CN1286466C - 地乌皂苷w3在治疗风湿类疾病药物制剂中的应用 - Google Patents

地乌皂苷w3在治疗风湿类疾病药物制剂中的应用 Download PDF

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地乌皂苷W3在治疗风湿类疾病药物制剂中的应用，地乌皂苷W3，分子式为C59H96O25：化学名称为3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)β-D-吡喃木糖-齐墩果酸-28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，其作为该药物制剂中有效成分。制备方法是取地乌粗粉，回流提取、浓缩，经大孔树脂吸附洗脱后，再经硅胶干柱吸附和洗脱，再以制备型高效液相分离得有效成分地乌皂苷W3，用该有效成分制成中药制剂，制剂中地乌皂苷W3含量≥90wt%，其中药制剂用于治疗风湿类疾病，具有疗效显著、毒副作用小的优点。

Description

地乌皂苷W3在治疗风湿类疾病药物制剂中的应用
技术领域
本发明涉及风湿类疾病的一种中药制剂及制备和应用。
背景技术
风湿类疾病是一种常见的自身免疫性疾病，可累及多个器官和组织。临床发病率高。由于其发病机理不完全清楚，目前尚无特效治疗方法(卢君健，结缔组织病中西医诊治学，人民卫生出版社，1992：348)。临床多采用皮质类固醇激素及细胞毒药物等综合治疗，但这常造成机体的非特异性免疫抑制等不良后果。
地乌系毛茛科银莲花属植物林荫银莲花(Anemone flaccida Fr.Schmidt)的干燥根茎。在《贵州民间药物》、《浙江天目山药物志》等书中均有记载，其性温，味辛微苦，具有祛风湿、强筋骨、消肿止痛之功效，善治风湿疼痛、跌打损伤。(中药大辞典，上海：上海科学技术出版社，2002：802)
从地乌中得到的总有效部位制成地乌提取物、地乌风湿安胶囊于2004年9月2日获国家中药5类新药的I II期临床批件，现已进入临床实验阶段。临床上用于治疗类风湿性关节炎(RA)，疗效显著。
发明内容
本发明的目的是提供一种从地乌中提取分离纯化得到的有效成分W3——分子式为C59H96O25而制成的风湿安制剂及应用。
本发明的风湿安中药制剂其组成有效成分为：3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)β-D-吡喃木糖-齐墩果酸-28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，【命名为地乌皂苷W3，以下所述地乌皂苷W3均指该化合物】，分子式为C59H96O25。
本发明的风湿安中药制剂中地乌皂苷W3含量≥90wt％。
本发明的风湿安中药制剂的制备方法，其工艺步骤为：
第1、取地乌粗粉，加8～12倍水回流提取3～4次，每次1～3h，合并提取液；
第2、将步骤1所得的提取液减压浓缩至于，加50％～80％乙醇，滤除沉淀，得醇提液；
第3、将步骤2所得的醇提液减压浓缩至干，加水溶解、过滤，滤液上D101大孔树脂吸附，并依次用水、40％～80％乙醇、80％～95％乙醇洗脱；收集40％～80％乙醇洗脱物，回收乙醇并水浴蒸干，得地乌总苷；
第4、将步骤3所得的地乌总苷上硅胶柱层析，以氯仿∶甲醇∶水＝20∶10∶1混合液洗脱，粗分成5段，高效液相色譜检识，收集富含地乌皂苷W3的第2段部分，再上硅胶柱层析，以氯仿∶甲醇∶水＝7∶4∶1混合液洗脱，高效液相色譜检识，收集富含地乌皂苷W3的部分，以制备型高效液相分离精制得化合物地乌皂苷W3含量≥90wt％。制备型高效液相分离条件：固定相：十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：甲醇∶水为6∶4～7∶3体积比的混合液；流速：2.0～10ml/min；柱温：25℃～40℃；检测波长：205～250nm。
第5、将步骤4所得的化合物地乌皂苷W3制备成制剂。其制剂包括粉剂，丸剂，滴剂和片剂.。
本发明的风湿安中药制剂应用于治疗风湿类疾病。本风湿安中药制剂在治疗风湿类疾病时，是通过针对机体特定的免疫调节状态来调节免疫，避免非特异性免疫抑制及药物的毒性作用，具有疗效显著、毒副作用小的优点。
本发明中除另有说明之外乙醇百分浓度均是指容量百分浓度，化合物百分含量是指质量百分含量。
附图说明
图1地乌皂苷W3原料药的制备工艺流程图
具体实施方式
实施例1
原料药W3的制备
参见附图1
取地乌粗粉，加8～12倍水回流提取3～4次，每次1～3h，合并提取液，将提取液减压浓缩至干，加50％～80％乙醇，滤除沉淀，得醇提液，减压浓缩至干，加水溶解、过滤，滤液上D101大孔树脂吸附，并依次用水、40％～80％乙醇、80％～95％乙醇洗脱；收集40％～80％乙醇洗脱物，回收乙醇并水浴蒸干，得地乌总苷；将所得地乌总苷上硅胶干柱层析，以氯仿∶甲醇∶水＝20∶10∶1体积比的混合液洗脱，粗分成5段，高效液相色譜(TLC)检识，收集富含地乌皂苷W3的第2段部分，再上硅胶柱层析，以氯仿∶甲醇∶水＝7∶4∶1体积比的混合液洗脱，TLC检识，收集富含地乌皂苷W3的部分，以制备型高效液相分离精制得化合物W3。制备型高效液相分离条件：固定相：十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：甲醇∶水为6∶4～7∶3体积比的混合液；流速：2.0～10ml/min；柱温：25℃～40℃；检测波长：205～250nm。
实施例2
大鼠长期毒性试验：
考察地乌提取物864、288、96mg/kg剂量连续灌胃给药6个月的长期毒性反应。观察动物的一般情况，体重变化、血液学、血液生化，全身器官大体解剖、脏器系数及组织病理学变化。结果动物均无1只死亡。各剂量组动物试验3个月试验期末和恢复期的一般情况，体重变化、血液学、血液生化、全身器官大体解剖，脏器系数各项指标与阴性对照组比较，均无统计学差异。试验结束时，各剂量组组织病理学检查提示：增生性小叶所占甲状腺滤泡小叶的比例不一，其中高剂量组增生性小叶占甲状腺滤泡小叶的50％以上，中剂量组占30～50％，低剂量组或蒸馏水对照组占10～30％。各剂量组和蒸馏水组动物100％出现增生性小叶，X2检验无显著性差异，只是严重程度随剂量的增大而加重。增生性甲状腺滤泡一般反映动物碘摄取量不足。本实验低剂量组或蒸馏水对照组增生性甲状腺滤泡所占比例一致，提示动物碘摄取量不足是由饮食碘含量不足所致；而高、中剂量组加重动物碘摄取量不足；结合动物总体代谢(生长曲线、脏器系数等)良好，故认为增生性甲状腺滤泡比例较高不属于地乌提取物不可逆性毒性损伤的范围。大白鼠长期毒性试验表明，地乌提取物96mg/kg连续6个月予大白鼠灌胃给药是安全的。
实施例3.
Beagle犬长期毒性试验：
考察地乌提取物按128mg/kg、256mg/kg和512mg/kg剂量连续给药9个月的长期毒性反应。观察动物的一般情况，体重变化，粪、尿常规，心电图、血液学、血液生化、全身器官大体解剖，脏器系数及组织病理学变化。结果动物均无死亡。高、中、低剂量组动物试验3个月、6个月、9个月和恢复期的各项指标与空白对照组比较均无统计学差异。长期毒性试验结果表明，地乌提取物按128mg/kg、256mg/kg和512mg/kg连续9个月予Beagle犬喂饲给药是安全的。
实施例4.
地乌提取物对大鼠佐剂关节炎的影响
1、观察地乌提取物对原发病变的影响
取体重180g左右的Wistar大鼠50只，雌雄各半，按体重随机分为5组，测其左后跖正常容积(ml)。每鼠左后跖皮内注射Freuneds完全佐剂[采用液体石蜡和羊毛脂(2∶1)共热至70℃振摇，高压灭菌，然后按每ml加入卡介苗6mg制成0.1ml致炎。自注入佐剂的前1日开始给药。观察该药对原发病变的影响。
地乌提取物3个剂量组，剂量分别为288、144、72mg/kg；醋酸泼尼片组20mg/kg；蒸馏水组20ml/kg。均灌胃给药，每日1次，连续10天。每天测量各鼠左后足跖容积，结果与蒸馏水组比较(t检验)列于表1。
2、观察地乌提取物对继发病变的预防作用
另取180g左右的大鼠50只，雌雄各半，随机分为5组。分组情况及给药剂量同(1)。于注射佐剂第7天开始给药，连续7天，观察对侧(右侧)的足跖肿胀度，体重变化，耳部、前肢和尾部病变的发生率，结节数或严重度，每隔3天测体重1次。结果与蒸馏水组比较t检验(确切概率法)列于表2。
3、观察地乌提取物对继发病变的治疗作用
另取出现继发病变大鼠50只，于注射佐剂第19天开始给药。观察佐剂注射对侧(右侧)的足跖肿胀度，体重变化，连续给药观察至第30天。每隔3天测体重1次。结果与蒸馏水组比较(t检验)列于表3。
结果表明：地乌提取物各剂量组致炎后，足跖肿胀程度在相同时间与蒸馏水组相比较，均具有高度显著性差异(P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001)，提示该药具有抗佐剂关节炎原发病变的作用。
表1地乌提取物对佐剂关节炎大鼠原发病变的影响(X±S，n＝10)
  组别   剂量(mg/kg)                                                  左后足跖容积(ml)
正常                                      给药后(天)
  1   2   3   4
  高剂量组中剂量组低剂量组醋酸泼尼松组蒸馏水组   288144722020ml   0.76±0.03*0.75±0.02*0.74±0.02*0.74±0.02*0.74±0.02   0.99±0.07***1.00±0.07***1.03±0.05**0.96±0.05****1.09±0.06   0.98±0.07***0.99±0.03****1.00±0.05***0.95±0.06****1.09±0.07   0.96±0.05****0.98±0.03****0.97±0.06***0.92±0.09****1.08±0.07   0.87±0.06****0.92±0.04***0.89±0.05****0.86±0.08****1.00±0.06
  5   6   7   8   9   10
  0.82±0.05****0.86±0.04***0.83±0.06****0.82±0.05****0.93±0.05   0.80±0.04****0.80±0.02****0.80±0.03****0.80±0.04****0.89±0.06   0.80±0.04***0.81±0.02***0.79±0.04***0.78±0.02****0.87±0.06   0.83±0.03****0.84±0.03****0.85±0.03****0.86±0.03***0.93±0.05   0.82±0.03****0.82±0.04****0.82±0.03****0.82±0.03****0.93±0.05   0.79±0.02****0.78±0.02****0.79±0.02****0.79±0.02****0.90±0.05
与蒸馏水组比较(t检验)*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01，****P＜0.001。
表2地乌提取物对继发性病变的预防作用(X±S，n＝10)
  组别   剂量(mg/kg)   正常右足跖容积(ml)                     致炎后不同时间佐剂注射对侧(右后足跖)容积(ml)
7天 8天 9天 10天
  高剂量组中剂量组低剂量组醋酸泼尼松组蒸馏水组   288144722020ml   0.73±0.02*0.74±0.03*0.73±0.02*0.73±0.02*0.73±0.02   0.73±0.02*0.75±0.03*0.74±0.02*0.73±0.02*0.73±0.02*   0.73±0.02*0.75±0.02*0.75±0.02*0.73±0.03*0.74±0.02*   0.74±0.03*0.76±0.03*0.77±0.04*0.74±0.02*0.76±0.03   0.75±0.03**0.77±0.02*0.78±0.04*0.75±0.02**0.79±0.04
组别   剂量(mg/kg)           致炎后不同时间佐剂注射对侧(右后足跖)容积(ml)
  11天   12天   13天
  高剂量组中剂量组低剂量组醋酸泼尼松组蒸馏水组   288144722020ml   0.75±0.03***0.78±0.02**0.80±0.05*0.75±0.03***0.81±0.04   0.75±0.03***0.78±0.02*0.81±0.05*0.75±0.03***0.82±0.06   0.75±0.03****0.78±0.02**0.81±0.05*0.76±0.03***0.83±0.06
与蒸馏水组比较(t检验)*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01，****P＜0.001。
表3地乌提取物对佐剂关节炎大鼠继发性病变的治疗作用
(右后足跖容积，X±S，n＝10)
  组别   剂量(mg/kg)   正常右后足跖容积(ml)                     致炎后不同时间右后足跖容积(ml)
19天 20天 21天 22天
  高剂量组中剂量组低剂量组醋酸泼尼松组蒸馏水组   288144722020ml   0.75±0.02*0.74±0.02*0.74±0.02*0.74±0.02*0.74±0.03   0.96±0.09*0.94±0.06*0.94±0.06*0.95±0.07*0.95±0.06   0.88±0.04***0.92±0.05**0.93±0.06*0.94±0.04*0.98±0.07   0.86±0.04****0.90±0.05****0.93±0.05***0.92±0.05***1.01±0.07   0.85±0.04****0.89±0.05***0.91±0.05**0.91±0.05**1.00±0.09
  23   24   25   26   27   28
  0.84±0.04****0.88±0.05****0.89±0.05****0.89±0.04****1.00±0.06   0.84±0.03****0.86±0.05****0.88±0.05***0.87±0.04****1.01±0.10   0.83±0.02****0.85±0.04****0.86±0.05****0.84±0.04****0.99±0.07   0.82±0.03****0.84±0.04****0.84±0.04****0.81±0.04****0.97±0.05   0.80±0.02****0.82±0.04****0.82±0.04****0.79±0.03****0.97±0.06   0.78±0.02****0.79±0.04****0.80±0.04****0.76±0.03****0.95±0.05
  29   30
  0.76±0.02****0.78±0.03****0.79±0.03****0.75±0.02****0.94±0.05   0.75±0.02****0.75±0.03****0.74±0.02****0.74±0.02****0.93±0.04
与蒸馏水组相比较(t检验)*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01，****P＜0.001。

Claims (1)

1、地乌皂苷W3在治疗风湿类疾病药物制剂中的应用，所述的地乌皂苷W3分子式为C59H96O25，名称为3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)β-D-吡喃木糖-齐墩果酸-28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，其特征是作为治疗风湿类疾病药物制剂的有效成分，该有效成分在药物制剂中的含量≥90wt％，其药物制剂的制备方法步骤为：
第1、取地乌粗粉，加8～12倍水回流提取3～4次，每次1～3h，合并提取液；
第2、将步骤1所得的提取液减压浓缩至干，加50％～80％乙醇，滤除沉淀，得醇提液；
第3、将步骤2所得的醇提液减压浓缩至干，加水溶解、过滤，滤液上D101大孔树脂吸附，并依次用水、40％～80％乙醇、80％～95％乙醇洗脱；收集40％～80％乙醇洗脱物，回收乙醇并水浴蒸干，得地乌总苷；
第4、将步骤3所得的地乌总苷上硅胶柱层析，以氯仿∶甲醇∶水＝20∶10∶1混合液洗脱，粗分成5段，高效液相色譜检识，收集富含地乌皂苷W3的第2段部分，再上硅胶柱层析，以氯仿∶甲醇∶水＝7∶4∶1混合液洗脱，高效液相色譜检识，收集富含地乌皂苷W3的部分，以制备型高效液相分离精制得化合物地乌皂苷W3含量≥90wt％；
第5、将步骤4所得的化合物地乌皂苷W3制备成制剂。
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