ES2271694T3 - Sistema de botella de cultivo de rodillo avanzado para el cultivo de celulas y tejidos. - Google Patents
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Abstract
Un sistema de botella de cultivo de rodillo de múltiples cámaras que tiene al menos tres cámaras cilíndricas, que comprende, una primera cámara cilíndrica adecuada para uso como un depósito de medio para el desarrollo de células que tiene al menos cuatro lumbreras, en donde dos lumbreras están situadas en una pared exterior, una que proporciona acceso a una fuente de aire, y la otra que proporciona acceso general a la primera cámara cilíndrica, y donde las otras dos lumbreras están situadas en una pared interior, donde apoyan a tope las cámaras cilíndricas primera y segunda, una lumbrera proporciona acceso a una fuente de aire para la segunda cámara cilíndrica a través de un conducto que conecta con la lumbrera en la pared exterior, proporcionando acceso al aire, y la otra lumbrera proporciona comunicación de fluido controlada con la segunda cámara cilíndrica a través de una válvula de control; una segunda cámara cilíndrica adecuada para el desarrollo de células o tejidos que tiene al menostres lumbreras, dos situadas en la pared lateral, que apoyan a tope con la primera cámara cilíndrica, siendo una lumbrera de igual extensión que la lumbrera que proporciona acceso al aire situada en la pared lateral interior de la primera cámara cilíndrica, y la otra lumbrera alineada con la lumbrera de la primera cámara cilíndrica que proporciona comunicación de fluido controlada, y la tercera lumbrera que proporciona comunicación de fluido controlada con una tercera cámara cilíndrica a través de una válvula de control; una tercera cámara cilíndrica adecuada para recibir medio gastado y que tiene al menos dos lumbreras, una situada en una pared exterior que apoya a tope con la segunda cámara cilíndrica y proporciona acceso general a la tercera cámara cilíndrica, y la segunda lumbrera alineada con la tercera lumbrera de la segunda cámara cilíndrica que proporciona comunicación de fluido controlada con la segunda cámara cilíndrica.
Description
Sistema de botella de cultivo de rodillo
avanzado para el cultivo de células y tejidos.
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El presente invento se refiere, en general, al
cultivo de células y, más en particular, a una botella de cultivo
de rodillo ("roller bottle") de múltiples cámaras adecuada
para la preparación de productos celulares.
Las botellas de cultivo de rodillo se usan
rutinariamente para el desarrollo de células y para la producción
de productos celulares. El cultivo de células tiene lugar después
de haber sido colocada la botella de cultivo de rodillo dentro de
un aparato giratorio, por ejemplo, en el RollerCell 40™ de la firma
Synthecon, Inc. o el R_{2}P Roller Culture Apparatus™ de la firma
Zinsser Analytic, Ltd. (UK).
Hay una necesidad permanente de mejora del
rendimiento del cultivo de células y de los rendimientos de
producto. En general, las condiciones para el cultivo o para la
obtención de producto se optimizan empíricamente para un tipo de
célula. Existen otros enfoques para determinar los parámetros de
funcionamiento. Se usa después típicamente un mecanismo de control
de la realimentación para asegurar que se mantengan esas
condiciones dentro de esos parámetros optimizados. Algunos de los
sistemas de control de la realimentación pueden ser complejos, o no
fácilmente adaptables a los sistemas de cultivo en una botella de
cultivo de rodillo. Por ejemplo, véanse las Patentes de EE.UU.
Números 4.839.292 y 6.323.022.
El invento proporciona un sistema de botella de
cultivo de rodillo avanzado (ARBS) para cultivar células que repone
eficaz, continua y automáticamente el medio gastado con medio
nuevo. El ARBS optimiza el uso del medio al eliminar el medio
gastado en respuesta a un cambio de condiciones predeterminado, y
reponer el medio gastado con medio nuevo.
El sistema ARBS incluye una botella de múltiples
cámaras en la que las cámaras son cilíndricas y están en
comunicación de fluido controlada entre ellas. En una realización,
una primera cámara cilíndrica es un depósito para medio nuevo, una
segunda cámara cilíndrica es una cámara para el desarrollo de
células o tejidos, y una tercera cámara cilíndrica es un depósito
para contener medio gastado. La comunicación de fluido entre las
cámaras es por medio de cámaras de transferencia y se consigue el
control mediante operación con válvulas. La comunicación de fluido
entre las cámaras primera y segunda permite la adición controlada
de medio nuevo, una vez que se haya satisfecho un parámetro
operativo. La comunicación de fluido entre las cámaras segunda y
tercera permite la retirada de medio desde la segunda, una vez que
se haya alcanzado la concentración de gastado o de umbral de
producto celular.
La comunicación de fluido se regula o controla
mediante un conjunto de válvulas de control situadas en lumbreras
entre las cámaras cilíndricas. La apertura y el cierre de las
válvulas de control permiten que el medio fluya desde una cámara
cilíndrica a la siguiente a través de la cámara de transferencia.
La cámara de transferencia de medio nuevo puede estar situada entre
las cámaras cilíndricas primera y segunda, o bien incluir partes de
una o más de esas cámaras. Análogamente, la cámara de medio gastado
puede estar situada entre las cámaras cilíndricas segunda y
tercera, o implicar partes de una o más de esas cámaras.
En una realización, la botella de cultivo de
rodillo gira a derechas o a izquierdas alrededor de su eje
geométrico de rotación, haciendo que el medio sea transferido desde
una cámara a la siguiente por gravedad.
La cámara de transferencia de medio nuevo recoge
y contiene un volumen predeterminado de medio nuevo de la primera
cámara cilíndrica al girar el ARES. El medio retenido es liberado a
la segunda cámara al actuar una válvula. En la posición de las 6
del reloj, la válvula de control que permite el flujo de medio
desde la segunda cámara cilíndrica a la cámara de transferencia de
medio gastado se abre, mediante un solenoide activado por un
conmutador de posición sensible ala gravedad.
Al completarse un giro de 360º desde su posición
de partida inicial (la posición de las "12 del reloj"), se
abre la válvula de control que permite que el medio retenido entre
en la segunda cámara cilíndrica, y se abre la válvula de control
que permite el flujo de medio desde la cámara de transferencia de
medio gastado ala tercera cámara cilíndrica, mediante un solenoide
activado por un sensor incluido en un conjunto de regulador.
Se puede seleccionar un sensor tal que pueda ser
medido cualquier parámetro asociado con el cultivo de células o de
tejidos, o con la formación de un producto deseado. En una
realización, el sensor mide un cambio en el pH.
En otra realización, el sensor mide el cambio en
la concentración de ión amonio.
En todavía otra realización, el regulador
incluye tanto un sensor que mide un cambio en el pH, como un sensor
que mide el cambio en la concentración de ión amonio.
\global\parskip0.990000\baselineskip
El conjunto de regulador incluye también
solenoide superior primero y segundo, que están conectados
operativamente a imanes. El conmutador de posición sensible ala
gravedad activa al primer solenoide que hace que actúe un campo
magnético entre el imán conectado operativamente al mismo y un imán
en oposición, situado dentro de la cámara de transferencia de medio
gastado. El campo magnético formado por el primer solenoide con el
imán en oposición abre la válvula de control que permite que fluya
medio desde la segunda cámara cilíndrica a la cámara de medio
gastado.
El segundo solenoide se activa cuando el sensor
detecta un cambio en las condiciones del medio en la segunda cámara
cilíndrica y envía una señal eléctrica al segundo solenoide. El
segundo solenoide hace que actúe un campo magnético entre los
imanes conectados al mismo y los imanes en oposición situados
dentro de la cámara de transferencia de medio gastado y la cámara
de transferencia de medio nuevo, abriendo con ello válvulas que
permiten el flujo de medio desde la cámara de transferencia de
medio nuevo a la segunda cámara cilíndrica y el flujo de medio
desde la cámara de transferencia de medio gastado a la tercera
cámara cilíndrica.
El invento proporciona también un método para
cultivar células usando el ARBS en el que se introduce medio de
desarrollo en la primera cámara cilíndrica y se introducen por
separado las células o los tejidos en la segunda cámara cilíndrica.
Las células o los tejidos se cultivan haciendo girar para ello el
ARES en sentido a derechas o en sentido a izquierdas.
Según este método, el medio nuevo de desarrollo
fluye automáticamente desde la primera cámara cilíndrica a la
segunda cámara cilíndrica, y e puede vigilar el pH o la
concentración de producto celular en la segunda cámara cilíndrica.
Cuando se mide mediante el sensor un pH o una concentración de
producto celular que se desee, el sensor hace que actúe el
solenoide, el cual abre las válvulas de control haciendo que fluya
medio gastado desde la segunda cámara cilíndrica a la tercera
cámara cilíndrica y que fluya medio de desarrollo nuevo desde la
primera cámara cilíndrica a la segunda cámara cilíndrica.
El método puede incluir también un paso de
recuperación, en el que se recuperan productos celulares de la
segunda o de la tercera cámara del sistema ARBS.
Como productos celulares se incluyen células
completas, tejidos, partes celulares, moléculas segregadas, o
productos de metabolismo celular.
En la Fig. 1 se ha representado el ARES del
invento, tal como está montado. Los componentes del sistema montado
representados en esta Figura son ejemplos de una realización
electromecánica del invento.
En la Fig. 2 se ha representado una vista
desarrollada de la parte superior del ARES.
En la Fig. 3 se ha representado una vista
desarrollada de la parte inferior del ARES. Los componentes del
sistema representados en esta Figura son ejemplos de una
realización electromecánica del invento.
El ARBS del invento, tal como se ha representado
en la Fig. 1, puede caracterizarse en general por tres
compartimientos: depósito de medio nuevo (1), cámara de desarrollo
(2), y depósito de medio gastado (3). Se consigue un flujo
constante de medio automáticamente entre los depósitos de medio
nuevo y de medio gastado (1) y (3), respectivamente, y la cámara de
desarrollo (2), con ayuda de válvulas cargadas por resorte que
abren y cierran mientras el ARBS gira 360º alrededor de su eje
geométrico longitudinal. La apertura y el cierre de estas válvulas
pueden controlarse ya sea electromecánicamente o ya sea
fisioquímicamente.
El ARBS se caracteriza también por tener un
conjunto bipartito, tal como se ha representado en las Figs. 2 y 3,
en el que un miembro roscado en espiral (15) se enrosca en un
miembro de recepción roscado en espiral (16).Análogamente, el
miembro roscado en espiral (15) puede desenroscarse del miembro de
recepción roscado en espiral (16), desmontando el ARES y exponiendo
la cámara de desarrollo (2). Quienes posean los conocimientos
corrientes de la técnica podrán incorporar medios alternativos de
montaje y desmontaje, incluyendo, aunque sin quedar limitados a
ellos, pinzas, clips, fijaciones del tipo de saliente macho/hembra,
obturaciones de vacío, u otros medios para sujetar un miembro a
otro.
La cámara de desarrollo (2) es el compartimiento
de cultivo principal dentro del cual se implantan las células o
los tejidos; dentro de la cual se introduce el medio de cultivo
nuevo desde el depósito de medio nuevo (1); y desde la cual se
expulsa el medio gastado al depósito de medio gastado (3).
Son útiles varios tipos de medios de cultivo de
células, conjuntamente con el ARES, y están fácilmente disponibles
a través de distribuidores por ordenador y por catálogo (por
ejemplo, GIBCO, Sigma y CellTech, Inc.) y pueden adquirirse en una
gama de volúmenes que tienen una diversidad de combinaciones de
nutriente; con o sin suplementos (por ejemplo, de aminoácidos, de
vitaminas, electrolito); o bien con o sin aditivos, tales como
antibióticos y/o antioxidantes. Está al alcance de quien posea los
conocimientos corrientes de la técnica determinar que tipo de medio
es el más adecuado para un protocolo de cultivo de células
específico, basado en los tipos de células o tejidos a ser
cultivados.
Por ejemplo, el medio Dulbecco's Modified Eagle
Médium (DMEM) es un medio de cultivo corrientemente usado, que
puede obtenerse en una diversidad de formas entre las que se
incluye una preparación de alto contenido de glucosa, una
preparación de bajo contenido de glucosa, y una preparación
F-12 que contiene L-glutamina e
hidrocloruro de piridoxina. El DMEM es ideal para soportar y
mantener una gama de tipos de células de mamíferos. El DMEM fue
desarrollado originalmente para el desarrollo de células
embrionarias de ratones, como una modificación del medio Basal
Médium Eagle (BME) pero con cuatro veces la concentración de
aminoácido y vitamina. La formulación de bajo contenido en glucosa,
de 1,0 g/l, se recomienda para el mantenimiento de cultivos de alta
densidad y el desarrollo de células en agar. Las formulaciones de
alto contenido en glucosa, de 4,5 g/l, se usan generalizadamente
para tipos de células dependientes del anclaje (por ejemplo,
células de ovario del hamster de la China, o células de riñón
embrionario humano) (Dulbecco, R. y otros (1959) Virology
8: 396-397, y Smith, JD K y otros (1960)
Virology 12: 185, véase también Moton, HJ (1970) In Vitro
6:89).
Son también útiles en el cultivo de células o
tejidos con el ARBS los siguientes tipos de medio, que se citan
aquí a modo de ejemplos, y no con fines de limitación:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
En los dispositivos diseñados para el cultivo de
células de alta densidad, (por ejemplo, el miniPERM™, los frascos
giratorios, las botellas de cultivo de rodillo, o los
fermentadores), las células y los tejidos son sometidos a
considerables fuerzas de cizalladura. Las fuerzas de cizalladura
pueden controlarse ya sea regulando la velocidad a la que se hace
girar al biorreactor, es decir, a una botella de cultivo de
rodillo, o ya sea mediante la adición de suplementos
anticizalladura en los medios de cultivo. Uno de tales suplementos
es el cellPROTECT™ que puede obtenerse de la firma VivaScience, AG.
El suplemento cellPROTECT™ aumenta la viscosidad del medio y
protege a las células de la fuerza/esfuerzo de cizalladura
experimentados en los cultivos. El suplemento cellPROTECT™ se añade
al medio de cultivo con una concentración de aproximadamente el
0,05% hasta aproximadamente el 0,1% del volumen final. Los
suplementos de aumento de la viscosidad, como el cellPROTECT™, o los
tipos de medio que tienen altas viscosidades pueden usarse en el
presente invento, siempre que sean compatibles con el ARBS y que su
viscosidad no impida el flujo de medio a través de las válvulas y
entre las cámaras y los depósitos.
En una realización del ARBS representada en las
Figs. 1 y 3, se consigue la reposición y la eliminación de medio
constantes mediante el flujo de medio entre los compartimientos, a
través de la válvula de reposición (11a), la válvula de eliminación
(13a), y la válvula de transferencia de desechos (13b). En esta
realización, las válvulas son controladas electromecánicamente
mediante un regulador desmontable (12), que tiene un sensor del pH
o del ión amonio, o bien un sensor capaz de detectar tanto los
cambios en el pH como los cambios en la concentración del ión
amonio. El Regulador (12) incluye además el solenoide superior
(7b), el solenoide inferior (7a), el sensor de posición, y los
imanes reguladores (8a), (8b), y (8c) conectados operativamente a
los solenoides (7a) y (7b), como se ha ilustrado en la Fig. 3.
En una realización del ARBS, el regulador (12)
puede incluir un sensor o medidor del pH que activa al solenoide
superior (7b) y al solenoide inferior (7a), como se ha ilustrado en
las Figs. 1 y 3. Si, por ejemplo, el regulador (12) incluye un
sensor o medidos del pH, se puede situar una sonda del pH
eliminable (no representada) internamente en la cámara de
desarrollo (2) que esté conectada operativamente al regulador (12) a
través de una abertura (no representada) en la pared de la
superficie dela cámara de desarrollo (2) (véase la Fig. 3). La
sonda de pH eliminable es desmontable del regulador (12), de tal
modo que se puede volver a usar el regulador (12) mientras que el
resto del conjunto del ARES es desechable.
Los dispositivos para medir el pH en un líquido
son bien conocidos. Como normales para las mediciones del pH se
usan corrientemente, y son fiables, los sensores de vidrio que
tienen electrodos del tipo de membrana (véanse, por ejemplo, Ohkawa
H, Tampakushitsu Kakusan Koso (Japonesa) (1998) 43(3);
272-80:y Moore EW, Gastroenterology (1968)
54(4): 501-7. También son útiles los
sensores del pH que no son de vidrio, como componentes del
regulador (12), y se preparan típicamente usando membranas de
polímero disolvente (descritas por Pretsch y otros, 1986) Anal.
Chem. 58: 2285-2289, que quedan aquí
incorporadas por sus referencias). Dentro de la categoría de
sensores no de vidrio están los que tienen configuraciones planas,
que son típicamente más pequeños que los sensores de vidrio, y
mucho menos caros tanto de fabricación como de operación. Se pueden
encontrar ejemplos de sensores planos en las Patentes de EE.UU.
Números 5.554.272, de Benco, y 5.702.575 de Foos, las cuales quedan
aquí incorporadas en su totalidad por sus referencias. Los
instrumentos que contienen sensores planos están disponibles
comercialmente. El formato plano de los sensores comprende,
típicamente, capas relativamente delgadas de material aplicadas a
unas bases de sustrato usando técnicas de película gruesa o de
película delgada, incluyendo, por ejemplo, la impresión por
serigrafiado. El material usado como sustrato puede ser
Al_{2}O_{2} 6 bien, Ta_{2}O_{2} depositados por medio del
proceso de PLD (deposición por láser de pulsos), o el
Si_{3}N_{4} aplicado mediante la PECVD (deposición de vapor
químico aumentado con plasma) y el LPCVD (deposición por vapor
químico de baja presión) sobre estructuras de silicio de efecto de
campo. Ambos tipos de sensor presentan una alta sensibilidad al pH
y estabilidad a largo plazo en funcionamiento. Además, la película
de polianilina es útil como un indicador del pH plano de alta
sensibilidad (Takenaka, Y y otros (1990) Chemical Sensors
6 (Supplement A): 77-80, y Takenaka Y y
otros en 81-84, y Shinohara H, y otros,
Chemical Sensors 6 (Supplement A): 85-88).
Si, por ejemplo, el DMEM es el medio
seleccionado para el cultivo de células o tejidos, el pH óptimo
típico será de aproximadamente 7,4 a aproximadamente 7,5. El sensor
del pH del regulador (12) está preferiblemente calibrado para
responder a los cambios en el pH por debajo de aproximadamente 7,4,
preferiblemente por debajo de aproximadamente 7,2, más
preferiblemente por debajo de aproximadamente 7,0, y lo más
preferiblemente por debajo de aproximadamente 6,8.
El ARBS puede también soportar cultivos de
células de explantes (de células primarias) tomados directamente de
un organismo vivo (por ejemplo, de un material para biopsia o en
aspiraciones), preferiblemente de un mamífero, y más
preferiblemente de un ser humano. Estos cultivos de células
consisten en poblaciones del tipo d células mezcladas. El pH óptimo
para el cultivo de células primarias es de aproximadamente 7,0, y
un sensor del pH incluido en el regulador (12) está preferiblemente
calibrado para detectar cambios del pH por debajo de aproximadamente
7,0, preferiblemente por debajo de aproximadamente 6,9, y más
preferiblemente por debajo de aproximadamente 6,8, para el cultivo
de células primarias.
\newpage
Quienes posean los conocimientos corrientes de
la técnica podrán calibrar un medidor del pH y determinar los
márgenes óptimos del pH tolerados por los protocolos de cultivos de
células específicos o por los tipos de células o tejidos usados, y
por consiguiente el regulador (12) no queda limitado en su
aplicación a cualquier protocolo de cultivo de tejidos o células o
tipos de células o tejidos.
El regulador (12) puede incluir también un
sensor del ión amonio (NH_{3}) para analizar las condiciones de
desarrollo en la cámara de desarrollo (2). Los sensores de ion
amonio pueden incluir electrodos de membrana de polímero
consistentes en varios materiales de intercambio de iones en una
matriz inerte, tal como de Teflón™ poroso, de poli(cloruro de
vinilo) (PVC), de polietileno, o de caucho de silicona. Después de
formada la membrana, se sella en el extremo de un tubo de PVC. Los
electrodos de este tipo incluyen potasio, calcio y nitrato.
Los sensores del ión amonio que tienen
electrodos de estado sólido utilizan sales inorgánicas
relativamente insolubles en una membrana. Los electrodos de estado
sólido existen en formas homogéneas o heterogéneas. En ambos tipos,
se desarrollan potenciales en la superficie de la membrana, debido
al proceso de intercambio de iones. Como ejemplos de electrodos de
estado sólido se incluyen los de sulfuro, los de cloruro y los de
fluoruro de plata.
Los sensores del ión amonio que tienen
electrodos de percepción del gas están disponibles para la medición
del amoniaco, el dióxido de carbono, el óxido de nitrógeno, y el
dióxido de azufre. Estos electrodos tienen una membrana permeable
al gas y una solución tampón interna. El pH de la solución tampón
cambia en respuesta al gas. El cambio es detectado por una
combinación de sensor del pH dentro del alojamiento. Debido a su
construcción, los electrodos de percepción del gas no requieren un
electrodo de referencia externo.
En esta realización, las células o los tejidos a
ser cultivados se implantan en la cámara de desarrollo (2). Las
células y los tejidos pueden ser implantados directamente en la
cámara de desarrollo (2), cuya superficie interior puede ser
derivatizada opcionalmente, o bien pueden ser introducidos a través
de un "andamiaje" (o estructura de soporte para el cultivo que
en lo que sigue denominaremos simplemente "andamiaje")
sembrado con las células o el tejido. Para facilitar la
implantación de la célula o el tejido en la cámara de desarrollo
(2), preferiblemente se separa el ARBS (se desenrosca) en la
interfaz del miembro roscado en espiral (15) y el miembro de
recepción de rosca en espiral (16).
La superficie interior de la cámara de
desarrollo (2) puede ser derivatizada, opcionalmente, para
facilitar la unión de la célula por métodos conocidos en la
técnica. La superficie interior de la cámara de desarrollo puede
ser derivatizada con grupos amino, halógeno activo, hidroxi, o
tilo, o bien con una N-hidroximetil acetamida
sustituida donde el sustituyente sea un halógeno activo o un seudo
halógeno. Las proteínas o los péptidos lineales pueden ser ligados
por contacto de las proteínas o los péptidos lineales en un medio
acuoso con una superficie hecha funcional que tenga grupos de
halógeno activo, de carboxi activados, por ejemplo, los ésteres, o
similares, bajo condiciones suaves, durante un tiempo suficiente
para completar una reacción de derivatización. Cualesquiera grupos
funcionales que queden que no hayan reaccionado pueden ser
bloqueados usando un agente de bloqueo de moléculas pequeñas,
apropiado. Por ejemplo, los halógenos activos pueden ser bloqueados
con aminas alifáticas, los tioles con maleimida, o similar. En
algunas realizaciones, puede no haber necesidad de bloquear un
exceso de grupos reactivos, dado que éstos no interferirán con los
pasos subsiguientes en el proceso de derivatización.
Si se seleccionan para el cultivo células
inmunológicas, por ejemplo, células-B, se puede
derivatizar la superficie interior de la cámara de desarrollo (2)
con un antígeno de la célula-B reconocido (por
ejemplo, el CD20), o bien mediante ligadura específica a un
antígeno soluble, en la que tal antígeno puede ser añadido a las
células, de modo que aquellas células que tengan inmunoglobulina en
la superficie que reconozca al antígeno, liguen el antígeno para
formar un complejo que es endocitosado y procesado. Se presentará
un fragmento del antígeno con el antígeno MHC de la célula.
Añadiendo células-T al medio que sean restringidas
por las células-B, las células-T
que reconocen el fragmento de antígeno segregarán linfoquinas, dando
por resultado la proliferación de las
células-B.
Al tener lugar la implantación se sitúa el ARBS
en un aparato para hacer girar, en donde el mismo gira alrededor de
su eje geométrico longitudinal. Un conmutador de posición sensible
a la gravedad (no representado) detecta que el ARBS ha girado 180º
con relación a su posición de partida (denominada aquí en lo que
sigue como la posición de las "6 del reloj"). Este conmutador
de posición sensible a la gravedad puede ser, por ejemplo, un
conmutador de inclinación de mercurio, o bien un conmutador de
palanca contrapesada.
Los conmutadores de inclinación de mercurio (o
"de vuelco") de mercurio están basados en una construcción
sencilla, que no tiene partes móviles aparte del mercurio que se
desplaza. Mecánicamente, estos conmutadores experimentan poco
desgaste, y tienen unas expectativas de larga vida con el número
medio de operaciones del orden de decenas de millones (Durakool,
DANA distribuido por la American Electronic Components).
También se pueden usar "conmutadores del tipo
de vuelco" no basados en el mercurio, como sensores de rotación.
Uno de tales conmutadores no basados en el mercurio puede obtenerse
de la firma Comus, y tiene un alojamiento de 9,344 mm x 8,874 mm y
es adecuado para operar en un margen de temperaturas desde -37 a
100º Celsius (que también puede obtenerse de la firma DuraKool,
DANA).
En la posición de las 6 del reloj, si el
regulador (12) detecta un cambio en el pH o un cambio en la
concentración de ión amonio, o ambas cosas, en el medio de la
cámara de desarrollo (2) que exceda de un umbral predeterminado, el
regulador (12) envía una señal eléctrica que activa al solenoide
inferior (7a). El solenoide inferior (7a) activado aplica el imán
regulador (8a) que forma un campo magnético con el imán interior en
oposición (9a). El imán interior (9a) origina a su vez la
constricción de un resorte en la válvula de transferencia de
desechos (13b), abriendo por tanto la válvula. La válvula de
transferencia de desechos (13b) abierta permite que fluya medio
desde la cámara de desarrollo (2) a la cámara de transferencia de
desechos (6).
La cámara de transferencia de desechos (6) tiene
capacidad para contener todo el volumen de medio que haya en la
cámara de desarrollo (2), típicamente alrededor de 1,5 ml. En la
posición de las 6 del reloj, la cámara de transferencia de desechos
(6) puede ser llenada en su totalidad, si así se desea, pero se
llena preferiblemente hasta aproximadamente el 6% de su capacidad,
y más preferiblemente hasta aproximadamente el 7% de su capacidad, y
lo más preferiblemente hasta aproximadamente el 8% de su capacidad.
El espacio de tiempo que se necesita para la transferencia del
medio gastado o nuevo desde una cámara a la siguiente está en
relación, en parte, con el tamaño del orificio entre las cámaras.
El solenoide abriría en todo el recorrido de 30 grados, desde las
posiciones de las "6 y las 12 del reloj". El espacio de tiempo
durante el cual estaría abierta la posición dependería de la
velocidad de rotación del dispositivo.
Cuando el ARBS completa una revolución (360º
desde su posición de partida, con referencia a la posición de las
"12 del reloj", aquí en lo que sigue), la cámara de
transferencia (5) de medio nuevo recoge aproximadamente 8 ml,
preferiblemente aproximadamente 9 ml, y más preferiblemente
aproximadamente 10 ml de medio nuevo desde el depósito de medio
nuevo (1).
En la posición de las 12 del reloj, el solenoide
superior (7b) es activado por señales eléctricas procedentes del
regulador (12) y aplica los imanes reguladores (8b) y (8c). El imán
regulador (8c) forma un campo magnético con el imán interior en
oposición (9c), forzando a la válvula de eliminación (13k) a abrir
y depositar el medio gastado que entró en la cámara de
transferencia de desechos (6) en la posición de las 6 del reloj, en
el depósito de medio gastado (3). Simultáneamente, el solenoide
superior (7b) activa también al imán regulador (8b), formando un
campo magnético con el imán interior en oposición (9b). El imán
inferior (9b) deprime el resorte (10) por medio del miembro de
núcleo móvil (11c) empujando al brazo (11b) a lo largo del eje
geométrico horizontal del ARBS, abriendo así la válvula de
reposición (11a). La válvula de reposición (11a) abierta permite
que el medio recogido de la cámara de transferencia (5) de medio
nuevo entre en la cámara de desarrollo (2).
Los cultivos de células y tejidos requieren
aireación para un correcto desarrollo. Al girar el ARBS, la cámara
de desarrollo (2) se airea mediante el tubo de aireación (4) que
conecta la cámara de desarrollo (2) con el aire ambiente, el cual
es, preferiblemente, estéril. Como se ha ilustrado en las Figs. 1 y
2, el tubo de aireación (4) se extiende a través del depósito de
medio nuevo (1) y sobresale a través del tornillo en la parte
superior (17), donde queda expuesto al aire ambiente a través de la
tapa ventilada (18).
El ARBS completa preferiblemente una revolución
para equilibrar antes de que el regulador (12) tome otra
lectura.
Como componentes adicionales del conjunto del
ARBS se incluyen la tapa de tubo (14a), que permite la sustitución
de medio nuevo en el depósito de medio nuevo (1), o la adición de
aditivos, nutrientes, factores de desarrollo, y similares, sin
tener que desarmar el sistema ni la tapa de tubo (14b) que permite
la retirada de medio gastado desde el depósito de medio gastado (3)
sin tener que desarmar el sistema. Ambas tapas de tubo (14a) y
(14b) pueden ser tapadas con cubiertas superiores roscadas
apropiadas (no representadas) durante el uso del ARBS.
El medio retirado del depósito de medio gastado
(3) a través de la tapa de tubo (14b) puede ser o bien desechado, o
bien guardado. En algunos métodos de cultivos de células usando el
ARBS, el medio gastado se guarda para aprovechar los productos
celulares deseados segregados durante el desarrollo y el
metabolismo de la célula. Tal como aquí se usa, la denominación de
"productos celulares" se entiende que abarca las células
completas o los tejidos, o cualquier subestructura de los mismos
(por ejemplo, los organelos -órganos celulares- o membranas de las
células), los iones segregados, los compuestos segregados, las
moléculas segregadas, los anticuerpos u otras inmunoglobulinas,
antígenos, proteínas, citoquinas, hormonas, compuestos orgánicos,
compuestos farmacéuticos, u otras biomoléculas de interés. Los
productos celulares incluyen también aquellas sustancias (por
ejemplo, iones) detectadas por un sensor incluido en el regulador
(12), cuya detección activa el flujo de medio entre las cámaras del
ARBS. Estos productos celulares pueden ser aprovechados
procedentes del medio gastado recogido del depósito de medio
gastado (3).
La superficie interior de la cámara de
desarrollo (2) puede ser derivatizada para facilitar la fijación de
la célula. Además, se pueden usar también partículas o un
andamiaje para la fijación de células o tejidos Estas partículas,
por ejemplo, glóbulos, o andamiaje, pueden ser derivatizadas. La
forma preferida del andamiaje es la de un miembro similar a un
bloque cilíndrico que puede ser fácilmente insertado en, y retirado
de, la cámara de desarrollo (2). Dentro del alcance del invento se
contemplan también otras formas que pueden ser fácilmente
insertadas en, y retiradas de, la cámara de desarrollo (2), por
ejemplo, un andamiaje de forma de disco. La espuma de poro abierto
del andamiaje es particularmente deseable, por cuanto la
estructura permite el fácil enjuagado y desprendimiento de las
células usando varias técnicas y materiales conocidos para la
recuperación de células.
En un mecanismo adecuado para enjuagar y
desprender células del andamiaje se hace uso de una solución que
contiene una enzima proteolítica, tal como la tripsina. Como otros
mecanismos adecuados para desprender las células se incluye la
sonificación ola agitación, siempre que la fuerza aplicada a las
células no induzca lisis. Sin embargo, si las células han de ser
usadas finalmente en muestras de extracción (por ejemplo, para
aislar productos de células intracelulares, metabolitos, o
moléculas o fracciones de moléculas de la superficie de la membrana
de la célula), la prevención de la lisis es menos importante. Quien
posea los conocimientos corrientes de la técnica apreciará que
cualquier método conocido en la técnica es útil para enjuagar o
desprender las células cultivadas del andamiaje como sea lo más
adecuado para el uso final de las células cultivadas.
En otra realización, el ARBS puede ser montado
sustituyendo para ello un hidrogel sensible al pH en vez del
regulador (12), lo cual hace que el ARBS sea desechable en su
totalidad.
En la realización fisioquímica del ARBS, la
dilatación y la contracción del hidrogel sensible al pH en
respuesta a los cambios en el pH ejerce una fuerza sobre la válvula
de reposición (11a), la válvula de eliminación (13a), y la válvula
de transferencia de desechos (13b), haciendo que las mismas se
abran y se cierren.
Los hidrogeles sensibles al pH aquí usados son
materiales polímeros que se esponjan en agua y en otros
disolventes, absorbiendo el fluido dentro de la red de polímero sin
disolverse. Los hidrogeles hidrófilos tienen grandes contenidos de
agua en equilibrio y buena biocompatibilidad. Los hidrogeles
sensibles al pH han sido los estudiados en más profundidad de los
hidrogeles hidrófilos. Los hidrogeles sensibles al pH son
entrecruzados, para formar un gel estabilizado, con varios tipos de
fuerzas de entrecruzamiento, tales como enlaces covalentes, enlaces
de hidrógeno, o interacciones hidrófugas. Los hidrogeles ácidos
serán por definición ionizados, y por consiguiente esponjados, para
un alto pH, y no cargados y no esponjados para un bajo pH. El
comportamiento en cuanto a esponjamiento de un hidrogel básico
tiene la dependencia opuesta del pH, que lo hace adecuado para su
aplicación en el ARBS. La sensibilidad al pH es originada por los
grupos colgados ácidos y básicos, tales como el de ácido
carboxílico, el de ácido sulfónico, el de amina primaria, y las
sales de amonio cuaternarias. Los grupos de ácido carboxílico, por
ejemplo, se cargan para un alto pH y se descargan para un bajo pH,
mientras que la inversa es cierta para los grupos de amina primaria
y para las sales de amonio cuaternarias. La transición del pH para
un grupo colgado dado viene determinada por el valor del pKa para
ese grupo colgado. Por consiguiente, seleccionando grupos colgados
con los valores apropiados del pKa, se puede construir un hidrogel
hidrófilo que puede ser ionizado reversiblemente en respuesta a
cualquier nivel de estímulo del pH que conduzca a cambios en las
propiedades de un gel. (La gama de pH dependería del tipo de célula
particular seleccionado, o del producto celular deseado). El
hidrogel se elige para la gama de pH fijada como objetivo deseado,
preferiblemente con una rápida transición de
esponjamiento/desesponjamiento que tenga lugar dentro de la gama de
pH fijada como objetivo. La posición del hidrogel y de las válvulas
sería crítica, y se necesitaría un imán externo que habría
necesidad de que fuera unido a la cremallera del rodillo para que
actuase como el sensor de posición.
Los hidrogeles sensibles al pH preferidos se
derivan de una serie de compuestos polímeros tales como: el
poli(alcohil acrilato), el poli(acrilmetacrilato), el
poli(2-hidroxietil metacrilato) (HEMA), el
poli(2-hidroxipropil metacrilato) (HPMA), la
poli(acrilacrilamida), la poli(N-vinil
pirrolidona), el poli(alcohol vinílico)(PVA), el óxido de
polietileno (PBO), el poli(heterouretano) y el
polielectrolito. Los monómeros usados para sintetizar los
homopolímeros que se acaban de relacionar pueden ser también usados
en varias combinaciones para formar copolímeros. Los hidrogeles
sensibles al pH formados a partir de esos polímeros contraen y
dilatan de modo reversible al producirse la adición de ácido y
alcalino, alternadamente. Se ha puesto de manifiesto que la
respuesta a un cambio en el pH puede ser rápida y reversible
después de cambios bruscos en el pH, para los hidrogeles de
poli(metil
metacrilato-co-N,N-dimetilaminoetil
metacrilato).Quienes posean los conocimientos corrientes de la
técnica sabrán como combinar varios polímeros para formar
compuestos de hidrogeles sensibles al pH.
El grado de equilibrio del esponjamiento y los
cambios de conformación de los hidrogeles sensibles al pH vienen
influenciados por varios factores, tales como el de la carga del
monómero iónico, el pKa del grupo ionizable, las concentraciones
del grupo colgado ionizable en la red, el pH, la resistencia
iónica, la constante dieléctrica del medio, la densidad del
entrecruzamiento, la hidrofilia, y la hidrofobia de la cadena
principal del polímero. Estos factores se han estudiado en la
publicación de Helle B, y otros, pH-Sensitive
Hydrogel; Characteristics and Potential in Drug Delivery in
Properties, Preparation, and Applications (Eds. Harland y
otros) 1992.
La carga del monómero fónico influye en los
cambios de conformación de los hidrogeles sensibles al pH. Un
hidrogel ácido no se cargará para bajos pHs, pero se ionizará para
altos pHs. Por consiguiente, el grado de equilibrio del
esponjamiento aumentará cuando se aumente el pH en un hidrogel que
contenga grupos colgados ácidos. El esponjamiento de un hidrogel
tiene la dependencia del pH opuesta. Los hidrogeles basados en el
ácido metacrílico, el sulfoxietil metacrilato, HEMA, o HPMA, han
sido usados generalmente para obtener geles ácidos, básicos, y
anfolíticos. Se ha estudiado el esponjamiento como función del tipo
de grupo iónico (Chen, LL y otros, (1998) Pharm. Dev.
Technol. 3(2):241-9).
El valor del pKa de los grupos ionizables
colgados en el gel influye en la curva de esponjamiento según el pH
(Chen, supra). Una disminución en el valor del pKa de un grupo
ionizable básico desplaza la curva hacia un pH más bajo. Se ha
demostrado que la respuesta de esponjamiento es más sensible al pH
para un valor del pH próximo al valor del pKa del grupo ionizable
del hidrogel (Eichenbaum GM, y otros, (1998),
Macromolecules 31(15): 5084-93). La
concentración de monómeros ionizables en el hidrogel es
significativo para el esponjamiento y la sensibilidad al pH del
gel. Este efecto depende de la hidrofilia relativa del monómero
ionizable comparada con la del comonómero neutro. La hidrofobia y la
hidrofilia de la cadena principal del polímero sensible al pH
afectan al esponjamiento. Se ha puesto de manifiesto que aumentando
la hidrofobia de la cadena principal del polímero se disminuye la
sensibilidad al pH del copolímero
poli(N-alcohil
metacrilato-co-N,N-dimetilaminoetil
metacrilato) y del copolímero de estireno y
4-vinilpiridina (VP). La composición tampón y la
resistencia iónica afectan al esponjamiento de los hidrogeles
sensibles al pH. Las protecciones "counterions" cargan sobre
las cadenas principales de los polímeros. La concentración de iones
dentro y fuera del gel será igual, así como disminuirá la presión
osmótica dentro del gel cuando aumente la concentración de iones
fuera del gel. Una solución tampón que contenga iones multivalentes
es capaz de neutralizar varias cargas dentro del gel. La densidad
del entrecruzamiento es importante para el esponjamiento sensible
al pH. Una densidad de entrecruzamiento aumentada restringirá el
grado de equilibrio del esponjamiento. Este efecto es más acusado
si se ioniza el gel mediante un cambio en el pH. Las propiedades de
la red de los hidrogeles son influidas principalmente por las
variables de síntesis, en particular por la composición química y
la densidad de entrecruzamiento (Chen, supra, véase también
Mandal TK y otros (2000) Pharm. Dev. Technol.
5(4): 555-60).
Las válvulas para hidrogel sensible al pH
preferidas incluyen copolímeros sintetizados de varios tipos de
monómeros derivados del metacrilato mediante la polimerización de
solución de radical libre. Estos copolímeros son polímeros tenaces,
flexibles, más que geles blandos; son sumamente biocompatibles; y
son inertes y no degradables, y como tales ideales para las
botellas de cultivo de rodillo tales como el ARBS que es
constantemente expuesto a esfuerzos de cizalladura debido al
movimiento del medio entre los compartimientos. Por ejemplo, el
esponjamiento de los geles que son copolímeros del
N,N-dietil-aminoetil metacrilato
(DEAMA) y el 2-hidroxipropilmetilacrilato (HPMA),
aumenta al disminuir el pH del medio. Esto ha sido puesto de
manifiesto por Ishihara K., y otros, (1984) Poly J.
16: 625-631. En contraste con esto, el
contenido de agua de un homopolímero HEMA es independiente del pH
del medio. Por consiguiente, los cambios en contenido de agua con
el pH del hidrogel copolímero HPMA resultan de la introducción de
la fracción del DEAMA. La fracción de DEAMA se considera que
experimenta protonación cuando disminuye el pH del medio, lo cual
aumenta la hidrofilia de la fracción de DEAMA y la del hidrogel.
Los contenidos de agua de los hidrogeles de los copolímeros DEAMA y
HPMA son reversibles con respecto a los cambios en el pH.
Claims (26)
1. Un sistema de botella de cultivo de rodillo
de múltiples cámaras que tiene al menos tres cámaras cilíndricas,
que comprende,
una primera cámara cilíndrica adecuada para uso
como un depósito de medio para el desarrollo de células que tiene
al menos cuatro lumbreras, en donde dos lumbreras están situadas
en una pared exterior, una que proporciona acceso a una fuente de
aire, y la otra que proporciona acceso general a la primera cámara
cilíndrica, y donde las otras dos lumbreras están situadas en una
pared interior, donde apoyan a tope las cámaras cilíndricas primera
y segunda, una lumbrera proporciona acceso a una fuente de aire
para la segunda cámara cilíndrica a través de un conducto que
conecta con la lumbrera en la pared exterior, proporcionando acceso
al aire, y la otra lumbrera proporciona comunicación de fluido
controlada con la segunda cámara cilíndrica a través de una válvula
de control;
una segunda cámara cilíndrica adecuada para el
desarrollo de células o tejidos que tiene al menos tres lumbreras,
dos situadas en la pared lateral, que apoyan a tope con la primera
cámara cilíndrica, siendo una lumbrera de igual extensión que la
lumbrera que proporciona acceso al aire situada en la pared lateral
interior de la primera cámara cilíndrica, y la otra lumbrera
alineada con la lumbrera de la primera cámara cilíndrica que
proporciona comunicación de fluido controlada, y la tercera
lumbrera que proporciona comunicación de fluido controlada con una
tercera cámara cilíndrica a través de una válvula de control;
una tercera cámara cilíndrica adecuada para
recibir medio gastado y que tiene al menos dos lumbreras, una
situada en una pared exterior que apoya a tope con la segunda
cámara cilíndrica y proporciona acceso general a la tercera cámara
cilíndrica, y la segunda lumbrera alineada con la tercera lumbrera
de la segunda cámara cilíndrica que proporciona comunicación de
fluido controlada con la segunda cámara cilíndrica; y
unos medios de control para activar
sucesivamente las válvulas para producir un flujo de fluido
controlado desde cada una de las respectivas cámaras a la otra, en
posiciones predeterminadas de rotación de las cámaras;
en que las cámaras cilíndricas primera, segunda
y tercera están interconectadas, de modo que permiten la rotación
de las cámaras cilíndricas como un solo conjunto alrededor de un
eje geométrico de rotación, y en que el control de la comunicación
de fluido permite que medio de desarrollo procedente de la primera
cámara cilíndrica sea introducido en la segunda cámara cilíndrica,
y medio gastado procedente de la segunda cámara cilíndrica sea
retirado de la segunda cámara cilíndrica a la tercera cámara
cilíndrica.
2. El sistema de botella de cultivo de rodillo
según la reivindicación 1, en el que la lumbrera que proporciona la
comunicación de fluido controlada de la primera cámara cilíndrica
con la segunda cámara cilíndrica incluye una válvula de control del
flujo de fluido a través de la lumbrera y una cámara de
transferencia de medio nuevo situada en la primera cámara
cilíndrica, en que dos de las paredes de la cámara de transferencia
de medio nuevo son partes de la pared curvada de la primera cámara
cilíndrica y de la pared interior, y cuya cámara de transferencia
de medio nuevo recoge y contiene medio de desarrollo de la primera
cámara cilíndrica durante la rotación de la botella de cultivo de
rodillo desde una posición de las seis del reloj a una posición de
las doce del reloj, en que la válvula se cierra en la posición de
las seis del reloj y es hecha actuar en la posición de las doce
del reloj, para liberar medio a la segunda cámara cilíndrica.
3. El sistema de botella de cultivo de rodillo
según la reivindicación 1, en el que la lumbrera que proporciona
comunicación de fluido controlada con la tercera cámara cilíndrica
incluye una primera válvula que controla el flujo de fluido a
través de la lumbrera a la tercera cámara cilíndrica, y una cámara
de transferencia de medio gastado situada en la tercera cámara
cilíndrica, la cual recibe el medio gastado de la segunda cámara
cilíndrica cuando se hace actuar una segunda válvula en respuesta a
un sensor presente en la segunda cámara cilíndrica, en que dos de
las paredes de la cámara de transferencia de medio gastado son
partes de la pared curvada de la tercera cámara cilíndrica y de la
pared interior, y cuya cámara, durante la rotación de la botella de
cultivo de rodillo desde una posición de las seis del reloj a una
posición de las doce del reloj, en que la primera válvula está
cerrada y la segunda válvula es hecha actuar en la posición de las
seis del reloj, la segunda válvula hecha actuar permite que fluya
medio gastado a la cámara de transferencia de medio gastado, y la
primera válvula es hecha actuar en la posición de las doce del
reloj para liberar medio que pase a la tercera cámara
cilíndrica.
4. El sistema de botella de cultivo de rodillo
según la reivindicación 1, en el que las cámaras cilíndricas
primera y segunda están interconectadas mediante el acoplamiento de
un miembro de unión macho con un miembro de unión hembra, en que
cada uno de los miembros rodea a la lumbrera y al conducto que
proporciona acceso al aire de la segunda cámara cilíndrica.
5. El sistema de botella de cultivo de rodillo
según la reivindicación 1, en el que los medios de control
comprenden un conmutador sensor de gravedad, un primer y un segundo
solenoide superior, en que el primer solenoide está conectado
operativamente a un primer y un segundo imanes, y el segundo
solenoide está conectado operativamente a un tercer imán.
\newpage
6. El sistema de botella de cultivo de rodillo
según la reivindicación 1, que comprende además al menos tres
imanes; al menos dos imanes situados en la pared interior de la
tercera cámara cilíndrica que apoya a tope con la segunda cámara
cilíndrica; y al menos un imán situado en la pared interior de la
primera cámara cilíndrica que apoya a tope con la segunda cámara
cilíndrica, situados los al menos tres imanes como imanes en
oposición con los imanes conectados operativamente a los solenoides
primero y segundo.
7. El sistema de botella de cultivo de rodillo
según la reivindicación 1, en el que uno o los dos de los
solenoides primero y segundo son activados, y en el que uno o más
imanes conectados operativamente forman un campo magnético con uno
o más imanes en oposición, abriendo uno o más imanes en oposición
una o más válvulas de control.
8. El sistema de botella de cultivo de rodillo
según la reivindicación 7, en el que el primer solenoide es
activado por un sensor.
9. El sistema de botella de cultivo de rodillo
según la reivindicación 8, en el que el sensor vigila los cambios
en el pH.
10. El sistema de botella de cultivo de rodillo
según la reivindicación 8, en el que el sensor vigila los cambios
en la concentración de un producto celular.
11. El sistema de botella de cultivo de rodillo
según la reivindicación 10, en el que dicho producto celular es el
ión amonio.
12. El sistema de botella de cultivo de rodillo
según la reivindicación 7, en el que el segundo solenoide es
activado por un conmutador de posición sensible a la gravedad.
13. El sistema de botella de cultivo de rodillo
según la reivindicación 12, en el que el conmutador de posición
sensible a la gravedad es seleccionado de un conmutador inclinable
de mercurio, o un conmutador de palanca contrapesado.
14. El sistema de botella de cultivo de rodillo
según la reivindicación 7, en el que el segundo solenoide activado
abre la válvula de control que activa la transferencia de medio de
desarrollo desde la segunda cámara cilíndrica a la cámara de
transferencia de medio gastado.
15. El sistema de botella de cultivo de rodillo
según la reivindicación 1, en el que los medios de control están
situados en el exterior de la segunda cámara, de modo que las
válvulas de control pueden ser hechas actuar directamente de una
manera que depende de la posición.
16. El sistema de botella de cultivo de rodillo
según la reivindicación 1, en el que la válvula comprende un
hidrogel sensible a las condiciones fisioquímicas.
17. Un método para el cultivo de células y
tejidos, que comprende los pasos de:
- A)
- introducir medio de desarrollo en la primera cámara cilíndrica y las células o el tejido en la segunda cámara cilíndrica del sistema de botella de cultivo de rodillo de la reivindicación 1,
- B)
- cultivar las células o el tejido haciendo girar para ello la botella de cultivo de rodillo alrededor de su eje geométrico longitudinal,
- C)
- hacer que fluya medio de desarrollo nuevo desde la primera cámara cilíndrica a la segunda cámara cilíndrica;
- D)
- vigilar un parámetro de cultivo de la célula o el tejido en la segunda cámara cilíndrica y hacer que el medio gastado fluya desde la segunda cámara cilíndrica a la tercera cámara cilíndrica cuando se mida un parámetro del cultivo de la célula o tejido umbral predeterminado.
18. El método según la reivindicación 17, n el
que el paso C) comporta introducir medio de desarrollo desde la
primera cámara cilíndrica a través de una abertura en una primera
cámara de transferencia durante la rotación, en que la cámara de
transferencia de medio nuevo comprende paredes y la lumbrera que
proporciona comunicación de fluido controlada con la segunda cámara
cilíndrica, y en que la válvula está cerrada cuando la botella de
cultivo de rodillo está en una posición de las seis del reloj,
haciendo que la cámara de transferencia de medio nuevo contenga y
retenga el medio y sea hecha actuar en una posición de las doce del
reloj para liberar a la segunda cámara cilíndrica el medio
retenido.
19. El método de acuerdo con la reivindicación
17, en el que el paso D) comporta introducir medio gastado desde la
segunda cámara cilíndrica, que contiene un sensor de señal umbral,
a través de una abertura controlada por una primera válvula en
respuesta a la señal del sensor, en una cámara de transferencia de
medio gastado durante la rotación de la botella de cultivo de
rodillo, en que la cámara de transferencia de medio gastado
comprende paredes, una segunda válvula que controla la lumbrera que
proporciona comunicación de fluido controlada con la tercera cámara
cilíndrica y la lumbrera, y en que la segunda válvula está cerrada
cuando la botella de cultivo de rodillo está en la posición de las
seis del reloj, haciendo que la segunda cámara de transferencia
contenga y retenga medio, permitiendo la primera válvula, que es
hecha actuar solamente a una posición abierta en la posición de las
seis del reloj cuando se alcanza un valor umbral de un parámetro
del cultivo de la célula o del tejido, que la cámara de
transferencia de medio gastado se llene de medio gastado, y la
segunda válvula abra en una posición de las doce del reloj para
liberar el medio gastado enviándolo a la tercera cámara
cilíndrica.
20. El método según la reivindicación 17, en el
que las células o los tejidos se unen a una superficie.
21. El método según la reivindicación 17, en el
que las células o los tejidos se unen a una superficie
derivatizada.
22. El método según la reivindicación 17, en el
que las células o los tejidos se unen a una superficie que puede
retirarse.
23. El método según la reivindicación 17, en el
que las células o el tejido se unen a una superficie derivatizada
que puede retirarse.
24. El método según la reivindicación 17, que
comprende además el paso: B) recuperar productos celulares del
sistema de botella de cultivo de rodillo.
25. El método según la reivindicación 24, en el
que el paso de recuperación incluye la retirada de productos
celulares de la segunda y/o la tercera cámara cilíndrica.
26. El método según la reivindicación 17, en el
que el parámetro del cultivo de la célula o el tejido es el pH o la
concentración de ión amonio.
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