DE60309178T2

DE60309178T2 - Verbessertes Rollflaschensystem zur Kultivierung von Zellen und Gewebe

Info

Publication number: DE60309178T2
Application number: DE60309178T
Authority: DE
Inventors: F. Neil Cary ROBBINS
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 2002-08-08
Filing date: 2003-08-04
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2023-08-05
Also published as: US20040029264A1; EP1527158A2; AU2003298541A1; US6841384B2; WO2004037969A2; EP1527158B1; JP2005535354A; BR0313314A; ZA200501669B; ES2271694T3; WO2004037969A3; ATE342958T1; CN1675351A; KR20050028919A; DE60309178D1; CN1298835C; CA2494584A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Sachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen das Kultivieren von Zellen und insbesondere eine Mehrkammer-Rollflasche, die zur Herstellung von Zellprodukten geeignet ist.
Beschreibung des Standes der Technik
Rollflaschen werden routinemäßig für das Züchten von Zellen und die Herstellung von Zellprodukten verwendet. Das Kultivieren von Zellen erfolgt nachdem die Rollflasche in eine rotierende Vorrichtung, beispielsweise Roller-Cell 40^TM von Synthecon, Inc. oder R₂P Roller Culture Apparatus^TM von Zinsser Analytic, Ltd. (UK), eingesetzt wurde.
Es besteht anhaltender Bedarf an der Verbesserung der Zellkultureffizienz und der Produkterträge. Im allgemeinen werden die Kultur- oder Produktherstellungsbedingungen für einen Zelltyp empirisch optimiert. Es existieren andere Ansätze zum Bestimmen der Betriebsparameter. Sodann wird üblicherweise ein Rückkopplungssteuermechanismus verwendet, um sicherzustellen, dass die Bedingungen innerhalb der optimierten Parameter gehalten werden. Einige dieser Rückkopplungssteuersysteme können komplex oder nicht einfach an Rollflaschenkultursysteme anpassbar sein. Siehe beispielsweise die US-Patente 4 839 292 und 6 323 022.
Überblick über die Erfindung
Die Erfindung schafft ein fortentwickeltes Rollflaschensystem (Advanced Roller Bottle System ARBS) für das Kultivieren von Zellen, das wirksam, kontinuierlich und automatisch verbrauchte Medien mit frischen Medien auffüllt. AEBS optimiert die Mediennutzung durch das Entfernen verbrauchter Medien als Antwort auf eine vorbestimmte Zustandsänderung und durch das Ersetzen der verbrauchten Medien durch frische.
Das ARBS-System umfasst eine Mehrkammer-Flasche, in welcher die Kammern zylindrisch sind und in geregelter gegenseitiger Fluidverbindung stehen. Bei einem Ausführungsbeispiel ist eine erste zylindrische Kammer ein Reservoir für Frischmedien, eine zweite zylindrische Kammer ist eine Zell- oder Gewebewachstumskammer, und eine dritte zylindrische Kammer ist ein Reservoir zum Aufnehmen verbrauchter Medien. Die Fluidverbindung zwischen den Kammern erfolgt über Transferkammern und die Steuerung erfolgt über Ventilbetrieb. Die Fluidverbindung zwischen der ersten und der zweiten Kammer ermöglicht ein kontrolliertes Hinzufügen von neuen Medien sobald ein Betriebsparameter erreicht wird. Die Fluidverbindung zwischen der zweiten und der dritten Kammer ermöglicht das Abziehen von Medium aus der zweiten Kammer, sobald es verbraucht ist oder eine Schwellenkonzentration an Zellprodukten erreicht ist.
Die Fluidverbindung wird durch eine Gruppe von Steuerventilen geregelt oder gesteuert, die sich in Ports zwischen den zylindrischen Kammern befinden. Das Öffnen und Schließen der Steuerventile ermöglicht das Fließen von Medium aus einer zylindrischen Kammer durch die Transferkammer in die nächste. Die Frischmediumtransferkammer kann zwischen der ersten und der zweiten zylindrischen Kammer angeordnet sein oder Bereiche einer oder mehrerer dieser Kammern umfassen. Ähnlich kann die Kammer für verbrauchte Medien zwischen der zweiten und der dritten zylindrischen Kammer angeordnet sein oder Bereiche einer oder mehrerer dieser Kammern umfassen.
Bei einem Ausführungsbeispiel dreht sich die Rollflasche im Uhrzeigersinn oder entgegen dem Uhrzeigersinn um ihre Drehachse, wodurch Medium durch Schwerkraft von einer Kammer in die nächste überführt wird.
Die Frischmediumtransferkammer schöpft und hält ein vorbestimmtes Volumen an Frischmedium aus der ersten zylindrischen Kammer während sich das ARBS dreht. Das aufgenommene Medium wird bei Betätigung eines Ventils in die zweite Kammer ausgegeben. An der Sechs-Uhr-Position wird das Steuerventil, welches das Fließen des Mediums aus der zweiten zylindrischen Kammer in die Transferkammer für verbrauchte Medien ermöglicht, durch einen Elektromagneten geöffnet, der durch einen schwerkraftempfindlichen Positionsschalter betätigt wird.
Bei Beendigung einer 360°-Drehung von der anfänglichen Startposition (der "Zwölf-Uhr"-Position) werden das Steuerventil, welches das Eintreten des aufgenommenen Mediums in die zweite zylindrische Kammer ermöglicht, und das Steuerventil, welches das Fließen von Medium aus der Transferkammer für verbrauchte Medien in die dritte zylindrische Kammer ermöglicht, durch einen Elektromagneten geöffnet, der durch einen in einer Regelanordnung angeordneten Sensor aktiviert wird.
Der Sensor kann derart gewählt sein, dass jeder beliebige der Zell- oder Gewebekultivierung oder der Bildung eines angestrebten Produkts zugeordnete Parameter gemessen werden kann. In einem Ausführungsbeispiel mist der Sensor die Veränderung des pH-Werts.
In einem anderen Ausführungsbeispiel misst der Sensor die Veränderung der Ammoniakionenkonzentration.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel weist der Regler sowohl einen Sensor auf, der eine Veränderung des pH-Werts misst, als auch einen Sensor, der die Veränderung der Ammoniakionenkonzentration misst.
Die Regleranordnung weist ferner einen ersten und einen zweiten Elektromagneten auf, die in Wirkverbindung mit Magneten stehen. Der schwerkraftempfindliche Positionsschalter aktiviert den ersten Elektromagneten, der ein Magnetfeld zwischen dem wirksam mit diesem verbundenen Magneten und einem gegenüberliegenden Magneten herstellt, der sich in der Transferkammer für verbrauchte Medien befindet. Das von dem ersten Elektromagneten mit dem gegenüberliegenden Magneten gebildete Magnetfeld öffnet das Steuerventil, welches das Fließen von Medium aus der zweiten zylindrischen Kammer in die Kammer für verbrauchte Medien ermöglicht.
Der zweite Elektromagnet wird aktiviert, wenn der Sensor eine Veränderung der Mediumbedingungen in der zweiten zylindrischen Kammer erkennt und ein elektrisches Signal an den zweiten Elektromagneten sendet. Der zweite Elektromagnet erzeugt ein Magnetfeld zwischen mit diesem verbundenen Magneten und gegenüberliegenden Magneten, die in der Transferkammer für verbrauchte Medien und der Frischmediumtransferkammer angeordnet sind, wodurch Ventile geöffnet werden, die das Fließen von Medium aus der Frischmediumtransferkammer in die zweite zylindrische Kammer und das Fließen von Medium aus der Transferkammer für verbrauchte Medien in die dritte zylindrische Kammer ermöglichen.
Die Erfindung schafft ferner ein Verfahren zum Kultivieren von Zellen unter Verwendung des ARBS, bei dem Wachstumsmedium in die erste zylindrische Kammer eingebracht wird und Zellen oder Gewebe separat in die zweite zylindrische Kammer eingebracht werden. Die Zellen oder das Gewebe werden durch Drehen des ARBS in oder entgegen dem Uhrzeigersinn kultiviert.
Bei diesem Verfahren fließt neues Wachstumsmedium automatisch aus der ersten zylindrischen Kammer in die zweite zylindrische Kammer, und der pH-Wert oder die Zellproduktkonzentration in der zweiten zylindrischen Kammer kann überwacht werden. Wenn ein angestrebter pH-Wert oder Zellproduktkonzentrationswert durch den Sensor gemessen wird, betätigt der Sensor die Elektromagnete, welche die Steuerventile öffnen, wodurch verbrauchtes Medium aus der zweiten zylindrischen Kammer in die dritte zylindrische Kammer und neues Wachstumsmedium aus der ersten zylindrischen Kammer in die zweite zylindrische Kammer fließt.
Das Verfahren kann ferner einen Wiedergewinnungsschritt umfassen, in dem Zellprodukte aus der zweiten oder dritten Kammer des ARBS Systems wiedergewonnen werden.
Zellprodukte umfassen ganze Zellen, Gewebe, Zellteile, abgesonderte Moleküle oder Produkte des Zellstoffwechsels.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt das erfindungsgemäße ARBS im zusammengesetzten Zustand. Die Bestandteile des in dieser Figur dargestellten zusammengesetzten Systems sind für ein elektromechanisches Ausführungsbeispiel der Erfindung beispielhaft.
2 ist eine vergrößerte Ansicht des oberen Bereichs des ARBS.
3 ist eine vergrößerte Ansicht des unteren Bereichs des ARBS. Die Bestandteile des in dieser Figur gezeigten Systems sind für ein elektromechanisches Ausführungsbeispiel der Erfindung beispielhaft.
Beschreibung der Erfindung
Das in der 1 dargestellte erfindungsgemäße ARBS kann allgemein durch drei Abteilungen gekennzeichnet werden: das Frischmediumreservoir (1), die Wachstumskammer (2) und das Reservoir für verbrauchte Medien (3). Ein konstanter Mediumfluss wird zwischen dem Frischmediumreservoir (1) bzw. dem Reservoir (2) für verbrauchtes Medium und der Wachstumskammer (2) automatisch mit Hilfe von federbelasteten Ventilen erreicht, die sich während einer 360°-Drehung des ARBS um seine Längsachse öffnen und schließen. Das Öffnen und Schließen dieser Ventile kann entweder elektromechanisch oder physiochemisch gesteuert werden.
Das ARBS ist ferner durch eine zweiteilige Anordnung gekennzeichnet, wie in den 2 und 3 dargestellt, wobei ein mit einem Spiralgewinde versehenes Element (15) in ein das Spiralgewinde aufnehmendes Element (16) eingeschraubt ist. In ähnlicher Weise kann das mit einem Spiralgewinde versehene Teil (15) aus dem das Spiralgewinde aufnehmenden Element (16) geschraubt werden, wodurch das ARBS demontiert und die Wachstumskammer (2) freigelegt wird. Der Fachmann mit routinierten Fertigkeiten ist in der Lage, alternative Montage- und Demontageeinrichtungen vorzusehen, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Klemmen, Clips, Befestigungen vom Typ männlicher/weiblicher Vorsprünge, Vakuumdichtungen, oder andere Mittel zum Befestigen eines Elements an einem anderen.
Die Wachstumskammer (2) ist der Hauptkultivierungsraum, in welchen Zellen oder Gewebe eingesetzt werden, in welchen frisches Kulturmedium aus dem Frischmediumreservoir (1) eingebracht wird, und aus dem verbrauchtes Medium in das Reservoir (3) für verbrauchte Medien ausgebracht wird.
Kulturmedien
Verschiedene Typen von Zellkulturmedien sind in Zusammenhang mit dem ARBS nützlich und sind über Online- und Katalog-Anbieter (beispielsweise GIBCO, Sigma und CellTech, Inc.) einfach erhältlich und können in einer Bandbreite von Volumina mit zahlreichen verschiedenen Nährstoffkombinationen, mit oder ohne Ergänzungsstoffen (beispielsweise Aminosäuren, Vitamine, Elektrolyte), oder mit oder ohne Zusatzstoffen wie Antibiotika und/oder Antioxidationsmitteln erworben werden. Es gehört zu den allgemeinen Fertigkeiten auf diesem Gebiet festzustellen, welcher Mediumtyp für ein spezifisches Zellkulturprotokoll basierend auf den zu kultivierenden Zell- oder Gewebetypen am besten geeignet ist.
Beispielsweise wird Dulbecco's Modifiziertes Eagel'sches Medium (DMEM) verbreitet als Kulturmedium eingesetzt, welches in vielfältiger Form erhältlich ist, einschließlich einer stark glukosehaltigen Zubereitung, einer schwach glukosehaltigen Zubereitung, und einer F-12 Zubereitung, die L-Glutamin und Pyridoxin-Hydrochlorid. DMEM ist ideal für das Unterstützen und Bewahren einer Vielzahl von Säugetierzelltypen geeignet. DMEM wurde ursprünglich für das Züchten von Mäuseembryonenzellen als Modifikation von Basal Medium Eagle (BME) Medien entwickelt, jedoch mit vierfachem Gehalt an Aminosäure und Vitaminkonzentration. Die schwach glukosehaltigen Formulierungen, 1,0 g/l, werden für das Aufrechterhalten hochdichter Kulturen und das Wachstum von Zellen in Agar empfohlen. Die stark glukosehaltigen Formulierungen, 4,5 g/l, werden weit verbreitet für verankerungsabhängige Zelltypen (beispielsweise Eizellen chinesischer Hamster oder Nierenzellen menschlicher Embryonen) verwendet (Dulbecco, R. et al., (1959) Virology 8: 396–397, und Smith, JD et al. (1960) Virology 12: 185, siehe auch Moton, Hj (1970) In Vitro 6: 89).
Ferner sind die folgenden Medientypen zur Kultivierung von Zellen oder Gewebe mit dem ARBS geeignet, welche hier als Beispiel und nicht als Einschränkung angeführt werden: Tabelle 1: Zellkulturmedien
In Vorrichtungen, die für hochdichte Zellkulturen ausgelegt sind (beispielsweise miniPERM^TM, Drehflaschen, Rollflaschen, oder Fermentierer), werden Zellen und Gewebe erheblichen Scherkräften ausgesetzt. Scherkräfte können entweder durch Regeln der Geschwindigkeit, mit welcher der Bioreaktor, d.h. eine Rollflasche, dreht, oder durch Hinzufügen von Anti-Scher-Ergänzungsstoffen in das Kulturmedium kontrolliert werden. Ein derartiger Ergänzungsstoff ist cellPROTECT^TM, das von VivaScience, AG erhältlich ist. Der Ergänzungsstoff cellPROTECT^TM erhöht die Viskosität des Mediums und schützt Zellen vor in der Kultur auftretender Scherkraft/-beanspruchung. Der Ergänzungsstoff cellPROTECT^TM wird dem Kulturmedium in einer Konzentration von ungefähr 0,05% bis ungefähr 0,1% des letztlichen Volumens beigegeben. Viskositätserhöhende Ergänzungsstoffe wie cellPROTECT^TM oder Medientypen mit hoher Viskosität können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, solange sie mit dem ARBS kompatibel sind und ihre Viskosität das Fließen von Medium durch die Ventile und zwischen den Kammern und Reservoirs nicht behindert.
ARBS Elektromechanische Anordnung
In einem Ausführungsbeispiel des ARBS, das in den 1 und 3 dargestellt ist, wird ein konstantes Auffüllen und Abführen von Medium durch das Fließen von Medium zwischen den Räumen mittels des Auffüllventils (11a), des Abführventils (13a) und des Abfalltransferventils (13b) erreicht. In diesem Ausführungsbeispiel werden die Ventile durch einen lösbaren Regler (12) elektromechanisch gesteuert, der einen pH- oder Ammoniakionensensor oder einen Sensor aufweist, der geeignet ist, sowohl Verschiebungen des pH-Werts, als auch Veränderungen der Ammoniakionenkonzentration zu erkennen. Der Regler (12) weist ferner einen oberen Elektromagneten (7b), einen unteren Elektromagneten (7a), einen Positionssensor und Reglermagneten (8a), (8b) und (8c) auf, die wie in 3 dargestellt in Wirkverbindung mit den Elektromagneten (7a) und (7b) stehen.
PH-Sensoren
Nach einem Ausführungsbeispiel des ARBS kann der Regler (12) einen pH-Sensor oder -Messer aufweisen, der den oberen Elektromagneten (7b) und den unteren Elektromagneten (7a) aktiviert, wie in den 1 und 3 dargestellt. Wenn beispielsweise der Regler (12) einen pH-Sensor oder -Messer aufweist, kann eine (nicht dargestellte) wegwerfbare pH-Sonde in der Wachstumskammer (2) angeordnet sein, welche über eine (nicht dargestellte) Öffnung der Oberflächenwand der Wachstumskammer (2) in Wirkverbindung mit dem Regler (12) steht (s. 3). Die wegwerfbare pH-Sonde ist von dem Regler (12) lösbar, derart dass der Regler (12) wiederverwendet werden kann, während der Rest der ARBS-Anordnung wegwerfbar ist.
Vorrichtungen zum Messen des pH-Werts in einer Flüssigkeit sind bekannt. Glassensoren mit Elektroden vom Membrantyp werden allgemein und zuverlässig als Standard für pH-Messungen verwendet (s. beispielsweise Ohkawa H., Tanpakushitsu Kakusan Koso [Japanisch] (1998) 43(3): 272–80, und Moore E.W., Gastroenterology (1968) 54(4) 501–7). Nicht aus Glas bestehende Sensoren sind ebenfalls als Bestandteile des Reglers (12) nützlich und werden üblicherweise unter Verwendung von Lösungsmittel-Polymermembranen hergestellt (beschrieben in Pretsch et al., (1986) Anal. Chem. 38: 2285–2289, durch Bezugnahme Teil des Gegenstandes der vorliegenden Anmeldung). In die Kategorie der nicht aus Glas bestehenden Sensoren fallen diejenigen mit planaren Konfigurationen, die üblicherweise kleiner als Glassensoren und erheblich kostengünstiger in der Herstellung und im Betrieb sind. Beispiele für planare Sensoren finden sich in den US-Patenten 5 554 272 an Benco und 5 702 575 an Foos, die durch Bezugnahme in ihrer Gänze Teil des Gegenstands der vorliegenden Anmeldung sind. Instrumente, die planare Sensoren enthal ten, sind im Handel erhältlich. Das planare Format der Sensoren weist üblicherweise relativ dünne Materialschichten auf, die auf Substratbase mittels Dickfilm- oder Dünnfilmverfahren, einschließlich beispielsweise Siebdruck, aufgebracht werden. Das als Substrat verwendete Material kann Al₂O₃ oder Ta₂O₅, das durch PLD (Laserimpulsablagerung) aufgebracht wird, oder Si₃N₄ sein, das durch PECVD (plasmagestütztes chemisches Aufdampfen) und LPCVD (chemisches Aufdampfen bei Niederdruck) auf Silizium-Feldeffekt-Strukturen aufgebracht wird. Beide Sensortypen weisen eine hohe pH-Empfindlichkeit und eine langfristige Stabilität im Betrieb auf. Darüber hinaus ist ein Polyanilin-Film als hochempfindlicher planarer pH-Indikator geeignet (Takenaka, Y. et al. (1990) Chemical Sensors 6 (Supplement A): 77–80, und Takenaka, Y. et al., 81–84, sowie Shinohara, H. et al., Chemical Sensors 6 (Supplement A): 85–88).
Wenn beispielsweise DMEM das für die Zell- oder Gewebekultur gewählte Medium ist, beträgt der typische optimale pH-Wert ungefähr 7,4 bis ungefähr 7,5. Der pH-Sensor des Reglers (12) ist vorzugsweise so kalibriert, dass er auf pH-Wertänderungen unter ungefähr 7,4, vorzugsweise unter ungefähr 7,2, mehr bevorzugt unter ungefähr 7,0 und meist bevorzugt unter ungefähr 6,8 reagiert.
Das ARBS kann ferner Zellkulturen von Explantaten (Primärzellen) unterstützen, die direkt einem lebenden Organismus, vorzugsweise einem Säugetier und höchst bevorzugt einem Menschen, entnommen sind (Biopsiematerialien oder Aspirationen). Diese Zellkulturen bestehen aus Populationen gemischter Zelltypen. Der optimale pH-Wert für das Kultivieren von Primärzellen liegt bei ungefähr 7,0, und der in dem Regler (12) enthaltene pH-Sensor ist vorzugsweise derart kalibriert, dass er für das Kultivieren von Primärzellen Verschiebungen des pH-Werts unter ungefähr 7,0, vorzugsweise unter ungefähr 6,9 und höchst bevorzugt unter ungefähr 6,8 erkennt.
Es fällt in den Rahmen der üblichen Fachkenntnis einen pH-Messer zu kalibrieren und die optimalen pH-Bereiche zu bestimmen, welche verwendete spezifische Zellkulturprotokolle oder Zell- oder Gewebetypen tolerieren, und somit ist der Regler (12) in seiner Anwendung nicht auf ein bestimmtes Zellkulturprotokoll oder einen bestimmten Zell- oder Gewebetyp beschränkt.
Ammoniakionensensoren
Der Regler (12) kann ferner einen Sensor für Ammoniakionen (NH₃) aufweisen, um die Wachstumsbedingungen in der Wachstumskammer (2) zu analysieren. Ammoniakionensenoren können Polmermembranenelektroden umfassen, die die aus verschiedenen Ionenaustauschmaterialien in einer inerten Matrix wie poröses Teflon^TM, Polyvinylchlorid (PVC), Polyethylen oder Silikongummi besteht. Nach dem Bilden der Membran wird diese an dicht an dem Ende eines PVC-Rohres angebracht. Elektroden dieses Typs umfassen Kalium, Calcium und Mitrat.
Ammoniakionensensoren mit Festzustandselektroden verwenden relativ unlösliche anorganische Salze in einer Membran. Festzustandselektroden existieren in homogener oder heterogener Form. Bei beiden Typen werden aufgrund des Ionenaustauschvorgangs Potentiale an der Membranfläche erzeugt. Beispiele für Festzustandselektroden sind unter anderem Silber/Sulfid, Chlorid und Fluorid.
Ammoniakionensensoren mit Gaserkennungssensoren sind für das Messen von Ammoniak, Kohlendioxid, Stickoxid und Schwefeldioxid erhältlich. Diese Elektroden haben eine gasdurchlässige Membran und eine innere Pufferlösung. Der pH-Wert der Pufferlösung verändert sich in Reaktion auf Gas. Die Veränderung wird durch eine pH-Sensor-Kombination in dem Gehäuse erkannt. Aufgrund des Aufbaus erfordern Gaserkennungselektroden keine externe Referenzelektrode.
Bei diesem Ausführungsbeispiel werden zu kultivierende Zellen oder Gewebe in die Wachstumskammer (2) eingesetzt. Zellen und Gewebe können direkt in die Wachstumskammer (2) eingesetzt werden, deren Innenflächen optional derivatisiert sein können, oder sie können über ein Gestell einge bracht werden, das mit den Zellen oder dem Gewebe versehen ist. Um das Einsetzen der Zellen oder des Gewebes in die Wachstumskammer (2) zu vereinfachen, wird das ARBS vorzugsweise an der Grenzfläche zwischen dem Spiralgewindeteil (15) und dem Spiralgewindeaufnahmeteil (16) getrennt (aufgeschraubt).
Derivatisierte Innenfläche der Wachstumskammer
Die Innenfläche der Wachstumskammer (2) kann optional durch auf diesem Gebiet bekannte Verfahren derivatisiert sein, um das Anhaften der Zellen zu erleichtern. Die Innenfläche der Wachstumskammer kann mit Amino-, aktiven Halo-, Hydroxy- oder Thiolgruppen oder einem substituierten N-Hydroxymethylacetamid derivatisiert sein, wobei der Substituent ein aktives Halogen oder Pseudohalogen ist. Proteine oder lineare Peptide können gebunden werden, indem die Proteine oder linearen Peptide in einem wässrigen Medium unter milden Bedingungen für eine Zeit, die zum Abschließen einer Derivatisationsreaktion ausreicht, mit einer funktionalisierten Fläche in Kontakt gebracht werden, welche aktives Halogen, aktivierte Carbongruppen, beispielsweise Ester und dergleichen, aufweist. Jede verbleibende Funktionsgruppe, die nicht reagiert hat, kann unter Verwendung eines geeigneten kleine Moleküle blockierenden Mittels blockiert werden. Aktive Halogene können beispielsweise durch aliphatische Amine, Thiole durch Maleimide oder dergleichen blockiert werden. Bei einigen Ausführungsbeispielen ist es unter Umständen nicht erforderlich, überschüssige Reaktionsgruppen zu blockieren, da sie die nachfolgenden Schritte des Derivatisierungsvorgangs nicht beeinträchtigen.
Wenn immunologische Zellen, beispielsweise B-Zellen, für die Kultur gewählt werden, kann die Innenfläche der Wachstumskammer (2) mit einem B-Zellen-Erkennungsantigen (beispielsweise CD20) oder mit einer spezifischen Bindung für lösbares Antigen derivatisiert werden, wobei ein derartiges Antigen den Zellen hinzugegeben werden kann, so dass die Zellen, welche Oberflächen-Immunoglobuline aufweisen, welche das Antigen erkennen, das Antigen binden, um einen Komplex zu bilden, der endozytiert und verarbeitet wird.
Ein Fragment der Zelle, welches das MHC Antigen der Zelle aufweist, liegt vor. Durch hinzugeben von T-Zellen in das Medium, die durch die B-Zellen eingeschränkt sind, scheiden T-Zellen, welche das Antigenfragment erkennen, Lymphokine ab, was zu einer Vermehrung der B-Zellen führt.
Zellkultivierung unter Verwendung eines elektromechanischen Ausführungsbeispiels des ARBS
Beim Implantieren wird das ARBS in eine Rollvorrichtung eingesetzt, in der es um seine Längsachse dreht. Ein (nicht dargestellter) schwerkraftempfindlicher Positionsschalter erkennt, dass sich das ARBS gegenüber seiner Ausgangsposition (im folgenden als die "6-Uhr-Position" bezeichnet) um 180° gedreht hat. Der schwerkraftempfindliche Positionsschalter kann beispielsweise ein Quecksilber-Neigungsschalter oder ein gewichteter Hebelschalter sein.
Quecksilber-Neigungsschalter (oder "Kippschalter") beruhen auf einem einfachen Aufbau ohne andere bewegbare Teile als verschiebbares Quecksilber. Diese Schalter sind geringem mechanischem Verschleiß ausgesetzt und haben eine lange Lebensdauer bei durchschnittlicher Betätigungshäufigkeit von mehreren zehn Millionen Mal (Durakool, DANA, vertrieben von American Electronic Components).
Nicht auf Quecksilber basierende "Kippschalter" können ebenfalls als Rotationssensoren verwendet werden. Ein derartiger Nicht-Quecksilber-Schalter ist von Comus erhältlich, weist ein Gehäuse von 0,360" × 0,310" auf, und ist für einen Betrieb im Temperaturbereich zwischen –37 bis 100°C geeignet (ebenfalls erhältlich von Durakool, DANA).
Wenn der Regler (12) in der Sechs-Uhr-Position eine Veränderung des pH-Werts oder eine Veränderung der Ammoniakionenkonzentration oder beides in dem Medium der Wachstumskammer (2) erkennt, die einen vorbestimmten Schwellenwert übersteigt, sendet der Regler (12) ein elektrisches Signal, welches den unteren Elektromagneten (7a) aktiviert. Der aktivierte untere Elektromagnet (7a) wirkt auf den Reglermagneten (8a) ein, wodurch ein Magnetfeld mit dem gegenüberliegenden inneren Magneten (9a) gebildet wird. Der innere Magnet (9a) bewirkt wiederum das Zusammenziehen einer Feder in dem Abfalltransferventil (13b), wodurch das Ventil geöffnet wird. Das geöffnete Abfalltransferventil (13b) ermöglicht das Fließen von Medium aus der Wachstumskammer (2) in die Abfalltransferkammer (6).
Die Abfalltransferkammer (6) hat die Kapazität, das gesamte Mediumvolumen in der Wachstumskammer (2) aufzunehmen, üblicherweise etwa 15 ml. In der 6-Uhr-Position kann die Abfalltransferkammer (6) falls gewünscht vollständig gefüllt werden, wird jedoch vorzugsweise zu ungefähr 6%, mehr bevorzugt zu ungefähr 7% des Fassungsvermögens, und höchst bevorzugt zu ungefähr 8% des Fassungsvermögens gefüllt. Die Zeitdauer des Transfers von verbrauchtem oder frischem Medium von einer Kammer in die nächste hängt teilweise von der Größe des Lochs zwischen den Kammern ab. Der Elektromagnet ist während der gesamten 30 Grad der "6- und 12-Uhr"-Positionen offen. Der Zeitraum, in dem diese Position offen ist, hängt von der Drehgeschwindigkeit der Vorrichtung ab.
Wenn das ARBS eine Umdrehung (360° von der Ausgangsposition, im folgenden als die "12-Uhr"-Position bezeichnet) beendet, nimmt die Frischmediumkammer (5) ungefähr 8 ml, vorzugsweise ungefähr 9 ml und meist bevorzugt ungefähr 10 ml Frischmedium aus dem Frischmediumreservoir (1).
In der 12-Uhr-Stellung wird der obere Elektromagnet (7b) durch elektrische Signale des Reglers (12) aktiviert und wirkt auf die Reglermagnete (8b) und (8c) ein. Der Reglermagnet (8c) bildet ein Magnetfeld mit dem gegenüberliegenden inneren Magneten (9c), wodurch das Abführventil (13a) geöffnet wird und das verbrauchte Medium, das in der 6-Uhr-Position in die Abfalltransferkammer (6) gelangt ist, in das Reservoir (3) für verbrauchtes Medium ausgegeben wird. Gleichzeitig aktiviert der obere Elektromagnet (7b) ferner den Reglermagneten (8b), wodurch ein Magnetfeld mit dem gegenüberliegenden inneren Magneten (9b) gebildet wird. Der innere Magnet (9b) drückt die Feder (10) mittels eines Stößelteils (11c) nieder, wodurch der Arm 11b) entlang der horizontalen Achse des ARBS gedrückt und so das Auffüllventil (11a) geöffnet wird. Das geöffnete Auffüllventil (11a) ermöglicht es dem aufgenommenen Medium aus der Frischmediumtransferkammer (5) in die Wachstumskammer (2) zu gelangen.
Für ein korrektes Wachstum erfordern Zell- und Gewebekulturen Belüftung. Während des Drehens des ARBS wird die Wachstumskammer (2) durch das Belüftungsrohr (4) belüftet, welches die Wachstumskammer (2) mit der vorzugsweise sterilen Umgebungsluft verbindet. Wie in den 1 und 2 dargestellt, erstreckt sich das Belüftungsrohr (4) durch das Frischmediumreservoir (1) und ragt durch den Schraubdeckel (17), wo es durch die belüftete Kappe (18) der Umgebungsluft ausgesetzt ist.
Das ARBS führt vorzugsweise eine Umdrehung bis zum Gleichgewicht durch, bevor der Regler (12) eine weitere Messung durchführt.
Weitere Teile der ARBS-Anordnung umfassen die Rohrkappe (14a), welche das Ersetzen von Frischmedium in dem Frischmediumreservoir (1) oder das Hinzufügen von Additiven, Nährstoffen, Wachstumsfaktoren und dergleichen ohne Demontieren des Systems ermöglicht, und die Rohrkappe (14b), welche das Abführen von verbrauchtem Medium aus dem Reservoir (3) für verbrauchtes Medium ohne Demontieren des Systems ermöglicht. Beide Rohrkappen (14a) und (14b) können während des Gebrauchs des ARBS mit (nicht dargestellten) geeigneten Schraubdeckeln abgedeckt sein.
Das aus dem Reservoir (3) für verbrauchte Medien durch die Rohrkappe (14b) abgeführte Medium kann entweder weggeworfen oder aufbewahrt werden. Bei einigen Zellkultivierungsverfahren, welche das ARBS verwenden, wird verbrauchtes Medium aufbewahrt, um gewünschte Zellprodukte zu nutzen, die während des Zellwachstums und des Zellstoffwechsels abgesondert wurden. Im vorliegenden Zusammenhang bezeichnet der Ausdruck "Zellprodukte" vollständige Zellen oder Gewebe oder jede Substruktur derselben (bei spielsweise Zellorganellen oder -membranen), abgesonderte Ionen, abgesonderte Verbindungen, abgesonderte Moleküle, Antikörper oder andere Immunoglobine, Antigene, Proteine, Cytokine, Hormone, organische Verbindungen, pharmazeutische Verbindungen, oder andere Biomoleküle von Interesse. Zellprodukte umfassen auch diejenigen Substanzen (beispielsweise Ionen), die von einem in dem Regler (12) enthaltenen Sensor erkannt werden, wobei deren Erkennung das Fließen von Medium zwischen den Kammern des ARBS bewirkt. Diese Zellprodukte können aus dem verbrauchten Medium gewonnen werden, das aus dem Reservoir (3) für verbrauchte Medien gesammelt wird.
Die Innenfläche der Wachstumskammer (2) kann derivatisiert sein, um die Zellanbindung zu erleichtern. Ferner können auch Partikel oder ein Gestell für das Anbringen von Zellen oder Gewebe verwendet werden. Diese Partikel, beispielsweise Kugeln, oder das Gestell kann derivatisiert sein. Die bevorzugte Form des Gestells ist diejenige eines zylindrischen blockartigen Teils, das einfach in die Wachstumskammer (2) eingesetzt und daraus entfernt werden kann. Andere Formen, die einfach in die Wachstumskammer (2) eingesetzt oder aus dieser entnommen werden können, fallen ebenfalls in den Rahmen der Erfindung, beispielsweise ein scheibenförmiges Gestell. Der offenporige Schaum dieses Gestells ist dahingehend besonders erwünscht, dass die Struktur ein einfaches Spülen und Lösen von Zellen unter Verwendung verschiedener bekannter Zellwiedergewinnungsverfahren und -materialien ermöglicht.
Ein geeigneter Mechanismus zum Spülen und Lösen von Zellen von dem Gestell verwendet eine Lösung, die ein proteolytisches Enzym wie Trypsin verwendet. Andere geeignete Mechanismen zum Lösen von Zellen umfassen Ultraschallbehandlung oder das Bewegen, solange die auf die Zellen aufgebrachte Kraft keine Lysis bewirkt. Wenn die Zellen jedoch letztlich in Extraktionsassays verwendet werden (beispielsweise um intrazelluläre Zellprodukte, Metaboliten, oder Zellmembranoberflächenmoleküle oder Reste zu isolieren), ist das Verhindern von Lysis weniger wichtig. Dem Fachmann ist ersichtlich, dass, je nach der letztlichen Verwendung der kultivierten Zellen, jedes be kannte Verfahren zum Spülen und Lösen der Zellen von dem Gestell geeignet ist.
ARBS Physiochemische Anordnung
Bei einem anderen Ausführungsbeispiel kann das ARBS durch Ersetzen des Reglers (12) durch ein pH-Hydrogel ausgebildet werden, wodurch das gesamte ARBS wegwerfbar wird.
Bei dem physiochemischen Ausführungsbeispiel des ARBS bringt das Ausdehnen und das Zusammenziehen des pH-Hydrogels in Reaktion auf pH-Verschiebungen eine Kraft auf das Auffüllventil (11a), das Abführventil (13a) und das Abfalltransferventil (13b) auf, so dass diese öffnen und schließen.
Die hier verwendeten pH-Hydrogels sind Polymermaterialien, die in Wasser und anderen Lösemitteln quellen, wobei sie das Fluid in dem Polymernetzwerk ohne Auflösen absorbieren. Hydrophile Hydrogels haben im Gleichgewicht einen hohen Wassergehalt und eine gute Biokompatibilität. pH-empfindliche Hydrogels sind die am ausführlichsten untersuchten hydrophilen Hydrogels. Die pH-empfindlichen Hydrogels werden zur Bildung eines stabilisierten Gels mit mehreren Arten von Vernetzungskräften, wie covalente Bindungen, Wasserstoffbindungen, oder hydrophobe Interaktionen, vernetzt. Acidische Hydrogels werden definitionsgemäß ionisiert und schwellen somit bei hohen pH-Werten, bzw. sind sie bei niedrigen pH-Werten ungeladen und schwellen nicht. Das Schwellverhalten eines basischen Hydrogels hat die entgegengesetzte Abhängigkeit von dem pH-Wert, wodurch es zur Anwendung in dem ARBS geeignet ist. Die pH-Empfindlichkeit wird durch anhängige acidische und basische Gruppen wie Carbonsäure, Schwefelsäure, primäre Amine und quaternäre Ammoniumsalze. Carbonsäuregruppen sind beispielsweise bei hohen pH-Werten geladen und bei niedrigen pH-Werten ungeladen, während das Umgekehrte für primäre Amingruppen und quaternäre Ammoniumsalze gilt. Der Übergangs-pH-Wert für eine bestimmte anhängige Gruppe ist durch den pKa-Wert für diese anhängige Gruppe bestimmt. Durch das Wählen von an hängigen Gruppen mit den geeigneten pKa-Werten kann ein hydrophiles Hydrogel konstruiert werden, das in Reaktion auf einen beliebigen pH-Stimulus, der zu Veränderungen in den Eigenschaften eines Gels führt, reversibel ionisierbar ist (der pH-Bereich hängt von dem bestimmten gewählten Zelltyp oder dem angestrebten Zellprodukt ab.) Das Hydrogel wird für den angestrebten Ziel-pH-Bereich gewählt, vorzugsweise mit einem in dem Ziel-pH-Bereich auftretenden schnellen Schwell-/Abschwellübergang. Die Position des Hydrogels und der Ventile ist entscheidend und ein externer Magnet, der an dem Rollvorrichtungsgestell angebracht werden muss, ist als Positionssensor erforderlich.
Die bevorzugten pH-empfindlichen Hydrogels sind aus einer Vielzahl von Polymerverbindungen abgeleitet, wie beispielsweise: Poly(alkylacrylat), Poly(acrylmethacrylat), Poly(2-Hydroxymethylmethacrylat) (HEMA), Poly(2-Hydroxypropylmethacrylat) (HPMA), Poly(acrylamid), Poly(N-Vinylpyrrolidon), Poly(vinylalkohol) (PVA), Polyethylenoxid (PEO), Poly(etherurethan) und Polyelektrolyt. Die zum Synthetisieren der genannten Homopolymere verwendeten Monomere können auch in verschiedenen Kombinationen zum Bilden von Copolymeren verwendet werden. pH-empfindliche Hydrogels, die aus diesen Polymeren gebildet wurden, dehnen sich reversibel und ziehen sich reversibel zusammen, wenn Säure und Alkali abwechselnd zugegeben werden. Es hat sich gezeigt, dass die Reaktion auf eine Veränderung des pH-Werts nach abrupten Veränderungen des pH-Werts bei Poly(methyl Methacrylat-co-N.N-Dimethylaminoethylmethacrylat)-Hydrogels schnell und reversibel sein kann. Dem Fachmann ist bekannt, wie mehrere Polymere zur Bildung von pH-empfindlichen Verbundhydrogels zu kombinieren sind.
Die Gleichgewichtsgrade des Schwellens und die Konformationsveränderungen von pH-empfindlichen Hydrogels werden durch mehrere Faktoren beeinflusst, wie die Ladung des ionischen Monomers, dem pKa der ionisierbaren Gruppe, den Konzentrationen ionisierbarer anhängiger Gruppen in dem Netzwerk, dem pH-Wert, der ionischen Stärke, der dielektrischen Konstante des Mediums, der Vernetzungsdichte, der Hydrophilie und der Hydrophobie des Polymer-Hauptstrangs. Diese Faktoren sind in Helle, B. et al., pH-Sensitive Hydrogel; Characteristics and Potential in Drug Delivery in Properties, Preparation, and Application (Eds. Harland et al.) 1992.
Die Ladung des ionischen Monomers beeinflusst die Konformationsveränderungen pH-empfindlicher Hydrogels. Ein acidisches Hydrogel ist bei niedrigen pH-Werten ungeladen, ionisiert jedoch bei hohen pH-Werten. Somit erhöht sich der Gleichgewichtsgrad des Schwellens, wenn der pH-Wert in einem anhängige acidische Gruppen enthaltenden Hydrogel erhöht wird. Das Schwellen des Hydrogels steht in umgekehrter Abhängigkeit von dem pH-Wert. Auf Methacrylsäure, Sulfoxyethylmethacrylat, HEMA oder HPMA basierende Hydrogels werden allgemein zur Gewinnung acidischer, basischer und amphlytischer Gels verwendet. Das Schwellen als Funktion des Typs der ionischen Gruppe ist untersucht worden (Chen, L.L. et al. (1998) Pharm. Dev. Technol. 3(2):241–9).
der pKa-Wert anhängiger ionisierbarer Gruppen in dem Gel beeinflusst die pH-Schwellkurve (Chen, s.o.). Eine Verringerung des kPa-Werts einer basischen ionisierbaren Gruppe verschiebt die Kurve in Richtung eines geringeren pH-Werts. Es wurde aufgezeigt, dass die Schwellreaktion bei einem pH-Wert nahe dem pKa-Wert der ionisierbaren Gruppe des Hydrogels am pH-empfindlichsten ist (Eichenbaum, G.M. et al. (1998) Macromolecules 31(15): 5084–93). Die Konzentration an ionisierbaren Monomeren in dem Hydrogel ist für das Schwellen und die pH-Empfindlichkeit des Gels bedeutsam. Dieser Effekt hängt von der relativen Hydrophilie des ionisierbaren Monomers im Vergleich mit dem neutralen Copolymer zusammen. Die Hydrophobie und die Hydrophilie des Hauptstrangs des pH-empfindlichen Polymers beeinflusst das Schwellen. Es hat sich gezeigt, dass ein Erhöhen der Hydrophobie des Polymerhauptstrangs die pH-Empfindlichkeit des Copolymers Poly(n-Alkylmethacrylat-Co-N,N-Dimethylaminoethylmathacrylat) und des Copolymers Styrol und 4-Vinyl-Pyridin (VP) verringert. Die Pufferzusammensetzung und die ionische Stärke beeinflussen das Schwellen der pH-empfindlichen Hydrogels. Gegenionen schirmen Ladungen der polymeren Hauptstränge ab.
Die Konzentration an Ionen innerhalb und außerhalb des Gels ist gleich, wie auch der osmotische Druck in den Gel abnimmt, wenn die Konzentration von Ioenen außerhalb des Gels zunimmt. Ein mehrwertige Ionen enthaltender Puffer ist in der Lage, mehrere Ladungen in dem Gel zu neutralisieren. Die Vernetzungsdichte ist für pH-empfindliches Schwellen wichtig. Eine erhöhte Vernetzungsdichte begrenzt den Gleichgewichtsgrad des Schwellens. Dieser Effekt ist stärker, wenn das Gel durch eine Änderung des pH-Werts ionisiert wird. Die Netzwerkeigenschaften der Hydrogels werden hauptsächlich durch die Synthesevariablen, insbesondere die chemische Zusammensetzung und die Vernetzungsdichte beeinflusst (Chen, s.o., siehe auch Mandal, T.R. et al. (2000) Pharm. Dev. Technol. 5(4): 555–60).
Die bevorzugten pH-empfindlichen Hydrogelventile umfassen Copolymere, die aus verschiedenen Arten von aus Methacrylat abgeleiteten Monomeren durch Polymerisation mit freier Radikalenlösung synthetisiert sind. Diese Copolymere sind feste, flexible Polymere anstatt weicher Gels; sie sind in hohem Maß biokompatibel; und sie sind inert und nicht abbaubar, so dass sie ideal für Rollflaschen wie das ARBS sind, das stetig Scherbeanspruchungen durch die Bewegung des Mediums zwischen den Kammern ausgesetzt ist. Beispielsweise nimmt das Schwellen der Gels, bei denen es sich um Copolymere von N,N-Diethylaminoethylmethacrylat (DEAMA) und 2-Hydroxypropylmethylacrylat (HPMA) handelt, mit dem abnehmenden pH-Wert des Mediums zu. Dies wurde von Ishihara, K. et al. (1984) Poly J. 16: 625–631 aufgezeigt. Im Gegensatz dazu ist der Wassergehalt eines HEMA-Copolymers von dem pH-Wert des Mediums unabhängig. Somit resultieren Veränderungen des Wassergehalts mit dem pH-Wert des HPMA-Copolymerhydrogels aus dem Einbringen der DEAMA-Teils. Der DEAMA-Teil gilt als protoniert, wenn der pH-Wert des Mediums abnimmt, wodurch die Hydrophilie des DEAMA-Teils und des Hydrogels zunimmt. Der Wassergehalt des DEAMA und des HPMA-Copolymerhydrogels ist entsprechend den Veränderungen des pH-Werts reversibel.

Claims

Mehrkammer-Rollflaschensystem mit mindestens drei zylindrischen Kammern, mit: einer ersten zylindrischen Kammer, die zur Verwendung als Reservoir für ein Zellwachstumsmedium geeignet ist und mindestens vier Ports aufweist, wobei sich zwei Ports an einer Außenwand befinden, von denen einer einen Zugang zu einer Luftquelle und der andere einen generellen Zugang zu der ersten zylindrischen Kammer bildet, und wobei die anderen beiden Ports an einer Innenwand angeordnet sind, an der die erste und die zweite zylindrische Kammer aneinander angrenzen, wobei ein Port einen Zugang zu einer Luftquelle für die zweite zylindrische Kammer über eine Leitung bildet, welche mit dem Port an der Außenwand, der einen Zugang zur Luft bildet, verbunden ist, und der andere Port über ein Steuerventil eine steuerbare Fluidverbindung mit der zweiten zylindrischen Kammer bildet; einer zweiten zylindrischen Kammer, die für das Zell- oder Gewebewachstum geeignet ist und mindestens drei Ports aufweist, von denen zwei an derjenigen Seitenwand angeordnet sind, die an die erste zylindrische Kammer angrenzt, wobei ein Port coextensiv mit dem an der Innenwand der ersten zylindrischen Kammer befindlichen Port ist, der einen Zugang zur Luft bildet, und der andere Port mit dem Port der ersten zylindrischen Kammer ausgerichtet ist, der eine steuerbare Fluidverbindung bildet, und der dritte Port eine steuerbare Fluidverbindung mit einer dritten zylindrischen Kammer über ein Steuerventil bildet; einer dritten zylindrischen Kammer, die zum Aufnehmen von verbrauchten Medien geeignet ist und mindestens zwei Ports aufweist, von denen einer an einer Außenwand angeordnet ist, die an die zweite zylindrische Kammer angrenzt, und allgemeinen Zugang zu der dritten zylindrischen Kammer schafft, und der zweite Port mit dem dritten Port der zweiten zylindrischen Kammer ausgerichtet ist, der eine steuerbare Fluidverbindung mit der zweiten zylindrischen Kammer bildet; und einer Steuereinrichtung zum sequentiellen Betätigen der Ventile, um in vorbestimmten Drehpositionen der Kammern eine steuerbare Fluidströmung aus jeder der jeweiligen Kammern in die andere zu erzeugen; wobei die erste, zweite und dritte zylindrische Kammer derart miteinander verbunden sind, dass sie das Drehen der zylindrischen Kammern als Einheit um eine Drehachse ermöglichen, und wobei die Steuerung der Fluidverbindung das Einleiten von Wachstumsmedien aus der ersten zylindrischen Kammer in die zweite zylindrische Kammer und das Entfernen von verbrauchten Medien aus der zweiten zylindrischen Kammer in die dritte zylindrische Kammer ermöglicht.
Rollflaschensystem nach Anspruch 1, bei dem der Port, welcher die steuerbare Fluidverbindung zwischen der ersten zylindrischen Kammer und der zweiten zylindrischen Kammer bildet, ein Ventil aufweist, das die Fluidströmung durch den Port und eine in der ersten zylindrischen Kammer befindlichen Frischmediumtransferkammer regelt, wobei zwei der Wände der Frischmediumtransferkammer Teile der gebogenen Wand der ersten zylindrischen Kammer und der Innenwand sind, und wobei die Frischmediumtransferkammer Wachstumsmedien aus der ersten zylindrischen Kammer während des Drehens der Rollflasche aus einer Sechs-Uhr-Position in eine Zwölf-Uhr-Position schöpft und aufnimmt, wobei das Ventil in der Sechs-Uhr-Position geschlossen ist und in der Zwölf-Uhr-Position betätigt ist, um Medien in die zweite zylindrische Kammer auszugeben.
Rollflaschensystem nach Anspruch 1, bei dem der Port, welcher die steuerbare Fluidverbindung mit der dritten zylindrischen Kammer be wirkt, ein erstes Ventil, das die Fluidströmung durch den Port zu der dritten zylindrischen Kammer steuert, und eine in der dritten zylindrischen Kammer angeordnete Transferkammer für verbrauchte Medien aufweist, die verbrauchte Medien aus der zweiten zylindrischen Kammer empfängt, wenn ein zweites Ventil in Reaktion auf einen in der zweiten zylindrischen Kammer vorhandenen Sensor betätigt wird, wobei zwei der Wände der Transferkammer für verbrauchte Medien Teile der gebogenen Wand der dritten zylindrischen Kammer und der Innenwand sind, und wobei während des Drehens der Rollflasche von einer Sechs-Uhr-Position in eine Zwölf-Uhr-Position, wenn das erste Ventil geschlossen und das zweite Ventil in der Sechs-Uhr-Position betätigt ist, das betätigte zweite Ventil das Fließen verbrauchter Medien in die Transferkammer für verbrauchte Medien ermöglicht und das erste Ventil in der Zwölf-Uhr-Position betätigt ist, um Medien in die dritte zylindrische Kammer auszulassen.
Rollflaschensystem nach Anspruch 1, bei dem die erste und die zweite zylindrische Kammer durch Verbinden eines männlichen Anschlussteils mit einem weiblichen Anschlussteil miteinander verbunden sind, wobei jedes der Teile den Port und die Leitung umgibt, welche Luftzugang zu der zweiten Kammer bewirken.
Rollflaschensystem nach Anspruch 1, bei dem die Steuereinrichtung einen Schwerkraftsensorschalter, einen ersten und einen zweiten Elektromagneten aufweist, wobei der erste Elektromagnet funktional mit einem ersten und einem zweiten Magneten und der zweite Elektromagnet funktional mit einem dritten Magneten verbunden ist.
Rollflaschensystem nach Anspruch 1, ferner mit mindestens drei Magneten, wobei mindestens zwei Magnete an der Innenwand der dritten zylindrischen Kammer angeordnet sind, die an der zweiten zylindrischen Kammer anliegt, und mindestens ein Magnet an der Innenwand der ersten zylindrischen Kammer angeordnet ist, die an die zweite zylindrische Kammer angrenzt, wobei die mindestens drei Magnete als den funktional mit dem ersten und dem zweiten Elektromagneten verbundenen Magneten gegenüberliegende Magnete angeordnet sind.
Rollflaschensystem nach Anspruch 1, bei dem der erste und/oder der zweite Elektromagnet aktiviert sind und einer oder mehrere funktional verbundene Magnete ein Magnetfeld mit einem oder mehreren gegenüberliegenden Magneten bilden, wobei einer oder mehrere der gegenüberliegenden Magnete ein oder mehrere Steuerventile öffnen.
Rollflaschensystem nach Anspruch 7, bei dem der erste Elektromagnet durch einen Sensor aktiviert wird.
Rollflaschensystem nach Anspruch 8, bei dem der Sensor Veränderungen im pH-Wert überwacht.
Rollflaschensystem nach Anspruch 8, bei dem der Sensor Veränderungen in der Konzentration eines Zellprodukts überwacht.
Rollflaschensystem nach Anspruch 10, bei dem das Zellprodukt ein Ammoniakion ist.
Rollflaschensystem nach Anspruch 7, bei dem der zweite Elektromagnet durch einen schwerkraftempfindlichen Positionsschalter aktiviert wird.
Rollflaschensystem nach Anspruch 12, bei dem der schwerkraftempfindliche Positionsschalter ein Quecksilber-Kippschalter oder ein gewichtsbelasteter Hebelschalter ist.
Rollflaschensystem nach Anspruch 7, bei dem der aktivierte zweite Elektromagnet das Steuerventil öffnet, das den Transfer von Wachstumsmedien aus der zweiten zylindrischen Kammer in die Transferkammer für verbrauchte Medien bewirkt.
Rollflaschensystem nach Anspruch 1, bei dem die Steuereinrichtung auf der Außenseite der zweiten Kammer angeordnet ist, so dass die Steuerventile direkt positionsabhängig betätigbar sind.
Rollflaschensystem nach Anspruch 1, bei dem das Ventil ein physiochemisches reagierendes Hydrogel umfasst.
Zell- und Gewebekulturverfahren mit den folgenden Schritten: A) Einbringen von Wachstumsmedien in die erste zylindrische Kammer und von Zellen oder Gewebe in die zweite zylindrische Kammer des Rollflaschensystems von Anspruch 1, B) Kultivieren der Zellen oder des Gewebes durch Drehen der Rollflasche um deren Längsachse, C) Bewirken des Fließens neuer Wachstumsmedien aus der ersten zylindrischen Kammer in die zweite zylindrische Kammer, D) Überwachen eines Zell- oder Kulturparameters in der zweiten zylindrischen Kammer und Bewirken des Fließens verbrauchter Medien aus der zweiten zylindrischen Kammer in die dritte zylindrische Kammer, wenn ein vorbestimmter Schwellenwert des Zellen- oder Gewebekulturparameters gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 17, bei dem der Schritt C) das Einbringen von Wachstumsmedien aus der ersten zylindrischen Kammer durch eine Öffnung in eine erste Transferkammer während des Drehens umfasst, wobei die Frischmedientransferkammer Wände und den Port aufweist, der eine geregelte Fluidverbindung mit der zweiten zylindrischen Kammer bewirkt, und wobei das Ventil geschlossen ist, wenn sich die Rollflasche in der Sechs-Uhr-Position befindet, wodurch die Frischmedientransfer kammer Medien aufnimmt und hält, und wobei das Ventil in der Zwölf-Uhr-Position betätigt ist, um die gehaltenen Medien in die zweite zylindrische Kammer auszugeben.
Verfahren nach Anspruch 17, bei dem der Schritt D) das Einbringen verbrauchter Medien von der zweiten zylindrischen Kammer, die einen Schwellensignalsensor enthält, durch eine Öffnung, die durch ein erstes Ventil in Reaktion auf das Sensorsignal gesteuert wird, in eine Transferkammer für verbrauchte Medien während des Drehens der Rollflasche umfasst, wobei die Transferkammer für verbrauchte Medien Wände, ein zweites Ventil, das den Port steuert, der die steuerbare Fluidverbindung mit der dritten zylindrischen Kammer bewirkt, und den Port aufweist, und wobei das zweite Ventil geschlossen ist, wenn sich die Rollflasche in der Sechs-Uhr-Position befindet, wodurch die zweite Transferkammer Medien aufnimmt und hält, wobei das erste Ventil, welches in der Sechs-Uhr-Position nur in eine offene Stellung verbracht wird, wenn ein Schwellenwert eines Zell- oder Gewebeparameters erreicht wird, das Füllen der Transferkammer für verbrauchte Medien mit verbrauchtem Medium ermöglicht, und das zweite Ventil in der Zwölf-Uhr-Position öffnet, um die verbrauchten Medien in die dritte zylindrische Kammer auszulassen.
Verfahren nach Anspruch 17, bei dem sich die Zellen oder das Gewebe an eine Fläche anheften.
Verfahren nach Anspruch 17, bei dem sich die Zellen oder das Gewebe an eine derivatisierte Fläche anheften.
Verfahren nach Anspruch 17, bei dem sich die Zellen oder das Gewebe an eine entnehmbare Fläche anheften.
Verfahren nach Anspruch 17, bei dem sich die Zellen an eine entnehmbare derivatisierte Fläche anheften.
Verfahren nach Anspruch 17, ferner mit dem Schritt E) des Wiedergewinnens von Zellprodukten aus dem Rollflaschensystem.
Verfahren nach Anspruch 24, bei dem der Schritt des Wiedergewinnens das Entfernen der Zellprodukte aus der zweiten und/oder dritten zylindrischen Kammer umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17, bei dem der Zell- oder Gewebekulturparameter pH oder die Ammoniakionenkonzentration ist.