CN1250744C - 确定二氢嘧啶脱氢酶基因表达的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及有效用于医学，特别是癌症化疗中的预测方法。本发明的目的是通过检验患者肿瘤细胞中的DPD mRNA量，并将其与预定的阈表达水平相比而提供一种评估组织中的二氢嘧啶脱氢酶(DPD)表达水平并预测患者的肿瘤对基于5-FU的治疗的可能抗性的方法。更具体地，本发明提供寡核苷酸引物对DPD3A和DPD3B，以及包括将它们用于检测二氢嘧啶脱氢酶(DPD)mRNA水平的方法。

Description

确定二氢嘧啶脱氢酶基因表达的方法
发明领域
本发明涉及有效用于医学，特别是癌症化疗中的预测方法。本发明也涉及评估患者中的肿瘤细胞的基因表达。更具体地，本发明涉及寡核苷酸和方法，包括它们在使用RT-PCR检测二氢嘧啶脱氢酶(DPD)mRNA表达中的用途。
发明背景
当正常细胞经历致癌性转化并成为恶性细胞时癌症发生。转化的(恶性)细胞逃离可规定细胞表型并抑制细胞增殖的正常生理控制。个体机体中的转化细胞因此在没有这些正常控制的情况下增殖，形成肿瘤。
当发现肿瘤时，临床目标是选择性破坏恶性细胞，同时减少对进行治疗的个体的正常细胞的损害。化疗方案是以对癌细胞具有选择毒性(细胞毒性)的药物的使用为基础的。人们已经研制出了很多类化疗药物，包括干扰核酸合成，蛋白合成，及其它重要代谢过程的药物。
5-氟尿嘧啶(5-FU)是一种在许多不同的癌症类型，包括如胃肠道和乳腺的主要癌症中广泛使用的药物(Moertel，C.G.New Engl.J.Med.，330：1136-1142，1994)。5-FU在40多年中一直是结直肠癌标准一线治疗的单一试剂，但最近被5-FU和CPT-11的联合替代为“护理标准”(Saltz等，Irinotecan Study Group.New EnglandJournal of Medicine，343：905-14，2000)。5-FU和奥沙利铂的联合在结直肠癌中产生了高有效率(Raymond等，Semin.Oncol.25：4-12，1998)。因此，很可能5-FU将在许多年中用于癌症治疗，因为它仍然是当前化疗方案中的核心成分。此外，单独的5-FU治疗仍然用于一些患者，5-FU与CPT-11或奥沙利铂的联合对这些患者特别具有毒性。
5-FU是大多数抗癌药中最典型的，因为只有少数患者对治疗产生有利的反应。大量的随机化临床试验证明，转移性结直肠癌患者对作为单一试剂的5-FU的总体肿瘤反应率为15-25％(Moertel，C.G.New Engl.J.Med.，330：1136-1142，1994)。与上述其它化疗联合时，对基于5-FU的方案的肿瘤反应率为约40％。然而，大多数受治疗的患者没有从接受基于5-FU的化疗中得到明显的益处，并且经历了显著的危险、不适和花费大量开支。由于目前还没有可靠的在治疗前预测个体肿瘤对治疗的反应的方法，标准的临床实践是让所有患者接受5-FU治疗，发现大多数患者的结果不满意。
为了鉴定药物的抗肿瘤活性的最重要生化决定因素，一直在广泛研究5-FU的活性和代谢途径。最终的目的是通过a)调节5-FU的细胞内代谢和生化以及b)通过在治疗前测量患者中的反应决定性因素以预测哪些患者最可能反应(或不反应)于药物，从而改进5-FU的临床有效性。这些研究中得到了两个主要的决定因素：1)5-FU的靶酶，胸苷酸合成酶(TS)的特性和2)5-FU代谢酶，二氢嘧啶脱氢酶(DPD)的特性。
对基于5-FU的治疗的肿瘤反应预测领域的第一个研究是对其在结直肠癌中的靶酶，胸苷酸合成酶(TS)进行的。Leiehman等(Leichman等，J.Clin Oncol.，15：3223-3229，1997)进行了一项前瞻性临床试验，用于在肿瘤对5-FU的反应和TS基因的表达之间建立联系，这是通过RT-PCR在结直肠癌的预治疗活检物中测定的。该研究表明：1)在这些肿瘤中TS基因表达水平有大的50倍范围；和2)反应和无反应肿瘤的TS基因表达水平之间具有显著差异。反应组TS水平的范围(0.5-4.1×10-3，相对于内部对照)窄于无反应组的范围(1.6-23.0×10-3，相对于内部对照)。研究者确定了所得到的TS表达的“无反应截断值”域水平，在该水平之上仅有无反应者。这样，TS表达水平高于该“无反应截断值”域的患者可以在治疗前被阳性鉴定为无反应者。“无反应”分类包括所有肿瘤缩小＜50％，进展性生长导致肿瘤增加＞25％和非进展性肿瘤缩小＜50％，无改变或增加＜25％。这些肿瘤具有最高的TS水平。因此，高TS表达特别鉴定了具有抗性的肿瘤。TS表达水平高于某域值鉴定为对5-FU无反应的肿瘤亚型，而TS表达低于该数值的肿瘤预测具有稍高的反应率。
随后的研究调查了DPD表达水平与TS表达水平联合作为对5-FU治疗的肿瘤反应决定因素的用途。DPD是一种减少5-FU的5，6双键，使其作为细胞毒性剂而无活性的分解代谢酶。以前的研究表明，正常组织中的DPD水平可以影响5-FU的生物利用度，从而调节其药代动力学和抗肿瘤活性(Harris等，Cancer Res.，50：197-201，1990)。此外，已经提出了肿瘤中DPD水平与对5-FU的敏感性相关的证据(Etienne等，J.Clin.Oncol.，13：1663-1670，1995；Beck等，Eur.J.Cancer，30：1517-1522，1994)。Salonga等(Clin Cancer Res.，6：1322-1327，2000，在此引入其全文作为参考)研究了在已经确定了TS表达的一组肿瘤中作为5-FU/甲酰四氢叶酸治疗的肿瘤反应决定因素的DPD基因表达。至于TS，与无反应肿瘤(0.2-16×10-3，80倍；相当于内部对照)相比，反应的肿瘤中DPD表达的范围相对窄(0.6-2.5×10-3，4.2倍；相对于内部对照)。此外，反应的肿瘤中DPD表达水平都不超过约2.5×10-3的域值水平。此外，DPD和TS表达水平表现出彼此不相关，表明它们是独立调节的基因。在TS和DPD表达水平都低于各自的“无反应截断”域值水平的肿瘤组中，92％反应于5-FU/LV。因此，可以根据DPD和TS的低表达水平鉴定反应的肿瘤。
DPD也是5-FU毒性的重要标记。也发现进行基于5-FU的治疗的具有非常低DPD水平(如在DPD缺陷综合征，即胸腺嘧啶尿嘧啶尿症)的患者受到了威胁生命的毒性的影响(Lyss等，Cancer Invest.，11：2390240，1993)。实际上，DPD水平在5-FU治疗中的重要性得到了很大程度的说明，因为5-FU和抗病毒化合物索利夫定之间的不利的药物相互作用使19名日本人死亡(Diasio等，Br.J.Clin.Pharmacol.46，1-4，1998)。随后发现索利夫定的代谢物是DPD的强抑制剂。该治疗导致DPD缺陷综合征样DPD水平降低，这增加了5-FU对患者的毒性(Diasio等，Br.J.Clin.Pharmacol.46，1-4，1998)。
因此，由于a)5-FU方案在癌症治疗中的广泛用途，b)DPD表达在预测肿瘤对5-FU的反应的重要作用和c)DPD-缺陷综合征个体对常用的基于5-FU治疗的敏感性，很明确在化疗前进行DPD的准确确定将为癌症患者提供重要的益处。
测量DPD酶活性要求含活性酶的新鲜组织的显著量。不利的是，大多数治疗前肿瘤活检物仅仅作为固定的石蜡包埋的(FPE)组织，特别是不合活性酶的福尔马林固定的石蜡包埋的组织而得到。而且，活检物一般只含有非常少量的非均质组织。
可以用RT-PCR引物和探针分析冷冻组织或新鲜组织中的DPD表达。然而，这些引物不适用于通过RT-PCR从固定组织中对DPD mRNA定量。目前存在的引物没有得到结果或得到不稳定的结果。这被认为是由于以下原因：a)DPD RNA本身水平低；b)石蜡中包埋的组织量非常小；和c)在石蜡中将RNA降解为＜100bp的小片。因此，其它的研究者进行了一致的，但不成功的尝试，以获得允许在石蜡包埋的组织中对DPD表达定量的寡核苷酸引物组。因此，需要从固定的组织中对DPD mRNA定量的方法，以便提供对预定的癌症治疗的早期预后。因为已经证明DPD酶活性和相应mRNA表达水平相关性很好(Ishikawa等，Clin.Cancer Res.，5：883-889，1999；Johnson等，Analyt.Biochem.278：175-184，2000)，测量FPE标本中DPD mRNA表达提供了评估患者DPD表达水平状态而不需要确定新鲜组织中酶活性的途径。此外，FPE标本容易进行显微解剖，因此可以在没有被基质组织污染的肿瘤组织中确定DPD基因表达。
因此，本发明的目的是通过检测患者肿瘤细胞中DPD mRNA的量，并把它与预定的阈表达水平进行比较，而提供一种评估组织中DPD的水平，并预测患者肿瘤对基于5-FU的治疗的可能抗性的方法。
发明概述
本发明的一方面提供了具有DPD3A-51F(SEQ ID NO：1)或DPD3A-134R(SEQ ID NO：2)的序列的寡核苷酸引物，以及寡核苷酸引物DPD3b-651F(SEQ ID NO：7)和DPD3b-736R(SEQ ID NO：8)和与其基本相同的序列。本发明还提供了具有在严格条件下与DPD3A-51F(SEQ IDNO：1)，DPD3A-134R(SEQ ID NO：2)，DPD3b-651F(SEQ ID NO：7)，DPD3b-736R(SEQ ID NO：8)或其互补序列杂交的序列的寡核苷酸引物。
而且，本发明涉及一种确定化疗方案的方法，包括从肿瘤标本中分离RNA；测定样品中DPD的基因表达水平；把测定的DPD基因表达水平与该基因的预定阈水平进行比较；根据测定的DPD基因表达水平和预定阈水平的比较结果确定化疗方案。
本发明还涉及一种标准化组织样品中相对于内部对照基因的DPD的未校正基因表达(UGE)的方法，其中所述组织样品是使用TaqMan技术分析的，所述方法是相对于样品的内部对照，对已知的ERCC1表达水平进行分析而进行的。
附图简述
图1表示比较四对不同的寡核苷酸引物扩增来自10个不同的福尔马林-FPE样品的DPD mRNA的能力。样品#1-5和#8-10来自于结肠肿瘤活检物，#6来自于支气管肺泡肿瘤活检物，#7来自于小肠肿瘤活检物。寡核苷酸引物对DPD1(DPD-70F，(SEQ ID NO：3)和DPD-201R，(SEQ ID NO：4))，DPD2(DPD2p-1129F，(SEQ ID NO：5)和DPD2p-1208R，(SEQ ID NO：6))对于测量这些样品中的DPD mRNA水平无效。寡核苷酸引物对DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO：1)和DPD3a-134R(SEQ ID NO：2))和DPD3B(DPD3b-651F(SEQ ID NO：7)和DPD3b-736R(SEQ ID NO：8))对于确定这些样品中的DPD mRNA水平有效。
图2表示比较寡核苷酸引物对DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO：1)和DPD3a-134R(SEQ ID NO：2))和DPD1(DPD-70F，(SEQ ID NO：3)和DPD-201R，(SEQ ID NO：4))在冷冻组织样品中的DPD mRNA扩增效率。该图表示，寡核苷酸引物对DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO：1)和DPD3a-134R(SEQ ID NO：2))不仅在测量冷冻组织样品(以及FPE来源的样品)中DPD表达水平中有效，而且比寡核苷酸引物对DPD1(DPD-70F，(SEQ ID NO：3)和DPD-201R，(SEQ ID NO：4))更有效。
图3是举例说明如何计算相对于内部对照基因的DPD表达的图表。所述图表包括用两种试验样品获得的数据，(未知1和2)，并举例说明如何测定未校正基因的表达数据(UGE)UCG。该图表还举例说明了如何利用TaqMan仪器，采用以前公开的DPD值标准化所产生的UGE。这是通过用UGE乘以校正因子KDPD完成的。图中的内部对照基因是β-肌动蛋白，校准RNA是来自Applied Biosystems的Universal PERNA，目录号4307281，批号3617812014。
图4是表示每种组织学类型标本中相对的校正DPD表达水平的柱状图。该柱状图表示第25和第75百分位(四分位之间)范围。平均值表示为每个柱中的水平条。柱上面的横线表示第25和第75百分位之外，但排除了离群值的水平。
发明详述
本发明人公开了允许准确评估组织中DPD表达的寡核苷酸引物和基本与其相同的寡核苷酸引物。这些寡核苷酸引物，DPD3a-51F(SEQID NO：1)和DPD 3a-134R(SEQ ID NO：2)(也称作寡核苷酸引物对DPD3A)和寡核苷酸引物DPD3b-651F(SEQ ID NO：7)和DPD3b-736R(SEQ ID NO：8)(也称作寡核苷酸引物对3B)在用于测定固定的石蜡包埋的(FPE)肿瘤标本中的DPD基因表达时特别有效。
此处针对核酸而使用的“基本相同的”表示在严格条件下与靶杂交的寡核苷酸，以及在具有适当的核苷酸插入和缺失的条件下进行适当比对时，在核苷酸的至少约60％，典型地至少约70％，更典型地至少约80％，通常至少约90％，更通常至少约95-98％的核苷酸中相同的核酸片段或其互补链。当杂交比总的特异性更具有选择性时，存在选择性杂交。见，Kanehisa，Nucleic Acids Res.，12：203-213(1984)。
本发明包括在严格条件下(如此处所定义)与寡核苷酸引物序列DPD3A-51F(SEQ ID NO：1)，其互补序列，DPD3A-134R(SEQ ID NO：2)或其互补序列的全部或一部分杂交的基本相同的寡核苷酸。此外，本发明还包括在严格条件下(如此处所定义)与寡核苷酸引物序列DPD3b-651F(SEQ ID NO：7)，其互补序列，DPD3b-736R(SEQ ID NO：8)或其互补序列的全部或一部分杂交的基本相同的寡核苷酸。
在严格的杂交条件下，只有高度互补的，即，与此处所定义的基本上相似的核酸序列才能进行杂交。优选，这种条件会阻碍20个连续核苷酸中有4个或更多错配，更优选20个连续核苷酸中有2个或更多错配，最优选20个相连核苷酸中有1个或更多错配的核酸进行杂交。
核酸的杂交部分通常至少约为10个(例如，15个)核苷酸长。杂交核酸进行杂交的部分与寡核苷酸引物序列DPD3A-51F(SEQ IDNO：1)，其互补序列，DPD3A-134R(SEQ ID NO：2)或其互补序列的全部或一部分至少约80％，优选至少约95％，或最优选至少约98％相同。此外，杂交核酸进行杂交的部分与寡核苷酸引物序列DPD3b-651F(SEQ ID NO：7)，其互补序列，DPD3b-736R(SEQ ID NO：8)或其互补序列的全部或一部分至少约80％，优选至少约95％，或最优选至少约98％相同。
寡核苷酸引物与核酸样品在严格条件下的杂交在下面规定。核酸双链体或杂交体的稳定性是以解链温度(Tm)表示的，它是探针从靶DNA解离下来的温度。解链温度可用于限定所需的严格条件。如果所要鉴定的序列与探针基本上相同，而不是相同，那么它可首先用于确定最低温度，在最低温度时，只有使用特殊浓度的盐(例如，SSC或SSPE)才能进行同源杂交。然后，假定1％错配导致Tm降低1℃，那么杂交反应的最终洗涤温度因此降低(例如，如果找到与探针的同一性＞95％的序列，那么最终的洗涤温度降低5℃)。实际上，Tm在0.5℃-1.5℃/1％错配之间变化。
严格条件包括约68℃时，在5×SSC/5×Denhart’s溶液/1.0％SDS中杂交，室温时，在0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤。中度的严格条件包括约42℃时，在3xSSC中洗涤。改变盐浓度和温度参数，可在引物和靶核酸之间获得最佳的同一性水平。有关这种条件的其它指导可在本领域中很容易地得到，例如，Sambrook，Fischer和Maniatis，MolecularCloning，a laboratory manual，(2nded.)，Cold Spring HarborLaboratory Press，NewYork，(1989)和F.M.Ausubel等编辑，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons(1994)。
本发明的这方面涉及使用从FPE标本可靠地提取RNA的方法，以及其次通过使用用于进行逆转录酶聚合酶链反应的寡核苷酸引物对DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO：1)和DPD3a-134R(SEQ ID NO：2))或与其基本相同的寡核苷酸和DPD3B(DPD3b-651F(SEQ ID NO：7)和DPD3b-736R(SEQ ID NO：8))或与其基本相同的寡核苷酸而确定标本中DPD mRNA的含量。通过如1999年12月20日提交的美国专利申请No.09/469,338的描述通过任何从样品中分离mRNA的方法从FPE细胞提取RNA，在此全文引入作为参考。
本发明的寡核苷酸引物允许评估固定的石蜡包埋(FPE)组织中的DPD表达(图1)。此外，本发明的寡核苷酸引物可以准确测定新鲜或冷冻组织中的DPD表达水平，即它们对其靶RNA具有高特异性。因此，本发明的方法不限于使用石蜡包埋组织。此处公开的寡核苷酸引物能够允许准确评估固定的石蜡包埋组织，以及冷冻或新鲜组织中的DPD基因表达(图2)。这是由于来源于FPE样品中的mRNA相对于新鲜或冷冻组织中的mRNA更成片段，因此更难以定量。因此，本发明提供了适用于测定FPE组织DPD表达水平的寡核苷酸引物，而以前没有适当的测定方法。见图1。
DPD mRNA的表达与基于5-FU的化疗的临床抗性相关。具体地，高水平DPD mRNA表达与基于5-FU的化疗的抗性相关。
本发明的方法适用于各种肿瘤类型。它可制备个体“肿瘤表达分布”，由此在个体患者的样品中测定DPD的表达水平，并预测对各种化疗的反应。本发明的方法最优选用于支气管肺泡、小肠或结肠肿瘤。对于将本发明的一些实施方案用于特定的肿瘤类型，优选证明DPD基因表达水平与存活力之间的关系，这是通过编辑在特定DPD表达和对基于5-FU的化疗的临床抗性之间建立联系的数据组而进行的。
本发明可以用于任何组织类型。例如，为了检验肿瘤组织的抗性，需要检验肿瘤组织。优选地，需要检验来自于获得肿瘤的患者的正常组织的一部分。正常组织抗基于5-FU的化疗化合物，但肿瘤组织预计对所述化合物敏感的患者可以然后接受较高量的化疗组合物的治疗。
本发明的方法包括从患者的肿瘤获得细胞样品的步骤。实体或淋巴瘤或其一部分是通过手术从患者切除下来的。如果不能在切除后立即从组织样品中提取RNA，然后可以固定或冷冻样品。然后可以用其获得RNA。从冷冻或新鲜肿瘤样品中分离出来的RNA是通过本领域任何一种典型的方法从细胞中提取出来的，例如Sambrook，Fischer和Maniatis，Molecular Cloning，alaboratory manual，(2nded.)，ColdSpring Harbor Laboratory Press，NewYork，(1989)。优选在提取过程中，注意避免RNA降解。
或者，患者的组织可以被固定，例如，通常用福尔马林(甲醛)或gluteraldehyde固定。本发明也通过醇浸渍而固定生物样品。通常是使固定的生物样品脱水，并将其包埋在石蜡或本领域那些技术人员已知的其它固体支持物中。将包埋固定组织的固体支持物设计为可用有机溶剂除去，随后使保存的组织再水合。此处描述的固定和石蜡包埋(FPE)组织标本是指可以储存并归档的组织样品。
RNA是通过1999年12月20日提交的美国专利申请US 09/469,338中描述的任何一种方法从FPE细胞中提取出来的，所述专利申请全部引入此处作为参考。最优选地，从福尔马林固定和石蜡包埋的组织标本中从肿瘤细胞提取RNA。
在本发明的一个优选实施方案中，RNA可从存档的病理样品或活检样品中分离出来，其首先脱石蜡。代表性的脱石蜡方法包括用有机溶剂，如二甲苯洗涤石蜡包埋的样品。脱石蜡样品还可用低级醇的水溶液再水合。适宜的低级醇包括，例如甲醇，乙醇，丙醇和丁醇。脱石蜡样品可用逐渐降低浓度的低级醇溶液连续洗涤而再水合。可选择地，样品可同时脱石蜡和再水合。
一旦样品再水合，从再水合组织中提取RNA。可利用机械，声波或其它匀化工具匀化脱石蜡的样品。在一个有效实施方案中，再水合的样品可在含有离液剂，如硫氰酸胍(也可作为异硫氰酸胍销售)的溶液中匀化。
“有效浓度的离液剂”的选择是指从石蜡包埋的样品中纯化的RNA量比没有离液剂情况下分离出来的RNA量高大约10倍。离液剂包括，如，胍化合物，脲，甲酰胺，碘化钾，硫氰酸钾及类似的化合物。本发明方法的优选离液剂是胍化合物，如异硫氰酸胍(也作为硫氰酸胍销售)和盐酸胍。很多阴平衡离子都是有用的，本领域的技术人员可用这种适宜的阴离子制备多种胍盐。本发明所用胍溶液的有效浓度通常约为1-5M，优选约4M。如果RNA已存在于溶液中，那么胍溶液的浓度可以更高，这样，样品中获得的最终浓度约为1-5M。优选用适当的生化缓冲液，如Tris-HCl把胍溶液缓冲至pH约3-6，更优选约4。离液溶液还可含有还原剂，如二硫苏糖醇(DTT)和β-巯基乙醇(BME)。离液溶液还可含有RNA酶抑制剂。
将离液溶液中的匀化样品加热至约50-约100℃，所述离液溶液含有有效量的离液剂，如胍化合物。优选的离液剂是硫氰酸胍。
然后通过苯酚-氯仿萃取，离子交换色谱或大小排阻色谱回收离液溶液中的RNA。然后，利用提取，电泳，层析，沉淀技术或其它适宜技术进一步纯化RNA。
DPD mRNA的定量优选使用本领域常用的逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)进行，其中所述DPD mRNA来源于新鲜，冷冻，或固定组织的纯化总mRNA。定量DPD mRNA的其它方法包括，例如，使用多重PCR中所用的分于指标和其它标记探针。此外，本发明还利用没有PCR的系统测量DPD的mRNA，其中没有PCR的系统使用的是与Invader测定(Third Wave Technologies，Inc.)中使用的探针相似的荧光标记探针。最优选，DPDcDNA及内部对照或管家基因(例如，β-肌动蛋白)的定量是利用基于荧光的实时检测法(ABIPRISM 7700或7900Sequence Detection System[TaqMan]，Applied Biosystems，FosterCity，CA.)或与Heid等(Genome Res 1996；6：986-994)和Gibson等(Genome Res 1996；6：995-1001)所述相似的系统进行的。ABI7700(TaqManInstrument)的输出量是以Ct’s或“循环阈”表示的。使用TaqMan系统，样品中具有较高数量靶分子的高水平表达基因产生一种信号，并且PCR循环(较低的Ct)比具有较少靶分子(较高的Ct)的低水平相对表达的基因要少。
本发明部分在于以下发现，即DPD mRNA的相对量与对化疗剂5-FU的抗性相关。此处发现，表达高水平DPD mRNA的肿瘤可能抗5-FU。相反，表达低DPD mRNA量的肿瘤可能对5-FU敏感。通过比较患者的肿瘤DPD mRNA的表达与DPD表达的预定域表达水平而判断患者的肿瘤DPD mRNA的表达。
此处所用“管家”基因或“内部对照”是任何一种组成型或全局型表达基因，它的存在可评估DPD mRNA的水平。这种评估包括测定基因转录的总体组成型水平和RNA回收中变异的对照。“管家”基因或“内部对照”包括，但不限制于亲环蛋白基因，β-肌动蛋白基因，转铁蛋白受体基因，GAPDH基因等。最优选内部对照基因是β-肌动蛋白基因，如Eads等，Cancer Research 1999；59：2302-2306所述。
RNA回收中变异的对照需要使用“校准RNA”。“校准RNA”可以是任何一种可得到的精确预定量的对照RNA。优选使用来自AppliedBiosystems的Universal PE RNA，目录号4307281，批号3617812014。
此处所用“未校正基因表达(UGE)”是指由TaqMan仪器产生的相对于内部对照基因的DPD表达的数字输出。用于确定UGE的公式在实施例4中表示，并用图3样品计算结果举例说明。
本发明另一方面提供一种标准化未校正基因表达(UGE)值的方法，所述未校正基因表达(UGE)值是利用源于非-TaqMan技术的“已知相对基因表达”值，从TaqMan仪器获得的。优选，由Salonga等，Clinical Cancer Research，6：1322-1327，2000(在此全文引入作为参考)以前公开的源于非-TaqMan的相对DPD：β-肌动蛋白表达值是用源于组织样品的DPD UGE值标准化的。
此处所用“校正的相对DPD表达”是指标准化的DPD表达，UGE乘以DPD特异性校正因子(KDPD)得到一个值，该值可与DPD相对于内部对照基因的已知表达水平范围相比较。图3详细说明了这些计算结果。
“以前公开的”相对基因表达是以靶基因的RT-PCR信号与组成型表达的基因(β-肌动蛋白)的比值为基础的。在Pre-TaqMan技术研究中，PCR反应进行固定的循环数(即，30次)，并报告每份样品的终点值。然后按照DPD表达与β-肌动蛋白表达的比值报道这些值。Salonga等，Clinical Cancer Research，6：1322-1327，2000，在此全文引入作为参考。
此处定义的DPD表达的“预定阈水平”是一种DPD表达水平，当高于此水平时，肿瘤可能对基于铂的化疗方案有抗性。表达水平低于该域值的肿瘤可能对基于铂的化疗方案敏感。相对DPD表达在反应于基于5-FU的化疗方案的肿瘤中的范围为低于约0.6×10-3-2.5×10- 3(约4.2倍范围)。不反应于基于5-FU的化疗方案的肿瘤的相对DPD表达为约0.2×10-3-16×10-3(约4.2倍范围)。如果相对DPD表达高于约2.0×10-3，优选高于约2.5×10-3，肿瘤一般不反应于5-FU治疗。这些肿瘤值允许确定特定样品的“校正的相对DPD表达”是高于还是低于“预定阈水平”。校正的相对DPD表达水平的阈值是约2.0×10-3-2.5×10-3。
本发明的方法可适于各种组织和肿瘤类型，可用于评估患者的临床治疗，并作为各种癌症，包括乳腺癌，头颈癌，肺癌，食管癌，结肠直肠癌等的诊断或预后工具。在优选实施方案中，本发明的方法适于支气管肺泡癌、小肠癌或结肠癌。
根据在肿瘤中表达DPD mRNA的量的测量，本领域的实施者可以进行关于肿瘤对基于5-FU的化疗的肿瘤的临床抗性。“基于5-FU的化疗”包括给予5-FU，其衍生物，单独给药或与其它化疗剂，如亚叶酸或DPD抑制剂，如尿嘧啶、5-乙炔基尿嘧啶、溴乙烯基尿嘧啶、胸腺嘧啶、苄氧基苄基尿嘧啶(BBU)或5-氯-2，4-二羟基吡啶联合给药。此外，已经发现，与5-FU或其衍生物与DPD抑制剂5-乙炔基尿嘧啶的联合相比，式(I)的5’-脱氧胞嘧啶衍生物与5-FU或其衍生物的共同给药显著改进化疗剂向肿瘤组织的选择性递送，并且在人癌症异种移植物模型中表现出抗肿瘤活性的显著改进。
上面描述了本发明，本发明的实际操作是通过下面给出的实验性实施例举例说明的。技术人员应认识到说明实施例中使用的材料和方法可以各种方式进行改进。这种改进也被认为落在本发明的范围之内。
实施例
实施例1
从FPE组织中分离RNA
RNA是通过下列一般过程从石蜡包埋组织中提取出来的。
A.切片的脱石蜡和水合
(1)把约10μM的切片的一部分放在1.5mL塑料离心管中。
(2)加入600μL二甲苯，室温(约20-25℃)用力振摇混合物约10分钟。
(3)室温时，以台式离心机的最大速度(约10-20,000xg)将样品离心约7分钟。
(4)重复步骤2和3，直到绝大部分石蜡溶解。根据原始样品部分所含的石蜡量，通常需要重复2次或更多次。
(5)用低级醇，优选用100％乙醇(约600μL)用力振摇约3分钟，除去二甲苯溶液。
(6)按照步骤(3)将试管离心约7分钟。倾出并弃去上清液。颗粒状物变为白色。
(7)用更稀释的乙醇溶液：首先用约95％乙醇，然后用约80％乙醇，最后用约70％乙醇连续重复步骤5和6。
(8)按照步骤(3)，室温将样品离心7分钟。弃去上清液，室温干燥颗粒状物约5分钟。
B.用苯酚-氯仿分离RNA
(1)加入400μL含0.5％肌氨酸的异硫氰酸胍溶液和8μL二硫苏糖醇。
(2)然后用组织匀浆器(Ultra-Turrax，IKA-Works，Inc.，Wilmington，NC)匀化样品约2-3分钟，速度从低速(速度1)到高速(速度5)逐渐升高。
(3)然后将样品在大约95℃时加热约5-20分钟。优选在加热到95℃之前，用细针刺入含样品的试管的管帽。可选择地，管帽可用塑料夹子或实验用薄膜固定。
(4)然后用pH4.0的50μL 2M醋酸钠和600μL苯酚/氯仿/异戊醇(10∶1.93∶0.036)萃取样品，其中苯酚/氯仿/异戊醇(10∶1.93∶0.036)是用18mL苯酚和3.6mL 1∶49的异戊醇∶氯仿溶液新制备的。用力振摇溶液约10秒，然后在冰上冷却约15分钟。
(5)以最大速度将溶液离心约7分钟。将上层的(水)相转移到一个新的试管中。
(6)-20℃时，用约10μL糖原和400μL异丙醇沉淀RNA30分钟。
(7)通过在台式离心机中以最大速度离心约7分钟，而使RNA成为颗粒状物；倾出并弃去上清液；用大约500μL约70-75％的乙醇洗涤颗粒状物。
(8)以最大速度将样品再次离心7分钟。弃去上清液，并将颗粒状物风干。然后将颗粒状物溶解在适宜的缓冲液中，用于进一步的实验(例如，50pL 5mM Tris氯化物，pH8.0)。
实施例2
mRNA的逆转录和PCR
逆转录：如实施例1中举例说明和1999年12月20日提交的美国专利申请US09/469,338中的描述(全文引入此处作为参考)，RNA是从显微解剖或非-显微解剖的福尔马林固定的石蜡包埋(FPE)组织中分离出来的。用乙醇沉淀并离心后，将RNA颗粒状物溶解在50μLpH8.0的5mM Tris/Cl中。所得RNA是随机的六聚体和来源于LifeTechnologies的M-MLV(目录号28025-02)逆转录的。逆转录是通过把25μL RNA溶液与25.5μL“逆转录混合物”混合进行的(见下文)。将反应物放在热循环仪中，26℃时8分钟(用于使随机的六聚体与RNA结合)，42℃时45分钟(用于M-MLV逆转录酶促反应)，95℃时5分钟(用于DNA酶的热灭活)。
“逆转录混合物”由以下成分组成：10μl 5X缓冲液(250mMTris-HCl，pH8.3，375mM KCl，15mM MgCl2)，0.5μl随机的六聚体(500.D.溶解在550μl，pH7.5的10mM Tris-HCl中)，5μl 10mM dNTPs(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)，5μl 0.1M DTT，1.25μl BSA(在pH7.5的10mM Tris-HCL中为3mg/ml)，1.25μl RNA Guard24，800U/ml(RNA酶抑制剂)(目录号27-0816，Amersham Pharmacia)和2.5μl MMLV200U/μl(Life Tech目录号28025-02)。
反应组分的最终浓度是：50mM Tris-HCl，pH8.3，75mM KCl，3mMMgCl2，1.0mM dNTP，1.0mM DTT，0.00375mg/ml BSA，0.62U/μl RNA Guard和10U/μl MMLV。
mRNA表达的PCR定量。DPD cDNA和内部对照或管家基因(例如β-肌动蛋白，如Eads等，Cancer Research 1999；59：2302-2306)cDNA的定量是使用Heid等，(Genome Res1996；6：986-994)；Gibson等，(Genome Res1996；6：995-1001)所述的基于荧光的实时检测法(ABIPRISM 7700或7900序列检测系统[TaqMan]，Applied Biosystems，FosterCity，CA.)进行的。简言之，该方法使用一种双重标记的产荧光TaqMan寡核苷酸探针，(DPD-530Tc(SEQ ID NO：3)，Tm＝70℃)，其特异性地在正向和反向引物内退火。含反应混合物的加盖孔内的激光刺激引起3’猝灭剂染料(TAMRA)发射，直到探针在PCR延伸过程中被DNA聚合酶的5’-3’核酸酶活性裂解，引起5’报道染料(6FAM)的释放。因此，扩增子的产生引起荧光信号的发射，这是通过TaqMan’sCCD(电荷耦合器件)检测照相机检测的，PCR反应纯指数相内，阈循环所产生的信号量可反映目标序列的起始拷贝数。寡核苷酸引物对DPD1(DPD-70F(SEQ ID NO：3)和DPD-201R(SEQ ID NO：4))的TaqMan探针是DPD-108Tc(SEQ ID NO：9)。寡核苷酸引物对DPD2(DPD2p-1129F(SEQ ID NO：5)和DPD2p-1208R(SEQ ID NO：6))的TaqMan探针是DPD-2p-1154Tc(SEQ ID NO：10)。寡核苷酸引物对DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO：1)和DPD 3a-134R(SEQ ID NO：2))的TaqMan探针是DPD3A-71Tc(SEQ ID NO：11)。寡核苷酸引物对DPD3B(DPD3b-651F(SEQ ID NO：7)和DPD3b-736R(SEQ ID NO：8))的TaqMan探针是DPD3b-685Tc(SEQ ID NO：12)。
PCR反应混合物含有来自引物对DPD1(DPD-70F(SEQ ID NO：3)和DPD-201R(SEQ ID NO：4))；DPD2(DPD2p-1129F(SEQ ID NO：5)和DPD2p-1208R(SEQ ID NO：6))；DPD3B(DPD3b-651F(SEQ ID NO：7)，Tm＝58℃和DPD3b-736R(SEQ ID NO：8)，Tm＝60℃)；或寡核苷酸引物对DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO：1)，Tm＝59℃和DPD3a-134R(SEQ IDNO：2)，Tm＝59℃)。每一种PCR引物混合物由以下成分组成：0.5μl含有cDNA以及600nM仅仅来自于一对(DPD1，DPD2，DPD3或DPD3A)引物的每一种寡核苷酸引物的逆转录反应物，200nM相应的TaqMan探针(用于DPD1，DPD2，DPD3或DPD3A)，5U AmpliTaq Gold聚合酶，200μM各dATP，dCTP，dGTP，400μM dTTP，5.5mM MgCl2，和含有参考染料的1xTaqman缓冲液A，最终的体积小于或等于25μl(所有试剂，Applied Biosystems，FosterCity，CA)。循环条件是，95℃10分钟，然后是95℃15秒和60℃1分钟循环45次。
实施例3
寡核苷酸引物对DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO：1)和DPD3a-134R(SEQ ID NO：2))和DPD 3B(DPD3b-651F(SEQ ID NO：7)和DPD3b-736R(SEQ ID NO：8))允许通过RT-PCR，使用从石蜡包埋组织提取的RNA进行强的、可重复的DPD基因表达定量。图1。寡核苷酸引物对DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO：1)和DPD3a-134R(SEQ ID NO：2))也显著增加了通过RT-PCR在新鲜的冷冻组织中分析DPD基因表达的敏感性。图2。按上述实施例2的描述使用ABI Prism 7700序列检测系统(Taqman)进行。
在PCR反应中使用30个循环。每一个循环由96℃变性1min，55℃退火1min，并且72℃延伸2min组成。用寡核苷酸引物对DPD 3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO：1)和DPD 3a-134R(SEQ ID NO：2))进行扩增的产物长度是84个碱基对。扩增产物相当于跨越一部分5’非翻译区(UTR)并进入外显子1的DPD cDNA区域。用寡核苷酸引物对DPD3B(DPD3b-651F(SEQ ID NO：7)和DPD3b-736R(SEQ ID NO：8))进行扩增的产物长度是86个碱基对。扩增产物相当于扩增DPD cDNA的一个相当于外显子6的区域。
比较了寡核苷酸引物对DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO：1)和DPD3a-134R(SEQ ID NO：2))和DPD3B(DPD3b-651F(SEQ ID NO：7)和DPD3b-736R(SEQ ID NO：8))与其它现存的引物组扩增来源于10个不同FPE组织样品的DPD mRNA的能力。样品#1-5和#8-10来自于结肠肿瘤活检物，#6来自于支气管肺泡肿瘤活检物，#7来自于小肠肿瘤活检物。使用的其它寡核苷酸引物对是DPD1(DPD-70F，(SEQID NO：3)和DPD-201R，(SEQ ID NO：4))和DPD2(DPD2p-1129F(SEQID NO：5)和DPD2p-1208R(SEQ ID NO：6))。
寡核苷酸引物对DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO：1)和DPD3a-134R(SEQ ID NO：2))准确确定各种样品中的DPD水平中最有效。寡核苷酸引物对DPD3B(DPD3b-651F(SEQ ID NO：7)和DPD3b-736R(SEQ IDNO：8))也有效，但没有产生强信号。结果见图1。
实施例4
测定DPD的未校正基因表达(UGE)
进行两对平行反应。“试验”反应和“校准”反应。图7。DPD扩增反应和β-肌动蛋白内部对照扩增反应是试验反应。单独的DPD和β-肌动蛋白扩增反应是在校准RNA模板上进行的，被称作校准反应。TaqMan仪器产生4个不同的循环阈(Ct)值：试验反应的CtDPD和Ctβ-肌动蛋白，和校准反应的CtDPD和Ctβ-肌动蛋白。两种反应的Ct差值是根据下列公式确定的：
ΔCt试验＝CtDPD-Ctβ-肌动蛋白(“试验”反应)
ΔCt校准＝CtDPD-Ctβ-肌动蛋白(“校准”反应)
下一步是按照下列公式计算2的负ΔCt次方。
2-ΔCt试验(“试验”反应)
2-ΔCt校准(“校准”反应)
为了从TaqMan仪器获得DPD的未校正基因表达，进行了下列计算：
DPD的未校基因表达(UGE)＝2-ΔCt试验/2-ΔCt校准
用已知的相对DPD表达水平标准化UGE
标准化的计算需要将UGE乘以对DPD和特定校准RNA特异的校正因子(KDPD)。还可测定任何一种内部对照基因和任何一种精确预定量的校准RNA的校正因子KDPD。优选，使用内部对照基因β-肌动蛋白和精确预定量的校准RNA，来自Applied Biosystems的Universal PERNA，目录号4307281，批号3617812014。
标准化是使用ΔCt方法的改进法进行的，所述ΔCt方法由AppliedBiosystems，TaqMan制造商，在User Bulletin#2中和上文描述。为了进行该过程，使用上述TaqMan方法，分析了6个不同FPE试验组织的UGE的DPD表达。使用内部对照基因β-肌动蛋白和校准RNA，来自Applied Biosystems的Universal PE RNA，目录号4307281，批号3617812014。
用以前描述于Salonga等(在此全文引入作为参考)的各样品L7，L91，L121，L150，L220和L164的相对DPD表达水平(PV)除以其相应的源于TaqMan的UGE，得到不平均的校正因子K。
K不平均的＝PV/UGE
接下来，求全部K值的平均值，从而确定对DPD，校准RNA即Universal PE RNA，目录号4307281，批号3617812014和β-肌动蛋白特异的单一KDPD校正因子。
因此，为了成规模地测定与pre-TaqManDPD表达研究一致的，未知组织样品中的校正相对DPD表达，人们只需用源于TaqMan仪器的未校正基因表达数据(UGE)乘以KDPD特异性校正因子，前提是使用相同的内部对照基因和校准RNA。
校正的相对DPD表达＝UGE×KDPD
KDPD可使用任何一种精确预定量的校准RNA或内部对照基因测定。未来来源的精确预定量RNA可按照上述方法，相对于样品用已知的相对DPD表达校准或可相对于先前已经校准过的校准RNA，如UniversalPE RNA，目录号4307281，批号3617812014。校准。
例如，如果随后测定不同的内部对照基因和/或不同的校准RNA的KDPD，则人们必须相对于组织样品校准内部对照基因和校准RNA，其中已经测定了相对于特定内部对照基因的DPD表达水平。这种测定可使用本领域熟知的标准pre-TaqMan，定量RT-PCR技术进行。用这些样品的已知表达水平除以它们相应的UGE水平，可确定样品的K值。然后根据已知样品数，求K值的平均值，从而测定对不同内部对照基因和/或校准RNA特异的新KDPD。
实施例5
FPE结直肠肿瘤样品中的DPD表达
将上文所述方法用于分析来自34名晚期结直肠癌患者的34个肿瘤样品。所有患者用静脉内5-FU/LV联合方案治疗，作为前瞻性多中心欧洲5-FU/CPT11交叉试验V239的一部分。所有用静脉内5-FU425mg/m2治疗的患者在连续5天内进行15分钟输注，也在连续5天内用20mg/m2的亚叶酸进行输注。该方案作为一线或二线缓解治疗。
9名患者(25.5％)反应于5-FU/LV，该反应定义为包括完全反应，部分反应和最小反应的任何反应。具有进展性疾病或稳定疾病的患者分类为无反应者(25名患者，73.5％)。从显微解剖的FPE预治疗肿瘤样品中分离总mRNA，并且按上文所述用定量PCR测量DPD/β-肌动蛋白的相对mRNA表达水平。
反应和无反应患者组的平均校正DPD/β-肌动蛋白的水平分别是0.87×10-3和2.04×10-3。采用比较两个独立样品组值的秩的Mann-WhitneyU检验来比较反应和无反应患者组的校正的相对DPD表达水平。无反应者组中的相对DPD水平与无反应者相比显著更低(P＝0.02)。这些患者中DPD mRNA表达和对5-FU/LV的反应之间的关联如图4所示。这些数据表明，DPD表达是对基于5-FU的化疗的反应的预测因子。
                        序列表
<110>K.D.达南伯格
<120>确定二氢吡啶脱氢酶基因表达的方法
<130>11220/155
<140>09/796,807
<141>2001-03-02
<140>09/842,111
<141>2001-04-26
<140>09/879,217
<141>2001-06-13
<160>12
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>1
aggacgcaag gagggtttg                                           19
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>2
gtccgccgag tccttactga                                          20
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>3
tcactggcag actcgagact gt                                       22
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>4
tggccgaagt ggaacaca                                            18
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>5
ctgcctttga ctgtgcaaca tc                                      22
<210>6
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>6
attaacaaag ccttttctga agacgat                                 27
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>7
gaagcctatt ctgcaaagat tgc                                     23
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>8
gagtacccca atcgagccaa a                                       21
<210>9
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>9
ccgccgagtc cttactgagc acagg                                   25
<210>10
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>10
cacacggcga gctccacaac gtaga                                   25
<210>11
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>11
cagtgcctac agtctcgagt ctgccagtg                                29
<210>12
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>12
aaggaagcac aacttatact tgcaggccca g                             31

Claims (8)

1.具有SEQ ID NO：1的序列或其互补序列的寡核苷酸。
2.具有SEQ ID NO：2的序列或其互补序列的寡核苷酸。
3.一种确定组织样品中二氢嘧啶脱氢酶(DPD)基因表达的相对水平的方法，包括：
(a)从肿瘤样品分离mRNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1的序列或其互补序列的寡核苷酸引物和具有8EQ ID NO：2的序列或其互补序列的寡核苷酸扩增mRNA；
(c)比较步骤(b)的二氢嘧啶脱氢酶(DPD)的量与内部对照基因的mRNA量。
4.权利要求3的方法，其中肿瘤样品被冷冻。
5.权利要求3的方法，其中肿瘤样品被固定。
6.权利要求5的方法，其中肿瘤样品在固定后被包埋在石蜡中。
7.权利要求5或6的方法，其中在有效量的离液剂存在下分离RNA。
8.权利要求3、5或6的任意一项的方法，其中肿瘤样品包含非肿瘤组织和肿瘤组织。
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