TWI274076B

TWI274076B - Method of determining dihydropyrimidine dehydrogenase gene expression

Info

Publication number: TWI274076B
Application number: TW091103764A
Authority: TW
Inventors: Kathleen D Danenberg
Original assignee: Response Genetics Inc
Priority date: 2001-03-02
Filing date: 2002-03-01
Publication date: 2007-02-21
Also published as: WO2002070750A2; CN1250744C; EP1409723A2; JP2005508603A; CA2439313C; US7005278B2; DE60214725D1; HK1068375A1; DE60214725T2; CA2439313A1; EP1409723B1; AU2002238115B2; ATE339521T1; CN1518603A; IL157694A0; NZ528374A; AR032917A1; WO2002070750A3; US20030165840A1; MXPA03007884A

Description

1274076

發明説明（1 發明領域本發明係關於一種適用於醫、症化學治療。本笋明十奶、人、狩力】疋心任㈣，— < 月亦關於揭人腫瘤細胞之基因表現之評更特疋…本發明係關於寡核钻 PCR法偵測二氫錢脫氫酶mRNA表現之方法。用” 發明背景症：生係源於正常細胞遭遇新生性轉型並且形成惡性，.枝。轉型（惡性）細胞脫離特化細胞之表型以及限制細胞增殖I正常生理調控。在缺乏此正常調控之下，轉型細胞在個體中增殖以致形成腫瘤。當發現腫瘤，臨床主要目的係選擇性地到除惡性細胞，同時減輕進行中之治療對正常細胞造成之任何傷害。化學治療係以對癌細胞具選擇毒性（細胞毒性）之藥物:基礎。數類一般化學治療藥物已經被研發出來，其包括干擾核酸合成、蛋白質合成、以及其他重要代謝過程之藥物。 5 -氟尿喃淀（5-Fluorouracil (5-FU))係為一種廣泛使用於多種不同類型癌症之藥物，其包含主要之癌症，諸如胃腸道癌症以及乳癌（Moertel，C. G. New Engl. J. Med.，m 1 136-1142，1994)。四十多年來結腸直腸癌之標準第一線治療為單獨使用5 -氟尿嘧啶，然已被5 -氟尿嘧啶與CPT-丨丨組合之”標準療護”所取代（Saltz等人，Irm〇tecan Study Gr〇up New England Journal of Medicine. 343:905-14, 2000)。5 -氟尿嘧啶與oxaliplatin之組合近來在結腸直腸癌患者中已產生高反應率。（Raymond 等人，Semin. Oncol·, 25:4-12, 1 998)。 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1274076 A7 — _____B7 五、發明説明（2~~-- 因此，5 -氟尿嘧啶於癌症治療之使用可能將會持續多年，因為其仍為當前化學治療法之主要成分。此外，對於5 _說尿嘧哫與CPT-1 1或oxaliplatin之合併使用產生過高毒性之病人’仍須繼續單獨使用5 -氟尿嘧啶。 5 -氟尿嘧啶係為大部份抗癌藥物之典型，僅讓少數接受治療之病人體驗較佳之反應。大規模之隨機臨床試驗指出，在轉移性結腸直腸癌病人中，腫瘤對弘氟尿嘧啶單劑之整體反應率在1 5 % - 2 0 %之範圍内（Moertel，C. G. New Engl. J. Med.，330:1 136-1 142, 1994)。在與前述其他化學治療法合併之下，以5 ·氟尿嘧啶為基礎之療法對於腫瘤之反應率已可增加至40%。儘管如此，大部分接受以弘氟尿嘧:為基礎之化學療法之病人並未從該療法獲得明顯之利益，甚至須承受重大之風險、痛苦、以及費用。既然治療之前尚無可信賴之工具預測個別腫瘤之反應性，在標準之臨床應用上病人仍須接受以5 -氟尿嘧啶為基礎之治療，並可預期大部分人仍須面對令人不滿意之結果。為了鑑定出抗癌藥物最重要之生物化學特性決定因子， 5 -氟尿嘧啶之反應機制以及代謝途徑已歷經多年之密集研究。其最終目標係以下列方式增進5 -氟尿嘧啶之臨床效力 :a )調節其細胞内新陳代謝與生物化學，以及b )於治療前檢測病人腫瘤之反應決定因子’用以預測哪些病人最可能對藥物有所反應（亦或沒有反應）。從下列研究發現兩個主要之決定因子：1) 5 -氟尿嘧啶標的酵素，胸甘酸合成酵素（thymidylate synthase (TS))，以及2) 5 -氟尿嘧啶之代謝 -5- ^本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1274076 A7 B7 五、發明説明（3 ) 酵素’二氫σ密咬脫氫酶（D p D)。在預測以5 -氟尿嘧啶治療之腫瘤反應之領域中，最初之研死係以存在於結腸直腸中之標的酵素T S為中心。

Leichman 等人（Leichman 等人.，j· Clin Oncol·, 1 5:3223-3229, 1 997)進行一具有前瞻性之臨床試驗’發現腫瘤對5 _氟尿口密咬之反應與T S基因表現相關；該基因之表現係在治療前之結腸直腸癌生物切片中以rt_PCr法測得。該研究顯示： 1)在此等腫瘤中具有高達五十倍之TS基因表現，以及2) TS基因表現量在反應與不反應之腫瘤之間，有驚人之差異。反應群組之T S表現範圍（0.5-4· 1 X 10·3,相對於内含標準品）係較非反應群組（1.6-23.0 X 1〇·3，相對於内含標準品）之 T S表現範圍為窄。研究者決定一 τ S表現之，，非反應切點門 k值’南於4值係為非反應者。因此，在治療前，具有高於T S表現之非反應切點門檻值之病人即確實地被鑑定為非反應者。非反應類包括小於5 0 %之腫瘤萎縮，進行性生長造成大於2 5 %之腫瘤增加，以及非進行性腫瘤僅有小於 5 0 %之萎縮、沒有改變亦或小於2 5 %之增加之所有治療反應。遠等腫瘤具有取南之T S量。因此，高τ S表現可鑑別出某些特別的抗藥性腫瘤。T S表現量高於某一特定門權值可鑑別出一亞群對5 -氟尿喃淀不反應之腫瘤，然而τ s表現量低於該數值雖可預測具有較高反應率，但無法特異性鑑別出反應性腫瘤。接％之研％則探查二氫ϋ密咬脫氫酶（D P D)之表現量與丁 s 表現量一起作為腫瘤對5 -氟尿喃淀治療之反應決定因子之 -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1274076 A7 _____B7 五、發明説明（4 ) 有效性。二氫P密啶脫氫酶（DPD)係一種代謝酵素，其功能係返原5 -氟尿嘧啶之5，6位置之雙鍵，進而使之失去細胞毒殺性。先丽之研究已經顯示二氫嘧啶脫氫膦在正常組織之f可以影響5 -氟尿嘧啶之身體可用率，因而調節5 -氟尿口密呢之藥動性以及抗腫瘤之活性。（Harris等人，Cancer

Res·，50:197-201，1990)。除此之外，已經有證據顯示腫瘤中二氫喃咬脫氫酶量係相關於對5 _氟尿嘧啶之敏感度 (Etienne等人，j. Clin· Oncol.，13:1663-1670，1995 ; Beck等人 Eur. J. Cancer，30:15 17- 1 522，1994)。，Salonga 等人（Clin Cancer Res·，6:1322-1327，2000，特此全部以參考方式併入本文）針對一組T S表現已被決定之腫瘤，探查二氫嘧啶脫氫酶之基因表現，在做為5 _氟尿嘧啶/甲醯四氫葉酸 (leucovorin)治療之腫瘤反應決定因子之用途。如同ts，反應性腫瘤之二氫嘧啶脫氫酶表現範圍（〇 6_2 5 χ 1〇.3，4 2_ fold ;相對於内含標準品）相較於非反應腫瘤（〇.2-16 X ι〇-3 ，8 0倍；相對於内含標準品）為窄。反應性腫瘤之二氫嘧咬脫氫酶表現量皆未高於2·5 X 1〇-3門檻值。再者，二氫嘧咬脫氫酶和T S表現量並無關聯性，意即二氫嘧啶脫氫酶以及T S係為獨立調節之基因。在τ s以及二氫嘧啶脫氫酶表現量低於其個別之非反應切點門檻值之腫瘤群組中，9 2 % 對5 -氟尿嘧啶/甲醯四氫葉酸鈣有反應。因此，根據二氫口密咬脫氫酶以及T S之低表現量可以鑑定出反應性腫瘤。二氫嘧啶脫氫酶亦為5 -氟尿嘧啶毒性之重要標記。吾人已觀察到，在5 -氟尿嘧啶為基礎之治療中具有低二氫嘧啶 ra本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公董） 1274076

脫虱酶量之病人（諸如二氫嘧啶脫氫酶缺乏徵候群；例如胸腺嘲心尿喃咬尿）蒙受致命性之毒性（Lyss等人，Cancer

Invest.’ 11.23 9-240，1993)。確實，日本所發生之19件起因万；5 -氟尿嘧哫與柷病毒化合物，即索立夫定（s〇rivUcHne) (Diasio 等人，Br· J· Clin. Pharmacol. 46,1-4, 1998)之不利藥物交互作用所引起之死亡充分闡明二氫嘧啶脫氫酶含量在以5 -氟尿嘧哫治療時之重要性。之後索立夫定被發現其代謝物為一種有效之二氫嘧啶脫氫酶抑制劑。索立夫定之治療造成類似二氫嘧啶脫氫酶缺乏症之低D p D表現量，此因而增加5-氟尿哺淀對病人之毒性。（Djasi〇等人，Βγ· j. CUn. Pharmacol. 46, 1-4, 1998) 0 因此’基於：a ) 5 -氟尿嘧啶療程於癌症治療之廣泛使用’ b )二氫喃淀脫氫酶表現在預測腫瘤對5 _氟尿嘧啶之反應中之重要角色’以及0)二氫σ密咬脫氫酶缺乏症個體對一般5 -氟尿喊啶治療之易感受性，可清楚知道如能在化學治療前精確地測定二氫嘧啶脫氫酶表現量，將十分有益於癌症病患。測量二氫嘧啶脫氫酶酵素活性需要足夠之含有活性酵素之新鮮組織。遺憾地是，大部分治療前之腫瘤切片僅僅足夠用於固足石躐包埋（paraffjn embedded (FPE))，特別是福馬林固定石蠟包埋，其無法包含具有活性之酵素。此外，活體切片一般僅包含非常少量之異質組織。 RT-PCR引子以及探針序列可利用於分析冷凍組織及新鮮組織中之二氫嘧啶脫氫酶表現。然而，該等引子無法適用 -8 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1274076 A7 ___ B7 五、發明説明（6 ) 於藉RT-PCR從固定後組織定量二氫嘧啶脫氩酶mRNA。迄今為止，目前所使用之引子若非無法獲致結果，即獲致不穩、足之結果。此係歸因於a )二氫嘧咬脫氫酶RN A本質上即為低量；b )僅有少量組織包埋於石蠟；c )石蠟中之RN a 降解成小於1 0 0個鹼基對。因此，其他研究者曾經試圖得到一寡核甞酸引子組以定量石蠟化組織中二氫嘧啶脫氫酶之表現，但未成功。因此，需要一種可從固定組織定量二氫喃咬脫氫酶mRNA之方法，以對提出之癌症治療提供早期預所。由於一鼠p密淀脫氫酶酵素之活性與其相對應之 mRNA量有良好之相關性（Ishlkawa等人，Clm. Cancer Res.， 5:883-889, 1999; Johnson等人，Analyt. Biochem. 278:175-184, 2000)，測量石蠟包埋樣本中二氫嘧啶脫氫酶mRNA之表現可以在不測定新鮮組織之酵素活性下，提供一評估病人二氫喊淀脫氫酶表現量狀態之途徑。再者，石蠟包埋樣本易經由顯微鏡解剖處理，以致於二氫嘧啶脫氫酶基因表現可以在未受基質组織污染之腫瘤組織中測定。因此，本發明之目的係提供一種評估組織中二氫嘧啶脫氫酶含量以及預斷病人腫瘤對於以5 _氟尿嘧啶為基礎之治療之可能抗藥性之方法；其係藉由測定病人腫瘤細胞中二氫嘧啶脫氫酶mRNA之量，並且比較其與預定之表現量門禮值而達成。發明概要一方面本發明提供寡核：y：酸引子DpD3A-5 1F (序列編號 • 1 )或DPD3A-1 3 4R (序列編號·· 2)，以及含寡核芬酸引子 -9- g本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1274076 A7 _______ B7 五、發明説明（7 ) DPD3b-65 1F (序列編號：7)以及DpD3b-736R (序列編號：8) ’以及與其本質上相同之序列。本發明亦提供具有在嚴苛之條件之下可與DPD3A-5 1F (序列編號：1 )、DPD3A-134R (序列編號：2)、DPD3b-651F (序列編號：7)、DPD3b-736R (序列編號：8 )或其之互補體雜交之寡核甞酸引子。再者’本發明係關於決定化學治療法之方法，其包含從腫瘤樣本後取mRNA樣品；測定樣本中二氫嘧啶脫氫酶基因之表現量；將測定之二氫嘧啶脫氫酶基因表現量與預先測定之該基因之門檻值加以比較；根據測定之基因表現量與預先測定之門檻值之比較結果，決定化學治療法。本發明進一步包含一種將組織樣品中藉由Taqman技術分析而得之二氫嘧啶脫氫酶相對於内含對照基因之未校正基因表現（UGE) 丁以標準化之方法，其係使用先前發表之二氫嘧啶脫氫酶相對於内含對照品之表現量將U G E標準化而達成。圖示簡單說明圖1係顯示四種不同核：y：酸引子對於二氫喊症脫氫酶 mRNA之增幅能力之比較圖表，該二氫嘧啶脫氫酶mRNA係從1 0種不同福馬林-石堪包埋組織樣品中取得。樣品1號至 5號，及8號至1 0號係從結腸腫瘤取得，6號係從支氣管肺泡腫瘤取得，以及7號係從小腸腫瘤切片取得。寡核荅酸引子對D P D 1 (D P D - 7 0 F，（序列編號：3 )以及D P D - 2 0 1 R， (序列編號·· 4))，DPD2 (DPD2p-1129F (序列編號：5)以及 DPD2p- 1208R (序列編號：6))等無法有效測量該等樣品中 -10 - u Λ本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1274076 A7 ____B7 _ 一五、發明説明（8 ) DPD mRNA之量。寡核$:酸引子對DPD3A (DPD3a-51F (序列編號：1)、DPD3a-134R (序列編號：2)、DPD3B (DPD3b-651F (序列編號：7)以及DPD3b-736R (序列編號：8))等能有效確疋各種樣品中D P D之量。圖2係為顯示寡核甞酸引子對DpD3A (DPD3a-51F (序列編號：1)及DPD3a-134R (序列編號：2)，與寡核甞酸引子對DPD1 (DPD-70F (序列編號：3 )以及DPD-201R，（序列編號·· 4 )對於冷凍組織樣品中二氫嘧啶脫氫酶mRNA之增幅效率之比較圖表。本圖表不僅闡述DPD3A (DPD3a-51F (序列編號：1 )及DPD3a-134R (序列編號：2)能有效測量冷凍組織樣品（亦或衍生自F P F之樣品）中之D P D表現量，同時亦闡明該等引子甚至比寡核甞酸引子對Dpdi (DPD-70F (序列編號：3)DPD-201R，（序列編號：4)更為有效。圖3係闡明如何計算二氫嘧啶脫氫酶相對於内含對照基因之表現量之圖表。本圖表包含從兩種測試樣品所取得之數據’（未知樣品1與2 );並且闡明如何測定未校正基因表現數據（uncorrected gene expression data (UGE)) UCG。本圖表亦闡明如何以先前發表之二氫嘧啶脫氫酶值標準化從 Taqman儀器取得之u G E。其係將u G £與一個校正係數 KDPD相乘所得。圖中之内含對照基因為β .肌動蛋白基因，杈準用 RNA (calibrator RNA)為 Universal P£ RNA ; (Applied

Biosystems公司出品，目錄編號·· 43〇728 1，批號·· 3617812014) 〇圖4係顯示各種組織型樣本之相對校正二氫嘧啶脫氫酶 -11 _ g本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1274076 A7 ____B7 _ 五、發明説明（9 ) 表現量之方框圖。該方框圖顯示第2 5至第7 5百分位數（中間四分位數）之範圍。中數值以各方框内之水平粗線表示之。橫線表示第2 5至第7 5百分位數以外之量，但排除在方框上方過分遠離之值。發明詳細說明本發明者揭示能精確評估組織中二氫喃淀脫氫酶之表現之寡核昝酸引子以及與其本質上相同之寡核荅酸引子。該等寡核荅酸引子DPD3a-51F (序列編號：1)及DPD3a-134R (序列編號·· 2)，（此後係以寡核：y：酸引子對DPD3A表示之）以及寡核荅酸引子DPD3b-65 1F (序列編號：7 )及DPD3b-736R ( 序列編號：8)，（此後係以DPD3B寡核荅酸引子對表示之）。當被用於測量固定石蠟包埋腫瘤（FPE)樣本中之二氫嘧啶脫氫酶基因表現時特別有效。 π本質上相同” 一辭用於核酸時，係指在嚴苛之條件之下 ’可與標的雜交（hybridize)之寡核甞酸；亦指核酸片段或其之互補股，當比對時，藉由適當的核：y：酸插入及刪除而適當對齊時’至少有6 0 %，典型有至少約7 0 %，更佳至少有約8 0 %，通常至少有約9 〇 %，更常至少有約9 5 %至9 8 % 之核芬酸相同者。當與完全缺乏特異性之情況相較，雜交較具選擇性時，選擇性雜交將存在。詳見，Kanehisa，

Nucleic Acids Res·，12:203-213 (1984)。本發明包含本質上相同之寡核：y：酸，該寡核嘗酸在嚴苛之條件下，可與寡核：y：酸引子DPD3a-51F (序列編號：1 ) 之序列或其之互補體，或者寡核茹酸引子DPD3a-134R (序 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1274076 A7 ____ B7 五、發明説明（1〇 ) 列編號· 2 )之序列或其之互補體之一部份或全部雜交。進一步而了，本發明亦包含本質上相同之寡核荅酸；該寡核备酸在嚴苛之條件下’可與寡核芬酸引子DpD3b_65lF (序列編號· 7 )之序列或其之互補體，或者寡核芬酸引子 DPD3b-73 6R (序列編號：8 )之序列或其互補體之一部份或全部雜交。在嚴苛雜交條件之下，僅有具高互補性（即本質上相同）之核酸序列可雜交。該條件較佳能防止2 〇個連續核酸中有 4個以上錯誤配對，更佳2 〇個連續核酸中有兩個以上錯誤配對，取佳2 0個連續核酸有一個以上錯誤配對之核酸雜交。核酸之雜交邵分一般而言至少為1 〇個（如，1 5個）核：y：酸長度。雜X核酸之雜交邵份與寡核：y：酸引子DPj)3a-5 1F (序列編唬· 1)之序列或其之互補體，或者寡核荅酸引子DPD3a_ 134R (序列編號·· 2 )之序列或其之互補之一部份或全部有至少約8 0 % ’較佳至少約9 5 %，最佳至少約9 8 %相同。除此4外’雜X核酸之雜X部分寡核菩酸引子DPD3b-651F ( 序列編唬· 7)或其之互補體，或者DpD3b_736R (序列編號 :8 )或其之互補體之一邵份或全部有至少約8 〇 %，較佳至少約9 5 %，最佳至少約9 8 %相同。核酸樣品與寡核荅酸引子於嚴苛條件下雜交定義如下。核酸雙股亦或雜父之穩定度係以、j：容化溫度（Tm)表示，丁⑺係指探針從標的D N A脫離之溫度。該熔化溫度（丁m)被用於定義所需之嚴苛條件。若待鑑別之序列與探針為本質上相同，而非完全相同，則應首先確立在特定濃度鹽類（如s s c -13- q ?本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1274076 A7 _____B7 五、發明説明（11 ) 或SSPE)下只發生同類物雜交之最低溫度。假定每i %之錯誤配對造成TmT降一度，雜交反應之最後洗滌溫度將據此減少（舉例而言，若欲尋找與探針具9 5 %相同之序列，則最終洗滌溫度應減少5 °C。實際上，每1 %錯誤配對Tm改變〇.5°C 至 1.5°C 之間。嚴苛條件係指在5x SSC/ 5x Denhart氏溶液/1 ·0% SDS中於 68C進行雜交，以及在〇·2χ SSC/0.1% SDS中於室溫進行洗滌。中等嚴苛條件則包含於4 2 °C，以3x SSC洗滌。溫度與鹽類濃度之參數隨著標的核酸與探針之間所能達到之最佳相同程度而改變。關於該條件之附加指導在本技藝中易於獲取’舉例而了 ’ Sambrook、Fischer以及Maniatis所著之 Molecular Cloning，實驗室手冊（第二版），冷泉港實驗室印製，New York，（1989)，以及F· M. Ausubel等人所著之Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons 出版 (1994) 〇本發明之一方面包含一種從石蠟包埋樣品中萃取R N A以及繼而測定該樣品中DPD mRNA之含量之可資信賴之方法 :該測定係藉由使用寡核：y：酸引子對DPD3A [DPD3a-51F (序列編號：1 )以及DPD3a-134R (序列編號：2)]或與其本質上相同之寡核站酸，或者DPD3B [DPD3b-651F (序列編號：7)以及DPD3b-73 6R (序列編號：8)]或與其本質上相同之寡核甞酸進行反錄聚合酶連鎖反應。從石蠟包埋細胞萃取RN A係用美國專利申請案09/469,338號（申請曰期西元 1999年1 2月20日）所述從此等樣品分離mRNA之任一方法 -14- A本紙張尺度適用中國國家標準<CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1274076 A7 B7 五、發明説明（12 ) 進行’該案全文以參考方式併入本文。本發明之暴核芬酸引子可精確評估固定石犧包埋（FpE) 組織中之二氫嘧啶脫氫酶表現（圖1 )。此外，本發明之寡核菩酸引子可被用於精確測定新鮮組織或冷凍組織中之二氫嘧啶脫氫酶表現量，亦即其對於其之標的R N A具高度特異性。因此，本發明之方法並非僅適用於石蠟包埋組織。本文揭不疋寡核：y：酸引子不但適用於固定石蠟包埋組織之二氫嘧哫脫氫酶基因表現之精準測定，亦可用於冷凍或新鮮組織（圖2 )。此乃由於從石蠟包埋樣品所得之mRNA相較於新鮮或冷凍組織更為破碎，更加難以定量。因此，本發明提供適用於檢驗石蠟包埋組織中之二氫嘧啶脫氫酶表現量之寡核荅酸引子，而目前為止對於該情況尚未有適當之檢驗法。詳見圖1。二氫哺淀脫氫酶mRNA之表現與以5 _氟尿嘧啶為基礎之化學π療法之5¾床抗藥性相關。具體而言，高二氫癌症脫氫酶mRNA表現係代表對以5 -氟尿嘧啶為基礎之化學治療法具臨床抗藥性。本發明之方法係應用於廣泛之腫瘤類型。此允許製作個別腫瘤表現特徵，藉此可以測定病人個別樣品中之二氫嘧啶脫氫酶表現量，並且預測病人對於各種化學療法之反應。本發明之方法最適宜應用於支氣管肺泡（br〇nchalve〇lar) 、小細或結腸腫瘤。為了將本發明之一些具體例應用於特定腫瘤類型，較佳藉由編匯測量所得之特定二氫嘧啶脫氫酶表現參數與對5 -氟尿嘧啶之臨床抗藥性之關係之數據組 -15- 5《參紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公着）

裝訂

線 1274076

’以確證測量值與臨床抗性之關係。本方法可應用於各種型態之組織。舉例而言，要檢驗腫瘤組織之抗藥性，宜檢驗腫瘤組織。較佳亦檢驗腫瘤所來自 <病人之一部份正常組織。正常組織對於以5-氟尿嘧啶為基％之化學治療具有抗藥性，但其腫瘤卻能對該化合物具敏感性之病人，可用較高劑量之化學治療組合物治療。本發明之方法包含從病人腫瘤取得樣品細胞之步驟。固體或類淋巴組織腫瘤亦或其之部分係從病人身上進行手術切除而得。倘若無法於切除後立即從組織樣品萃取r N a，則應固定或冷凍該樣品。然後被用於獲取r N A。從切除組織之冷凍或新鮮樣品萃取以及分離之R N a藉本技藝已知之任何方法萃取，例如Sambrook、Fischer以及Maniatis所著之 Molecular Cloning，實驗室手冊（第二版），（冷泉港實驗室印製，New York，（1989))所述之方法。另外，從病人獲取之組織亦可被固定，較佳用福馬林或戊二醛處理。本發明亦涵蓋以酒精浸潤固定之生物樣品。固定之生物樣品通常被脫水並包埋於石蠟或其他孰諳此藝所熟知之固體支撐物中。該固體支撐物係被設計成能被有機溶劑所去除，以允許接下來再水合所保存之組織。本文所述之固定以及石蠟包埋組織樣本係指可保存而或可建檔之組織樣品。 R N A從石犧包埋細胞之萃取係以美國專利申請案 09/469,33 8號（申請日期西元1999年12月20日）所述之方法進行，該案之全文以參考方式併入本文。RN A最佳從來自福 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1274076 A7 B7 五、發明説明（14 馬林固定以及石蠟包埋之組織樣本之腫瘤細胞萃取而得。在本發明之一具體例子中，RNA從建檔之病理樣品或切片（先被去石蠟）單離。示範之去石蠟方法係包含以如二甲苯之有機t劑洗滌石蠟化樣品。去石蠟之樣品可以低碳醇類之水落液加以再水合。適當之低碳醇類例如包含甲醇、乙酉予丙S于、丁醇。去石蠟樣品可以連續降低濃度之低碳醇類溶液連續錢以再水合。另—選擇騎⑽品同時去石蠟以及再水合。 -旦樣品被再水合後’即可自再水合之組織萃取rna 去石蠟之樣品可經由機械、超音波或其他均質化工具進^ 均質化。在-實施例中’將再水合之樣品於含有諸如硫氰§ 瓤（guanidlnium th丨〇cyanate)(亦以異硫氛酸瓠（guanidiniu lsothlocyanate)之名販售）之擾亂劑之溶液中進行均奸化擾亂劑之有效濃度係選擇能使RNA從石壞包埋樣貝品” 化之*2：咼於未存在該擾亂劑時純化所段曰、 , w 听件10倍以上者擾亂货彳係包含但不限於：瓢化合物、昆切床素啶、甲醯胺、石化鉀、硫氰酸鉀以及相似之化合物。太 τ發明之方法使用二較佳擾亂劑為一種瓢化合物，諸如里 — Α 井硫氰酸瓠（亦以硫4 鉍狐（guanidinium thiocyanate)之名破隹成Q )，以及鹽酸^ (guanidinium hydorchloride)。許多陰禽鱼， κ囉予平衡離用’精於本技藝人士可用此等適當陰離7 用於本發明之瓤鹽溶液之有效濃度通人備3午夕孤鹽，以4 Μ為較佳。若R N A已經在溶液之中约1芏約5 M範[ 度則須提高’以使其在樣品中達到、田’孤鹽落液之：建到 < 最終濃度仍落在 •17- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

% ij

線 1274076 A7 __— B7 五、發日^明（15 ) " " ^ - 1 Μ至約5 Μ之間。瓤鹽溶液之p Η值較佳用適當之生化緩衝液諸如Tris-HCl緩衝在3至6之間，以4為更佳。擾亂劑亦可包含還原劑，諸如二硫蘇糖醇（DTT)、β-硫醇基乙醇 (ΒΜΕ)以及其之組合。擾亂劑亦可包含RNAse抑制劑。均貝化之樣品可在擾亂劑溶液中，加熱至約5 〇至約1 範圍’該擾亂劑溶液包含有效量之擾亂劑，如瓤鹽化合物。較佳之擾亂劑為硫氰酸孤。然後’將R N A齡/氯仿萃取、離子交換層析或分子篩層析從溶液中萃取出。然後可進一步用萃取技術、電泳、層析、沉殿或其他適合之技術純化R N A。 k新鮮、冷；東或固定組織純化而得之全部mRN a中二氯 p密啶脫氫酶mRNA之定量最妤以本技藝常用之反錄聚合酶連鎖反應（RT-PCR)進行。其他定量二氫嘧啶脫氫酶mRNA 之方法包括使用分子信標及其他用於多重p C R之加標籤探針。此外，本發明利用非P c R系統定量二氫嘧啶脫氫酶 mRNA，該系統例如使用類似於invader® Assay (Third Wave Technologies, Inc.)所使用之螢光標記之探針。最佳使用以螢光為基礎之即時偵測方法（ABI PRISM 7700或7900 Sequence Detection System [TaqMan®]，Applied Biosystems， Foster City，CA·)，亦或Heid 等人（Genome Res 1996; 6:986-994)及Gibson等人（Genome Res 1996; 6:995-1001)所描述之相似系統，進行二氫嘧碇脫氫酶CDNA、内含對照品或管家基因（house keeping gene)(如 β -肌動蛋白（β -actin))之定量。ABI 7700 (TaqMan® Instrument)之輸出係以循環門檻值 •18- ^㈣本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1274076 A7 B7 五、發明説明（16 (cycle thresholds)或Ct，s表示。以TaqMan®系統而言，樣品中具有較多標的基因之較高表現基因，相較於具有較少標的基因之相對較低表現基因，可以較少之PC R循環產生訊號’亦即前者具較低c t值，後者具較高C t值。本發明邵份在於發現二氫嘧啶脫氫酶mRNA之相對量與對化學治療劑5 -氟尿嘧啶之抗藥性具有相關性。本發明發現表現南量二氫喃淀脫氫酶A之腫瘤很可能對5 -氟尿口密症具抗藥性。相反地，表現低量二氫嘧啶脫氫酶mRNA 之腫瘤可能對5 -氟尿嘧啶具敏感性。病人之腫瘤二氫嘧啶脫氫酶mRNA之表現係根據與預先測定之二氫嘧啶脫氫酶表現量之門檻值比較而為判斷。在本發明中使用之管家基因（house keeping gene)或内含對知、品係指任何結構性或全面性表現之基因，該等基因之存在有助於二氫嘧啶脫氫酶mRNA量之評估。該評估包含測定基因轉錄之整體基本量，以及r N A回收變化量之對照組。管家基因或内含對照品係包含但不限於環孢素親和素 (cyclophilin)基因、β-肌動蛋白（β-actin)基因、運鐵蛋白 (transferrin)受體基因、GAPDH基因’以及其他類似之基因。最佳之内含對照基因係如Eads等人於Cancer Research 1999; 59:23 02-23 06所描述之β-肌動蛋白基因。 RN Α回收變化量之對照組需要使用校準用RN a。校準用R N A意指預先被精確定量之對照R N A之任何可獲得源。較佳使用 Applied Biosystems之Universal PE RNA (目綠編號 430728 1，批號 36 178 12014)。 -19- S5 3本紙張尺度適用中國國家標準(Cns) A4規格(210 X 297公爱) 裝- 訂線 1274076 A7 B7 五、發明説明（17 ) 此處所使用之未校正基因表現（jjncorrecte(j Gene Expression (UGE))—詞係指以TaqMan⑧儀器分析二氫p密淀脫氫酶表現量相對於内含對照基因所產生之輸出數據。用於測定U G E之方程式係陳述於實例4之中，並且於圖3以樣品計算方式例示說明。另一方面，本發明提供一種將從TaqMan儀器所獲取之未校正基因表現（UGE)值用先前發表之非TaqMan儀器獲取之相對基因表現值予以標準化之方法。先前已由Salonga等人於Clinical Cancer* ResearCh，6:13 22-1327, 2000 (全文以參考方式併入本文）發表之非TaqMan®產生之二氫嘧啶脫氫酶： β -肌動蛋白表現量相對值，較佳用組織樣品所得之二氫嘧啶脫氫酶U G Ε標準化。此處所s之’’已校正之相對二氫σ密淀脫氫酶表現”係指藉由將U G Ε與二氫嘧啶脫氫酶特定之校正係數（Kdpd)相乘所得之已標準化之二氫嘧啶脫氫酶表現，因此可以將其與先前發表範圍之值相比較。圖3將例示說明該等計算之細節。 ’’先前發表”之相對基因表現之結果係依據標的基因之 RT-PCR信號與結構性表現基因（卜肌動蛋白基因）之比例。在前-TaqMan®技術之研究中，？（：11反應係以固定之循環數進行（如3 0個），並且以各個樣品之最終點之數值報告之。該等數值係以二氫嘧啶脫氫酶表現與β ·肌動蛋白表現之比表示之。Salonga 等人，Clinical Cancer Research，6:1322- 1327，2000之全文以參考方式併入本文。如本文所界定二氫嘧症脫氫酶相對表現之預先測定門様 -20- S94本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公董）

裝- 訂

線 1274076

係一二氫嘧啶氫酶表現量，已發現高於該值腫瘤可能對 =氟尿嘧啶具有抗性。表現量低於該門檻值之腫瘤可能對於5 -氟尿嘧啶敏感。對於以5-氟尿嘧啶為基礎之化學治療法有反應I腫瘤，其二氫嘧啶脫氫酶相對表現量於約〇 6 X 1 〇_3 至約2.5 X 1〇·3之範圍（大約4·2倍之範圍）。對以卜氟尿嘧啶為基％之化學治療法不具反應之腫瘤，其二氫嘧啶脫氫酶相對表現里之範圍在約0.2 X 至约μ χ 1〇_3 (大約8 〇倍之範圍）。通常一氫ρ密淀脫氫酶相對表現量高於2.0 χ 1 〇·3，更佳高於2.5 χ 1〇·3之腫瘤對5-氟尿嘧啶治療缺乏反應。該等數值有助於決定特定樣品之校正二氫嘧啶脫氫酶相對表現是否落於預先測定之門檻值之上或下。已校正之二氫嘧啶脫氫每相對表現量為約2.0 χ 10·3至約2.5 χ 1〇·3左右。本發明之方法可應用於廣範圍之組織以及腫瘤類型，並且亦可應用於評估病人之治療以及作為乳癌、頭頸癌症、肺癌、食道癌、結腸癌以及其他癌症之診斷以及預後之工具。本發明較適宜應用於支氣管肺泡腫、小腸以及結腸癌之預後。根據在腫瘤中表現之二氫嘧啶脫氫酶mRNA之量之測定，孰諳此技之醫師得以預斷腫瘤對於以5 _氟尿嘧啶為基礎之治療之臨床抗藥性。所謂以5 -氟尿嘧啶為基礎之治療係指施以單獨的5 -氟尿嘧啶或同時包含其他化學治療法之治療；其他化學治療法包括甲醯四氫葉酸’或二氫嘧啶脫氫酶抑制劑如尿嘧啶，乙炔尿嘧啶，溴乙烯基尿嘧啶，胸腺喊唉’苯甲氧笨甲基尿嘧啶（BBU)或5-氯-2,‘二羥基吡啶 -21 - 5本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210><297公釐) 1274076 A7 B7 五、發明説明（19 ) 。再者發現式（丨）之5、去氧基-胞啶衍生物與5 -氟尿嘧啶或其衍生物之合併使用’與5 _氟尿嘧啶或其衍生物與二氫口密淀脫氫酶抑制劑5 -乙炔基尿嘧啶之合併使用相較，能促進化學治療劑選擇性輸送至腫瘤組織，以及在人類癌症異種移植物模型中顯著增進抗腫瘤活性。如上描述，本發明之實際應用係以下列提供之實驗實例例示說明。孰諳此技之醫師將明瞭所描述之實例中所使用之材料與方法可以各種方式加以修飾。該修飾係視同屬於本發明之範圍。實例實例1 從固定石蠟包埋（FPE)組織單離RN A 藉由下述通用步驟從固定石蠟包埋（FPE)組織萃取rna。 A .切片之去石蠟以及水合 (1) 將約10 μΜ之切片置於ι·5 mL之塑膠離心管中。 (2) 加入600吣之二甲苯，將該混合液於室溫（約2〇至25。〇劇烈搖動約1 0分鐘。 (3) 室溫下，該樣品以桌上型離心機之最大轉速（約1〇_ 20,000 X g)離心約7分鐘。 (4) 重複步驟2與3直至大部分之石蠟溶解。一般需要重複2至多次，視最初樣品石蠟含量而定。 (：>)藉由與低碳醇（约6〇〇 μ L) —起劇烈搖動，約3分鐘以去除二甲苯溶液，低碳醇以1〇〇%乙醇為較佳。 (6)如步驟（3)，將試管離心約7分鐘。傾倒出上清液， -22- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐)

裝- 訂

線 1274076 A7 B7 五、發明説明（2〇 ) 並丟棄之。小丸變為白色。 (7) 連續以更高稀釋倍數之乙醇溶液，重覆步驟5及6 ; 乙醇濃度最初為9 5 %，然後8 〇 %，最後為7 0 %。 (8) 如步驟（3 )’將樣品於室溫離心7分鐘。丢棄上清液，並讓小丸於室溫乾燥約5分鐘。

B ·以紛/氯仿分離R N A

(1) 加入 400 μί之異硫氰酸胍（guanidine isothiocyanate)溶液，該溶液包含0.5 %甲基甘胺酸（sarcrosine)以及8 μ L二硫蘇糖醇。裝- (2) 以組織均化器（Ultra-Turrax， IKA-Works， Inc., Wilm丨ngton，NC)均質化樣品約2至3分鐘，同時逐漸從低速 (速度1)增加至高速（速度5)。 (3) 在約9 5 C加熱樣品約5至2 0分鐘。加熱前，較佳以細微針頭刺穿含有樣品試管之蓋子。或者，管蓋亦可利用塑膠夾或實驗室薄膜固定。

線 (4) 樣品以p Η值為4.0之50 μ L 2M醋酸鈉以及600 μΐ^之酚/ 氯仿/3-甲基丁醇（10:1.93:0.036)萃取，酚/氯仿/3-甲基丁醇係以將1 8 mLS分與3.6 mL氣仿/ 3 -甲基丁醇（1:49)溶液混合而新鮮配製。劇烈搖動該溶液約1 〇秒鐘，而後置於冰上冷卻約1 5分鐘。 (5) 將該溶液以最大轉速離心約7分鐘。將上層（水溶液）液體轉移至新試管中。 (6) 將RN A於-20°C以約10 μ L肝醣及400 juL異丙醇沉殿 3 0分鐘。 _ -23- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1274076 A7 B7 五、發明説明（21 ) (7)用桌上型離心機以最大轉速離心約7分鐘以使R N a丸粒化’將上清液緩衝倒出並丟棄，以5〇〇 μ [之7 〇 %至7 5 % 之乙醇洗滌。 (8 )將該樣品以最大轉速再次離心7分鐘。將上清液去除’並將小丸風乾。以適當緩衝液（如，5 〇 ρ 1. 5 m Μ之T r i s chloride，pH 8.0)溶解小丸’以進行進一步之實驗。實例2 mRNA反錄以及（PCR) 反錄：將R N A從顯微鏡解剖法亦或非顯微鏡解剖法之福馬林固定石壤包埋組織中萃取之方法被例示說明於實例1 以及於西元1999年1 2月2 0日提出申請之美國專利申請案 09/469,338號中，後者全文以參考方式併入本文。經過乙醇沉澱與離心後，將RN A丸溶解於pH 8.0之50 μ 1 5 mM Tris/HCl°所得之RN A係以Life Technologies之6鹼基隨機引子（hexamer*)以及M-MLV RT (目錄編號：28025-02)進行反錄。反綠反應係藉由將25 μΐ RNA與25.5 μ L，，反錄混合液，， (如後所示）混合而達成。將反應置於熱循環器（thermocycler) ’以26°C/8分鐘（其目的係使6鹼基隨機引子與RN A結合）、 42°C/45分鐘（其目的係使M-MLV反錄酶進行反應）以及95C /5分鐘（其目的係將DNAse以熱去活性化）處理。 π反錄混合液”包含10 μΐ之5倍之緩衝液（pH 8.3之250 mM Tris-HCl、375 mM KC1、15 mM MgC12)，0·5 μΐ 之 6 驗基隨機引子（50 O.D.溶於550 μΐ之 10 mM Tris-HCl，pH 7.5)、5 μΐ之 10 mM dNTPs (dATP、dGTP、dCTP 以及 dTTP)，5 μΐ 之〇·1 Μ -24- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210Χ 297公釐）裝· 訂

線 1274076 A7 B7

五、發明説明（ DTT，1.25 μΐ 之 BSA (濃度 3 mg/ml，溶於pH 值為 7,5 之 10 mM Tris-HCl)、1·25 μΐ 之濃度為 24800 U/ml 之 RNA Guard (RNAse 抑制劑）（P〇rcine #27-08 16，Amersham Pharmacia)以及 2.5 μΐ 之濃度為200 U/μΙ之MMLV (Life Tech Cat#28025-02)。反應組份之最終濃度為：50 mM Tris-HCl、pH 8.3、75 mM KCM、3 mM MgC12、1.0 mM dNTP、1.0 mM DTT、0.00375 mg/ml BSA、0·62 U/ul RNA Guard以及 10 U/ul MMLV。 mRNA表現之PCR定量：二氫嘧啶脫氫酶cDNA、内含對照品以及管家基因（如β -肌動蛋白基因，如Eads等人， Cancer Research 1999; 59:23 02-2306)之定量係以螢光為基礎之即時偵測方法（ABI PRISM 7700或7900 Sequence Detection System [TaqMan®]，Applied Biosystems，Foster City，CA.)進行’該方法如 Heid 等人（Genome Res 1996; 6:986-994)及 Gibson 等人（Genome Res 1996; 6:995-1001)所描述。簡而言之，該方法係利用雙標記之產螢光寡核芬酸探針（the TaqMan® probe)，此探針可與橫跨正向及反向引子之模板增幅段特異性粘合。在P C R延伸期間，在含有反應混合物之加蓋凹穴内施以雷射刺激’造成3，消光染料（TAMRA)發光’直至探針被D N A聚合酶之5 ’ 3 ’核酸酶活性斷裂為止，此導致5，報信染料（6FAM)釋出。增幅段之製造因此造成螢光信號放出，其可藉TaqMan®之CCD (電荷-偶合裝置）偵測相機偵測，以及在P C R反應之純指數增加期中門檻循環產生之信號量反應出研究中序列之起始套數。寡核芬酸引子對DPD1 (DPD-70F (序列編號：3 )以及DPD-201R (序列 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐）裝· 訂

線 1274076 A7 B7

編號·· 4 ))之TaqMan⑧探針係dPD-i〇8Tc (序列編號·· 9 )。寡核嘗酸弓丨子對DPD2 (DPD2p-l 129F (序列編號：5)以及 DPD2p-1208R (序列編號：6)之 TaqMan®探針係 DPD-2p~ H54TC (序列編號：} 0)。寡核：y：酸引子對DpD3A (DpD3a_ 5 1F (序列編號：i )以及DPD3a-134R (序列編號：2))之 TaqMan®探針係DPD3A-71Tc (序列編號·· n )。寡核荅酸引子對DPD3B (DPD3b-651F (序列編號：7)以及DPD3b-73 6R (序列編號：8))之TaqMan®探針係DPD3b-685Tc (序列編號：1 2 )。本PCR反應包含來自DPD 1 [DPD-70F (序列編號：3 )以及 DPD-201R (序列編號：4)]、DPD2 (DPD2p-l 129F (序列編號：5)以及 DPD2p-1208R (序列編號：6)] 、DPD3B (DPD3b-65 1F (序列編號：7)，（Tm = 58°C)以及 DPD3b-736R (序列編號：8)，（Tm=60°C)，或 DPD3A [(DPD3a-51F (序列編號 :1)，（Tm=5 9°C)以及 DPD3a-134R (序列編號：2)，（Tm = 59°C)] 之寡核荅酸引子對。PCR反應混合液包含0.5 μΐ具cDN A之反錄反應液以及600 nM之任一寡核甞酸引子對（DPD1， DPD2，DPD3B，DPD3A)之二寡核芬酸引子之各個，200 nM 對應 TaqMan® 探針（DPD1，DPD2，DPD3B 或 DPD3A 之任一者之深針）、5 U AmpliTaq Gold Polymerase、各 200 μΜ 之 dATP、dCTP 及 dGTP、400 μΜ 之 dTTP、5.5 mM MgCl2、含有對照染料之1 x Taqman緩衝液A，並使最終之體積少於或等於25 μ 1 (所有試劑均來自Applied Biosystems，Foster City, CA)。循環條件為95°C/10分鐘，接續以95°C · 15秒以及 -26- ζΐβ本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇χ297公釐)

裝-

1274076 A7 __ B7 五、發明説明（24 ) 60°C /1分鐘之循環4 5個。實例3 在F PE腫瘤樣品中之DPD表現寡核荅酸引子對DPD3A (DPD3a-51F (序列編號：1 )以及 DPD3a-134R (序列編號：2))及DPD3B (DPD3b-651F (序列編號：7)以及DPD3b-73 6R (序列編號：8))使二氫嘧啶脫氫酶之基因表現可藉由RT-PCR準確且具再現性之定量，其中RT-PCT使用從石蠟包埋組織萃取之rn A。圖1顯示寡核钻酸引子對DPD3A (DPD3a-5 1F (序列編號：1 )以及DPD3a-1 34R (序列編號·· 2 ))亦顯著地增加在新鮮冷凍組織中藉由 R 丁-PCR分析二氫口密淀脫氫酉每基因表現之靈敏度。圖2如上列之實例2所述，以ABI Prism 7700序列偵測系統 (Taqman®)進行 RT-PCR。在P C R反應中使用3 0個循環。每一個循環包含96°C變性 1分鐘’ 5 5 C黏接1分鐘，以及7 2 °C鏈增長2分鐘。以 DPD3A (DPD3a-51F (序列編號：1 )以及 DPD3a-13R (序列編號：2 ))為寡核答酸引子對之增幅產物之大小係8 4鹼基對。增幅產物對應於二氫嘧啶脫氫酶cDNA中從5 ’非轉譯區域（UTR)至外顯子（Exon) 1之區域。以DPD3B (DPD3b-651F (序列編號：7)以及DPD3b-736R (序列編號：8))為寡核芬酸引子對之增幅產物之大小係8 6鹼基對。增幅產物對應於二氫嘧啶脫氫酶cDNA中外顯子6之區域。比較寡核^:酸引子對DPD3A [DPD3a-5 1F (序列編號：1 ) 及 DPD3a-134R (序列編號：2)]以及 DPD3B [DPD3b-65 1F (序 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1274076 A7 ____B7 五、發明説明（25 ) 列編號：7 )及DPD3b-736R (序列編號：8 )]與其他現存之引子組在增增^一氫A淀脫氫酶m RN A上之能力，該二氫口密啶脫氫酶mRNΑ係從十種不同固定石蠟包埋組織樣品取得 -。樣品號碼1至5，及號碼8至1 0係從結腸取得，號碼6從支氣管肺泡腫瘤切片取得，及號碼7從小腸腫瘤切片取得。其他所使用之寡核站酸引子對係DPD 1 [(DPD-70F (序列編號：3 )及DPD-201R (序列編號：4 )]及與DPD2 [DPD2p-1 129F (序列編號：5 )及DPD2p-i208R (序列編號：6)]。寡核站酸引子對DPD3A (DPD3a-51F (序列編號：1 )及 DPD3a-1 34R (序列編號：2 ))對測定各種樣品之二氫嘧啶脫氫酶量最為有效。寡核芸酸引子對DPD3B (DPD3b-651F (序列編號：7 )及DPD3b-736R (序列編號：8 ))亦有其效力，然其並無法提供一個強烈之訊號。圖1說明其結果。實例4 測定二氫嘧啶脫氫酶之未校正基因表現進行兩組平行之反應，測試，，反應以及"校準，，（caHbrati〇n) 反應。二氫嘧啶脫氫酶之增幅反應及β -肌動蛋白内含對照品之增幅反應係測試反應。β_肌動蛋白與二氫嘧啶脫氫酶之增幅反應分別對於校準用RN Α進行，且稱之為校準反應。 Taqman儀器能產生四種不同循環門檻值(Ct):來自測試反應之CtDPD及Ctp.肌動蛋白以及來自校準反應之ctDpc^Ctp-肌動蛋白。兩種反應中C t值之差異係根據下列方程式決定： △ Ct測試=CtDPD-CtP-肌動蛋白（從”測試'，反應所得） △ Ct校準=CtDPD_Ctp_肌動蛋白（從丨’校準，丨反應所得） -28- 5¾¾本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公爱) 1274076 A7 B7 五、發明説明（26 ) 其次的步驟係根據下列方程式，涉及將數字2乘以負ACt。 2^、試（從"測試，，反應所得） △Ct校準（從"校準，’反應所得）為從Taqmari儀器獲取二氫嘧啶脫氫酶之未校正基因表現 (uncorrected gene expression)，進行下歹ij 計算： DPD之未校正基因表現（UGE) = 2‘t測試/2-Δ(：ί校準用先前發表之數值標準化（normalize) UGE 標準化計算包含將U G E與一個校正係數（Kdpd)相乘，該校正係數對於二氫嘧咬脫氫酶以及一特定校準用R N A具專一性。該校正係數KDPD可用任何内含對照基因及任何預先被精確定量之校準用R N A測定。較佳使用内含對照基因以 β -肌動蛋白基因及預先被精確定量之校準用RN A : Universal PE RNA (Applied Biosystems之產品，目錄編號： 4307281，批號：3617812014。

標準化係以丁aqman之製造商，即Applied Biosystems於其使用者小冊2號所述或上述之修正法達成。為了進行該步驟，用上述Taqman方法分析先前發表之六種測試組織之 U G E，以了解二氫嘧啶脫氫酶之表現。使用内含對照基因 β -肌動蛋白基因以及校準用RN A即Universal PE RNA

Applied Biosystems之產品，目錄編號：430728 1，批號： 3617812014 〇將Sal onga等人（全文以參考方式併入本文）先前所述之各樣品之相對二氫喊淀脫氫酶表現量（PV) : L7，L9 1，L 1 2 1， L150，L220和L164 ’除以其相對應之Taqman所得UGE值， -29- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1274076 A7 _________ B7 __ 五、發明説明（27 ) 可得到一個未平均之校正係數，κ。

Κ未平均= PV/(JGE 其’人’平均所有K值以決定對二氫p密淀脫氫酶、 universal PE RNA (目錄編號 4307281 ,批號·· 36178 12014，才父準用RNA)及β -肌動蛋白具專一性之單一 kdpd校正係數。因此’假若使用相同之内含對照基因以及校準用r N A，則未知組織樣品中校正之相對二氫嘧啶脫氫酶表現量如欲用與先前發表之Taqman二氲嘧啶脫氫酶表現研究一致之標度測定’僅需將得自Taqman儀器之未校正基因表現（UGE) 數據乘以專一校正係數kdpd即可。

校正之相對DPD表現= UGE X KDPD KDPD可藉由任何預先被精確定量之校準用R n A測定之。未來預先被精確定量r N A之來源可用上述方法所述之已發表樣品校準，或可用先前已校準之校準用r N A諸如上述

Universal PE RNA (目錄編號：4307281 ，批號： 361 78 12014)校準。實例5 固定石蠟包埋之結腸直腸腫瘤樣品之二氫嘧啶脫氫酶表現以上述之方法被用於分析3 4個末期結腸直腸癌病人之 3 4個腫瘤樣品。所有病人施以靜脈注射之5 -氟尿嘧唉/ l v 組合療法’遠療法係歐洲前瞻多中心5 -氟尿σ密淀/ Cp 丁 11交又測試案V239之一部分。連續五天對所有病人靜脈輪注5 _ 氟尿喃咬1 5分鐘，劑量為425 mg/m2，並輸注劑量為 20mg/m2之甲醯四氫葉酸，連續五天。該療法係作為第一 -30- 涵本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱] "—' ' 1274076 A7 B7 五、發明説明（28 ) 道或第二道緩解治療。九位病人（25.5%)對5-氟尿嘧啶/LV有所反應，該反應被定義為任何反應，包含完全反應、部分反應以及最小反應。其中進行性疾患與穩定疾患之病人被歸類為不反應者有 2 5位，即73.5%。全部A係從顯微鏡切片之固定石蠟包埋預處理腫瘤樣品中分離出，且二氫嘧啶脫氫酶/ β _肌動蛋白之相對mRN Α表現量以上述之定量p c r測量。杈正二氫嘧哫脫氫酶之平均值：反應與非反應群組病人之β-肌動蛋白量分別為〇.87 χ 1〇_3及2〇4 χ丨〇〇。以曼—惠特尼U 4驗（Mann-Whitney U test主要比較兩獨立樣品組數值之級位）分析比較反應與非反應群組之校正之相對二氖。密建脫氫酶表現量。反應群組之相對二氫嘧啶脫氫酶量：較於非反應者明顯地較低（P=0 〇2)。圖4顯示二氫錢脫气酶mRNA表現與病人對5.氟尿錢/LV之反應之關係。該寺數據顯示二氫㈣脫氫酶表現可作為對以5•氟基礎之化學治療法之反應之預斷因子。 … 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公复） 1274076 A7 B7 五、發明説明（29 ) 序列表 <110> Danenberg, K. <120>測定二氫嘧啶脫氫酶基因表現之方法 <130> 11220/157 <140> 09/796,807 <141> 2001-03-02 <140> 09/842,1 1 1 <141> 2001-04-26 <140〉09/879,2 17 <141> 2001-06-13 <160〉 12 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210〉 1 <21 1〉19 <212> DNA <2 13>合成序列 <220> <223〉寡核甞酸引子 <400> 1 aggacgcaag gagggtttg 19 <210> 2 <2 1 1> 20 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210X297公釐） 1274076 A7 B7 五、發明説明（3〇 ) <2 12> DNA <2 13>合成序列 <220> <223〉寡核茹酸引子 <4 0 0 > 2 gtccgccgag tccttactga 20 <210> 3 <21 1> 22 <212> DNA <213〉合成序列 • <220> <223〉寡核荅酸引子 <400〉 3 tcactggcag actcgagact gt 22 <210> 4 <211> 18 <212〉DNA <2 13〉合成序列言丁 # <220> <223>寡核：y：酸引子 k m* <400> 4 tggccgaagt ggaacaca 18 < <210> 5 <21 1> 22 <212> DNA <213>合成序列 -33-1^7本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1274076 A7 B7 五、發明説明（31 ) <220> <223〉寡核嘗酸引子 <400> 5 ctgcctttga ctgtgcaaca tc 22 <210> 6 <2 1 1> 27 <212> DNA <2 13>合成序列 <220〉 <223〉寡核苷酸引子 <400> 6 attaacaaag ccttttctga agacgat 27 <210> 7 <21 1> 23 <212〉DNA <213〉合成序列 <220> <223〉寡核：y：酸引子 <4 0 0 > 7 gaagcctatt ctgcaaagat tgc 23 <210> 8 <21 1> 21 <212> DNA <213>合成序列 <220> -34- 5¾¾本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210X297公釐)

線 1274076 A7 B7 五、發明説明（32 ) <223>寡核荅酸引子 <400> 8 gagtacccca atcgagccaa a 21 <210〉 9 <21 1> 25 <212> DNA <2 13>合成序列 <220> <223>寡核甞酸引子 <400> 9 ccgccgagtc cttactgagc acagg 25 <210> 10 <21 1> 25 <212> DNA <213〉合成序列 <220> <223>寡核芬酸引子 <400> 10 cacacggcga gctccacaac gtaga 25 <210> 1 1 <21 1> 29 <212> DNA <2 13>合成序列 <220> <223〉寡核荅酸引子 -35- 5¾¾本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1274076 A7 B7 五、發明説明（33 ) < 4 0 0 > 1 1 cagtgcctac agtctcgagt ctgccagtg 2 9 <210> 12 <21 1> 3 1 <2 12> DNA <2 13>合成序列 <220> <223>寡核芬酸引子 <400> 12 aaggaagcac aacttatact tgcaggccca g 31 __-36- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

Claims

12740界1103764號專利申請案中文申請專利範圍替換本(94年1月） A8 B8 C8 D8

申請專利範圍列列酸犧 5丨 2 . 一列列酸蠟列列酸蠟 5, 4.-列列酸蠟種經分離及純化之寡核苷酸，其係由序列編號丨之序、或至少或約8 0 %相同於或在嚴苛條件下雜交於序編號1之序列所組成，其中該經分離及純化之寡核甞备與序列編號2 —起使用時，可增幅分離自固定及石包埋（FPE)組織之一處^密咬脫氫酶（DPD)mRNA之未轉澤區域及外顯子1(Εχ〇η 1)之部份。種經分離及純化之寡核甞酸，其係由序列編號2之序、或至少或約8 0 %相同於或在嚴苛條件下雜交於序編號2之序列所組成，其中該經分難及純化之寡核甞當與序列編號1 一起使用時，可增幅分離自固定及石包埋（FPE)組織之二氫嘧啶脫氫酶（DPD)mRNA之未轉譯區域及外顯子1 ( E X ο η 1 )之部份。種經分離及純化之寡核苷酸，其係由序列編號7之序、或至少或約8 0 %相同於或在嚴苛條件下雜交於序編號7之序列所組成，其中該經分離及純化之寡核甞當與序列編號8 —起使用時，可增幅分離自固定及石包埋（F Ρ Ε)組織之二氫嘧啶脫氫酶（D P D ) m R Ν Α之未轉譯區域及外顯子1 ( E X ο η 1 )之部份。種經分離及純化之寡核苷酸，其係由序列編號8之序、或至少或約8 0 %相同於或在嚴苛條件下雜交於序編號8之序列所組成，其中該經分離及純化之寡核甞當與序列編號7 —起使用時，可增幅分離自固定及石包埋（F Ρ Ε )組織之二氫嘧啶脫氫酶（D P D ) m R Ν Α之未轉譯區域及外顯子1 ( Ε X ο η 1 )之部份。 76895-940118.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐) 1274076 as B8 C8 _____— D8 六、申請專利範圍 5 · —種偵測組織中二氫嘧啶脫氫臃（DpD)基因表現之套組，其包含至少2個寡核嘗酸引子，該2個寡核甞酸引子係由下列所組成··序列編號i之序列、或至少或約8 〇 % 相同於或在嚴苛條件下雜交於序列編號1之序列，其當與序列編號2 —起使用時，可增幅分離自固定及石犧包埋（FPE)組織之二氫嘧啶脫氫酶（DPD)mRNA之一部份，及序列編號2之序列、或至少或約8 〇 %相同於或在嚴苛條件下雜交於序列編號2之序列，其當與序列編號 1 一起使用時，可增幅分離自固定及石犧包埋（F p E)組織之二氫嘧啶脫氫酶（D p D ) m R N A之一部份。 6 · —種測定組織樣品中二氫嘧啶脱氫酶基因表現之相對量之活體外方法，其包含： (a)提供一分離自病人之腫瘤樣品； (b )從該腫瘤樣品分離mRN A ; (Ο以具有序列編號1之序列、或至少或約8 〇 %相同於或在嚴苛條件下雜交於序列編號1之序列之寡核荅酸引子，及具有序列編號2之序列、或至少或約 8 0 %相同於或在嚴苛條件下雜交於序列編號2之序列之春核菩酸引子，增幅mRNA ;及 (d)比較由步驟⑷所得之二氫嘧啶脫氫酶（DpD) mRNA 之里與内含對照基因之mRN A之量。 7 ·如申請專利範圍第6項之方法，其中腫瘤樣品從病人採取後被冷；東處理。 8 .如申請專利範圍第6項之方法，其中腫瘤樣品從病人採 -2 - 76895-940118.DOC 本紙張尺度適财S目家標準(CNS) A4規格(210X297公 A8 B8 C8 D8 1274076 六、申請專利範圍取後被固定處理。 9 ·如申睛專利範圍第8項之方法，其中腫瘤樣品於固定後被包埋在石蠟中固定。 10·如申請專利範圍第8或9項之方法，其中rn A係於存在有效量之擾亂劑下被分離。 11.如申請專利範圍第6、8或9項之任一項之方法，其中腫瘤樣品包含非腫瘤組織以及腫瘤組織。 12· —種決定以5 -氟尿嘧啶（5_FU)為基礎之化學治療法治療病人之腫瘤之活體外方法，其包含： (a) 提供一分離自病人之腫瘤樣品； (b) 將至少一部份之腫瘤樣品固定於石蠟中，以達成固定及石蠟包埋（F P E )之腫瘤組織樣品； (c )從該F P E腫瘤樣品分離mRN A ; (d)以一對寡核甞酸引子，其中之一者係具有序列編號1之序列、或至少或約8 0 %相同於或在嚴苛條件下雜交於序列編號1之序列，及另一者係具有序列編號2之序列、或至少或約8 〇 %相同於或在嚴苛條件下雜交於序列編號2之序列，使分離自該F P E腫瘤組織進行增幅，以獲得增幅樣品； (e )測定增幅樣品中二氫嘧啶脫氫酶（DPD) mRNA之量 (Ο將增幅樣品中二氫者啶脫氫酶（DPD) mRNA之量與預先測定之二氫嘧啶脫氫酶表現之門檻值加以比較；及 -3- 76895-940118.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1274076

(g )依據被增幅樣品中二氫嘧啶脫氫酶mRNA之量與二氯喃唉脫氫酶基因表現之門檻值之差異，決定以氟尿嘧啶（5-FU)為基礎之化學治療法。 13·如申凊專利範圍第1 2項之方法，其中該預先測定之二氯°密咬脫氫酶表現之門檻值係内含對照基因表現量之約2_0至2.5倍。 14·如申請專利範圍第1 2或1 3項之方法，其中該内含對照基因係β -肌動蛋白基因。 15·如申請專利範圍第1 3項之方法，其中mRNΑ於有效量之擾亂劑存在下被分雜。 16· —種測定組織樣品中二氫嘧啶脫氫酶基因表現之相對里之’舌體外方法，其中包含：〇)提供一分離自病人之腫瘤樣品； (b )從該腫瘤樣品分離mRN A ; (Ο以具有序列編號7之序列、或至少或約8 0 %相同於或在嚴苛條件下雜交於序列編號7之序列之寡核菩酸引子，以及具有序列編號8之序列、或至少或約 8 0 %相同於或在嚴苛條件下雜交於序列編號8之序列之暴核答酸引子，增幅mRNA ;及 (d)比較由步驟（c)所得之二氫嘧啶脫氫酶（DpD) mRNA 之量與内含對照品之mRN A之量。 17.如申請專利範圍第1 6項之方法，其中腫瘤樣品於採取後被冷凍處理。 18·如申請專利範圍第1 6項之方法，其中腫瘤樣品被固定 -4 - 76895-940118.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公酱) 1274076 as B8 C8

後被包埋在石4鼠中固定。 19. 如申請專利範圍第18項之方法，其中mRNA於有效量之擾亂劑存在下被分離。 20. 如申巧專利範圍第i 6項之方法，其中組織樣品係從腫瘤獲取。 21·如申請專利範圍第丨9項之方法，其中腫瘤樣品包含非腫瘤組織以及腫瘤組織。 22· —種決定以5 -氟尿嘧啶（5-FU)為基礎之化學治療法之治療病人之腫瘤之活體外方法，其包含：〇)提供一分離自病人之腫瘤樣品； (b )將至少一部份之腫瘤樣品固定於石蠟中，以達成固定及石壤包埋（F P E )之腫瘤組織樣品； (c )從該F P E腫瘤樣品分離mRNA ; (d)以一對寡核苷酸引子，其中之一者係具有序列編號7之序列、或至少或約8 〇 %相同於或在嚴苛條件下雜交於序列編號7之序列，及另一者係具有序列編號8之序列、或至少或約8 0 %相同於或在嚴苛條件下雜交於序列編號8之序列，使分離自該F P E腫瘤組織進行增幅，以獲得增幅樣品； (e )測定增幅樣品中二氫嘧啶脫氫酶（DPD) mRNA之量 (f)將增幅樣品中二氫喊淀脫氫酶（DPD) mRNA之量與預先測定之二氫喃淀脫氫酶表現之門摇值加以比較；及 -5- 76895-940118.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1274076 A8 B8 C8 no

(g)依據增加樣品中二氫嘧啶脫氫酶mRNA之量與二氯嘧啶脫氫酶基因表現之門檻值之差異，決定以5_氣尿一淀（5-FU)為基礎之化學治療法治療該病人。 23. 如申請專利範圍第2 2項之方法，其中該預先測定之二鼠<脫氫酶表現之門；f監值係内含對照基因表現量之約2.0至2.5倍。 24. 如申請專利範圍第2 2或2 3項之方法，其中該内含對照基因係β -肌動蛋白基因。 25. 如申請專利範圍第6、1 2、1 6及2 2項中任一項中之方法’其中至少一種組織樣品包含支氣管肺泡腫瘤組識、小腸腫瘤組織或結腸腫瘤組織。 26. 如申凊專利範圍第5項之套組，其中至少一種組織樣品包含支氣管肺泡腫瘤組織、小腸腫瘤組織或結腸腫瘤組織。 27· —種偵測組織中之二氫嘧啶脫氧酶（〇 p d )基因之表現之套組，其包括至少二個寡核甞酸引子，該二個寡核甞酸引由由下列所組成：序列編號7之序列、或至少或約8 0 %相同於或在嚴苛條件下雜交於序列編號7之序列，其當與序列編號8 —起使用時，可增幅分離自固定及石蠟包埋（FPE)組織之二氫嘧啶脫氫酶（DPD)mRN A 之一部份；及序列編號8之序列、或至少或約8 0 %相同於或在嚴苛條件下雜交於序列編號8之序列，其當與序列編號7 —起使用時，可增幅分離自固定及石堪包埋 (FPE)組織之二氫嘧啶脫氫酶（DpD)mRNA之一部分 76895-940118.DOC -6- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

裝” 訂

1274076 as B8 C8 ------- —__一 —__D8 六、申請專利範圍 28. —種偵測在固定或固定及石蠟包埋組織中之二氡嘧啶脫氧酶（D P D )基因之表現之套組，其包括至少^個寡核苷酸引子，該二個寡核苷酸引子由下列所組成：序列編號1之序列、或至少或約8 0 %相同於或在嚴苛條件下雜交於序列編號1之序列，及序列編號2之序列、或至少或約8 0 %相同於或在嚴苛條件下雜交於序列編號2 之序列。 29. —種偵測在固定或固定及石蠟包埋組織中之二氫嘧淀脫氧酶（DPD)基因之表現之套組，其包括至少二個寡核甘fel引子’該二個寡核嘗酸引子由下列所組成：序列編號7之序列、或至少或約8 〇 %相同於或在嚴苛條件下雜交於序列編號7之序列，及序列編號8之序列、或至少或約8 0 %相同於或在嚴苛條件下雜交於序列編號8 之序列。 -7- 76895-940118.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)