CN1246695C - 田基黄药材tlc指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及田基黄药材TLC指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱。首先，取田基黄药材粉末，加水回流提取，滤过，减压浓缩，加入乙醇，搅匀，放置过夜，滤过，滤液减压回收乙醇近干，加乙醇溶解，转移至10ml容量瓶中，定容至刻度，得供试品溶液；再精密称取槲皮苷，置于容量瓶中，加95%乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，制成1mg/ml参照物溶液；然后进行薄层层析和扫描：薄层板为聚酰胺薄膜，展开剂为水-95%乙醇-甲酸-乙酰丙酮(9∶2∶2∶1)；显色剂为2%三氯化铝-乙醇溶液，扫描波长为320nm；得到田基黄药材TLC指纹图谱。通过对32批田基黄药材进行分析，构建了田基黄药材的标准指纹图谱。利用该标准指纹图谱可对田基黄药材质量进行有效控制。
Description
技术领域
本发明涉及田基黄药材TLC指纹图谱的构建方法，以及由此方法所得到的田基黄药材标准指纹图谱。
背景技术
中药质量标准化及其品质评价方法研究是我国中医药行业亟待解决的问题。由于种种原因，目前的中药质量标准很不完善，市场上屡见中药的混淆品甚至伪品，严重危害人们的用药安全。要想控制伪劣药材的蔓延，必须加强对中药质量的研究，制定出更完善、更准确且更有权威性的评价中药质量的方法，这已成为人前的共识。
目前中药质量评价以中药内一、二个有效成分的含量为指标，这样常常会引起争议，因为中医理论十分强调中药的整体效应，重视诸化学成分在药效上的协同作用。仅以中药一、二个“有效成分”作为定量指标，远未能从整体上反映中药的内在质量。从化学的角度看，中药的疗效，实质上是中药内各种化学成分协同作用的结果。单凭其中一、二种成分或少数几种成分的含量，并不能全面反映中药质量的优劣，因此建立从整体上综合评价中药质量的方法很有必要。
中药质量的优劣，归根到底在于其内所含的化学成分及含量上存在的差异。这种差异可以通过中药的色谱指纹图谱反映出来。采用现代色谱分析技术，可选用适当方法，一次得到若干个色谱峰，每一个峰的位置代表不同组分，其峰面积的大小反映了各组分的含量高低。因此，色谱指纹图谱能够从整体上反映中药质量的差异，能够较好地体现出中药成分的复杂性和相关性，尤其是在现阶段绝大多数有效成分不明确的情况下，能够更好地反映并评价、控制中药的内在质量。
色谱指纹图谱在国际上易获得认可，美国在植物药制品指导原则(草案)中允许申报者提供产品色谱指纹图谱资料，英国草药典、加拿大药用及芳香植物学会、德国药用植物学会、印度草药典也接受色谱指纹图谱。因此，为中药材建立相应的指纹图谱，是现阶段控制中药内在质量的有效手段。
田基黄系金丝桃科植物地耳草(Hypericum juaponicum Thunb)的全草，属一年生草本，分布于江苏、浙江、云南、四川、广东、广西、贵州、湖南、江西、福建等地。于夏、秋季采，洗净，晒干，以全草入药。但目前田基黄的质量标准极不完善。
发明内容
本发明的目的是提供田基黄药材TLC指纹图谱的构建方法以及由该方法所得到的田基黄药材标准指纹图谱。
本发明的田基黄药材TLC指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
(1).供试品溶液的制备：取田基黄药材粉末，加水回流提取，滤过，减压浓缩，加入95％乙醇，使溶液含醇量不少于60％(V/V)，搅匀，放置过夜，滤过，滤液减压回收乙醇近干，加95％乙醇溶解，转移至容量瓶中，定容至刻度，得到供试品溶液；
(2).参照物溶液的配制：精密称取槲皮苷对照品，置于容量瓶中，加95％乙醇使溶解并定容至刻度，摇匀，制成参照物溶液；
(3).薄层层析和扫描：分别吸取上述供试品和对照品溶液，点于聚酰胺薄膜上，以水-95％乙醇-甲酸-乙酰丙酮(9∶2∶2∶1体积比)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％(W/V)三氯化铝-乙醇溶液；置薄层扫描仪上，在320nm波长处扫描测定，计算其比移值Rf，得到田基黄药材的TLC指纹图谱。
按照上述方法，通过对32批田基黄药材的TLC指纹图谱进行比较分析找出其共有特征峰，计算各共有特征峰的位移值Rf，得到田基黄药材标准指纹图谱。共有峰为4、6、7、11、13、15、17、19、20、21十个峰(见图3)，Rf值分别为0.05、0.13、0.18、0.32、0.41、0.47、0.55、0.62、0.70、0.75，它们构成了田基黄药材的指纹特征。
本发明经反复试验，优选了薄层层析和薄层扫描的条件。具体说明如下：
薄层板：田基黄有效成分主要是黄酮类化合物，聚酰胺薄膜常用于分离黄酮类成分，因此选择聚酰胺薄膜。
展开剂：经多次试验，展开剂为水∶95％乙醇∶甲酸∶乙酰丙酮(9∶2∶2∶1)时，样品中各组分分离较好，扫描基线平稳。因此确定水∶95％乙醇∶甲酸∶乙酰丙酮(9∶2∶2∶1)为展开剂。
显色剂：黄酮类常用的显色剂有三氯化铁-乙醇溶液、三氯化铝-乙醇溶液、氨熏等。经试验，用2％三氯化铝-乙醇溶液显色后，样品斑点清晰，荧光强，信息量大。因此，选用2％三氯化铝-乙醇溶液为显色剂。
扫描波长：样品扫描图在各波长下基线均很平稳，但是在320nm波长扫描信息量大，因此选择320nm为扫描波长。
提取方法：经反复试验，水提醇沉的扫描基线较好，因此选择水提醇沉法。
参照物的选择：参照物一般要选取活性成分或指标成分，资料表明田基黄中有效成分主要为黄酮类成分，本发明选择槲皮苷为参照物，其分子量为464，化学结构式如下：
槲皮苷结构式
本发明具有以下优点及用途：目前中药质量评价以中药内一、二个有效成分的含量为指标，这样常常会引起争议，因为中医理论十分强调中药的整体效应，重视诸化学成分在药效上的协同作用。仅以中药一、二个“有效成分”作为定量指标，远未能从整体上反映中药的内在质量。从化学的角度看，中药的疗效，实质上是中药内各种化学成分协同作用的结果。单凭其中一、二种成分或少数几种成分的含量，并不能全面反映中药质量的优劣，因此建立从整体上综合评价中药质量的方法很有必要。田基黄药材含有多种黄酮类化合物，以往的质量检测方法仅对其中水解后的槲皮素进行了测定，没能全面反映其质量，而利用本发明的方法可从图上看出多个化合物的有无及量的多少，从而可有效地对田基黄药材质量进行控制。同时本发明采用TLC法，具有快速、经济、重现性好、简便、可操作性强等优点。
以下结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。
附图说明
图1是田基黄药材样品TLC图；
图2是田基黄药材样品薄层扫描三维图象；
图3是田基黄药材标准指纹图谱。
具体实施方式
本发明的实施例如下：
1.仪器与试药
1.1仪器：自动点样仪(Automatic TLC Sampler 4，瑞士CAMAG)；薄层色谱摄像仪(Reprostar 3，瑞士CAMAG)；薄层色谱扫描仪(TLC Scanner 3，瑞士CAMAG)；双槽展开缸(瑞士CAMAG)；聚酰胺薄膜10cm×20cm(艺能色谱材料厂)。
1.2试药：田基黄药材共32批，分别采自江苏、浙江、云南、四川、广东、广西、贵州、湖南、江西、福建等地，经鉴定全部样品均为《中国药典》所指定的品种，系金丝桃科金丝桃属植物地耳草(Hypercum japonicum Thunb.)的全草。对照品为槲皮苷(WA17779，Fluka公司)；实验所用试剂均为分析纯。
2.方法与结果
2.1供试品溶液的制备：剔除田基黄全草中的杂草，洗净，晒干，粉碎过2号筛，分别取各产地田基黄药材粉末约3.0g，精密称定，加水40ml回流1h，滤过，减压浓缩至5ml，定量加入95％乙醇17ml，使溶液含醇量达75％，搅匀，放置过夜，滤过，滤液减压回收乙醇近干，加95％乙醇溶解，定量转移至10ml容量瓶中，稀释至刻度，即得。
2.2参照物溶液的配制：取槲皮苷对照品适量，精密称定，置于10ml容量瓶中，加95％乙醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，制成1mg/ml的溶液，即得。
2.3薄层层析及扫描：分别精密吸取各产地田基黄药材供试品溶液3μl，参照物溶液5μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，在室温(25℃)和湿度65％左右条件下，以水-95％乙醇-甲酸-乙酰丙酮(9∶2∶2∶1)为展开剂，预饱和10分钟，展开，展距14～16cm，取出，晾干，喷以2％三氯化铝乙醇溶液，加热至显色清晰，置紫外光(366nm)灯下拍照，然后单波长反射法线性扫描，自原点开始对斑点一次连续全程扫描，扫描波长为320nm，扫描速度为100mm/s，光束狭缝为5.00mm×0.45mm。得到各批田基黄药材样品和参照物槲皮苷的TLC图和三维扫描图(图1，图2)。
2.4参照物峰的标定：将参照物槲皮苷色谱与供试品田基黄药材的色谱进行对照，表明7号峰为槲皮苷色谱峰。
2.5共有峰确定：将32批田基黄药材的色谱峰进行比较，共出现21个色谱峰。其中：共有峰为4、6、7、11、13、15、17、19、20、21十个峰，Rf值分别为0.05、0.13、0.18、0.32、0.41、0.47、0.55、0.62、0.70、0.75；它们构成了田基黄药材的指纹特征(见图3)，可作为田基黄药材的标准指纹图谱。
Claims (2)
1.一种田基黄药材TLC指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
(1).供试品溶液的制备：精密称取田基黄药材粉末，加水回流提取，滤过，减压浓缩，加入95％乙醇，使溶液含醇量不少于60％V/V，搅匀，放置过夜，滤过，滤液减压回收乙醇近干，加95％乙醇溶解，转移至容量瓶中，定容至刻度，得到供试品溶液；
(2).参照物溶液的配制：精密称取槲皮苷对照品，置于容量瓶中，加95％乙醇使溶解并定容至刻度，摇匀，制成参照物溶液；
(3).薄层层析和扫描：分别吸取上述供试品和对照品溶液，点于聚酰胺薄膜上，以按体积比9∶2∶2∶1的水-95％乙醇-甲酸-乙酰丙酮为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％三氯化铝-乙醇溶液；置薄层扫描仪上，在320nm波长处扫描测定，计算其比移值Rf，得到田基黄药材的TLC指纹图谱；
(4).测定32批田基黄药材的TLC指纹图谱并进行比较，得到由其共有特征峰构成的田基黄药材标准指纹图谱，该指纹图谱具有的共有特征峰为(4)、(6)、(7)、(11)、(13)、(15)、(17)、(19)、(20)、(21)十个峰，各峰位移Rf值分别为0.05、0.13、0.18、0.32、0.41、0.47、0.55、0.62、0.70、0.75。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征是：在制备供试品溶液时，加水量为不少于生药量的5倍重量，回流的时间不少于10min。
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