CN1298835C - 用于细胞和组织培养的滚瓶系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于细胞培养的先进的滚瓶系统，它能够有效地、连续地、和自动地用新培养基补充废培养基。所述滚瓶系统通过根据预定的条件变化排出废培养基并且用新培养基补充所述废培养基，对培养基进行优化。

Description

用于细胞和组织培养的滚瓶系统
发明领域
本发明总体上涉及细胞培养，更具体地讲，本发明涉及适合制备细胞产物的多腔室滚瓶。
背景技术的说明
滚瓶通常被用于细胞生长和细胞产物的生产。细胞培养是在将滚瓶放入旋转装置，例如，由Synthecon，Inc.提供的RollerCell40TM，或由Zinsser Analytic，Ltd、(UK)提供的R2P Roller Culture ApparatusTM中之后进行的。
一直需要提高细胞培养效率和产量。一般，培养物或产物生长条件，是根据细胞类型凭经验优化的。存在决定操作参数的其他方法。然后，通常将反馈控制机制用于确保将条件保持在所述优化的参数内。某些反馈控制系统可能是复杂的，或者不能方便地适应滚瓶培养系统。例如，参见美国专利号4,839,292和6,323,022。
                      发明概述
本发明提供了用于细胞培养的先进的滚瓶系统(ARBS)，它能有效地、连续地、和自动地用新培养基补充废培养基。ARBS通过根据预定的条件改变排出废培养基并且用新培养基补充所述废培养基优化培养基。
所述ARBS系统包括多腔室的瓶子，其中，所述腔室是筒形的，并且彼此之间形成受控制的流体连通。在一种实施方案中，第一筒形腔室是用于容纳新培养基的容器；第二筒形腔室是细胞或组织生长箱，而第三筒形腔室是用于容纳废培养基的容器。所述腔室之间的流体连通是通过转移腔室实现的，而控制是通过阀操作实现的。第一和第二腔室之间的流体连通，可以控制在一旦满足操作参数之后新培养基的添加。第二和第三腔室之间的流体连通允许在一旦达到了细胞产物的废弃的或阈值浓度之后，可以将培养基从第二腔室取出。
所述流体连通是通过位于筒形腔室之间的端口中的一组控制阀控制或操纵的。所述控制阀的开启和关闭，允许培养基通过转移腔室从一个筒形腔室流向下一个筒形腔室。新培养基转移腔室可以位于第一和第二筒形腔室之间，或包括一个或多个所述腔室的一部分。同样，废培养基腔室可以位于第二和第三筒形腔室之间或包括一个或多个所述腔室的一部分。
在一种实施方案中，所述滚瓶绕它的旋转轴线顺时针或逆时针旋转，导致培养基在重力的作用下从一个腔室转移到另一个腔室。
在ARBS旋转时，新培养基转移腔室从第一筒形腔室中挖起并且保持预定体积的新培养基。通过启动阀，将所述保持的培养基释放到第二个腔室中。在六点钟的位置上，通过电磁阀打开允许培养基从第二筒形腔室流向废培养基转移腔室的控制阀，所述电磁阀是通过重力敏感型座席开关激活的。
在从它的最初的起始位置(十二点钟位置)完成360度的旋转之后，所述控制阀允许所述保持的培养基进入第二筒形腔室，并且，允许培养基从废培养基转移腔室流向第三筒形腔室的控制阀是通过电磁阀开启的，该电磁阀是通过包含在调控器组件中的传感器激活的。
可以选择传感器，以便可以测定与细胞或组织培养物或需要的产物形成相关的任何参数。在一种实施方案中，所述传感器测定pH的改变。
在另一种实施方案中，所述传感器测定氨离子浓度的改变。
在另一种实施方案中，所述调控器包括测定pH改变的传感器和测定氨离子浓度的改变的传感器。
所述调控器组件还包括第一和第二电磁阀，所述电磁阀可操作地连接在磁铁上。重力敏感型座席开关激活第一电磁阀，由它启动可操作地与它连接的磁铁和位于废培养基转移腔室内部的相对的磁铁之间的磁场。通过第一电磁阀和相对的磁铁形成的磁场打开了所述控制阀，使得培养基能够从第二筒形腔室流入废培养基腔室。
当所述传感器检测到第二筒形腔室中培养基条件的改变，并且向第二电磁阀发送电信号时，第二电磁阀被激活。第二电磁阀启动了与它连接的磁铁和位于废培养基转移腔室和新培养基转移腔室内的相对的磁铁之间的磁场，以便开启允许培养基从新培养基转移腔室流向第二筒形腔室，以及允许培养基从废培养基转移腔室流向第三筒形腔室的阀。
本发明还提供了利用ARBS培养细胞的方法，其中，将生长培养基导入第一筒形腔室，并且将细胞或组织分别导入第二筒形腔室。通过沿顺时针或逆时针方向旋转ARBS，培养所述细胞或组织。
在该方法中，新的生长培养基从第一筒形腔室自动流入第二筒形腔室，并且可以监测第二筒形腔室中的pH或细胞产物浓度。在通过所述传感器测定到理想的pH或细胞产物浓度时，所述传感器启动所述电磁阀，由它开启所述控制阀，导致废培养基从第二筒形腔室流入第三筒形腔室，并且，新的生长培养基从第一筒形腔室流入第二筒形腔室。
所述方法还可以包括回收步骤，其中，细胞产物是从ARBS系统的第二或第三个腔室中回收的。
细胞产物包括完整的细胞，组织，细胞部分，细胞代谢的分泌的分子或产物。
                   附图的简要说明
图1表示组装之后的本发明的ARBS。在图1中示出的该组装系统的部件是本发明的机电实施方案的典型例子。
图2表示ARBS上部的放大示意图。
图3表示所述ARBS下部的放大示意图。在该示意图中示出的系统的部件是本发明机电实施方案的典型例子。
                     发明说明
如图1所示的本发明的ARBS总体上以三个腔室为特征：新培养基容器(1)，生长箱(2)，和废培养基容器(3)。新培养基容器(1)和废培养基容器(3)以及生长箱(2)之间的恒定的培养基流动，是借助弹簧加载的阀自动实现的，所述阀是在ARBS绕它的纵向轴线旋转360度时开启和关闭的。所述阀的开启和关闭可以通过机电或生理化学操纵。
ARBS还以具有如图2和3所示的两部分组成的组件为特征，其中，带螺纹的部件(15)拧入螺纹接纳部件(16)。类似地，可以将带螺纹的部件(15)从螺纹接纳部件(16)拧出，以便拆开ARBS，并且暴露出生长箱(2)。具有普通技能的普通技术人员能够采用其他组装和拆卸装置，包括，但不局限于钩子，夹子，凸形/凹形突出类型的连接装置，真空密封，或将一个部件固定在另一个部件上的其他方式。
生长箱(2)是主要的培养腔室，将细胞或组织植入其中，将新培养基从新培养基容器(1)导入其中；并且将废培养基从它里面排入废培养基容器(3)。
培养基
各种类型的细胞培养基可以与ARBS组合使用，并且可以通过在线和目录批发商(例如，GIBCO，Sigma，和CellTech，Inc.)方便地获得，并且能够以具有多种营养组合的各种体积购买；有或没有添加剂(例如，氨基酸，维生素，电解质)或有或没有添加剂，如抗生素和/或抗氧化剂。本领域技术人员可以根据要培养的细胞或组织的类型，确定哪一种类型的培养基最适合特定的细胞培养方案。
例如，Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)是常用的培养基，这种培养基能够以多种形式获得，包括高葡萄糖制剂，低葡萄糖制剂，和含有L-谷氨酰胺和盐酸吡哆辛的F12制剂。DMEM适合支持和维持多种类型的哺乳动物细胞。最初开发DMEM是为了生长小鼠胚胎细胞，它是基础培养基Eagle(BME)培养基的改进形式，不过，氨基酸和维生素的浓度提高了四倍。推荐将1.0g/L的低葡萄糖制剂用于保持高密度培养物，和细胞在琼脂中的生长。4.5g/L的高葡萄糖制剂被广泛用于贴壁依赖型细胞类型(例如，中国仓鼠卵巢细胞或人胚胎肾细胞)(Dulbecco，R等，(1959)Virology 8：396-397，和Smith，JD等，(1960)Virology 12：185，还可参见Moton，HJ(1970)In Vitro6：89)。
还可以将以下类型的培养基用于通过ARBS培养细胞或组织，这些培养基是以举例形式提供的，而不是用于限定目的的。
表1：细胞培养基
培养基 参考文献
α最低必需培养基 Eagle，H.(1959)Science130：432-437.
BME-Cyroprotective培养基 Eagle，H.(1955)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，89：362-364.
Ham’s培养基 Ham，RG，et al.，(1965)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 53：288-293)；Ham，RG，et al.，(1963)Exp.Cell Res.29：515-526.
Iscove改进的Dulbecco培养基 Iscove，NN，et al.，(1978)J.of Exptl.Med.147：923-933.
Leibovitz’s Leibovita，A.(1963)Am.J.Hyg.78：173-180.
McCoy’s McCoy，TA，et al.，(1959)Proc，Soc.Exptl.Biol.Med.100：115-118.
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最低必需培养基 Eagle in Science.supra.
NCTC McQuilkin，WT，(1957)J.Nat.Canc.Inst.19：885-907.
RPMI Moore，GE，et al.，(1967)J.Am.Med.Assoc.199：87-92.
GMEM Eagle in Science，supra.
在被设计用于高密度细胞培养的装置中(例如，miniPERMTM，旋转烧瓶，滚瓶，或发酵罐)中，细胞和组织经受显著的剪切力。可以通过调控生物反应器的速度，即滚瓶的转速控制剪切力，或通过向所述培养基中添加抗剪切的添加剂控制剪切力。一种这样的添加剂是可以从VivaScience，AG购买的cellPROTECTTM。所述cellPROTECTTM添加剂能够提高培养基的黏度，并且保护细胞免受在培养中所经受的剪切力/应力的损伤。将所述cellPROTECTTM添加剂添加到培养基中，使它的浓度为占最终体积的0.05％-大约0.1％。可以将诸如cellPROTECTTM的能提高黏度的添加剂或具有高黏度的培养基类型用于本发明，只要它们与ARBS相容，并且它们的黏度不会妨碍培养基通过腔室和容器之间的阀流动就行。
ARBS机电组件
在图1和3所示出的ARBS的一种实施方案中，恒定的培养基补充和排放是通过腔室之间的培养基流动实现的，所述流动是通过补充阀(11a)，排泄阀(13a)，和废物转移阀(13b)控制的。在本实施方案中，所述阀是通过可分离的调控器(12)以机电方式控制的，该调控器具有pH或氨离子传感器或能够检测pH改变和氨离子浓度改变的传感器。调控器(12)还包括上电磁阀(7b)，下电磁阀(7a)，位置传感器和调控器磁铁(8a)，(8b)，和(8c)，这些磁铁可操作地与电磁阀(7a)和(7b)连接，如图3所示。
pH传感器
在ARBS的一种实施方案中，调控器(12)可以包括pH传感器或pH计，它能启动上电磁阀(7b)和下电磁阀(7a)，如图1和3所示。例如，如果调控器(12)包括pH传感器或pH计的话，一次性pH探头(未示出)可以位于生长箱(2)内部，它通过生长箱(2)的表面板上的孔(未示出)可操作地与调控器(12)连接(参见图3)。所述一次性pH探头可以与调控器(12)分离，以便当ARBS组件的其余部分是一次性的时候，调控器(12)可以再利用。
用于测定液体中的pH的装置是众所周知的。具有薄膜类型的电极的玻璃传感器是常见的，并且能可靠地用作pH测量的标准(参见，例如，Ohkawa H，Tanpakushitsu Kakusan Koso[Japanese](1998)43(3)：272-80；和Moore EW，Gastroenterology(1968)54(4)：501-7)。还可将非玻璃pH传感器用作调控器(12)的部件，并且通常是用溶剂聚合物薄膜制备的(如Pretsch等披露的，(1986)Anal.Chem.58：2285-2289，被收作本文参考)。在非玻璃传感器的范畴内，是具有平面结构的传感器，这种传感器通常比玻璃传感器小，并且生产和操作的成本要低的多。平板传感器的例子披露于授予Benco的美国专利号5,554,272和授予Foos的5,702,575中，这些专利以它们的整体形式收作本文参考。包括平板传感器的仪器可以通过商业渠道获得。所述传感器的平板方式通常包括应用在基质基础上的相对薄层材料，使用厚膜或薄膜技术，例如，包括丝网印刷。用作基质的材料可以是通过PLD(脉冲激光沉积)沉积的Al2O3或Ta2O5，或通过PECVD(等离子强化的化学蒸汽沉积)和LPCVD(低压化学蒸汽沉积)涂在硅场效应结构上的Si3N4。在操作中，这两种类型的传感器都具有高的pH灵敏度和长期稳定性。另外，可以将聚苯胺薄膜用作高灵敏度平板pH指示器(Takenaka，Y等，(1990)Chemical sensor6(Supplement A)：77-80，和Takenaka Y等，第81-84页，和Shinohara，H等，Chemical sensor6(SupplementA)：85-88)。
例如，如果DMEM是选择用于细胞或组织培养物的培养基的话，典型的pH最佳值为大约7.4-大约7.5。调控器(12)的pH传感器优选进行调准，以便对低于大约7.4，优选低于大约7.2，更优选低于大约7.0，最优选低于大约6.8的pH改变作出响应。
所述ARBS还能够支持直接从活的有机体，优选哺乳动物，更优选人类中取出的外植体的细胞培养(原代细胞)(例如，活组织检查材料或吸出液)。所述细胞培养物由混合的细胞类型群体构成。用于培养原代细胞的最佳pH为大约7.0，并且，在调控器(12)中所包括的pH传感器优选进行调准，以便检测低于大约7.0的pH改变；优选低于大约6.9；最优选低于大约6.8，用于原代细胞培养。
本领域技术人员能够校准pH计，并且确定所使用的特定细胞培养方法或细胞或组织类型所能承受的最佳pH范围，因此，调控器(12)不局限于任何一种细胞培养方法或细胞或组织类型的应用。
氨离子传感器
调控器(12)还包括氨(NH3)离子传感器，用于分析生长箱(2)中的生长条件。氨离子传感器可以包括聚合物膜电极，它由存在于惰性基质中的各种离子交换材料组成，所述基质如多孔特氟龙，聚氯乙烯(PVC)，聚乙烯或硅橡胶。在形成所述膜之后，将它封闭在PVC管的末端。这种类型的电极包括钾，钙和硝酸盐。
具有固态电极的氨离子传感器，将相对不溶性的无机盐用于膜中。固态电极是以均相或异相形式存在的。在这两种类型中，由于离子交换过程，在所述膜表面上形成了电位。固态电极的例子包括银/硫化物，氯化物和氟化物。
具有气体感测电极的氨离子传感器可用于测量氨，二氧化碳，氧化氮和二氧化硫。这种电极具有气体可渗透的膜，和内部缓冲溶液。所述缓冲溶液的pH根据气体而改变。这种改变是通过在外壳内组合的pH传感器检测的。由于它的结构，气体感测电极不需要外部参考电极。
在本实施方案中，将要培养细胞或组织植入生长箱(2)。可以将细胞和组织直接植入生长箱(2)，生长箱的内表面可选择性地衍生化，或者可以通过用所述细胞或组织进行工作台接种导入。为了方便将细胞或组织植入生长箱(2)，ARBS优选在带螺纹的部件(15)和螺纹接纳部件(16)的界面上分离(旋开)。
生长箱的衍生化的内表面
生长箱(2)的内表面可选择性地进行衍生化，以便有利于通过已知方法结合细胞。可以用氨基，活性卤，羟基，或硫醇基，或取代的N-羟甲基乙酰胺衍生化，其中，所述取代基是活性卤或拟卤素。可以通过让含水培养基中的蛋白或线性肽与具有活性卤基，活化的羧基，例如酯等的官能化表面，在温和条件下接触足够的时间，以便完成衍生化反应而结合蛋白或线性肽。任何残余的未反应的官能团，都可以通过使用合适的小分子-封端剂封闭。例如，活性卤基可以用脂族胺封闭，硫醇可以用马来酰亚胺封闭等。在某些实施方案中，可能没有必要封闭多余的活性基团，因为它们不会影响所述衍生过程中的随后的步骤。
如果选择免疫学细胞，例如，B-细胞培养的话，生长箱(2)的内表面可以用B-细胞识别的抗原衍生化(例如，CD20)或通过与可溶性抗原的专一性结合衍生化，其中，可以将所述抗原添加到所述细胞中，以便所述细胞具有表面免疫球蛋白，它能识别所述抗原，并且结合所述抗原，以便形成被内吞和加工的复合物。将会呈递具有细胞MHC抗原的抗原片段。通过将T-细胞添加到由B-细胞限制的培养基中，能识别所述抗原片断的T-细胞能分泌淋巴因子，导致所述B-细胞增殖。
利用ARBS的机电实施方案进行细胞培养
在植入时，将ARBS放入滚动装置中，在这里，它围绕它的纵向轴线旋转。由重力敏感型座席开关(未示出)检测所述ARBS业已相对它的起始位置转动了180度(以下称之为六点钟的位置)。例如，这种重力敏感型座席开关可以是水银倾斜开关或均重杆开关。
水银倾斜(或″翻倒″)开关是基于简单的结构，除了移动的水银之外，它没有其他活动部件。从机械角度讲，这种开关所经受的磨损很小，并且具有很长的预期使用寿命，平均使用次数为数千万次(Durakool，DANA，由美国电子元件公司销售)。
还可将非水银型″翻倒开关″用作旋转传感器。一种此类非水银开关可以从Comus获得，并且具有0.360″×0.310″的外壳，并且适合在-37-100℃的温度下工作(还可以从DuraKool，DANA获得)。
在六点钟的位置上，如果调控器(12)检测到生长箱(2)的培养基中pH的改变或氨离子浓度的改变，或这两者的改变超过了预定的阈值，调控器(12)就发送电信号，激活下电磁阀(7a)。激活的下电磁阀(7a)接合调控器磁铁(8a)，与相对的内部磁铁(9a)形成磁场。内部磁铁(9a)反过来又压缩废物转移阀(13b)内的弹簧，从而打开该阀门。打开的废物转移阀(13b)使得培养基从生长箱(2)流入废物转移腔室(6)。
废物转移腔室(6)具有容纳生长箱(2)中的所有培养基体积的容量，通常大约为15mL。在六点钟的位置上，废物转移腔室(6)可以完全充满，如果需要这样的话，不过，优选充满大约6％的容量，更优选大约7％的容量，最优选大约8％的容量。将废培养基或新培养基从一个腔室转移到另一个腔室所需要的时间，在一定程度上与这些腔室之间的孔的大小相关。所述电磁阀在“六点和十二点钟”的位置上的整个30度范围内一直是开启的。保持这种开启状态的时间取决于该装置的旋转速度。
当ARBS完成一周的旋转时(从它的起始位置旋转360度；以下称之为“十二点钟”的位置)，新培养基转移腔室(5)从新培养基容器(1)中挖起大约8mL，优选大约9mL，最优选大约10mL新培养基。
在十二点钟的位置上，上电磁阀(7b)被来自调控器(12)的电信号激活，并且与调控器磁铁(8b)和(8c)接合。调控器磁铁(8c)与相对的内部磁铁(9c)形成了磁场，迫使排泄阀(13a)打开，并且在六点钟的位置上将进入废物转移腔室(6)的废培养基排泄到废培养基容器(3)中。与此同时，上电磁阀(7b)还启动了调控器磁铁(8b)，与相对的内部磁铁(9b)形成磁场。内部磁铁(9b)下压弹簧(10)，它是通过由活塞部件(11c)沿ARBS′的水平轴线方向推压臂(11b)完成的，从而打开补充阀(11a)。打开的补充阀(11a)使得从新培养基转移腔室(5)中挖起的培养基能进入生长箱(2)。
细胞和组织培养物需要通气，以便能适当地生长。在ARBS旋转时，通过与生长室(2)连接的通气管(4)用环境空气，优选是消毒的对生长箱(2)通气。如图1和2所示，通气管(4)延伸穿过新培养基容器(1)，并且突出通过螺纹顶部(17)，在这里，它通过通气的盖子(18)与环境空气接触。
ARBS优选完成一周的旋转，以便在调控器(12)进行下一次读数之前平衡。
ARBS组件的其他部件包括管帽(14a)，它能够在不拆卸所述系统和管帽(14b)的前提下更换新培养基容器(1)中的新培养基或添加添加剂，营养物，生长因子等，可以在不拆卸该系统的前提下从废培养基容器(3)中排出废培养基。在ARBS使用期间，可以用合适的带螺纹的顶部(未示出)封闭管帽(14a)和(14b)。
通过管帽(14b)从废培养基容器(3)中排出的培养基可以扔掉或保存。在使用ARBS培养细胞的某些方法中，保存废培养基，以便开发在细胞生长和代谢期间分泌的需要的细胞产物。在本文中，术语“细胞产物”表示包括完整的细胞或组织或其中的任何亚结构(例如，细胞器或细胞膜)，分泌的离子，分泌的化合物，分泌的分子，抗体或其他免疫球蛋白，抗原，蛋白，细胞因子，激素，有机化合物，药用化合物，或其他感兴趣的生物分子。细胞产物还包括由调控器(12)内所包含的传感器检测的物质(例如，离子)，所述物质的检测启动了培养基在ARBS的腔室之间的流动。所述细胞产物可以从在废培养基容器(3)中收集的废培养基中收获。
可以对生长箱(2)的内表面进行衍生化，以便促进细胞结合。另外，还可将颗粒或支架用于细胞或组织结合。所述颗粒，例如，小球或支架可以是衍生化的。所述支架的优选形状是筒形模块样部件，可将它方便地插入或取出生长箱(2)。能够方便地插入和取出生长箱(2)的其他形状也包括在本发明的范围内，例如，碟形支架。开孔泡沫的支架是特别理想的，因为这种结构允许利用各种已知的细胞回收技术和材料方便地漂洗和分离细胞。
用于漂洗和从所述支架上分离细胞的一种合适的机制使用含有诸如胰蛋白酶的蛋白水解酶的溶液。用于分离细胞的其他合适的机制包括超声波或搅拌，只要施加在所述细胞上的力不会诱导裂解就行。不过，如果所述细胞被最终用于提取分析(例如，分离细胞内细胞产物，代谢物或细胞膜表面分子或部分)的话，抑制裂解就变得不那么重要了。技术人员能够理解的是，本领域已知的任何方法都可用于漂洗或从所述支架上分离培养的细胞，以便适合所述培养细胞的最终用途。
ARBS生理化学组件
在另一种实施方案中，可以通过用pH水凝胶取代调控器(12)组装ARBS，这使得整个ARBS成为一次性的。
在ARBS的所述生理化学实施方案中，pH水凝胶根据pH的改变扩张和收缩，对补充阀(11a)，排泄阀(13a)，和废物转移阀(13b)施加力，导致它们打开和关闭。
这里所使用的pH水凝胶是聚合材料，它能够在水和其他溶剂中膨胀，吸收聚合物网络中的流体，而又不会溶解。亲水性水凝胶在平衡状态下具有大的含水量和良好的相容性。pH-敏感型水凝胶一直是最广泛地研究的亲水性水凝胶。pH-敏感型水凝胶是交联的，以便通过若干种类型的交联力，如共价键，氢键，或疏水性相互作用形成稳定的凝胶。
所定义的酸性水凝胶是离子化的，因此，能在高pH条件下膨胀，而在低pH下不带电荷，并且不膨胀。碱性水凝胶的膨胀表现对于pH具有相反的依赖性，这使得它适合应用于ARBS。所述pH敏感性是由酸性和碱性侧基导致的，如羧酸，磺酸，伯胺，和季胺盐。例如，羧酸基团在高pH下是带电荷的，而在低pH下是不带电荷的，而对于伯胺基团和季胺盐来说，情况正好相反。特定侧基的过渡pH是通过所述侧基的pKa值确定的。因此，通过选择具有合适pKa值的侧基，可以构建亲水性水凝胶，它可以根据任何水平的pH刺激可恢复地离子化，导致凝胶的性能改变。所述pH范围取决于所选择的特定细胞类型或所需要的细胞产物。所述水凝胶是根据需要的目标pH范围选择的，优选在所述目标pH范围内具有快速的膨胀/去膨胀过渡。所述水凝胶和阀的位置是关键的，并且需要外部磁铁以便结合在辊筒架上，需要用它起到位置传感器的作用。
优选的pH-敏感型水凝胶源于多种聚合化合物，如：聚(烷基丙烯酸酯)，聚(丙烯异丁烯酸酯)，聚(2-甲基丙烯酸羟乙酯)(HEMA)，聚(2-羟丙基异丁烯酸酯)(HPMA)，聚(丙烯酰胺)，聚(N-乙烯基吡咯烷酮)，聚(乙烯醇)(PVA)，聚环氧乙烷(PEO)，聚(乙醚尿烷)，和聚电解质。上面所列举的用于合成均聚物的单体还能够以各种组合形式使用，以便形成共聚物。由所述聚合物形成的pH-敏感型水凝胶在分别添加酸和碱时能够可恢复地收缩和扩张。业已证实，在突然改变聚(甲基异丁烯酸酯-共-N，N-二甲基氨基乙基异丁烯酸酯)水凝胶的pH之后，对pH改变的反应可以是快速的和可恢复的。具有本领域普通技能的人员了解如何组合几种聚合物，以便形成复合pH敏感型水凝胶。
pH-敏感型水凝胶的膨胀和构建改变的平衡度受若干种因素的影响，如离子单体的电荷，可离子化基团的pKa，可离子化侧基在所述网络中的浓度，pH，离子强度，培养基的介电常数，交联密度，聚合物主链的亲水性和疏水性。上述因素在Helle B等的文献中进行了讨论，pH-sensitive hydrogel；Characteristics and Potential in DrugDelivery in Properties，Preparation，and Application(Eds.Harland等)1992。
所述离子单体的电荷影响pH-敏感型水凝胶的构像改变。酸性水凝胶在低pH下是不带电荷的，但是，在高pH下会离子化。因此，当提高含有酸性侧基的水凝胶中的pH时，膨胀的平衡度会提高。水凝胶的膨胀对pH的依赖性相反。基于异丁烯酸，硫氧基乙基异丁烯酸酯，HEMA，或HPMA的水凝胶业已被普遍用于获得酸性，碱性，和两性凝胶。业已研究了受离子基团类型影响的膨胀(Chen，LL等，(1998)Pharm.Dev.Technol 3(2)：241-9)。
所述凝胶中的可离子化的侧基的pKa值影响pH膨胀曲线(Chen，同上)。碱性可离子化基团的pKa值的降低会使所述曲线向低pH值方向偏移。业已证实，这种膨胀反应对接近水凝胶的可离子化基团的pKa值的pH值时最敏感(Eichenbaum GM等，(1998)Macromolecules31(15)：5084-93)。所述水凝胶中可离子化的单体的浓度对于凝胶的膨胀和pH敏感性来说是重要的。与中性共同单体相比，这种影响取决于可离子化单体的相对亲水性。pH敏感型聚合物主链的疏水性和亲水性影响膨胀。业已证实，提高所述聚合物主链的疏水性，能减弱共聚物聚(n-烷基异丁烯酸酯-共-N，N-二甲基氨基乙基异丁烯酸酯)和共聚物苯乙烯和4-乙烯基吡啶(VP)的pH敏感性。缓冲液组成和离子强度影响pH-敏感型水凝胶的膨胀。抗衡离子能屏蔽聚合物主链上的电荷。所述凝胶内和外的离子浓度将会是相等的，并且凝胶内的渗透压会随着凝胶外的离子浓度的提高而降低。含有多价离子的缓冲液能够中和凝胶内的一些电荷。交联密度对于pH敏感型膨胀来说是重要的。提高了的交联密度会限制膨胀的平衡度。如果所述凝胶是通过pH改变离子化的话，这种作用更明显。所述水凝胶的网络特性主要受合成变量的影响，特别是化学组成和交联密度(Chen，同上，还可参见Mandal TK等，(2000)Pharm.Dev.Technol.5(4)：555-60)。
优选的pH-敏感型水凝胶阀门，包括用各种类型的异丁烯酸酯合成的共聚物，所述异丁烯酸酯是通过自由基溶液聚合，由单体形成的。所述共聚物是坚韧的柔性聚合物，而不是柔软的凝胶。它们是高度生物相容性的；并且它们是惰性的和不会降解的，并且在用于诸如ARBS的滚瓶时是理想的，它会恒定接受由于培养基在腔室之间运动所产生的剪切应力。例如，N，N-二乙基-氨基乙基异丁烯酸酯(DEAMA)和2-羟丙基甲基丙烯酸酯(HPMA)的共聚物凝胶的膨胀，会随着培养基pH的降低而加强。Ishihara K.等业已证实了这一点(1984)Poly J.16：625-631。相反，HEMA均聚物的含水量不取决于培养基的pH。因此，由于导入了DEAMA部分，含水量随着HPMA共聚物水凝胶的pH而改变。当培养基的pH降低时，所述DEAMA部分被认为是质子化的，它能提高DEAMA部分和水凝胶的亲水性。DEAMA和HPMA共聚物水凝胶的含水量可以根据pH的改变而恢复。
上面所引用的所有文献都被收作本文参考，无论是否专门指出了要被收作了本文参考。
在业已对本发明进行全面说明之后，本领域技术人员可以理解的是，本发明可以在不超出本发明的构思和范围，并且在不进行过多实验的情况下，可以在等同参数，浓度，和条件的较宽的范围内实施本发明。
尽管业已结合本发明的具体实施方案对本发明进行了说明，应当理解的是，可以对本发明做进一步的改进。本申请意为包括遵循本发明原理的任何改变，用途，或改良，并且包括本发明所属领域的公知的或通常的实践的偏离本文说明的方案，并且可应用于所述实质性特征。

Claims (26)

1.一种具有至少三个筒形腔室的多腔室滚瓶系统，包括：适合用作细胞生长培养基腔室的第一筒形腔室，它具有至少四个口，其中，两个口位于外侧壁上，一个提供了空气源的入口，另一个提供了第一筒形腔室的总入口，并且，其中的另外两个口位于内侧壁上，其中，第一和第二筒形腔室是贴在一起的，一个口通过与所述外侧壁上提供了空气进入的口连接的导管提供了第二筒形腔室的空气源的入口，而另一个口通过控制阀提供与第二筒形腔室的受控制的流体连通；
适合细胞或组织生长的第二筒形腔室具有至少三个口，两个口位于与第一筒形腔室贴在一起的侧壁上，一个口与位于第一筒形腔室的内侧壁上的构成空气入口的口共同延伸，而另一个口与第一筒形腔室的提供受控的流体连通的口对齐，而第三个口通过控制阀提供了与第三筒形腔室的受控制的流体连通；
适合接纳废培养基并且具有至少两个口的第三筒形腔室，一个口位于与第二筒形腔室贴在一起的外侧壁上，并且提供了通向第三筒形腔室的总的入口，而第二个口与第二筒形腔室的第三个口对齐，提供了与第二筒形腔室的受控制的流体连通；以及
控制装置，用于顺序启动所述阀，以便产生从每一个相应的腔室到位于所述腔室的预定旋转位置上的其他腔室的受控制的流体流动；
其中，第一、第二和第三筒形腔室是相互连接在一起的，以便允许所述筒形腔室作为一个单一的组件绕旋转轴线旋转，并且，其中，所述流体连通的控制允许将生长培养基从第一筒形腔室导入第二筒形腔室，并且将废培养基从第二筒形腔室中排出，使它从第二筒形腔室进入第三筒形腔室。
2.如权利要求1的滚瓶系统，其中，提供了第一筒形腔室与第二筒形腔室的受控制的流体连通的所述口包括控制流体通过所述口流动的阀，和位于第一筒形腔室中的新培养基转移腔室，其中，所述新培养基转移腔室的两个壁是第一筒形腔室的弧形壁和所述内壁的一部分，并且，在所述滚瓶从六点钟的位置转动到十二点钟的位置期间，新培养基转移腔室从第一筒形腔室铲起并且保持生长培养基，其中，所述阀在六点钟的位置上是关闭的，并且在十二点钟的位置启动，以便将培养基释放到第二筒形腔室中。
3.如权利要求1的滚瓶系统，其中，所述提供与第三筒形腔室的受控制的流体连通的口包括控制流体从所述口流入第三筒形腔室的第一个阀，以及位于第三筒形腔室中的废培养基转移腔室，它接收当第二个阀根据存在于第二筒形腔室中的传感器而被启动时从第二筒形腔室中流出的废培养基，其中，所述废培养基转移腔室的两个壁是第三筒形腔室的弧形壁和所述内壁的一部分，并且，所述腔室在所述滚瓶从六点钟的位置旋转到十二点钟位置的旋转期间，其中，在六点钟的位置第一个阀是闭合的，而第二个阀是开启的，开启了的第二个阀允许废培养基流入所述废培养基转移腔室，而第一个阀在十二点钟的位置上是开启的，以便将培养基释放到第三筒形腔室中。
4.如权利要求1的滚瓶系统，其中，所述第一和第二筒形腔室是通过结合凸形结合部件和凹形结合部件相互连接在一起的，其中，每一个部件环绕提供通向第二筒形腔室的空气入口的口和导管。
5.如权利要求1的滚瓶系统，其中，所述控制装置包括重力传感器开关，第一和第二电磁阀，其中，第一电磁阀可操作地与第一和第二磁铁连接，第二电磁阀可操作地与第三磁铁连接。
6.如权利要求1的滚瓶系统，还包括至少三个磁铁；至少两个磁铁位于与第二筒形腔室贴在一起的第三筒形腔室的内壁上；并且至少一个磁铁位于与第二筒形腔室贴在一起的第一筒形腔室的内壁上，所述至少三个磁铁是作为与可操作地与第一和第二电磁阀的磁铁相对的磁铁定位的。
7.如权利要求1的滚瓶系统，其中，第一和第二电磁阀中的一个或两个是开启的，并且，其中，一个或多个可操作地连接的磁铁与一个或多个相对的磁铁构成了磁场，由一个或多个相对的磁铁打开一个或多个控制阀。
8.如权利要求7的滚瓶系统，其中，所述第一电磁阀是通过传感器启动的。
9.如权利要求8的滚瓶系统，其中，所述传感器监测pH的改变。
10.如权利要求8的滚瓶系统，其中，所述传感器监测细胞产物浓度的改变。
11.如权利要求10的滚瓶系统，其中，所述细胞产物是氨离子。
12.如权利要求7的滚瓶系统，其中，所述第二电磁阀是由重力敏感型座席开关启动的。
13.如权利要求12的滚瓶系统，其中，所述重力敏感型座席开关选自水银倾斜开关或均重杆开关。
14.如权利要求7的滚瓶系统，其中，所述启动的第二电磁阀打开了所述控制阀，由它启动生长培养基从第二筒形腔室向所述废培养基转移腔室中的转移。
15.如权利要求1的滚瓶系统，其中，所述控制装置位于第二腔室的外侧，以便所述控制阀能够直接以位置依赖形式启动。
16.如权利要求1的滚瓶系统，其中，所述阀包括生理化学响应型水凝胶。
17.一种用于细胞和组织培养的方法，包括以下步骤：
A)将生长培养基导入如权利要求1的滚瓶系统的第一筒形腔室，并且将细胞或组织导入第二筒形腔室，
B)通过使所述滚瓶绕它的纵向轴线旋转培养所述细胞或组织，
C)使新的生长培养基从第一筒形腔室流入第二筒形腔室，
D)监测第二筒形腔室中的细胞或组织培养物参数，并且在测定到预定的阈值细胞或组织培养参数时，使得废培养基从第二筒形腔室流入第三筒形腔室。
18.如权利要求17的方法，其中，步骤C)包括在旋转期间将生长培养基通过开口从第一筒形腔室导入第一转移腔室，其中，所述新培养基转移腔室包括壁，和提供了与第二筒形腔室的受控制的流体连通的所述口，并且，其中，当所述滚瓶处在六点钟的位置时，所述阀是闭合的，导致所述新培养基转移腔室容纳并且保留培养基，而在十二点钟的位置上启动，以便将保留的培养基释放到第二筒形腔室中。
19.如权利要求17的方法，其中，步骤D)包括在滚瓶旋转期间根据所述传感器的信号通过由第一个阀控制的开口将废培养基从包括阈值信号传感器的第二筒形腔室导入废培养基腔室中，其中，所述废培养基转移腔室包括壁，控制所述开口以提供与第三筒形腔室和所述口的受控制的流体连通的第二个阀，并且，其中，当所述滚瓶处在六点钟的位置上时，第二个阀是闭合的，导致第二转移腔室容纳并且保留培养基，只有在满足细胞或组织培养物参数值阈值时，所述第一个阀才启动到六点钟的位置的开放状态，使得用废培养基充满所述废培养基转移腔室，并且所述第二个阀在十二点钟的位置上开启，以便将废培养基释放到第三筒形腔室中。
20.如权利要求17的方法，其中，所述细胞或组织结合在表面上。
21.如权利要求17的方法，其中，所述细胞或组织结合在衍生化的表面上。
22.如权利要求17的方法，其中，所述细胞或组织结合在可除去的表面上。
23.如权利要求17的方法，其中，所述细胞或组织结合在可除去的衍生化的表面上。
24.如权利要求17的方法，还包括以下步骤：E)从所述滚瓶系统中回收细胞产物。
25.如权利要求24的方法，其中，所述回收步骤包括从第二和/或第三筒形腔室中取出细胞产物。
26.如权利要求17的方法，其中，所述细胞或组织培养物参数是pH或氨离子浓度。
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