CN1300293A - 四肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新的和改进的制备四肽H－Tyr－D－Ala－Phe(F)－Phe－NH2(它是一种式(1)的肽)或其药学上可接受的盐的方法,以及其制备中的新的中间产物。这种新的方法适用于大规模生产。
Description
本发明领域
本发明涉及一种新的制备四肽、更准确地说是四肽H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2或其药学上可接受盐的方法。在其它方面，本发明也涉及用于该方法中的新的中间体。
背景和现有技术
本发明涉及一种新的用于制备肽H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2或其药学上可接受的盐的方法。
WO97/07129公开了一种尤其用于制备肽H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2的方法。该肽H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2也公开于WO97/07130中。所述肽显示出外周止痛活性和对阿片样物质受体μ亚型的选择性，并特别适用于疼痛的治疗。此外，该肽可以采用根据本领域中成熟方法的固相合成法制备。固相合成法(一种用于肽合成的常用及成熟的方法)的缺陷在于除了成本昂贵外，难用于大规模生产。
本发明方法以与本领域已知方法相比成本更低和对环境更有利的方式提供高纯度的四肽H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2。此外，本申请的方法提供更高收率的产品。
因此，本发明的目地是提供一种适合大规模合成使用的新方法。本方明的另一个目地是提供一个包括尽可能少的反应步骤的方法。
本发明概述
本发明提供一种大规模地制备肽H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2的新方法，它是一种如式(Ⅰ)所示的肽或其药学上可接受的盐：
根据本发明制备如上式(1)化合物的方法包括如下反应步骤：步骤1
(ⅰ)一个偶合步骤，其中通过预先活化步骤或就地产生预先制备的、活化的p-氟苯丙氨酸衍生物(Ⅲ)与苯丙氨酸的氨基(其中羧基作为酯或酰胺被保护，即式Phe-R1化合物，其中R1是酯或酰胺残基)在溶剂的存在下反应，得到被保护的二肽衍生物(Ⅳ)，式(Ⅲ)和(Ⅳ)的结构式如下：
其中A是氨基保护基团，和R是活化剂残基；其中A是氨基保护基团，和R1是酯或酰胺残基；
(ⅱ)一个脱保护步骤，其中在以上步骤中制备的被保护的二肽衍生物(Ⅳ)，根据所用的氨基保护基团，通过催化氢化作用、碱或酸处理来脱保护，得到二肽衍生物(5)：其中R1是酯或酰胺残基；步骤2
(ⅰ)一个偶合步骤，其中通过预活化步骤或就地产生预先制备的活化丙氨酸衍生物(Ⅶ)，与步骤1的产物即二肽衍生物(5)在溶剂的存在下反应，得到被保护的三肽衍生物(Ⅷ)，式(Ⅶ)和(Ⅷ)化合物的结构式如下：其中A是氨基保护基团，和R是活化剂的残基；
其中A是氨基保护基团，和R1是酯或酰胺残基；
(ⅱ)脱保护步骤，其中在前面步骤中制备的、被保护的三肽衍生物(Ⅷ)根据使用的氨基保护基，通过催化氢化作用或酸处理被脱保护，得到三肽衍生物(9)：其中R1是酯或酰胺残基；步骤3
(ⅰ)一个偶合步骤，其中通过预先活化步骤或就地产生预先制备的一种活化酪氨酸衍生物(Ⅹ)，在溶剂存在下，与三肽衍生物(9)(步骤2的产物)反应，提供保护的四肽衍生物(Ⅺ)。式(Ⅹ)和(Ⅺ)化合物的结构式如下；其中A是一种氨基保护基团，R是一种活化剂残基，和R2是H或类似苄基的基团；
其中A是一种氨基保护基，和R1是一种酯或酰胺残基；
(ⅱ)如果在前面步骤(ⅰ)中制备的被保护的四肽衍生物(Ⅺ)是一种酯，则进行任选的转化反应，其中酯化合物(Ⅺ)在有机醇中与氨反应，优选与甲醇中的氨反应，提供保护的二肽衍生物(Ⅻ)：
(ⅲ)一个脱保护步骤，其中被保护的四肽衍生物(Ⅻ)，根据所使用的氨基保护基团，通过催化氢化作用、碱或酸处理而脱保护，提供最终的四肽(Ⅰ)，其可任选转换为四肽(Ⅰ)的盐。
如果需要，可以使肽H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2(Ⅰ)与一种药学上可接受的酸如AcOH、磷酸、柠檬酸、乳酸和盐酸反应。根据本发明，盐酸是优选使用的酸。可以使用的盐在S.M.Berge,L.D.Bighley和D.C.Monkhouse,J.Pharmaceut.Sci,66(1977)1-19中描述。
因此，根据以上叙述的本发明方法可简述为包括下列步骤：步骤1
(ⅰ)一个偶合步骤，
(ⅱ)一个脱保护步骤。步骤2
(ⅱ)一个偶合步骤，
(ⅱ)一个脱保护步骤。步骤3
(ⅰ)一个偶合步骤，
(ⅱ)一个任选的转化步骤，
(ⅲ)一个脱保护步骤。
在以上步骤3(ⅱ)中描述的任选转化步骤可代之以在步骤1或步骤2中偶合步骤(ⅰ)之后进行。优选该转化步骤在步骤1中的偶合步骤(ⅰ)之后进行。因此，进行本发明方法的优选方式简述为包括以下步骤：步骤1
(ⅰ)一个偶合步骤，
(ⅱ)一个任选的转化步骤，
(ⅲ)一个脱保护步骤。步骤2
(ⅰ)一个偶合步骤，
(ⅱ)一个脱保护步骤。步骤3
(ⅰ)一个偶合步骤，
(ⅱ)一个脱保护步骤。
Nα-氨基保护基可以从适合肽合成的任何保护基中选择，例如，叔丁氧基羰基(Boc)或苄氧基羰基(经常缩写为Z-)，仅是提到的两种可能的氨基保护基。然而，苄氧基羰基特别优选用于本合成，因为它容易通过催化氧化作用去除，与保护基Boc相反，它不需要中和释放出的胺。本领域的技术人员可了解根据本发明可使用的合适的氨基和羧基保护基。参照J.Meienhofer in The Peptides，笫1卷，编辑：E.Gross& J.Meienhofer,Academic Press,Inc,London,1979,264-309页；Thepeptides,1-9卷，E.Gross&J.Meienhofer，编辑，Academic PressInc,London,1979-1987；Houben-Weyl,Methoden der organischenChemie,E.Muller，编辑，15卷，Ⅰ-Ⅱ部分，Thieme,Stuttgart 1974；和M.Bodanszky,Principles of peptide Synthesis,Springer Verlag,Berlin1984。
上述步骤1-3前的预活化步骤，或就地产生活化的活性氨基酸衍生物，可通过一种氨基酸在叔胺和有机溶剂的存在下，与一种活化剂反应完成，其中所述氨基酸的氨基官能团通过合适的保护基保护，例如叔丁氧基羰基(Boc)或苄氧基羰基(Z)(这些保护基可以购买到或通过本领域已知技术获得)，提供活化的氨基酸衍生物。预先活化步骤可简略表示如下：
其中A是一种氨基保护基，和R是一种活化剂残基；
对于上述1-3步骤中的偶合步骤而言，只要所述氨基成分为基本上可溶的并可与活化的肽衍生物直接反应，可使用各种强的溶剂。用于偶合步骤的合适的溶剂的实例为丙酮、乙腈、DMF、N-甲基吡咯烷酮(NMP)和EtOAc，或它们的混合物。
这里所用术语“类似苄基的基团”，表示任何取代或未取代的苄基，它们在类似的反应条件下，作为苄氧基羰基被氢解。
术语“pF”表示对位氟取代基。
在每个步骤中可能的以及优选的反应物和反应条件如下。预活化步骤：
合适的活化剂可选自那些产生常用的活化氨基酸衍生物的活化剂，包括(但不限于)碳二亚胺、活化酯、叠氮化物或酸酐。氯代甲酸异丁酯(iBuOCOCI)是优选的活化剂。当氯代甲酸异丁酯(iBuOCOCI)为活化剂时，活化的肽衍生物具有以下结构，以D-丙氨酸为例：
叔胺可选自任何叔胺。然而，优选NMM(N-甲基吗啉)、二异丙基乙胺和三乙胺。另外，也可使用位阻的仲胺。
有机溶剂可以是本领域中技术人员所知的在肽化学中合适的任何有机溶剂。然而，在预活化步骤中优选乙酸乙酯、乙腈、丙酮和四氢呋喃。偶合步骤：步骤1(ⅰ)、步骤2(ⅰ)和步骤3(ⅰ)：
用于偶合步骤的溶剂可以从许多溶剂中选择，只要氨基成分基本上可溶和可与活化氨基酸残基直接反应即可。用于偶合步骤合适的溶剂的实例为丙酮、乙腈、DMF,N-甲基吡咯烷酮(NMP)和EtOAc，或它们的混合物，其中优选丙酮、EtOAc、NMP和DMF。
当活化氨基酸衍生物不降解或反应速度不是太慢时，任何温度都可使用。优选的温度范围是0℃至-20℃，特别优选的温度是从-5℃至-15℃。调节加料的速度以便维持优选的温度。脱保护步骤：步骤1(ⅱ)、步骤2(ⅱ)和骤3(ⅲ)：
用于氢化的催化剂可以从许多本领域技术人员所知的催化剂中选择。然而，优选5％的披钯碳。可以使用任何至少可溶解一些肽的溶剂，除了酮(例如丙酮)或使催化剂中毒的或与反应成分起反应的溶剂之外。本领域技术人员了解溶剂的选择。DMF是优选的溶剂。
只有在步骤3(ⅰ)中制备的保护的四肽衍生物(Ⅺ)是一种酯的情况下，才需要任选步骤3(ⅱ)因此，如果使用苯丙氨酸的酰胺，步骤3(ⅱ)将从合成流程中省去。
如果使用酸来除去α-保护基，则需要等摩尔量的碱，以使肽衍生物的氨基脱质子化。
在本发明优选的实施方案中，将保护的氨基酸(优选用苄氧羰基作为Na-氨基保护基)用异丁氧基碳酰氯或类似类型的氯代甲酸酯以混合酐的形式活化。使用的方法基于J.Meienhofer在下列文献中所综述的通用方法：The Peptides，第一卷，编辑：E.Gross & J.Meienhofer,Academic Press,Inc,London 1979,264-309页。
我们已惊奇地发现，活化时间在0到-15℃的温度下可延长至少30分钟，而建议的活化时间在-15℃温度下为1-2分钟。我们也发现尽管其它情况下推荐，严格的无水条件是不必要的。这使本方法可用于大规模生产，其中较长的反应时间使得可以进行安全的和可重复的过程。立体化学的完整性全部保留，化学纯度和收率一般在90％以上。生成的混合酐在约0至-15℃温度范围内与缓慢加入的氨基成分(氨基酸/肽酰胺或酯)偶合，然后，在产物开始直接从该反应混合物中结晶前，使反应混合物在大约30-60分钟内或更长时间达到20-30℃。
我们还惊奇地反现当使用本方法时，如果使用适当选择的溶剂混合物，则不需要结晶前的单独的洗涤步骤。优选使用DMF、乙腈、EtOAc和水。控制结晶，不但可以达到高度纯化，而且还可以在后处理中缩短过滤或离心的时间，如果需要干燥的中间产物，还可缩短干燥的时间。一个重要的因素是产生足够量的、不阻塞过滤装置或离心布的相对窄的粒度分布。这尤其对于产生几乎不可能过滤的凝胶或无定形结晶的肽是很常见的。
三肽衍生物(9)是一个用于制备目标化合物(Ⅰ)的有用的中间产物：
其中R1是一种酯或酰胺残基。本发明的详细说明
现在通过下面的实施例更详细地介绍肽H-TyrD-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2或其药学上可接受的盐的制备，然而该实施例不认为是对本发明的限制。另外，以下方案1提供用一种其中羧基作为酯被保护的苯丙氨酸衍生物制备根据本发明的式(Ⅰ)肽的合成途径的详细综述。以下方案2提供用一种其中羧基作为酰胺被保护苯丙氨酸衍生物制备根据本发明的式(Ⅰ)肽的合成途径的详细综述。参照以下实施例详细的合成描述中的化合物编号，与方案1和2中化合物的编号一致。
方案1
方案1(续)
方案1(续)步骤1(ⅰ)Z-Phe(pF)-Phe-OMe(方案1中化合物3)的制备：3.5摩尔规模
先将Z-Phe(pF)(化合物1)(1当量)溶于丙酮(4.7L/摩尔)中，冷却，然后加入IBK(0.9-1.2当量)(实际1当量)。然后根据加入NMM(N-甲基吗啉)(0.9-1.2当量)(实际1当量)的速度(约20分钟)控制反应。推荐反应温度为0到-15℃之间(实际为-9℃到-14℃)，其中加入NMM后立即反应，然而防止混合酐迅速分解。
同时将H-Phe-Ome x HCI(0.9-1.3当量)(实际1.04当量)与丙酮(2.6L/摩尔)混合，用NMM(0.9-1.5当量)(实际1.04当量)中和，冷却至0到-20℃(实际大约-10℃)。在活化完成后，以保持温度在约-10℃(实际从-8℃到-13℃)的速度(大约30分钟)加入该悬浮液。然后加入EtOAc(4L/摩尔)，用水(2×2升/摩尔)洗涤有机相，然后从ACN中共沸蒸馏，于下一步骤前溶解于MeOH中。在甲醇悬浮液中纯度为92％。化学移位 峰裂数 积分(Integral)H8.5 d 17.49 d 17.31 m 77.24 m 57.08 m 24.93 m 24.5 m 14.26 m 13.58 s 32.99 m 32.67 m 1(ⅱ)Z-Phe(pF)-Phe-NH2(方案1中产物4)的制备：2.3到3.3摩尔规模
将氨加入在前面步骤中制备的化合物3溶液(大约8升MeOH/摩尔)中，压力在1到5巴之间，在15-40℃下持续5个小时以上或直到反应接近完成为止(实际转换率99％)。到反应完成时，蒸发氨，在过滤或离心前冷却反应物。产物用MeOH洗涤，在20-50℃下真空干燥。由化合物1(Z-Phe(pF)计算的收率为74％，纯度为100％。化学移位 峰裂数 积分H8.05 d 17.49 d 17.24 m 117.07 m 34.94 m 24.46 m 14.21 m 13.00 m 12.88 m 12.66 m 1H-Phe(pF)-Phe-NH2(方案1中产物5)的制备4.3摩尔规模
将在前面步骤中制备的化合物4与DMF(4.2升/摩尔)混合，加入Pd/C催化剂(Pd实际含量5％)(0.2-10％w/w/LEF-581)(实际7％)，将得到的混合物在25℃、3巴H2压力下氢化0.5小时以上(实际1.2小时)。然后过滤反应混合物，在下一步骤前冷却至大约-15℃。在溶液中的纯度为99.6％。步骤2(ⅰ)Z-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2(方案1中化合物8)的制备4.4摩尔规模
将Z-D-Ala(化合物6)(1当量)溶解在乙腈(ACN)(2.3L/摩尔)中，在加入IBK(0.9-1.2当量)(实用1当量)前冷却。然后以上述的制备化合物3同样的方式加入NMM(0.9-1.2当量)(实用1当量)。在大约30分钟内加入化合物5(24.5升)的溶液，维持温度在约-10℃(实际从-8℃到-14℃)。偶合完成后，通过慢慢加入水(3×3.6升/摩尔+1×1.3升/摩尔)，每次加水间隔时间为约25分钟，开始温度大约为30℃，结束温度大约为20℃，从反应混合物中结晶出产物。然后离心结晶，在20-50℃下真空干燥前用水/乙腈(4∶1)洗涤。收率为90％，纯度为99.5％。化学移位 峰裂数 积分H8.14 d 18.05 d 17.43 d 17.29 m 127.05 m 25.01 m 24.44 m 24.01 m 12.92 m 32.73 m 10.96 d 3H-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2(方案1中化合物9)的制备：
将在前面步骤中制备的化合物8与DMF(4.2升/摩尔)混合，加入Pd/C催化剂(Pd实际含量5％)(0.2-10％w/w/化合物3)(实际7％)，将得到的混合物在25℃和3巴H2压力下氢化0.5小时以上(实际1.2小时)。然后过滤反应混合物，在下一步骤前冷却至约-15℃。纯度为97％，原料转化率大于98％。步骤3(ⅰ)Z-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2(方案1中化合物12)的制备：4.1摩尔规模
使用与前面两次偶合同样的方法偶合。将Z-Tyr(化合物10)(1当量)溶解于ACN(2.3L/摩尔)中，在加入IBK(0.9-1.2当量)前冷却。然后，以上述化合物3时同样的方式加入NMM(0.9-1.2当量)。在大约30分钟内加入从前步骤中得到的化合物3的溶液，维持温度在约-10℃(实际从-7℃到-14℃)。偶合完成后，通过缓慢加入乙腈和水(2升/摩尔ACN+0.3升/摩尔25％氨的水溶液)，放置2小时，加入1.5升/摩尔CAN∶水(1∶1)，放置1小时，升温到35℃，加入晶种(大约1％w/w)，放置1小时，加入1.3L/摩尔CAN∶水(1∶1)，放置1小时，加入1.2升/摩尔水并在35℃下放置0.5小时，加入1.2升/摩尔水并在20℃下放置2小时，加1.2升/摩尔水并在20℃下放置1小时，加1.2L/摩尔水并在20℃下放置0.5小时，从反应混合物中结晶出产物。离心，先水洗然后用ACN洗，然后在20-50℃真空干燥。
由化合物8计算的收率为81％，纯度为98.4％。化学移位 峰裂数 积分H9.18 s 18.18 d 18.11 d 18.05 d 17.43 d 17.24 m 127.04 m 46.63 d 24.92 m 24.45 m 24.22 m 23.00 m 12.83 m 12.64 m 10.89 d 3(ⅱ)H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2(方案1中化合物1)的制备：3.1和3.2摩尔规模
将化合物4与DMF(实际操作2-2.6升/摩尔)混合，加入5％的Pd/C催化剂(实际含量)(0.2-10％w/w/化合物3)(实际6-7％)，将得到的混合物在20-40℃(实际操作20-25℃)、3巴H2压力下氢化0.5小时以上(实际操作1-2小时)。然后，过滤反应混合物以除去Pd/c，加入EtOAc(一般10升/摩尔)直至使所有物质结晶。经过过滤或离心作用分离固体，用EtOAc洗涤，在20-50℃下真空干燥。H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2盐酸盐的制备2.1摩尔规模
将游离碱化合物I溶解于加有1当量氯化氢的水和丙酮的混合液中并过滤(在实际操作中146克/摩尔25％氯化氢/水，2升丙酮/摩尔)。此盐在丙酮中的溶解度有限，因此，用额外量的丙酮/水(95∶5)的混合液(0.5升/摩尔)洗涤一次。在高速搅拌下，通过缓慢加入丙酮(3.4升/摩尔)，然后加入至少1％w/w晶种，诱发结晶。30分钟后，缓慢加入第一份MIBK(31/mde)，缓慢搅拌下放置直到配料明显变稠。分三次再加入MIBK(3升/摩尔)，每次间隔30-60分钟，同时维持反应器内部温度在约20℃。然后，经过离心或过滤分离该固体，用MIBK洗涤，然后在20-50℃下真空干燥16小时以上或直到溶剂含量低于规定的技术规范的要求。
方案2
方案2(续)
方案2(续)步骤1(ⅰ)Z-Phe(pF)-Phe-NH2(方案2中化合物13)的制备：6.7摩尔规模
首先将Z-Phe(pF)(1当量)溶解于乙腈(EtOAc)(1.7升/摩尔)中，在加入氯代甲酸异丁酯(0.9-1.2当量)(实际1.05当量)前冷却。然后，通过加入N-甲基吗啉(0.9-2.0当量)(实际1.4当量)的速度(大约20分钟，实际15分钟)控制反应。推荐反应温度为0到-15℃(实际从-8℃到-11℃)，其中，加入N-甲基吗啉后反应立即发生，然而防止混合酐迅速分解。
同时将H-Phe-NH2 x HCI(0.9-1.3当量)(实际1.04当量)溶解于DMF(4.0升/摩尔)中，用N-甲基吗啉(0.9-1.5当量)(实际1.04当量)中和并冷却至0到-20℃(实际大约-10℃)。在活化完成后，以维持温度在大约-10℃(实际从-6℃到-13℃)的速度(大约15分钟)实际8分钟加入该悬浆液。
偶合完成后，通过缓慢加入50％乙醇/水(3.6升/摩尔)，由反应混合物中结晶出产物。等待30分钟后，于约20℃下，分三部分加入总量为2.85升/摩尔的水，每次加入间隔大约25分钟。大约17小时后，过滤或离心结晶，用50％乙醇/水、随后用若干份的乙腈洗涤，然后在20-60℃下真空干燥。收率为90％，纯度为99.9％。H-Phe(pF)-Phe-NH2(方案2中化合物14)的制备：6.7摩尔规模
将在前面步骤中制备的Z-Phe(pF)-Phe-NH2与DMF(3.5升/摩尔)混合，加入Pd/C催化剂(Pd实际含量为5％)(0.2-10％w/w/LEF-582)，在25-30℃、大约3巴H2压力下氢化得到的混合物0.5小时以上(实际1.3小时)。然后过滤反应混合物，在下一步骤前冷却至约-15℃。在溶液中的纯度为99.6％，原料转化率大于99％。步骤2(ⅰ)Z-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2(方案2中化合物15)的制备：5.9摩尔规模
将Z-D-Ala-OH(化合物x)(实用1.03当量)溶于乙腈(1.9升/摩尔)中，冷却，然后加入氯代甲酸异丁酯(0.9-1.2当量)(使用1.07当量)。以上述的制备Z-Phe(pF)-Phe-NH2的类似方式加入N-甲基吗啉(0.9-2.0当量)(使用1.2当量)。然后在大约15分钟内(实际8分钟内)加入H-Phe(pF)-Phe-NH2(25升)溶液，维持温度在-10℃左右(实际从-8℃到-11℃)。偶合完成后，通过于约20℃温度下缓慢加入水(4×1.9升/摩尔)，每次加入间隔大约15-30分钟，使产物从混合物中结晶。然后，过滤或离心结晶，用水/乙腈(4∶1)、随后用乙腈洗涤，然后任选在20-60℃真空干燥。由Z-Phe(pF)-Phe-NH2计算的收率为93.8％，纯度为99.6％。H-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2(方案2中化合物16)的制备：5.5摩尔规模
将前面步骤制备的Z-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2与DMF(2.9升/摩尔)混合，加入Pd/C催化剂(Pd实际含量为5％)(0.2-10％w/w/化合物3)(实际5％)，在25-35℃及大约3巴H2压力下，将得到的混合物氢化0.5小时以上(实际3小时)。然后过滤反应混合物，在下一步骤前冷却至约-15℃。纯度为99.4％，原料转化率大于99％。步骤3(ⅰ)Z-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2(方案2中化合物17)的制备：5.5摩尔规模
使用与前两次偶合类似的方法偶合。将Z-Tyr(化合物x)(1.05当量)溶于MeCN(1.9升/摩尔)中，冷却，加入氯代甲酸异丁酯(0.9-1.2当量)(实际1.05当量)。以上述制备Z-Phe(pF)-Phe-NH2的类似的方式加入N-甲基吗啉(0.9-2.0当量)(实际1.3当量)。在大约20分钟(实际6分钟)内加入从前一步骤得到的H-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2溶液，维持温度在-10℃左右(实际从-8℃到-9℃)。偶合步骤完成后，通过缓慢加入乙腈和水(3.4升/摩尔MeCN+0.9升/摩尔15％氨水)，放置5分钟，加入晶种，放置4-24小时，然后分四份加入总量为13.9升/摩尔的水，在每次加入之间放置大约30分钟或以上，使产物从反应混合物中结晶。过滤或离心，用水洗，然后用MeCN洗涤，任选在20-60℃下真空干燥。由Z-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2的收率为87.7％，纯度为95.1％。
经发现，通过加热反应物到大约60℃并加入氨，使pH为9左右2小时可增加收率及纯度。这可以将主要的杂质Z-Tyr(O-(异丁氧基羰基))-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2转化为产物(ⅱ)H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2(方案2中化合物I)的制备5.4摩尔规模
将Z-Tyr-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2与DMF(实际操作2.6升/摩尔)混合，加入5％的Pd/C催化剂(实际含量)(0.2-10％w/w/化合物3)(实际6.4％)，在20-40℃(实际操作20-25℃)和大约3巴H2压力下，氢化得到的混合物0.5小时以上(实际操作1.8小时)。过滤反应混合物以除去Pd/C，然后通过加入EtOAc直到所有物质结晶(一般为约14升/摩尔)为止，使产物结晶。经过滤或离心分离固体，用EtOAc洗涤，然后在20-50℃下真空干燥。纯度为96.7％。原料转化率大于99％。H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2盐酸盐的制备4.6摩尔规模
将游离碱H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2溶解于加有1当量氯化氢的水和丙酮混合液中，过滤(在实际操作中146克/摩尔25％氯化氢/水，2升/丙酮/摩尔)。该盐几乎不溶于乙酮中，因此，过滤器用额外量的丙酮/水(95∶5)的混合物(0.5升/摩尔)洗涤一次。通过高速搅拌下，缓慢加入丙酮(3.4升/摩尔)，然后加入大约1％w/w的晶种，诱发结晶。30分钟后，缓慢加入第一份MIBK(3升/摩尔)，缓慢搅拌下放置直到配料明显变稠。再分三次加入MIBK(3升/摩尔)，间隔30-60分钟，同时维持反应器内部温度在大约20℃左右。然后，经离心或过滤使固体分离，用MIBK洗涤，在20-50℃下真空干燥16小时以上或直到溶剂含量低于规定的技术规范的要求。收率为95.8％，纯度为99.8％。后处理：
没有达到药用物质技术要求的产物可通过上述结晶化合物I同样方法进行重结晶，但不加入氯化氢。H-Tyr-D-Ala-Phe(F)-Phe-NH2 x HCI即化合物I的盐酸盐形式的NMR光谱确定
36mg所述化合物在大约0.7ml DMSO-d6(99.95％原子-D)中的溶液，在27℃下，在Varian UNITY加400MHz仪上获得NMR光谱。对于质子光谱化学位移参考标准为2.49ppm的DMSO-d6的多峰的中间峰值。对于碳谱化学位移参考标准为39.5ppm的DMSO-d6的多峰的中间峰值。
在确定中使用的原子编号是任意的，参考上图质子光谱：
一维质子光谱用于α位质子(3.9-4.4ppm)、苄基-CH2(2.6-3.1ppm)、酰胺-NH和酚-OH(8.2-8.5ppm)的以组确定(groupwiseassignment)，也用于Ala-CH3(14-CH3)(0.74ppm)专门确定(specificassignment)。
二维DQFCOSY光谱用干对每个氨基酸残基中自旋糸统(α位、β位和NH质子)以组确定，每个芳环中的芳基质子以组确定。所有Ala残基中的质子也可专门确定。碳谱
一维碳谱用于α位碳、苄基-CH2、羰基和芳基碳的组确定，当然用于C-14的专门确定。APT谱用于对每个碳的CH-峰裂数的确定。由于C-F偶合引起的谱线裂分用于氟代芳环中碳的专门确定。二维异型相关谱：
二维碳-质子相关谱(HMQC)产生质子化的碳与所有直接连接的质子间的相关性。可以专门确定所有Ala残基中的质子化碳。
二维碳-质子多键相关谱(HMBC)产生碳与相隔2-3个键的质子间的相关性。这使得借助α氢和以及借助NH和邻接氨基酸残基的羰基(三键相关)，以及借助NH和邻接氨基酸残基(二键相关)确定氨基酸顺序。类似，苄基-CH2和芳基碳之间以及芳基质子和苄基-CH2之间的二-和三-键相关使得可以专门确定各芳香氨基酸的芳基质子和碳。
用这种方法，可以以确定的方式专门确定所有四种氨基酸残基中的所有(不能互换的)质子和碳。表1质子确定化学位移(ppm) 积分 峰裂数 确定9.4 1H s 300H8.48 1H d 9NH8.37 1H d 1NH8.35 1H d 8NH8.26 2H s7.53 1H s7.28 2H m 18H,19H7.26 2H m 21H,22H7.22 2H m 6H,7H7.18 1H m 24H7.12 1H s7.04 2H m 10H,11H6.98 2H m 26H,27H6.68 2H m 28H,29H4.43 1H m 1H4.39 1H m 8H4.26 1H m 9H3.96 1H m 20H3.39 HDO3.02 1H m 12Hb2.99 1H m 2Hb2.87 2H m 23Ha,23Hb2.85 1H m 12Ha2.67 1H m 2Ha0.74 3H d 14H表2碳确定化学位移(ppm) 峰裂数 确定 JC-F172.99 s 13171.08 s 5170.81 s 3167.39 s 17162.11 s 15 241Hz159.70 s 15 241Hz156.50 s 30137.98 s 16133.96 s 4 3.1Hz133.93 s 4 3.1Hz131.16 d 6.7 8.4Hz131.08 d 6.7 8.4Hz130.46 d 26.27129.26 d 18.19128.09 d 21.22126.30 d 24124.73 s 25115.16 d 28.29114.63 d 10.11 21.3Hz114.41 d 10.11 21.3Hz54.33 d 854.01 d 153.37 d 2047.96 d 937.57 t 1236.83 t 236.17 t 2318.45 q 14
Claims (14)
1．制备式(Ⅰ)四肽H-Tyr-D-Ala-Phe(F)-Phe-NH2或其药学上可接受的盐的方法，包括以下步骤：
(ⅰ)一个偶合步骤，其中在标准条件下，一种活化酪氨酸衍生物(Ⅹ)，在溶剂存在下，与三肽衍生物(9)反应，提供保护的四肽衍生物(Ⅺ)，式(Ⅹ)、(9)和(Ⅺ)化合物的结构式如下：
其中A是一种氨基保护基团，R是一种活化剂残基，和R2是H或类似苄基的基团；
其中R1是一种酯或酰胺残基；
其中A是一种氨基保护基，和R1是一种酯或酰胺残基；
(ⅱ)一个脱保护步骤，其中被保护的四肽衍生物(Ⅻ)，在标准条件下，在溶剂存在下，通过催化氢化作用、碱或酸处理而脱保护，得到(Ⅰ)。
2．根据权利要求1的方法，其特征在于包括如下另外的步骤：
(ⅰ)一个偶合步骤，其中在标准条件下，一种活化的丙氨酸衍生物(Ⅶ)与二肽衍生物(5)在溶剂的存在下反应，得到被保护的三肽衍生物(Ⅷ)，式(Ⅶ)、(5)和(Ⅷ)化合物的结构式如下：其中A是一种氨基保护基团，和R是一种活化剂的残基；其中R1是酯或酰胺残基；
其中A是一种氨基保护基团，和R1是酯或酰胺残基；
(ⅱ)脱保护步骤，其中在前面步骤中制备的、被保护的三肽衍生物(Ⅷ)在标准的条件下，在溶剂存在下，通过催化氢化作用、碱或酸处理被脱保护，得到三肽衍生物(9)：其中R1是酯或酰胺残基。
3．权利要求2的方法，其特征在于包括如下另外的步骤：
(ⅰ)一个偶合步骤，其中在标准的条件下，在溶剂的存在下，活化的p-氟苯丙氨酸衍生物(Ⅲ)与苯丙氨酸的氨基反应，其中羧基作为酯或酰胺被保护，得到被保护的二肽衍生物(Ⅳ)，式(Ⅲ)和(Ⅳ)化合物的结构式如下：其中A是氨基保护基团，和R是活化剂残基；其中A是氨基保护基团，和R1是酯或酰胺残基；
(ⅱ)一个脱保护步骤，其中在以上步骤中制备的被保护的二肽衍生物(Ⅳ)，在标准的条件下，在溶剂的存在下，通过催化氢化作用、碱或酸处理被脱保护，得到二肽衍生物(5)：
其中R1是酯或酰胺残基。
4．根据权利权求1-3的方法，其特征在于所述偶合步骤(ⅰ)之一后跟着任选的转化步骤，如果所述氨基酸衍生物的羧基作为酯衍生物被保护，其中酯化合物在有机乙醇中与氨反应进行。
5．根据权利权求1-3的方法，其特征在于在至少一个偶合步骤中使用的活化氨基酸衍生物选自碳二亚胺、活化酯、叠氮化物或酸酐。
6．根据权利要求5的方法，其中所述活化剂是氯代甲酸异丁酯。
7．根据权利要求1-6中任何一项的方法，其特征在于用于至少一个偶合步骤中的溶剂是丙酮、乙腈、NMP、DMP或EtOAc。
8．根据权利要求1-3的方法，其中在偶合步骤中的溶剂是DMF。
9．根据权利要求1-3中任何一项的方法，其特征在于所述脱保护步骤使用披钯木炭进行。
10．根据权利要求1-9中任何一项的方法，其特征在于至少一个反应是在0℃到-20℃的温度下进行。
11．根据权利要求10的方法，其中所述温度为从-5℃到-15℃。
12．根据权利要求1的方法制备的式Ⅰ肽：
13．根据权利要求12的肽，为盐酸盐的形式。
14．式(9)的肽衍生物：其中R1是一种酯或酰胺残基。
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