KR102410357B1 - 세포 배양 장치 시스템 및 그의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

세포를 생육, 배양 및/또는 변형시키는데 사용하기 위한 용기는 주요 용기(10)를 갖고, 주요 용기(10)의 벽 요소(8)는 압축가능한 내강을 한정하며, 이 용기는 주요 용기(10)와 유체 연통되는 보조 용기(16)를 갖는다. 용기가 보조 용기(16)를 갖는다는 사실은 단일 용기 내에서 다수개의 별도의 반응이 수행될 수 있도록 한다.

Description

세포 배양 장치 시스템 및 그의 사용 방법
본 발명은 세포를 배양, 조작(manipulate), 또는 저장하는 장치를 사용하는 시스템 및 그의 사용 방법을 비롯한, 세포를 배양, 조작 또는 저장하는 장치에 관한 것이다. 본 발명은 그러한 장치를 이용하여 생물학적 샘플을 수득하는 방법을 포함한, 배양, 유전자 조작 및 동결 보존에서 세포를 증식시키는 방법 및 세포를 개체에게 전달하는 방법에 관한 것이다.
세포의 배양 또는 처리(processing)는 통상적으로 예를 들면 세포를 배양할 때 적절한 배지 중에 세포를 보유하는 장치의 사용을 필요로 한다. 공지된 장치는 진탕 플라스크(shaker flask), 회전 병(roller bottle), T-플라스크(T-flask) 및 백을 포함한다. 그러한 병이나 플라스크가 널리 사용되나, 여러 단점을 갖는다. 문제점들 중 주요한 것은 계대배양(passaging)이나 후속 처리시 오염 없는 세포의 전달(transfer) 및 보충제와 인자의 멸균 첨가에 대한 요구이다.
기존의 세포 배양 장치는 연속 세포 증식을 위해 배지 및 산소의 재공급을 요구한다. 기체 투과성 세포 배양 장치가 미국 특허 제 8415144 호에 기재된다. 그러나, 그러한 장치도 장치의 내외부에서의 배지 및/또는 세포의 전달을 필요로 한다.
의약 분야에서 사용되는 접을 수 있는 장치(collapsible device)가 공지되어 있다. 예를 들면, 혈액 수집기에 관한 미국 특허 제 4867172 호, 또는 유체 수집을 위한 캐니스터 라이너에 관한 WO 2008/030597 호를 참조한다. 그러나, 그러한 장치는 세포 배양에서의 사용을 위해 제작되거나 제조되지 않는다.
의약에서 사용하기 위한 세포의 생산에서 핵심 제한 인자는 오염 없이 세포를 처리하기 위한 완전 폐쇄 시스템의 부재이다. 예를 들면, 세포의 배양 또는 후속 처리 동안, 배양 용기로의 추가, 또는 세포의 제거시 오염의 위험이 있다. 작동 시스템이 주로 수동이고 따라서 작동이 비싸다. 또한, 수동 작업의 증가에 따라, 수동 오류의 위험이 증가되고, 따라서 현재의 노동-집약적 공정은 임상-등급 치료제의 제조를 위해 요구되는 건전성(robustness)이 부족하다.
따라서, 신선한 배양 장치로의 세포의 지속적인 계대배양, 원심분리 관으로의 또한 원심분리 관으로부터의 세포의 다수회의 전달의 요건을 피하고, 세포의 용이한 유전적 변형을 가능하게 하고, 후속 단계(예를 들면, 세척 등) 및/또는 임상적 사용에서 세포의 취급을 단순화하는 처리를 허용하는 세포 배양 장치에 대한 요구가 있다. 예를 들면, 주어진 배양액의 세포 개체군이 증가되면서 세포를 더 큰 장치로 옮기지 않으면서 배양액 중 세포의 확장(scale-up)이 이루어질 수 있다면 유리할 것이다. 본 출원인의 이전 출원(PCT/GB2016/051451 호)은 가요성 물질로 구성되는 벽 요소가 그의 상부 및 기부 구역에 대해 압축가능한 세포 배양 용기를 기재한다.
이제 본 출원인은 본원에서, 이전 출원의 세포 배양 용기의 이점(즉, 새로운 배양 장치, 보유 용기, 관 등으로의 세포의 지속적인 계대배양 요구를 피함)을, 개별적으로 구성될 수 있는 저장 또는 배양 장치를 가짐으로써 부여되는 이점과 조합하는, 그 이전 용기의 개선된 버전을 제공한다. 개선된 장치는 본원에서 더욱 상세하게 설명되는 바와 같이 세포 배양 용기 같은 단일 용기 내에서 다양한 기능이 수행될 수 있게 한다.
따라서, 본 발명은 세포를 생장, 배양 및/또는 변형시키는데 사용하기 위한 장치를 제공하며, 이 장치는 세포 배양 용기 같은 주요 용기를 포함하고, 이 장치는 주요 용기와 유체 연통되는 하나 이상의 보조 용기를 추가로 포함하며, 상기 주요 용기는 기부 구역, 기부 구역과 실질적으로 평행하게 배열된 상부 구역 및 상부 구역과 기부 구역 사이에 배열되고 주요 용기의 내강(internal lumen)을 한정하는 벽 요소를 갖고, 상기 주요 용기는 하나 이상의 임의적으로 밀봉가능한 유입구를 갖는다.
장치는 복수개의 보조 용기를 포함할 수 있다. 하나 이상의 보조 용기 또는 복수개의 보조 용기는 주요 용기 외부에 있을 수 있고 주요 용기와 유체 연통될 수 있다.
주요 용기의 벽 요소는 상부 및 기부 구역에 대해 압축될 수 있다. 주요 용기의 벽 요소는 가요성 물질로 구성될 수 있다. 주요 용기는 이에 따라 '콘서티나(concertina)' 또는 '벨로즈(bellows)' 배열을 가질 수 있다. 예컨대, 이는 벽 요소에서 하나 이상의 z-주름을 가질 수 있다. 다르게는, 주요 용기는 재충전되거나 비워질 수 있도록 하는 주사기 배열을 가질 수 있다.
본원에 기재되는 바와 같이, 본 발명은 완전히 압축되거나 비워진 용기로의 유체 연통을 중단하기 위한 수단을 포함할 수 있다.
하나 이상의 보조 용기는 예를 들어 하나 이상의 밀봉가능한 유입구를 통해 주요 용기에 탈착가능하게 연결될 수 있다. 따라서, 하나 이상의 보조 용기는 주요 용기로부터 탈착된 후 재부착될 수 있도록 구성될 수 있다. 이는 이렇게 구성된 보조 용기가 시약으로 충전된 다음 주요 용기에 부착 또는 달리 연결될 수 있도록 한다. 보조 용기를 주요 용기에 가역적으로 고정시키는 임의의 수단(예컨대, 나사 기계장치 또는 밀어맞추기 잠금장치)을 사용할 수 있다. 다르게는, 장치는 하나 이상의 보조 용기가 주요 용기와 단일 폐쇄 상호연결 시스템을 형성하도록 제작될 수 있다. 각 용기에 있는 별도의 포트를 통해 유체를 도입함으로써, 예컨대 세포 배지로 하나 이상의 용기를 채울 수 있다. 이 별도의 포트는 보조 용기의 상부에 위치할 수 있다.
장치는 복수개의 보조 용기를 포함할 수 있다. 보조 용기는 독립적으로 주요 용기와 유체 연통될 수 있다. 둘 이상의 보조 용기가 직렬보다는 병렬로, 즉 주요 용기와는 직접 유체 연통되지만 서로와는 직접 유체 연통되지 않도록, 주요 용기에 연결될 수 있다. 추가로 또는 다르게는, 하나 이상의 보조 용기는 하나 이상의 다른 보조 용기와 직접 유체 연통될 수 있고, 주요 용기와 직접 유체 연통되지 않을 수 있다. 보조 용기는 형태에 따라 크기 및 부피가 변할 수 있다. 하나 이상의 보조 용기는 생물 반응기 같은 추가 용기와 직접 유체 연통될 수 있다. 본 발명은 원래 제 1 용기, 예컨대 주요 용기와 직접 유체 연통되는 보조 용기가 제 2 용기, 예를 들어 생물 반응기 같은 추가 용기와 직접 연통될 수 있도록 하는 수단을 한정한다.
제 2 용기와 "직접" 유체 연통되는 제 1 용기에 대한 각각의 인용은 제 1 용기의 내용물이 중간 용기를 통해 통과하지 않고 제 2 용기로 전달될 수 있음(또는 그 반대로)을 의미한다.
일반적으로, 하나 이상의 보조 용기는 주요 용기보다 작은 크기 및 부피를 가질 것이다. 그러나, 주요 용기로부터의 폐기물을 수용하도록 구성되는 임의의 보조 용기는 통상 보조 용기보다 더 큰 부피를 가질 것으로 생각된다.
하나 이상의 보조 용기는 주요 용기의 상부 구역에 위치할 수 있다.
추가로 또는 다르게는, 하나 이상의 보조 용기는 주요 용기의 기부 구역에 또는 그 근처에 위치할 수 있다. 예를 들어 주요 용기에서 수행되는 임의의 반응(들)의 생성물(들)을 수집하고자 하는 경우에는, 이러한 구성을 이용할 수 있다. 예를 들어 주요 용기에서 이루어지는 진행중인 공정, 예컨대 세포 배양 공정에서 품질 평가 또는 품질 제어를 수행하고자 하는 경우에는, 이러한 형태를 이용할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 장치와 함께 사용하기 위한 보조 용기를 제공한다.
본 발명의 보조 용기는 주요 용기와 동일한 대략적인 형태를 가질 수 있다. 즉, 이는 기부 구역, 기부 구역과 실질적으로 평행하게 배열되는 상부 구역 및 상부 구역과 기부 구역 사이에 배열되고 보조 용기의 내강(이 안에서 용기는 하나 이상의 임의적으로 밀봉가능한 유입구를 가짐)을 한정하는 벽 요소를 포함할 수 있다. 보조 용기의 벽 요소는 상부 및 기부 구역에 대해 압축될 수 있다. 보조 용기의 벽 요소는 가요성 물질로 구성될 수 있다. 이에 따라 보조 용기는 '콘서티나' 또는 '벨로즈' 배열을 가질 수 있다. 예컨대, 이는 벽 요소에서 하나 이상의 z-주름을 가질 수 있다. 다르게는, 보조 용기는 재충전되거나 비워질 수 있도록 하는 주사기 배열을 가질 수 있다. 본 발명의 보조 용기의 내용물을 다른 용기 내로 전달할 수 있을 필요가 있고, 이는 본원에 상세하게 기재되는 바와 같이 보조 용기를 접음으로써 또는 주사기 배열을 포함시킴으로써 달성될 수 있는 것으로 생각된다.
본 발명의 보조 용기는 그 보조 용기의 내용물을 특정 온도로 유지시키도록 구성되는 열 슬리브(thermal sleeve) 같은 절연 수단을 포함할 수 있다. 따라서, 보조 용기는 그의 내용물을 최적 세포 배양 온도(37℃) 또는 실온(22℃), 또는 냉장 온도(예를 들어, 약 4℃) 또는 동결점 미만(예컨대, 약 -4℃ 이하, 예를 들어 -20℃ 또는 -80℃)으로 유지시키도록 구성될 수 있다. 그의 의도되는 형태에 따라, 본 발명의 장치는 다양한 온도를 유지하도록 구성되는 하나 이상의 보조 용기를 가질 수 있다.
본 발명의 보조 용기는 본 발명의 주요 용기와 유체 연통 상태로 부착되도록 구성되는 경우 단일 유출구를 가질 수 있다. 다르게는, 본 발명의 보조 용기는 하나 보다 많은 유출구, 예를 들어 대향하는 면 상에 두 개의 유출구를 가질 수 있다. 이 배열은 하나 이상의 보조 용기가 직렬로 연결되도록 한다.
본 발명의 보조 용기가 본 발명의 장치의 주요 용기로부터 탈착될 수 있기 때문에, 본 발명은 본원에 정의되는 하나 이상의 보조 용기와 함께 본원에 정의하는 본 발명의 주요 용기를 포함하는, 본 발명의 장치 내로 조립하기 위한 부품의 키트를 제공한다.
주요 용기와 유체 연통되는 하나 이상의 보조 용기를 포함하는 본 발명의 이러한 본원에서 정의되는 장치의 배열이, 단일 용기 내에서 다수개의 별도의 반응이 수행될 수 있도록 함을 알게 될 것이다. 구체적으로, 본 발명의 장치 내에서 다단계 세포 배양이 고려된다. 또한, 일련의 처리를 위해, 예를 들어 세포를 일련의 항체 또는 소분자에 노출시키는데 본 발명의 장치를 사용할 수 있음을 알게 될 것이다. 또한 예컨대 생검으로부터의 세포의 특정 부분모집단을 정제하는 데에도 이 장치를 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 장치가 복수개의 보조 용기를 포함하는 경우, 보조 용기는 상이한 요소를 함유하도록 구성될 수 있다. 하나의 예에서, 제 1 보조 용기는 세포 배지를 함유하도록 구성될 수 있는 한편, 다른 보조 용기는 바이러스 벡터를 함유하도록 구성될 수 있고, 다른 보조 용기는 세척 완충액을 함유하도록 구성될 수 있으며, 또한 추가적인 보조 용기는 자기 비드, 성장 인자 등을 함유하도록 구성될 수 있다. 당 업자에 의해 용이하게 예상되는 바와 같이 다른 형태도 가능하다.
본 발명의 장치는 주요 용기가 예컨대 그의 중심 축 상에서 원심분리되거나 또는 달리 회전될 수 있도록 구성될 수 있다.
따라서, 본 발명의 장치는 내용물을 분리해내기 위하여 용기의 내용물을 회전시킬 수 있는 원심분리기 또는 다른 수단 같은 추가적인 장치를 포함할 수 있다. 장치는 용기의 좌우로 흔들기를 유지하기 위한 흔들기 수단을 포함할 수 있고/있거나 그 위에 놓인 용기가 진동되어 진탕되도록 할 수 있는 플랫폼을 포함할 수 있다. 장치는 주요 용기 및/또는 하나 이상의 보조 용기를 압축시키도록 구성된 레버, 플런저 또는 일련의 레버, 플런저 또는 벨로즈 같은 수단을 포함할 수 있다. 이러한 임의의 수단은 바람직하게는 본 발명의 용기를 압축시키거나 접을 수 있을 뿐만 아니라 요구되는 경우 용기를 재개방할 수 있어야 함을 알게 될 것이다. 용기의 반복되는 압축/확장에 의해 배지를 진탕시킴으로써 예컨대 원심분리 후 침강된/펠렛화된 세포를 재현탁시키게 된다. 장치는 센서 수단, 광 섬유, 산소 또는 다른 기체용의 기체 공급구, 가열/냉각 수단 및 온도 제어 수단 등과 같은 추가적인 수단을 포함할 수 있다. 그러므로, 장치는 주요 용기, 및 생물 반응기(본원에 정의된 바와 같음) 같은 임의의 임의적인 추가 용기(들)를 특정 온도로 유지하도록 구성될 수 있다. 이 온도는 일반적으로 최적 세포 배양 온도(37℃) 또는 실온(22℃)이지만, 이는 일부 경우에 세포 배양액의 냉장을 위해(예를 들어 약 4℃) 또는 냉동을 위해(예를 들어, 약 -4℃ 이하, 예컨대 -20℃) 더 낮을 수 있거나, 또는 저온 보존이 요구되는 경우에는 -80℃ 미만일 수 있다. 장치는 또한 온 상태와 오프 상태 사이에서 제어될 수 있는 자석을 포함할 수 있다. 이러한 자석은 본원에 더욱 상세하게 기재되는 바와 같이 금속 비드를 보유하도록 구성되는 보조 용기와 함께 사용될 수 있다.
주요 용기(및 생물 반응기 같은 임의의 임의적인 추가 용기(들))의 온도 같은 조건은 주요 용기와 유체 연통되는 하나 이상의 보조용기중 임의의 것 내에서의 조건과는 독립적으로 유지될 수 있음을 알게 될 것이다.
본원에 상세하게 기재되는 바와 같이, 본 발명의 용기(즉, 각각 본원에서 더욱 상세하게 정의되는 주요 용기, 보조 용기 및/또는 생물 반응기 같은 추가 용기)는 주요 용기와 동일한 일반적인 형태를 가질 수 있다. 즉, 본 발명의 용기는 기부 구역, 기부 구역과 실질적으로 평행하게 배열되는 상부 구역 및 상부 구역과 기부 구역 사이에 배열되고 영기의 내강(이 안에서 용기는 하나 이상의 임의적으로 밀봉가능한 유출구를 가짐)을 한정하는 벽 요소를 포함할 수 있다. 용기의 벽 요소는 상부 및 기부 구역에 대해 압축가능할 수 있다. 용기의 벽 요소는 가요성 물질로 구성될 수 있다. 이에 따라 용기는 '콘서티나' 또는 '벨로즈' 배열을 가질 수 있다. 예컨대, 이는 벽 요소에서 하나 이상의 z-주름을 가질 수 있다. 다르게는, 용기는 재충전되거나 비워질 수 있도록 하는 주사기 배열을 가질 수 있다. 본원에 상세하게 기재되는 바와 같이 용기를 접음으로써 또는 주사기 배열을 포함시킴으로써 본 발명의 용기의 내용물을 다른 용기 내로 전달할 수 있다.
본 발명의 용기는 조정가능할 수 있고 다수의 상이한 형태를 취할 수 있다. 이는 확장되거나 또는 부분적으로 확장된 상태로부터 압축되거나, 또는 압축되거나 또는 부분적으로 압축된 상태로부터 확장될 수 있다. 본원에서 설명되는 바와 같이, 수동적으로 또는 능동적으로, 예를 들면 수동으로 또는 레버 또는 플런저 같은 작동 장치(actuating device)의 제어하에 상이한 형태가 달성될 수 있다. 작동 장치는 원하는 대로 또는 필요에 따라 본 발명의 용기의 압축 또는 확장을 유발하기 위해 가역적인 방식으로 작동될 수 있다.
본 발명의 용기는 완전히 확장된 개방 배열로부터, 부분적으로 압축되거나 접힌 반-개방 또는 반-폐쇄 배열을 거쳐서, 완전히 접히거나 압축된 배열로 압축될 수 있다.
본 발명의 용기는 벽 요소가 변형가능한 경우 상부 및 기부 구역에 대해 압축가능하다. 본 발명의 용기의 압축은 콘서티나 또는 벨로즈의 압축(즉, 용기의 벽 구역이 변형가능하고 예컨대 z-주름으로 접힐 수 있음)과 유사할 수 있다. 상부 구역 및 기부 구역이 벽 요소의 변형에 의해 함께 더 가깝게 당겨진다. 변형은 용기의 유연한 물질중 더 높은 유연성의 라인이나 영역을 따라 일어날 수 있다. 다르게는, 본 발명의 용기는, 본 발명의 용기로부터 액체를 몰아내거나 액체를 다시 안으로 빨아들이도록 움직일 수 있는 요소를 갖는, 주사기와 유사한 배열을 가질 수 있다.
따라서, 본 발명의 용기의 압축은 상부 구역과 기부 구역의 평면에 접선인 축을 따라 일어나는 것으로 기술될 수 있다. 따라서, 상부 구역과 기부 구역이 실질적으로 수평 위치로 배열된 경우(용기가 직립 형태인 것으로 기술될 수 있는 경우), 용기의 압축은 수직 방향으로 일어난다. 마찬가지로, 상부 구역과 기부 구역이 실질적으로 수직 위치로 배열된 경우(용기가 횡단 또는 측방향 형태인 것으로 기술될 수 있는 경우), 용기의 압축은 수평 방향으로 일어난다.
완전히 확장된 또는 개방된 배열에서, 본 발명의 용기는 세포의 배양을 위한 최대 가용 부피를 가질 수 있다. 완전히 접히거나 또는 압축된 배열에서, 본 발명의 용기는 용기의 저장 또는 수송에 더 적합하거나, 또는 세포의 세척 또는 펠렛화에 의한 세포의 처리에서 단계의 일부로서 더 적합한 최소 가용 부피를 가질 수 있다. 본 발명의 용기는 상부 구역과 기부 구역을 함께 보다 가깝게 가져오는 작동 장치에 의해 압축될 수 있다. 마찬가지로, 본 발명의 용기는 상부 구역과 기부 구역을 더 멀리 떨어지게 이동시키는 작동 장치에 의해 확장될 수 있다. 이는 압축 및 확장 둘 다를 달성하는 동일한 작동 장치일 수 있다. 따라서, 본 발명의 장치는 본 발명의 용기의 상부 및 기부 구역을 상대적으로 움직이기 위한 하나 이상의 작동 장치를 포함할 수 있다.
본 발명의 용기가 폐쇄 또는 반-폐쇄 배열에서 확장되는 경우, 확장은 예를 들어 용기의 수동 확장에 의해, 또는 상부 구역과 기부 구역을 더 멀어지게 이동시킴으로써 용기를 확장하는 작동 장치 내에 용기를 유지시키는 경우 기계적 확장에 의해 적절하게 제어될 수 있다. 본 발명의 용기는 또한 적절한 물질로부터 제조된 일부 실시양태에서 자가-확장될 수 있다. 본 발명의 용기는 또한 액체 또는 기체와 같은 유체를 도입함에 의해 확장될 수 있다. 마찬가지로, 본 발명의 용기는 또한 액체 또는 기체와 같은 유체를 제거함에 의해 압축될 수 있다.
주요 용기와 유체 연통되는 관계로 배열되는 하나 이상의 보조 용기를 갖는 본 발명의 장치의 형태가 단일 용기 내에서 다단계 세포 배양을 가능케 함을 알게 될 것이다. 따라서, 반응을 개시한 다음 혼합물을 원심분리하거나 또는 달리 회전시켜 주요 용기 내에 관심 세포를 보유시킬 수 있고, 반응 매질은 주요 용기의 압축시 폐기물로서 적합하게 구성된 보조 용기 내로 방출될 수 있다. 이어, 관심 세포를 추가 보조 용기로부터 주요 용기 내로 도입될 수 있는 추가 반응 매질에 재현탁시킬 수 있다. 관심 세포 배양액 또는 세포 배양 생성물을 수득하기 위하여 필요한만큼 자주 원심분리/회전 및 재현탁 순서를 반복할 수 있다. 추가 보조 용기로부터의 벡터, 또는 라벨, 또는 선택 매질의 도입 같은 다른 단계를, 주요 용기와 유체 연통되는 적합하게 구성된 보조 용기의 존재를 포함하여 이러한 단계에서 필요한만큼 수행할 수 있다. 적합한 시점에서, 매질을 지정된 폐기물 보조 용기 내로 방출하여 새로운 매질의 재도입을 가능케 할 수 있다.
원심분리 외의 수단에 의해 고체-액체 분리를 달성할 수 있고, 따라서 중력 침강, 정상파 또는 여과 수단의 방법도 포괄되는 것으로 생각된다. 현탁액에 입자를 보유하는 음파 수단은 예를 들어 첸(Chen) 등의 문헌[(2014) Lab Chip. 3월 7일:14(5):924-30]에 기재되어 있는 바와 같이 널리 공지되어 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 장치 내에서 세포를 생장, 배양 및/또는 변형시키는 다단계 방법을 제공한다. 이 방법은 본 발명의 주요 용기와 유체 연통되는 하나 이상의 보조 용기를 다양한 시약으로 채움을 포함할 수 있다. 다르게는, 하나 이상의 미리 채워진 보조 용기를 제공할 수 있다. 방법은 주요 용기와 유체 연통되기 위하여 하나 이상의 미리 채워진 보조 용기를 주요 용기에 연결시킴을 포함할 수 있다. 시약은 세포를 생장, 배양 및/또는 변형시키는 방법에 사용되는 임의의 시약을 포함할 수 있다. 따라서, 하나 이상의 보조 용기는 완충제, 배지, pH 안정화제, 플라스미드, 바이러스 벡터, 다른 벡터, 성장 인자, 세척 매질, 라벨링된 항체, 자기 비드를 비롯한 다른 라벨랑 잔기 등을 함유할 수 있다.
본 방법은 관심 세포를 주요 용기 내로 도입하고, 세포의 목적하는 생장, 배양 및/또는 변형을 수행하기 위하여 하나 이상의 보조 용기로부터의 하나 이상의 시약을 주요 용기 내로 연속적으로 첨가함을 포함한다. 방법은 또한 하나 이상의 보조 용기에서 특정 공정을 수행하는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있으며, 이에 의해 주요 용기 내의 세포중 일부 또는 전부가 요구되는 보조 용기 내로 이동한다. 이 단계를 종결한 후, 세포를 주요 용기로 다시 전달할 수 있다. 방법은 세포 또는 세포 배양 생성물을 하나 이상의 보조 용기 내로 수집하는 단계를 포함할 수 있고; 수집된 세포 또는 세포 배양 생성물을 동결시키는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 예를 들어 품질 제어 또는 다른 모니터링 목적을 위해, 수집된 세포 또는 세포 배양 생성물의 샘플을 채취하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 소비된 배지를 주요 용기로부터 적합하게 구성된 폐기물 보조 용기 내로 전달하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 원심분리 또는 회전 단계일 수 있는, 배지로부터 세포를 분리해내는 단계를 포함할 수 있다. 세포는 주요 용기의 기부 판 상으로 분리될 수 있거나, 또는 이들은 주요 용기의 벽에 부착되도록 분리될 수 있다. 방법은 세포를 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 세포의 원심분리 또는 분리 후에 세척 단계를 수행할 수 있다. 분리는 여과, 회전, 중력 침강 또는 다른 공지의 수단에 의한 것일 수 있다. 다르게는, 방법은 예를 들어 정상파 또는 음파 수단을 통해 세척 동안 세포를 제 자리에 보유하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 주요 용기 내로 벡터를 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 주요 용기 내로 라벨을 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 주요 용기 내로 선택 매질을 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 새로운 배지에 세포를 재현탁하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 세포의 전기천공 또는 지질 또는 화합물 시약을 사용한 형질감염을 포함할 수 있다. 방법은 선택을 위해 항생체를 사용한 형질감염체 풀의 처리, 영양요구체 제거 또는 임의의 다른 수단을 포함할 수 있다. 방법은 바이러스-유사 입자로의 세포의 노출을 포함할 수 있다. 방법은 크기에 기초하여 세포를 단리하기 위해 밀도 원심분리를 포함할 수 있다. 방법은 친화력 정제 단계를 포함할 수 있다. 방법은 생물 반응기 작동의 유가 배양, 관류 또는 화학물질 조정 모드를 포함할 수 있다. 방법은 세포의 응집을 포함할 수 있다. 방법은 물질로부터 또는 서로로부터 세포를 해리시킴을 포함할 수 있다.
본 방법은 세포를 주요 용기로부터 생물 반응기 같은 추가 용기로 전달하는 단계를 포함할 수 있다. 세포가 주요 용기 내에서 특정 밀도(예컨대, 광학 밀도)에 도달할 때 이루어질 수 있다. 방법은 추가 용기 내에서 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 예를 들어 제 1 추가 용기 내에서 세포가 특정 밀도(예를 들어, 광학 밀도)에 도달했을 때, 세포를 제 1 추가 용기에서 제 2 추가 용기로 전달하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 예컨대 본원에서 더욱 상세하게 정의되는 잠금 밸브 기계장치에 의해, 하나 이상의 보조 용기가 추가 용기(들)와 유체 연통되도록, 주요 용기와 유체 연통되는 하나 이상의 보조 용기를 연결하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 하나 이상의 보조 용기를 추가 용기에 직접 연결하는 단계를 포함할 수 있다.
본 방법은 하나 이상의 보조 용기, 주요 용기 및/또는 하나 이상의 추가 용기중 임의의 용기 내에서 온도를 조절하는 단계를 포함할 수 있다. 가능한 온도 또는 온도 범위는 본원에 정의된 바와 같다. 방법은 주요 용기 또는 추가 용기 내에서의 조건(예컨대, pH 또는 온도)을 하나 이상의 보조 용기 내에서의 조건과 독립적으로 유지함을 포함할 수 있다.
목적하는 결과를 수행하기 위하여 필요한만큼 1회보다 더 많이 상기 임의의 단계를 수행할 수 있다.
본 방법은 보조 용기의 압축/접힘(이는 부분적으로 접히거나 완전히 접히는 것일 수 있음)을 통해 보조 용기의 내용물을 전달할 수 있다. 보조 용기에서의 주사기 기계장치를 통해 전달을 수행할 수 있다. 방법은 보조 용기의 압축/접힘(이는 부분적인 또는 완전한 접힘일 수 있음)을 통해 주요 용기의 내용물을 전달할 수 있다. 주요 용기 내의 주사기 기계장치를 통해 전달을 실행할 수 있다.
따라서, 본 방법은 주요 용기 및/또는 하나 이상의 보조 용기 내에서 세포의 초기 변형을 수행한 다음, 주요 용기를 생물 반응기 같은 추가 용기 내로 완전히 접는 단계를 포함할 수 있다. 이 단계 전에, 추가 용기는 완전히 접힌 상태이다.
또한, 주요 용기는 두 방향으로, 즉 그의 기부 구역 쪽으로 또는 그의 상부 구역 쪽으로 접힐 수 있는 것으로 생각된다. 따라서, 관심 세포가 펠렛화되어 주요 용기의 기부 구역에 놓이도록 주요 용기를 원심분리하는 경우에는, 주요 용기의 상부 구역과 유체 연통 관계로 위치되는 폐기물을 보유하도록 구성되는 보조 용기를 갖고; 폐기물 유체가 주요 용기의 기부 구역에서 원심분리된 펠렛을 최소한으로만 교란시키면서 방출되도록 주요 용기를 그의 상부 구역 쪽으로 압축시키는 것이 바람직할 수 있다. 반대로, 원심분리된 생성물을 수집하고자 한다면, 주요 용기의 기부 또는 기부 근처에서 유체 연통 관계로 위치되는 그 생성물을 수용하도록 구성되는 보조 용기를 갖고 주요 용기를 그의 기부 구역 쪽으로 압축시킴으로써 원심분리된 생성물을 개별적인 보조 용기 내로 방출시키는 것이 바람직할 수 있다. 생물 반응기 같은 임의의 추가 용기에 대해 동일한 배열이 존재할 수 있는 것으로 생각된다.
하나 이상의 용기가 직렬 연결될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 장치는 추가 보조 용기와 유체 연통되는 보조 용기를 포함할 수 있으며, 이 때 추가 보조 용기는 장치의 주요 용기와 직접 유체 연통되지 않는다. 추가로 또는 다르게는, 본 발명의 장치는 주요 용기와는 직접 유체 연통되지만 하나 이상의 보조 용기(들)와는 반드시 직접 유체 연통되는 것은 아닌 생물 반응기 같은 하나 이상의 추가 용기를 또한 포함할 수 있다. 따라서, 세포 반응이 주요 용기 내에서 종결되면, 세포 배지를 추가로 배양하기 위하여 생물 반응기 같은 추가 용기 내로 방출시킬 수 있다. 생물 반응기 같은 추가 용기 내로의 방출은 특정 세포 밀도에 도달하는 때, 예를 들어 주요 용기 내에서의 광학 밀도(OD)가 특정 소정 수준에 도달하는 때에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 장치는 연속적으로 더 큰 내부 부피의 일련의 이러한 생물 반응기를 포함할 수 있으며, 이 때 세포 배양액은 특정 세포 밀도에 도달할 때 각각의 후속 생물 반응기로 방출된다.
이러한 추가 용기(들)는 본원에서 정의되는 주요 용기와 동일한 방식으로, 예를 들어 압축가능하고 따라서 사용되지 않을 때에는 압축됨으로써 공간을 절약하도록 구성될 수 있다.
주요 용기, 하나 이상의 보조 용기 및 하나 이상의 추가 용기는 유출구를 통한 유체 연통이 제어되도록 하는 밸브 같은 수단을 가질 수 있다. 밸브 또는 다른 수단은 일방향성(예를 들어, 보조 용기가 압축될 때 보조 용기의 내용물이 주요 용기 내로 방출될 수 있게 하지만 반대로는 안되도록 함)일 수 있다. 다르게는, 밸브 또는 다른 수단은 다른 방향으로 일방향성(예컨대, 주요 용기가 압축될 때 주요 용기의 내용물이 보조 용기 내로 방출되도록 함)일 수 있다. 따라서, 하나 이상의 보조 용기는 반응으로부터의 폐기물을 보유하도록 구성되어, 반응의 몇가지 단계가 주요 용기 내에서 수행될 수 있도록 하고 각 단계로부터의 폐기물이 적합하게 구성된 보조 용기로 전달되도록 할 수 있다. 다르게는, 밸브는 이방향성일 수 있다. 그의 의도되는 구성에 따라, 본 발명의 장치는 이방향성 밸브와 일방향성 밸브 또는 다른 유체 제어 수단의 혼합물을 갖는 보조 용기를 가질 수 있다.
주요 용기, 하나 이상의 보조 용기 및 하나 이상의 추가 용기는 용기의 대향하는 면 상에 밸브 같은 유체 제어 수단과 유출구를 가질 수 있는데, 예를 들면 본 발명의 용기는 그의 상부 구역 및 기부 구역 둘 다에 밸브 같은 수단을 가질 수 있다. 이는 주요 용기, 보조 용기 또는 추가 용기중 하나 이상, 또는 이들의 임의의 조합이 직렬로 연결되도록 할 수 있다. 용기의 두 대향 면에서의 밸브 또는 다른 수단은 본 발명의 용기가 완전히 압축될 때 채널을 형성함으로써 상호 작용하도록 구성될 수 있다. 이로써, 채널은 본 발명의 용기의 내용물이 후속 용기로 전달되는 것을 도울 수 있다. 두 대향 면에서의 밸브 또는 다른 수단은 맞물리도록 구성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 용기를 1회만 사용하고자 하는 경우, 채널의 잠금은 그 용기의 유체 연통을 중단시킴으로써 사용된 용기에서의 소용없는 공간을 최소화한다. 이는 후속 용기 내로 세척될 때 후속 용기를 오염시킬 수 있는 사용된 용기 내에서의 임의의 잔류물이 존재하는 경우 중요할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 주요 용기가 생물 반응기 같은 추가 용기 내로 비워진 후에는 보조 용기로부터의 시약을 추가 용기 내로 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 주요 용기를 완전히 압축시키면 주요 용기와 유체 연통되는 보조 용기의 임의의 밸브 또는 다른 수단이 추가 용기의 유사한 밸브 또는 다른 수단과 맞물리게 함으로써 압축된 주요 용기 내의 소용없는 공간에 임의의 시약이 들어가지 못하게 할 수 있다. 이러한 방식으로, 보조 용기는 추가 용기와 직접 유체 연통되도록 위치될 수 있다. 추가로 또는 다르게는, 하나 이상의 보조 용기를 생물 반응기 같은 추가 용기에 직접 연결할 수 있는 것으로 고려된다.
본 발명의 용기(이에 의해 본원에 정의되는 주요 용기, 보조 용기 또는 생물 반응기 같은 추가 용기를 의미함)의 벽 요소는 기부 구역과 평행으로 배열된 벽에서의 복수개의 측방항 강성 구역을 포함하고, 이 때 각 쌍의 측면 강성 구역 사이에 변형가능한 영역이 끼워진다. 본 발명의 용기의 벽 요소는 나선 코일 영역의 어느 한 면에 제공되는 변형가능한 영역을 갖는 강성 나선형 코일 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 용기의 상부 구역, 기부 구역 및 벽 요소는 조정가능한 외부 프레임 내에 보유될 수 있는 백을 형성할 수 있거나, 또는 백의 물질 내에 조정가능한 내부 프레임을 포함한다. 따라서, 본 발명의 용기와(예를 들어, 주요 용기 또는 생물 반응기 같은 추가 용기와) 유체 연통되는 하나 이상의 보조 용기는 조정가능한 외부 프레임 내에 보유될 수 있는 백을 형성할 수 있거나, 또는 백은 백의 물질 내에 조정가능한 내부 프레임을 포함한다. 이러한 백은 예를 들어 정맥내 점적 주입 백으로서 작용하도록 구성될 수 있다. 따라서, 주요 용기 또는 추가 용기에서 수행되는 임의의 반응(들)의 생성물(들)은 백 내로 직접 수집될 수 있고, 이는 다시 제거되어 정맥내 점적 주입으로 전달될 수 있는 것으로 이해된다. 다르게는, 임의의 반응(들)의 생성물(들)은 용기의 강중 하나로부터 환자에게 직접 전달될 수 있고, 이 때 용기는 본원에 기재된 바와 같이 분할된다.
본 출원인의 이전 출원(PCT/GB2016/051451 호)에 기재된 바와 같이, 주요 용기 같은 용기는 단일 챔버를 포함하는 단일 내강을 포함할 수 있거나, 또는 이는 내강 내에서 복수개의 연속적으로 배열되는 내부 챔버를 형성하기 위하여 하나 이상의 폐쇄 수단에 의해 분할될 수 있다. 이러한 방식으로, 주요 용기는 주요 용기가 사용될 때 상이한 공정이 연속적으로 및/또는 병행하여 일어날 수 있는 다수의 상이한 대역 또는 영역을 수용할 수 있다. 단일 폐쇄-용기 시스템 내의 복수개의 챔버는 각각 고유한 챔버 내에서 다수개의 세포 유형의 동시 처리를 가능케 하는데, 필요한 경우에만 혼합이 이루어진다. 주요 용기는 본원에 기재된 바와 같이 용기내 영역의 선택적인 개방 및 폐쇄에 의해 이러한 상이한 챔버를 제공하도록 조정될 수 있다. 주요 용기가 복수개의 측면 강성 구역을 포함하는 경우, 개별적인 구역의 움직임은 독립적으로 제어되어 하나 이상의 쌍의 구역이 개방되도록 하는 한편 다른 것들이 폐쇄된 채로 유지되도록 할 수 있다. 각 쌍의 측방향 강성 구역은 주요 용기에서 개별적인 구획을 한정할 수 있다. 따라서, 주요 용기는 하나 이상의 구획을 구성하는 몇 개의 영역을 포함할 수 있다. 상이한 구획 또는 수 개의 구획을 한정하는 영역을 선택적으로 개방 또는 폐쇄하는 능력은 본 발명의 이 양태의 이점이다. 상부 구역 및/또는 기부 구역 및/또는 벽 요소는 유입 및/또는 유출 포트를 가질 수 있다. 이러한 방식으로, 상이한 구획 또는 영역을 선택적으로 개방 및 폐쇄함으로써 장치를 통해 세포를 이동시킴으로써 주요 용기를 세포 처리에 사용할 수 있다. 상이한 구획 또는 영역을 선택적으로 개방 또는 폐쇄하는 작용은 실행되는 공정에 따라 요구되는대로 부피 및 가용 표면적을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 구획 또는 영역을 개방하는 작용은 배양액중 세포가 용기의 강 내에서 한 챔버로부터 다른 챔버로 이동하도록 하거나 또는 배양액중 세포가 혼합되도록 할 수 있다(예를 들어, 원심분리 후). 세포는 구획의 상태(즉, 개방 또는 폐쇄)에 따라 어느 방향으로든 이동할 수 있다. 마찬가지로, 구획 또는 영역을 폐쇄하는 작용은 세포의 이동 및/또는 혼합을 야기할 수 있다. 주요 용기를 완전히 압축시키고 배양액중 세포를 용기로부터 방출시킬 수 있다. 세포 또는 액체 공급원에 부착되거나 인접할 때 주요 용기를 폐쇄 배열로부터 개방시키면 액체 또는 세포가 용기의 강 내로 빨려들어가게 할 수 있으며, 이 경우 용기는 캐뉼러를 통해 이러한 물질 또는 액체를 수용하도록 적합하게 변형된다.
이 이전에 기재된 배열이 본 발명의 용기(주요 용기, 보조 용기 또는 생물 반응기 같은 추가 용기)에 적용될 수 있음을 알게 될 것이다.
본 출원인의 이전 출원(PCT/GB2016/051451 호)는 또한 주요 용기 같은 용기의 벽 둘레의 적합한 위치를 가로지르는 열-밀봉 작용에 의해 용기의 벽을 어닐링하여 밀봉을 형성시킴으로써 복수개의 강을 형성할 수 있다고 기재하고 있다. 이러한 밀봉은 저장(즉, 동결 보존) 및/또는 수송 및/또는 폐기물 제거(소비된 배지) 및/또는 세포 선택을 위해 세포 또는 배지를 함유하는 주요 용기의 일부를 선택적으로 제거할 수 있다.
이 이전에 기재된 배열이 본 발명의 용기(주요 용기, 보조 용기 또는 생물 반응기 같은 추가 용기)에 적용될 수 있음을 알게 될 것이다. 그러나, 본 발명은 주요 용기 같은 용기의 압축 및 하나 이상의 적합하게 구성된 보조 용기(들) 내로의 관심 분획의 후속 방출에 의해 수행될 수 있는 선택적인 제거를 제공한다. 이어, 하나 이상의 적합하게 구성된 보조 용기(들)를 탈착시킬 수 있다. 임의적으로는, 추가적인 생성물을 수집하기 위하여 하나 이상의 추가적인 보조 용기를 후속 부착할 수 있다.
본 출원인의 이전 출원(PCT/GB2016/051451 호)은 또한 주요 용기 같은 용기가 기부 구역 및 상부 구역의 방향에 수직인 주요 용기의 축을 따라 주요 용기의 강 내에 배치되는 복수개의 챔버를 포함할 수 있다고 기재하고 있다. 복수개의 챔버는 상이한 폭을 가질 수 있다. 즉, 챔버는 균일한 크기이거나 균일하지 않은 크기일 수 있다. 챔버는 각각 독립적으로 유체 연통될 수 있거나, 또는 다르게는 챔버는 각각 독립적으로 재밀봉가능하게 유체 연통될 수 있다. 따라서, 하나 이상의 챔버는 하나 이상의 다른 챔버로부터 선택적으로 단리될 수 있다. 단일 장치 내에 상이한 부피의 챔버를 가짐으로써, 특정 세포 또는 시약 밀도를 요구하는 광범위한 작동을 실행할 수 있다. 예를 들어, 형질감염 및 전기천공은 둘 다 작은 부피에서 높은 밀도의 세포를 필요로 하고; 접종은 큰 부피에서 낮은 밀도의 세포를 필요로 한다. 마찬가지로, 효율적으로 작동하는 특정 농도로 있을 필요가 있는 값비싼 시약의 경우, 더 높은 세포 밀도를 갖는 더 작은 부피의 챔버가 더욱 비용 효율적이다. 이러한 실시양태에서, 세포 개체군을 주요 용기의 상부 구역을 통해 도입할 수 있고 제 1 챔버에서 처리한 다음 제 1 챔버를 선택적으로 폐쇄하고 제 1 챔버의 폐쇄와 동시에 인접한 제 2 챔버를 선택적으로 개방함으로써 후속 처리를 위해 세포를 제 2 챔버 내로 이동시킬 수 있다. 예를 들어, 제 1 챔버를 이용하여 세포를 형질감염시킬 수 있는데, 이 때 제 1 챔버는 비교적 작은 가용 부피를 갖고, 제 2 챔버는 형질감염된 세포의 배양 및 증식을 위해 더 큰 가용 부피를 가질 수 있음으로써, 필요한 경우 추가적인 배지를 공급할 수 있다. 따라서, 채택되는 처리 방법에 따라 필요한만큼 더 많은 챔버를 형성시킬 수 있으며, 이 때 용기의 전체 치수는 그에 따라 선택될 수 있다.
이 배열이 본 발명의 용기(주요 용기, 보조 용기 또는 생물 반응기 같은 추가 용기)에 적용될 수 있음을 알게 될 것이다. 다르게는, 도면을 참조하여 본원에 더욱 상세하게 기재되는 바와 같이, 하나 이상의 보조 용기는 파형 관에 의해 주요 용기 또는 생물 반응기 같은 추가 용기와 유체 연통될 수 있다. 관은 용기가 확장되는 것과 동일한 방향으로 압축될 수 있어서, 그 용기의 압축 또는 접힘을 방해하지 않을 수 있다. 관은 보조 용기와 유체 연통될 수 있는 단부로부터 먼 단부에 포트를 가질 수 있으며, 따라서 보조 용기의 내용물이 주요 용기 또는 추가 용기 내의 정확한 위치 내로 방출되도록 할 수 있다. 추가로 또는 다르게는, 이 배열은 주요 용기 또는 추가 용기의 내용물이 주요 용기 또는 추가 용기 내의 정확한 위치로부터 보조 용기 내로 방출되도록 할 수 있다. 관에서의 포트의 위치가 내용물의 전달이 일어나는 주요 용기 또는 추가 용기 내의 위치를 결정하게 됨을 알게 될 것이다.
본 발명의 용기는 전체적으로 동일한 가요성 물질로 구성될 수 있다. 그러나, 상부 구역 및/또는 기부 구역은 벽 요소의 물질와 상이한 물질로 구성될 수 있다. 상부 구역 및 기부 구역에서 사용되는 물질은 벽 요소에서 사용되는 물질보다 덜 가요성일 수 있는데, 이는 사용시 압축되거나 또는 확장될 필요가 없기 때문이다. 물질은 강성 물질이어서, 이러한 구역이 더 높은 구조적 강도(structural rigidity)를 가질 수 있다. 상부 구역은 기부 구역과 상이한 물질로 구성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 용기의 기부 구역은 아래에서 정의되는 바와 같이 기체 투과성일 수 있다. 이는 주요 용기 및 생물 반응기 같은 추가 용기의 경우에 특히 고려된다. 다르게는, 본 발명의 용기의 모든 부분은 동일한 가요성 물질로 구성될 수 있다.
금속이 용기 내에서 전기천공 효과를 생성시키기 위해 요구되는 경우, 본 발명의 용기의 상부 구역 및/또는 기부 구역은 적어도 부분적으로 스테인레스 강 등과 같은 금속으로 구성될 수 있다. 다르게는, 세포 배양, 처리 및 저장(예를 들면, 동결 보존)에서 사용하기 위해 일반적으로 적절한 임의의 플라스틱 물질, 예를 들면 폴리에틸렌(고밀도 폴리에틸렌 또는 저밀도 폴리에틸렌, HDPE 또는 LDPE), 폴리비닐클로라이드(PVC), 폴리프로필렌(PP), 내충격성 폴리스티렌(high impact polystyrene)을 포함한 폴리스티렌(PS), 폴리아미드(PA), 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌(ABS), 폴리카보네이트(PC), 폴리카보네이트/아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌(PC/ABS) 등을 사용할 수 있다.
가요성 물질은 기체 투과성 물질일 수 있고, 본 발명의 용기(예컨대, 주요 용기 또는 생물 반응기 같은 추가 용기)의 기부 구역이 이러한 물질로 구성될 수 있는 것으로 고려된다. 가요성 물질은 플라스틱 물질일 수 있다. 가요성 물질은 폴리에틸렌(임의적으로는, 저밀도 폴리에틸렌(LDPE)), 시스-1,4-폴리부타디엔, 폴리(에틸 메타크릴레이트) 같은 메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트) 같은 프탈레이트, 폴리(비닐리덴 클로라이드), 셀룰로즈 아세테이트 부티레이트 같은 셀룰로즈 아세테이트, 실리콘, 플루오로에틸렌폴리프로필렌, 폴리올레핀, 또는 에틸렌 비닐 아세테이트 공중합체일 수 있다.
본 발명의 용기는 세포 요법, 유전자 요법 벡터 생산 및/또는 엑소좀(exosome) 생산에서의 용기의 사용을 포함한 세포 배양 및 세포의 처리를 위해 적합할 수 있다. 본 발명의 용기는 사용 전에 적절히 멸균될 수 있다(예를 들면, 감마선 조사 또는 기타 수단에 의해). 임의적으로, 장치의 내표면은 배양액중 세포에 작용할 수 있고/있거나 분화를 유도할 수 있는 생물학적 활성제로 코팅되거나 또는 이들을 포함할 수 있다.
본 발명의 용기는 예를 들어 그의 기부 구역에 본원에 정의된 바와 같이 유출구를 포함할 수 있고, 각 유출구 및 임의의 유입구는 커넥터(connector)로의 연결, 본 발명의 하나 이상의 추가 용기(들)로의 연결을 위해 개조되거나 또는 조정가능한 또는 제거가능한 폐쇄 수단, 또는 제거가능한 미세다공성 필터가 장착될 수 있다. 본 발명의 용기의 기부 구역은 수집 영역을 포함할 수 있다. 본 발명의 용기의 기부 구역은 실질적으로 평탄하거나(수평) 또는 기부 영역은 단면이 각을 갖도록(angular) 구성될 수 있고, 예를 들면 기부 구역은 장치에서 침강을 통해 세포를 수집하는 수집 영역을 가질 수 있다.
본 발명의 용기가 복수개의 본원에 정의된 측면 강성 구역을 갖는 경우, 2 내지 3, 2 내지 4, 2 내지 5, 2 내지 6, 2 내지 7, 2 내지 8, 2 내지 9, 또는 2 내지 10개의 구역 또는 그 이상이 있을 수 있다. 측면 강성 구역의 수는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상일 수 있다. 일부 실시양태에서, 측면 강성 구역의 수는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100, 또는 그 이상일 수 있다. 그러한 실시양태에서 측면 강성 구역의 최소 수는 2이고, 상부 구역은 하나의 측면 강성 구역을 포함하고, 기부 구역은 하나의 측면 강성 구역을 갖고, 그 사이에 하나의 변형가능한 영역이 끼워 넣어져 있다. 측면 강성 구역은 용기의 벽에 있는 변형가능한 영역에 비해 물질의 강화된 구역, 예를 들면 와이어 프레임(wire frame)으로 구성될 수 있다.
본 발명의 용기는 원형, 정사각형, 직사각형, 타원형, 또는 삼각형 단면을 가질 수 있다. 다르게는, 본 발명의 용기는 예를 들어 가변성(증가 및/또는 감소하는) 직경을 갖는 일련의 원형 단면 같은 다양한 단면의 다수개의 상이한 구역 또는 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 용기는 구획간 또는 구역/챔버간 액체 흐름을 허용하면서, 상기 용기의 강 내에서 개별적인 구획 또는 구역/챔버 간에 부분적인 폐색을 허용하도록 개조될 수 있다. 예를 들면, 용기의 강은 복수개의 연결된 챔버를 포함할 수 있고, 각 챔버는 측면 강성 구역의 쌍으로부터 형성된 일련의 구획으로 구성될 수 있다. 복수개의 연결된 챔버에는 또한 상기 복수개의 연결된 챔버의 양 말단에 해제가능한 폐쇄 수단이 제공될 수 있다. 폐쇄 수단은 클램프(clamp)일 수 있다. 다른 실시양태에서, 챔버는 가열 밀봉기(heat sealer)를 이용하여 영구적으로 밀봉될 수 있거나, 또는 유사하게 원하는 위치에서 벽 요소의 용접을 유발하여 개별적인 챔버(구역)가 용기로부터 제거될 수 있게 한다.
본 발명의 용기에, 강을 측면 강성 구역의 쌍으로부터 형성된 복수개의 구획으로 분할하기 위해 변형가능한 영역에서 강 내에 위치한 막 또는 필터가 제공될 수 있다. 막 또는 필터는 하나 이상의 구멍에 의해 천공될 수 있다. 막 또는 필터는 강의 가용 표면 단면적의 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 또는 100%까지 강을 반-분할(semi-partition)할 수 있다. 막은 벽 요소와 인접하지 않고(즉, 막은 강을 완전히 분리하지 않음), 따라서 내강 내에 배열된 일련의 배플(baffle)을 형성할 수 있다. 예를 들면, 배플 요소는 하나씩 거른(alternate) 측면 강성 구역 또는 각각의 측면 강성 구역에 배열될 수 있다. 막 또는 필터의 물질은 벽 요소를 형성하는 물질과 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 막은 셀룰로즈, 예를 들면 니트로셀룰로즈 막일 수 있다. 필터는 미세다공성 필터일 수 있다. 막 또는 필터는 해제가능할 수 있다.
본 발명의 용기는 챔버의 강 내에 동심 배열된 복수개의 내부 벽 요소를 가질 수 있다. 이 실시양태에서는, 용기에 또한 감소되는 단면적을 가지나, 내강을 절대적으로 분할하지는 않는, 일련의 동심 내표면이 제공될 수 있다. 그러한 실시양태에서, 용기는 감소되는 단면적을 갖는, 동심 배열된, 일련의 포개진(nested) 벽 요소를 포함한다. 그러나, 배양액중 세포가 모든 가용 표면에 부착될 수 있도록 용기의 내강 주위 및 전체를 통한 액체 흐름이 가능하다. 배열은 반드시 원형일 필요는 없으며, 기타 규칙적인 기하학적 형태가 가능하다. 유일한 요건은 각각의 더 작은 포개진 표면이 용기의 벽 요소까지 선행하는 더 큰 포개진 표면 내에 맞춰져야 한다는 것이다.
각각의 측면 강성 구역은 변형가능한 영역과 동일하거나 상이한 단면적을 가질 수 있다. 이러한 방식으로, 용기는 증가되거나 감소하는 부피 및 표면적을 갖는 일련의 상호연결된 챔버로 구성될 수 있다.
본 발명의 용기의 기부 구역은 실질적으로 편평한 수평 기부 영역을 갖는, 원추대(frusto-conical) 형태일 수 있다. 기부 구역은 본원에 기재된 세포의 개체로의 투여 방법에서와 같이, 용기로부터의 세포의 방출을 위한 전달 메카니즘과 맞물리도록 구성될 수 있다. 따라서, 유출구가 기부 구역에 제공되어 그러한 방출이나 투여를 가능하게 할 수 있다. 유출구가 존재하는 경우, 이는 루어 잠금 커넥터("Luer-Lok™")에 의해 캐뉼라를 수용하도록 적절하게 개조된다. 유출구는 조정가능한 및/또는 제거가능한 폐쇄 수단에 의해 밀봉가능할 수 있다.
본 발명의 용기의 상부 구역은 원추대 형태일 수 있다. 상부 구역의 유입구는 예컨대 루어 잠금 커넥터에 의해 캐뉼라를 수용하도록 적절하게 개조된다. 상부의 유입구는 조정가능한 및/또는 제거가능한 폐쇄 수단에 의해 밀봉가능할 수 있거나, 또는 유입구에 제거가능한 미세다공성 필터가 제공될 수 있다. 상부 구역은 실질적으로 편평(수평)하거나 또는 단면이 각지도록 구성될 수 있다.
임의의 유입구와 유출구는 필요한 경우 반대 방식으로 독립적으로 기능할 수 있다. 캐뉼라에 대한 언급은 세포 또는 유체의 개체로의 전달에 사용되거나, 또는 개체로부터 생물학적 물질 또는 액체의 샘플를 수득하는데 사용되는 임의의 종류의 바늘을 포함한다. 존재하는 경우, 캐뉼라는 용기의 내강과 유체 연통될 수 있다.
본 발명의 이 양태는 배양액중 세포와 세포 배지를 포함하는 본 발명의 용기까지 확장된다. 세포를 포함하는 용기는 동결될 수 있다.
본 발명의 이 양태에서, 세포는 본 발명의 주요 용기에서 및/또는 생물 반응기 같은 하나 이상의 추가 용기에서 배양될 수 있다. 세포는 현탁 배양액에 존재하거나 또는 기판에 부착될 수 있다. 기판은 용기의 강에서 하나 이상의 내표면에 제거가능하게 부착될 수 있거나, 또는 미세입자에 제거가능하게 부착될 수 있다. 세포는 혼합 또는 원심분리된 후, 본원에 상세하게 기재되는 바와 같이 신선한 배지를 전달하고 임의의 폐기 배지를 보유하기 위한 본원에 정의된 보조 용기를 사용하여 신선한 배지에 재현탁될 수 있다. 접을 수 있는 용기(또는 그의 일부)의 가요성 물질은 기체, 예를 들면 산소를 세포에 공급할 수 있도록 기체 투과성일 수 있다.
주어진 배양의 규모를 증가시키기 위해, 주요 용기는 주요 용기가 완전히 또는 부분적으로 접힌 폐쇄 또는 반-폐쇄 배열로부터 주요 용기가 펼쳐진 개방 또는 반-개방 배열로 확장될 수 있다. 다르게는, 본 발명의 장치는 각각 연속적으로 증가되는 부피를 가질 수 있는 생물 반응기 같은 하나 이상의 접힐 수 있는 추가 용기를 추가로 포함할 수 있다. 광학 밀도 같은 특정 밀도에 도달할 때 세포 배양액을 하나의 용기에서 다음 용기로 옮길 수 있다.
알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 장치는 다양한 배향 및 배열을 가질 수 있다. 이는 본원에 기재된 세포의 다-단계 처리 및 세포 배양의 규모 증가에 적합하다. 용기는 단일 (주요) 용기 또는 주요 용기 및 상이한 가공 단계를 적합하게는 연속적으로 수행할 수 있는 하나 이상의 추가 용기를 포함할 수 있다. 본 발명이 주요 용기와 유체 연통되는 하나 이상의 보조 용기를 제공함을 알게 될 것이다. 하나 이상의 보조 용기는 시약이 주요 용기 내의 특정 챔버에 및/또는 추가 용기 내의 특정 챔버에 전달되도록 할 수 있다. 하나 이상의 보조 용기는 생성물/폐기물 등이 주요 용기의 특정 챔버로부터 및/또는 추가 용기 내의 특정 챔버로부터 수집되도록 할 수 있다. 하나 이상의 보조 용기가 주요 용기로부터 탈착될 수 있기 때문에, 이는 연속적인 세포 배양 공정이 진행되도록 하면서 주요 용기로부터 생성물을 수집하거나 또는 주요 용기 내의 조건을 유지하는 용이한 방법을 제공하는 것으로 이해된다.
마찬가지로, 하나 이상의 보조 용기가 예컨대 온도, pH 등에 대해 개별적으로 조절될 수 있기 때문에, 이는 요구되는 정확한 조건하에서 내용물을 전달 또는 수집하도록 하는 것으로 이해된다. 따라서, 하나 이상의 보조 용기는 주요 용기를 오염시키거나 또는 주요 용기 내의 조건에 달리 부정적으로 영향을 끼치지 않으면서 주요 용기 및 생물 반응기 같은 임의의 추가 용기 내에서의 조건과는 매우 상이한 조건을 위해 구성될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 주요 용기 내에서 및/또는 본원에 정의된 바와 같은 생물 반응기 같은 추가 용기 내에서 세포를 배양하는 방법을 또한 제공한다.
본 방법은 세포를 세척, 분리 및/또는 동결 보존하는 하나 이상의 단계를 추가로 포함할 수 있는데, 시약(예컨대, 완충제, 세척 매질, 추가 배지, 선택 배지, 플라스미드, 라벨, 항체 등)은 본 발명의 주요 용기와 유체 연통되는 하나 이상의 보조 용기로부터 전달되고, 임의의 폐기물 또는 배양 생성물(예를 들어, 세포, 단백질, 효소, 항체 등)은 본 발명의 주요 용기와 유체 연통되는 하나 이상의 보조 용기 내로 수집된다. 단계는 임의의 적절한 순서대로 이루어질 수 있고 원하는대로 반복될 수 있다. 일부 단계는 주요 용기와 유체 연통되는 하나 이상의 보조 용기 내에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 더 작은 부피의 액체 중에서 몇몇 단계(예컨대, 세포의 형질감염)를 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 방법은 형질감염을 위해 배지를 주요 용기로부터 하나 이상의 보조 용기로 전달하는 단계 후, 형질감염된 세포를 다시 주요 용기 내의 세포 배지로 전달하는 단계를 포함할 수 있다. 이들 단계는 생물 반응기 같은 하나 이상의 추가 용기 내에서 이루어질 수 있고, 본 발명의 하나 이상의 보조 용기는 주요 용기에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 유체를 추가 용기로 또는 추가 용기로부터 전달 또는 수집하는 것으로 이해된다.
본 방법은 본 발명의 용기를 원심분리하여 세포의 펠렛을 형성함을 추가로 포함할 수 있으며, 본원에 기재된 바와 같이, 예컨대 용기를 임의적으로는 상향으로 접고(개방 콘서티나를 폐쇄하는 방식으로 용기를 접고), 상청액을 하나 이상의 보조 용기 내로 방출한 다음, 적합하게는 하나 이상의 추가적인 보조 용기로부터 전달되는 추가적인 배지 또는 다른 적합한 매질(예컨대, 세척 완충액)로 폐쇄 콘서티나의 개방 방식으로 용기를 재개방함에 의해 세포 펠렛을 재현탁시킴으로써, 상청액을 옮길 수 있다. 접힐 수 있는 용기 내의 세포 배양액을 임의적인 활성화 단계 또는 가공 및 개체로의 후속 투여를 비롯하여 수송 또는 저장을 위해, 또는 추가 배양을 위해 동결(예컨대, 동결 보존)시킬 수 있다. 개체로의 투여는 정맥내 투여를 위해 구성될 수 있는(예를 들어, 점적 장치의 일부로서) 본원에 기재된 백으로부터일 수 있다.
세포의 배양은 프로모터와 같은 유전자 발현과 관련된 수반되는 조절 및 제어 요소들과 함께 목적 단백질 또는 RNA 서열을 코딩할 수 있는, 임의적으로는 벡터에 포함된 핵산 서열의 형태일 수 있는 이종기원 핵산(유전 물질)을 세포 내로 도입하기 위하여 세포의 형질감염 단계를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 세포를 형질감염시키는 단계는 소량의 액체에서 적절하게 일어날 수 있고, 따라서 방법은 본원에 기재된 바와 같이 주요 용기와 또는 생물 반응기 같은 추가 용기와 유체 연통되는 보조 용기에서 형질 감염을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 용기가 본원에 기재되는 바와 같이 용기의 강 내에 다수의 개별적인 별개의 챔버를 포함하는 경우, 형질감염 단계는 세포의 형질감염을 촉진하기 위해 감소된 부피의 액체를 수용하도록 배열될 수 있는 챔버의 정해진 영역에서 일어날 수 있다.
상이한 처리 단계가, 주요 용기와 유체 연통되거나 또는 생물 반응기 같은 추가 용기와 유체 연통되는 상이한 보조 용기에서 일어나도록 배열될 수 있다.
원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포, 적절하게는 동물 세포, 예를 들면 포유동물 세포를 배양하기 위해 본 발명의 장치가 이용될 수 있다. 세포는 인간 또는 비-인간 세포일 수 있다. 적절한 비-인간 세포의 공급원의 예는 마우스, 래트 및 기니어 피그와 같은 설치류, 양, 염소, 돼지, 소 및/또는 말 종으로부터 선택된 유제류 동물, 또는 인간이 아닌 영장류 종을 포함한다. 그러나, 세포는 세균, 효모, 진균 또는 식물 세포일 수 있다.
세포는 체세포 및 비-체세포를 비롯한 임의의 유형일 수 있다. 세포는 배아, 태아 또는 성체 동물의 임의의 발생 단계로부터 유래되는 줄기세포일 수 있다. 세포는 유전적으로 변형된 세포, 예를 들면 키메라 항원 수용체 T-세포(CART)일 수 있다. 세포는 기탁된 세포주, 예를 들면 재조합 단백질을 생성시키기 위한 유전적으로 변형된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포로부터 유래될 수 있다.
예를 들면, 비-인간 기원의 세포를 포함한 배아 줄기(ES) 세포. 세포는 ES 세포주와 같은 기탁된 세포주로부터 유래될 수 있다. ES 세포는 WO 2003/046141 호에 기재되어 있는 바와 같이 단성 생식 활성화 같은 사람의 수정란 파괴를 필요로 하지 않는 수단으로부터 유래될 수 있다. 세포는 배양액에서 증식하고/하거나 단일클론 항체를 생산하도록 유발될 수 있는 암 또는 하이브리도마 세포일 수 있다. 세포는 또한 체세포의 핵이 탈핵 난모세포(enucleated oocyte) 내로 배치되는 체세포 핵 치환(SCNT)의 결과로부터 유래될 수 있다.
세포는 다능성 줄기세포, 예를 들면 영장류 다능성 줄기(pPS) 세포, 예를 들면 인간 배아 줄기(hES) 세포일 수 있다. 세포가 줄기세포인 경우, 공급원은 중간엽 줄기세포(탯줄 유래 줄기세포 포함), 신경 줄기세포, 또는 조혈 줄기세포를 포함한, 신체의 임의의 조직으로부터 유래된 것일 수 있다. 또한 유도 다능성 줄기(iPS) 세포도 포함된다.
따라서, 본 발명은 또한 본원에 정의되는 바와 같이 세포를 본 발명의 용기로부터 개체에게 투여함을 포함하는, 개체에서 의학적 또는 수의학적 상태를 치료하는 방법도 제공한다.
의학적 상태 또는 수의학적 상태의 치료 방법은 그를 필요로 하는 개체에게 유전적으로 변형된 세포를 포함한 세포를 투여함에 의한 세포 요법을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 의학적 상태 또는 수의학적 상태의 치료 방법은 그를 필요로 하는 개체에게, 엑소좀, 조건화 배지(conditioned media), 단일클론 항체 및 재조합 단백질을 비롯하여 세포에 의해 생산된 생성물을 포함할 수 있다.
미용 처치는 개체에게 세포의 투여에 의한 미용(심미적) 강화를 제공하는 처치의 비-치유(non-therapeutic) 방법을 포함할 수 있다.
세포는 임의적으로 용기중 세포의 세척 및 재현탁을 포함하여, 투여 전에, 본 발명에 따른 장치에서 배양될 수 있다.
본 발명의 장치는 임의적으로 본 발명의 용기 중 세포의 동결 보존 집단을 포함할 수 있고, 이들은 뒤이어 투여 전에 해동된다. 적절하게, 해동된 세포는 사용 전에 생리학적으로 허용가능한 매질에 재현탁될 수 있다. 세포는 필요한 경우, 더 세척되고, 원심분리되며, 용기 중에 다시 재현탁된다. 생리학적으로 허용가능한 매질은 개체에게 투여될 최종 제형을 위해 요구되는 임의의 일반적으로 허용가능한 완충액, 보조제 및/희석제일 수 있다. 예를 들면, 상기 매질은 적절히 pH 7.4인 인산염 완충 염수(PBS)일 수 있다.
세포는 주사의 형태로 용기로부터, 더욱 바람직하게는 본 발명의 보조 용기로부터 투여될 수 있다. 용기 또는 적합하게 구성된 보조 용기에 예를 들어 루어 잠금 커넷터에 의해 세포의 투여를 위한 캐뉼라가 제공될 수 있다. 용기에 또는 적합하게 구성된 보조 용기에 세포의 전달을 위한 작동기 수단이 제공될 수 있다. 작동기 수단은 레버 또는 주사기 장치의 작용에서와 같이 기능할 수 있는 본 발명의 용기를 압축하기 위한 힘을 제공하는 임의의 수단을 포함할 수 있다. 작동기는 수동으로 작동되거나 또는 외래 전기 제어 시스템에 의해 제어될 수 있다. 따라서, 작동기 수단은 캐뉼라를 통해 용기로부터 개체로의 세포의 방출을 유발하도록 용기, 또는 적합한 구성된 보조 용기의 접힘을 제어하도록 작용하는 소형화 기계장치로서 작용할 수 있다.
세포는 또한 용기, 또는 더욱 바람직하게는 본 발명의 보조 용기로부터의 주입에 의해 투여될 수 있고, 이 때 용기 또는 적합하게 구성된 보조 용기는 최대한 확장될 수 있다. 이 실시양태에서, 세포는 적절하게 더 큰 부피의 배지에 현탁될 수 있다. 주입은 수동적으로 투여될 수 있고, 더 큰 제어가 요구되거나 필요한 경우, 외래 전기 시스템의 제어하에 작동되는 양방향 선형 작동기(예를 들면, 시린지-드라이버-유사 장치)가 제공될 수 있다.
본 발명은 또한 캐뉼라를 개체에게 삽입함을 포함하는, 개체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 방법을 제공하며, 이 때 상기 캐뉼라는 본원에 정의되는 본 발명의 용기, 예컨대 본원에 정의되는 적합하게 구성된 보조 용기 내에 배치된다. 본 발명의 용기의 기부 구역에는 캐뉼라가 제공될 수 있고, 본 발명의 용기는 가요성 물질로 구성될 수 있으며, 이 때 상기 용기는 용기를 확장시킴으로써 개체로부터 샘플을 제거하기 위한 작동기 수단에 작동가능하게 연결된다.
작동기 수단은 용기의 강 내로의 샘플의 진입을 허용하기 위해 폐쇄 또는 반-폐쇄 배열로부터 본 발명의 용기를 개방하도록 구성될 수 있다. 작동기 수단은 레버 또는 주사기 또는 기타 생검 장치의 작용에서와 같이 용기를 확장할 수 있는 힘을 제공하는 기타 수단을 포함할 수 있다. 작동기는 수동으로 작동되거나 또는 외래 전기 제어 시스템에 의해 제어될 수 있다.
상기 용기의 캐뉼라는 혈관 또는 골수강 내로 삽입될 수 있다. 용기는 이러한 방식으로 편리하게 생검될 수 있는, 혈액, 골수, 탯줄, 지방 조직, 양수 등과 같은 개체로부터의 세포, 예를 들면 줄기세포를 수득하기 위해 이용될 수 있다. 용기가 적합하게 구성된 보조 용기인 경우에는, 보조 용기가 주요 용기와 유체 연통되도록 보조 용기를 주요 용기에 부착시킴으로써, 샘플을 용기로부터 본 발명의 주요 용기 내로 전달할 수 있다.
따라서, 본 발명은 주요 용기와 유체 연통되는 하나 이상의 보조 용기 내로의 또는 주요 용기와 유체 연통되는 하나 이상의 보조 용기로부터의 목적하는 시약, 폐기물, 세포 또는 생성물의 전달/추출을 통해 주요 용기 내에서 원하는 대로 다수의 단위 공정들이 일어남으로써 오염의 위험을 피하는, 단일 용기 내에서의 세포의 처리를 제공한다. 이 시스템은 사용하기에 더 단순하고 또한 기존 방식의 복잡성을 피한다. 본 발명은 개선된 재현성 및 사용 용이성을 갖는, 세포의 보다 안전한 처리를 제공한다.
본 발명은 또한 환자로부터 세포의 추출(생검, 예를 들면, 혈액 또는 골수), 세포의 분리, 세포의 처리(사이토카인 자극 및/또는 유전적 변형 포함), 고체-액체 분리, 및 전달 장치로의 로딩을 제공하며, 이 때 세포는 전체 과정 내내 동일한 용기에서 배양될 수 있다.
이제, 예시의 목적으로만 제공되고 특허청구된 발명에 대한 한정으로 해석되어서는 안되는 하기의 실시예 및 도면을 참조하여 본 발명을 더 설명할 것이다. 또한 하기 도면에 대한 참조가 이루어진다:
도 1은 본 발명의 장치의 한 실시양태를 두 가지 별도의 배열로 도시한다. 도 1(a)는 장치의 측면으로부터의 개략도이고, 도 1(b)는 평면도이다.
도 2는 레버 또는 플런저 기계장치가 보조 용기로부터 주요 용기 내로 배지를 방출하는 방식을 보여주는 도 1의 실시양태의 도면이다. 도 2(a)는 보조 용기를 압축할 준비가 된 레버 또는 플런저를 도시하고, 도 2(b)는 완전히 폐쇄된 형태(완전히 접힘)의 보조 용기를 도시한다.
도 3은 레버 또는 플런저를 갖는 밸브 작동 암(valve operator arm)이 암 자체의 이동을 통해 또는 주요 용기의 회전을 통해 하나의 보조 용기로부터 다음 용기로 이동할 수 있는 방법을 도시하는, 도 1의 실시양태의 도면이다.
도 4는 생물 반응기 같은 하나 이상의 추가 용기와 조합된 주요 용기를 갖는 본 발명의 장치를 도시한다.
도 5는 일부 보조 용기가 주요 용기와 직접 유체 연통되고 추가적인 보조 용기가 추가 용기와 직접 유체 연통되는, 도 4와는 상이한 본 발명의 장치의 배열을 도시한다.
도 6은 하나 이상의 보조 용기가 본 발명의 용기의 상부 외의 다른 지점에서 연결되는 방법을 도시한다. 본 발명의 용기의 기부에서의 또는 기부를 향한 이러한 연결은 예를 들어 샘플 채취(품질 분석 또는 품질 제어 목적을 위해)를 위해 또는 세포 배양액의 최종 생성물을 수집하기 위해 이용된다.
도 7은 본 발명의 용기를 가로질러 온도 제어가 변화될 수 있는 방식을 도시한다. 도 7(a)는 본 발명의 주요 용기가 보조 용기와 동일한 온도로 유지되는 실시양태를 도시하고; 도 7(b)는 보조 용기가 서로 또한 주요 용기와 상이한 온도로 유지될 수 있음을 도시한다.
도 8은 세포가 본 발명의 주요 용기 또는 추가 용기(예컨대, 생물 반응기) 내에서 배양될 수 있는 다양한 옵션을 도시한다. 도 8(a)는 세포가 용기의 기부에 존재하는(가능하게는 원심분리 후) 실시양태를 도시하고; 도 8(b)는 세포가 용기 내의 개별 챔버의 기부에서 배양되는 실시양태를 도시하며; 도 8(c)는 세포가 회전되는 용기에 유지되는 실시양태를 도시하고; 도 8(d)는 세포가 좌우로 흔들리는 용기에 유지되는 실시양태를 도시한다.
도 9는 복수개의 보조 용기가 주요 용기와 함께 작동되는 방식을 도시한다.
도 10의 (a) 내지 (h)는 본 발명의 장치에서 세포를 배양하는 다단계 공정을 도시한다.
도 11은 본 발명의 압축가능한 용기에서의 밸브 배열을 도시한다. 도 11(a)는 용기가 완전히 폐쇄되지 않는 경우의 배열을 도시한다. 도 11(b)는 용기가 완전히 폐쇄된 경우의 배열을 도시한다. 도 11(c)는 도 11(b)의 세부 도면이다. 도 11(d)는 본원에 기재된 밸브 배열의 결과 유체 연통이 변화할 수 있는 방식을 도시하는 개략도이다.
도 12는 본 발명의 용기가 용기의 나머지 부분과는 상이한 물질로 구성되는 제거가능한 기부를 가질 수 있는 배열을 도시한다.
도 13은 본 발명의 용기 내에서의 센서 옵션의 예를 도시한다.
도 14는 세포와 액체를 분리하는 옵션을 도시한다. 도 14(a)는 세포가 펠렛화되어 용기의 기부 상에 안착한 버킷 원심분리 구성을 도시한다. 도 14(b)는 세포가 용기의 벽에 부착되는 상이한 원심분리의 결과를 도시한다. 도 14(c)는 개방된 상태의 본 발명의 접힐 수 있는 용기를 도시한다. 도 14(d)는 부분적으로 접힌 상태의 본 발명의 접힐 수 있는 용기를 도시한다.
도 15는 구성요소가 용기 내의 특정 위치에서 제거되거나 추가될 수 있는 장치의 구성을 도시한다. 도 15(a)는 최초 구성을 도시한다. 도 15(b) 및 도 15(c)는 세포가 회전해서 용기의 측벽에 위치하는 구성이 작동하는 방식을 도시한다. 도 15(d) 및 도 15(e)는 세포가 용기의 기부로 원심분리되는 구성이 작동하는 방식을 도시한다.
도 16은 자기 비드를 사용하여 정제하기 위한 장치의 구성을 도시한다. 도 16(a)는 최초 설정을 도시하는데, 자석은 스위치가 꺼지고 자기 비드는 보조 용기에 보유된다. 도 16(b)는 비드가 보조 용기로부터 세포를 보유하는 용기 내로 전달되는 도 16(a)의 구성을 도시한다. 도 16(c)는 자석이 스위치가 켜진 후의 구성을 도시한다. 도 16(d)는 세포를 보유하는 용기가 비워지고 결합되지 않은 세포가 추가의 보조 용기로 전달된 후의 도 16(c)의 구성을 도시한다. 도 16(e)는 세포를 보유하는 용기가 해리 완충액으로 재충전될 때의 도 16(d)의 구성을 도시한다. 도 16(f)는 세포가 세척 완충액에 재현탁되는 도 16(e)의 구성을 도시한다. 도 16(g)는 추가의 보조 용기에서의 표적 세포의 수집을 도시한다.
도 17은 본 발명의 용기 내에서 세척되는 동안 세포가 음파 기법으로 제 자리에 보유되는 구성을 도시한다.
도 18은 추가 처리에 사용하기 위하여 본 발명의 보조 용기 내에 혈액을 수집하는 방법을 도시한다.
도 19는 수집된 혈액을 처리하기 위한 본 발명의 장치의 한 가지 구성을 도시한다. 도 19(a)는 처리하기 위하여 혈액을 보조 용기로부터 주요 용기 내로 전달함을 도시한다. 도 19(b)는 혈액을 주요 용기의 회전을 통해 수직 분획으로 분리함을 도시한다. 도 19(c)는 주요 용기의 압축에 의해 혈장 분획을 보조 용기 내로 제거 및 수집함을 도시한다. 도 19(d)는 주요 용기의 압축에 의해 줄기세포 분획을 추가의 보조 용기 내로 제거 및 수집함을 도시한다. 도 19(e)는 최종 생성물: 각각 별도의 분획을 갖는 3개의 별도의 용기를 도시한다.
도 20은 도 19에 도시된 방법의 변형을 도시한다. 도 20(a)는 처리하기 위해 혈액을 보조 용기로부터 주요 용기 내로 전달함을 도시한다. 도 20(b)는 주요 용기의 원심분리를 통한 혈액의 수평 분획으로의 분리를 도시한다. 도 20(c)는 주요 용기의 압축에 의한 혈장 분획의 보조 용기 내로의 제거 및 수집을 도시한다. 도 20(d)는 주요 용기의 압축에 의한 줄기세포 분획의 추가의 보조 용기 내로의 제거 및 수집을 도시한다. 도 20(e)는 최종 생성물: 각각 별도의 분획을 갖는 3개의 별도의 용기를 도시한다.
도 21은 단일 원추형 삽입물에 의해 일련의 용기 사이에서의 유체 연통을 제어할 수 있는 방식을 도시하는, 도 11에 도시된 밸브 배열의 다른 구성을 도시한다.
도 1은 기부 구역(12), 상부 구역(14) 및 벽 요소(8)를 포함하는 주요 용기(10)를 포함하는 본 발명의 장치의 한 실시양태를 도시한다. 벽 요소(8)는 기부 구역(12)에 평행하게 측방향으로 배열되는 강성 구역을 포함할 수 있다. 도면은 직립 형태의 용기를 도시한다.
중간 강성 구역의 각 인접 쌍에는 변형가능한 영역이 끼어질 수 있다. 용기의 수직 대칭축에 수직인 하향 압축력이 작용하면 용기가 부분적으로 폐쇄된 배열로, 이어 완전히 폐쇄된 배열로 접혀지게 된다.
주요 용기(10)는 제거가능한 폐쇄 수단 및 일시적인 밀봉부로서 기능할 수 있는 하나 이상의 유입구(도시되지 않음)를 갖는다. 각 유입구에는 주요 용기(10)와 유체 연통되는 보조 용기(16)가 연결될 수 있다. 도 1(a)에서, 보조 용기는 모두가 평행하게 연결되도록, 즉 각각이 주요 용기(10)와는 직접 유체 연통되지만 다른 보조 용기(16)와는 직접 유체 연통되지 않도록 배열된다. 각각의 보조 용기(16)는 상이한 형태(16a 내지 16e)를 가질 수 있다. 예를 들어, 하나의 보조 용기(16a)는 성장 인자를 함유하도록 구성될 수 있고, 다른 보조 용기(16b)는 재프로그래밍 벡터를 함유하도록 구성될 수 있으며, 다른 보조 용기(16c)는 세척 완충액을 함유하도록 구성될 수 있고, 다른 용기(16d)는 배지를 함유하도록 구성될 수 있는 한편, 다른 보조 용기(16e)는 폐기물 용기로서 구성될 수 있다. 따라서, 이 실시양태에서, 다양한 보조 용기(16)는 상이한 형태이고, 상이한 크기 및 부피를 가질 수 있다. 보조 용기(16)는 주요 용기(10)보다 더 작은 크기 및 부피를 가질 수 있으나, 임의의 폐기물 보조 용기(들)는 주요 용기보다 더 큰 부피를 가질 수도 있다
이 배열의 도 1(b)에 도시된 바와 같이, 보조 용기는 주요 용기(10)의 상부 구역(14)을 통해 연결된다. 주요 용기는 원형 단면을 갖는다. 이 원형 단면은 필수적이지 않으나, 예컨대 회전 또는 원심분리 면에서 특정 이점을 갖는다.
도 2(a) 및 도 2(b)는 더 큰 장치(부분적으로 도시됨)의 요소와 함께 주요 용기(10)를 도시한다. 이 장치는 원심분리기 또는 다른 회전 장치(도시되지 않음)뿐만 아니라 주요 용기(10) 및 보조 용기(16)를 압축시키거나 압축 해제시켜 이들의 내용물을 전달하는 수단(20, 22)을 함유할 수 있다. 암 또는 다른 수단(도시되지 않음)이 레버 또는 플런저 형태일 수 있는 수단(20)을 움직여, 보조 용기(16a)를 압축할 수 있도록 할 수 있다. 바람직하게는, 동일한 수단(20)이 또한 보조 용기를 압축 해제시킬 수 있다. 따라서, 보조 용기(16a)의 내용물은 주요 용기(10)로 전달된다. 다르게는, 주요 용기(10)는 원심분리기 또는 다른 회전 수단(도시되지 않음) 상에서 회전하여, 수단(20)이 보조 용기(16a) 위에 위치하도록 할 수 있다. 장치(도시되지 않음)는 또한 주요 용기(10)를 압축 또는 압축 해제할 수 있는 수단(22)도 함유한다. 일부 형태에서, 보조 용기(16)를 압축 또는 압축 해제할 수 있는 수단(20) 및 주요 용기(10)를 압축 또는 압축 해제할 수 있는 수단(22)은 동일한 것이다. 예를 들어, 레버 또는 플런저는 주요 용기(10)에 대해서뿐만 아니라 보조 용기(16)에 대해서도 작용하도록 움직일 수 있다.
도 3은 도 2에 도시된 장치에 이용가능한 배열을 도시한다. 따라서, 세포 배양 장치는 구부러진 화살표로 표시되는 방향으로 주요 용기(10)를 회전시키도록 작용할 수 있다. 추가로 또는 다르게는, 보조 용기(16)를 압축 또는 압축 해제시키기 위한 수단(20)에 장치의 암(30)을 연결할 수 있다. 이러한 형태에서, 암(30)은 보조 용기(16) 사이에서 압축 수단(20)을 이동시키기 위하여 화살표로 표시되는 것처럼 움직일 수 있다.
도 4는 본 발명의 용기 세트를 구성할 수 있는 방식을 도시한다. 따라서, 주요 용기(10)는 평행으로 배열된 복수개의 보조 용기(16)와 직접 유체 연통된다. 주요 용기(10)는 그 자체로 생물 반응기(40) 같은 제 1 추가 용기 및 생물 반응기(42) 같은 제 2 추가 용기와 유체 연통된다. 주요 용기(10) 및 제 1 및 제 2 용기(40, 42)는 직렬로 배열됨을 알게 될 것이다.
도 5는 도 4의 변형 형태를 도시한다. 도 5에서, 주요 용기(10)는 평행으로 배열된 복수개의 보조 용기(16)와 직접 유체 연통된다. 주요 용기(10) 자체는 생물 반응기(40) 같은 추가 용기와 유체 연통된다.
도 4 및 도 5 둘 다에서, 주요 용기(10)는 소규모 처리 및 세포 배양의 최초 개시(예컨대, 유전자 변형)에 사용되며, 보조 용기(16)는 이 공정을 위한 공급물 및 폐기물로서 이용된다. 소규모 최초 처리가 종결되면, 세포는 대규모 처리(예컨대, 생육 및 배양/수획)를 위해 주요 용기(10)로부터 제 1 생물 반응기(40) 내로 전달될 수 있다.
도 5는 배지가 생물 반응기(40) 내로 전달된 후 배지의 추가 처리를 수행하기 위한 수단을 도시한다는 점에서 상이하다. 그러므로, 추가의 보조 용기(16)가 생물 반응기(40)와는 직접 유체 연통되지만 주요 용기(10)와는 직접 유체 연통되지 않도록 배열된다. 이들 추가의 보조 용기(16)는 생물 반응기(40)에서 이루어지는 대규모 공정의 공급물을 보유하거나 이 대규모 공정으로부터의 폐기물을 받아들이도록 구성된다. 따라서, 도 5는 본 발명의 장치를 이용하여 2개의 병행 공정이 수행될 수 있는 방식을 보여준다.
도 6에 도시된 바와 같이, 보조 용기(16)는 주요 용기(10) 또는 제 1 추가 용기(40) 또는 제 2 추가 용기(42)의 상부 구역(14) 상에 배치될 필요가 없다. 한 형태에서 이들은 용기(10, 40, 42)의 기부 구역(12)에 배치될 수 있다. 이는 예를 들어 임의의 원심분리된 생성물의 용이한 샘플 채취 또는 이의 수집을 허용한다. 보조 용기(16)는 두 형태 모두로, 즉 용기(10, 40, 42)의 기부 구역(12) 및 상부 구역(14)에 배치될 수 있음을 알게 될 것이다.
본원에 제공되는 본 발명의 설명으로부터, 주요 용기(10)와 유체 연통되지만 그로부터 분리될 수 있는 보조 용기(16)를 갖는 이점이, 보조 용기(16) 내의 조건이 주요 용기(10)와는 상이한 환경에서 유지될 수 있다는 것임을 알게 될 것이다. 따라서, 도 7에서는 주요 용기(10)가 보조 용기(16)와 동일한 온도에서 유지될 수 있는 반면, 도 7(b)는 보조 용기(16)가 예를 들어 절연된 슬리브(60)에 의해 상이한 온도에서 유지될 수 있는 것으로 도시하고 있다. 이 형태에서, 3개의 보조 용기(16)는 냉장 또는 동결 온도(예컨대, 각각 4℃ 내지 -20℃)에서 유지되는 반면, 2개의 보조 용기(16)는 주위 온도에서 유지되는 한편, 추가 수단(도시되지 않음)은 주요 용기(10)를 37℃ 같은 최적 세포 배양 온도에서 유지할 수 있다.
도 8로부터, 본 발명의 장치가 주요 용기(10)의 이동을 위한 다른 수단을 함유할 수 있음을 알게 될 것이다. 따라서, 주요 용기의 회전/원심분리 및/또는 흔들기가 모두 고려된다.
또한, 도 9로부터 보조 용기(16)가 상이한 방향으로 주요 용기(10)와 유체 연통될 수 있음을 알게 될 것이다. 따라서, 세포(80)를 최적 조건에서 주요 용기(10) 내에서 현탁액으로 유지하기 위하여, 배지를 제 1 보조 용기(16a)로부터 주요 용기 내로 도입할 수 있고, 폐기 배지를 제 2 보조 용기(16b) 내로 수집한다. 본원에 언급된 바와 같이, 위쪽 방향으로의 주요 용기의 압축은 폐기 배지를 보조 용기(16b) 내로 밀어낸다.
다단계 작동(예를 들어, CAR-T 세포 요법의 형질도입, 활성화, 증식 및 세척)으로 본 발명의 장치를 사용하는 예시적인 방법을, 이제 도 10을 참조하여 기재한다. 도 10(a)에서 시작하여, 세포(80)는 주요 용기(10) 내에서 현탁된다. 다수개의 보조 용기(16a 내지 16d)는 다양한 공급물 및 배지를 보유하도록 구성되는 한편; 폐기물을 보유하도록 구성된 추가의 보조 용기(16e)는 처음에 압축되고 비어 있다.
도 10(b)에서는, 예를 들어 바이러스 벡터 배지를 함유하는 제 1 보조 용기(16a)를 주요 용기(10) 내로 비워내었고, 세포(80)는 배지에 현탁되는 것을 볼 수 있다. 벡터가 배양되기에 충분한 시간을 보낸 후, 주요 용기를 원심분리하고, 세포(80)는 주요 용기(10)의 기부에 침착된다. 도 10(c)는 주요 용기를 폐기물 보조 용기(16e) 내로 비워내어 사용된 배지를 제거함을 보여준다. 도 10(d)에 도시된 바와 같이, 세포는 이어 예컨대 세포 활성화 인자를 함유하는 추가 배지에서 세척될 수 있는데, 이 추가 배지는 추가의 보조 용기(16d)로부터 주요 용기(10) 내로 도입된다. 도 10(e)에 도시된 바와 같이, 주요 용기(10)를 추가로 원심분리시킨 다음, 주요 용기(10)를 폐기물 보조 용기(16e) 내로 비워낸다. 이제 주요 용기(10)는 바이러스 벡터를 전혀 갖지 않거나 또는 최소한의 흔적량으로 가짐이 분명하다. 그 후, 도 10(f)는 추가 배지(예컨대, 증식 배지)를 추가의 보조 용기(16c)로부터 주요 용기(10) 내로 도입함을 보여준다. 세포를 충분한 시간동안 배양한 후, 주요 용기(10)를 다시 원심분리하고(도 10(g)) 그 안의 배지는 폐기물 보조 용기(16e)에 수집될 수 있다. 이어, 신선한 배지, 예를 들어 배합 완충액을 추가의 보조 용기(16d)로부터 도입할 수 있고(도 10(h)), 세포를 재현탁시킬 수 있다.
그러므로, 주요 용기(10)의 세포는 필요한만큼의 기간동안 유지될 수 있음을 알게 될 것이다. 보조 용기(16)가 탈착가능한 경우, 추가적인 배지를 갖는 새로운 보조 용기를 소비한 보조 용기 대신 연결할 수 있고/있거나 폐기물 보조 용기(16e)를 비우기 위해 탈착시키고 그 용기 또는 새로운 폐기물 보조 용기를 후속해서 재연결할 수 있다.
예컨대 도 4에 도시된 장치 내에서, 도 10에 도시된 방법을 수행할 수 있다. 달리 말해, 주요 용기(10)에서의 반응이 종결되면, 주요 용기(10)를 생물 반응기 같은 추가 용기(40) 내로 비움으로써(예컨대, 압축을 통해) 세포를 전달할 수 있다. 따라서, 사용된 주요 용기(10)를 폐쇄하여 추가 용기(40)를 오염시키지 않도록 방지하는 것이 바람직할 수 있다.
이 경우, 도 11에 도시된 밸브 배열을 사용할 수 있다. 도 11(a)는 주요 용기(10), 보조 용기(16) 또는 추가 용기(40, 42)일 수 있는 본 발명의 용기를 도시한다. 용기(10, 16, 40, 42)는 폐쇄되지 않은 상태로 도시되고, 대향하는 면에 두 개의 포트(110, 112)를 갖는다. 도 11(a)에 도시된 바와 같이, 두 포트(110, 112)는 상부 구역 및 기부 구역에 존재한다. 도 11(a)에서는 포트중 하나(110)가 용기(10, 16, 40, 42) 내로 연장되고 다른 포트(112)와 상호 작용하도록 구성되는 밸브 부재(115)를 포함함을 볼 수 있다. 상호작용은 도 11(b)에 도시되어 있는데, 용기(10, 16, 40, 42)가 완전히 압축되고, 밸브 부재(115)가 제 1 포트(110)로부터 제 2 포트(112) 내로 연장됨으로써 우회로를 형성하여 제 1 포트(110) 및 제 2 포트(112)를 통해 통과하는 임의의 유체가 용기(10, 16, 40, 42) 내로 들어가지 않도록 한다. 도 11(c)는 도 11(b)의 임의적인 세부사항을 도시하는데, 한 방향 연결을 형성하고 제 1 포트(110)와 제 2 포트(112) 사이에서 맞물리는 잠금 기계장치(이 경우에는 후크)(119)가 밸브 부재(115)에 장착된다. 이러한 방식으로, 방수 연결이 형성될 수 있다.
배열을 이용하여 두 용기(A, C) 사이에 중간 용기(B)가 존재하는 경우에도 이들 두 용기를 직접 유체 연통시킬 수 있음을 도 11(d)의 개략도로부터 볼 수 있다. 중간 용기(B)의 압축 및 앞서 기재된 바와 같은 잠금 밸브(115)의 사용은 중간 용기(B)에 들어가지 않고도 임의의 유체가 제 1 용기(A)로부터 추가 용기(C)내로 직접 통과할 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 제 1 용기(A)는 본 발명의 보조 용기일 수 있고, 중간 용기(B)는 본 발명의 주요 용기일 수 있으며, 추가 용기(C)는 생물 반응기일 수 있다. 따라서, 최초 세포 설정이 완결되고 세포가 추가 배양을 위해 생물 반응기(C) 내로 전달된 후, 생물 반응기(C)에 의해 물질(예를 들어, 신선한 배지) 또는 추출 물질(예를 들어, 수획된 세포 생성물, 소비된 배지)을 보조 용기(A) 내로 또는 보조 용기(A)로부터 직접 도입하는 것이 여전히 가능하다. 도 11(d)는 또한 도 11(a) 내지 도 11(c)에 도시된 밸브 배열(115)이 유체 유동(어느 방향으로나 가능)을 허용할 수 있음을 도시한다. 몇몇 경우에는 본원에서 더욱 상세하게 논의되는 바와 같이 유체 유동이 일방향성인 것이 바람직할 수 있음을 알게 될 것이다.
본원에서 상세하게 기재되는 바와 같이, 본 발명의 용기는 상이한 물질로 제작될 수 있다. 도 12에 도시된 바와 같이, 본 발명의 용기(10, 16, 40, 42)는 용기(10, 16, 40, 42)의 의도되는 용도에 따라 상이한 물질이 연결될 수 있도록 하는 제거하능한 기부 판(120)을 가질 수 있다. 예를 들어, 제거가능한 기부 판은 세포 배양 표면이 적합화될 수 있음을 의미한다. 따라서, 배양되는 관련 세포 유형에 대해 선택되는 세포 배양 조직 플라스틱을 세포에 부착할 수 있다. 도 12(b)에서는 기부를 제거하고 특정 물질로 제작된 새로운 기부 판(120)을 용기(10, 16, 40, 42)에 부착시킨다. 예를 들어, 도 12(c)에 도시된 생성된 용기는 박막 기체 투과성 시트 또는 막을 포함함으로써 세포에 기체를 더욱 개선되게 전달할 수 있다. 이는 침강된 현탁 세포, 예를 들어 T-세포를 배양하는데 있어서의 사용일 수 있다. 기부 판(120)은 강성 지지 스트립(125)을 가질 수 있고, 이는 기부 판(120)이 박막으로 제작되는 경우 특정 값을 가져서 기부 판(120)의 구조적 일체성을 보장할 수 있다. 기부 판(120)은 상기 도 11에 대해 기재된 바와 같이, 즉 용기(10, 16, 40, 42)의 대향하는 표면 상의 추가 포트와 상호작용하도록 구성될 수 있는 포트(128)를 가질 수 있다.
도 13에 도시된 바와 같이, 본 발명의 용기(10, 16, 40, 42)는 용기의 내용물을 모니터링하기 위해 센서를 갖도록 구성될 수 있다. 다양한 센서 옵션이 가능하며, 필요에 따라 개별적으로 또는 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 광학 프로브(120)를 연결하여 현미경에 의한 조사를 가능케 하고; 광학 밀도 프로브(121)를 연결하여 예를 들어 세포 배양액의 광학 세포 밀도를 확립할 수 있다. 산소/pH 프로브(122)를 용기(10, 16, 40, 42)의 내부 벽의 산소/pH 센서 스팟(123)에 연결할 수 있다. 센서의 사용은 잘 알려져 있고 당 업자는 당해 분야에 공지되어 있는 바와 같이 임의의 이러한 수단을 적용할 수 있음을 용이하게 알 것이다.
본원에 기재되어 있는 바와 같이, 본 발명의 장치는 세포가 생육하는 배지로부터 배양액 내의 세포를 분리해내기 위한 수단을 포함할 수 있다. 도 14는 본 발명의 용기(10, 16, 40, 42) 내의 세포 배양액(80)을 회전시킬 수 있는 두 가지 방식을 도시한다. 도 14(a)는 종래의 원심분리를 도시하고, 이 때 세포는 펠렛화되어 용기(10, 16, 40, 42)의 기부 상에 놓인다. 도 14(b)는 상이한 방법의 결과를 보여주는데, 세포는 용기(10, 16, 40, 42)의 벽을 코팅하도록 회전한다. 다른 방법에서, 도 14(c)는 필터 막(140)에 의해 본 발명의 용기(10, 16, 40, 42)가 분할될 수 있음을 보여준다. 용기(10, 16, 40, 42)의 압축 또는 접힘(또는 부분적인 접힘)은 도 14(d)에 도시된 바와 같이 세포(80)가 필터 막(140)을 통해 용기의 한쪽 부분 내에 포획되는 한편 배지가 용기의 다른 부분 내로 방출됨을 의미한다.
세포로부터 폐기 배지를 분리하는 다른 수단이 도 15에 도시된다. 이 형태에서, 본 발명의 용기(10, 16, 40, 42)에는 보조 용기(16)를 배지(155)와 연결하는 긴 파이핑(151)이 제공된다. 파이핑(151)은 용기(10, 16, 40, 42)와 동일한 방식으로 접힐 수 있다. 즉, 이는 용기(10, 16, 40, 42)의 압축 및 접힘을 방해해서는 안된다. 파이핑(151)은 용기(10, 16, 40, 42)가 압축될 때 소비된 배지(155)를 파이핑(151) 내로 밀어낼 수 있는 특정 높이에 개구(152)를 갖는다. 도 15(a)는 세포(80)가 용기(10, 16, 40, 42)의 측면 상에 침착되도록 하기 위해 세포(80)를 회전시킬 때의 배열을 도시한다. 이 실시양태에서, 개구(152)는 용기(10, 16, 40, 42)의 기부에 가까울수록 실용적이며, 용기(10, 16, 40, 42)의 압축은 배지(155)를 적합하게 구성된 보조 용기(16c) 내로 밀어올린다. 필요한 경우, 다른 보조 용기(16a, 16b)로부터 새로운 배지, 세척 완충액 등을 도임할 수 있다. 다르게는, 세포(80)가 용기(10, 16, 40, 42)의 기부 상으로 펠렛화되도록 용기(10, 16, 40, 42)를 원심분리할 수 있다. 이 형태에서, 파이핑(151)은 용기(10, 16, 40, 42)의 압축이, 세포(80)를 남겨두고 소비된 배지(155)를 적합하게 구성된 보조 용기(16c) 내로 밀어내도록, 펠렛화된 세포(80)의 수준보다 높게 위치되는 개구(152)를 갖는다.
도 15는 또한 본 발명의 용기(10, 16, 40, 42)에, 용기(10, 16, 40, 42) 내에 기체/액체 상을 확립하는데 사용될 수 있는 배기구(159)(예컨대, 산소 및/또는 이산화탄소를 제공함)가 제공될 수 있음을 보여준다. 이 배기구(159)는 도 15에 도시된 실시양태로만 한정되는 것은 아니고, 다른 도면에 도시된 다른 실시양태에도 혼입될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 장치는 세포의 정제를 돕기 위하여 자석을 포함할 수 있다. 이러한 배열은 도 16에 도시되어 있고, 장치(도시되지 않음)는 주요 용기(10) 같은 용기의 기부 판 아래에 위치되는 자석(160)을 포함한다. 도 16(a)에서, 세포(80)는 현탁되어 있고, 보조 용기(16a)는 특정 세포(예를 들어, 성공적으로 형질감염되어 관심 단백질을 발현하는 세포)에 선택적으로 결합되도록(예를 들어, 적합한 잔기와의 접합을 통해) 구성된 자기 비드를 함유한다. 이 시점에서 자석(160)은 스위치가 켜져 있지 않다. 도 16(b)는 자기 비드가 보조 용기(16b)로부터 주요 용기(10) 내로 전달된 후의 형태를 도시한다. 비드는 관심 세포와 접촉하고 관심 세포와 선택적으로 결합하지만, 예를 들어 성공적으로 형질감염되지 않은 세포에는 결합하지 않는다.
이 시점에서, 자석(160) 스위치를 켜고, 결과는 도 16(c)에 도시되어 있다. 자기 비드에 결합된 세포는 자석 쪽으로 잡아당겨지는 반면, 자기 비드에 결합되지 않은 세포(비결합 세포)는 현탁액에 잔류한다. 주요 용기(16)를 압축시키면 소비된 배지와 비결합 세포가 추가 보조 용기(16d) 내로 밀려들어간다. 세척 완충액을 함유하는 추가의 보조 용기(16b)를 이 시점에서 부분적으로 압축시켜, 세포가 부분적으로 현탁된 상태로 유지되도록 한다. 그 후, 도 16(d)에 도시된 바와 같이, 비결합 세포는 결합된 세포로부터 분리되고, 결합된 세포는 주요 용기(10)에 잔류한다. 도 16(e)에 도시된 바와 같이, 이어 해리 완충액을 함유하는 추가의 보조 용기(16c)를 압축하여, 해리 완충액을 주요 용기(10) 내로 전달한다. 해리 완충액은 결합된 세포를 자기 비드로부터 방출하고 이들 세포는 도 16(f)에 도시된 바와 같이 현탁액 내로 방출된다. 추가의 세척 완충액을 보조 용기(16b)로부터 주요 용기(10) 내로 전달한 다음, 주요 용기(10)를 압축시켜 추가의 보조 용기(16e) 내로 비움으로써, 도 16(g)에 도시된 바와 같이 관심 있는 표적 세포를 수집한다.
세포를 제 위치에 보유하여 예컨대 세척될 수 있도록 하는 다른 수단이 도 17에 도시된다. 본 발명의 용기(10, 16, 40, 42)는 음파 발생기(170)를 통해 세포(80)를 제 자리에 보유한다. 음파(171)는 필터 또는 원심분리를 필요로 하지 않으면서 세포를 용기(10, 16, 40, 42) 내에서 제 자리에 보유한다. 이는 연속적인 세척 공정을 가능케 하며, 화살표는 세척 완충액의 방향을 나타낸다.
도 18은 혈액 수집에서의 본 발명의 용기의 사용을 개시한다. 탯줄이 있는 태반 또는 정맥 또는 다른 적절한 공급원일 수 있는 혈액 공급원(180)으로부터의 혈액은 유동 조절기(182)로 이어지는 하나 이상의 배수구(181)에 모인다. 유동 조절기는 간단한 클립일 수 있거나, 또는 이는 본 발명의 보조 용기(16) 같은 용기 내로의 유동을 돕기 위한 진공/스텝퍼 모터일 수 있다. 용기(16)는 처음에는 완전히 압축되고 비고 멸균 상태이며, 이는 유동 조절기(182)를 통해 혈액 배수구(181)에 연결된다. 용기 내로의 혈액의 유동은 앞서 논의된 바와 갚이 진공 또는 스텝퍼 모터 제어기를 통해 보조될 수 있다. 가득 차면, 용기(16)를 연결 해제하고 동결한 다음 중앙 저장 시설(도시되지 않음)로 보낼 수 있다.
도 19는 이미 수집된 혈액의 처리를 도시한다. 도 19(a)에서, 제 1 보조 용기(16a)는 주요 용기(10)에 연결된다. 하나 이상의 추가의 보조 용기가 또한 제 1 보조 용기(16a)와 주요 용기(10) 사이의 위치(16b)에서 주요 용기(10)에 연결되지만, 완전히 폐쇄되고 제 1 보조 용기(16a)와 유체 연통되지 않는다. 제 1 보조 용기(16a)는 공여자 또는 환자 또는 다른 공급원으로부터 채취된 혈액을 보유한다. 도 19(a)는 제 1 보조 용기(16a)의 압축/접힘을 통해 혈액이 제 1 보조 용기(16a)로부터 주요 용기(10)로 전달됨을 보여준다. 도 19(b)에서는, 혈액의 다양한 부분을 혈장(190), 줄기세포(191) 및 적혈구 세포(192)의 수직 칼럼으로 분별하기 위하여 주요 용기(10)를 회전시킨다. 도 19(b)에서는 제 1 보조 용기(16a)가 완전히 접힌 걸 볼 수 있다. 이어, 이를 제거할 수 있다.
도 19(c)는 보조 용기(16c)가 주요 용기(10)의 압축을 통해 및/또는 보조 용기(16c)의 개방(이로써 유체가 주요 용기(10)로부터 배수됨)을 통해 혈장(190)으로 채워진 것을 보여준다. 혈장 분획(190)이 주요 용기(10)로부터 완전히 제거되면, 추가의 보조 용기(16d)를 도 19(d)에 도시된 바와 같이 줄기세포 분획(191)으로 채울 수 있다. 이 적혈구 세포(192)를 또한 추가의 보조 용기(도시되지 않음)에 수집할 수 있다. 다르게는, 도 19(e)는 적혈구 세포(192)가 적합하게 구성된 주요 용기(10) 내에 보유되는 실시양태를 도시한다.
분리 후, 다양한 분획을 필요에 따라 사용, 저장, 동결할 수 있다(도시되지 않음).
도 20은 도 19의 공정의 변형을 도시한다. 도 20(a)에서, 제 1 보조 용기(16a)는 주요 용기(10)에 연결된다. 하나 이상의 추가의 보조 용기도 제 1 보조 용기(16a)와 주요 용기(10) 사이의 위치(16b)에서 주요 용기(10)에 연결되지만, 완전히 폐쇄되고 제 1 보조 용기(16a)와 유체 연통되지 않는다. 제 1 보조 용기(16a)는 공여자, 환자 또는 다른 공급원으로부터 채취한 혈액을 보유한다. 도 20(a)는 제 1 보조 용기(16a)의 압축/접힘을 통해 혈액이 제 1 보조 용기(16a)로부터 주요 용기(10)로 전달됨을 보여준다. 도 20(b)에서는, 혈액의 다양한 부분을 혈장(190), 줄기세포(191) 및 적혈구 세포(192)의 수평 칼럼으로 분별하기 위하여 주요 용기(10)를 회전시킨다. 도 20(b)에서는 제 1 보조 용기(16a)가 완전히 접힌 걸 볼 수 있다. 이어, 이를 제거할 수 있다.
도 20(c)는 보조 용기(16c)가 주요 용기(10)의 압축을 통해 및/또는 보조 용기(16c)의 개방(이로써 유체가 주요 용기(10)로부터 배수됨)을 통해 혈장(190)으로 채워진 것을 보여준다. 혈장 분획(190)이 주요 용기(10)로부터 완전히 제거되면, 추가의 보조 용기(16d)를 도 20(d)에 도시된 바와 같이 줄기세포 분획(191)으로 채울 수 있다. 이 적혈구 세포(192)를 또한 추가의 보조 용기(도시되지 않음)에 수집할 수 있다. 다르게는, 도 20(e)는 적혈구 세포(192)가 적합하게 구성된 주요 용기(10) 내에 보유되는 실시양태를 도시한다.
분리 후, 다양한 분획을 필요에 따라 사용, 저장, 동결할 수 있다(도시되지 않음).
도 21은 복수개의 연결된 용기 사이에서 유체 연통을 전달/폐쇄하는 다른 배열을 도시한다. 도 21(a)에 도시된 바와 같이, 제 1 용기(211)는 접혀진 상태이고 역시 접혀진 상태인 제 2 용기(212)에 인접한다. 제 2 용기(212)에 연결된 제 3 용기(213)는 개방되고 세포 배양액을 함유한다. 원추형 삽입물(210)이 제 1 용기(211)의 중앙 개구로 연결되고 제 2 용기(212) 및 제 3 용기(213)의 동심 개구를 통해 연장된다. 원추형 삽입물(210)의 측부는 삽입물(210)이 용기의 외부와 제 3 용기(213)의 내부 사이에서만 유체 연통이 가능하도록 배열되고; 제 1 용기(211) 또는 제 2 용기(212) 둘 다가 폐쇄된 위치에 있는 동안 이들 두 용기와 유체 연통되지 않는다.
도 21(b)는, 제 2 용기(212) 개방이, 제 2 용기(212)와 제 3 용기(213) 사이의 유체 연통을 허용하지만 제 1 용기(211)와는 유체 연통을 허용하지 않도록 원추형 삽입물(210)을 위치시킬 수 있음을 의미한다는 것을 보여준다. 도 21(c)에 도시된 바와 같이, 제 3 용기(213)의 내용물이 제 2 용기(212)로 전달된 후, 제 3 용기(213)는 폐쇄된 상태로 접혀질 수 있고, 이에 의해 제 3 용기(213) 내로의 유체 연통이 중단될 수 있다. 이제 원추형 삽입물(210)은 제 2 용기(212) 및 용기의 외부와만 유체 연통을 허용하고 제 1 용기(211) 또는 제 3 용기(213)와는 연통을 허용하지 않는다.
도 21(d)는, 제 1 용기(211) 개방이, 제 2 용기(212)와 제 1 용기(211) 사이의 유체 연통을 허용하지만 제 3 용기(213)와는 유체 연통을 허용하지 않도록 원추형 삽입물(210)을 위치시킬 수 있음을 의미한다는 것을 보여준다. 도 21(e)에 도시된 바와 같이, 제 2 용기(212)의 내용물이 제 1 용기(211)로 전달된 후, 제 2 용기(212)는 폐쇄된 상태로 접힐 수 있고, 이에 의해 제 2 용기(212) 내로의 유체 연통이 중단될 수 있다. 이제 원추형 삽입물(210)은 제 1 용기(211)와만 유체 연통을 허용하고 제 2 용기(212) 또는 제 3 용기(213)와는 연통을 허용하지 않는다.
따라서, 최초 세포 배양액은 제 3 용기(213)에서 출발하고, 원추형 삽입물(210)을 통해 다른 용기(212, 211) 내로 연속적으로 전달될 수 있다.

Claims (20)

  1. 기부 구역, 기부 구역에 평행하게 배열된 상부 구역, 및 상부 구역과 기부 구역 사이에 배열되고 주요 용기의 내강(internal lumen)을 한정하는 벽 요소를 갖는 주요 용기를 포함하는, 세포를 생육, 배양 또는 변형시키는데 사용하기 위한 장치로서,
    상기 주요 용기의 벽 요소가 상부 구역 및 기부 구역에 대해 압축가능하고,
    상기 주요 용기가 하나 이상의 유입구를 갖고,
    상기 주요 용기의 벽 요소가 가요성 물질로 구성되며,
    상기 장치가 주요 용기의 외부에서 주요 용기와 직접 유체 연통되는 하나 이상의 보조 용기를 추가로 포함하고,
    상기 하나 이상의 보조 용기가 주요 용기의 상부 구역에 위치하는 장치.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 보조 용기 중 적어도 하나가 주요 용기에 탈착가능하게 연결되는 장치.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 유입구가 밀봉가능한 유입구인 장치.
  4. 제 1 항에 있어서,
    주요 용기의 기부 구역에 또는 기부 구역 근처에 위치하는 하나 이상의 보조 용기를 더 포함하는 장치.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 보조 용기 중 적어도 하나가 기부 구역, 기부 구역에 평행하게 배열된 상부 구역, 및 기부 구역과 상부 구역 사이에 배열되고 보조 용기의 내강을 한정하는 벽 요소를 포함하고,
    상기 보조 용기의 벽 요소가 상부 구역 및 기부 구역에 대해 압축가능하며,
    상기 용기가 하나 이상의 유입구를 갖고,
    상기 보조 용기의 벽 요소가 가요성 물질로 구성되고,
    상기 보조 용기가 주요 용기의 유입구 또는 유출구에 탈착가능하게 연결되도록 구성되는 장치.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 보조 용기가 보조 용기의 내용물을 특정 온도로 유지하도록 구성되는 절연 수단을 포함하는 장치.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 주요 용기가 용기의 대향하는 면 상에 밸브를 갖는 장치.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 용기의 두 대향하는 면의 밸브가, 용기가 완전히 압축될 때 채널을 형성함으로써 상호 작용하도록 구성되는 장치.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 장치 내로 조립하기 위한 부품의 키트로서,
    상기 키트가 (i) 기부 구역, 기부 구역에 평행하게 배열된 상부 구역, 및 상부 구역과 기부 구역 사이에 배열되고 주요 용기의 내강을 한정하는 벽 요소를 갖는 주요 용기, 및 (ii) 주요 용기와 함께 사용하기 위한 보조 용기로서, 주요 용기와 직접 유체 연통되도록 배치하고 주요 용기의 상부 구역에 위치하도록 구성되는 보조 용기를 포함하고,
    상기 주요 용기의 벽 요소가 상부 구역 및 기부 구역에 대해 압축가능하고,
    상기 주요 용기가 하나 이상의 유입구를 갖고,
    상기 주요 용기의 벽 요소가 가요성 물질로 구성되는, 키트.
  10. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 장치 내에서 세포를 생육, 배양 또는 변형시키는 다단계 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 방법이, 관심 세포 개체군을 주요 용기 내로 도입하고, 세포의 목적하는 생육, 배양 또는 변형을 수행하기 위하여 하나 이상의 보조 용기로부터 하나 이상의 시약을 주요 용기 내로 연속적으로 첨가함을 포함하는 다단계 방법.
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 방법이, 하나 이상의 보조 용기에서 공정을 수행함으로써, 주요 용기 내의 세포중 일부 또는 전부를 요구되는 보조 용기 내로 이동시키고 공정이 종결된 후 주요 용기 내로 다시 전달함을 포함하는 다단계 방법.
  13. 제 10 항에 있어서,
    상기 방법이, 주요 용기 내의 세포의 광학 밀도를 모니터링하고, 세포가 주요 용기 내에서 특정 광학 밀도에 도달한 후 세포를 주요 용기로부터 생물 반응기 같은 추가 용기로 전달하며, 세포를 추가 용기 내에서 배양함을 포함하는 다단계 방법.
  14. 제 10 항에 있어서,
    상기 방법이, 장치 내의 주요 용기 또는 추가 용기로부터 세포 또는 세포 배양 생성물을 하나 이상의 보조 용기 내로 수집하 는 다단계 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    수집된 세포 또는 세포 배양 생성물을 동결함을 포함하는 다단계 방법.
  16. 제 1 항에 따른 장치와 함께 사용하기 위한 보조 용기.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 보조 용기가 기부 구역, 기부 구역에 평행하게 배열된 상부 구역, 및 기부 구역과 상부 구역 사이에 배열되고 보조 용기의 내강을 한정하는 벽 요소를 포함하고,
    상기 보조 용기의 벽 요소가 상부 구역 및 기부 구역에 대해 압축가능하며,
    상기 용기가 하나 이상의 유입구를 갖고,
    상기 보조 용기의 벽 요소가 가요성 물질로 구성되고,
    상기 보조 용기가 주요 용기의 유입구 또는 유출구에 탈착가능하게 연결되도록 구성되는 보조 용기.
  18. 제 16 항에 있어서,
    상기 보조 용기가 보조 용기의 내용물을 특정 온도로 유지하도록 구성되는 절연 수단을 포함하는 보조 용기.
  19. 제 16 항에 있어서,
    상기 보조 용기가 용기의 대향하는 면 상에 밸브를 갖는 보조 용기.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 보조 용기의 두 대향하는 면의 밸브가, 용기가 완전히 압축될 때 채널을 형성함으로써 상호 작용하도록 구성되는 보조 용기.
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