CN1273597C

CN1273597C - 融合的渗透压调节基因和蛋白质及制备方法和应用

Info

Publication number: CN1273597C
Application number: CN 200410013264
Authority: CN
Inventors: 曹军卫; 刘瑞杰; 魏红波; 陈明清
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2004-06-04
Filing date: 2004-06-04
Publication date: 2006-09-06
Anticipated expiration: 2024-06-04
Also published as: CN1624130A

Abstract

本发明公开了一种融合的渗透压调节基因和蛋白质，制备方法及应用，其特征是其具有与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列和SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，制备步骤是A.引物设计；B.融合proB基因的克隆；C.proBA基因的克隆；本发明方法简单，操作方便；一种含有融合基因的重组载体(pBE2/proBA/MF)在大肠杆菌中的表达，比表达未修饰proBA基因的JM83提高了20%；一种含有融合基因的植物表达载体(pMD1/proBA/MF)在植物中的表达，能有效提高植物耐渗透压胁迫的能力，使双子叶植物如拟南芥能够在2.0～3.5%盐浓度环境下生长。

Description

融合的渗透压调节基因和蛋白质及制备方法和应用

技术领域

本发明属于转基因植物领域，具体地说，本发明涉及一种分离渗透压调节功能的融合基因，其编码的融合蛋白质，含有该融合的渗透压调节基因的载体，制备基因、蛋白质、载体的方法，以及该基因在转基因植物中的应用。

背景技术

耐盐和嗜盐微生物在高渗透压环境中为应付环境渗透压的变化，进化出不同的主动机制来快速而有效的适应外界渗透压的改变。细胞对渗透胁迫的调节是保护有机体对抗环境渗透压变化的主要生物学过程，这个过程称为渗透调节。

在高渗环境的胁迫下，耐盐和嗜盐微生物通过合成或从环境中吸收一些有限种类的低分子量物质来调节自身的渗透压，以平衡外界渗透压的增加。这些低分子量物质包括K+，糖类(如海藻糖，蔗糖等)，醇类，氨基酸(谷氨酸，脯氨酸等)，氨基酸的衍生物(如甜菜碱，肽，氨基酸甲基取代物)等。

在芽孢杆菌中发现了许多耐盐细菌，它们在自然界中分布非常广泛。其中枯草芽孢杆菌是以合成脯氨酸作为相容溶质。其脯氨酸的合成从谷氨酸开始，在γ-谷氨酰激酶(γ-glutamyl kinase，γ-GK或ProB，由proB基因编码)、谷氨酰磷酸还原酶(γ-glutamyl phosphate reductase，γ-GPR或ProA，由proA基因编码)和吡咯琳-5-羧酸还原酶(Δ¹-pyrroline-5-carboxylate reductase，P5CR或ProC，由proC基因编码)的作用下形成脯氨酸。其中γ-GK是脯氨酸生物合成过程中的限速酶，受其终产物脯氨酸的反馈抑制，在渗透压调节中起着至关重要的作用。

研究微生物渗透调节在理论上，可以探讨耐盐和嗜盐微生物细胞渗透胁迫调节的生理和分子机理。在应用上，相容溶质的渗透调节作用已被广泛用于工农业等技术方面。特别是在转基因植物方面，利用转基因手段来获得抗干旱、耐盐渍的转基因植物，已经成为当今植物生物技术领域研究的热点之一。现已证实，在植物中过量表达低分子量化合物如脯氨酸，甘露醇，胆碱等，能够提高转基因植物抗渗透胁迫的能力。迄今，已有不少微生物来源的渗透压调节基因被转化到植物，获得了有一定水平抗旱和耐盐的转基因植物[张荃等，生物工程学报，17(2001)：658-662.Holmstron KO，et al.，Plant J.，6(1994)：749-759.Hayashi HA，etal.，Plant J.，12(1997)：133-142.]。可见微生物有关相容溶质体系的遗传成分，是农业生物技术非常有用的基因来源[Yoshu Y，et al，Plant Cell Physiol.，38(1997)：1095-1102.]。

至今对渗透调节的应用主要还是利用天然的或未加修饰的基因或基因产物。但是由于各种渗透调节基因普遍存在着反馈调节作用，当生物在体内积累了一定浓度的相容溶质时，因为反馈调节作用，就会阻止相容溶质的进一步合成，最终限制了生物对更高渗透胁迫的抵抗能力。渗透压调节基因的反馈调节作用，可以通过各种育种方法加以修饰得以解除，进而提高细胞耐渗透胁迫的能力。

中国专利03134987公开了来源于枯草芽孢杆菌抗脯氨酸结构类似物耐盐突变株的渗透压调节基因proBA基因，其表达的蛋白质和转基因植物，提高了植物耐渗透压胁迫的能力。该基因由proB和proA以重叠基因的方式组织，但是仍旧表达出两个单独的蛋白质。但是将此proB和proA基因在植物中表达，由于基因的重叠，同时真核细胞又不能识别原核基因的SD序列，会使植物表达错误蛋白质序列的频率增加，从而影响植物耐更高渗透压胁迫的能力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种融合的渗透压调节基因proBA和融合蛋白质γ-GK/γ-GPR；分离渗透压调节融合基因proBA在大肠杆菌中的表达，使宿主菌大肠杆菌JM83耐高盐胁迫能力达到了0.6M NaCl，比表达未修饰proBA基因的JM83提高了20％。

本发明的另一个目的是提供一种分离渗透压调节融合基因的方法；此方法具有制备方法简单，操作方便的优点。

本发明的再一个目的是提供一种渗透压调节融合基因在转基因植物中的应用；该基因克服了以重叠基因方式组织的天然proB和proA基因在植物中表达时，由于基因的重叠，真核细胞不能识别原核基因的SD序列，使植物表达错误蛋白质序列的频率增加，影响植物耐更高渗透压胁迫的能力的缺点，使植物能够正确表达融合的proBA基因，从而能有效提高植物耐渗透压胁迫的能力，使双子叶植物如拟南芥能够在2.0～3.5％盐浓度环境下生长。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：一种重组载体(pBE2/proBA/MF)中proBA融合基因，其特征是具有SEQ ID No.1所示的核酸序列，具有SEQ ID No.1所示的proBA基因含有2364bp。

本发明还公开了一种由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列编码产生的一种融合蛋白，其蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。具有SEQ IDNo.2所示的序列编码一个由787个氨基酸组成的融合蛋白质分子，蛋白质分子量约为85kD。

本发明还公开了一种制备渗透压调节融合基因的方法，包括下列步骤：将出发菌株枯草芽孢杆菌93151经亚硝基胍(NTG)诱变，经NTG诱变后的细胞，涂布于含不同盐浓度的基本培养基(MM)上，筛选耐盐突变株。将筛选出的耐盐突变株涂布于含有0.04mM 3，4-脱氢脯氨酸(DHP)的MM培养基上，筛选抗脯氨酸结构类似物突变株。对筛选出来的菌株进一步测定其在不同盐浓度下的胞内自由脯氨酸含量，以获得抗脯氨酸反馈抑制突变株。用以上方法筛选出耐盐能力高达14％，在盐胁迫条件下以高产率产生脯氨酸作为相容溶质的突变株(CCTCCNO：M203041，该菌株已申请专利)。此突变株作为本发明融合的proBA基因构建的基因来源。

A.引物设计：

①proB基因克隆引物：

proBfp：5’-ggcctgcagacggagaaacta-3’，

proBrp：5’-ggctctagatttgttttccccctc-3’；

②proA基因克隆引物：

proAfp：5’-ggctctagaatgagtgaagtattg-3’，

proArp：5′-ggcgagctcatcgtcaatctccccgcaca-3’；

B.融合proB基因的克隆

①proB基因的克隆：以枯草芽孢杆菌突变株(CCTCC NO：M204041，该菌株已申请专利)的染色体DNA为模板，采用上述proB基因克隆引物进行PCR扩增；

②反应条件为：95℃，5分钟；94℃，30秒；55℃，1分钟；72℃，3分钟；共30个循环，最后72℃延伸10分钟；

③Xba I和Pst I双酶切PCR产物，体系如下：

PCR products 8μl

10×T 2.5μl

BSA 2.5μl

Xba I 1μl

Pst I 1μl

水 10μl

总体积 25μl；

④提取pBE2表达载体，Xba I和Pst I分别双酶切pBE2，体系如下：

pBE2 20μl

10×T 5μl

BSA 5μl

Xba I 2μl

水 18μl

总体积 50μl

先利用Xba I 37℃单酶切3小时后，补加2μl Pst I，同时相应的补加各成分，使反应体系为55μl，再反应3小时后，全部酶切反应样品电泳回收；

⑤利用DNA试剂盒纯化PCR产物后，同时0.8％琼脂糖电泳检测，根据电泳带的亮度，初步确定连接所需的样品量，连接如下：

10×Ligation buffer 1μl

T4 Ligase 1μl

pBE2(Xba I+Pst I酶切产物) 1μl

PCR products(Xba I+Pst I酶切产物) 4μl

水 3μl

总体积为10μl，过夜连接14小时；

⑥大肠杆菌感受态细胞的制备：从LB平板上挑选大肠杆菌单菌落，接种到LB培养基中，37℃过夜振荡培养，转接继续培养至OD₆₀₀为0.5，将培养液转移到离心管中，冰浴中冷却10分钟后，4000rpm离心3分钟，回收菌体，加入预冷的0.1mol/LCaCl₂重悬沉淀，4000rpm离心3分钟回收菌体，加入用冰预冷的0.1mol/L CaCl₂，重悬细胞沉淀，放置4℃保存；

⑦转化：上述步骤⑥制备好的脯氨酸营养缺陷型大肠杆菌(E.coli)JM83[F-ara，Δ(lac-proAB)，rpsl(Φ80lacZΔM15)]感受态细胞，加入连接产物3μl，混匀，在冰上放置30分钟，将离心管置于预热至42℃的水浴中，放置90秒，将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却2分钟，加入LB液体培养基，37℃摇床，180rpm培养45分钟，取培养物涂布到含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养，筛选转化子，提取质粒，利用Xba I+Pst I双酶切筛选出阳性转化子；

C、proBA基因的克隆：

以枯草芽孢杆菌突变株(CCTCC NO：M203041，该菌株已申请专利)的染色体DNA为模板，采用上述步骤A中proA基因克隆引物进行PCR扩增，PCR反应条件步骤B，PCR产物纯化后经XbaI和Sac I双酶切，条件同步骤B，连接到同样双酶切的已经含有proB基因的pBE2载体上，转化大肠杆菌JM83，涂布Amp抗性平板，提取质粒经双酶切，筛选出阳性转化子，获得了含有proBA融合基因核苷酸序列的重组载体pBE2/proBA/MF，保藏编号：CCTCC NO：M203040。以含有融合基因的重组载体pBE2/proBA/MF为模板，采用的上游引物为：5′-GGCGGATCCGAAACTATGAAAAAG-3′，下游引物：5′-GCCTGCAGCTTAAAAAGACTATAC-3′；PCR产物经BamH I和Pst I双酶切并纯化后，连接到经同样双酶切纯化的表达载体pBV220上，转化大肠杆菌JM83；提取质粒，双酶切鉴定出阳性转化子，记为大肠杆菌(Escherichia coli)JM83，保藏编号：CCTCC NO：：204003。以含有融合基因的重组载体pBE2/proBA/MF为模板，采用上下游引物扩增融合基因，上游引物：5′-GGCGGATCCGAAACTATGAAAAAG-3′，下游引物为5′-GGCGAGCTCATCGT CAATCTCCCCGCACA-3′。反应条件为95℃，5分钟；94℃，30秒；55℃，1分钟；72℃，3分钟；共30个循环，最后72℃延伸10分钟；回收proBA融合基因，采用PstI和Sac I限制性酶酶切，与采用同样酶切的pMD1质粒连接，转化转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性转化子，记作大肠杆菌(Escherichia coli DH5α)，pMD1/proBA/MF，CCTCCNO：M204002；提取重组载体转化根癌土壤杆菌LBA4404感受态细胞，并涂布在含有Kan的抗性平板上，筛选阳性转化子；转化子记作根癌土壤杆菌(Agrobacterium tunefacieus)LBA4404，pMD1/proBA/MF，CCTCC NO：M204001，此重组载体适于在双子叶植物中表达。

本发明还公开了具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列起渗透压调节作用的融合基因在转基因植物中的应用，转化了具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的渗透压调节融合基因的植物，可适应高盐渍化土地的正常生长，是将种植两周左右的拟南芥幼苗的整个植株浸泡在大量培养的CCTCC NO：M204001菌液中，利用渗透的方法使细菌细胞侵染拟南芥的花器官。收获F1代种子，在含有km的平板上筛选抗性植株。将抗性筛选得到的F1代种子种植到含有0.8％盐浓度的生根培养基上培育，与野生型拟南芥植株比较耐盐性能。将经过盐浓度筛选存活下来的F1代植株移植到蛭石中继续生长。并采用含有不同盐浓度的营养液浇灌，筛选出耐盐能力在2.0～3.5％的耐盐植株。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：一种含有融合基因的重组载体(pBE2/proBA/MF)在大肠杆菌中的表达，使宿主菌大肠杆菌JM83耐高盐胁迫能力达到了0.6M NaCl，比表达未修饰proBA基因的JM83提高了20％；一种含有融合基因的植物表达载体(pMD1/proBA/MF)在植物中的表达，该基因克服了以重叠基因方式组织的天然proB和proA基因在植物中表达时，由于基因的重叠，真核细胞不能识别原核基因的SD序列，使植物表达错误蛋白质序列的频率增加，影响植物耐更高渗透压胁迫的能力的缺点，使植物能够正确表达融合的proBA基因，从而能有效提高植物耐渗透压胁迫的能力，使双子叶植物拟南芥能够在2.0～3.5％盐浓度环境下生长。

一种含有proBA融合基因核苷酸序列的重组载体：，大肠杆菌(Escherichiacoli)JM83，pBE2/proBA/MF，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2003年5月13日，保藏编号：CCTCC NO：M203040。

一种含有proBA融合基因核苷酸序列的重组表达载体：大肠杆菌(Escherichiacoli)JM83，pBV220/proBA/MF，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2004年2月20日，保藏编号：CCTCC NO：M204003。

一种含有proBA融合基因的核酸序列的植物表达载体：大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α，pMD1/proBA/MF，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2004年2月20日，保藏编号：CCTCC NO：M204002；

一种含有proBA融合基因的核酸序列的植物表达载体：根癌土壤杆菌(Agrobacterium tuefaciens LBA4404)，pMD1/proBA/MF，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2004年2月20日，保藏编号：CCTCC NO：M204001。

附图说明

图1重组载体pBE2/proBA/MF构建图

图2proBA融合基因的构建示意图，

其中：GAG G为proA基因的SD序列，是插入的7个核苷酸

图3重组载体pMD1/proBA/MF结构图谱

具体实施方式

实施例

下面结合具体实施例。进一步阐述本发明，应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；陈正华主编，高等教育出版社，1986，木本植物组织培养及其应用；(联邦德国)赖纳特(REINERT，J.)，(英)约曼(YEOMAN，M.M.)著；尤瑞麟，王模善译，北京大学出版社，1988，植物细胞和组织培养实验手册；以及德)巴尔茨(W.Barz)等主编；夏镇澳等译，科学出版社，1983，植物组织培养及其在生物技术上的应用等书中所述的条件，或接照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选枯草芽孢杆菌抗脯氨酸结构类似物耐盐突变株

①将出发菌株枯草芽孢杆菌93151经亚硝基胍(NTG)诱变；

②经亚硝基胍(NTG)诱变后的细胞，涂布于含不同盐浓度的基本培养基(MM)上，筛选耐盐突变株；

③将筛选出的耐盐突变株涂布于含有0.04mM 3，4-脱氢脯氨酸(DHP)的MM培养基上，筛选抗脯氨酸结构类似物突变株；

④对筛选出来的菌株进一步测定其在不同盐浓度下的胞内自由脯氨酸含量，以获得抗脯氨酸反馈抑制突变株；

⑤用以上方法筛选出耐盐能力高达14％，在盐胁迫条件下以高产率产生脯氨酸作为相容溶质的突变株。

实施例2枯草芽孢杆菌抗脯氨酸结构类似物耐盐突变株proBA融合基因引物设计

在设计下游引物扩增proB基因时，通过在其最后一个氨基酸密码子AAA末端插入7个核苷酸ATCTAGA，引入一个限制性酶切位点，增加2个氨基酸—丝氨酸和精氨酸(图2)，去除了其终止密码子TGA，扩增出没有终止密码子的proB基因；其引物如下设计：

①proB基因克隆引物：

proBfp：5’-ggcctgcagacggagaaacta-3’(含PstI位点)

proBrp：5’-ggc

tttgttttccccctc-3’(含XbaI位点)

②proA基因克隆引物：

proAfp：5’-ggc

atgagtgaagtattg-3’(含XbaI位点)

proArp：5′-ggcgagctcatcgtcaatctccccgcaca-3’(含Sac I位点)

实施例3融合proBA基因的克隆

A.融合proB基因的克隆

①proB基因的克隆：以菌株CCTCC NO：M203041的染色体DNA为模板，采用实施例1中proB基因克隆引物进行PCR扩增；

③Xba I和Pst I双酶切PCR产物，体系如下：

PCR products 8μl

10×T 2.5μl

BSA 2.5μl

Xba I 1μl

Pst I 1μl

水 10μl

总体积 25μl

④提取pBE2表达载体，Xba I和Pst I分别双酶切pBE2，体系如下：

pBE2 20μl

10×T 5μl

BSA 5μl

Xba I 2μl

水 18μl

总体积 50μl；

先利用Xba I 37℃单酶切3小时后，补加2μl PstI，同时相应的补加各成分，使反应体系为55μl，再反应3小时后，全部酶切反应样品电泳回收；

10×Ligation buffer 1μl

T4Ligase 1μl

pBE2(Xba I+Pst I酶切产物) 1μl

PCR products(Xba I+Pst I酶切产物) 4μl

水 3μl

总体积为10μl，过夜连接14h；

⑥大肠杆菌感受态细胞的制备：从LB平板上挑选大肠杆菌单菌落，接种到LB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜活化，转接继续培养至OD₆₀₀为0.5，将培养液转移到离心管中，冰浴中冷却10分钟后，4000rpm离心3分钟，回收菌体，加入预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬沉淀，4000rpm离心3分钟回收菌体，加入用冰预冷的0.1mol/L CaCl₂，重悬细胞沉淀，放置4℃保存；

⑦转化：上述步骤⑥制备好的脯氨酸营养缺陷型E.coli JM83[F-ara，Δ(lac-proAB)，rpsl(Φ80lacZΔM15)]感受态细胞，加入连接产物3μl，混匀，在冰上放置30分钟，将离心管置于预热至42℃的水浴中，放置90秒，将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却2分钟，加入LB液体培养基，37℃摇床，180rpm培养45分钟，取培养物涂布到含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养，筛选转化子，提取质粒，利用Xba I+Pst I双酶切筛选出阳性转化子；

B、proBA基因的克隆及含融合基因重组载体构建

以菌株CCTCC NO：M203041的染色体DNA为模板，采用上述实施例1中proA基因克隆引物进行PCR扩增，PCR反应条件步骤A，PCR产物纯化后经XbaI和Sac I双酶切，条件同步骤B，连接到同样双酶切的已经含有proB基因的pBE2载体上，转化大肠杆菌JM83，涂布Amp抗性平板，提取质粒经双酶切，筛选出阳性转化子，获得了重组载体pBE2/proBA/MF，CCTCC NO：M203040。

实施例4proBA融合基因的功能互补鉴定

①将通过质粒双酶切，鉴定为含有proBA融合基因的JM83转化子单菌落划线接种到MM培养基，37℃培养，待菌落长出后，重新划线接种到MM培养基上，以进一步鉴定；将获得的转化子E.coli JM83接种在不同盐浓度的MM培养基上，测定其最高耐盐能力和胞内自由脯氨酸含量；

②表达pBE2/proBA/MF的转化子最高耐盐能力可提高到0.6M NaCl，而表达pBE2/proBA/M的转化子却最高只能耐0.5M NaCl；而在同一盐浓度下，表达pBE2/proBA/MF的细胞均比表达pBE2/proBA/M的细胞生长的延迟期要短，达到稳定期的时间要快，证明其的生长的要快，代时要短；以上结果说明融合基因确实提高了JM83细胞的耐高渗胁迫能力。

实施例5proBA融合基因表达产物的检测

A.proBA融合基因表达载体的构建

以pBE2/proBA/MF为DNA模板，设计引物，扩增proBA融合基因；上游引物为：5′-GGCGGATCCGAAACTATGAAAAAG-3′，下游引物：5′-GCCTGCAGCT TAAAAAGACTATAC-3′；PCR产物经BamH I和Pst I双酶切并纯化后，连接到经同样双酶切纯化的表达载体pBV220上，转化大肠杆菌JM83；提取质粒，双酶切鉴定出阳性转化子，即为大肠杆菌(Escherichia coli)JM83，pBV220/proBA/MF，CCTCC NO：204003；

B.胞内蛋白质样品制备

挑取转化子JM83(pBV220/proBA/MF)单菌落，接种到含有Amp的LB液体培养基中，30℃过夜培养后，按1％接种量转接，培养至OD₅₅₀值0.4时，立即转到热诱导温度42℃，继续培养4小时后，离心收集菌体，加样缓冲液重悬菌体，100℃煮沸5分钟，10000rpm离心，取上清10μl上样，进行SDS-PAGE电泳，proBA融合基因的SDS-PAGE电泳结果显示有一条约85kD的新蛋白带产生在40kD处的ProB蛋白质带消失，但45kD处表达ProA的蛋白质带仍旧存在。

实施例6大肠杆菌JM83转化子耐高渗胁迫能力的测定

①分别挑取JM83(pBE2-proBA/M)和JM83(pBE2-proBA/MF)单菌落，接种到10ml含有Amp抗性的LB液体培养基中，37℃培养10h；

②离心收集菌体，用1ml MM培养基洗涤两次后，按1/50的比例转接到MM液体培养基中，37℃培养约12h至对数生长后期；

③再按适当比例转接到含不同NaCl浓度(0.3M，0.4M，0.5M，0.6M)的MM培养基中，37℃，220r/min震荡培养；

④每2h测定一次OD₅₅₀值，以培养时间为横坐标，以OD₅₅₀值为纵坐标，绘制生长曲线。

⑤随着盐浓度的上升，JM83(pBE2-proBA/MF)和JM83(pBE2-proBA/M)生长的延迟期和到达稳定期的时间延长。而在同一盐浓度下，JM83(pBE2-proBA/MF)均比JM83(pBE2-proBA/M)生长的延迟期和达到稳定期的时间要短，证明其生长更快，代时要短。JM83(pBE2-proBA/MF)最高耐盐能力为0.6M NaCl，而JM83(pBE2-proBA/M)最高只能耐0.5M。

实施例7 胞内自由脯氨酸测定

将JM83(pBE2-proBA/MF)和JM83(pBE2-proBA/M)分别接种在含0.5MNaCl浓度MM培养基中培养，测定了培养12h时，细胞的胞内自由脯氨酸含量；结果显示JM83(pBE2-proBA/MF)的胞内自由脯氨酸含量为200.63μg/g细胞，而JM83(pBE2-proBA/M)胞内自由脯氨酸含量仅为130.03μg/g细胞。

实施例8重组植物表达载体构建和阳性克隆子筛选

①以含有融合基因的重组载体pBE2/proBA/MF为模板，设计上下游引物扩增融合基因，上游引物：5′-GGCGGATCCGAAACTATGAAAAAG-3′，下游引物为5′-GGCGAGCTCATCGTC AATCTCCCCGCACA-3′；

②反应条件为95℃，5分钟；94℃，30秒；55℃，1分钟；72℃，3分钟；共30个循环，最后72℃延伸10分钟；

③回收proBA融合基因片段，PCR产物采用BamH I和Sac I限制性酶双酶切回收后，与采用同样酶切的pMD1表达载体连接，连接体系为：

proBA/BamHI+SacI 2μl

pMD1/BamHI+SacI 6μl

10×Ligation buffer 1μl

T4 Ligase 1μl

总体积 10μl

④16℃连接14小时后，取冷CaCl₂法制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在含有Kan抗性(50μg/ml)的LB培养基上，37℃培养，质粒双酶切鉴定出阳性转化子；

⑤转化子记为大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α，pMD1/proBA/MF，CCTCCNO：M204002。

实施例9根癌土壤杆菌LBA4404感受态细胞的制备与重组载体转化

①将根癌土壤杆菌LBA4404单菌落，接到含有利福平(100μg/ml)的YEB液体培养基中，培养24小时活化；

②1％转接到同样的培养基中，继续培养约7小时后，菌液冰浴30分钟，5000rpm，5分钟，去上清，加入1ml0.15M的NaCl重悬；

③5000rpm，5分钟离心，去上清，加入200μl20mM的CaCl2悬浮，4℃冰箱中放置12-24h；

④将从大肠杆菌DH5α中提纯pMD1-proBA/MF质粒加入此根癌土壤杆菌感受态细胞中，冰浴30分钟；

⑤液氮中放置5分钟，37℃水中复苏5分钟后，加入YEB培养基复苏6小时；将菌液全部涂布在含有利福平(100μg/ml)和卡那霉素抗性(50μg/ml)的YEB固体培养基上，筛选转化子，利用PCR的方法检测出阳性转化子；

⑥转化子记作根癌土壤杆菌(Agrobacterium tuefaciens)LBA4404(pMD1/proBA/MF)，专利菌种保藏号：CCTCC NO：M204001。

实施例10拟南芥的栽培及转化

A.拟南芥的栽培

①装满蛭石容器，用Horgland营养液浸湿后，接种拟南芥种子到蛭石中；放在一个较大的盆子中，保持盆底有水；

②4℃春化48小时后移到日光灯下培养；

③约8周，拟南芥开始开花，在刚刚开花，只形成1-2个角果时，可进行转化。

B.拟南芥的转化与种子的收获

①取LBA4404(pMD1/proBA/MF)细胞接种到含有利福平(100μg/ml)和卡那霉素抗性(50μg/ml)的YEB液体培养基中，培养24小时；

②5500rpm离心，去上清，细胞用转化介质重悬；

③将种植两周左右的拟南芥幼苗基部以上部分全部倒置，将花浸泡到菌液中3～5分钟；

④取出拟南芥，放置在暗处闭光培养过夜，外罩黑罩避光；

⑤第二天，解开罩子，光照下培养约一个月；

⑥待荚果成熟变黄时，将植株全部套在信封里，倾斜培养，此时停止浇水，直到植株枯黄时收集种子，-20℃冰箱中保存。

C.拟南芥转基因苗的筛选

①取相当于100μl体积的种子于离心管中；

②加入1ml 70％的无水乙醇，1分钟后，离心，去除乙醇；

③加入1ml双蒸水重悬种子，6000rpm 5秒钟离心，去上清；

④加入1ml 10％的NaClO，重悬种子，并放置5分钟，6000rpm离心5秒钟，去上清；

⑤用无菌水重复洗涤4次；

⑥加入0.1％的琼脂粉溶液重悬，移至含有卡那霉素的筛选平板上，均匀的平铺，使水尽可能的吸干；

⑦4℃春化2天，移至灯光下，保证充分的光照；

⑧约20天，可观察到大部分苗变黄，变白直至死亡，而少量的绿苗生长良好；

⑨将经过盐浓度筛选存活下来的F1代植株移植到蛭石中继续生长；

⑩采用含有不同盐浓度的营养液浇灌，筛选出耐盐能力在2.0～3.5％的耐盐植株。

SEQUENCE LISTING

<110>武汉大学

<120>融合的渗透压调节基因和蛋白质及制备方法和应用

<130>融合的渗透压调节基因和蛋白质及制备方法和应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2364

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌

<400>1

atgaaaaagc agagaattgt tgtgaaaatc gggagcagct cgctcacaaa cagtaacgga 60

agtattgatg aagccaaaat caaggagcat acggaagcca tttcattatt aaaagaaaac 120

gggcatgaag taatcctcat tacctcaggc gcggtggcag ccggtttttc cgctctcggc 180

tatccggcgc gccccgttac gataaaagga aagcaggcag ccgccgcggt cggccagacg 240

cttttaatgc agcaatatat ggaccattta aaaagatacg gtctgacgcc ggcgcaaatt 300

ttattaacaa gaaatgattt ctcaaaaaga gagcggtaca gaaatgcgta tgccacggta 360

atggaattat tggagcgggg agtcgtgccg attattaatg agaatgattc cacatcagtc 420

gaagaactga cgttcggaga taatgacatg ctgtcggcgc ttgtgagcgg cctgattcat 480

gcagaccaat taatgattct cacagacatt aacgggctgt acgatgccaa tccgaatgaa 540

aaccctgacg caaagcggtt tgactatttg actgacatta cacctgaatt gctcgggtat 600

gccggatcag cgggctcgaa ggtcggcacc ggaggcatga agtcaaaact tctcgctgcc 660

cagaccgcat tgtcgctcgg agttaaggtg tttatcggaa ccggtgccgg acgggaaaaa 720

ctgaaggtga ttttagacgg taaaggcgac ggcacatata tcggtgataa agagctgtcc 780

accgtcaata atacacggca atggatcatg tttcattctc cgatatcagg ggaaatcatc 840

attgatgggg gagcggagca ggcgatgatc cataacggct caagtctcct tccggccggt 900

gtcgccgatg tctgcggcag ttttccgaaa ggggccgtgg tggaagtcag aggtcccggc 960

ggcatcatcg gcaaagggca gacgcattac tcatccgatg agattttgga agccaaaggg 1020

aagcggagcg atcagcttcc gggcgcgaag caggtggaag tgattcacag aaatgattgg 1080

gtgaatttat ttgacgaggg ggaaaacaaa tctagaatga gtgaagtatt gcaaaaagct 1140

gccttggcaa aagaagcggc tgccgaaatg gtcatgaaaa cgactgctga aaaaaacgaa 1200

gcgctccaat gtattgcaga cggactcaga aatgaacgcc agctgatttt aacagagaat 1260

cagaaagata ttgaagcggg acagaaaaga gggctgacac ctgacattat tgacaggctg 1320

actcttgatg aaaaacgcct gctcgatatc gcggatgctg tagaactgtt aatcggtctg 1380

gaagatcccg tcggtgaatc attggagacc attcaaaaag agaatggatt atccattgaa 1440

aaaatccgcg tgcccctcgg agtagtgggc atgatctatg aagccagacc gaatgttacc 1500

gtagacgctg ccacactttg cctgaaaacc ggaaacgcgg ttgtgctcag aggaagttcg 1560

tcagccatcc acagcaacaa agcgcttgtc agtgtgatga aacgcgcact gggactgtca 1620

aagcttccga ttgatgccgt tcagctcata gaagatacaa gcaaagaaac cgcgaaacag 1680

ctcttcacat taaatgacgg gctggatgta ttgatcccgc gcggcggcaa aaatttgatt 1740

gatctggtgg tcagggaatc aaccgtaccc gtgttagaaa ccggagcggg caactgccac 1800

gtgtacatag atgagtcagc agatcccgat atggcaagag atgtcgtcat caacgccaaa 1860

acacagcggc cttctgtctg caatgcgatt gaatctcttt tgattcatga aaaatgggcg 1920

gaagtacacg gacgaaagct gctgaatcag ctgacagaaa aaggggtgga gctacgcgga 1980

gatcagatga tttgcgagct ggagcctaat gcgaaacaag ccgaagaggc cgattgggga 2040

gcggaatacc tggcgccgat tctcagtgta aaaacggtgc atgacgtaca ggaggcggtc 2100

cgccacattc agcagtacgg cacaaaccat tcagaagcca ttctgacgga aaacggtgag 2160

catgccgctt acttccagac agccgttgac gccgccgccg tgtatcataa tgcttccaca 2220

cggtttacag acggctttga attcgggtac ggagccgaaa tcggcatcag cacgcaaaag 2280

cttcacgcga gaggaccgat ggggcttccg gcgttaacat ctacaaaaat cattattaaa 2340

ggaaacggac gaatccgcgt atag 2364

<210>2

<211>787

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌

<400>2

Met Lys Lys Gln Arg Ile Val Val Lys Ile Gly Ser Ser Ser Leu Thr

1 5 10 15

Asn Ser Asn Gly Ser Ile Asp Glu Ala Lys Ile Lys Glu His Thr Glu

20 25 30

Ala Ile Ser Leu Leu Lys Glu Ash Gly His Glu Val Ile Leu Ile Thr

35 40 45

Ser Gly Ala Val Ala Ala Gly Phe Ser Ala Leu Gly Tyr Pro Ala Arg

50 55 60

Pro Val Thr Ile Lys Gly Lys Gln Ala Ala Ala Ala Val Gly Gln Thr

65 70 75 80

Leu Leu Met Gln Gln Tyr Met Asp His Leu Lys Arg Tyr Gly Leu Thr

85 90 95

Pro Ala Gln Ile Leu Leu Thr Arg Asn Asp Phe Ser Lys Arg Glu Arg

100 105 110

Tyr Arg Asn Ala Tyr Ala Thr Val Met Glu Leu Leu Glu Arg Gly Val

115 120 125

Val Pro Ile Ile Ash Glu Asn Asp Ser Thr Ser Val Glu Glu Leu Thr

130 135 140

Phe Gly Asp Asn Asp Met Leu Ser Ala Leu Val Ser Gly Leu Ile His

145 150 155 160

Ala Asp Gln Leu Met Ile Leu Thr Asp Ile Asn Gly Leu Tyr Asp Ala

165 170 175

Asn Pro Ash Glu Asn Pro Asp Ala Lys Arg Phe Asp Tyr Leu Thr Asp

180 185 190

Ile Thr Pro Glu Leu Leu Gly Tyr Ala Gly Ser Ala Gly Ser Lys Val

195 200 205

Gly Thr Gly Gly Met Lys Ser Lys Leu Leu Ala Ala Gln Thr Ala Leu

210 215 220

Ser Leu Gly Val Lys Val Phe Ile Gly Thr Gly Ala Gly Arg Glu Lys

225 230 235 240

Leu Lys Val Ile Leu Asp Gly Lys Gly Asp Gly Thr Tyr Ile Gly Asp

245 250 255

Lys Glu Leu Ser Thr Val Asn Asn Thr Arg Gln Trp Ile Met Phe His

260 265 270

Ser Pro Ile Ser Gly Glu Ile Ile Ile Asp Gly Gly Ala Glu Gln Ala

275 280 285

Met Ile His Asn Gly Ser Ser Leu Leu Pro Ala Gly Val Ala Asp Val

290 295 300

Cys Gly Ser Phe Pro Lys Gly Ala Val Val Glu Val Arg Gly Pro Gly

305 310 315 320

Gly Ile Ile Gly Lys Gly Gln Thr His Tyr Ser Ser Asp Glu Ile Leu

325 330 335

Glu Ala Lys Gly Lys Arg Ser Asp Gln Leu Pro Gly Ala Lys Gln Val

340 345 350

Glu Val Ile His Arg Asn Asp Trp Val Asn Leu Phe Asp Glu Gly Glu

355 360 365

Asn Lys Ser Arg Met Ser Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Leu Ala Lys

370 375 380

Glu Ala Ala Ala Glu Met Val Met Lys Thr Thr Ala Glu Lys Asn Glu

385 390 395 400

Ala Leu Gln Cys Ile Ala Asp Gly Leu Arg Asn Glu Arg Gln Leu Ile

405 410 415

Leu Thr Glu Asn Gln Lys Asp Ile Glu Ala Gly Gln Lys Arg Gly Leu

420 425 430

Thr Pro Asp Ile Ile Asp Arg Leu Thr Leu Asp Glu Lys Arg Leu Leu

435 440 445

Asp Ile Ala Asp Ala Val Glu Leu Leu Ile Gly Leu Glu Asp Pro Val

450 455 460

Gly Glu Ser Leu Glu Thr Ile Gln Lys Glu Asn Gly Leu Ser Ile Glu

465 470 475 480

Lys Ile Arg Val Pro Leu Gly Val Val Gly Met Ile Tyr Glu Ala Arg

485 490 495

Pro Asn Val Thr Val Asp Ala Ala Thr Leu Cys Leu Lys Thr Gly Asn

500 505 510

Ala Val Val Leu Arg Gly Ser Ser Ser Ala Ile His Ser Asn Lys Ala

515 520 525

Leu Val Ser Val Met Lys Arg Ala Leu Gly Leu Ser Lys Leu Pro Ile

530 535 540

Asp Ala Val Gln Leu Ile Glu Asp Thr Ser Lys Glu Thr Ala Lys Gln

545 550 555 560

Leu Phe Thr Leu Asn Asp Gly Leu Asp Val Leu Ile Pro Arg Gly Gly

565 570 575

Lys Asn Leu Ile Asp Leu Val Val Arg Glu Ser Thr Val Pro Val Leu

580 585 590

Glu Thr Gly Ala Gly Asn Cys His Val Tyr Ile Asp Glu Ser Ala Asp

595 600 605

Pro Asp Met Ala Arg Asp Val Val Ile Asn Ala Lys Thr Gln Arg Pro

610 615 620

Ser Val Cys Asn Ala Ile Glu Ser Leu Leu Ile His Glu Lys Trp Ala

625 630 635 640

Glu Val His Gly Arg Lys Leu Leu Asn Gln Leu Thr Glu Lys Gly Val

645 650 655

Glu Leu Arg Gly Asp Gln Met Ile Cys Glu Leu Glu Pro Asn Ala Lys

660 665 670

Gln Ala Glu Glu Ala Asp Trp Gly Ala Glu Tyr Leu Ala Pro Ile Leu

675 680 685

Ser Val Lys Thr Val His Asp Val Gln Glu Ala Val Arg His Ile Gln

690 695 700

Gln Tyr Gly Thr Asn His Ser Glu Ala Ile Leu Thr Glu Asn Gly Glu

705 710 715 720

His Ala Ala Tyr Phe Gln Thr Ala Val Asp Ala Ala Ala Val Tyr His

725 730 735

Asn Ala Ser Thr Arg Phe Thr Asp Gly Phe Glu Phe Gly Tyr Gly Ala

740 745 750

Glu Ile Gly Ile Ser Thr Gln Lys Leu His Ala Arg Gly Pro Met Gly

755 760 765

Leu Pro Ala Leu Thr Ser Thr Lys Ile Ile Ile Lys Gly Asn Gly Arg

770 775 780

Ile Arg Val

785

Claims

1、一种分离的渗透压调节融合基因，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

2、权利要求1所述的分离的渗透压调节融合基因编码的融合蛋白，其具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

3、权利要求1所述的分离的渗透压调节融合基因的制备方法，它包括下列步骤：

A.引物设计：

①proB基因克隆引物：

proBfp：5’-ggcctgcagacggagaaacta-3’，

proBrp：5’-ggctctagatttgttttccccctc-3’；

②proA基因克隆引物：

proAfp：5’-ggctctagaatgagtgaagtattg-3’，

proArp：5′-ggcgagctcatcgtcaatctccccgcaca-3’；

B.融合proB基因的克隆

①proB基因的克隆：以枯草芽孢杆菌的染色体DNA为模板，采用上述proB基因克隆引物进行PCR扩增；

③Xba I和Pst I双酶切PCR产物，体系如下：

PCR products 8μl

10×T 2.5μl

BSA 2.5μl

Xba I 1μl

Pst I 1μl

水 10μl

总体积 25μl；

④用Xba I和Pst I分别双酶切pBE2，体系如下：

pBE 220μl

10×T 5μl

BSA 5μl

XbaI 2μl

水 18μl

总体积 50μl；

先利用XbaI 37℃单酶切3小时后，补加2μl PstI，同时相应的补加各成分，使反应体系为55μl，再反应3小时后，全部酶切反应样品电泳回收；

⑤利用DNA试剂盒纯化PCR产物后，用0.8％琼脂糖电泳检测，根据电泳带的亮度，初步确定连接所需的样品量，连接如下：

10×Ligation buffer 1μl

T4 Ligase 1μl

pBE2/Xba I+Pst I 1μl

PCR products/Xba I+Pst I 4μl

水 3μl

总体积为10μl，过夜连接14小时；

⑥脯氨酸营养缺陷型大肠杆菌JM83感受态细胞的制备，从LB平板上挑选大肠杆菌单菌落，接种到LB培养基中，37℃过夜振荡培养，转接继续培养至OD₆₀₀为0.5，将培养液转移到离心管中，冰浴中冷却10分钟后，4000rpm离心3分钟，回收菌体，加入预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬沉淀，4000rpm离心3分钟回收菌体，加入用冰预冷的0.1mol/L CaCl₂，重悬细胞沉淀，放置于4℃保存；

⑦转化，上述步骤⑥制备好的E.coli JM83感受态细胞中，加入连接产物3μl，混匀，在冰上放置30分钟，将离心管置于预热至42℃的水浴中，放置90秒，将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却2分钟，加入LB液体培养基，37℃摇床，180rpm培养45分钟，取培养物涂布到含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养，筛选转化子，提取质粒，利用Xba I+Pst I双酶切筛选出阳性转化子；

C、proBA基因的克隆：

以枯草芽孢杆菌的染色体DNA为模板，采用上述步骤A中proA基因克隆引物进行PCR扩增，PCR反应条件同步骤B；PCR产物纯化后经XbaI和Sac I双酶切，条件同步骤B；连接到同样双酶切的已经含有proB基因的pBE2载体上，转化大肠杆菌JM83，涂布Amp抗性平板，筛选转化子，提取质粒经双酶切，筛选出阳性转化子，获得了含有proBA融合基因的核苷酸序列的重组载体。

4、含有proBA融合基因核苷酸序列的重组载体，其为大肠杆菌(Escherichiacoli)JM83，pBE2/proBA/MF，CCTCC NO：M203040。

5、含有proBA融合基因核苷酸序列的重组表达载体，其为大肠杆菌(Escherichia coli)JM83，pBV220/proBA/MF，CCTCC NO：M204003。

6、权利要求5所述的含有proBA融合基因核苷酸序列的重组表达载体的构建方法，包括以下步骤：

以pBE2/proBA/MF为DNA模板，设计引物，扩增proBA融合基因；上游引物为：5′-GGCGGATCCGAAACTATGAAAAAG-3′，下游引物：5′-GCCTGCAGCTTAAAAAGACTATAC-3′；PCR产物经BamH I和Pst I双酶切并纯化后，连接到经同样双酶切纯化的表达载体pBV220上，转化大肠杆菌JM83提取质粒，双酶切鉴定出阳性转化子。

7、含有proBA融合基因核苷酸序列的植物表达载体，其为大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a，pMD1/proBA/MF，CCTCC NO：M204002。

8、权利要求7所述的含有proBA融合基因核苷酸序列的植物表达载体转化根癌土壤杆菌的方法，包括下列步骤：

A.以含有融合基因的重组载体pBE2/proBA/MF为模板，采用上下游引物扩增融合基因，上游引物：5′-GGCGGATCCGAAACTATGAAAAAG-3′，下游引物为5′-GGCGAGCTCATCGTCAATCTCCCCGCACA-3′；

B.反应条件为95℃，5分钟；94℃，30秒；55℃，1分钟；72℃，3分钟；共30个循环，最后72℃延伸10分钟；

C.回收proBA融合基因片段，PCR产物采用BamH I和Sac I限制性酶双酶切回收后，与采用同样酶切的pMD1表达载体连接，连接体系为：

proBA/BamHI+SacI 2μl

pMD1/BamHI+SacI 6μl

10×Ligation buffer 1μl

T4Ligase 1μl

总体积 10μl；

D.连接混合物16℃连接14小时后，取冷CaCl₂法制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞与之混合，转化步骤与权利要求3B⑦相同，涂布在含有卡那霉素抗性的LB培养基上，37℃培养，挑取单菌落，提取质粒双酶切，鉴定出阳性转化子。

9、含有proBA融合基因核苷酸序列的植物表达载体，其为根癌土壤杆菌(Agrobacterium tuefaciens)LBA4404，pMD1/proBA/MF，CCTCC NO：M204001。

10、权利要求9所述的含有proBA融合基因核苷酸序列的植物表达载体的构建方法，包括下列步骤：

①将根癌土壤杆菌LBA4404单菌落，接到含有利福平抗性的YEB液体培养基中，培养24小时活化；

②转接到同样的培养基中，继续培养7小时后，菌液冰浴30分钟，5000rpm，离心5分钟，去上清，加入0.15M的NaCl重悬；

③5000rpm，5分钟离心，去上清，加入20mM的CaCl₂悬浮，4℃冰箱中放置12-24小时；

④将从大肠杆菌DH5α中提纯的pMD1/proBA/MF质粒加入此根癌土壤杆菌感受态细胞中，冰浴30分钟；

⑤液氮中放置5分钟，37℃水中复苏5分钟后，加入YEB培养基复苏6小时；将菌液涂布在含有利福平和卡那霉素的YEB固体培养基上，筛选转化子；利用PCR的方法检测出阳性转化子。

11、权利要求1所述的分离的渗透压调节融合基因在转基因植物中的应用。