JP2005535354A - 細胞および組織の培養用改良型ローラボトルシステム - Google Patents

Abstract

本発明は、効率よく、連続して、自動的に使用済みの培地に新しい培地を補給する細胞培養のための改良型のローラボトルシステムをもたらす。そのローラボトルシステムは、所定の条件変更に応じて使用済みの培地を除去し、使用済みの培地に新しい培地を補給することにより、培地の使用を最適化する。

Description

本発明は、概ね、細胞培養に関し、さらに詳細には、細胞生産物の調製に適した複数の部屋があるローラボトルに関する。

ローラボトルは、普通、細胞の培養および細胞生産物の生産用に使用される。ローラボトルが回転装置、例えば、ＲｏｌｌｅｒＣｅｌｌ４０（登録商標）（Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ社製）、または、Ｒ_２Ｐ Ｒｏｌｌｅｒ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ａｐｐａｒａｔｕｓ（登録商標）（Ｚｉｎｓｓｅｒ Ａｎａｌｙｔｉｃ（ＵＫ）社製）内に配された後、細胞培養が行なわれる。

細胞培養の効率および製品収量を高めることが引き続き必要である。一般に、培養または製品生産の条件は、経験的に細胞形式に対し最適化されている。他の方法は、オペレーティングパラメータを決定することについて存在する。それから、フィードバックコントロール機構は、代表的に、条件がこれらの最適化されたパラメータ内に確実に維持されるように使用されている。フィードバックコントロールシステムの幾つかは、複雑で、また、ローラボトル培養システムに容易に適合できない。例えば、米国特許第４，８３９，２９２号、米国特許第６，３２３，０２２号を参照。

米国特許第４，８３９，２９２号 米国特許第６，３２３，０２２号

本発明は、効率よく、連続して、自動的に使用済みの培地に新しい培地を補給する細胞培養のための改良型のローラボトルシステム（ＡＲＢＳ）をもたらす。そのＡＲＢＳは、所定の条件変更に応じて使用済みの培地を除去し、使用済みの培地に新しい培地を補給することにより、培地の使用を最適化する。

ＡＲＢＳシステムは、チャンバが円筒形であり、互いに制御された流体連通している複数の部屋があるボトルを含む。１つの実施例において、第１の円筒形チャンバは、新しい培地用リザーバであり、第２の円筒形チャンバは、細胞または組織の培養チャンバであり、第３の円筒形チャンバは、使用済みの培地を保持するためのリザーバである。チャンバ相互間の流体連通は、移送用チャンバにより、制御はバルブ動作により実現される。第１のチャンバと第２のチャンバとの間の流体連通により、作動パラメータが一致したならば制御された新しい培地の添加が可能となる。第２のチャンバと第３のチャンバとの間の流体連通により、使用済みまたは細胞生産物の閾値濃度が到達したならば、第２のチャンバからのその培地の引き出しを可能とする。

流体連通は、円筒形チャンバ相互間のポートに配される一組のコントロールバルブにより調整または制御される。コントロールバルブの開閉により、培地が、一方の円筒形チャンバから次のチャンバに移送用チャンバを介して流れる。新しい培地移送用チャンバは、第１および第２の円筒形チャンバ相互間に配され、即ち、これらのチャンバにおける１以上の一部を含む。さらに、使用済み培地チャンバは、第２の円筒形チャンバと第３の円筒形チャンバとの間に配され、即ち、これらのチャンバにおける１以上の一部を含む。

１つの実施例において、ローラボトルは、その回転軸線の回りを時計回り、または反時計回りに回転する。その結果、重力により、培地が一方のチャンバから次のチャンバに移送可能とされる。

新しい培地移送用チャンバは、ＡＲＢＳが回転するとき、第１の円筒形チャンバから所定の容量の新しい培地をすくい、保持する。保持された培地は、バルブの作動のとき、第２のチャンバに放出される。６時方向の位置で、培地を第２の円筒形チャンバから使用済み移送用チャンバに流れさせるコントロールバルブが、重力感応型ポジションスイッチにより作動されるソレノイドにより開かれる。

初期の始動位置（１２時方向の位置）から３６０°回転し終わったとき、保持された培地を第２の円筒形チャンバに入れさせる、または、培地を使用済み培地移送用チャンバから第３の円筒形チャンバに流れさせるコントロールバルブは、レギュレータアッセンブリに含まれるセンサにより作動されるソレノイドにより、開かれる。

センサは、細胞または組織の培養に関連するいずれかのパラメータ、または、所望される生産物の形態が測定可能とされるように選択される。１つの実施例においては、センサは、ｐＨの変化を測定する。

他の実施例においては、センサは、アンモニアイオン濃度の変化を測定する。

更なる実施例においては、レギュレータは、ｐＨの変化を測定するセンサと、アンモニアイオン濃度の変化を測定するセンサとを含む。

また、レギュレータアッセンブリは、作動的にマグネットに接続される第１および第２のソレノイドを含む。重力感応型ポジションスイッチは、作動的に接続されるマグネットと使用済み培地移送用チャンバ内に相対向して配されるマグネットとの間に磁界を作用させる第１のソレノイドを作動させる。相対向するマグネットで第１のソレノイドにより形成されるその磁界が、培地を第２の円筒形チャンバから使用済み培地用チャンバに流れさせるコントロールバルブを開く。

第２のソレノイドは、センサが第２の円筒形チャンバ内の培地状態の変化を検出し、電気信号を第２のソレノイドに送出した場合、作動される。第２のソレノイドは、接続されるマグネットと使用済み培地移送用チャンバおよび新しい培地移送用チャンバ内に配される相対向するマグネットとの間の磁界を作用させる。それにより、培地を新しい培地移送用チャンバから第２の円筒形チャンバに流れさせる、または、培地を使用済み培地移送用チャンバから第３の円筒形チャンバに流れさせるバルブを開く。

本発明は、ＡＲＢＳを使って細胞を培養する方法を提供する。その方法において、培養培地が第１の円筒形チャンバに導入され、細胞または組織が個別に第２の円筒形チャンバに導入される。細胞または組織は、ＡＲＢＳを時計回り、または反時計回りに回転させることにより培養される。

この方法において、新しい培養培地は、自動的に第１の円筒形チャンバから第２の円筒形チャンバに流れ、第２の円筒形チャンバにおけるｐＨまたは細胞生産物の濃度が監視可能とされる。所望されるｐＨ、細胞生産物の濃度値は、センサにより測定され、そのセンサは、使用済み培地を第２の円筒形チャンバから第３の円筒形チャンバに流れさせ、また、新しい培養培地を第１の円筒形チャンバから第２の円筒形チャンバに流れさせるコントロールバルブを開かせるソレノイドを作動させる。

また、その方法は、ＡＲＢＳシステムにおける第２または第３のチャンバからの細胞生産物が回復される回復工程を含む。

細胞生産物は、全細胞、組織、細胞内部分、分泌された分子、または、細胞内物質交代の生産物を含む。

図１に示されるような本発明のARBSは、概ね、新しい培地用リザーバ（１）、培養用チャンバ（２）、使用済み培地用リザーバ（３）からなる３つの区画された部分により特徴付けられ得る。そのARBSがその縦軸の回りに３６０°回転する間、開閉するスプリング付バルブを用いて、均一の培地流れが培養用チャンバ（２）とそれぞれ新しい培地用リザーバ（１）、使用済み培地用リザーバ（３）との間で自動的に実現される。これらのバルブの開閉は、電気機械的または物理化学的に制御され得る。

また、ARBSは、図２および図３に示されるように、二つの部分からなるアッセンブリを有することにより特徴付けられ、らせん状のねじ部材（１５）が、らせん状のねじ式の受け止め用部材（１６）にねじ込まれる。同様に、らせん状のねじ部材（１５）が、らせん状のねじ式の受け止め用部材（１６）から取り外し可能とされ、ARBSを分解し、培養用チャンバ（２）を露出させる。当業者は、留め金、クリップ、雄/雌突起型アタッチメント、真空封止、または一方の部材を他の部材に固定するための他の手段を含むが限定されない代替的な組み立ておよび分解手段を組み込むことができるだろう。

培養用チャンバ（２）は、細胞または組織が移植される主な培養用の区画された部分であり、新しい培地が新しい培地用リザーバ（１）から導入され、使用済みの培地が使用済み培地用リザーバ（３）に放出される。

培養培地
様々な形式の細胞培養培地は、ＡＲＢＳに関連して有用であり、ネットワークおよびカタログ販売者（例えば、ＧＩＢＣＯ，Ｓｉｇｍａ，ＣｅｌｌＴｅｃｈ社）を通じて容易に利用でき、サプリメント（例えば、アミノ酸、ビタミン、電解質）を有するもの、または有しないもの、または、抗生物質および／または抗酸化剤のような添加剤を有するものまたは有しないものといった様々な栄養分の組み合わせを有するある範囲の量で購入可能とされる。培地の形式が培養される細胞または組織に基づく専用の細胞培養プロトコルに最適に決定されることは、その分野の技術によりまかなえる。

例えば、Dulbeccoの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）は、ハイグルコース製剤、ロウグルコース製剤、およびＬグルタミンおよび塩酸ピリドキシンを含むＦ−１２製剤などの様々な形式で得られる一般に使用される培養培地である。ＤＭＥＭは、哺乳動物の細胞の範囲に対応し、維持するのに理想的である。ＤＭＥＭは、４倍の濃度のアミノ酸およびビタミンを有したバーサルメディウムイーグル（ＢＭＥ）修飾培地のようなマウス胚の細胞用の培養用に当初、開発された。１．０ｇ／Ｌのロウグルコースの配合物は、高濃度培養の維持、および、寒天内の培養に対し推奨される。４．５ｇ／Ｌのハイグルコースの配合物は、固定依存細胞形式に対し（例えば、Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ ｏｒ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ）（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ，Ｒ，ｅｔ ａｌ，（１９５９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ８：３９６−３９７，Ｓｍｉｔｈ，ＪＤ ｅｔ ａｌ（１９６０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２：１８５，Ｍｏｎｔｏｎ，ＨＪ（１９７０）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ６：８９）広く使用される。

また、ＡＲＢＳによる細胞または組織の培養において有用なのは、一例としてここでもたらされるものであってこれに限定する意図でない以下の培地形式である。

高密度細胞培養用に設計された装置において（例えば、ｍｉｎｉＰＥＲＭ（登録商標）、スピナフラスコ、ローラボトル、または発酵層）、細胞および組織は、かなりのせん断力を受ける。せん断力は、バイオリアクタ、即ち、ローラボトルが回転する速度を調整することにより、または培養培地にせん断防止剤を添加することにより制御可能とされる。そのような防止剤の１つは、ＶｉｖａＳｃｉｅｎｃｅ、ＡＧから入手できるｃｅｌｌＰＲＯＴＥＣＴ（登録商標）である。ｃｅｌｌＰＲＯＴＥＣＴ（登録商標）剤は、培地の粘性を増大させ、培養において遭遇されるせん断力／応力から細胞を守る。ｃｅｌｌＰＲＯＴＥＣＴ（登録商標）剤は、最終容積の約０．０５％から約０．１％の濃度で培養培地に添加される。ｃｅｌｌＰＲＯＴＥＣＴ（登録商標）のような粘性を増大させる補助剤または高粘度を有する培地形式が、それらがＡＲＢＳに適合し、それらの粘性がバルブを介してまたはそのチャンバとリザーバとの間における培地の流れを妨げない限り、本発明において使用されてもよい。

ＡＲＢＳの電気機械的アッセンブリ
図１および図３に示されるＡＲＢＳの１つの実施例において、均一な培地の補給および廃棄は、補給用バルブ（１１ａ），廃棄用バルブ（１３ａ），廃棄物移送用バルブ（１３ｂ）による区画された部分相互間の培地の流れによって実現される。この実施例において、バルブは、ｐＨセンサ、アンモニアイオンセンサ、またはアンモニアイオン濃度におけるｐＨのずれおよび変化を検出できるセンサを有し、取り外せるレギュレータ（１２）により電気機械的に制御される。レギュレータ（１２）は、さらに上部ソレノイド（７ｂ）、下部ソレノイド（７ａ），位置センサ、および図３に示されるようにソレノイド（７ａ），（７ｂ）に作動的に接続されるレギュレータマグネット（８ａ），（８ｂ），および（８ｃ）を含んでいる。

ｐＨセンサ
ＡＲＢＳにおける１つの実施例において、レギュレータ（１２）は、ｐＨセンサ、または図１および図３に示されるように上部ソレノイド（７ｂ）および下部ソレノイド（７ａ）を作動させるメータを含んでいる。例えば、レギュレータ（１２）がｐＨセンサまたはメータ、培養チャンバ（２）（図３を参照）の表面壁における開口（不図示）を通じてレギュレータに作動的に接続される培養チャンバ（２）の内部に配置される使い捨て式ｐＨプローブ（不図示）を含んでいる。使い捨て式ｐＨプローブは、ＡＲＢＳアッセンブリの残部が使い捨てできるものでありながらレギュレータ（１２）が再利用可能とされるようにレギュレータ（１２）から取り外し可能とされる。

液体内のｐＨ測定用装置は、よく知られている。膜形式の電極を有するガラスセンサは、一般に、ｐＨ測定の基準として信頼し使用される（例えば、Ｏｈｋａｗａ Ｈ，Ｔａｎｐａｋｕｓｈｉｔｕ Ｋａｋｕｓａｎ Ｋｏｓｏ［日本］（１９８８）４３（３）：２７２−８０；および、Ｍｏｏｒｅ ＥＷ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（１９６８）５４（４）：５０１−７を参照）。また、非ガラスセンサは、レギュレータ（１２）の部品として有用であり、代表的には、溶剤性高分子膜を使用するものが用意されている（Ｐｒｅｔｓｈ ｅｔ ａｌ（１９８６） Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５８：２２８５−２２８９において述べられており、これは、本願発明の一部を構成する）。非ガラスセンサの部類には、代表的には、ガラスセンサよりも小さく、製造ならびに操作に対しそれほど高価とならない平らな形態を有するものがある。平らなセンサの例は、Ｂｅｎｃｏの米国特許第５，５５４，２７２号、Ｆｏｏｓの米国特許第５７０２５７５号において見つけられ、それらの全体について本願発明の一部を構成する。平らなセンサを含む計器は、市販されている。平らな形式のセンサは、代表的には、例えば、シルクスクリーン印刷などの厚膜または薄膜技術を使用して基板の基部に塗布された材料の比較的薄い層を含んでいる。基板として使用される材料は、ＰＬＤ法（パルスレーザー堆積法）により堆積された酸化アルミ（Ａｌ_２Ｏ_３）または酸化タンタル（Ｔａ_２Ｏ_５）、または、ＰＥＣＶＤ（プラズマ強化化学蒸着）および、シリコン電界効果構造におけるＬＰＣＶＤ（低圧化学蒸着）により塗布された窒化ケイ素（Ｓｉ_３Ｎ_４）である。双方のセンサ形式は、ｐＨに対する高感度、作動時の長期の安定性を発揮する。加えて、ポリアニリン膜は、高感度の平らなｐＨ指示器として有用である（Ｔａｋｅｎａｋａ，Ｙ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｅｎｓｏｒｓ ６（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ａ）：７７−８０，および、Ｔａｋｅｎａｋａ Ｙ ｅｔ ａｌ．８１−８４，Ｓｈｉｎｏｈａｒａ，Ｈ ｅｔ ａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｅｎｓｏｒｓ ６（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ａ）：８５−８８）。

例えば、ＤＭＥＭが選択された細胞または組織培養用培地ならば、代表的な最適なｐＨ
は、約７．４から約７．５である。レギュレータ（１２）のｐＨセンサは、好ましくは、約７．４以下のｐＨの変化に対応して較正される。レギュレータ（１２）のｐＨセンサは、好ましくは、約７．２以下のｐＨの変化、さらに好ましくは、約７．０以下、最も好ましくは、約６．８以下のｐＨの変化に対応して較正される。

また、ＡＲＢＳは、生物（例えば、生検材料または吸引物（ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）），好ましくは、哺乳類、さらに好ましくは、人間から直接とられた移植片（一次細胞）の細胞培養を支援する。これらの細胞培養は、混合細胞型種族からなる。一次細胞の培養に最適なｐＨは、約７．０であり、レギュレータ（１２）に含まれるｐＨセンサは、好ましくは、約７．０以下へのずれ、好ましくは、約６．９以下、最も好ましくは、一次細胞培養に対し約６．８以下へのずれを検出するように較正される。

その分野の技術により、ｐＨメータを較正すること、専用の細胞培養プロトコル、または、使用される細胞あるいは組織の型により許容される最適なｐＨの範囲を決定することはその分野の技術でまかなえる。従って、レギュレータ（１２）は、どれか１つの細胞培養プロトコルまたは細胞または組織の型についての用途に限定されない。

アンモニアイオンセンサ
また、レギュレータ（１２）は、培養チャンバ（２）内の培養条件を分析するためのアンモニア（NH₃）イオンセンサを含んでいる。アンモニアイオンセンサは、多孔質のテフロン（登録商標）、ポリ塩化ビニル（PVC）、ポリエチレン、またはシリコンゴムのような不活性の地で様々なイオン交換材料からなるポリマー膜電極を含んでいる。膜が形成された後、その膜がPVC管の端部に封しされる。この形式の電極は、カリウム、カルシウム、硝酸塩を含む。

固体電極を有するアンモニアイオンセンサは、膜で比較的不溶性の無機塩を利用する。固体電極は、均一または不均一な形で存在する。双方の形において、電位がイオン交換により膜表面で生じる。固体電極の例としては、銀／硫化物、塩化物、フッ化物を含む。

ガス検知用電極を有するアンモニアイオンセンサは、アンモニア、二酸化炭素、酸化窒素、二酸化硫黄の測定に利用される。これらの電極は、ガス透過膜および内部緩衝液を有している。緩衝液のｐＨの変化が、ガスに対する反応である。その変化は、ハウジング内の結合ｐＨセンサにより検出される。その構造により、ガス検知用電極は、外部基準電極を必要としない。

この実施例において、培養される細胞または組織は、培養チャンバ（２）に移植される。細胞および組織は、培養チャンバ（２）内に直接的に移植可能とされ、その内面は任意で誘導体化されてもよく、即ち、細胞または組織が蒔かれたスカッフォルド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）を介して導入可能とされる。培養チャンバ（２）への細胞または組織の移植を容易にするためにＡＲＢＳは、好ましくは、らせん状ネジ部材（１５）およびらせん状ねじ受け部材（１６）の境界面で分離（取り外される）されている。

培養チャンバの誘導体化内面
培養チャンバ（２）の内面は、任意で、その分野で知られた方法により細胞接着を容易にするように誘導体化可能とされる。その培養チャンバの内面は、アミノ酸、アクティブハロー（ａｃｔｉｖｅ ｈａｌｏ）、ヒドロキシ、または、チオール群、または、置換が活性ハロゲン、または擬ハロゲンである置換Ｎヒドロキシルメチルアセトアミドにより誘導体化可能とされる。

プロテイン、または線状ペプチドは、水性培地内のプロテインまたは線状ペプチドを、誘導体化反応を完了するように十分な期間、温和な条件のもとで、活性ハロゲン、活性カルボキシル基群、例えば、エステル等を有する機能表面に接触させることにより、結合可能とされる。適切な小分子ブロック薬を使用することにより、いずれかの残部の未反応機能群は、ブロックされる。例えば、活性ハロゲンは、脂肪属系アミン、マレイミドを有するチオールなどによりブロックされ得る。いくつかの実施例においては、誘導体化処理において次の段階を妨げないので過剰な反応群をブロックすることを必要とする場合がない。

免疫細胞、例えば、Ｂ細胞が培養のために選択されるならば、培養チャンバ（２）の内面は、抗原が認識されるＢ細胞（例えば、ＣＤ２０）により、誘導体化可能とされる。または、可溶性抗原に対し特異結合によっても誘導体化可能とされる。そのような抗原は、抗原を認識する表面免疫グロブリンを有する細胞が、エンドサイトーシスし、処理される錯体を形成するためにその抗原に結合するように細胞に添加され得る。細胞のＭＨＣ抗原を有する抗原の小片がもたらされるだろう。Ｂ細胞により拘束された培地にＴ細胞を添加することにより、
その抗原の小片を認識するＴ細胞は、リンホカインを分泌するだろう。その結果、Ｂ細胞の増殖となる。

ＡＲＢＳの電気化学的な実施例を使用した細胞培養
移植のとき、ＡＲＢＳがその縦軸の回りを回転する回転装置に配される。重力感応型ポジションスイッチ（ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｓｗｉｔｃｈ）（不図示）は、ＡＲＢＳがその始動位置（以後、「６時方向の位置」と呼ぶ）に対し１８０°回転したことを検出する。この重力感応型ポジションスイッチは、例えば、水銀式チルトスイッチ（ｔｉｌｔ ｓｗｉｔｃｈ）または、錘付レバースイッチであってもよい。

水銀式チルト（または「チップオーバ」）スイッチは、水銀を移動させるもの以外に動く部品がない単純な構造に基づいている。機械的にいえば、これらのスイッチは、磨耗せず、数千万回の平均動作数で長い耐用年数を有している（Ｄｕｒａｋｏｏｌ、ＤＡＮＡ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ社から販売されている）。
また、非水銀式「チップオーバスイッチ」は、回転センサとして使用可能とされる。そのような非水銀式スイッチの１つは、Ｃｏｍｕｓから入手可能であり、０．３６０×０．３１０（インチ）のハウジングを有している。摂氏−３７°から１００°までの温度範囲での動作に適している（Ｄｕｒａｋｏｏｌ、ＤＡＮＡから入手可能である）。

６時方向の位置で、レギュレータ（１２）が培養チャンバ（２）の培地内で所定の閾値を超えてｐＨの移動、またはアンモニアイオン濃度の変化、あるいは双方を検出したとき、レギュレータ（１２）は、電気信号を送出し下部ソレノイド（７ａ）を作動させる。作動された下部ソレノイド（７ａ）は、レギュレータマグネット（８ａ）に係合し、対向するインナーマグネット（９ａ）とともに磁界を形成する。その結果としてインナーマグネット（９ａ）により、廃棄物移送用バルブ（１３ｂ）におけるスプリングの圧縮が引き起こされ、従って、バルブを開く。開いた廃棄物移送用バルブ（１３ｂ）により、培地が培養チャンバ（２）から廃棄物移送用チャンバ（６）に流れ込む。

廃棄物移送用チャンバ（６）は、培養チャンバ（２）における全培地量、代表的には、約１５ｍＬを保持するように容量を有している。６時方向の位置で、廃棄物移送用チャンバ（６）は要望があれば全部満たされるが、しかし、好ましくは、容量率約６％、さらに好ましくは、容量率約７％、最も好ましくは、容量率約８％に満たされている。使用済みまたは新しい培地の一方のチャンバから次のチャンバへの移送のために要される時間の長さは、チャンバ相互間の孔の大きさにある程度関係する。そのソレノイドは、６時の方向の位置および１２時の方向の位置における全３０度にわたり開くだろう。その位置が開く期間は、装置の回転速度に依存するだろう。

ＡＲＢＳが１回転終えたとき（始動位置から３６０°、以下、１２時方向の位置と呼ぶ）、新しい培地移送用チャンバ（５）は、約８ｍＬ、好ましくは、約９ｍＬ，最も好ましくは、約１０ｍＬの新しい培地を新しい培地用リザーバ（１）からすくう。

１２時の方向の位置で、上部ソレノイド（７ｂ）は、レギュレータ（１２）からの電気信号により作動され、レギュレータマグネット（８ｂ）、（８ｃ）に係合する。レギュレータマグネット（８ｃ）は、対向するインナーマグネット（９ｃ）とともに磁界を形成し、使い捨てバルブ（１３ａ）を開くように付勢し、６時の方向の位置で廃棄物移送用チャンバ（６）に入れられた使用済みの培地を使用済み用リザーバ（３）に堆積させる。同時に、また、上部ソレノイド（７ｂ）は、レギュレータマグネット（８ｂ）を作動させ、対向するインナーマグネット（９ｂ）とともに磁界を形成する。インナーマグネット（９ｂ）は、ＡＲＢＳの横軸に沿ってプランジャ部材（１１ｃ）、プッシングアーム（１１ｂ）を介してスプリング（１０）を押し下げ、従って、補給用バルブ（１１ａ）を開く。
補給用バルブ（１１ａ）が開かれることにより、新しい培地移送用チャンバ（５）からすくわれた培地が培養チャンバ（２）に入ることが可能となる。

細胞および組織の培養において適切な培養のための通気が必要となる。ＡＲＢＳが回転するとき、培養チャンバ（２）が培養チャンバ（２）に接続される通気管（４）を経由して好ましくは、滅菌した外気によって通気される。図１および図２に示されるように、通気管（４）は、新しい培地用リザーバ（１）を貫通し、排気キャップ（１８）を介して外気に晒されるねじ付部（１７）内に突出している。

ＡＲＢＳは、好ましくは、レギュレータ（１２）が他の読み出しを行なう以前に平衡を保つように１回転を終える。

ＡＲＢＳアッセンブリの付加的な部品は、チューブキャップ（１４ａ）を含む。その結果、そのシステムおよびチューブキャップ（１４ｂ）を分解することなく新しい培地用リザーバ（１）内の新しい培地の取替えを可能とし、または、添加剤、栄養素、発育因子などの添加を可能とし、使用済み培地用リザーバ（３）からの使用済みの培地の除去を、システムを分解することなく、可能とする。

チューブキャップ（１４ａ）および（１４ｂ）双方は、ＡＲＢＳの使用中、適切なスクリュートップ（不図示）により覆われる。

チューブキャップ（１４ｂ）を介して使用済み培地用リザーバ（３）から除去された培地は、廃棄または保存される。ＡＲＢＳを使ったいくつかの細胞培養法において、使用済みの培地は、細胞培養および物質交代の間、分泌された所望される細胞生産物を利用するために保存される。ここで使用される「細胞生産物」という言葉は、細胞全体または組織全体、または、その中のいかなる下部構造（例えば、細胞小器官、または膜）、分泌されたイオン、分泌された化合物、分泌された分子、抗体、または他の免疫グロブリン、抗原、プロテイン、サイトカイン、ホルモン、有機化合物、薬剤の化合物、または他の重要な有機化合物を包含するような意味である。また、細胞生産物は、レギュレータ（１２）に含まれるセンサによる検出される、ＡＲＢＳのチャンバ相互間の培地の流れを始動させることを検出することにより検出されるそれらの物質（例えば、イオン）を含む。

これらの細胞生産物は、使用済み培地用リザーバ（３）から採集された使用済み培地から得られる。

培養チャンバ（２）の内面は、細胞接着を容易にするように誘導体化され得る。さらに、粒子またはスカッフォールドは、細胞または組織の接着のために使用されてもよい。これらの粒子、例えば、ビーズ、またはスカッフォールドが誘導体化され得る。スカッフォールドの好ましい形状は、容易く挿入され、培養チャンバ（２）から除去可能とされる円柱ブロック状部材の形状である。また、容易く挿入され、培養チャンバ（２）から除去可能とされる他の形状は、本発明の範囲にあると意図される。スカッフォールドの発泡通気孔がその構造が様々な知られた細胞回復技術および材料を使って簡単な洗浄、および細胞の分離可能とされる点で特に望ましい。

洗浄およびスカッフォールドから細胞を分離するための適切な機構の一つは、トリプシンのようなたんぱく質分解酵素を含む溶液を使用する。細胞を分離するための他の適切な機構は、細胞に作用される力がリーシスを誘導しない限り、超音波処理、または攪拌を含む。しかしながら、細胞が最終的に抽出分析（例えば、細胞内の細胞生産物、代謝物、または、細胞膜表面分子、または部分を分離すること）で使用されるならば、リーシスを防止することは、重要ではない。当業者は、培養された細胞の最終使用が適しているとき、洗浄またはそのスカッフォールドから培養された細胞を分離することにおいてその分野において知られたいかなる方法も有用であることを理解するだろう。

ARBS物理化学的アッセンブリ
他の実施例において、ARBSは、ｐHヒドロゲルをレギュレータ（１２）の代わりにすることにより、組み立て可能である。その結果、完全な使い捨て式ARBSを作る。

ARBSの物理化学的な実施例において、ｐＨの変化に応じたｐＨヒドロゲルの膨張および収縮が、力を補給用バルブ（１１ａ），廃棄用バルブ（１３ａ），廃棄物移送用バルブ（１３ｂ）に作用させ、その結果、開閉させる。

ここで使用されるｐＨヒドロゲルは、水、および他の溶液で膨張し、溶解することなく高分子網目内に流体を吸収するポリマー材料である。親水性のヒドロゲルは、平衡かつ良好な生体適合性で多くの水分を有している。ｐＨ感応型ヒドロゲルは、親水性ヒドロゲルについて最も広く研究されている。ｐＨ感応型ヒドロゲルは、共有結合、水素結合、または、疎水的相互作用のような様々な形式の架橋力を有した安定ゲルを形成するように架橋化されている。酸性ヒドロゲルは、本質的に、イオン化されるだろう。従って、高いｐＨで膨張し、低いｐＨで放出し膨張しない。塩基性ヒドロゲルの膨張の動きは、ＡＲＢＳにおける用途に適しているｐＨに逆に依存している。ｐＨ感度は、ペンダントアシディック（ｐｅｎｄａｎｔ ａｃｉｄｉｃ）や，カルボン酸、スルホン酸、第１アミン、第四アンモニウム塩などのような塩基性群に起因している。カルボン酸群は、例えば、高いｐＨで充満され、低いｐＨで放出するのに対し、その逆は、第１アミン、第四アンモニウム塩については正しい。所定のペンダント群についての過渡期のｐＨは、ペンダント群のためのｐＫａ値により決定される。従って、適切なｐＫａ値でペンダント群を選択することにより、親水性ヒドロゲルは、ゲルの特性における変化をまねくｐＨの刺激におけるいかなるレベルにも反応して可逆的にイオン化可能な構成とされる。ｐＨの範囲は、選択された固有の細胞形式または所望される細胞生産物に依存するだろう。そのヒドロゲルは、好ましくは、所望される目標のｐＨの範囲内で生じる迅速な膨張／非膨張への移行を伴う所望される目標のｐＨの範囲で選ばれる。ヒドロゲルおよびバルブの位置は、臨界的となり、ローララックに取り付けられることが必要とされる外部マグネットは、位置センサとして作用する必要がある。好ましいｐＨ感応型ヒドロゲルは、ポリ（アクリル アクリラート）、ポリ（アクリメタクリレート）、ポリ（２ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＨＥＭＡ）、ポリ（２ヒドロキシプロピルメタクリレート）（ＨＰＭＡ）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（N‐ビニル‐ピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリ（エーテルウレタン）、および、高分子電解質などのような多くのポリマー化合物からもたらされる。また、記載されたホモポリマーと合成するように使用されるモノマーは、コポリマーを形成するように様々な組み合わせで使用可能とされる。これらのポリマーから形成されるｐＨ感応型ヒドロゲルは、交互に酸およびアルカリを添加するとき、可逆的に収縮し、膨張する。ｐＨの変化に対する応答は、ポリヒドロゲル（メチルメタクリレートｃｏ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）についてのｐＨにおける急峻な変化後、速く、可逆的となる。当業者は、複合のｐＨ感応型ヒドロゲルを形成するようにいくつかのポリマーを組み合わせ方を知っているだろう。膨張の平衡の程度、および、ｐＨ感応型ヒドロゲルの形態変化は、イオニックモノマーの投入、イオン化群のｐＫａ、網状組織におけるイオン化ペンダント群の濃度、ｐＨ，イオン強度、培地の誘電率、架橋密度、ポリマーバックボーンの親水性および疎水性のようないくつかの要因により影響される。これらの要因は、Ｈｅｌｌ Ｂ等のｐＨ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ；ＥＤｓ．Ｈａｒｌａｎｄ等のＣｈａｒｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（１９９２）において説明されている。

イオニックモノマーの投入は、ｐＨ感応型ヒドロゲルの形態変化に影響を及ぼす。酸性ヒドロゲルは、低いｐＨで放出するが、高いｐＨでイオン化するだろう。従って、膨張の平衡の程度は、酸性ペンダント群を含むヒドロゲルにおいてｐＨが高められる場合、増大するだろう。ヒドロゲルの膨張は、逆のｐＨの依存性を有する。メタクリル酸に基づくヒドロゲル、スルホキシルエチルメタクリレート、ＨＥＭＡ，またはＨＰＭＡは、酸、塩基、および両性のゲルを得るために一般に使用されている。イオン群形式の要因としての膨張は、研究されている（Ｃｈｅｎ，ＬＬ等のＰｈａｍ．Ｄｅｖ，Ｔｅｃｈｎｏｌ ３（２）：２４１−９（１９９８））。

ゲルにおけるペンダントイオン化群のｐＫａ値は、ｐＨの膨張曲線（Ｃｈｅｎ，ｓｕｐｒａ）に影響を及ぼす。塩基イオン化群のｐＫａ値における減少は、低いｐＨに向かう曲線に移行する。膨張応答が、ヒドロゲルのイオン化群におけるｐＫａ値に近いｐＨ値でｐＨに対し最も敏感であることが説明されている（Ｅｉｃｈｅｎｂａｕｍ ＧＭ等のＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３１（１５９：５０８４−９３（１９９８））。ヒドロゲルにおいてイオン化モノマーの濃度は、ゲルの膨張およびｐＨ感度に対し重要である。この影響は、中性コモノマーと比べてイオン化モノマーの相対親水性に依存している。ｐＨ感応型ポリマーのバックボーンの疎水性および親水性は、膨張に影響を及ぼす。ポリマーバックボーンの増大した疎水性が、コポリマーポリ（ｎ−アルキルメタクリルレート−ｃｏ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）およびコポリマースチレンおよび４−ビニルピリジン（ＶＰ）におけるｐＨ感度を低下させることが示されている。緩衝組成物およびイオン強度は、ｐＨ感応型ヒドロゲルの膨張に影響を及ぼす。対イオンシールドは、ポリマーバックボーンに帯電する。ゲルの内側および外側のイオン濃度は、等しく、ならびに、ゲルの内側の浸透圧は、ゲルの外側のイオン濃度が増大する場合、低下する。多価のイオンを含む緩衝液は、ゲルの内側のいくらかの電荷を中性化することができる。架橋密度は、ｐＨ感応型膨張に対し重要である。増大した架橋密度は、膨張の平衡の程度を制限するだろう。この影響は、ゲルがｐＨの変化によりイオン化された場合、強い。ヒドロゲルの網目構造の特性は、主に、合成の変化量、特に、化学的組成物、および架橋密度により影響される（Ｃｈｅｎ，ｓｕｐｒａ，Ｍａｎｄａｌ ＴＫ等のＰｈａｒｍ．Ｄｅｖ，Ｔｅｃｈｎｏｌ．５（４）：５５５−６０を参照）。

好ましいｐＨ感応型ヒドロゲルバルブは、フリーラジカル溶液重合によりモノマーから抽出された様々な形式のメタクリレートから合成されたコポリマーを含んでいる。これらのコポリマーは、ソフトゲルではなく、強靭な、柔軟なポリマーであり、それらは、非常に生体適合性があり、また、それらは、不活性で非分解性、そのこと自体は、常時、区切られた部分相互間の培地の移動からのせん断応力を受けるＡＲＢＳのようなローラボトルに対し理想的である。例えば、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート（ＤＥＡＭＡ）および、２ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）のコポリマーであるゲルの膨張は、培地のｐＨの低下に伴い増大する。これはＩｓｈｉｈａｒａ Ｋ等のＰｏｌｙ Ｊ １６：６２５−６３１（１９８４）により示されている。それに反して、ＨＥＭＡホモポリマーの水分は、培地のｐＨに依存していない。従って、ＨＰＭＡコポリマーヒドロゲルのｐＨとともに水分の変化は、ＤＥＡＭＡ成分の導入に起因する。ＤＥＡＭＡ成分は、培地のｐＨが低下した場合、プロトン化されるように考慮される。ＤＥＡＭＡ成分の親水性およびヒドロゲルを増大させる。ＤＥＡＭＡおよびＨＰＭＡコポリマーヒドロゲルの水分は、ｐＨの変化に対し可逆的である。

ここで、上述の文献すべては、明確に盛り込まれていようといまいが、本明細書の一部を構成する。

本発明が十分に説明されたが、その分野の当業者は、本発明が、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、また、不適切な実験なしに、同等のパラメータ、濃度、条件における広い範囲内における実行可能であることを理解するだろう。

本発明は、特定の実施例に関連して説明されたが、本発明がさらなる変更可能であることは理解されるだろう。この出願は、概して、いかなる変形、使用、以下の発明における適合、発明の原理、本発明に関係した分野における知られたまたは慣行の範囲、また重要な特徴が応用され得るような本開示からの発展を包含することを意図している。

組み立てられた本発明のARBSを示す。この図に示される組み立てられたシステムの構成要素は、本発明の電気機械式の実施例を代表するものである。 そのARBSの上部の拡大図を示す。 そのARBSの下部の拡大図を示す。この図のシステムの構成要素は、本発明の電気機械式の実施例を代表するものである。

Claims (26)

1. 少なくとも４つのポートを有する細胞培養培地用リザーバを用いるに適した第１の円筒形チャンバであって、一方が空気源に接続でき、他方が該第１の円筒形チャンバに接続できる二つのポートが外壁に配され、他の二つのポートは該第１の円筒形チャンバ、および第２の円筒形チャンバが当接する内壁に配され、一方のポートが該第２の円筒形チャンバのための空気源に、空気をもたらす前記外壁における前記ポートに接続するダクトを介して接続でき、他方のポートが、コントロールバルブを介して該第２の円筒形チャンバとの制御された流体連通をもたらす第１の円筒形チャンバと、
   少なくとも３つのポートを有する細胞または組織の培養に適した第２の円筒形チャンバであって、一方のポートが前記第１の円筒形チャンバの内壁に配され空気をもたらすポートと同一の広がりをもち、他方のポートが制御された流体連通をもたらす前記第１の円筒形チャンバのポートと揃えられ、第３のポートがコントロールバルブを介して第３の円筒形チャンバと制御された流体連通をもたらす第２の円筒形チャンバと、
   少なくとも二つのポートを有し使用済みの培地を収容するのに適した第３の円筒形チャンバであって、前記第２の円筒形チャンバに当接する外壁に配される一方が該第３の円筒形チャンバに接続でき、他方のポートが前記第２の円筒形チャンバの第３のポートと揃えられ、該第２の円筒形チャンバと制御された流体連通をもたらす第３の円筒形チャンバと、
   前記チャンバの回転における所定位置で前記各チャンバのそれぞれから他方への制御された流体流れを作るように前記複数のバルブを順次作動させる制御手段と、を備え、
   前記第１、第２および第３の円筒形チャンバは、単一のアッセンブリとして円筒形チャンバを回転軸線回りに回転できるように相互接続され、
   流体連通の制御により、前記第１の円筒形チャンバからの培養培地が前記第２の円筒形チャンバに導入可能とされ、該第２の円筒形チャンバからの使用済み培地が、該第２の円筒形チャンバから前記第３の円筒形チャンバに除去可能とされる、少なくとも３つの円筒形チャンバを有する複数のチャンバがあるローラボトルシステム。
2. 前記第１の円筒形チャンバと前記第２の円筒形チャンバとの制御された流体連通をもたらすポートは、該ポート内の流体流れを制御するバルブと、前記第１の円筒形チャンバ内に配される新しい培地移送用チャンバとを含み、該新しい培地移送用チャンバの二つの壁は、第１の円筒形チャンバの湾曲した壁および内壁であり、該新しい培地移送用チャンバは、培養培地をすくい、６時方向の位置から１２時方向の位置までのローラボトルの回転中、該培養培地を保持し、前記バルブは、該６時方向の位置で閉じられ、該１２時方向の位置で作動し、該培地を前記第２の円筒形チャンバに放出する請求項１記載のローラボトルシステム。
3. 前記第３の円筒形チャンバとの制御された流体連通をもたらすポートは、前記第３の円筒形チャンバに対する該ポート内の流体流れを制御する第１のバルブと、第２のバルブが前記第２の円筒形チャンバにあるセンサに応答して作動される場合、前記第２の円筒形チャンバからの使用済み培地を収容する第３の円筒形チャンバ内に配される使用済み移送用チャンバとを含み、該使用済み培地移送用チャンバの二つの壁は、該第３の円筒形チャンバの湾曲した壁の一部、および内壁であり、６時方向の位置から１２時方向の位置までのローラボトルの回転中、該第１のバルブは、閉じられ、該第２のバルブは、６時方向の位置で作動され、該作動された第２のバルブは、使用済み培地を該使用済み培地移送用チャンバに流れ込ませ、該第１のバルブは、１２時方向の位置で作動され、培地を該第３の円筒形チャンバに放出する請求項１記載のローラボトルシステム。
4. 前記第１および第２の円筒形チャンバは、雄型取付部材と雌型取付部材とが結合することにより相互接続されており、各部材は、前記ポートと、前記第２の円筒形チャンバに空気をもたらすように接続できる前記ダクトとを包囲する請求項１記載のローラボトルシステム。
5. 前記制御手段は、重力センサスイッチと、第１および第２のソレノイドを含み、
   該第１のソレノイドは、作動的に第１および第２のマグネットに接続され、該第２のソレノイドは、作動的に第３のマグネットに接続される請求項１記載のローラボトルシステム。
6. さらに少なくとも３つのマグネットを含み、少なくとも二つのマグネットは前記第２の円筒形チャンバに当接する前記第３の円筒形チャンバの内壁に配され、少なくとも１つのマグネットは、前記第２の円筒形チャンバに当接する第１の円筒形チャンバの内壁に配され、少なくとも３つのマグネットは、前記第１および第２のソレノイドに作動的に接続されるマグネットに対向するように配置される請求項１記載のローラボトルシステム。
7. 前記第１および第２のソレノイドの一方または双方は、作動され、作動的に接続される１以上のマグネットが、１以上の相対向するマグネットとともに磁界を形成し、該１以上の相対向するマグネットが１以上のコントロールバルブを開く請求項１記載のローラボトルシステム。
8. 前記第１のソレノイドは、センサにより作動される請求項７記載のローラボトルシステム。
9. 前記センサは、ｐＨの変化を監視する請求項８記載のローラボトルシステム。
10. 前記センサは、細胞生産物の濃度の変化を監視する請求項８記載のローラボトルシステム。
11. 前記細胞生産物は、アンモニアイオンである請求項１０記載のローラボトルシステム。
12. 前記第２のソレノイドは、重力感応型ポジションスイッチにより作動される請求項７記載のローラボトルシステム。
13. 前記重力感応型ポジションスイッチは、水銀式チルトスイッチまたは錘付レバースイッチから選択される請求項１２記載のローラボトルシステム。
14. 前記作動された第２のソレノイドは、前記第２の円筒形チャンバから前記使用済み移送用チャンバへ培養培地の移送を駆動する前記コントロールバルブを開く請求項７記載のローラボトルシステム。
15. 前記制御手段は、前記コントロールバルブが位置依存方法により直接的に作動するように前記第２のチャンバの外側に位置付けられている請求項１記載のローラボトルシステム。
16. 前記バルブは、物理化学的感応型ヒドロゲルを含む請求項１記載のローラボトルシステム。
17. Ａ）培養培地を請求項１記載のローラボトルシステムにおける第１の円筒形チャンバに導入し、細胞または組織を前記第２の円筒形チャンバに導入し、
    Ｂ）縦軸線回りに前記ローラボトルを回転することにより、細胞または組織を培養し、
    Ｃ）新しい培養培地を、前記第１の円筒形チャンバから前記第２の円筒形チャンバに流し、
    Ｄ）前記第２の円筒形チャンバ内の細胞または組織の培養パラメータを監視し、細胞または組織の培養パラメータの値が所定の閾値である場合、使用済みの培地を該第２の円筒形チャンバから前記第３の円筒形チャンバに流す細胞および組織の培養法。
18. 工程（Ｃ）は、培養培地を、回転中、前記第１の円筒形チャンバから開口を通じて第１の移送用チャンバに導入し、前記新しい培地移送用チャンバが複数の壁および、第２の円筒形チャンバと制御された流体連通することをもたらすポートを含み、前記バルブは、ローラボトルが新しい培地移送用チャンバが培地を保持および維持する６時方向の位置にある場合、閉じられ、１２時方向の位置で作動され、維持された培地を該第２の円筒形チャンバに放出することを含む請求項１７記載の方法。
19. 工程（Ｄ）は、ローラボトルの回転中、閾値信号用センサを収容する前記第２の円筒形チャンバからの使用済み培地を、前記センサの信号に応じて第１のバルブにより制御される開口を通じて使用済み培地移送用チャンバに導き、
    前記使用済み培地移送用チャンバは、複数の壁と、前記第３の円筒形チャンバおよびポートの制御された流体連通をもたらすポートを制御する第２のバルブと、を含み、
    該第２のバルブは、前記ローラボトルが第２の移送用チャンバが培地を保持及び維持する６時方向の位置にある場合、閉じられ、細胞または組織の培養パラメータ値が閾値に一致する場合、６時方向の位置で開状態となるように作動される前記第１のバルブは、該使用済み培地移送用チャンバが使用済み培地で満たされ、該第２のバルブが１２時方向の位置で開かれ、使用済み培地を該第３の円筒形チャンバに放出する請求項１７記載の方法。
20. 前記細胞または組織は、表面に接着する請求項１７記載の方法。
21. 前記細胞または組織は、誘導体化表面に接着する請求項１７記載の方法。
22. 前記細胞または組織は、取り外し可能な表面に接着する請求項１７記載の方法。
23. 前記細胞または組織は、取り外し可能な誘導体化表面に接着する請求項１７記載の方法。
24. Ｅ）前記ローラボトルシステムからの細胞生産物を回復させることをさらに含む請求項１７記載の方法。
25. 前記回復工程は、前記第２および／または第３の円筒形チャンバから細胞生産物を除去することを含む請求項２４記載の方法。
26. 前記細胞または組織の培養パラメータは、ｐＨ，またはアンモニアイオン濃度である請求項１７記載の方法。
    

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