求41的方法，其中所述光激活包括对该至少一种光敏分子试剂进行同时双光子激发。

43．处理包含至少一种光敏分子试剂的植物或动物组织的特定体积的设备，该设备包括：

准直光束源，所述光具有基本上能有效穿透组织的频率，能被用来促进包含在该组织中的该分子试剂发生同时双光子激发(two-photonexcitation,TPE)；和

用于将准直光聚焦于一定焦距范围内的聚焦仪，该聚焦范围是从该组织的表面到基本上远离其表面的深度，所述光源和聚焦仪相配合以促进该分子试剂发生双光子激发；

其中焦点或焦平面能根据该光源进行调整。

44．按照权利要求43的设备，其中所述光源产生脉冲重复频率大约在75兆赫兹以上、脉冲宽度是次纳秒的脉冲输出。

45．按照权利要求44的设备，其中所述光源产生近红外光。

46．按照权利要求45的设备，其中所述光源产生的脉冲能量在20纳焦耳左右。

47．按照权利要求45的设备，其中所述光源包含一种激光器。

48．一种医治特定体积的组织的方法，该方法包含以下步骤：

向组织中导入一种光敏分子试剂，所述试剂能被组织吸收和在组织中聚集，对于双光子激发(TPE)敏感，当它在被关注的特定组织中聚集之后，将光投射到组织中我们所感兴趣的特定区域，包括基本上位于组织表面之下的区域，选用光的频率和能量应使它能够穿透该组织，并且基本上仅在一个共焦区促进双光子激发；

在所述组织的一定深度范围内控制共焦区的位置；和

利用TPE，在该组织的所述深度范围内光激活该试剂，由此在共焦区域内产生被光激活的试剂。

49．按照权利要求48的方法，其中所述投射光的步骤包括利用一个在短脉冲宽度、高脉冲重复频率上运行的脉冲激光器产生近红外光，和将该激光聚焦于该组织内。

50．按照权利要求48的方法，其中所述控制位置的步骤包括改变共焦区相对于受检组织的位置，或者改变受检组织相对于一个固定的共聚区的位置。

51．实施光促医疗的设备，包括：

用于将受限光投射到欲治疗的深部组织的表面或内部的光源设备，选用的这种光在频率和能量上应能够穿透至组织表面下，并且能够基本上只在共焦区促进发生TPE；和

用于在待治疗组织的一定深度范围内改变光的共焦区位置的设备，以便在应用双光子激发(TPE)时组织内的分子试剂变得已被光激活。

52．按照权利要求51的设备：

其中所述光源设备包括产生准直光束的设备；和

其中所述光源设备包括将准直光束聚焦于一个位于组织表面下的某个点的共焦区上的聚焦设备。

53．按照权利要求52的设备，其中用于产生准直光束的设备包括在近红外光谱内运作的脉冲激光器。

54．一种治疗植物或动物组织的特定体积的方法，该方法包括以下步骤：

(a)用至少一种光敏分子试剂处理所述植物或动物组织，其中该植物或动物组织的该特定体积中保留了至少一种光敏分子试剂中的至少一部分；和

(b)用光处理该植物或动物组织的该特定体积以促进该植物或动物组织的该特定体积中所保留的至少一种光敏分子试剂中的至少一种发生同时双光子激发，其中所述至少一种光敏分子试剂被激发至一种不稳定的虚拟态，并且该至少一种被激发的光敏分子试剂在该植物或动物组织的该特定体积转变为光敏性的。

55．按照权利要求54的方法，其中所述不稳定的虚拟态低于一种可用更高频辐射达到的状态，这种辐射会破坏介于光源和该特定体积之间的组织。

56．一种治疗包含至少一种光敏分子试剂的植物或动物组织的特定体积的方法，该方法包括：用光处理该特定体积以促进所述至少一种分子试剂中的至少一种发生同时双光子激发，从而使至少一种被激发的分子试剂在该特定体积中的可控制的位置上变为已被光激活。

57．按照权利要求56的方法，其中所述至少一种被激发的分子试剂在所述特定体积中一个基本上位于组织表面之外的可控制的位置上变得已被光激活。

58．按照权利要求57的方法，它还包括在光束存在时改变组织内所述光的焦距位置，由此光激活位于所述组织表面和基本上在所述组织表面之外的位置之间的可控制位置处的至少一种分子试剂。

59．按照权利要求56的方法，其中所述处理步骤包括将激光投射到所述特定体积中。

60．按照权利要求59的方法，其中所述处理步骤包括将脉冲激光投射到所述特定体积中。

61．按照权利要求60的方法，其中所述激光被脉冲调制以产生次纳秒宽度的脉冲。

62．按照权利要求60的方法，其中所述激光产生频率为大约1千赫～10千兆赫的脉冲。

63．按照权利要求62的方法，其中所述激光产生频率在大约75兆赫以上的脉冲。

64．按照权利要求60的方法，其中所述脉冲激光的能量为10皮焦耳～50毫焦耳。

65．按照权利要求64的方法，其中所述激光脉冲的能量大约为20纳焦耳。

67．按照权利要求56的方法，它包括运行激光源来产生近红外光。

68．一种治疗患癌植物或动物组织的特定体积的方法，该组织包含至少一种光敏分子试剂，该方法包括：用光处理所述特定体积以促进所述至少一种分子试剂中的至少一种发生同时双光子激发，以便所述至少一种被激发的分子试剂在该特定体积中一个可控制位置上变得已被光激活。

69．按照权利要求68的方法，其中所述至少一种被激发的分子试剂在所述特定体积中基本上位于组织表面之外的一个可控制位置变得已被光激活。

70．按照权利要求68的方法，它还包括在所述光存在时改变该光在该组织内的焦距位置，以便沿着该组织表面和基本上位于该组织表面之外的一个位置之间的可控制位置上光激活所述至少一种分子试剂。

71．按照权利要求68的方法，其中所述处理步骤包括将激光投射到所述特定体积中。

72．按照权利要求71的方法，其中所述处理步骤包括将一脉冲激光投射到所述特定体积中。

73．按照权利要求72的方法，其中所述激光被脉冲调制以产生次纳秒宽度的脉冲。

74．按照权利要求72的方法，其中所述激光产生频率为大约1千赫～10千兆赫的脉冲。

75．按照权利要求74的方法，其中所述激光产生频率在大约75兆赫以上的脉冲。

76．按照权利要求72的方法，其中所述激光脉冲的能量为大约10皮焦耳～50毫焦耳。

77．按照权利要求76的方法，其中所述激光脉冲的能量大约为20纳焦耳。

78．按照权利要求68的方法，其中包括运行光源以产生近红外光。

79．一种用于医治包含至少一种光敏分子试剂的组织的一个特定体积的方法，该方法包括以下步骤：

将光投射到该组织中感兴趣的特定区域，包括基本上位于组织表面之下的区域，选用的该光线能够穿透该组织，并且能够基本上仅在一个共焦区内促进发生双光子激发(TPE)；

将该共焦区的位置控制在所述组织内的一定深度范围内；和

利用TPE，在该组织的所述深度范围内光激活所述至少一种分子试剂中的至少一种，由此基本上只在共焦区内产生至少一种被光激活的试剂。

80．按照权利要求79的方法，其中所述投射步骤包括将激光投射到所述特定体积中。

81．按照权利要求80的方法，其中所述投射步骤包括将脉冲激光投射到所述特定体积中。

82．按照权利要求81的方法，其中运行所述激光以产生次纳秒宽度的脉冲。

83．按照权利要求81的方法，其中所述激光产生频率为大约1千赫～10千兆赫的脉冲。

84．按照权利要求83的方法，其中所述激光产生频率在大约75兆赫以上的脉冲。

85．按照权利要求81的方法，其中所述激光脉冲的能量为大约10皮焦耳～50毫焦耳。

86．按照权利要求85的方法，其中所述激光脉冲的能量大约为20纳焦耳。

87．按照权利要求72的方法，它包括运行激光源以产生近红外光。

88．按照权利要求79的方法，其中所述方法在所述共焦区内引发同时双光子激发(TPE)。

89．按照权利要求79的方法，其中所述光激活步骤包括利用一个第一种光子的能量来激发该至少一种分子试剂中的至少一种至介于基态和激发电子态之间的不稳定的虚拟态，再利用一个第二种光子的能量在该试剂跃迁到一个基本不同的激发态之前将其激发至激发电子态。

90．一种处理植物或动物组织的特定体积的方法，该组织在该特定体积中包含至少一种光敏分子试剂，该方法包括：

用光照射组织的该特定体积以引发所述至少一种光敏分子试剂中的至少一种发生同时双光子激发(TPE)，

其中所述位于双光子激发一个位点的所述至少一种光敏分子试剂被激发至不稳定的虚拟态，并且其中所述至少一种被激发的光敏分子试剂在该特定体积中已被光激活。

91．按照权利要求90的方法，它包括对基本上位于组织表面之下的植物或动物组织的特定体积进行处理。

92．按照权利要求91的方法，其中所述不稳定的虚拟态基本上仅发生在所述特定体积中，尽管光通过介于所述表面和所述特定体积之间的其它组织部分。

93．按照权利要求92的方法，它还包括在该组织表面下的一定深度范围内改变发生双光子激发的位置。

94．按照权利要求90的方法，其中所述光照射步骤包括将激光束投射到该特定体积中。

95．按照权利要求94的方法，其中所述光照射步骤包括将具有次纳秒脉冲的脉冲激光束投射到该特定体积中。

96．按照权利要求95的方法，其中由所述脉冲激光束提供的单个光子所具备的能量不足以将该分子试剂直接从基态激发至激发电子态。