KR101739630B1

KR101739630B1 - 연골 세포가 부착된 다공질체의 장기 보존 방법

Info

Publication number: KR101739630B1
Application number: KR1020147014497A
Authority: KR
Inventors: 모토히로 하라이; 도시아키 다테야마
Original assignee: 후지소프트 가부시키가이샤
Priority date: 2011-12-01
Filing date: 2012-11-30
Publication date: 2017-05-24
Also published as: KR20140088589A; WO2013081122A1; JPWO2013081122A1; SG11201402694XA; EP2787074A4; EP2787074A1; CN103958670A; US20140273149A1; JP5851520B2

Abstract

연골 세포 부착 다공질체를 밀봉 상태에서 적어도 14일간에 걸쳐 장기 보존하는 방법을 개시한다. 당해 방법은, 단리된 연골 세포를 아텔로콜라겐 액에 1.0×10⁷cells/ml∼1.0×10⁸cells/ml의 투여 세포 농도로 현탁하여 세포 현탁액을 조제하는 것과, 상기 세포 현탁액을 생체 적합성 다공질체에 파종하는 것과, 상기 세포 현탁액을 상기 다공질체에 있어서 겔화하여 연골 세포 부착 다공질체를 얻는 것과, 상기 연골 세포 부착 다공질체를, 투여 생세포수 1.0×10⁵cells당 1mL 이상의 양의, 인슐린, 섬유 아세포 성장 인자 및 5% 이상의 혈청을 포함하는 배지 중에서, 배지의 진탕 속도가 0cm/s보다도 크고 2.8cm/s 이하인 범위에서 진탕하면서, 26∼37℃에서 유지하는 것을 구비한다.

Description

연골 세포가 부착된 다공질체의 장기 보존 방법{METHOD FOR LONG-TERM STORAGE OF POROUS BODY BEARING CHONDROCYTES}

본 발명은 연골 세포가 부착된 다공질체를 장기 보존하기 위한 보존 방법에 관한 것이다.

특허문헌 1에는, 연골 세포를 배양하여 얻어진 배양 연골 조직을 인산 완충액, 링거계 보존액, 또는 생리 식염수 등의 등장 염류 용액을 이용하여 2∼25℃에서 10일간에 걸쳐 보존하는 방법이 개시되어 있다.

특허문헌 2에는, 세포 보존액에 세포를 침지하는 세포 보존 방법으로서, 인접하는 2개의 세포 집합체의 회전 속도를 측정하고, 그 회전 속도에 기초하여 세포 보존액의 에너지원의 농도 또는 양을 다르게 하여, 세포 활성을 유지하면서 세포 증식능을 둔화시키는 방법이 개시되어 있다.

특허문헌 1에 기재된 방법은 수송 기간을 의도한 보존(10일 정도)을 목적으로 하고 있고, 약전에서 정해진 무균 시험에서 요구되는 14일의 기간에 대하여 보존을 의도한 것은 아니다.

특허문헌 2에서는 인접한 2개의 세포 집합체의 회전 속도가 세포 활성을 유지하면서 세포 증식능을 둔화시키는 범위가 되도록 세포 보존액의 에너지원이나 양을 다르게 한 것이기 때문에 배지가 교환될 수 없는 상황에서는 적용할 수 없다.

일본 특허공개 2005-95152호 공보 일본 특허 제4230750호 공보

본 발명의 과제는, 배지 교환을 필요로 하지 않고서 연골 세포가 부착된 다공질체를 장기 보존하는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 과제를 해결하기 위한 본 발명은,

연골 세포가 부착된 다공질체를 밀봉 상태에서 적어도 14일간에 걸쳐 장기 보존하는 방법으로서,

단리된 연골 세포를 아텔로콜라겐에 1.0×10⁷cells/ml∼1.0×10⁸cells/ml의 투여 세포 농도로 현탁하여 세포 현탁액을 조제하는 것과,

상기 세포 현탁액을 다공질체에 파종하는 것과,

상기 세포 현탁액을 상기 다공질체에 있어서 겔화하여 연골 세포가 부착된 다공질체를 얻는 것과,

상기 연골 세포가 부착된 다공질체를, 투여 생세포수 1.0×10⁵cells당 1mL 이상의 양의, 인슐린, 섬유 아세포 성장 인자 및 5% 이상의 혈청을 포함하는 배지 중에서, 배지의 진탕 속도가 0cm/s보다도 크고 2.8cm/s 이하인 범위에서 진탕하면서, 26∼37℃에서 유지하는 것

을 구비하는 방법이다.

본 발명에 따르면, 배지 교환을 필요로 하지 않고서 연골 세포가 부착된 다공질체를 장기 보존하는 것이 가능해진다. 그에 의해, 연골 세포가 부착된 다공질체의 무균 상태를 무균 시험에 의해 확인할 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 장기 보존 중에 있어서, 다공질체에 부착된 연골 세포의 과증식을 방지하는 것이 가능해진다. 또, 장기 보존 후에 있어서의 사(死)세포수가 적기 때문에, 장기 보존 후에 있어서도 이식에 적합한 상태의 연골 세포가 부착된 다공질체를 제공하는 것이 가능해진다. 따라서, 종래보다도 장기간에 걸쳐, 예컨대 일본 약전에서 정해진 무균 시험의 기간 동안, 즉 14일간에 걸쳐 배지를 교환함이 없이 연골 세포가 부착된 다공질체를 보존하는 방법을 제공하는 것이 가능해진다. 또한, 법률에 의해 14일간의 보존이 의무화되고 있지 않은 나라나 지역에 있어서도, 연골 세포가 부착된 다공질체를 제조하고 나서 환자에게 이식하는 기관에 제공할 때까지 다소의 시간차가 생기는 것도 상정되지만, 그 기간에 있어서도, 적어도 14일간은 연골 세포를 살린 상태에서 안전하게 보존할 수 있다.

도 1은 이개(耳介) 연골 세포가 부착된 다공질체의 제조 공정을 나타내는 체계도이다.
도 2는 다공질체에 대하여 아텔로콜라겐을 포함하는 세포 현탁액을 투여하고 있는 상태를 나타내는 모식도이다.
도 3은 세포 부착 다공체를 밀폐 용기 내에 보존한 상태를 나타내는 모식도이다.
도 4는 세포 부착 다공체를 장기 보존하고 있는 상태를 나타내는 모식도이다.
도 5는 보존 온도에 따른 보존 중의 세포 생존율의 차이를 나타내는 그래프이다.
도 6은 특정한 보존 온도에서는 세포 생존율에 차이가 없는 것을 나타내는 그래프이다.

(1) 연골 세포가 부착된 다공질체의 제조 및 보존의 개요

본 명세서에 있어서는 「연골 세포가 부착된 다공질체」를 「세포 부착 다공질체」라고도 칭한다. 세포 부착 다공질체의 제조 공정의 개략을 도 1을 이용하여 설명한다.

우선, 연골을 대상으로부터 채취한다. 얻어진 연골을, 예컨대 콜라게나제 처리 등에 의한 효소 처리를 행하여, 연골 세포를 단리한다. 다음으로, 이것을 1.0×10⁷cells/mL∼1.0×10⁵cells/mL의 농도로 2∼3% 아텔로콜라겐 용액에 현탁한다. 얻어진 세포 현탁액을 다공질체에 파종한다. 다음으로, 예컨대 37℃의 인큐베이터 내에 2시간 정치하는 것에 의해 아텔로콜라겐을 겔화함으로써 세포를 다공질체에 고정한다. 이에 의해, 세포 부착 다공질체가 얻어진다. 세포 부착 다공질체는, 대상에 있어서 이식되어 사용된다. 따라서, 이식에 앞서서, 제작된 세포 부착 다공질체가 무균인 것을 시험할 필요가 있다.

무균 시험은, 1개의 로트에 대하여, 동일 연골에서 유래하는 복수의 세포 부착 다공질체를 제작하고, 그 로트에 포함되는 일부의 세포 부착 다공질체에 대하여 무균 시험을 행하는 것이다. 무균 시험에 제공되지 않는 세포 부착 다공질체는, 무균 시험을 받고 있는 세포 부착 다공질체와 병행하여 밀폐 용기에 밀봉 보존된다. 밀봉 보존은, 적어도 무균 시험의 기간 동안 유지된다. 밀봉 보존은, 세포 부착 다공질체를, 투여 생세포수 1.0×10⁵cells당 1mL 이상의 양의 인슐린, 섬유 아세포 성장 인자 및 5% 이상의 혈청을 포함하는 보존용 배지 중에서, 진탕 진폭이 직선인 경우에는 적어도 1방향으로 10mm∼50mm, 원 방향인 경우에도 그 직경이 10mm∼50mm이며, 진탕 속도 15rpm∼90rpm인 범위에서 진탕하면서, 26∼37℃에서 유지하는 것에 의해 행해진다. 무균 시험에 의해 당해 로트가 무균인 것이 확인된 후에, 밀봉 보존되어 있던 세포 부착 다공질체가 이식에 이용된다.

(2) 세포 부착 다공질체

세포 부착 다공질체는, 다공질체와, 다공질체의 표면 및 구멍의 내면에 고정된 연골 세포를 포함한다.

(3) 단리 세포

단리 세포는 다음과 같이 조제된다. 우선, 연골 세포, 예컨대 이개 연골 세포를 채취한다. 다음으로, 채취된 연골 세포로부터 지방, 혈관 및 혈액 등을 제거한다. 이것을 세절(細切)한다. 또, 효소, 예컨대 콜라게나제 용액으로 소화하는 것에 의해 단리 세포를 얻는다.

단리 세포를 사용하여 세포 부착 다공질체를 조제하기 전에, 단리 세포는, 젤라틴 코팅된 페트리 디쉬 또는 젤라틴 코팅된 플라스크에 파종되며, 이것을 예컨대 트립신 등의 효소에 의해 소화하여 회수하는 것에 의해 초대(初代) 배양 및 계대(繼代) 배양되어도 좋다.

초대 배양 및 계대 배양을 위한 증식 배지는, 기초 배지, 예컨대 DMEM/F12 또는 MEM 중에 항생 물질, 예컨대 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함한다.

단리 세포를 다공질체에 고정하여 세포 부착 다공질체를 조제하는 공정은 다음과 같이 행해진다. 단리된 세포를, 아텔로콜라겐 액에 현탁하여 세포 현탁액을 얻는다. 아텔로콜라겐 액은, 아텔로콜라겐과, 기초 배지, 예컨대 MEM, DMEM/F12와, 항생 물질, 예컨대 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함한다.

세포 현탁액을, 예컨대 반원주상의 다공질체에 첨가한다. 다공질체로의 세포 현탁액의 첨가는, 도 2에 나타내는 바와 같이 원하는 크기의 다공질체(21)의 상방으로부터, 세포 현탁액(22)을 피펫(23)에 의해 투여하는 것에 의해 행해져도 좋다. 다공질체에 투여되는 세포 현탁액은, 세포를 1.0×10⁷cells/mL∼1.0×10⁸cells/mL로 포함해도 좋다.

다공질체는, 생체 적합성 다공질 재료, 예컨대 폴리락트산이어도 좋다. 다공질체의 체적은 이식되는 부위에 의존하여 결정되면 좋다. 다공질체의 기공률은 85∼90%이며, 평균 구멍 직경은 약 400㎛이다.

세포가 투여된 다공질체를, 37℃의 충분히 습도가 있는 환경에서, 예컨대 뚜껑을 닫은 페트리 디쉬에 넣은 상태로 37℃의 인큐베이터 내에 정치하여 약 2시간 유지하는 것에 의해 아텔로콜라겐을 겔화한다.

아텔로콜라겐의 겔화에 의해, 세포 현탁액이 겔화되고, 그에 의해 세포가 다공질체의 표면 및 구멍의 내면에 고정되어, 세포 부착 다공질체가 얻어진다.

또한, 아텔로콜라겐 액의 겔화는, 예컨대 기초 배지, 예컨대 MEM, DMEM, DMEM/F12 또는 DMEM/F12에 항생 물질, 예컨대 페니실린 및 스트렙토마이신을 가한 배지를 10mL 넣은 직경 9cm의 페트리 디쉬 내에 다공질체를 얹는 대를 설치하고, 그 대 상에, 세포가 투여된 다공질체가 배지에 가라앉지 않고서 배지로부터 노출된 상태로 재치하고, 페트리 디쉬의 뚜껑을 닫은 상태에서, 예컨대 37℃의 인큐베이터 내에서 2시간 인큐베이팅하는 것에 의해 행해도 좋다.

(4) 밀봉 보존

밀봉 보존에 대하여 도 3에 나타낸다. 우선, 멸균된 밀폐 용기(30)를 준비한다. 이 밀폐 용기(30)는, 개구 가장자리부의 외면에 나사 절삭 가공된 편(片)봉지 통체(31)와, 개구 가장자리부의 내면에 나사 절삭 가공되고, 편봉지 통체(31)의 나사부에 나사식 부착된 캡(32)을 구비한다. 이어서, 편봉지 통체(31)의 내부에 보존용 배지(33)를 수용한다. 계속하여, 편봉지 통체(31)의 내부에 세포 부착 다공질체(34)를 수납한다. 편봉지 통체(31)의 개구부에 캡(32)을 나사식 부착하여 편봉지 통체(31) 내부를 밀폐한다.

(5) 보존용 배지의 진탕

보존용 배지(33)의 진탕을 도 4를 참조하여 설명한다. 우선, 예컨대 타원형으로 이동 가능한 슬라이드 대(41)를 내부에 배치한 항온 진탕기(40)를 준비한다. 슬라이드 대(41) 상에 밀폐 용기(30)를 그 용기(30)의 축 방향이 슬라이드 대(41)의 표면에 대하여 대략 평행해지도록 재치한다. 한편, 밀폐 용기(30)에는 세포 부착 다공질체(34) 전체가 보존용 배지(33)에 가라앉도록 수납되어 있다.

용기(30)를 슬라이드 대(41) 상에 재치한 후에, 항온 진탕기(40)의 내부를 26∼37℃의 환경으로 설정하여, 슬라이드 대(41)를 운동시킨다. 슬라이드 대(41)의 운동에 의해 보존용 배지(33)가 용기(30) 내에서 진탕된다.

슬라이드 대(41)의 움직임은, 타원 운동 외에, 예컨대 원 운동, 왕복 운동 및/또는 8자형 운동 등 타원 이외의 운동이어도 좋다. 슬라이드 대(41)의 운동에 의해, 밀폐 용기(30) 내에 포함되는 보존용 배지는, 진탕 진폭이 직선인 경우에는 적어도 1방향으로 10mm∼50mm, 원 방향인 경우에도 그 직경이 10mm∼50mm이며, 진탕 속도 15rpm∼90rpm인 범위에서 진탕된다. 그와 같은 진탕 환경은, 예컨대 초소형 항온 진탕 배양기(다이테크사제, V·BR-36)를 이용하여 15rpm∼90rpm의 설정에 의해 생기는 타원 운동에 의해 달성된다. 또한, 그 자체 공지된 진탕기에 의해, 예컨대 슬라이드 대(41)를, 예컨대 경사 각도 0°∼15°로 반복하여 경사시키는 것에 의해 마찬가지의 진탕 효과를 달성하는 것도 가능하다.

진탕 진폭 20mm(원 운동)로 보존용 배지를 진탕시켰을 때의 보존용 배지(33)의 유속은, 도시바제 Aplio(등록상표) XG1202S로 측정한 바, 이하와 같았다.

15rpm···유속 측정할 수 없다. 단, 밀폐 용기(30) 내의 보존용 배지(33)의 수면은 슬라이드 대(41)의 운동에 수반하여 근소하게 오르내리는 것이 확인될 수 있었다. 따라서, 측정기로는 측정할 수 없는 0 이상의 근소한 흐름이 형성되어 있는 것으로 생각된다.

30rpm···유속 측정할 수 없다. 단, 밀폐 용기(30) 내의 보존용 배지(33)의 수면은 15rpm일 때와 마찬가지로 슬라이드 대(41)의 운동에 수반하여 오르내리는 것이 확인될 수 있었다. 또한, 수면의 오르내림은 15rpm의 경우와 비교하여, 분명히 그 진폭이 크게 관찰되었다. 따라서, 측정기로는 측정할 수 없는 0 이상의 흐름이 형성되어 있는 것으로 생각된다.

60rpm···유속은 0.5∼1.0cm/s이며, 밀폐 용기(30) 내의 보존용 배지(33)의 수면이 슬라이드 대(41)의 운동에 수반하여 분명히 오르내리는 것이 확인될 수 있었다.

90rpm···유속은 1.6∼2.8cm/s이며, 밀폐 용기(30) 내의 보존용 배지(33)의 수면이 슬라이드 대(41)의 운동에 수반하여 크게 오르내리는 것이 확인될 수 있었다.

보존용 배지의 진탕 속도는, 0cm/s보다도 크고 2.8cm/s 이하이면 좋고, 바람직하게는 U = 1.6cm/s 이상 2.8cm/s 이하이면 좋다. 이 속도는, 보존용 배지의 유속을 u로 했을 때, 0cm/s < u ≤ 2.8cm/s, U = 1.6cm/s∼2.8cm/s의 식에 의해 표시된다.

한편, 하기의 실시예에 있어서 진탕기의 진탕 폭은 특별히 표기가 없는 한 20mm에서 검증하고 있다.

보존용 배지는, 기초 배지, 예컨대 DMEM/F12 중에, 인슐린, 섬유 아세포 성장 인자 및 5% 이상의 혈청을 포함하는 배지이며, 추가로 항생 물질, 예컨대 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함한다.

본 발명의 방법에 따르면, 배지 교환을 행함이 없이, 세포 부착 다공질체를 장기, 적어도 14일간에 걸쳐 보존하는 것이 가능해진다. 그에 의해, 세포 부착 다공질체의 무균 상태를 확인하기 위한 무균 시험을 행하는 것이 가능하다. 또한, 당해 방법은, 장기 보존 중에 세포 부착 다공질체의 과증식을 방지하고, 장기 보존 후에 있어서 사세포수를 적게 하는 것이 가능하다. 따라서, 장기 보존 후에도 이식에 적합한 상태의 세포 부착 다공질체를 제공하는 것이 가능하다.

[예]

1. 연골 세포 부착 다공질체의 제작 순서

후술하는 예 1∼예 8에서 사용하는 연골 세포 부착 다공질체를 기본적으로 이하와 같이 제작했다.

(1) 연골 조직의 단리와 세포 파종(P0)

무균 조작에 의해 채취된 연골 조직을 반입하고, 지방이나 혈액 등을 제거했다. 다음으로, 얻어진 연골을 세절했다. 세절된 연골을 1.2%의 콜라게나제 용액에 넣고, 초소형 항온 진탕 배양기(다이테크사제, V·BR-36)를 이용해서 37℃에서 18시간 120rpm(장직경이 20mm인 원 운동, 이하, 특별히 기재가 없는 경우, 진탕의 움직임은 동일)으로 진탕하여 세포를 단리했다. 단리 세포를 원하는 세포수로 증식 배지(5μg/mL의 인슐린 + 0.1μg/mL의 FGF + 5% 혈청 + 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM/F12)에 현탁했다. 세포 현탁액을, 2×10⁵cells/페트리 디쉬의 농도로 젤라틴 코팅 페트리 디쉬에 파종했다. 이것을 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 인큐베이팅했다.

1.2%의 콜라게나제 용액은 다음과 같이 조제했다. 콜라게나제를 0.3g 칭량하여, 50mL 튜브에 가했다. 이에 대하여 DMEM/F12를 25mL 첨가하여, 완전히 녹였다.

배양 배지는 다음과 같이 조제했다. 배지병에 50mL 피펫으로 DMEM/F12를 450mL 가했다. 다음으로, 5mL 피펫으로 100유닛/mL 페니실린-0.1mg/mL의 페니실린-스트렙토마이신을 5mL 가했다. 또한, 1000μL 칩으로 100μg/ml의 FGF를 500μL 가했다. 또, 1000μL 칩으로 노보린 R을 인슐린으로서 710μL 가했다. 이에 대하여 25mL 피펫으로 혈청을 25mL 가하여 잘 혼합했다.

상기 (1)의 세포에 대한 배지 교환은 다음과 같이 행했다. 상기 (1)의 세포를 포함하는 배양 중의 젤라틴 코팅 페트리 디쉬로부터, 어스피레이터에 의해 배지를 제거했다. 다음으로, 증식 배지를 각 10mL 가했다. 이것을 추가로 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 인큐베이팅했다. 배지 교환은 3∼4일에 1회 행했다.

(2) 계대(P0→P1)

다음과 같이 계대를 행했다. 초대 배양 중인 세포를 포함하는 젤라틴 코팅 페트리 디쉬로부터 세포를 트립신 처리에 의해 박리하여, 1개의 튜브에 모았다. 회수된 세포를 증식 배지(5μg/mL의 인슐린 + 0.1μg/mL의 FGF + 5% 혈청 + 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM/F12)에 현탁했다. 얻어진 세포 현탁액을 1.5×10⁵cells/플라스크의 농도로 젤라틴 코팅 플라스크 18매에 파종했다. 이것을 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 인큐베이팅했다.

<배지 교환>

계대 배양 중의 배지 교환은 다음과 같이 행했다. 젤라틴 코팅 플라스크로부터, 어스피레이터를 이용하여 배지를 제거했다. 다음으로, 증식 배지를 그의 젤라틴 코팅 플라스크에 20mL 가했다. 이것을 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 인큐베이팅했다.

(3) 세포 회수와 다공질체로의 투여

젤라틴 코팅 플라스크 18매로부터 세포를 박리하여, 1개의 튜브에 모아 세포를 회수했다. 회수된 세포 현탁액을 원심 분리한 후, 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 MEM으로 하여, 그 일부를 이용해서 세포수를 측정했다. 측정된 세포에 기초하여, 2.25×10⁸cells에 상당하는 양의 세포 현탁액을 25mL의 튜브로 옮겨 취하여, 원심 분리한 후, 그의 상청을 제거했다. 얻어진 세포 펠렛을, 최종 액량이 3.0mL로 되도록 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 MEM에 현탁했다. 이것을 3% 아텔로콜라겐 1.5mL와 혼합했다. 여기서, 세포 현탁액:아텔로콜라겐 = 2:1이며, 혼합한 후의 아텔로콜라겐의 최종 농도는 1%이다. 1mL의 시린지로 700μL를 채취하여, 폴리락트산제의 대략 반원주상의 다공질체(6(폭, W)×50(길이, L)×3(높이, H))에 투여했다. 다공질에 첨가하는 아텔로콜라겐을 포함하는 세포 현탁액 중의 양은 다공질체의 크기에 따라서 결정했다. 예컨대, 다공질의 크기가 6(W)×5(L)×3(H)인 경우는 투여액량을 70μL로 하고, 10(W)×5(L)×3(H)인 경우는 120∼150μL를 투여했다.

(4) 세포의 고정

다음으로, 세포를 투여한 다공질체를 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 보존용 배지를 넣은 페트리 디쉬에 배치하고, 37℃의 인큐베이터 내에서 2시간 정치하는 것에 의해 아텔로콜라겐을 겔화하여 세포 부착 다공질체를 얻었다.

2. 세포수 계측 방법

예에 있어서의 세포수의 계측은, chemometec사제의 NucleoCounter(등록상표)를 사용하고, 세포 처리 시약으로서 Reagent A100 및 Reagent B100(chemometec사제) 및 전용 샘플 카세트인 NucleoCassette(등록상표)를 이용하여 행했다.

전체 세포 농도 측정은 다음과 같이 행했다.

·샘플의 조제

측정하고자 하는 세포의 현탁액 50μL를 시험관에 채취하고, 세포 처리 시약 Reagent A100 및 Reagent B100을 각각 50μL 가하여 샘플을 조제했다.

·전체 세포 농도의 측정

전체 세포 농도의 측정은, 상기의 「샘플의 조제」의 항에서 조제된 샘플을 NucleoCassette(등록상표)에 흡인하여, NucleoCounter(등록상표)에 세팅했다. 다음으로, NucleoCounter(등록상표)의 「Run」 버튼을 눌러, 전체 세포수의 측정을 개시하여, 계측 결과를 얻었다.

·사세포 농도의 측정

사세포 농도의 측정은 다음과 같이 행했다. 배양 세포 100μL를 튜브에 취하고 NucleoCassette(등록상표)에 흡인하여, NucleoCounter(등록상표)에 세팅했다. 다음으로, NucleoCounter(등록상표)의 「Run」 버튼을 눌러, 사세포수의 측정을 개시하여, 계측 결과를 얻었다.

세포 생존율은 다음 계산식을 이용하여 산출했다:

생세포 농도 = 전체 세포 농도 - 사세포 농도

세포 생존율 = 생세포 농도/전체 세포 농도.

<예 1>

보존용 배지의 조성

세포 부착 다공질체의 보존용 배지의 조성을 결정했다. 성장 인자인 인슐린, FGF(Fibroblast Growth Factors: 섬유 아세포 증식 인자), 덱사메타손(연골 세포의 재분화를 유도한다) 및 소마토메딘(연골 세포의 재분화를 유도한다), 및 혈청 중 어느 것을 조합하여 포함하는 배지에 대하여, 세포 부착 다공질체의 장기 보존 후의 세포에 주는 영향을 검토했다.

배지에 포함되는 각 성분은 이하의 기호에 의해 나타내고, 사용 농도와 함께 약어의 대응을 이하의 표 1에 나타낸다.

·실험 1

배지 A0, A1 및 A2를 비교했다. 이들 배지의 기초 배지에는 DMEM을 사용하고, 페니실린-스트렙토마이신을 포함한다. 각 배지의 조성은 이하와 같다.

배지 A0의 조성: 인슐린 5μg/mL, FGF 0.1μg/mL 및 5% 혈청;

배지 A1의 조성: 소마토메딘 C 100ng/mL, 인슐린 5μg/mL, FGF 0.1μg/mL 및 5% 혈청;

배지 A2의 조성: 덱사메타손 1μM, 인슐린 5μg/mL, FGF 0.1μg/mL 및 5% 혈청.

이들 배지를 비교하는 것에 의해, 연골 세포 증식 인자인 덱사메타손 및 소마토메딘의 세포 부착 다공질체의 장기 보존 후의 세포에 주는 영향을 검토했다.

세포 부착 다공질체를, 상기 (1)∼(4)에 기재된 방법에 준하여 조제했다. 즉, 상기 「1. 연골 세포 부착 다공질체의 제작 순서」에 있어서의 (1)∼(2)에 따라서 조제한 계대 배양 세포를 이용하여 아텔로콜라겐을 포함하는 세포 현탁액을 조제했다. 투여 세포수가 1.5×10⁶cells로 되도록, 조제된 1.0×10⁷cells/mL의 세포 현탁액을 크기 10(W)×5(L)×3(H)의 반원주상의 폴리락트산제 다공질체에 투여했다. 아텔로콜라겐을 37℃의 인큐베이터 내에 2시간 정치하는 것에 의해 겔화했다. 그 후, 2% 아가로스 상에 배지 A0, A1 또는 A2를 30mL씩 첨가하여 추가로 정치하고, 배지 A0, A1 또는 A2 중에서 환경 온도 37℃에서 2주간 유지했다.

그 후, 세포 부착 다공질체로부터 세포를 트립신(TrypLE Express, GIBCO사제) 처리한 후에 회수하여, 전체 세포수, 생세포수 및 세포수 비율을 산출하여 비교했다. 데이터는 2개의 예에 대한 평균값으로 나타내었다.

결과를 표 2에 나타낸다.

표 중의 각 항목은 이하의 것을 나타낸다:

생존율은, 2주간 보존 후의 전체 세포수 중의 생세포수의 비율이다.

사세포에는, 완전히 막이 파괴된 사세포와, 막의 파괴에 이르고 있지 않은 사세포의 양쪽이 포함된다. 사세포가 많이 존재하면 이식 후에 세포로부터 누출 성분에 의해서 염증이 야기될 우려가 있다. 따라서, 사세포가 많이 존재하는 것은 이식에는 바람직하지는 않다.

세포수 비율은, 2주간 보존 후에 확인된 생세포수와, 2주간 전에 투여한 투여 세포수의 비율이다.

생세포수는, 2주간 보존 후에 확인된 생세포의 수이다.

표 2에 나타낸 바와 같이, 배지 A0, A1 및 A2 중 어느 경우에 있어서도, 세포수 비율은 거의 변하지 않았다. 따라서, 덱사메타손 및 소마토메딘의 첨가에 의한 연골 세포의 보존성은 개선되지 않는다는 것이 시사되었다. 따라서, 이하의 실험에서는, A0 배지, 즉 5μg/mL의 인슐린, 0.1μg/mL의 FGF 및 5%의 혈청을 포함하는 DMEM을 사용하는 것으로 했다. 또한, 어느 배지의 경우에도 세포수 비율이 25% 정도로 낮은 값이었다. 이것은 정치에 의한 보존이 원인이라고 생각되었다. 이하의 실험에 있어서는, 진탕 보존을 행하는 것으로 했다.

·실험 2

배지 A0에 있어서, FGF 및 인슐린이, 세포 부착 다공질체의 장기 보존 후의 세포에 악영향을 미치고 있는지 여부를 확인한다. 배지 A0으로부터 FGF를 제외한 배지, 즉 인슐린 5μg/mL 및 5%의 혈청을 포함하는 DMEM 배지(즉, A3 배지)와, 배지 A0으로부터 FGF 및 인슐린을 제외한 배지, 즉 5%의 혈청을 포함하는 DMEM 배지(즉, A4 배지)로 세포에 대한 영향을 비교했다.

세포 부착 다공체를, 실험 1과 마찬가지로 조제했다. 상기 (1)∼(2)에 따라서 조제한 계대 배양 세포를 이용하여 아텔로콜라겐을 포함하는 세포 현탁액을 조제했다. 투여 세포수가, 투여 생세포수 1.2×10⁶cells로 되도록 조제된 1.0×10⁷cells/mL의 세포 현탁액을 크기 10(W)×5(L)×3(H)의 반원주상의 폴리락트산제 다공질체에 투여했다. 37℃의 인큐베이터 내에 2시간 정치하는 것에 의해 아텔로콜라겐을 겔화한 후, 배지 A0, A3 또는 A4를 30mL씩 수용한 밀폐 용기 내에 수납하고, 초소형 항온 진탕 배양기(다이테크사제, V·BR-36)를 이용하여 37℃에서 진탕 속도 15rpm으로 진탕하면서 2주간 보존했다.

각 배지의 조성을 이하에 정리한다:

배지 A0의 조성: 인슐린 5μg/mL, FGF 0.1μg/mL 및 5% 혈청;

배지 A3의 조성: 인슐린 5μg/mL 및 5% 혈청;

배지 A4의 조성: 5% 혈청.

그 후, 생존율, 생세포수 및 세포수 비율을 얻었다. 그 결과를 표 3에 나타낸다. 데이터는 2개의 예의 평균값으로 나타내었다.

배지 A3 및 A4와 비교하여, 배지 A0의 세포수 비율 및 생존율은 모두 높은 것이 분명해졌다. 또한, 정치 보존과 비교하여, 진탕 보존 쪽이 세포수 비율 및 생존율은 모두 높은 것이 분명해졌다. 이것은 보존용 배지가 세포 부착 다공체에 대하여 약간이기는 하지만 어떤 유속을 가지고 접촉하여, 다공질체에 부착된 세포에 보존용 배지가 공급되기 쉬워지거나, 또는 다공질체 내의 세포가 발생시키는 노폐물이 보존용 배지의 흐름에 의해 1개소에 머무름이 없이 흘렀기 때문인 것으로 추정된다. 즉, 보존용 배지의 유속은 0을 초과하는 상태인 것이 바람직하다.

예 1의 정리

본 발명의 목적은, 다공질체에 세포를 부착시키는 것에 의해 제작된 세포 부착 다공질체를 일본 약전에서 정해진 무균 시험의 기간, 즉 14일간에 걸쳐, 배지 교환을 행하지 않고서 연골 세포를 양호한 상태로 보존하는 것이다. 그것을 위해서는 생존율 100%, 세포수 비율 100%가 보다 바람직하다. 한편, 세포수 비율이 100%를 크게 초과한다고 하는 것은, 보존 기간 동안에 세포가 증식하고 있는 것을 의미한다. 또한, 세포 증식 = 암화일 우려도 있다. 따라서, 2주간의 보존 기간 후에 있어서의 세포수 비율은 100% 전후가 바람직하다. 본 발명의 방법에 따르는 보존 기간 후에 있어서의 세포수 비율은 약 80%∼약 120%이면 좋고, 바람직하게는 약 90%∼약 110%이면 좋다.

예 1에 있어서, 생존율 및 세포수 비율이 보다 바람직한 조건은, 실험 2의 조건에서 A0 배지를 사용한 경우였다. 즉, 5μg/mL의 인슐린, 0.1μg/mL의 FGF 및 5%의 혈청을 포함하는 DMEM을 보존용 배지로서 사용하여, 37℃의 진탕 하에서 보존한 경우에, 보다 바람직한 생존율 및 세포수 비율이 얻어졌다. 따라서, 이하의 실험에서는, 배지 A0을 사용하여 진탕 보존을 행하는 것으로 했다.

<예 2>

보존용 배지의 양 및 투여 세포수

다공질체에 세포를 파종한 상태에서 14일간 보존하기 위해서 최적인 세포수 및 배지량을 발견하기 위해서 복수의 실험을 행했다.

·실험 3

세포 부착 다공질체를 양호하게 보존하기 위해서 필요한 보존용 배지의 양을 검토하기 위해서, 세포 부착 다공질체를 이용하여 실험을 행했다.

상기 (1)∼(2)와 마찬가지의 방법에 의해 얻은 아텔로콜라겐을 포함하는 세포 현탁액을 조제했다. 투여 생세포수가 1.5×10⁶cells로 되도록 투여 세포 농도 1×10⁷cells/mL의 세포 현탁액을 크기 10(W)×5(L)×3(H)의 반원주상의 폴리락트산제 다공질체에 투여했다. 37℃의 인큐베이터 내에 2시간 정치하는 것에 의해 아텔로콜라겐을 겔화한 후, 세포 부착 다공질체를 제작했다. 이것을, 배지 A0을 30mL 또는 300mL를 각각 수용한 편봉지 통체에 수납하고, 캡을 닫았다. 이에 의해 밀폐 용기에 세포 부착 다공질체를 수납했다. 이것을, 초소형 항온 진탕 배양기(다이테크사제, V·BR-36)를 이용하여 환경 온도 37℃에서 2주간, 진탕 속도 15rpm으로 진탕하면서 2주간에 걸쳐 보존했다.

그 후, 생존율, 생세포수 및 세포수 비율을 얻었다. 결과를 표 4에 나타낸다.

투여 세포 농도가 1×10⁷cells/mL이고 투여 세포수가 1.5×10⁶cells인 세포 현탁액을 이용하여 세포 부착 다공질체를 제작한 경우, 배지량 30mL 및 300mL 중 어느 경우도 14일 후에는 세포수가 증가했다. 이 결과로부터, 투여 세포 농도가 1×10⁷cells/mL이고 투여 세포수가 1.5×10⁶cells인 세포 현탁액을 사용한 경우에는, 보존용 배지의 양은 적어도 30mL 있으면 충분하다는 것이 시사되었다.

·실험 4

실험 3의 결과로부터, 보존용 배지의 양은 30mL로 충분하다는 것이 분명해졌다. 다음으로, 투여 세포 농도에 대하여 검토했다.

투여 세포 농도 및 투여 세포수만을 변경하고, 다른 조건은 실험 3과 마찬가지의 조건에서 세포 부착 다공질체를 2주간 보존했다.

상기 (1)∼(2)와 마찬가지의 방법에 의해 얻은 아텔로콜라겐을 포함하는 세포 현탁액을 조제했다. 투여 생세포수가 3×10⁶cells로 되도록 투여 세포 농도 2×10⁷cells/mL의 세포 현탁액을 크기 10(W)×5(L)×3(H)의 반원주상의 폴리락트산제 다공질체에 투여했다. 37℃의 인큐베이터 내에 2시간 정치하는 것에 의해 아텔로콜라겐을 겔화한 후, 세포 부착 다공질체를 제작했다. 이것을, 배지 A0을 30mL 수용한 편봉지 통체에 수납하고, 캡을 닫았다. 이에 의해 밀폐 용기에 세포 부착 다공질체를 수납했다. 이것을, 초소형 항온 진탕 배양기(다이테크사제, V·BR-36)를 이용하여 환경 온도 37℃에서 2주간, 진탕 속도 15rpm으로 진탕하면서 2주간에 걸쳐 보존했다.

그 후, 생존율, 생세포수 및 세포수 비율을 얻었다. 결과를 표 5에 나타낸다. 데이터는 2개의 예의 평균값으로 나타내었다.

투여 세포 농도가 2×10⁷cells/ml이고 투여 세포수가 3×10⁶cells인 경우, 배지량 30mL에서 세포수 비율은 103%였다. 이 결과로부터, 실험 4의 조건에 있어서 양호하게 세포를 보존할 수 있다는 것이 시사되었다.

·실험 5

상기의 실험 4에 나타낸 바와 같이, 투여 세포 농도가 2×10⁷cells/mL이고 투여 세포수가 3×10⁶cells인 경우에, 배지량을 30mL로 사용하는 것에 의해 세포수 비율은 103%인 것을 확인할 수 있었다. 다음으로, 실제의 재생 의료 현장에서 이용될 가능성이 높은 크기의 다공질체를 사용하여 보존 조건을 검토했다.

상기 (1)∼(2)와 마찬가지의 방법에 의해 얻은 아텔로콜라겐을 포함하는 세포 현탁액을 조제했다. 투여 생세포수가 3.5×10⁶cells 또는 7×10⁶cells로 되도록 투여 세포 농도 5×10⁷cells/mL 또는 1×10⁸cells/mL의 세포 현탁액을 크기 6(W)×5(L)×3(H)의 반원주상의 폴리락트산제 다공질체에 투여했다. 아텔로콜라겐의 겔화를 행하지 않고서, 세포 부착 다공질체를 제작했다. 이것을, 배지 A0을 50mL 수용한 편봉지 통체에 수납하고, 캡을 닫았다. 이에 의해 밀폐 용기에 세포 부착 다공질체를 수납했다. 이것을, 초소형 항온 진탕 배양기(다이테크사제, V·BR-36)를 이용하여 환경 온도 37℃에서 2주간, 진탕 속도 15rpm으로 진탕하면서 2주간에 걸쳐 보존했다.

여기서, 이와 같은 실험 5의 결과를 전술한 실험 4의 결과와 비교하면, 실험 5에 있어서의 투여 세포 농도인 5.0×10⁷cells/mL 및 1.0×10⁸cells/mL는, 실험 4의 투여 세포 농도의 각각 2배 및 5배이다. 그러나, 실험 5에서 사용한 세포 부착 다공질체는, 실험 4에서 이용한 세포 부착 다공질체의 체적의 6할인 체적이다. 따라서, 실험 4와 비교했을 때의 다공질체의 체적에 대한 투여 생세포수는, 실험 5에 있어서의 투여 세포 농도가 5.0×10⁷cells/mL 및 1.0×10⁸cells/mL인 경우에, 각각 1.17배 및 2.3배 정도가 된다. 이와 같은 조건과, 실험 2의 양호한 결과를 낳는 조건을 고려하여, 실험 5에서는 50mL의 양의 보존용 배지를 사용했다.

상기의 조건에서 세포 부착 다공질체를 보존한 후에, 생존율, 생세포수 및 세포수 비율을 계측 및 산출했다. 결과를 표 6에 나타낸다. 데이터는, 0일째에 대해서는 2개의 예의 평균값, 14일째에 대해서는 3개의 예의 평균값으로 나타내었다.

이 결과로부터, 투여 세포 농도 5.0×10⁷cells/mL에서는, 보존용 배지의 양 50mL에서 세포수 비율을 약 90%로 유지할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 한편, 투여 세포 농도 1×10⁸cells/mL의 경우, 세포수 비율은 59.5%였다.

투여 세포 농도 5×10⁷cells/mL에서 세포 부착 다공질체를 제작한 경우에는, 보존용 배지를 50mL로 하는 것에 의해, 2주간의 보존 후의 세포수 비율은 90.9%였다. 따라서, 이와 같은 조건이면, 양호하게 세포 부착 다공질체의 보존이 가능하다고 판단했다.

이들의 결과로부터, 연골 세포를 양호하게 장기간에 걸쳐 보존하기 위해서는, 보존용 배지의 양을 적절한 조건으로 하는 것이 중요하다고 생각된다. 한편, 보존용 배지에 포함되는 영양 성분, 예컨대 혈청 등의 함유량이 영향을 줄 가능성도 시사되었다. 즉, 채용된 투여 세포수에 대하여, 사용되는 보존용 배지의 양이 적은 경우에는, 세포로의 영양 공급량이 적기 때문에 세포수 비율이 낮은 결과가 된다는 것도 시사된다. 보존용 배지의 양을 증가시킴이 없이, 보존용 배지에 포함되는 영양 성분의 양을 증대하는 것에 의해, 즉 혈청량을 증가시키는 것에 의해, 어느 투여 세포수에 대해서도 양호하게 세포를 장기간에 걸쳐 보존하는 것이 가능하다는 것이 시사되었다.

한편, 실험 결과는 나타내지 않지만, 투여 세포 농도 1×10⁸cells/mL로 제작된 세포 부착 다공질체와, 투여 세포 농도 5×10⁷cells/mL로 제작된 세포 부착 다공질체에 대하여 연골의 재분화의 경향을 검증한 바, 어느 투여 세포 농도의 경우에 있어서도 재분화의 경향에 차는 없었다.

<예 3>

진탕 속도의 검토

상기 예 2에서 나타낸 바와 같이, 양호한 결과를 얻을 수 있는 몇 개의 조건, 즉 투여 세포 농도, 보존용 배지의 양 및 보존 환경 조건 등이 밝혀졌다. 그러나, 더욱 세포수 비율을 높이기 위한 추가적인 조건을 구하기 위한 검토를 행했다.

·실험 6

실험 5에서 투여 세포 농도 5×10⁷cells/mL를 이용하여 제작한 세포 부착 다공질체를, 50mL의 보존용 배지에서 보존했을 때에는 세포수 비율이 90.9%였다. 그와 같은 실험 5의 조건을 유지하면서, 더욱 생존율 및 세포수 비율을 향상시키기 위한 추가적인 조건에 대하여 검증했다.

추가적인 보존 조건으로서 진탕 속도에 대하여 검토했다. 진탕 속도가 세포 부착 다공질체의 장기 보존 후의 세포에 주는 영향에 대하여 검토했다. 투여 생세포수가 3×10⁶cells로 되도록 투여 세포 농도 5×10⁷cells/mL를 사용하여 세포 부착 다공질체를 제작하는 것, 및 보존 중 60rpm으로 진탕하는 것 이외에는, 실험 5와 마찬가지의 방법에 의해 실험을 행했다.

상기의 조건에서 세포 부착 다공질체를 2주간에 걸쳐 보존한 후에, 생존율, 생세포수 및 세포수 비율을 계측 및 산출했다. 결과를 표 7에 나타낸다. 데이터는, 3개의 예의 평균값으로 나타내었다.

진탕 속도가 15rpm일 때에 비하여, 60rpm일 때인 쪽이 생존율 및 세포수 비율 모두 양호했다. 이와 같은 결과로부터, 진탕 속도를 빠르게 하는 것에 의해, 다공질체 내의 세포로 배지에 포함되는 영양분의 공급이 원활히 행해진다는 것이 시사되었다.

또한, 진탕 속도가 15rpm일 경우, 보존용 배지의 유속은 유속 측정기 등으로는 측정할 수 없는 정도(단, 0은 아니다)였다. 진탕 속도가 60rpm일 경우에는 진탕기의 움직임에 수반하여 보존용 배지의 수면이 분명히 오르내리고, 그의 유속은 0.5∼1.0cm/s였다. 보존용 배지의 유속이 높아질수록 다공질체 내의 세포에 대하여 배지에 포함되는 영양분이 보다 원활히 공급되는 것으로 추정할 수 있다. 한편, 15rpm 및 60rpm 중 어느 경우에 있어서도, 다공질체에 손상이 없다는 것을 육안에 의해 확인했다.

여기에서, 진탕 속도는, 다공질체에 내포된 세포로 배지가 공급되는 유속, 즉 진탕기의 진탕 진폭, 회전수, 왕복수, 또는 경사 정확도, 및 그의 주기에 관계되어 있다는 것이 시사되었다. 그러나, 진탕 속도를 극단적으로 높인 경우에는, 다공질체가 손상될 우려가 있다. 그 때문에, 회전수를 극단적으로 높일 수는 없다고 하는 일면도 있다. 따라서, 다공질체가 손상되지 않는 범위 내의 높은 속도로 진탕시키는 것이 중요하다는 것이 시사되었다.

<예 4>

보존 온도의 검증

보존 온도를 어느 정도 가변할 수 있는가에 대하여 검증했다.

·실험 7

보존 온도가 37℃ 또는 32℃인 경우에 대하여, 세포 부착 다공질체의 장기 보존 후의 세포에 주는 영향을 검토했다.

상기 (1)∼(2)와 마찬가지의 방법에 의해 얻은 아텔로콜라겐을 포함하는 세포 현탁액을 조제했다. 투여 생세포수가 3.5×10⁶cells 또는 7.0×10⁶cells로 되도록 투여 세포 농도 5.0×10⁷cells/ml, 1.0×10⁸cells/ml의 세포 현탁액을, 크기 6(W)×5(L)×3(H)의 반원주상의 폴리락트산제 다공질체에 투여했다. 37℃의 인큐베이터 내에 2시간 정치하는 것에 의해 아텔로콜라겐을 겔화한 후, 세포 부착 다공질체를 제작했다. 이것을, 배지 A0을 50mL 수용한 편봉지 통체에 수납하고, 캡을 닫았다. 이에 의해 밀폐 용기에 세포 부착 다공질체를 수납했다. 이것을, 초소형 항온 진탕 배양기(다이테크사제, V·BR-36)를 이용하여, 환경 온도 37℃ 또는 32℃에서 2주간, 진탕 속도 60rpm으로 진탕하면서 2주간에 걸쳐 보존했다.

상기의 조건에서 세포 부착 다공질체를 보존한 후에, 생존율, 생세포수 및 세포수 비율을 계측 및 산출했다. 결과를 표 8에 나타낸다. 데이터는 5.0×10⁷cells/ml의 37℃에 대해서는 10개의 예, 32℃에 대해서는 12개의 예, 1.0×10⁸cells/ml의 37℃에 대해서는 3개의 예, 32℃에 대해서는 5개의 예의 평균값으로 나타내었다.

투여 세포 농도 5.0×10⁷cells/mL로 제작된 세포 부착 다공질체를 32℃에서 보존했을 때, 세포수 비율이 110.4% 및 생존율이 95.4%로, 표 8의 다른 조건일 때에 비하여 모두 보다 양호한 보존이 달성되었다.

한편, 투여 세포 농도 1.0×10⁸cells/mL로 제작된 세포 부착 다공질체의 경우에서는, 37℃에서 보존했을 때보다도 32℃에서 보존했을 때 쪽이, 세포수 비율 및 생존율 모두 양호한 결과를 얻을 수 있었다.

표 8에 나타낸 세포수 비율에 대한 각 값을 그래프로 표시한 결과를 도 5에 나타낸다. 도 5의 결과로부터, 보존 온도를 37℃로부터 32℃로 낮추는 것에 의해, 안정적으로 세포 부착 다공질체를 보존할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 세포 투여 농도가 1×10⁸cells/mL인 경우에서는, 5.0×10⁷cells/mL인 경우와 비교하여, 생존율 및 세포수 비율이 낮아, 보존성이 낮은 것을 알 수 있다. 따라서, 세포 부착 다공질체의 제작에는, 5.0×10⁷cells/mL의 농도를 사용하는 것이 바람직하다고 생각했다.

·실험 8

상기 실험 7에 있어서, 보존 온도는 37℃보다도 32℃인 쪽이 양호한 보존이 달성될 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 실험 8에서는, 보존 온도를 어느 정도 가변할 수 있는가에 대하여 검증했다.

상기 (1)∼(2)와 마찬가지의 방법에 의해 얻은 아텔로콜라겐을 포함하는 세포 현탁액을 조제했다. 투여 생세포수가 3.5×10⁶cells로 되도록 투여 세포 농도 5.0×10⁷cells/mL의 세포 현탁액을 크기 6(W)×5(L)×3(H)의 반원주상의 폴리락트산제 다공질체에 투여했다. 37℃의 인큐베이터 내에 2시간 정치하는 것에 의해 아텔로콜라겐을 겔화한 후, 세포 부착 다공질체를 제작했다. 이것을, 배지 A0을 50mL 수용한 편봉지 통체에 수납하고, 캡을 닫았다. 이에 의해 밀폐 용기에 세포 부착 다공질체를 수납했다. 이것을, 초소형 항온 진탕 배양기(다이테크사제, V·BR-36)를 이용하여, 환경 온도 30℃, 32℃ 또는 34℃에서 2주간, 진탕 속도 60rpm으로 진탕하면서 2주간에 걸쳐 보존했다.

상기의 조건에서 세포 부착 다공질체를 보존한 후에, 생존율, 생세포수 및 세포수 비율을 계측 및 산출했다. 결과를 표 9에 나타낸다. 데이터는 30℃, 34℃에 대해서는 3개의 예, 32℃에 대해서는 6개의 예의 평균값으로 나타내었다.

표 9는 30℃, 32℃ 및 34℃에서 각각 보존한 경우의 결과를 나타낸다.

표 9에 나타낸 세포수 비율에 대한 각 값을 그래프로 나타낸 결과를 도 6에 나타낸다. 도 6의 결과로부터, 보존 온도 30℃, 32℃ 및 34℃ 중 어느 조건에 있어서도, 안정적으로 세포 부착 다공질체를 보존할 수 있다는 것이 밝혀졌다.

30℃, 32℃ 및 34℃ 중 어느 조건에서도 양호한 생존성이 유지되었다. 안전 여유를 고려하면, 32℃에서 보존하는 것이 바람직한 것으로 시사되었다.

<예 5>

다공질의 크기를 변경한 경우의 검토

·실험 9

실험 1, 2, 3 및 4에서는 10(W)×5(L)×3(H)의 크기의 다공질체를 이용했다. 실험 5, 6, 7 및 8에서는 6(W)×5(L)×3(H)의 크기의 다공질체를 이용했다. 이들 다공질체를 각각 사용하여 세포 부착 다공질체를 제작했다. 제작된 세포 부착 다공질체를 보존할 때의 보존 조건을 검토했다. 또, 실험 9에서는, 6(W)×50(L)×3(H)의 크기의 다공질체에 대하여, 최적의 보존 조건을 검토했다.

상기 (1)∼(2)와 마찬가지의 방법에 의해 얻은 아텔로콜라겐을 포함하는 세포 현탁액을 조제했다. 투여 생세포수가 3.5×10⁷cells로 되도록 투여 세포 농도 5.0×10⁷cells/mL의 세포 현탁액을 크기 6(W)×50(L)×3(H)의 반원주상의 폴리락트산제 다공질체에 투여했다. 37℃의 인큐베이터 내에 2시간 정치하는 것에 의해 아텔로콜라겐을 겔화한 후, 세포 부착 다공질체 A를 제작하여 실험 A에 사용했다. 마찬가지의 방법에 의해, 추가로 3개의 세포 부착 다공질체 B, C 및 D를 제작하여 각각 실험 B∼D에 사용했다.

얻어진 세포 부착 다공질체 A, B, C 및 D를 각각 5μg/mL의 인슐린, 0.1μg/mL의 FGF 및 10% 혈청을 포함하는 DMEM 배지(즉, 배지 A5)를 250mL 수용한 편봉지 통체에 수납하고, 캡을 닫았다. 이에 의해 밀폐 용기에 세포 부착 다공질체를 수납했다. 이것을, 초소형 항온 진탕 배양기(다이테크사제, V·BR-36)를 이용하여, 각각 환경 온도 32℃에서 2주간, 진탕 속도 90rpm으로 진탕하면서 2주간에 걸쳐 보존했다.

상기의 조건에서 세포 부착 다공질체 A, B, C 및 D를 각각 보존한 후에, 생존율, 생세포수 및 세포수 비율을 각각 계측 및 산출했다. 결과를 표 10에 나타낸다.

표 10 중의 실험 A∼D의 평균 세포수 비율은 88.6%였다.

여기서, 6(W)×50(L)×3(H)의 크기의 다공질체가 실제로 유지할 수 있는 세포수는 3.0×10⁷cells이다. 따라서, 다공질체가 유지할 수 있는 세포수를 고려하여, 측정된 88.6%의 평균 세포수 비율을 보정하면, 보정 후의 평균 세포수 비율은 103.3%가 된다. 이 보정은 이하의 식에 따라서 계산했다:

세포수 비율(%) = (세포 부착 다공질체로부터 회수한 생세포수)/(다공질체가 실제로 유지할 수 있는 세포수(3.0×10⁷cells))×100.

이상의 결과로부터, 6(W)×50(L)×3(H)의 크기의 다공질체를 이용한 경우에 있어서도, 세포 부착 다공질체를 양호하게 장기 보존하는 것이 가능한 것이 분명해졌다.

여기서, 전술한 실험 1∼실험 8에 있어서는, 실험 9보다도 작은 다공질체를 사용했다. 실험 1∼실험 8과 같은 작은 다공질체의 경우, 다공질체에 대하여 세포 현탁액을 투여했을 때의 손실은 거의 없다. 그에 비하여 실험 8과 같은 큰 다공질체의 경우에는 투여에 의해 손실이 생긴다. 그 때문에 다공질체에 투여하는 세포수를 조금 많게 설정했다. 한편, 다공질체가 실제로 유지할 수 있는 양은, 다공질체의 체적에 기공률 87%를 곱한 양이다. 따라서, 다공질체가 실제로 유지할 수 있는 세포수는, 다음 계산식: 5.0×10⁷cells/mL×0.59mL = 3.0×10⁷cells에 의해 산출된다.

또한, 실험 9의 조건 설정은 다음과 같이 행했다. 실험 9에 있어서 사용하는 다공질체의 크기는 6(W)×50(L)×3(H)이다. 이 다공질체는, 실험 5∼8에 있어서 사용한 다공질체 6(W)×5(L)×3(H)의 10배의 체적이다. 따라서, 실험 9에서 사용하는 다공질체는, 실험 5∼8에서 사용한 다공질체의 10배가 된다. 따라서, 보존용 배지의 양은, 실험 5∼8에서 채용한 50mL의 10배인 500mL를 선택하는 것도 생각되었다. 그러나, 실험 5의 고찰에 기초하여, 보존용 배지의 양은 250mL로 하고, 거기에 포함되는 혈청의 농도를 10%로 하여 실험을 행했다. 또한, 실험 5∼8에 있어서 밀폐 용기 중에서 생기는 보존용 배지의 순환과 동등한 순환을 얻기 위해서, 진탕 속도를 90rpm으로 설정했다.

실제로는 진탕 속도를 90rpm으로 설정하면, 보존용 배지의 유속은 1.6∼2.8cm/s이며, 이와 같은 유속 하에서 연골 세포가 부착된 다공질체를 보존하면, 연골 세포로의 영양 공급이 충분히 행해지고, 또한 세포로부터의 노폐물이 적절히 다공질체 내로부터 유출된 결과, 양호하게 보존을 행할 수 있었던 것으로 추정되었다. 전술한 각 예를 고려하면, 보존용 배지의 유속 u는 0 < u ≤ 2.8cm/s, 바람직하게는 1.6∼2.8cm/s이다.

<예 6>

예 1∼예 5의 실험에 의해 바람직하다는 것이 밝혀진 조건에서 세포 부착 다공질체를 보존했다.

전술한 「1. 연골 세포 부착 다공질체의 제작 순서」의 (1)∼(4)에 기재된 방법에 의해, 세포 부착 다공질체를 제작했다. 또한, 다공질체로의 세포의 투여는, 3.5×10⁷cells로 되도록 투여 세포 농도 5.0×10⁷cells/mL의 세포 현탁액을 이용하여 크기 6(W)×50(L)×3(H)의 반원주상의 폴리락트산제 다공질체에 투여하는 것에 의해 행했다.

·장기 보존

상기에서 제작된 세포 부착 다공질체를 이하와 같이 보존했다.

겔화 종료 후, 세포 부착 다공질체를 페트리 디쉬로부터 신속하게 취출하고, 미리 5μg/mL의 인슐린, 0.1μg/mL의 FGF, 10%의 혈청 및 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 보존용 배지 A5를 수용한 편봉지 통체에 수납하고, 캡을 꽉 닫았다. 이에 의해 세포 부착 다공질체를 밀폐 용기 내에 수납했다. 마찬가지로 하여 동일한 것을 5개 제작했다. 여기서 사용되는 보존용 배지는, 겔화가 종료하기에 앞서서, 밀폐 용기의 편봉지 통체 내에서 조제했다. 우선, 50mL의 피펫으로 DMEM을 225mL 가했다. 다음으로, 5mL의 피펫으로 100유닛/mL 페니실린-0.1mg/mL 스트렙토마이신을 2.5mL 가했다. 추가로, 이것에 1000μL의 칩으로 100μg/mL의 FGF를 각 250μL 가했다. 다음으로, 1000μL의 칩으로 인슐린으로서 노보린 R을 350μL 가했다. 추가로, 25mL의 피펫으로 혈청을 25mL 가하여 잘 혼합하여 조제했다.

5개의 세포 부착 다공질체를 포함하는 밀폐 용기를 32℃에서 90rpm으로 진탕하면서 인큐베이팅했다. 2시간 후에 5개의 밀폐 용기 중 1개로부터 세포 부착 다공질체를 취출하여, 무균 검사용으로 사용했다. 7일 후에 남은 4개 중 1개의 용기로부터 세포 부착 다공질체를 취출하여, 생화학 검사 및 mRNA 검사를 행했다. 진탕 개시로부터 14일 후에, 남은 3개의 밀폐 용기 중 1개로부터 세포 부착 다공질체를 취출하여 세포수 측정을 행했다. 검사 결과를 얻어, 그들의 결과가 출하 기준을 만족시키고 있는 경우에, 남은 2개의 밀폐 용기에 수납된 상태에서 세포 부착 다공질체를 이식에 사용하기 위해서 출하한다.

이와 같이 보존된 세포 부착 다공질체는, 양호한 세포 생존율 및 세포수 비율을 나타내었다. 본 발명에 의해서, 다공질체에 세포를 부착시키는 것에 의해 제작된 세포 부착 다공질체를 일본 약전에서 정해진 무균 시험의 기간, 즉 14일간에 걸쳐 배지 교환을 행하지 않고서 연골 세포를 양호한 상태로 보존하는 것이 가능해졌다.

한편, 본 실시예에서는 진탕의 동작을 직경이 20mm인 원 운동의 경우를 예로 들어 설명했지만, 이에 한정하는 것은 아니며, 원 운동의 직경을 10mm 내지 50mm로 설정해도 좋고, 또한 원 운동이 아니라 왕복 운동이나 슬라이드 대를 이용한 경사에 의한 진탕에 의해 세포 부착 다공질체에 내포된 세포로 배지가 공급되면 마찬가지의 효과를 달성할 수 있다.

또, 진탕의 동작을 원 운동의 직경 10mm 내지 50mm로 설정한 경우, 배지의 유속이 원 운동의 직경에 비례한다고 가정하면, 유속은 0을 초과하여 7cm/s 정도의 범위가 되어, 다공질체가 파손되지 않는 한 이 범위의 유속을 부여함으로써 바람직한 결과를 얻을 수 있을 것으로 예상된다. 또한, 진탕의 동작을 직선 운동으로 한 경우에는, 원 운동과 비교하여 배지가 밀폐 용기의 내벽에 힘차게 부딪쳐, 순간적으로 일부의 배지에서는 유속이 높은 부분이 생겨 있는 것과 같이 보였지만, 배지 전체의 유속으로서는 거의 동일한 범위라고 생각된다.

또한, 본 실시예에 이용한 기초 배지의 성분은, 염화칼륨, 염화나트륨 등의 무기염, L-알기닌·HCl, L-시스틴·2HCl, L-히스티딘·HCl·H₂O, L-아이소류신, L-류신, L-라이신·HCl, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신·2Na·2H₂O, L-발린 등의 아미노산, 염화콜린, 엽산, 나이아신아마이드, D-판토텐산, 피리독살·HCl, 리보플라빈, 싸이아민·HCl 등의 바이타민 및 글루코스 등의 당을 포함하는 것이지만, 이들 모든 성분이 필수적인 것은 아니며, 세포를 배양하기 위한 배지이면, 마찬가지의 효과를 발휘한다.

Claims

연골 세포 부착 다공질체를 밀봉 상태에서 적어도 14일간에 걸쳐 장기 보존하는 방법으로서,
단리된 연골 세포를 2∼3% 아텔로콜라겐 용액에 1.0×10⁷cells/ml∼1.0×10⁸cells/ml의 투여 세포 농도로 현탁하여 세포 현탁액을 조제하는 것과,
상기 세포 현탁액을 생체 적합성 다공질체에 파종하는 것과,
상기 세포 현탁액을 상기 다공질체에 있어서 겔화하여 연골 세포 부착 다공질체를 얻는 것과,
상기 연골 세포 부착 다공질체를, 밀봉 상태에서, 투여 생세포수 1.0×10⁵cells당 1mL 이상의 양의, 인슐린, 섬유 아세포 성장 인자 및 5% 이상의 혈청을 포함하는 배지 중에서, 배지의 진탕 속도가 0cm/s보다도 크고 2.8cm/s 이하인 범위에서 진탕하면서, 보존 온도 26∼37℃에서 유지하는 것
을 구비하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 진탕 속도가 1.6cm/s∼2.8cm/s의 범위인 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 진탕 속도가, 진탕 진폭이 직선인 경우에는 적어도 1방향으로 10mm∼50mm, 원 방향인 경우에는 그 직경이 10mm∼50mm이며, 진탕 속도 15rpm∼90rpm인 범위에서의 진탕에 의해 달성되는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 연골 세포가 이개(耳介) 연골 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 혈청 농도가 배지 중에 5체적% 이상으로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 혈청 농도가 배지 중에 10체적% 이상으로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 배지가 DMEM/F12인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 보존 온도가 30℃∼34℃인 것을 특징으로 하는 방법.