KR100434452B1 - 포유동물 세포를 슬라이드글래스의 미세배양조건 하에배양할 수 있는 킷트 및 이의 제조방법 - Google Patents

포유동물 세포를 슬라이드글래스의 미세배양조건 하에배양할 수 있는 킷트 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포유동물 세포를 다중시험 슬라이드글래스의 미세배양조건하에서 배양이 가능하게 하였으며 다중시험 슬라이드글래스 상에서 배양된 세포에 대하여 조직면역화학 시험법과 리포좀을 이용한 세포의 형질전환법도 가능한 킷트로서 포유동물 세포에서 새로운 유전자가 삽입되어 형질전환된 세포에서 새로운 단백질 발현과 발현위치를 현미경으로 확인할 수 있음에 따라 포유동물 세포에서 신규 유전자의 발현과 발현위치를 확인하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

포유동물 세포를 슬라이드글래스의 미세배양조건 하에 배양할 수 있는 킷트 및 이의 제조방법 {Multitest-Microslide of living cell cultures and culture slide assembly and their preparation}
본 발명은 포유동물 세포를 다중시험 슬라이드글래스(multitest-slideglass) 상에서 배양할 수 있는 킷트와 이의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 포유동물 세포를 슬라이드글래스에 어떤 배양챔버의 설치 없이 배양이 가능하게 하였으며 조직면역화학 시험법과 리포좀을 이용한 세포의 형질전환법도 가능한 킷트로서, 포유동물 세포에서 새로운 유전자가 삽입되어 형질전환된 세포에서 새로운 단백질 발현과 발현위치를 도립현미경(Inverted microscope) 뿐만아니라 광학현미경(Optical microscope)으로도 확인할 수 있음에 따라 포유동물 세포에서 신규 유전자의 발현과 발현위치를 확인할 수 있는 킷트에 관한 것이다. 현재 세포시험에 사용되는 현미경은 도립현미경만을 통해서만 세포의 배양상태를 볼 수 있으며 배양액 역시 96 플레이트(plate)에서 배양할 경우 100ul (참조: Qiagen Inc. Transfection Resource Book)가 필요한데 비하여 본 발명 다중시험 슬라이드글래스 한 웰의 면적은 5mm2이며 배양부피도 20ul로서 배양액, 세포수, 형질전환에 필요한 시약 등이 5분의 1로도 형질전환시험이 이루어질 수 있어서, 기존 시스템으로 하나의 유전자의 발현을 확인하는데 필요한 량으로 적어도 5개 이상의 다른 유전자 또는 하나의 유전자가 각기 다른 5개 이상의 세포주에서의 발현양상을 각각 확인할 수 있으므로 신규유전자의 기능연구(functional genomics)에서 매우 유용하게 사용될 수 있다.
유전공학(Genomics) 기술의 발달에 따라 기능을 알지 못하는 많은 신규 유전자들이 클로닝되고 있다. 이러한 신규유전자의 기능을 첫 번째로 알 수 있는 것은 세포내에서 발현시켜서 그 위치가 어디에 존재하느냐에 따라 그 기능을 추정할 수 있다. 핵내에서 발현하면 DNA 합성 등에 관여하는 단백질로 추정되며, 원형질내에 존재하면 단백질합성이나 세포대사에 관여하는 단백질로 추정할 수 있으며 세포막에 존재하면 세포의 신호전달 등에 일차적으로 관여하는 기능을 가진 단백질로 추정할 수 있다.
슬라이드글래스 상에 동물세포를 부착하여 면역조직화학법에 의하여 질병의 진단에 사용하는 기술은 이미 여러 논문(참조; Development of an incubation system for an inverted microscopy for long-term observation of cell cultures using chamber slides .Biomed. Tech. 2001;(5):133-136., Effects of Nd:YAG-laser irradiation on monolayer cell cultures. Lasers Surg Med 1998;22(1):30-36., An indirect immunofluorescence assay using a cell culture-derived antigen for detection of antibodies to the agent of human granulocytic ehrlichiosis. J Clin Microbiol 1997 ;35(6):1510-1516.)이나 특허(참조; CN1281984: Preparation method of antinuclear antibody detection reagent Hep-2 cell antigen fragment and its product, FR2602241: Plate for the microscopic examination of livingcell cultures, WO9402594: Macrophage cell line for an antinuclear antibody test; A method for detecting the said antibody by employing the macrophage cell line and therof.)에 개시되어 있다. 슬라이드글래스에 세포를 부착하는 방법은 슬라이드글래스 위에 세포현탁액을 넣고 원심력을 이용하여 슬라이드글래스 표면에 세포를 부착시킨 후에 세포를 고정하는 기술(참조; Pat. No.; US4853188:Cell for placing solid matters on a slide glass under centrifugal force)과 슬라이드글래스상에 배양챔버를 설치하는 방법(참조: Pat No.; FR2602241:Plate for the microscopic examination of living cell cultures, US3883398: Microculture slide chamber, EP681024:Improved biological culture slide and method of making same, EP0747474: Culture slide assembly)이 있다. 원심력을 이용하여 슬라이드글래스표면에 세포를 부착시킨 후에 세포를 고정하는 기술은 세포를 무균적으로 배양하기 어려워서 계속배양으로는 사용할 수 없으며, 배양챔버가 설치된 슬라이드글래스의 경우는 배양챔버를 따로 제작하고 이를 슬라이드글래스에 붙여서 무균처리하는 등 제작과정상 여러 단계를 거쳐야 하며 배양면적이 96플레이트(50mm2)에 비해 작지 않으므로 배양에 필요한 세포의 수나 시험에 필요한 시약의 양이 96플레이트에 비해 적지 않다.
본 발명은 포유동물 세포를 다중시험 슬라이드글래스 상에서 배양할 수 있는킷트와 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 포유동물 세포를 다중시험 슬라이드글래스 상에서 보다 쉽게 배양하고 하나의 슬라이드글래스 상에서 동시에 적어도 12 종류의 다른 세포를 배양하여 비교할 수 있으며 앞서 제시된 여러 배양챔버 슬라이드 글래스보다 배양면적(28mm2)이 작아서 시험에 필요한 세포의 수가 적고 배양에 필요한 배지의 부피(20ul)도 작아서 세포의 특성분석에 사용되는 시약의 양도 적게 소요된다. 또한 일반적으로 많이 쓰이는 페트리디쉬(petri dish)를 이용하였으며 12웰-슬라이드글래스만을 교체하고 배양페트리디쉬는 계속 사용할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 포유동물 세포를 미세배양조건 하에 배양할 수 있는 다중시험 슬라이드글래스의 제조과정을 나타낸 그림이다.
도 2는 포유동물 세포를 미세배양조건 하에 배양할 수 있는 다중시험 슬라이드글래스를 위에서 본 모식도이다.
도 3은 포유동물 세포를 미세배양조건 하에 배양할 수 있는 배양용기를 위에서 본 형태를 모식화한 그림이다.
도 4는 포유동물 세포를 미세배양조건 하에 배양할 수 있는 다중시험슬라이드글래스를 배양용기에 넣은 그림이다.
도 5는 포유동물 세포를 미세배양조건 하에 배양할 수 있는 다중시험 글라이드 글래스를 배양용기에 넣고 동물세포를 배양하여 세포의 정상적인 형태를 보이고 있는 그림이다.
도 6은 포유동물 세포를 미세배양조건 하에 배양할 수 있는 다중시험 슬라이드글래스를 이용하여 동물세포내에서 GnTIII 단백질의 세포밖단백질부문과 세포막단백질의 발현양상을 보인 그림이다.
본 발명은 슬라이드글래스에 세포배양이 가능한 2∼100개의 웰이 구비된 세포배양용 다중시험 슬라이드글래스로 구성된다. 또한 본 발명은 슬라이드글래스에 세포배양이 가능한 2∼100개의 웰이 구비된 다중시험 슬라이드글래스; 상기 다중시험 슬라이드글래스를 고정시키는 고정수단과 공기중 수분량을 조절하기 위한 수분유지수단이 구비된 배양용기; 및 상기 배양용기를 덮는 뚜껑으로 이루어진 세포배양용 킷트로 구성된다. 또한 본 발명은 슬라이드글래스에 2∼100개의 웰이 표시된 소수성 필름을 코팅한 다음 고압멸균처리하고 각 웰에 젤라틴 용액을 가한 후 건조시켜 다중시험 슬라이드글래스를 제조하는 단계; 상기 다중시험 슬라이드글래스를 고정시키는 고정수단을 설치하고 용기내의 수분량을 조절하기 위하여 용기 바닥의안쪽을 따라 수분유지수단을 설치하는 배양용기를 제조하는 단계; 및 상기 배양용기를 덮는 뚜껑을 제조하는 단계로 이루어진 세포배양용 킷트의 제조방법으로 구성된다.
본 발명은 세포배양이 가능한 웰이 구비된 다중시험 슬라이드글래스의 각 웰에 제라틴 기질을 코팅하여 세포를 부착시키는 세포배양용 킷트를 제공한다. 또한 본 발명은 세포배양이 가능한 웰이 구비된 다중시험 슬라이드글래스에서 배양시켜 이용할 수 있는 질병진단용 세포를 제공한다. 또한 본 발명은 세포배양이 가능한 웰이 구비된 다중시험 슬라이드글래스에서 배양시켜 이용할 수 있는 신규의 유전자 발현과 기능확인용 세포를 제공한다.
또한 본 발명은 슬라이드글래스에 2∼100개의 웰이 표시된 소수성 필름을 입힌 다음 고압멸균처리하고 각 웰에 젤라틴 용액을 가하여 건조시켜서 세포배양용 다중시험 슬라이드글래스를 제조하는 단계; 상기 다중시험 슬라이드글래스의 움직임을 고정하여 억제할 수 있도록 볼록면을 설치하고 배양용기내 수분의 량을 조절하기 위하여 용기 바닥의 안쪽을 따라 볼록면을 설치하여 배양용기를 제조하는 단계; 및 상기 배양용기의 뚜껑을 제조하는 단계를 포함하는 세포배양용 킷트의 제조방법을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 세포를 배양할 수 있는 슬라이드글래스를 제공한다. 또한 본 발명은 슬라이드글래스에서 세포를 배양할 수 있는 적어도 2 개 이상의 웰을 제공한다. 또한 본 발명은 슬라이드글래스를 고정할 수 있는 배양페트리디쉬를 제공한다. 또한 본 발명은 슬라이드글래스 상에서 배양된 동물세포를 조직화학법에 이용하는 용도를 제공한다. 또한 본 발명은 슬라이드글래스 상에서 신규의 유전자 삽입에 의한 동물세포를 형질전환하여 신규의 유전자 발현특성을 확인하는 용도를 제공한다. 이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
일반적인 슬라이드글래스에 도 1과 같이 12개의 원형 모양의 구멍(직경 5mm)을 가진 소수성 필름(두께 0.1mm 이상)을 부착시켜서 12웰-슬라이드글래스를 제조하고 이를 고온멸균하거나 고압멸균의 방법으로 무균처리하였다. 12웰-슬라이드글래스의 각 웰에 각각 무균의 젤라틴용액(0.2%) 5ul를 떨어뜨리고 실온에서 건조시켜서 세포배양용 12웰-슬라이드글래스를 제조하였다.
투명한 플라스틱의 재질로 된 페트리디쉬에 슬라이드글래스를 넣을 때 슬라이드의 이동을 막기 위하여 슬라이드글래스의 모서리를 따라 높이 1mm의 구릉을 설치하고 슬라이드글래스의 장·단 측면을 에워싸고 있는 구릉중 장측면의 중앙 양쪽에 5mm 가량에는 구릉이 없는 형태로 슬라이드글래스 배양플라스크를 제조하였다. 이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로서 본 발명의 권리범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
＜실시예 1＞ 다중시험 슬라이드글래스의 제조
일반적인 슬라이드글래스(75mm×25mm)에 12개의 웰(직경 6mm)이 표시된 소수성 필름을 입힌 다음 고압멸균처리하고 각 웰에 0.2% 젤라틴(gelatin)용액을 가하고 1시간 동안 건조시켜서 세포배양용 다중시험 슬라이드글래스를 제조하였다.(도1및 도2 참조)
＜실시예 2＞ 다중시험 슬라이드글래스용 배양페트리쉬 용기의 제조
다중시험 슬라이드글래스 상에서 세포배양을 원활히 하기 위하여 본 발명의 배양페트리디쉬를 제조하였다.(도3 참조) 배양페트리쉬는 다중시험 슬라이드슬래스가 놓이는 용기와 그의 뚜껑으로 되어 있다. 배양페트리쉬는 슬라이드글래스의 움직임을 억제할 수 있도록 볼록면을 설치하였으며 배양페트리쉬내 수분의 량을 조절하기 위하여 용기 바닥의 안쪽을 따라 역시 볼록면을 설치하였다.(도3 참조)
＜실시예 3＞ 다중시험 슬라이드글래스에서 세포배양
다중시험 슬라이드글래스를 배양페트리디쉬에 넣고(도4 참조) 원숭이 신장세포주 COS-1, 사람 자궁암세포주 Hela세포를 본 발명 다중시험슬라이드글래스에 각각 2일간 배양한 후 세포의 성장상태를 현미경으로 확인하였다.(도5) 두 종 세포 모두 상피세포주의 특성을 갖고 있는 세포주로서 현미경으로 관찰한 결과 두 종의 세포주 모두 상피세포의 특성을 갖추고 있음을 알 수 있었다.
＜실시예 4＞ 다중시험 슬라이드글래스 상에서 세포의 형질전환과 신규의 유전자발현 확인
실시예 3에서 COS-1세포와 Fugene 6(Boeringer Mannheim Co.)용액 0.1ul, 그리고 사람 GnTIII 유전자의 세포내분포 서열을 포함하는 pGFP/GnT368 플라스미드또는 사람 GnT-3 유전자의 세포외분포 서열의 일부를 포함하는 pGFP/GnT609 플라스미드를 20ul의 10% 소아태아혈청이 포함된 배지에 섞어서 12웰-슬라이드글래스의 각 웰에 투여하여 형광물질을 생산하지 않는 COS-1세포를 형질변환시키고 계속 배양하였다. 각 재조합 플라스미드에 대한 대조군으로는 사람 GnTIII 유전자를 포함하지 않은 pGFP 플라스미드를 사용하였다. 이 결과에서 pGFP 플라스미드를 포함한 COS-1세포는 세포의 전부분에서 형광을 나타내었으나 pGFP/GnT368 플라스미드와 pGFP/GnT609 플라스미드를 포함한 COS-1 세포에서는 각각 다른 위치에서 발현함을 확인하였다.(도6 참조)
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 포유동물 세포를 다중시험 슬라이드글래스 상에서 배양할 수 있는 킷트와 이의 제조방법을 이용하면 약물 투여에 의한 변화를 여러가지 각기 다른 종류의 세포들에 대해 시험할 수 있으며, 신규의 유전자 삽입에 의한 형질변환된 세포의 형태를 한번에 일반 현미경으로 매우 쉽게 확인할 수 있을 뿐만 아니라 형질전환된 세포에서도 역시 신규의 유전자 발현 및 발현위치를 세포의 종류에 따라 그 발현양상을 한번에 일반 현미경으로 매우 쉽게 확인할 수 있으며 유전자의 발현를 고배율로 볼 수 있고 각각의 세포들에 적어도 12종류의 각기 다른 신규의 유전자 발현양상도 동시에 확인할 수 있다.
또한 다중시험 슬라이드글래스의 한 웰의 면적이 5mm2이어서 배양액이 10-20ul의 부피만이 필요하므로 DNA의 소요량이나 세포의 형질전환에 사용되는 시약의 양도 96웰 플레이트에서 형질전환 시험을 수행하는 방법(참조: Qiagen 사, superfect transfection reagent handbook, 2000)과 비교할 때 표 1에 표시한 바와 같이 적게 사용됨을 알 수 있다. 따라서 동일한 양의 시약과 DNA로 보다 많은 시험을 할 수 있고 기존 세포배양용으로 판매되고 있는 슬라이드글래스제품보다는 시약 및 DNA의 사용량뿐만 아니라 보다 많은 시험을 동일한 슬라이드글래스에서 수행할 수 있는 매우 많은 경제적으로도 높은 가치를 가지고 있다.
또한 최근 기능성 유전공학(functional genomics) 연구에서 많은 유전자의 기능을 밝히는 연구가 증대되고 있는 바 세포내에서 유전자를 발현시키고 이를 항체를 이용하여 발현된 유전자를 확인할 수 있는 방법으로 면역조직화학방법은 매우 특이적인 방법이나 확인할 수 있는 방법이 필요한 실정이다. 96웰 플레이트는 시약의 사용량 등에서는 본 특허의 다중시험 슬라이드글래스에 비해 약간 떨어지나 발현된 유전자를 면역조직화학법으로 확인할 수 없으며, 기존의 세포배양용 슬라이드글래스(Nunc 사 제품번호 155411)는 형질전환 시험에서 보다 많은 양의 시약이 필요하다.
다중시험 슬라이드글래스와 96웰 플레이트의 각 웰에서 형질전환 시험에 필요한 시약량의 비교
시약플레이트 DNA의 양(ug) 시험액의 부피(ul) 리포좀의 량(ul) 배양액(ul) 필요한세포의 수
다중시험슬라이드글래스 0.10 20 1 20 5000
96웰 플레이트 0.50 30 2.5 150 20000
다중시험 슬라이드글래스와 세포배양용 슬라이드의 각 웰에서 세포 배양에 필요한 배지량의 비교
시약플레이트 슬라이드당웰 수 배양액의 부피(ul) 배양면적(cm2/well)
다중시험슬라이드글래스 12 20 0.2
기존 세포배양용슬라이드 8 200-400 0.8

Claims (5)

  1. 삭제
  2. 슬라이드글래스에 세포배양이 가능한 2∼100개의 웰이 구비된 다중시험 슬라이드글래스; 상기 다중시험 슬라이드글래스를 고정시키는 고정수단과 공기중 수분량을 조절하기 위한 수분유지수단이 구비된 배양용기; 및 상기 배양용기를 덮는 뚜껑으로 이루어진 것을 특징으로 하는 세포배양용 킷트.
  3. 슬라이드글래스에 2∼100개의 웰이 표시된 소수성 필름을 코팅한 다음 고압멸균처리하고 각 웰에 젤라틴 용액을 가한 후 건조시켜 다중시험 슬라이드글래스를 제조하는 단계; 상기 다중시험 슬라이드글래스를 고정시키는 고정수단을 설치하고 용기내의 수분량을 조절하기 위하여 용기 바닥의 안쪽을 따라 수분유지수단을 설치하는 배양용기를 제조하는 단계; 및 상기 배양용기를 덮는 뚜껑을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포배양용 킷트의 제조방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
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