CN1294927C

CN1294927C - 治疗肝病的药物

Info

Publication number: CN1294927C
Application number: CNB2004100405076A
Authority: CN
Inventors: 崔秀明; 王强; 蒋云结; 周家明; 柯金虎
Original assignee: Notoginseng Science & Technology Inst Wenshan Zhuang & Miao Autonomous Prefect
Current assignee: Notoginseng Science & Technology Inst Wenshan Zhuang & Miao Autonomous Prefect
Priority date: 2004-08-19
Filing date: 2004-08-19
Publication date: 2007-01-17
Anticipated expiration: 2024-08-19
Also published as: CN1628767A

Abstract

本发明涉及一种治疗肝病的药物，具体地说是以三七有效部位和丹参总酚酸为原料配制而成的“三七复方制剂”。

Description

治疗肝病的药物

技术领域：

背景技术：

肝纤维化在中医属血痹症的范畴。20世纪70年代中期始，开展中医药防治肝硬化及抗肝纤维化研究，迄今的研究已表明，中医药在抗肝纤维化治疗中具有明显的优势，其多环节、多层次及多靶点的综合药理学作用可能是其优势所在。近年来，我国及日本的肝病学家进行了大量的中医中药治疗肝纤维化的实验与临床研究，结果表明无论采用专方专药、单味药或有效成分均取得了较好疗效、对肝纤维化既有预防作用，又有治疗作用。抗肝纤维化比较有效的单味中药有丹参、黄茂、柴胡、桃仁、当归、冬虫夏草、齐墩果酸、葫芦素B等；而各家根据中医理论、临床经验或动物实验研究结果拟定了不同的抗肝纤维化中药方剂。现在对复方的研究较多，开展了中药复方抗肝纤维化治疗的临床试验，如：抗纤软坚冲剂、肝纤I号冲剂、百草柔肝胶囊、汗丹必妥、参芪二甲散、活血软肝胶囊、加味膈下逐淤汤，结果表明，这些复方对改善肝脏病变均有较好的疗效。对单味药的实验研究也比较多，三七和丹参是较为广泛使用的两种，三七的主要活性成分是三七总皂苷(皂甙)，药效分析，它可以改善肝脏微循环，增加肝内血流量，减少肝内胶原纤维的形成，降解肝内形成的胶原纤维，能延缓肝纤维化进程和促进早期肝纤维化的消退。丹酚酸是从丹参中提取水溶性成分物质，近来年研究表明丹参不但可抑制肝纤维组织的增生.而且可促进已形成的肝内胶原纤维降解和重吸收。单味丹参治疗肝病及防治肝纤维化有明显效果，有报导采用丹参注射液或丹参煎剂对实验性肝纤维组织增生有治疗和预防作用、尤其对慢性肝炎发展为肝硬化有预防和治疗价值、临床上应用丹参治疗各型肝病肝纤维化。同时，实验证明丹参具有抗氧化作用，能清除具有肝细胞毒性的自由基.促进已形成的肝胶原纤维降解和重吸收。

三七Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen，和丹参Salvia miltiorrhiza Bge.均为我国有名的常用活血化瘀药物。在临床上的应用十分广泛，但大多仅用于心脑血管系统疾病。近几年来，有大量研究表明三七和丹参分别具有有促进肝损伤修复和抗肝纤维化的作用，并能延缓肝纤维化的进程和促进早期纤维化的消退。三七对CCL4诱发的小鼠肝纤维化和肝损伤具有明显减轻肝细胞坏死、促进修复再生及减轻肝纤维化作用。丹参近几年也开始用于抗肝纤维化的研究，有报道从中药丹参中提取水溶性成分—丹参酸乙(丹酚酸B镁盐)用于肝纤维化的治疗。复方制剂的开发是中药现代化研究中的一个热点。

三七的主要成分是三七皂甙(皂苷)，在对三七抗肝纤维化研究上，武凡等研究三七皂甙单体Rg₁、Rb₁抗纤维化的作用机制，形态学胶原纤维和血清学ALT、HA、PCIII的统计学分析说明三七皂贰Rg₁、Rb₁有显著抗肝纤维化作用。石小枫观察三七总皂甙对肝纤维化大鼠胶原合成及TGF-β1表达的影响，结论是：三七总皂甙有抗肝纤维化作用。张荣华等对三七抗肝纤维化进行实验研究表明，三七对肝细胞损伤有一定保护作用。并可明显抑制肝组织中成纤维细胞及胶原纤维增生，是较理想的防治肝纤维化的药物。刘成海用MTT法观察三七总甙对NIH/3T3成纤维细胞毒性作用与增殖的影响，三七总甙对细胞的毒性作用与增殖抑制影响均较明显，能抑制成纤维细胞增殖，具有体外抗肝纤维化作用。丹酚酸(Salvianolic acid)是从丹参中提取的一类既有咖啡酰缩酚酸结构又有新木脂素骨架的水溶性成分，包括丹酚酸A、B、C、D、E、P、、C、H、I和异丹酚酸C等，都具有很强的抗脂质过氧化和清除自由基作用，其中含量最高的两个成分丹酚酸A(SalA)和丹酚酸B(SalB)活性最强，研究表明丹酚酸具有抗肝纤维化的作用。胡义扬等探讨丹参提取物预防和治疗肝纤维化的效果及部分作用机理，研究结果表明，丹参提取物可显著改善肝组织损伤和纤维化程度，同时能显著降低肝组织Hyp和WDA含量，提示丹参提取物有显著的抗肝纤维化作用。国内一些研究人员分别对三七和丹参治疗肝纤维化进行了实验与临床研究，认为其所含成分在抗肝纤维化上有独特疗效，但对三七与丹参的有效部位抗肝纤维化的复方新药研究开发未见文献报道。

在药物提纯方面，张杰等以三七所含人参皂甙为考查指标，对三七的不同提取工艺进行了比较研究，认为结三七以乙醇回流醇提取最好。贤英越等研究用D101大孔树脂吸附法对三七总皂甙进行精制提纯。对三七、丹参有效部位提取以及纯化的工艺制备(有效部位的纯度不小于50％)未见文献报道。

在利用HPCL测定三七和丹参的有效成分上，叶放采用RP-HPLC法测定复方丹参软胶囊中丹参酮中II_A的含量。吕东采用TLC鉴别复方丹参胶囊中高原丹参、三七及冰片。孙毅坤采用高效液相色谱法和气相色谱法，建立了复方丹参片中丹参酮II_A、原儿茶醛、三七皂甙R₁和冰片的含量测定方法。黄永焯采用高效液相色谱一蒸发光散射检测法对复方丹参滴九中人参皂苷Rg₁、Rb₁和三七皂苷R₁进行了含量测定。梁宁等建立HPLC同时测定三七总皂苷中人参皂苷Rg₁与Rb₁的方法，用于人参及三七的质量控制。赵祥军采用高效液相色谱法测定复方鳖甲软肝片中三七皂苷R₁和人参皂苷Rg₁的含量。对复方丹参软胶囊、复方丹参片、复方丹参滴九采用HPLC测定其有效成分，国内有见文献报道，但采用HPLC测定三七丹参复方制剂有效成分的质量标准研究，未见文献报道。在对三七和丹参的药效学和毒理学研究方面，张伯礼等对应用复方黄茂丹参颗粒剂进行冠心病心绞痛临床观察和药效学观察；商洪才等对丹参/三七不同配比药效学比较研究；沈惠云等对新云三七的毒理学进行研究，并做出了化学性肝损伤保护作用的功能评价；徐曼等对丹参多酚酸盐在大鼠慢性肾衰时肾功能及内源性内皮夷释放的影晌方面进行了毒理学试验研究。

对三七和丹参的药效学、毒理学的研究有见文献报道，三七丹参复方制剂有效部位在治疗肝纤维化的药效学、毒理学研究，未见文献报道。综上所述，现有技术未见用于治疗肝病的三七与丹参复方制剂的报道。

发明内容：

针对现有技术的空白，本发明的目的在于提供一种以三七有效部位和丹参总酚酸为原料配制而成的治疗肝病的复方制剂。

本发明的药物是以以三七有效部位和丹参总酚酸为原料，以重量比为1∶1~20∶1配制而成的药剂；复方可优选三七有效部位与丹参总酚酸的重量比为1∶1~10∶1；进一步优选三七有效部位与丹参总酚酸的重量比为2.5∶1~5∶1；最佳重量配比是三七有效部位∶丹参总酚酸＝5∶1。

本发明治疗肝病的药物复方制剂可以是任何一种药剂学上所说的剂型。

本发明“三七复方制剂”药物的制法可包括：

(1)取三七、丹参原药材，粉碎成粗粉，按三七、丹参2∶1投料，50％乙醇6倍量回流提取2h提取2次，合并提取液，回收乙醇，浓缩至0.5g/ml浓缩液用(12)HCl酸化至pH3.5，滤过，滤液上AB-8大孔树脂柱，水洗至中性，洗脱液弃去，35％乙醇洗脱至无FeCl₃反应，得“三七复方制剂”总酚酸部分；继续用65％乙醇洗脱至无Libermen反应，经氧化铝脱色，得“三七复方制剂”三七有效部位部分；

(2)、按权利要求1处方取主料三七有效部位和丹参总酚酸，然后按常规药物制法加入药物辅料得所需药剂。

本发明可以采用从三七中主要以水为溶剂提取的有效部位和丹参有效部位制成胶囊剂。本发明按常规药物制剂制成胶囊剂或片剂(以下简称三七复方制剂)之后，进行了药理、药效、毒理等试验，下面用这些试验结果进一步说明本发明的实质性内容和优益效果：

1、三七复方制剂对CCl₄致大鼠肝纤维化的影响

方法：运用CCl₄多次给予加饲高脂饲料制作大鼠肝纤维化模型。大鼠随机分组，除正常组外，其余各组大鼠首次以纯CCl₄1ml/100g体重，以后以40％CCl₄的橄榄油溶液0.3ml/100g体重，在大鼠背部后侧皮下注射，每周两次，至第4周；第5周后以20％CCl₄的橄榄油溶液0.25ml/100g体重，同法皮下注射，每周两次，至第10周。造模的第1-2周饲以高脂玉米粉饲料(80％玉米粉，20％猪油，0.5％胆固醇)，第3周后饲以普通饲料；自由饮水。正常组大鼠以普通饲料喂养。

从第5周起，给药组大鼠分别每日灌胃给予复方三七25，50，100mg/kg，阳性对照组每日灌胃给予马洛替酯100mg/kg，至第10周。

末次给药后24小时采血测血清生化指标，取肝、脾称重。肝组织一部分制成肝匀浆，用于测定羟脯氨酸含量；其余肝组织用10％福尔马林液固定，用于组织病理学检查。

结果：对于CCl₄诱导的大鼠肝纤维化模型，模型组大鼠体重明显减轻，肝脾肿大，肝脾指数明显增加(表1)，血清ALT显著上升，白蛋白及白/球比值均显著下降(表2)，肝组织中羟脯氨酸(Hyp)含量明显升高(表3)，反应肝细胞炎性损伤较严重，肝纤维化已经形成。经复方三七治疗后，肝脾指数显著恢复(表1)，血清ALT明显降低、Alb及A/G比值升高(表2)，肝组织中羟脯氨酸(Hyp)也明显含量下降，并有较好的量效关系，提示该药具有良好的抗肝纤维作用。

表1 三七复方制剂对CCl₄致肝纤维化大鼠体重、肝脾重量的影响( X±SD)

组别	剂量(mg/kg)	动物数(只)	体重(g)	肝重(g)	肝指数(mg/g)	脾重(g)	脾指数(mg/g)
组别	剂量(mg/kg)	动物数(只)	体重(g)	肝重(g)	肝指数(mg/g)	脾重(g)	脾指数(mg/g)	正常组模型对照组复方三七低剂量组复方三七中剂量组复方三七高剂量组马洛替酯组	--2550100100	1099111113	357±29294±46^**298±26290±52300±44316±39	10.5±1.315.4±3.^13.6±3.012.7±3.213.2±2.311.9±1.4^	29.3±2.852.4±6.0^45.5±8.243.6±6.1^43.9±4.0^37.7±3.3^	0.69±0.131.03±0.24^0.92±0.450.73±0.14^0.77±0.11^0.68±0.09^	2.0±0.43.6±0.8^3.2±1.92.6±0.7^2.6±0.7^2.2±0.2^

^*P＜0.05，^**P＜0.01，与正常组相比；^#P＜0.05，^##P＜0.01，与对照组相比。

表2 三七复方制剂对CCl₄致肝纤维化大鼠血清生化指标的影响( X±SD)

组别	剂量(mg/kg)	动物数(只)	ALT(Karmen Unit)	Alb(mg/ml)	TP(mg/ml)	A/G比值
组别	剂量(mg/kg)	动物数(只)	ALT(Karmen Unit)	Alb(mg/ml)	TP(mg/ml)	A/G比值	正常组模型对照组复方三七低剂量组复方三七中剂量组复方三七高剂量组马洛替酯组	--2550100100	1099111113	38.4±13.1326.0±82.9*263.5±133.4244.3±87.3^227.3±53.6^44.3±18.0^	55.3±4.446.8±2.7^*49.7±5.249.5±3.351.5±4.5^53.9±4.9^**	110.9±9.5107.7±13.9110.7±17.3106.0±25.697.0±15.198.1±13.8	1.010±0.1620.803±0.1770.900±0.3171.053±0.4611.199±0.309^1.344±0.450^*

*P＜0.05，**P＜0.01，与正常组相比；^#P＜0.05，^##P＜0.01，与对照组相比。

表3 三七复方制剂对CCl₄致肝纤维化大鼠肝组织中羟脯氨酸(Hyp)含量的影响( X±SD)

组别	剂量(mg/kg)	动物数(只)	Hyp(μg/g肝重)
组别	剂量(mg/kg)	动物数(只)	Hyp(μg/g肝重)	正常组模型对照组复方三七低剂量组复方三七中剂量组复方三七高剂量组马洛替酯组	--2550100100	1099111113	84.1±36.7215.1±27.8125.9±42.9^124.1±44.1^88.2±30.4^137.4±69.7^**

**P＜0.01，与正常组相比；^#P＜0.05，^##P＜0.01，与对照组相比。

2、三七有效部位与丹参总酚酸不同配比对肝细胞及成纤维细胞的影响

2-1试验目的

运用肝细胞及成纤维细胞体外培养，探讨三七有效部位与丹参总酚酸不同配比对其的影响，以确定两者的最佳比例。

2-2试验材料

2-2-1细胞株

L-02肝细胞株、NIH/3T3成纤维细胞株，均购自中国科学院上海细胞生物研究所。

2-2-2药物及试剂

三七复方制剂按本发明实施例制得，给药前称取适量用培养液配成所需浓度。

主要试剂：四氯化碳(CCl₄)，上海化学试剂研究所；噻唑蓝(MTT)(Sigma)；胰蛋白酶(DIFCO)；DMEM培养液为DHEM(GIBCO BRL)的重蒸馏水溶液，内含100U/ml的青霉素，100mg/ml的链霉素；新生牛血清(杭州四季青血清厂)；96孔培养板为Nuc产品。

2-3实验方法

2-3-1细胞传代培养

细胞以胰蛋白酶消化，含10％新生牛血清的DMEH培养液悬浮，L-02细胞以2×10⁵个/ml、NIH/3T3细胞以1×10⁵个/ml接种于96孔培养板中，总体积100μl，5％CO₂/95％潮湿空气培养。倒置显微镜观察生长，贴壁等形态。

2-3-2药物对CCl₄体外致L-02肝细胞损伤的影响

96孔传代的L-02细胞生长近单层时，吸弃上清，加入不同浓度的药物，培养24后，洗去药物，加入含0.2％CCl₄的培养液，12h后用MTT法检测肝细胞的存活数。

2-3-3药物对新生牛血清致NIH/3T3成纤维细胞增殖的影响

2-3-3-1血清浓度与MTT转化吸光度值的关系

96孔传代的NIH/3T3细胞生长近单层时，吸弃上清，分别换为含0％，5％，10％和20％新生牛血清的DMEM培养液，18小时后每孔加入MTT 20μl，继续温育4小时，倾去培养上清，轻轻吸干，加入DMSO 100μl/孔，振荡溶解结晶，形成均匀溶液，酶标仪540nm波长测定各孔吸光度(OD₅₄₀)值。

2-3-3-2细胞毒性与增殖实验

96孔传代的NIH/3T3细胞生长成近单层后，换为10^-7，10^-6，10^-5，10^-4g/ml浓度的无血清或含10％血清的药物温育液，温育18小时，每孔加入MTT 20μl，继续温育4小时，同上法测定各孔OD₅₄₀值。

2-4统计结果以mean±SD表示，以Student’s-t检验比较组间差异。

2-5结果

2-5-1药物对CCl₄体外致L-02肝细胞损伤的影响

结果如图1所示，与单独加培养液(Med)组相比，CCl₄显著抑制了L-02肝细胞的生长，大量肝细胞死亡。而三七有效部位(S)、丹参总酚酸(D)、及其二者不同配比组成的复方均有不同程度的浓度依赖性的保护肝细胞作用，其中复方各组优于单味组。复方各组中又以三七有效部位∶丹参总酚酸(S∶D)为5∶1时的肝细胞保护作用最强，2.5∶1组次之，1∶1与2∶1组作用相当并略次于2.5∶1组，10∶1与20∶1组较弱。

2-5-2三七复方制剂对NIH/3T3成纤维细胞增殖的影响

2-5-1-1血清浓度对细胞增殖及MTT吸光度的影响

随着血清浓度增加，MTT吸光度增加，呈明显正相关关系，说明新生牛血清在一定范围内刺激NIH/3T3细胞的增殖(图2)。

2-5-1-2药物的细胞毒作用

结果如图3所示，丹参总酚酸(D)对NIH/3T3细胞有较强的细胞毒性，而三七有效部位(S)对NIH/3T3细胞的细胞毒性最弱，仅在高剂量(10^-4g/ml)有一定的细胞毒作用。丹参总酚酸与三七有效部位配伍后，其细胞毒作用随三七总皂苷量的增加及丹参总酚酸量的减少而逐渐减弱。

2-5-1-3药物对新生牛血清刺激细胞增殖的影响

结果如图4所示，与单独加培养液(Med)组相比，新生牛血清(Cont组)显著促进了NIH/3T3细胞增殖。而三七总皂苷(S)、丹参总酚酸(D)、及其二者不同配比组成的复方对血清所致NIH/3T3细胞的增殖均有不同程度的抑制作用。复方各组中又以三七有效部位∶丹参总酚酸(S∶D)为5∶1时对血清所致NIH/3T3细胞增殖的抑制作用最强，2.5∶1与2∶1组次之，其它各配比与单味药物组无明显差异。

2-6结论：三七有效部位、丹参总酚酸对CCl₄致L-02肝细胞损伤有浓度依赖性的保护作用，两者配伍后作用增强，以三七有效部位∶丹参总酚酸为5∶1时的肝细胞保护作用最强，2.5∶1组次之，1∶1与2∶1组作用相当并略次于2.5∶1组，10∶1与20∶1组较弱。

三七有效部位、丹参总酚酸及其配伍对血清所致NIH/3T3细胞的增殖均有浓度依赖性的抑制作用。复方各组中以三七有效部位∶丹参总酚酸为5∶1时对血清所致NIH/3T3细胞增殖的抑制作用最强，且配伍后对NIH/3T3的细胞毒作用减弱。

综上，三七有效部位、丹参总酚酸均有保肝、抑制成纤维细胞增殖作用，但二者配伍后作用增强，毒性降低，其中以三七有效部位∶丹参总酚酸为5∶1时最佳。

3、三七复方制剂有效部位提取及制剂工艺的试验

从含三七、丹参中提取有效部位，使之达到中药5类新药的申报要求，即各有效部位的可测成分含量达到50％，并随行进行药效学比较(详见资料四.治疗肝病药效学的前期研究中--复方三七三七有效部位对CCl₄诱导的小鼠急性肝损伤的影响)，确认复方有效部位的提取工艺；在此基础上，制备成胶囊剂或其它剂型。胶囊剂的质量标准为：胶囊总皂苷以Rg1计不低于67.5mg/粒、Rg1不低于22.5mg/粒、总酚酸不低于13.5mg/粒、丹酚酸不低于7.8mg/粒。

三七为五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根，丹参为唇形科植物丹参Salia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎。其中三七的主要活性成分是三萜皂苷，丹参的主要活性成分是水溶性的酚酸类。

提取工艺研究：

(1).提取工艺流程

以三萜皂苷类成分和酚酸类成分的提取率为考察指标，进行了不同溶剂(水，50％乙醇，乙醇)，提取次数，溶剂倍数及提取时间的试验比较，优选以下总酚酸及三七有效部位的提取工艺：

三七、丹参原药材(三七为五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根，丹参为唇形科植物丹参Salia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎)粉碎成粗粉，按三七、丹参2∶1投料，50％乙醇6倍量回流提取2h提取2次，合并提取液，回收乙醇，浓缩至0.5g/ml浓缩液用(12)HCl酸化至pH3.5，滤过，滤液上AB-8大孔树脂柱，水洗至中性，洗脱液弃去，35％乙醇洗脱至无FeCl₃反应，得“三七复方制剂”总酚酸部分；继续用65％乙醇洗脱至无Libermen反应，经氧化铝脱色，得“三七复方制剂”三七有效部位部分。

(2).提取所得三七有效部位的含量测定和复方配比的确定

共提取试验三次。按三七、丹参药材比2∶1投料，投料量为三七400克，丹参200克。

35％乙醇洗脱液浓缩至干燥至恒重，得总酚酸部位，用紫外分光光度法于288nm处，以丹酚酸乙为对照品，测得总酚酸含量。

第一次：总酚酸部位5.64克，总酚酸含量为60.42％，总酚酸为3.408克；

第二次：总酚酸部位5.52克，总酚酸含量为60.30％，总酚酸为3.329克；

第三次：总酚酸部位5.44克，总酚酸含量为60.33％，总酚酸为3.282克；

平均得总酚酸量为3.340克。

65％乙醇洗脱液浓缩干燥至恒重，得三七有效部位部位，用比色法于560nm处，以人参皂苷Rg₁为对照品，测得三七有效部位含量：

第一次：三七有效部位22.97克，三七有效部位含量75.12％，三七有效部位为17.255克；

第二次：三七有效部位22.60克，三七有效部位含量75.09％，三七有效部位为16.970克；

第三次：三七有效部位22.56克，三七有效部位含量74.81％，三七有效部位为16.877克；

平均得三七有效部位量为17.034克。

结论：本复方按三七与丹参药材比2∶1投料，用以上工艺提取，得三七有效部位与总酚酸。

制剂工艺研究：

(1)处方：三七有效部位、总酚酸、微晶纤维素、微粉硅胶、乳糖适量制成胶囊剂或片剂。

(2)制法：将原料、辅料分别过80目筛，称取处方量的原、辅料，混合，过80目筛。加入30％乙醇制取软材，16目筛制颗粒，置干燥箱中，55℃热风干燥1.0小时，过16目筛，分装于1号胶囊中，每粒胶囊装量为0.25克，包装，即得。

4、三七复方制剂质量标准的研究

三七复方制剂含总皂苷以人参皂苷Rg₁计算，不得低于70.0％、人参皂苷Rg₁不得低于23.0％、丹酚酸乙不得低于30.0％。

5、急性毒性试验研究

按照新药申报要求和新药毒理学研究规范，本项目在中国药科大学已经完成了“三七复方制剂”急性毒性试验研究。试验结果无1例动物死亡，也未见异常反应，实验观察结束后处死小鼠，尸检心、肝、脾、肺、肾及胃肠道均未见异常。小鼠口服三七皂苷及“三七复方制剂”总提物无明显毒性，最大耐受量分别为：22.88g/kg，25.12g/kg。

6主要药效学研究

进行了“三七复方制剂”对CCl₄诱导的小鼠急性肝损伤的影响试验；三七与丹参组成复方后，对血清ALT的抑制作用较单用三七皂苷及单用丹酚酸要强，三七与丹参两药2∶1相配时(相当于总皂苷+总酚酸5∶1)作用更好，这些结果提示，三七皂苷对CCl₄诱导的小鼠急性肝损伤模型有显著的保护作用，配伍丹酚酸后作用增强。在此基础上又进行了“三七复方制剂”对D-半乳糖胺盐酸盐致大鼠急性肝损伤的影响研究。阳性对照药为联苯双酯滴丸(BDD)，北京协和制药厂，批号000816，批准文号：京卫药准字(1996)第121020号。结果：对照组血清ALT、AST水平明显升高，而三七皂苷原料低高剂量组及“三七复方制剂”高剂量组对血清ALT、AST均有显著的降低作用。病理组织学检查结果表明，模型大鼠肝脏的损伤以肝窦严重扩张充血、肝细胞广泛水肿伴有脂肪变性及点状坏死、汇管区炎细胞浸润等病理改变为主，经阳性药联苯双酯干预后，肝损伤明显减轻，丹酚酸原料组肝脏病变有一定程度减轻，但不显著；三七皂苷高、中、低剂量组及“三七复方制剂”有效部位高、中、低剂量组对肝损伤均有不同程度的改善作用，其中以三七皂苷高剂量组及“三七复方制剂”有效部位高剂量组减轻肝损伤较为明显。提示，“三七复方制剂”有效部位对D-GalN诱导的大鼠急性肝损伤模型有明显的保护作用。为了进一步研究其药效，又进行了“三七复方制剂”有效部位对二甲基亚硝胺(DMN)致大鼠肝纤维化模型的影响。阳性对照药为马洛替酯片，锦州九泰药业有限公司，批号：991101。批准文号：(94)卫药准字X-29-2号。结果表明，与正常组相比，模型对照组大鼠体重明显减轻，肝脾肿大，肝脾指数明显增加。与对照组相比，复方高剂量组对肝指数有明显的恢复作用，对脾指数有恢复的趋势；其它药物组对此无明显改善作用。供试药物组与正常组相比，模型组大鼠血清ALT、AST明显上升，白/球比值显著下降；三七皂苷原料及“三七复方制剂”有效部位对血清ALT、AST的上升均有明显的抑制作用；对于白/球比值，三七皂苷原料高剂组及“三七复方制剂”有效部位高剂量均有恢复的趋势。阳性药对血清ALT、AST均有显著皂制作用，对自/球比值有恢复的趋势。对大鼠肝组织中羟脯氨酸含量的影响也显示，供试药物与正常组相比，模型组大鼠肝组织中羟脯氨酸(Hyp)含量明显升高。而丹酚酸原料组、三七皂苷原料高剂量组、“三七复方制剂”有效部位低、中、高剂量组及阳性药马洛替酯组均显著降低了肝组织中Hyp含量。以上试验结果说明：以三七、丹参复方制剂提取物开发治疗肝纤维化新药具有工艺成熟、质量稳定可控、毒副作用小、疗效确切。

附图说明：

图1为本发明三七有效部位、丹参总酚酸及二者不同配比对CCl₄体外致L-02肝细胞损伤的影响示意图：(^##P＜0.01与Med组相比，*P＜0.05、**P＜0.01与CCl₄组相比)

图2为血清浓度对NIH/3T3细胞增殖及MTT吸光度的影响示意图；(**P＜0.01与不含血清组(0％)相比)

图3为三七有效部位、丹参总酚酸及二者不同配比对NIH/3T3的细胞毒作用示意图；(*P＜0.05、**P＜0.01与Med组相比)

图4为三七有效部位、丹参总酚酸及二者不同配比对血清致NIH/3T3细胞增殖的影响示意图；(^##P＜0.01与Med组相比，*P＜0.05、**P＜0.01与Cont组相比)

具体实施方式：

下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1：

1、“三七复方制剂”总酚酸及三七有效部位的提取：

2、药物的制备：

称取1所得三七有效部位75.0克、丹参总酚酸15.0克、微晶纤维素60.0克、微粉硅胶30.0克、乳糖适量，混合，过80目筛。加入30％乙醇制取软材，16目筛制颗粒，置干燥箱中，55℃热风干燥1.0小时，过16目筛，分装于1号胶囊中，每粒胶囊装量为0.25克，包装，即得胶囊剂1000粒。

实施例2：

按实施例1得原料，称取三七有效部位75.0克、丹参总酚酸75.0克、微晶纤维素60.0克、微粉硅胶30.0克、乳糖适量按实施例1的方法制成胶囊剂1000粒。

实施例3：

按实施例1得原料，称取三七有效部位150.0克、丹参总酚酸7.5克、微晶纤维素80.0克、微粉硅胶40.0克、乳糖适量按实施例1的方法制成胶囊剂1000粒。

实施例4：

按实施例1得原料，称取三七有效部位75.0克、丹参总酚酸30克、微晶纤维素60.0克、微粉硅胶30.0克、乳糖适量按实施例1的方法制成胶囊剂1000粒。

实施例5：

按实施例1得原料，以重量比5∶1取三七有效部位75.0克、丹参总酚酸15克混匀，粉碎，过40-60目的筛孔，收集筛出细粉，装入胶囊按实施例1的方法制成胶囊剂1000粒。

实施例6：

按实施例1得原料，以重量比5∶1取三七有效部位75.0克、丹参总酚酸15克混匀，粉碎，过40-60目的筛孔，收集筛出细粉，按药效部份与赋形剂重量比为4∶1加入赋形剂淀粉，制粒压片成片剂。

实施例7：

按实施例1得原料，以重量比2.5∶1取三七有效部位37.5克、丹参总酚酸15克混匀，粉碎，过40-60目的筛孔，收集筛出细粉，按药效部份与赋形剂重量比为3∶1加入赋形剂淀粉，制粒压片成片剂。

Claims

1、一种用于治疗肝纤维化的药物，按照下述方法制成：

(1)取三七、丹参原药材，粉碎成粗粉，按三七、丹参2∶1投料，50％乙醇6倍量回流提取2小时2次，合并提取液，回收乙醇，浓缩至0.5g/ml，浓缩液用HCl酸化至PH3.5，滤过，滤液上AB-8大孔树脂柱，水洗至中性，洗脱液弃去，35％乙醇洗脱至无FeCl3反应，得该药物的丹参总酚酸部分；继续用65％乙醇洗脱至无Libermen反应，经氧化铝脱色，得该药物的三七有效部位部分；

(2)按重量比为5∶1取(1)步骤所得的三七有效部位∶丹参总酚酸，然后按常规药物制法加入药物辅料即得。