CN107132306A - 一种侧柏叶tlc快速鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种侧柏叶TLC快速鉴别方法，取待测样品，加水、盐酸、乙酸乙酯，水浴加热回流水解，趁热滤过，滤液分液、水洗、蒸干，残渣加甲醇溶解，作为供试品溶液；采用薄层色谱法，紫外光灯下检视。具有高效、便捷、重现性好、色谱清晰，各斑点分离良好等优点。

Description

一种侧柏叶TLC快速鉴别方法

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种侧柏叶TLC快速鉴别方法。

背景技术

侧柏叶又名柏叶、丛柏叶、扁柏、云片柏等，是医家所重视的治血良药。中医认为侧柏叶味苦，性微寒，无毒，入心、肝、大肠经。具有凉血、止血、祛内湿、散肿毒之功。可治吐血、鼻出血、尿血、血痢、崩漏、风湿痛、咳嗽、烫伤等症。根据科学研究表明，侧柏叶含大量的挥发油，油中主要成分为侧柏烯、小茴香酮等，叶中还含有钾、钠、磷、氮、钙、镁、锰和锌等多种微量元素。药理实验表明，侧柏叶煎剂能够明显的缩短出血时间及凝血时间，除此以外，还有镇咳、平喘、祛痰、镇静等作用。相关实验表明，侧柏叶对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、卡他球菌、白喉杆菌、伤寒杆菌等均有很好的抑制作用，有乌须发、止血、止咳喘的功效。

目前，对中药材的理化鉴别方法，主要包括荧光法，微量升华法，显色，沉淀、泡沫反应，钙盐、钠盐等鉴别反应，薄层色谱法（TLC）等。 其中，由于TLC法处理简单，成本低，可同时对多个成分进行比较，不需使用复杂仪器，应用范围最为广泛。如现行2015年版中国药典侧柏叶项下收载了法定的侧柏叶TLC鉴别方法，但由于该法中采用的索氏提取步骤，至少需6小时，加热回流步骤也需要1小时，实际操作过程中存在操作步骤繁琐，操作时间长、有机试剂用量多导致成本较高等缺点，无法满足实际应用中快速、简便的需求。因此，建立一种快速、准确，高效的侧柏叶TLC鉴别方法是很有必要的。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述问题，提供一种侧柏叶TLC快速鉴别方法，具有操作简单、快速、准确，高效、成本低廉、重现性好等优点，可用于对侧柏叶药材及饮片质量快速检测。

本发明技术方案如下：

一种侧柏叶TLC快速鉴别方法，步骤包括：

（1）取待测样品粉末2～4 g，加水20～30mL，加盐酸2～4mL，加乙酸乙酯30～50mL，水浴加热回流水解20～40min，趁热滤过，滤液置分液漏斗，分液，取乙酸乙酯层，水洗3次，每次10mL，水浴蒸干，残渣加甲醇4～6mL溶解，作为供试品溶液；

（2）另取槲皮素标准品，加乙醇配制为0.05～0.15mg/mL的溶液，作为对照品溶液；

（3）薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各2～4μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为（4:2:1）～（6:2:1）的甲苯-乙酸乙酯-甲酸的上层溶液为展开剂展开，取出，晾干，喷以1wt％的三氯化铝-乙醇溶液，置紫外光灯365nm下检视。

优选地，步骤（1）中，各原料用量为待测样品粉末3g、水25mL、盐酸3mL、乙酸乙酯40mL、甲醇5mL。

优选地，步骤（1）中，水浴加热回流水解30min。

优选地，步骤（2）中，加乙醇配制为0.1mg/mL的溶液。

优选地，步骤（3）中，吸取供试品溶液和对照品溶液各3μL，甲苯-乙酸乙酯-甲酸的体积比为 5:2:1。

优选地，步骤（3）中，所述的薄层色谱法试验为2015年版中国药典四部0502薄层色谱法。

所述侧柏叶TLC快速鉴别方法，供试品色谱中，在与对照品色谱相对应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，则待测样品为侧柏叶。

侧柏叶的止血有效成分通常认为是槲皮素和鞣质，实际上，本发明通过实验表明侧柏叶中没有槲皮素，只有槲皮苷，现有检测方法中，也都是将槲皮苷水解成槲皮素后进行鉴定。现有技术中，以药典收载的侧柏叶TLC鉴别方法为例，是将侧柏叶中所含叶绿素成分进行提取后，再对其所含黄酮类成分槲皮苷进行酸水解，水解成槲皮素，再用乙酸乙酯萃取，水洗，浓缩后进行鉴定。由于其样品制备过程涉及索氏提取，耗时至少6h，且以乙醚为提取液，操作具一定的危险性和不适性，黄酮类成分提取、水解共计耗时1.5h。本发明方法将黄酮类成分提取和水解步骤合并，直接用水、盐酸、乙酸乙酯加热回流提取样品，不需要索氏提取等步骤，只需30min，亦能将槲皮苷水解成槲皮素，加之叶绿素成分的存在，使得TLC图谱中反映的样品的信息量较药典法更为详细，效果更好，因此本发明方法更适合于侧柏叶的TLC鉴定。

本发明技术方案相对于现有技术有益效果为：

1、高效、便捷、重现性好：①节约时间：该法较药典法省去药典中索氏提取（至少6h）、加热回流1h的步骤，整体可将鉴定时间缩短4/5。②节省试剂：上述步骤中的有机试剂均可节省，尤其是减少了乙醚的使用，减少操作过程的不适性和危险性。③重现性好：该法相对简单、易操作，具有较强的专属性和良好的重现性。

2、色谱清晰，各斑点分离良好：色谱图斑点清晰，信息量大，供试品色谱中各斑点分离好，重现性好。用该方法鉴别侧柏叶，快速、准确，高效。

附图说明

图1为实施例1侧柏叶TLC鉴别图谱，图中1-4,6-9均为侧柏叶，5-槲皮素对照品；

图2为实施例2侧柏叶TLC鉴别图谱，图中1-4,6-9均为侧柏叶，5-槲皮素对照品；

图3为实施例3侧柏叶TLC鉴别图谱，图中1-4,6-9均为侧柏叶，5-槲皮素对照品；

图4为对比例1侧柏叶TLC鉴别图谱，图中1-5,7-10均为侧柏叶，6-槲皮素对照品；

图5为对比例2侧柏叶TLC鉴别图谱，图中1-4,6-9均为侧柏叶，5-槲皮素对照品；

图6为对比例3侧柏叶TLC鉴别图谱，图中1-4,6-9均为侧柏叶，5-槲皮素对照品。

具体实施方式

下面通过具体实施例来进一步说明本发明方案及有益效果。

实施例1

一种侧柏叶TLC快速鉴别方法，步骤包括：

（1）取待测样品粉末3g，加水25mL，加盐酸3mL，加乙酸乙酯40mL，水浴加热回流水解30min，趁热滤过，滤液置分液漏斗，分液，取乙酸乙酯层，水洗3次，每次10mL，水浴蒸干，残渣加甲醇5mL溶解，作为供试品溶液；

（2）另取槲皮素标准品，加乙醇配制为0.1mg/mL的溶液，作为对照品溶液；

（3）照2015年版中国药典四部0502薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各3μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为 5:2:1的甲苯-乙酸乙酯-甲酸的上层溶液为展开剂展开，取出，晾干，喷以1wt％的三氯化铝-乙醇溶液，置紫外光灯365nm下检视。

供试品色谱中，在与对照品色谱相对应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，TLC薄层图谱见图1，待测样品为侧柏叶。由图1可见，8批侧柏叶中均检出槲皮素，且斑点清晰，分离度良好。

实施例2

一种侧柏叶TLC快速鉴别方法，步骤包括：

（1）取待测样品粉末2g，加水20mL，加盐酸2mL，加乙酸乙酯30mL，水浴加热回流水解20min，趁热滤过，滤液置分液漏斗，分液，取乙酸乙酯层，水洗3次，每次10mL，水浴蒸干，残渣加甲醇4mL溶解，作为供试品溶液；

（2）另取槲皮素标准品，加乙醇配制为0.05mg/mL的溶液，作为对照品溶液；

（3）照2015年版中国药典四部0502薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为 4:2:1的甲苯-乙酸乙酯-甲酸的上层溶液为展开剂展开，取出，晾干，喷以1wt％的三氯化铝-乙醇溶液，置紫外光灯365nm下检视。

供试品色谱中，在与对照品色谱相对应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，TLC薄层图谱见图1，待测样品为侧柏叶。由图2可见，8批侧柏叶中均检出槲皮素，且斑点清晰，分离度良好。

实施例3

一种侧柏叶TLC快速鉴别方法，步骤包括：

（1）取待测样品粉末4g，加水30mL，加盐酸4mL，加乙酸乙酯50mL，水浴加热回流水解40min，趁热滤过，滤液置分液漏斗，分液，取乙酸乙酯层，水洗3次，每次10mL，水浴蒸干，残渣加甲醇6mL溶解，作为供试品溶液；

（2）另取槲皮素标准品，加乙醇配制为0.15mg/mL的溶液，作为对照品溶液；

（3）照2015年版中国药典四部0502薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各3μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为 6:2:1的甲苯-乙酸乙酯-甲酸的上层溶液为展开剂展开，取出，晾干，喷以1wt％的三氯化铝-乙醇溶液，置紫外光灯365nm下检视。

供试品色谱中，在与对照品色谱相对应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，TLC薄层图谱见图1，待测样品为侧柏叶。由图3可见，8批侧柏叶中均检出槲皮素，且斑点清晰，分离度良好。

对比例1：2015版中国药典

取样品（同实施例1）粉末3g，置索氏提取器中，加乙醚适量，加热，回流至提取液无色，弃去乙醚液，药渣挥干乙醚，加70％乙醇50mL，加热回流1小时，趁热滤过，滤液蒸干，残渣加水25mL使溶解，加盐酸3mL，加热水解30分钟，立即冷却，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，用水洗涤3次，每次10mL。水浴蒸干，残渣加甲醇5mL溶解作为供试品溶液。另取槲皮素对照品，加乙醇制成每1mL含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（2015年版中国药典四部通则0502）试验，吸取上述供试品溶液和对照品溶液3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5:2:1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1wt％三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。TLC薄层图谱见图4。由图4可见，9批侧柏叶中均检出槲皮素，斑点清晰，分离度良好。

对比例2

取样品（同实施例1）粉末3g，加水25mL加盐酸3mL，加热水解30分钟，立即冷却，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，用水洗涤3次，每次10mL。水浴蒸干，残渣加甲醇5mL溶解作为供试品溶液。另取槲皮素对照品，加乙醇制成每1mL含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（2015年版中国药典四部通则0502）试验，吸取上述供试品溶液和对照品溶液3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5:2:1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1wt％三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。TLC薄层图谱见图5。由图5可见，8批侧柏叶中对应槲皮素处，斑点清晰，但顶端叶绿素斑点未检出。

对比例3

将步骤（1）乙酸乙酯替换为石油醚，其余步骤同实施例1；TLC薄层图谱见图6。由图6可见，9批侧柏叶相应位置未检出任何斑点，仅检出槲皮素对照品斑点。

结果分析

由实施例1-3可见，本发明方法快速、简便、耗时短，易操作，受影响因素小，重现性好。采用HPLC法对本发明方法进行验证发现，本方法可快速实现侧柏叶中槲皮苷的水解过程中对水解产物槲皮素成分的有效富集，因此可用于侧柏叶的TLC鉴定。

实施例及对比例结果分析：本发明方法与现有的药典等其他方法比较可见，并未影响槲皮素的鉴别，且本发明方法的斑点更为清晰，信息量大（与药典法比较，色谱图中Rf值较小的斑点为侧柏叶中叶绿素类成分），专属性强，分离良好，因此本发明方法具有现有侧柏叶鉴别方法不可比拟的突出优点，可用于替代现行药典法等用于侧柏叶的TLC鉴别。

Claims (7)

1.一种侧柏叶TLC快速鉴别方法，其特征在于，步骤包括：

（1）取待测样品粉末2～4 g，加水20～30mL，加盐酸2～4mL，加乙酸乙酯30～50mL，水浴加热回流水解20～40min，趁热滤过，滤液置分液漏斗，分液，取乙酸乙酯层，水洗3次，每次10mL，水浴蒸干，残渣加甲醇4～6mL溶解，作为供试品溶液；

（2）另取槲皮素标准品，加乙醇配制为0.05～0.15mg/mL（优选 0.1mg/mL）的溶液，作为对照品溶液；

（3）薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各2～4μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为（4:2:1）～（6:2:1）的甲苯-乙酸乙酯-甲酸的上层溶液为展开剂展开，取出，晾干，喷以1wt％的三氯化铝-乙醇溶液，置紫外光灯365nm下检视。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，各原料用量为待测样品粉末3g、水25mL、盐酸3mL、乙酸乙酯40mL、甲醇5mL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，水浴加热回流水解30min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，加乙醇配制为0.1mg/mL的溶液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，吸取供试品溶液和对照品溶液各3μL，甲苯-乙酸乙酯-甲酸的体积比为 5:2:1。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述的薄层色谱法试验为2015年版中国药典四部0502薄层色谱法。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述侧柏叶TLC快速鉴别方法，供试品色谱中，在与对照品色谱相对应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，则待测样品为侧柏叶。