CN1252797A - 可待斯达汀a、b、c和d及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

分子式为C35H34O11的可待斯达汀A和B以及分子式为C35H34O12的可待斯达汀C和D具有抗糖尿病的活性。

Description

可待斯达汀A、B、C和D及其制备方法和用途
本发明涉及称为可待斯达汀(Kodaistatin)A、B、C和D的新化合物，其制备方法和用途。
肝葡萄糖输出比率增加是糖尿病的一般特征。尤其是在非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)中，空腹血糖量与肝葡萄糖的输出有明显的相关性。肝脏中葡萄糖由糖异生和肝糖原分解两条途径产生。两条途径的最后一步都由微粒体葡萄糖-6-磷酸酶催化，该酶是稳态调节血糖水平的关键酶。已知该酶的水平在糖尿病的实验和病理条件下均升高。该酶系统受干扰将导致肝产生葡萄糖的减少。
肝葡萄糖-6-磷酸酶是一个多组分系统，包含至少三个功能活性位点：葡萄糖-6-磷酸移位酶(T1)，葡萄糖-6-磷酸磷酸水解酶和磷酸/焦磷酸移位酶(T2)。葡萄糖-6-磷酸移位酶促进葡萄糖-6-磷酸转移至内质网(ER)内腔。磷酸水解酶，其活性位点位于ER的内表面，水解葡萄糖-6-磷酸，释放葡萄糖和磷酸至内腔。磷酸被磷酸/焦磷酸移位酶介导排出，葡萄糖排出的确切机制还不清楚。
葡萄糖-6-磷酸移位酶的高度底物专一性使其成为糖尿病治疗中药物的潜在作用位点。在生理性产生的磷酸糖中，只有6-磷酸葡萄糖被移位酶转移。相反，磷酸酶是非专一性的，已知能水解多种有机磷酸酯。A)文献中报道了一系列非特异性葡萄糖-6-磷酸酶抑制剂，如根皮苷[生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，242，1955-1960(1967)]、5，5’-二硫代-双-2-硝基苯甲酸[生物化学生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)，48，694-699(1972)]、2，2’-双异硫氰酸均二苯代乙烯和2-异硫氰酸-2’-乙酰氧基均二苯代乙烯[生物化学杂志，255，1113-1119(1980)]。第一个可作治疗用的葡萄糖-6-磷酸酶系统抑制剂公开于欧洲专利公开文本587087(申请号93114260.8)和587088(申请号93114261.6)。
现在发现，可待斯达汀A、B、C和D具有酶抑制剂活性，特别是针对葡萄糖-6-磷酸酶移位酶。
因此本发明的主题如下：
1)可待斯达汀A和可待斯达汀B，其是分子式为C35H34O11的化合物，和它们的药学可接受的盐、酯、醚以及它们的明显的化学等效物。
可待斯达汀B具有至今未报道的新结构，由一个O-对苯二酚、苯酚、不饱和γ-内酯、二羟基-环戊烯酮和α，β，γ，δ-不饱和羰基部分形成，是可待斯达汀A的一个非对映体。
可待斯达汀A和B是具有结构式I的化合物：
Figure A9880420100051
本发明也涉及：
2)可待斯达汀C和可待斯达汀D，其是分子式为C35H34O12的化合物，及其药学可接受的盐、酯、醚和明显的化学等效物。
可待斯达汀C具有至今未报道的新结构，由O-对苯二酚、不饱和γ-内酯、二羟基-环戊烯酮和α，β，γ，δ-不饱和羰基部分形成。可待斯达汀D是可待斯达汀C的一个非对映体。
可待斯达汀C和可待斯达汀D的结构式不同于上面所给的结构式I，添加了(特别最常见在末端苯环A的6位)一个羟基。
因此，本发明涉及所有可待斯达汀的立体异构体以及它们的混合物。单个的立体异构体可通过已知的方法如正相色谱、阴离子交换色谱、HPLC和选择结晶进行分离。
生理耐受性的盐(如钠、钾、铵盐)、酯(如有机酸酯)以及化学等效物(氧化产物、加成产物如水化物)的制备方法是本领域熟练技术人员所熟知的。
本发明的另一个目的是提供一个从HIL-051652号培养物及它们的突变体和变种中制备新化合物可待斯达汀A、B、C和D的方法。所述的方法包含培养HIL-051652号培养物及它们的突变体和变种，在有氧的条件下于含碳源、氮源和营养性无机盐的培养基中培养后，从培养基滤液中分离、纯化所述的化合物。
培养基包含碳源、氮源、无机盐和任选的微量元素。碳源可为如淀粉、葡萄糖、蔗糖、糊精、果糖、糖蜜、甘油、乳糖或半乳糖，优选为淀粉。氮源有如大豆粉、花生粉、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、胰胨、麦芽提取物、玉米浆、白明胶或酪蛋白氨基酸，优选胰胨和酵母膏。营养无机盐为如磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、氯化钠、氯化钙、碳酸钙、硝酸钾、硫酸铵或硫酸镁，优选氯化钠和碳酸钙。
HIL-051652号培养物在25-30℃，pH6.0-8.0的条件下培养。优选地在温度为25℃(±1℃)、pH约7.0下培养HIL-051652培养物。
优选发酵进行40-90小时，至获得本发明的化合物的最佳产率。尤其优选深层发酵45-70小时，如摇瓶发酵及在实验室发酵罐中发酵。如需要，在发酵过程中可使用消泡剂如Desmophen(聚环氧丙烷，Bayer AG，Leverkusen，德国)。发酵和可待斯达汀A、B、C和D形成进程可通过测定微滴定板中未处理的和TritonX-100破坏的大鼠肝微粒体中6-磷酸葡萄糖的活性和HPLC来监测，方法是在室温下用酶学方法，174，58-67(1989)中描述的比色分析法的改进方法。在所得的培养基中，可待斯达汀B、C和D是次要化合物，可待斯达汀A是主要化合物。活性粗品的回收是通过用可与水混溶的溶剂如甲醇、乙醇和丙酮从菌丝体中提取、用与水不混溶的溶剂如乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿或丁醇在pH5-8条件下从发酵液过滤液中提取，或用聚合物树脂如“Diaion HP-20”(三菱化工，日本)、“AmberliteXAD”(Rohm and Haas Industries，美国)活性炭的疏水作用色谱或离子交换色谱于pH5-8从发酵液过滤液中提取。优选的方法是用“Diaion HP-20”吸附，然后用洗脱液解吸附，洗脱液有水、甲醇、丙酮或乙腈或它们的混合物。浓缩和冻干活性洗脱液得到粗品化合物。
粗品可用如下任何一种技术进一步纯化：正相色谱(用氧化铝或硅胶作固定相，用如乙酸乙酯、氯仿、甲醇或它们的混合物作洗脱液)；反相色谱(用反相硅胶如二甲基十八烷基硅烷基硅胶，即RP-18或二甲基辛烷基硅烷基硅胶即RP-8作固定相，用如水、缓冲溶液如磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐(pH2-8)缓冲溶液和有机溶剂甲醇、乙腈或丙酮、或这些溶剂的混合物作洗脱液)；凝胶过滤色谱(用树脂如SephadexLH-20(Pharmacia化学工业，瑞典)，TSKgel’Toyoperal HW-40F’(Tosohaas，Tosoh公司，日本)在如甲醇、氯仿或乙酸乙酯及它们的混合物的溶剂中，或者在水中的”SephadexG-10”、”SephadexG-25”；或通过离子交换色谱，优选阴离子交换色谱；或逆流色谱，利用两或多种溶剂如水和氯仿组成的双相溶剂系统。这些技术可重复使用，也可使用不同技术的组合。优选的方法是先用Toyopearl色谱分离然后用反相改性硅胶(RP-18)。
用于制备可待斯达汀A、B、C和D的微生物从在Kodaikanal，TamiNadu，印度采集的土壤样品中分离，培养号Y-93，02839(HIL-051652)，以后称HIL-051652。微生物HIL-051652经鉴定是土曲霉。于1996年10月21日保藏于德意志微生物保藏中心，德国，Braunschweig，保藏号DSM 11247。
可待斯达汀A、B、C和D能有效的抑制大鼠肝微粒体葡萄糖-6-磷酸移位酶的活性。它们大约的IC50值如下：
可待斯达汀A：                            0.2μg/ml(约300nM)
可待斯达汀B：                            0.3μg/ml
可待斯达汀C：                            0.09μg/ml
可待斯达汀D：                            0.5μg/ml
相反，可待斯达汀A抑制去污剂破坏的微粒体中磷酸酶活性，IC50约为200μg/ml(约300μM)，说明对移位酶有高度的专一性。而且可待斯达汀A不影响磷酸/焦磷酸移位酶的活性。可待斯达汀A是葡萄糖-6-磷酸移位酶的一个可逆的竞争性抑制剂。
于分离的大鼠肝细胞中进一步研究可待斯达汀A对葡萄糖输出的影响。其能抑制果糖诱导的糖异生和胰高血糖素诱导的肝糖原分解，IC50分别为约25μg/ml和50μg/ml。
因此，本申请的另一个内容是：可待斯达汀A、B、C和D作为药物的用途，和可待斯达汀A、B、C和D用于具有抗糖尿病作用的药物生产中的用途。本申请还有一个内容是提供分别包含活性量的可待斯达汀A、B、C和D的药物。
可待斯达汀的药物制剂、施用方法以及剂量范围根据治疗的疾病种类和各疾病/失调的具体情况而定，可用本领域熟知的方法优化。在这方面，可参考上述段落A)所引用的文献。可待斯达汀A、B、C和D可口服、肌肉注射或静脉注射。它们可通过将化合物与一种或多种可药用的佐剂和/或赋型剂混合，制成合适的给药形式，如片剂、包衣片、胶囊或溶液或适于非肠道给药的混悬液。赋性剂有填充物、乳化剂、润滑剂、掩味剂、着色剂或缓冲物质。
可能提及的佐剂和/或赋型剂的实例有西黄蓍胶、乳糖、滑石粉、琼脂、聚乙二醇、乙醇和水。合适的以及优选的非肠道给药制剂是水溶液或混悬液。也可不用溶媒或稀释剂以合适的形式，比如装在胶囊中施用活性物质。
这些化合物可制成它们的药学可接受的衍生物如酯和醚。酯可通过将该化合物与羧酸在催化剂作用下反应制得，或将该化合物与酰化剂如酰氯反应制得。其它制备酯的方法可见于文献中，例如高等有机合成，第四版，J.March，John Wiley & Sons，1992。
醚可通过将该化合物与烷基化试剂在碱性条件下反应制得。其它制备醚的方法可见于文献中，例如高等有机合成，第四版，J.March，John Wiley & Sons，1992。
下面的实施例是本发明的说明，但并不限定其范围：实施例I从土壤中分离培养物HIL-051652(a)分离培养基的组成(沙保弱氏琼脂)蛋白胨：                10.0g葡萄糖：                40.0g琼脂：                  13.0g去离子水：              1.0升pH：                    7.0(b)土样铺碟和分离
10克采集于Kodaikanal，Tami Nadu，印度的土壤样品加入装有90ml无菌去离子水的250ml锥形瓶中，于旋转摇床上振摇2小时(220转/分)。上述土壤混悬液按十倍逐级稀释至10-5。从最后稀释液中取1ml混悬液置于无菌的玻璃培养皿(直径15cm)中心，再倒入约50ml添加了50μg/ml氯霉素和0.5％丙酸钠的上述分离培养基。培养基冷却至45℃，充分旋转培养皿。土壤混悬液和培养基混合物凝固后于25℃(±1℃)培养7天。定期观察该培养皿，从生长的微生物中分离培养物HIL-051652。实施例II培养物HIL-051652的维持培养物HIL-051652维持在实施例I所述的沙保弱氏琼脂上
加热完全溶解上述组分，分装于试管中于121℃灭菌20分钟。试管冷却，倾斜放置至固化。在琼脂斜面用金属环划上生长的培养物HIL-051652，25℃(±1℃)培养，直至观察到生长良好。生长好的培养物保存于8℃冰箱中。实施例III在摇瓶中培养物HIL-051652的发酵种子培养基的组成：淀粉：                    15.0g葡萄糖：                  5.0g大豆粉：                  15.0g酵母膏：                  2.0g玉米浆：                  1.0gNaCl：                    5.0gCaCO3：                  2.0g去离子水：                1.0升pH：                      6.8
上述种子培养基分成每份80ml，装于500ml锥形瓶中于121℃高压灭菌20分钟，冷却至室温。每瓶接种满环上述实施例II的生长良好的培养物，在旋转摇床上于25℃(±1℃)240转/分振摇72小时，得到种子培养物。发酵培养基的组成淀粉：                    24.0g葡萄糖：                    15.0g胰胨：                      5.0g酵母膏：                    5.0g牛肉膏：                    3.0gCaCO3：                    4.0g去离子水：                  1.0升pH：                        6.5
发酵培养基分成每份60ml，装于500ml锥形瓶中于121℃高压灭菌20分钟，冷却至室温，接种上述种子培养物(1％v/v)。在旋转摇床上于25℃(±1℃)240转/分发酵40-48小时。
活性化合物的产生通过测定葡萄糖-6-磷酸移位酶的抑制来监测。发酵结束后将培养基离心，按实施例V所述从培养基滤液中分离并纯化可待斯达汀A、B、C和/或D。实施例IV在发酵罐中发酵培养物HIL-051652阶段1：在摇瓶中制备种子培养物
实施例III的种子培养基分成每份160ml，装于1L锥形瓶中高压灭菌20分钟。种子培养物按实施例III所述于这些摇瓶中生长。阶段2：在发酵罐中制备种子培养物
按实施例III所述，75升种子培养基装于100升Marubishi发酵罐中在原地于121℃灭菌45分钟，冷却至25±1℃，接种入3升上述种子培养物。发酵参数如下：
温度：    25℃(±0.5℃)
搅拌：    80转/分
通气：        50升/分
收获时间：    50小时阶段3：大规模发酵
750升如实施例III所述的发酵培养基装入1000升Marubishi发酵罐中，同时加入175ml Desmophen(聚环氧丙烷)做消泡剂，在原地于121℃灭菌45分钟，冷却至25±1℃，接种入75升来源于阶段2的种子培养物。发酵参数如下：
温度：        25℃(±0.5℃)
搅拌：        50转/分
通气：        350升/分
收获时间：    40-44小时
活性化合物的产生通过测定葡萄糖-6-磷酸移位酶的抑制来监测。发酵结束后培养基的pH为6.0-7.0。收获后将培养基离心，按实施例V所述从培养基滤液中分离葡萄糖-6-磷酸移位酶抑制剂可待斯达汀A、B、C和/或D。实施例V可待斯达汀A、B、C和/或D的分离和纯化：
将约1000升所得的肉汤培养基离心，与菌丝体(110公斤)分离。菌丝体和滤液中均含有可待斯达汀A、B、C和D。滤液(830升)与菌丝体的30％甲醇水溶液提取液(330升)合并，通过Diaion HP-20柱(35升，3％v/v)。柱子以去离子水(50升)充分冲洗，然后以台阶梯度的CH3CN水溶液洗脱。洗脱用10％CH3CN(90升)和30％CH3CN(90升)完成，级分以15升量器收集。合并用30％CH3CN洗脱获得的活性组分(3×15升)。于10-100毫米汞柱35℃减压浓缩，冻干得活性粗品(225g)可待斯达汀A的IC50为25μg/ml。
所得的粗品随后以两个连续的凝胶渗透色谱分离，固定相TSKgelToyopearl HW-40F，根据底物改变凝胶比率。上述粗品分成15份，每份15克分别通过装有Toyopearl HW-40F(1.5升)的Latek-SulenM6-48玻璃柱。流动相是10％CH3CN水溶液，流速维持在10ml/分钟，压力3-5巴。级分收集在250ml体积。合并活性洗脱液，于10-100毫米汞柱35℃减压浓缩，冻干得浓缩的活性物质(3.0g)，可待斯达汀A的IC50为1-1.5μg/ml。
将上述浓缩的物质进一步分成10份，每份300毫克，分别通过装有Toyopearl HW-40F(500毫升)的Latek-Sulen M4-48玻璃柱。流动相是10％CH3CN水溶液，流速维持在1.5-2.0ml/分钟。级分收集于20ml量器中。合并所有活性级分，于10-100毫米汞柱压力下35℃浓缩，冻干得包含活性物质可待斯达汀A的半纯化物质，可待斯达汀A是主要化合物，IC50为0.375μg/ml，可待斯达汀B、C和/或D是次要化合物(0.85g)。
可待斯达汀B、C和D最后从可待斯达汀A中分离，流动相流速8ml/分钟，于294nm检测，获得纯的可待斯达汀B(0.004g)、可待斯达汀C(0.011g)和可待斯达汀D(0.004g)。
可待斯达汀B、C和D的纯度用HPLC(高压液相色谱)检测，色谱柱为LiChrocart-250-4 RP Select B(5μ)，于40℃利用20分钟内从0.1％磷酸水溶液(pH2.5)到CH3CN的梯度洗脱，流速1ml/分钟，于294nm处紫外检测。
所得的半纯化可待斯达汀A最后用制备型HPLC纯化，色谱柱为16×250mm的Eurosphere C-18(10μ)，用20％CH3CN水溶液作流动相，流速8ml/分钟，紫外检测波长294nm，获得纯可待斯达汀A(0.14g)，IC50为0.2μg/ml。
可待斯达汀A的物理化学性质和光谱特性总结于表1和1A，可待斯达汀C见表2，可待斯达汀B见表3，可待斯达汀D见表4。表1可待斯达汀A性状：            黄色固体溶解性：          MeOH，CH3CN，和DMSO熔点：            ＞200℃(分解)[α]D：          -85.7°(c 0.042，甲醇)高压液相色谱：    保留时间：7.3分钟(HPLC)            色谱柱：[4mm×(30+250)mm]ODS-Hypersil(5μ)
              洗脱剂：CH3CN-H2O(20∶80)
              流速：1ml/分钟；检测：294nm
              图1为所附色谱图分子量：          630(ESI-MS)分子式：          C35H34O11[检测值：m/z 631.2174(M+H)+(HR FAB-MS，
              基底：TFA/NBA，内标：PEG 500)；C35H34O11的计算值：631.2179]UV：              图2为所附谱图IR(KBr)：         图3为所附谱图1HNMR(300MHz，DMSO-d6)：       图4为所附谱图13CNMR(150MHz，DMSO-d6)：       图5为所附谱图表1A  可待斯达汀A于氘代甲醇中的1H与13C数据(ppm rel.TMS，278K)
    1H     13C
    A1     -     160.14
    A2     6.84d     116.89
    A3     7.62d     133.92
    A4     -     125.45
    B1     6.20s     110.71
    B2     -     142.01
    B3     -     166.51
    B4     -     102.86
    B5     -     172.74
    C1     -     121.65
    C2     6.87s     118.77
    C3     -     147.93
    C4     -     146.95
    C5     6.40s     114.76
    C6     -     124.24
    D1     -     163.69
    D2     -     139.12
    D3     -     202.65
    D4     4.54s     86.32
    D5     -     91.69
    D6     -     210.05br
    D7     2.46s     28.52br
    E1     3.48d/3.23d     38.69
    E2     -     196.65
    E3     6.02d     122.94
    E4     6.96d     149.93
    E5     -     133.37
    E5-Me     1.75s     12.76
    E6     5.48d     151.51
    E7     2.46     36.31
    E7-Me     1.02d     20.85
    E8     1.34m/1.22m     31.13
    E9     0.80t     12.51
表2
可待斯达汀C性状：                黄色固体溶解性：              MeOH和DMSO熔点：                ＞200℃(分解)[α]D：              -20.0°(c 0.04，甲醇)HPLC保留时间：        12.81分钟
                  图6为所附色谱图分子量：              646(ESI-MS)元素分析：检测值：              C，64.52；H，5.41C35H34O12的计算值：C，65.01；H，5.26分子式：              C35H34O12UV：                  图7为所附谱图IR(KBr)：             图8为所附谱图1HNMR(300MHz，：     图9为所附谱图DMSO-d6)13CNMR(δ，75MHz，：  208.78，201.38，194.58，176.28，172.24，166.94，148.70，DMSO-d6)             146.83，146.61，145.49，145.10，144.99，142.76，134.56，
                  131.77，126.03，124.86，122.69，122.46，121.60，116.99，
                  116.32，115.32，112.48，100.12，90.36，89.75，84.70，
                  37.29，34.34，29.37，28.17，19.95，12.17，和11.75表3
可待斯达汀B性状：             黄色固体溶解性：           MeOH和DMSO熔点：             ＞200℃(分解)HPLC保留时间：     13.45分钟分子量：           630(ESI-MS)分子式：           C35H34O11UV(65∶35：        240，300和375nmCH3CN-0.1％磷酸)1HNMR(300MHz，：  图10为所附谱图DMSO-d6)表4
              可待斯达汀D性状：            黄色固体溶解性：          MeOH和DMSO熔点：            ＞200℃(分解)HPLC保留时间：    12.67分钟分子量：          646(ESI-MS)分子式：          C35H34O12UV(65∶35：       285和380nmCH3CN-0.1％磷酸)1HNMR(300MHz，： 图11为所附谱图DMSO-d6)

Claims (14)

1.一种如结构式I的化合物可待斯达汀A/B，及其立体异构体、药学可接受的盐、酯、醚和明显的化学等效物。
Figure A9880420100021
2.一种分子式为C35H34O11的化合物可待斯达汀A/B及其药学可接受的盐、酯和醚。
3.一种分子式为C35H34O11的化合物可待斯达汀A/B，其可通过培养微生物土曲霉HIL-051652(DSM 11247)获得，方法是在含有碳源、氮源、无机盐和微量元素的培养基中培养，且用常规的方法从培养物中分离并纯化该化合物。
4.一种分子式为C35H34O12的化合物可待斯达汀C/D及其药学可接受的盐、酯和醚。
5.一种分子式为C35H34O12的化合物可待斯达汀C/D，其可通过培养微生物土曲霉HIL-051652(DSM 11247)获得，方法是在含有碳源、氮源、无机盐和微量元素的培养基中培养，且用常规的方法从培养物中分离并纯化该化合物。
6.可待斯达汀A、B、C或D，其分别具有表1、3、2或4所述的任何一种或多种物理特性。
7.一种制备可待斯达汀A、B、C或D的方法，其包括在有氧条件下在含有碳源、氮源、无机盐和微量元素的培养基中培养微生物土曲霉HIL-051652(DSM 11247)，且用常规的方法从培养物中分离并纯化该化合物。
8.权利要求7的方法，其中培养在温度约25至30℃之间，pH在约6到8之间进行。
9.权利要求7或8的方法，其中培养在温度为25℃(±1℃)，pH约7.0下进行。
10.根据权利要求7到9中任意一项的方法，其中培养为深层发酵。
11.一种药物，其包含权利要求1到6中任意一项的化合物以及用于制药的常规佐剂和/或赋型剂。
12.权利要求1到6中任意一项的化合物用于制备具有葡萄糖-6-磷酸移位酶抑制活性的药物的用途。
13.权利要求1到6中任意一项的化合物用于制备具有抗糖尿病作用的药物的用途。
14.土曲霉HIL-051652(DSM 11247)。
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