CN112625087A - 用于合成司美鲁肽的二肽片段衍生物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于司美鲁肽合成的二肽片段衍生物，二肽片段衍生物可直接与司美鲁肽主链反应，相较于多肽方法大大提高了反应效率，且在反应中组氨酸的羰基不再参与反应，其手性位点不产生消旋；本发明还提供二肽片段衍生物的制备方法，由高光学纯度的二肽片段R1‑His(R2)‑Aib‑OH制备得到；本发明的另一方面还提供了二肽片段的合成方法，将本发明的方法用于司美鲁肽的合成过程中，能降低杂质的含量，提高司美鲁肽产品质量。
Description
技术领域
本领域属于化合物制备领域，具体涉及一种用于司美鲁肽合成的二肽片段衍生物及其合成方法。
技术背景
索马鲁肽(又称司美鲁肽)由丹麦诺和诺德公司研发，主要用于治疗成人2型糖尿病。索马鲁肽注射液于2017年12月被FDA批准上市，其片剂于2019年9月被FDA批准上市。用于辅助饮食和锻炼，改善成人2型糖尿病患者的血糖控制，能够显著降低II型糖尿病患者重大心血管事件风险。索马鲁肽口服固体制剂“Rybelsus”目前已在美国上市，在欧洲、日本申请上市。
索玛鲁肽的肽序结构如下：
索马鲁肽由31个氨基酸主链与一个脂肪酸侧链组成，在主链端位有His-Aib2个氨基酸(Aib为非天然氨基酸)。司美鲁肽的主要合成方法是通过固相法或生物方法合成主链(29个氨基酸组成)，然后在Lys20上接入脂肪酸侧链后，再在端位接入His-Aib-OH制备出索马鲁肽原料药，如诺和诺德公司公开的专利CN101133082中的记载。
在已报导的合成文献中索马鲁肽端位二肽片段的合成报道较少，如专利WO2016046753报道了用端位[1-4]片段合参与成主序列但未报道片段[1-4]的合成方法。但端位肽的合成尤为重要，按照已报导的固相方法逐步偶联氨基酸合成索玛鲁肽时，在引入大位阻的氨基酸Aib后，对后面的His的偶联带来挑战，收率较低，会产生缺失His的杂质，主链在与His偶联同时，会造成His的消旋化，异构体含量不易控制，造成产品光学纯度低。因此，预先得到高光学纯度的稳定的His-Aib-OH二肽片段或其衍生物在合成索马鲁肽原料药中具有重要意义。
发明内容
基于上述索马鲁肽制备方法存在的不足，本发明的目的一方面是提供一种用于制备索马鲁肽的端位二肽片段衍生物。
其中，R1选自Fmoc、Cbz，R2选自H、Fmoc；
该二肽片段衍生物均为活性结构，可以直接与司美鲁肽主链连接，用于合成司美鲁肽，提高反应效率。
本发明的另一个目的在于提供一种制备上述二肽片段衍生物的方法，所述方法由高光学纯度的二肽片段R1-His(R2)-Aib-OH为反应物，其中R1为Fmoc或Cbz；R2为H或Fmoc，该方法包括以下步骤：
(3a)将二肽片段用四氢呋喃溶解，加入N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)和2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TSTU)，一定温度下反应10～12小时，浓缩反应液，加入乙酸乙酯、水搅拌分层，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，剩余物在一定温度下用乙腈打浆，过滤，干燥后得二肽片段衍生物I(R1-His(R2)-Aib-OSu)。
或者包括以下步骤：
(3b)将二肽片段用二氯甲烷溶解，加入催化量的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，冰水浴下，加入氯化亚砜，搅拌20分钟，升温至35℃搅拌4小时，反应液浓缩，经乙酸乙酯打浆或柱层析提纯得到二肽片段衍生物II(R1-His(R2)-Aib-Cl)。
优选的，所述反应步骤(3a)中，四氢呋喃与R1-His(R2)-Aib-OH的质量比为(5.0～15.0)：1；N，N-二异丙基乙胺与R1-His(R2)-Aib-OH的摩尔比为(1.0～1.6)：1；TSTU与R1-His(R2)-Aib-OH的摩尔比为(1.0～1.5)：1；
优选的，所述反应步骤(3a)中，所述反应温度为20～40℃；打浆溶剂乙腈与R1-His(R2)-Aib-OH的质量比为(4.0～10.0)：1；所述打浆温度为0～25℃；
或者，优选的，所述反应步骤(3b)中，二氯甲烷与R1-His(R2)-Aib-OH的质量比为(5.0～15.0)：1；氯化亚砜与R1-His(R2)-Aib-OH摩尔比为(1.0～2.0)：1；
本发明的另一目的在于，提供制备上述所述高光学纯度的端位二肽片段R1-His(R2)-Aib-OH的方法，该制备方法为：
其中，R3＝Trt、Mmt、Mtt、Boc、Fmoc中的一种；
(1)用带保护基的L-组氨酸，与2-氨基异丁酸叔丁酯盐酸盐，在反应溶剂1中，室温条件下，加入N，N二异丙基乙胺(DIPEA)、缩合剂与活化试剂，室温下搅拌，完全后，浓缩反应液，将剩余物溶解于乙酸乙酯中，乙酸乙酯相用水洗涤2次，用饱和氯化钠溶液洗涤1次，浓缩乙酸乙酯相至L-组氨酸质量的2～3倍，将乙酸乙酯相在一定温度下滴入至溶剂2中，滴加完毕后保温搅拌30分钟，搅拌析晶，过滤，干燥后得到中间体I粗品。
(2)将步骤(1)中间体I粗品溶于溶剂3中，冰水浴下缓慢加入三氟乙酸和三异丙基硅烷，室温下，搅拌至反应完全，浓缩反应液，剩余物加入溶剂4打浆，过滤后，再用溶剂5打浆，过滤，干燥后得二肽片段(R1-His(R2)-Aib-OH)或其三氟乙酸盐。
优选的，步骤(1)中，所述反应溶剂1为四氢呋喃、二氯甲烷、乙二醇二甲醚中的一种；溶剂1与R3-His(R1)-OH的质量比为(5.0～15.0)：1；
优选的，步骤(1)中所述的反应的步骤中，DIPEA与R3-His(R1)-OH的摩尔比为(2.0～2.5)：1；
优选的，步骤(1)中，所述2-氨基异丁酸叔丁酯盐酸盐与R3-His(R1)-OH的摩尔比为(1.0～1.5)：1；
优选的，步骤(1)中，所述缩合试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、二环己基碳酰亚胺(DCC)中的一种；缩合试剂与R3-His(R1)-OH的摩尔比为(1.2～2.0)：1；
优选的，步骤(1)中，所述活化试剂为1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)、1-羟基苯并三唑(HOBT)中的一种；活化试剂与R3-His(R1)-OH的摩尔比为(1.2～2.0)：1；
优选的，步骤(1)中，所述溶剂2为正庚烷、正己烷、石油醚、甲苯中的一种，溶剂2与R3-His(R1)-OH的质量比为(12.0～20.0)：1；析晶温度为-5～15℃；
优选的，步骤(2)中，所用的反应溶剂3为二氯甲烷、四氢呋喃、乙二醇二甲醚中的一种，溶剂3与中间体I的质量比为(5.0～15.0)：1；
优选的，步骤(2)中，三氟乙酸与中间体I的质量比为(2.0～5.0)：1；
优选的，步骤(2)中，当R3为Trt、Mmt、Mtt时，三异丙基硅烷与中间体I的摩尔比为(1.2～2.2)：1；当R3为Fmoc、Boc时，三异丙基硅烷的加入量为0g；
优选的，步骤(2)中，所述打浆溶剂4为异丙醚、甲基叔丁基醚、石油醚中的一种或任意比例组合，打浆溶剂4与中间体I粗品的质量比为(10.0～22.0)：1，用溶剂4的打浆温度为10～35℃；
优选的，步骤(2)中，所述打浆溶剂5为乙腈、乙酸乙酯、异丙醇、乙醇中的一种；打浆溶剂5与中间体I粗品的质量比为(4.0～10.0)：1；用溶剂5的打浆温度为0～35℃。
常规的固相逐步偶联的方法合成司美鲁肽时，在偶联大位阻氨基酸Aib后，与His偶联效率低，本发明用化学方法，通过反应条件优化及有效的后处理，得到高光学纯度的端位二肽片段R2-His(R1)-Aib-OH，对映体过量值为99.2％～99.8％。利用该端位二肽片段合成二肽片段衍生物，用于司美鲁肽的合成，相较于多肽方法大大提高了偶联效率；且在后续反应中由于组氨酸的羰基不会再参与反应，组氨酸的光学纯度能够被保持，因此用此端位二肽片段(或二肽片段衍生物)会降低索马鲁肽合成过程中D-His1的含量，提高索马鲁肽产品质量。
有益效果
1.本发明提供了2个新的用于索马鲁肽合成的二肽片段衍生物，为索马鲁肽合成提供更多可能性，该衍生物可以直接与司美鲁肽主链连接，提高反应效率。
2.本发明利用化学方法高收率合成了高光学纯度的索马鲁肽二肽片段，将该二肽片段用于司美鲁肽的合成过程中，能减低消旋概率，减小杂质含量，提高产品质量。
3.本发明利用化学方法制备端位二肽片段及其衍生物，产率高，步骤短，便于放大生产。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明作进一步描述，下述说明仅是为了解释本发明，本发明的保护范围并不限于这些实施例，本领域的技术人员应理解，对本发明内容所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
下面有具体实例对本发明进行详细说明，但不限定本专利。
实施例1：中间体I的合成
R1＝Fmoc，R3＝Trt
称取50.01g Fmoc-L-His(Trt)-OH加入到500ml四氢呋喃中，搅拌，向反应瓶中加入18.95g DIPEA(2.00eq)搅拌溶解，依次向反应瓶中加入20.12g EDCI(1.30eq)、14.21gHOBt(1.30eq)、18.95g2-氨基异丁酸叔丁酯盐酸盐(1.20eq)，搅拌5小时，反应完全，浓缩反应液，剩余物用300ml EA溶解，有机相用300ml纯化水洗2次，300ml饱和氯化钠水溶液洗一次，分液，收集有机相，浓缩有机相至100g，控温0-15℃，将浓缩液滴加到750ml正庚烷中析晶，滴加完毕后，保温0～15℃搅拌30分钟，过滤，滤饼真空干燥，得到65.90g白色固体粉末中间体I粗品，收率107.31％，纯度90.72％，异构体含量0.34％。
实施例2：中间体I的合成
R1＝Fmoc，R3＝Fmoc
称取50.00g Fmoc-L-His(Fmoc)-OH加入到500ml二氯甲烷中，搅拌，向反应瓶中加入21.55g DIPEA(2.00eq)搅拌溶解，依次向反应瓶中加入14.21g DIC(1.35eq)、15.21gHOBt(1.35eq)、19.58g2-氨基异丁酸叔丁酯盐酸盐(1.20eq)，搅拌6小时，反应完全，浓缩反应液，剩余物用300ml EA溶解，有机相用300ml纯化水洗2次，300ml饱和氯化钠水溶液洗一次，分液，收集有机相，浓缩有机相至100g，控温0-10℃，将浓缩液滴加到750ml石油醚中析晶，滴加完毕后，保温0～10℃搅拌30分钟，过滤，滤饼真空干燥，得到66.24g白色固体粉末中间体I粗品，收率107.24％，纯度89.69％，异构体含量0.45％。
实施例3：R1-His(R2)-Aib-OH的合成
R1＝Fmoc，R3＝Trt或Mmt或Mtt，R2＝H
室温下，称取62.66g中间体I粗品加入到250ml二氯甲烷中，搅拌溶解，量取188ml三氟乙酸加入至反应瓶中，加入25.90g三异丙基硅烷，室温搅拌4小时，原料反应完全，反应液浓缩，浓缩完成，剩余物1378ml异丙醚室温打浆，过滤，滤饼中加入564ml乙腈室温打浆，干燥，得到36.13g白色固体粉末端位二肽片段，纯度98.27％，收率70.50％，异构体含量0.05％。
实施例4：R1-His(R2)-Aib-OH的合成
R1＝Fmoc，R3＝Fmoc或H，R2＝Fmoc
室温下，称取60.00gR1-His(R2)-Aib-OH加入到250ml四氢呋喃中，搅拌溶解，量取188ml三氟乙酸加入至反应瓶中，室温搅拌4小时，原料反应完全，反应液浓缩，浓缩完成，剩余物用1000ml异丙醚室温打浆，过滤，滤饼中用300ml异丙醇0～5℃打浆，过滤，干燥，得到73.26g白色固体粉末端位二肽片段，纯度98.12％，收率78.00％，异构体含量0.08％。
实施例5：二肽片段衍生物I(R1-His(R2)-Aib-OSu)的合成
R1＝Fmoc，R2＝H
室温下，称取18.00gR1-His(R2)-Aib-OH加入到150ml四氢呋喃中，搅拌溶解，加入9.28gDIPEA(2.3eq)、11.28gTSTU(1.2eq)，25～30℃下搅拌12小时，反应完全，反应液浓缩，浓缩完成后加入150mL乙酸乙酯，100mL水，搅拌分层，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，剩余物用60mL乙腈0～10℃打浆，过滤，干燥后得二肽片段衍生物I(R1-His(R2)-Aib-OSu)15.70g，收率89.86％，纯度97.28％。
实施例6：二肽片段衍生物I(R1-His(R2)-Aib-OSu)的合成
R1＝Fmoc，R2＝Fomc
室温下，称取30.00gR1-His(R2)-Aib-OH加入到200ml四氢呋喃中，搅拌溶解，加入7.36gDIPEA(1.3eq)、15.83gTSTU(1.2eq)，25～30℃下搅拌10小时，反应完全，反应液浓缩，浓缩完成后加入200mL乙酸乙酯，150mL水，搅拌分层，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，剩余物用80mL乙腈打浆，过滤，干燥后得二肽片段衍生物I(R1-His(R2)-Aib-OSu)29.92g，收率87.35％，纯度98.33％。
实施例7：二肽片段衍生物II(R1-His(R2)-Aib-Cl)的合成
R1＝Fmoc，R2＝H
室温下，称取30.00gR1-His(R2)-Aib-OH用240mL二氯甲烷溶解，加入催化量的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，冰水浴下，滴加入9.90g氯化亚砜(1.60eq)，滴加完毕升温至35℃搅拌4小时，反应完全，浓缩反应液，加入120mL乙酸乙酯，0～5℃搅拌1小时，析出固体，过滤干燥得到26.17g二肽片段衍生物II(R1-His(R2)-Aib-Cl)，收率97.20％。
实施例8：二肽片段衍生物II(R1-His(R2)-Aib-Cl)的合成
R1＝Fmoc，R2＝Fomc
室温下，称取30.00gR1-His(R2)-Aib-OH用240mL二氯甲烷溶解，加入催化量的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，冰水浴下，滴加入8.34g氯化亚砜(1.60eq)，滴加完毕升温至35℃搅拌4小时，反应完全，浓缩反应液，用石油醚/乙酸乙酯柱层析，得到产物29.02g二肽片段衍生物II(R1-His(R2)-Aib-Cl)，收率94.20％。
Claims (9)
1.用于制备司美鲁肽的二肽片段衍生物：
其中，R1选自Fmoc或Cbz，R2选自H或Fmoc。
2.一种制备如权利要求1所述二肽片段衍生物的方法，其特征在于，制备所述二肽片段衍生物Ⅰ包括以下步骤：
(3a)将二肽片段用四氢呋喃溶解，加入N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)和2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TSTU)，一定温度下反应10～12小时，浓缩反应液，加入乙酸乙酯、水搅拌分层，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，剩余物在一定温度下用乙腈打浆，过滤，干燥后得二肽片段衍生物I(R1-His(R2)-Aib-OSu)。
3.一种制备如权利要求1所述二肽片段衍生物的方法，其特征在于，制备所述二肽片段衍生物二肽片段衍生物Ⅱ包括以下步骤：
(3b)将二肽片段用二氯甲烷溶解，加入催化量的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，冰水浴下，加入氯化亚砜，搅拌20分钟，升温至35℃搅拌4小时，反应液浓缩，经乙酸乙酯打浆或柱层析提纯得到二肽片段衍生物II(R1-His(R2)-Aib-Cl)。
4.根据权利要求2所述的制备二肽片段衍生物的方法，所述步骤(3a)中，四氢呋喃与R1-His(R2)-Aib-OH的质量比为(5.0～15.0)：1；N，N-二异丙基乙胺与R1-His(R2)-Aib-OH的摩尔比为(1.0～1.6)：1；TSTU与R1-His(R2)-Aib-OH的摩尔比为(1.0～1.5)：1；所述反应温度为20～40℃；打浆溶剂乙腈与R1-His(R2)-Aib-OH的质量比为(4.0～10.0)：1；所述打浆温度为0～25℃。
5.根据权利要求3所述的制备二肽片段衍生物的方法，所述反应步骤(3b)中，二氯甲烷与R1-His(R2)-Aib-OH的质量比为(5.0～15.0)：1；氯化亚砜与R1-His(R2)-Aib-OH摩尔比为(1.0～2.0)：1。
6.根据权利要求2或3所述的制备二肽片段衍生物的方法，其特征在于，所述二肽片段R1-His(R2)-Aib-OH的制备方法包括以下步骤：
其中，R3＝Trt、Mmt、Mtt、Boc、Fmoc中的一种；
(1)用带保护基的L-组氨酸，与2-氨基异丁酸叔丁酯盐酸盐，在反应溶剂1中，室温条件下，加入N,N二异丙基乙胺(DIPEA)、缩合剂与活化试剂，反应一段时间后，浓缩反应液，将剩余物溶解于乙酸乙酯中，乙酸乙酯相用水洗涤2次，用饱和氯化钠溶液洗涤1次，浓缩乙酸乙酯相至L-组氨酸质量的2～3倍，将乙酸乙酯相在一定温度下滴入至溶剂2中，滴加完毕后保温搅拌30分钟，搅拌析晶，过滤，干燥后得到中间体I粗品；
(2)将步骤(1)中间体I粗品溶于溶剂3中，冰水浴下缓慢加入三氟乙酸和三异丙基硅烷，室温下，搅拌至反应完全，浓缩反应液，剩余物加入溶剂4打浆，过滤后，再用溶剂5打浆，过滤，干燥，后得二肽片段(R1-His(R2)-Aib-OH)或其三氟乙酸盐。
7.根据权利要求6所述的二肽片段衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述反应溶剂1为四氢呋喃、二氯甲烷、乙二醇二甲醚中的一种；溶剂1与R3-His(R1)-OH的质量比为(5.0～15.0)：1；所述2-氨基异丁酸叔丁酯盐酸盐与R3-His(R1)-OH的摩尔比为(1.0～1.5)：1；所述的N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)与R3-His(R1)-OH的摩尔比为(2.0～2.5)：1；所述缩合试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、二环己基碳酰亚胺(DCC)中的一种；缩合试剂与R3-His(R1)-OH的摩尔比为(1.2～2.0)：1；所述活化试剂为1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)、1-羟基苯并三唑(HOBT)中的一种；活化试剂与R3-His(R1)-OH的摩尔比为(1.2～2.0)：1；所述溶剂2为正庚烷、正己烷、石油醚、甲苯中的一种，溶剂2与R3-His(R1)-OH的质量比为(12.0～20.0)：1；析晶温度为-5～15℃。
8.根据权利要求6所述的二肽片段衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所用的反应溶剂3为二氯甲烷、四氢呋喃、乙二醇二甲醚中的一种，溶剂3与中间体I的质量比为(5.0～15.0)：1；三氟乙酸与中间体I的质量比为(2.0～5.0)：1；当R3为Trt、Mmt、Mtt时，三异丙基硅烷与中间体I的摩尔比为(1.2～2.2)：1；当R3为Fmoc、Boc时，三异丙基硅烷的加入量为0g；所述打浆溶剂4为异丙醚、甲基叔丁基醚、石油醚中的一种或任意比例组合，打浆溶剂4与中间体I粗品的质量比为(10.0～22.0)：1，用溶剂4的打浆温度为10～35℃；所述打浆溶剂5为乙腈、乙酸乙酯、异丙醇、乙醇中的一种；打浆溶剂5与中间体I粗品的质量比为(4.0～10.0)：1；用溶剂5的打浆温度为0～35℃。
9.权利要求1所述的二肽片段衍生物在司美鲁肽合成中的应用。
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