JP5851520B2 - 軟骨細胞が付着した多孔質体の長期保存方法 - Google Patents
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Description
軟骨細胞が付着した多孔質体を密封状態で少なくとも14日間に亘り長期保存する方法であって、
単離された軟骨細胞をアテロコラーゲンに1.0×107cells/ml〜1.0×108cells/mlの投与細胞濃度で懸濁して細胞懸濁液を調製することと、
前記の細胞懸濁液を多孔質体に播種することと、
前記細胞懸濁液を前記多孔質体においてゲル化して軟骨細胞が付着した多孔質体を得ることと、
前記軟骨細胞が付着した多孔質体を、投与生細胞数1.0×105cellsあたり1mL以上の量の、インスリン、線維芽細胞成長因子および5%以上の血清を含む培地中で、培地の振盪速度が、0cm/sよりも大きく2.8cm/s以下の範囲で振盪しながら、26〜37℃で維持することと、
を具備する方法
である。
本明細書においては「軟骨細胞が付着した多孔質体」を「細胞付着多孔質体」とも称す。細胞付着多孔質体の製造工程の概略を図1を用いて説明する。
細胞付着多孔質体は、多孔質体と、多孔質体の表面および孔の内面に固定された軟骨細胞とを含む。
単離細胞は次のように調製される。まず、軟骨細胞、例えば、耳介軟骨細胞を採取する。次に採取された軟骨細胞から脂肪、血管および血液などを除去する。これを細切する。更に、酵素、例えば、コラゲナーゼ溶液で消化することにより、単離細胞を得る。
密封保存について図3に示す。まず、滅菌された密閉容器30を準備する。この密閉容器30は、開口縁部の外面にネジ切り加工された片封じ筒体31と、開口縁部の内面にネジ切り加工され、片封じ筒体31のネジ部に螺着されるキャップ32とを備える。次いで、片封じ筒体31の内部に保存用培地33を収容する。つづいて、片封じ筒体31の内部に細胞付着多孔質体34を収納する。片封じ筒体31の開口部にキャップ32を螺着して片封じ筒体31内部を密閉する。
保存用培地33の振盪を図4を参照して説明する。まず、例えば楕円形に移動可能なスライド台41を内部に配置した恒温振盪器40を用意する。スライド台41上に密閉容器30をその容器30の軸方向がスライド台41の表面に対して略平行になるように載置する。なお、密閉容器30には細胞付着多孔質体34全体が保存用培地33に沈むように収納されている。
1.軟骨細胞付着多孔質体の作製手順
後述する例1〜例8で使用する軟骨細胞付着多孔質体を基本的に以下のように作製した。
無菌操作により採取された軟骨組織を搬入し、脂肪や血液などを除去した。次に、得られた軟骨を細切した。細切された軟骨を1.2%のコラゲナーゼ溶液に入れて、超小型恒温振盪培養機(タイテック社製、V・BR−36)を用いて37℃で18時間120rpm(長径が20mmの円運動、以下、特に記載がない場合、振盪の動きは同じ)で振盪して、細胞を単離した。単離細胞を所望の細胞数で増殖培地(5μg/mLのインスリン+0.1μg/mLのFGF+5%血清+ペニシリン−ストレプトマイシンを含むDMEM/F12)に懸濁した。細胞懸濁液を、2×105cells/シャーレの濃度でゼラチンコートシャーレに播種した。これを37℃、CO2インキュベータでインキュベートした。
上記(1)の細胞についての培地交換は次の通りに行った。上記(1)の細胞を含む培養中のゼラチンコートシャーレから、アスピレーターにより培地を除去した。次に、増殖培地を各10mL加えた。これを更に、37℃、CO2インキュベータでインキュベートした。培地交換は、3〜4日に1回行った。
次のように継代を行った。初代培養中の細胞を含むゼラチンコートシャーレから細胞をトリプシン処理により剥がし、1本のチューブに纏めた。回収された細胞を増殖培地(5μg/mLのインスリン+0.1μg/mLのFGF+5%血清+ペニシリン−ストレプトマイシンを含むDMEM/F12)に懸濁した。得られた細胞懸濁液を1.5×105cells/フラスコの濃度でゼラチンコートフラスコ18枚に播種した。これを37℃、CO2インキュベータでインキュベートした。
継代培養中の培地交換は次のように行った。ゼラチンコートフラスコから、アスピレーターを用いて培地を除去した。次に、増殖培地をそのゼラチンコートフラスコに20mL加えた。これを37℃、CO2インキュベータでインキュベートした。
ゼラチンコートフラスコ18枚から細胞を剥がし、1本のチューブに纏めて細胞を回収した。回収された細胞懸濁液を遠心分離した後、ペニシリン−ストレプトマイシンを含むMEMにして、その一部を用いて細胞数を測定した。測定された細胞に基づいて、2.25×108cellsに相当する量の細胞懸濁液を25mLのチューブに移し取り、遠心分離後、その上清を除去した。得られた細胞ペレットを、最終液量が3.0mLになるようにペニシリン−ストレプトマイシンを含むMEMに懸濁した。これを3%アテロコラーゲンの1.5mLと混合した。ここで、細胞懸濁液:アテロコラーゲン=2:1であり、混合後のアテロコラーゲンの終濃度は1%である。1mLのシリンジで700μLを採取し、ポリ乳酸製の略半円柱状の多孔質体(6(幅、W)×50(長さ、L)×3(高さ、H))に投与した。多孔質に添加するアテロコラーゲンを含む細胞懸濁液中の量は、多孔質体の大きさに従って決定した。例えば多孔質の大きさが、6(W)×5(L)×3(H)の場合は、投与液量を70μLとし、10(W)×5(L)×3(H)の場合は120〜150μLを投与した。
次に、細胞を投与した多孔質体をペニシリン−ストレプトマイシンを含む保存用培地を入れたシャーレに配置して、37℃のインキュベータ内で2時間静置することによりアテロコラーゲンをゲル化して細胞付着多孔質体を得た。
例における細胞数の計測は、chemometec社製のNucleoCounter(登録商標)を使用して、細胞処理試薬としてReagent A100およびReagent B100(chemometec社製)並びに専用サンプルカセットであるNucleoCassette(登録商標)を用いて行った。
測定しようとする細胞の懸濁液の50μLを試験管に採取し、細胞処理試薬Reagent A100およびReagent B100をそれぞれ50μL加えてサンプルを調製した。
全細胞濃度の測定は、上記の「サンプルの調製」の項で調製されたサンプルをNucleoCassette(登録商標)に吸引し、NucleoCounter(登録商標)にセットした。次にNucleoCounter(登録商標)の「Run」のボタンを押して、全細胞数の測定を開始し、計測結果を得た。
死細胞濃度の測定は次のように行った。培養細胞100μLをチューブにとりNucleoCassette(登録商標)に吸引し、NucleoCounter(登録商標)にセットした。次にNucleoCounter(登録商標)の「Run」のボタンを押し、死細胞数の測定を開始し、計測結果を得た。
生細胞濃度=全細胞濃度―死細胞濃度
細胞生存率=生細胞濃度/全細胞濃度。
保存用培地の組成
細胞付着多孔質体の保存用培地の組成を決定した。成長因子であるインスリン、FGF(Fibroblast Growth Factors:線維芽細胞増殖因子)、デキサメタゾン(軟骨細胞の再分化を誘導する)およびソマトメジン(軟骨細胞の再分化を誘導する)並びに血清の何れかを組み合わせて含む培地について、細胞付着多孔質体の長期保存後の細胞に与える影響を検討した。
培地A0、A1およびA2を比較した。これらの培地の基礎培地にはDMEMを使用し、ペニシリン−ストレプトマイシンを含む。各培地の組成は以下の通りである。
培地A1の組成:ソマトメジンC100ng/mL、インスリン5μg/mL、FGF0.1μg/mLおよび5%血清;
培地A2の組成:デキサメタゾン1μM、インスリン5μg/mL、FGF0.1μg/mLおよび5%血清。
生存率は、2週間保存後の全細胞数中の生細胞数の割合である。
培地A0において、FGFおよびインスリンが、細胞付着多孔質体の長期保存後の細胞に悪影響を及ぼしているか否かを確認する。培地A0からFGFを除いた培地、即ち、インスリン5μg/mLおよび5%の血清を含むDMEM培地(即ち、A3培地)と、培地A0からFGFおよびインスリンを除いた培地、即ち、5%の血清を含むDMEM培地(即ち、A4培地)とで細胞に対する影響を比較した。
培地A0の組成:インスリン5μg/mL、FGF0.1μg/mLおよび5%血清;
培地A3の組成:インスリン5μg/mLおよび5%血清;
培地A4の組成:5%血清。
本発明の目的は、多孔質体に細胞を付着させることにより作製された細胞付着多孔質体を日本薬局方で定められた無菌試験の期間、即ち、14日間に亘り、培地交換を行わずに軟骨細胞を良好な状態で保存することである。そのためには生存率100%、細胞数比率100%がより好ましい。一方で、細胞数比率が100%を大きく超えるということは、保存期間中に細胞が増殖していることを意味する。また、細胞増殖=癌化である恐れもある。従って、2週間の保存期間後における細胞数比率は100%前後が好ましい。本発明の方法に従う保存期間後における細胞数比率は、約80%〜約120%であればよく、好ましくは約90%〜約110%であればよい。
保存用培地の量および投与細胞数
多孔質体に細胞を播種した状態で14日間保存するために最適な細胞数及び培地量を見出すために複数の実験を行った。
細胞付着多孔質体を良好に保存するために必要な保存用培地の量を検討するために、細胞付着多孔質体を用いて実験を行った。
実験3の結果から、保存用培地の量は30mLで足りることが明らかとなった。次に、投与細胞濃度について検討した。
上記の実験4に示す通り、投与細胞濃度が2×107cells/mLであり、投与細胞数が3×106cellsである場合に、培地量を30mLで使用することによって細胞数比率は103%であることが確認できた。次に、実際の再生医療現場で用いられる可能性が高い大きさの多孔質体を使用して保存条件を検討した。
振盪速度の検討
上記例2で示された通り、良好な結果を得ることができる幾つかの条件、即ち、投与細胞濃度、保存用培地の量および保存環境条件などが明らかになった。しかしながら、更に細胞数比率を高めるための更なる条件を求めるための検討を行った。
実験5で投与細胞濃度5×107cells/mLを用いて作製した細胞付着多孔質体を、50mLの保存用培地で保存したときには細胞数比率が90.9%であった。そのような実験5の条件を維持しながら、更に生存率および細胞数比率を向上するための更なる条件について検証した。
保存温度の検証
保存温度をどの程度可変することができるかについて検証した。
保存温度が37℃または32℃の場合について、細胞付着多孔質体の長期保存後の細胞に与える影響を検討した。
上記実験7において、保存温度は37℃よりも32℃である方が良好な保存が達成できることを確認できた。更に、実験8では、保存温度をどの程度可変できるかについて検証した。
多孔質の大きさを変更した場合の検討
・実験9
実験1、2、3および4では10(W)×5(L)×3(H)の大きさの多孔質体を用いた。実験5、6、7および8では6(W)×5(L)×3(H)の大きさの多孔質体を用いた。これらの多孔質体をそれぞれ使用して細胞付着多孔質体を作製した。作製された細胞付着多孔質体を保存する際の保存条件を検討した。更に、実験9では、6(W)×50(L)×3(H)の大きさの多孔質体について、最適な保存条件を検討した。
細胞数比率(%)=(細胞付着多孔質体から回収した生細胞数)/(多孔質体が実際に維持できる細胞数(3.0×107cells))×100。
例1〜例5の実験により好ましいことが明らかになった条件で細胞付着多孔質体を保存した。
上記で作製された細胞付着多孔質体を以下のように保存した。
Claims (10)
- 軟骨細胞付着多孔質体を密封状態で少なくとも14日間に亘り長期保存する方法であって、
単離された軟骨細胞を2〜3%アテロコラーゲンに1.0×107cells/ml〜1.0×108cells/mlの投与細胞濃度で懸濁して細胞懸濁液を調製することと、
前記の細胞懸濁液を生体適合性の多孔質体に播種することと、
前記細胞懸濁液を前記多孔質体においてゲル化して軟骨細胞付着多孔質体を得ることと、
前記軟骨細胞付着多孔質体を、投与生細胞数1.0×105cellsあたり1mL以上の量の、インスリン、線維芽細胞成長因子および5%以上の血清を含む培地中で、培地の振盪速度が、0cm/sよりも大きく2.8cm/s以下の範囲で振盪しながら、26〜37℃で密封状態で維持することと、
を具備する方法。 - 前記振盪速度が、1.6cm/s〜2.8cm/sの範囲である請求項1に記載の方法。
- 前記振盪速度が、振盪振り幅が直線の場合には少なくとも一方向に10mm〜50mm、円方向の場合にはその直径が10mm〜50mmであり、振盪速度15rpm〜90rpmの範囲での振盪により達成される請求項1に記載の方法。
- 前記軟骨細胞が耳介軟骨細胞であることを特徴とする請求項1〜3の何れか1項に記載の方法。
- 前記血清濃度が培地中に5体積%以上で含まれることを特徴とする請求項1〜4の何れか1項に記載の方法。
- 前記血清濃度が培地中に10体積%以上で含まれることを特徴とする請求項1〜5の何れか1項に記載の方法。
- 前記培地がDMEM/F12であることを特徴とする請求項1〜6の何れか1項に記載の方法。
- 前記保存温度が30℃〜34℃であることを特徴とする請求項1〜7の何れか1項に記載の方法。
- 軟骨細胞付着多孔質体を密封状態で少なくとも14日間に亘り長期保存する方法であって、
単離された軟骨細胞を2〜3%アテロコラーゲンに1.0×107cells/ml〜1.0×108cells/mlの投与細胞濃度で懸濁して細胞懸濁液を調製することと、
前記の細胞懸濁液を生体適合性の複数の多孔質体に対して播種することと、
前記複数の多孔質体のそれぞれにおいて前記細胞懸濁液をゲル化して、複数の軟骨細胞付着多孔質体を得ることと、
前記複数の軟骨細胞付着多孔質体のそれぞれを、投与生細胞数1.0×105cellsあたり1mL以上の量の、インスリン、線維芽細胞成長因子および5%以上の血清を含む培地中で、培地の振盪速度が、0cm/sよりも大きく2.8cm/s以下の範囲で振盪しながら、26〜37℃でそれぞれ密封状態で少なくとも14日間に亘り維持することと、
を具備する方法。 - 軟骨細胞付着多孔質体を密封状態で少なくとも14日間に亘り長期保存する方法であって、
単離された軟骨細胞を2〜3%アテロコラーゲンに1.0×107cells/ml〜1.0×108cells/mlの投与細胞濃度で懸濁して細胞懸濁液を調製することと、
前記の細胞懸濁液を生体適合性の複数の多孔質体に対して播種することと、
前記複数の多孔質体のそれぞれにおいて前記細胞懸濁液をゲル化して、複数の軟骨細胞付着多孔質体を得ることと、
前記複数の軟骨細胞付着多孔質体のうちの少なくとも1つを無菌試験用とし、残りの当該軟骨細胞付着多孔質体を、当該軟骨細胞付着多孔質体毎に、投与生細胞数1.0×105cellsあたり1mL以上の量の、インスリン、線維芽細胞成長因子および5%以上の血清を含む培地中で、培地の振盪速度が、0cm/sよりも大きく2.8cm/s以下の範囲で振盪しながら、26〜37℃で、密封状態で少なくとも14日間に亘り維持することと、
を具備する方法。
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