CN1236816C - 组织容量减少 - Google Patents

Abstract

本发明描述了用于实现非手术性肺容量减少(例如，支气管镜术肺容量减少(BLVR))的装置、组合物和方法。BLVR可以通过如下步骤施行：萎陷肺的一个区域，将已萎陷的区域的一个部分与另一个部分粘合，并促进粘合的组织中或组织周围的纤维化。

Description

组织容量减少

发明背景

本发明的领域为组织修复和容量减少，例如，肺修复和容量减少。

末期肺气肿可用肺减容术(LVRS)进行治疗(参见，例如，Cooper等，胸和心血管手术杂志(J.Thorac.Cardiovasc.Surg.) 109：106-116，1995)。尽管通过去除部分肺会提高呼吸功能看起来违反直觉，但切除过于膨胀的组织(如患有异源肺气肿所看到的那样)使得更正常的相邻区域的肺膨胀。而这种膨胀使得反冲和气体交换得到改善。即使是患有同源肺气肿的病人也会从LVRS受益，原因是异常肺的切除导致肺容量全面下降、弹性反冲压力增加和静态顺应性曲线向正常转移(Hoppin，Am.J.Resp.Crit.Care Med. 155：520-525，1997)。

尽管许多接受过LVRS的病人感受到明显的改善(Cooper等，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.) 112：1319-1329，1996)，但他们却承担了实质性的风险。LVRS是通过外科除去一部分患病的肺进行的，其通过插入一个胸腔镜穿过胸壁或通过沿胸骨进行更彻底的切除来接近患病的肺(Katloff等，Chest  110：1399-1406，1996)。因此，接近肺会造成创伤，并且可能包括用U型钉固定脆弱的肺组织的随后的过程可能引起严重的术后并发症。

发明概述

本发明的特征是修复组织和实现组织(例如，肺)的非外科容量减少的装置、组合物及方法。一个方面，本方法使用一种支气管镜在肺组织上进行。该方法完全排除了外科手术的需要，因为该方法使得组织的减少过程是穿过病人的气管和更小的气道进行。在该方法中，通过萎陷肺的一个区域，将一部分被萎陷的区域粘着到另一个区域上，并促进粘着的组织内部或周围的纤维化，来施行支气管镜肺容量减少(BLVR)。用来实现肺萎陷的组合物可以是，但并非必然是，与用来在组织内形成粘着的相同的组合物。优选的实施方案可以包括下述的一个或多个特征。

有多种方法引起肺的萎陷。例如，一种增加衬在肺泡里面的流体的表面张力的物质(即，一种能够充当抗表面活性剂的物质)可以穿过支气管镜(优选穿过处于该支气管镜内部的一个导管)引入。该物质可以包括血纤维蛋白原、血纤维蛋白或其生物活性片段。也可以通过阻止空气流入和流出作为萎陷目标的肺区引起肺的萎陷。这种方法是通过穿过支气管镜插入一个气囊导管并给气囊充气，致使气囊闭塞已置入气囊的支气管或细支气管来实现的。在引起肺萎陷之前，可以用氧气充满肺，以使滞留的气体可被吸收到血液中去。

类似地，有多种方法促进一部分萎陷的肺与另一部分之间的粘合。如果血纤维蛋白原被选为抗表面活性剂，则通过将血纤维蛋白原与一种纤维蛋白原激活剂，如凝血酶接触来促进粘合，凝血酶分解血纤维蛋白原并聚合所得的血纤维蛋白。其它物质，包括凝血酶受体激动剂和类凝血酶也可以用来活化血纤维蛋白原。如果血纤维蛋白被选为抗表面活性剂，则无需施用额外的物质或化合物；血纤维蛋白能够自发地聚合，从而将萎陷的组织的一部分与另一部分粘合。

通过提供一种或多种多肽生长因子，同时提供一种或多种上述的抗表面活性剂或激活剂物质促进纤维化。生长因子可以选自成纤维细胞生长因子(FGF)家族或可以为类β-变异生长因子(类TGFβ)多肽。

上述的组合物也可以含有一种或多种抗生素以帮助防止感染。作为选择，或此外，抗生素也可以通过其它途径给用(例如，抗生素可以通过口服或肌肉内给用)。

本发明的其它方面包括上述的用于促进萎陷和/或粘合的组合物，以及用于将该组合物引入体内的装置。例如，一个方面，本发明的特征是生理用组合物，该组合物包含一种多肽生长因子或其一种生物活性片段(例如，一种血小板衍生的生长因子、一种成纤维细胞生长因子(FGF)或一种类β-变异生长因子多肽)和一种血纤维蛋白原，或一种血纤维蛋白单体(例如，一种I型血纤维蛋白单体、一种II型血纤维蛋白单体、一种des BB血纤维蛋白单体、或其任何混合物或结合物)，或一种血纤维蛋白原激活剂(例如，凝血酶)。可用在BLVR中的血纤维蛋白原、血纤维蛋白单体和血纤维蛋白原激活剂可以是这些多肽的生物活性突变体(例如，片段)。

另一个方面，本发明的特征是用来施行非外科肺容量减少的装置。例如，本发明的特征是一种装置，其包含一个具有一个工作通路和一根可以插入到该工作通路中的导管的支气管镜。该导管可以包含多个内腔并可以包含一个可膨胀的气囊。用于施行肺容量减少的另一个装置包含一根具有多个内腔(例如，两个或更多个)的导管和一个具有多个腔(例如，两个或更多个)的盛放物质的容器，该容器的腔可以连接到该导管的内腔上。这些装置也可以包含一个注射器，用来帮助物质从容器到导管的运动。

BLVR具有优于标准肺减容术(LVRS)的几个优点。BLVR会减少已知与LVRS有关的发病率和死亡率(Swanson等，J.Am.Coll.Surg.185：25-32，1997)。房性心律不齐和长期漏气是LVRS的最常见报道的并发症，其极少可能发生在BLVR中，原因是BLVR不需要用U型钉固定脆弱的肺组织和刺激心包的外科手术。BLVR还可以比SLVR显著便宜，一例SLVR目前的成本大约在18,000-26,000美元之间。假定仅在美国就有2百万-6百万病人受肺气肿折磨，则节约的钱将是非常可观的。此外，一些并非是LVRS的候选者的病人(例如，由于其高龄)可以接受BLVR。此外，如果有需要，BLVR将使病人有机会接受一次以上的减容术。尽管对大多数病人来说重复外科手术并不是一个可行的选择(由于在初次手术后形成胸膜粘连)，但对于已接受过BLVR的病人来说，不应该存在这样的限制。

从以下的详细描述和权利要求书，本发明的其它特征和优点将显而易见。

附图的简要说明

图1是BLVR的一个示意性表示。

图2a图解了一根穿过支气管镜可被插入的导管。

图2b为穿过图2a中图示的导管的柄体的一个横截面图。

图2c图解了一个可以附着到图2a图示的导管上的一个药筒。

图2d图解了一个可用来从图2c图示的药筒中排出物质的注射器。

图2e图解了装配有图2c的药筒、图2d的注射器和一个leur-lock、充满空气的注射器的图2的导管。

图3a和3b为说明从一只对照豚鼠(图3a)和从一只与LPS接触的豚鼠(图3b)获得的表面张力对表面活性剂膜的表面积的曲线。

图4a和4b是说明对于血纤维蛋白原和白蛋白表面活性剂混合物，作为蛋白质/脂质浓度函数的表面膜稳定性参数(Gy/dA)l(A/y)的棒状图。

图5a和5b为说明在绵羊与木瓜蛋白酶接触3个月后的动态(图5a)和准静态(图5b)顺应性的棒状图。n＝6。

图6a和6b为说明生理功能(图6a中示出了作为a％基线的C_dyn，图6b中示出了作为a％基线的R_L)与肺气肿严重性分数之间关系的图形。

图7为图解在基线处(即，预处理)和用木瓜蛋白酶治疗绵羊后8星期时静态肺顺应性图形(以升为单位的体积对以cmH₂O为单位的P_tp)。

图8a和8b为概括含有各种ECM成分的凝胶条的弹性模量(图8a)和凝胶聚合速率(图8b)的棒状图。

图9为说明对于仅由血纤维蛋白或由血纤维蛋白+PLL+CS组成的凝胶条，应变百分数(Percent strain)对疲劳破坏循环的线状图。

图10a和10b为在含有ECM成分的血纤维蛋白凝胶上的人类成纤维细胞增生的棒状图。

图11为说明改性的冲洗液和胶水对绵羊肺生理功能的影响的棒状图。

图12a和12b为说明对一只用4×10ml子段冲洗加血纤维蛋白胶水处理的绵羊(图12a表示两周后的结果)和一只用含有ECM成分的冲洗液处理的绵羊(图12b)，准静态压力容量关系的线状图。

图13a、13b和13c为双内腔导管系统的示意图。

图14a和14b为一个可以用来密封支气管胸膜的瘘管的导管系统的示意图。

发明详述

本文所述的装置、组合物和方法可用来修复组织如肺的损伤或漏洞，该损伤或漏洞可能由创伤、疾病或外科手术引起，以及用来减少先天性萎陷的组织的容量。例如，肺的容量可以使用支气管镜减少(支气管镜肺容量减少在本文中缩写为BLVR)。参照图1，一个柔韧的支气管镜10穿过病人的气管12被插入到达肺20的目标区20a，穿过该支气管镜内的一个通路插入一个带有一个远侧内腔端口60的气囊导管50(图2)。当通往目标区20a的气路14被堵塞时，或当一种抗表面活性剂通过气囊导管50施用到目标区20a时，目标区20a将发生萎陷。不管萎陷的原因是什么，当萎陷的目标区的一部分与一种或多种下述的组合物接触时，所述萎陷的目标区的一部分将与另一部分粘合。这些组合物含有可以自发地聚合的物质(例如，血纤维蛋白)或与一种激活剂响应的物质(血纤维蛋白原)。此外，一种或多种组合物含有一种促进纤维化的多肽生长因子，并可以含有一种帮助防止感染的抗生素或一种另外的因子(如因子XIIIa转谷氨酰胺酶)以促进聚合。施用这种(这些)组合物后，移走该支气管镜。

患有慢性阻塞性肺病的病人能够从BLVR中受益。这些病人包括，但不限于，那些患有肺气肿、慢性哮喘、慢性支气管炎和支气管扩张症的病人。当病人的肺受创伤损害时，或在发生自发性气胸时也可以施行BLVR。尽管本发明的组合物(在本文中可以多样地称为溶液、胶水和凝胶)可以由本发明的新型装置施用，但其也可以独立施用。例如，该组合物可以在LVR过程中或在任何将病人处于使肺、呼吸道内的其它组织、其它器官或其它器官系统受到损害的危险的外科手术的过程中施用。本发明组合物的一些用途在标题为“其它实施方案”的章节中更详细地描述。

识别并接近肺的目标区

一旦一个病人被定为BLVR的候选者，可以使用放射学研究(例如，胸部X光检查)和计算机辅助的X射线体层照相扫描识别肺的目标区20a。当随后进行该过程时，对病人施行麻醉并将管子插入病人体内，且可以把病人置于一种可吸收的气体(例如，至少90％氧气并直到100％氧气)中一段指定的时间(例如，大约30分钟)。首先通过放射术鉴定肺的区域，然后用支气管检查术鉴定。

合适的支气管镜包括由Pentax、Olympus和Fujinon制造的那些，这些支气管镜使得能够目测一个被照亮的区域。内科医生引导支气管镜10插入气管12穿过支气管树，以致支气管镜10的开口端60被定位在目标区20a的入口处(即，到达将被减少容量的肺的区域)。支气管镜10可被导引逐渐穿过支气管树的更窄的分枝，到达任一个肺20的多个子区。例如，如图1所示，可将支气管镜导引至病人左肺的上肺叶内的一个子区。

然后，导引上述的气囊导管50(且下文将充分描述)通过支气管镜到达肺20的目标区20a。当导管50被定位至支气管镜10内时，对气囊58充气，以致经过导管的物质将被盛放在远离气囊的肺区。目标区可用盐水灌洗，以减少自然存在的表面活性剂的量，然后将含有一种抗表面活性剂(即，一种增加衬在肺泡里面的液体的表面张力的试剂)的生理相容性的组合物通过导管施用到肺的目标区。优选将该组合物配制成溶液或悬浮液，并含有血纤维蛋白或血纤维蛋白原。给用这些物质的一个优点是它们不仅能够充当抗表面活性剂，而且也能够参与粘合过程。

基于血纤维蛋白原的溶液

血纤维蛋白原能够充当抗表面活性剂，原因是其能够增加衬在肺泡里面的液体的表面张力，且其能够充当密封剂或粘合剂，原因是其能够参与级联凝固，在级联凝固中血纤维蛋白原被转化为血纤维蛋白单体，然后，该单体发生聚合并交联，形成一种稳定的网状物。血纤维蛋白原也称为因子I，代表约2-4g/L血浆蛋白质，其为一种由二硫键连接的、称为(Aα)₂、(Bβ)₂和γ₂的三对多肽链组成的单体。“A”和“B”链表示两个小的N-端基肽，也分别叫做血纤维蛋白肽A和B。凝血酶分解血纤维蛋白原产生称为血纤维蛋白I的化合物，并且随后血纤维蛋白肽B的分解产生血纤维蛋白II。尽管这些分解仅轻微地减少血纤维蛋白原的分子量，但它们却将聚合位暴露。在正常的凝块形成过程中，当血纤维蛋白原与凝血酶接触时，引发级联凝固，且当血纤维蛋白原与一种激活剂如凝血酶，或该凝血酶受体的一种激动剂，在一种含钙的水溶液(例如，1.5-50mM钙)中接触时，该过程可在肺容量减少的范围内重复。

含有血纤维蛋白原的组合物可以含有3-12％的血纤维蛋白原，并优选含有大约10％的含在盐水(例如，0.9％盐水)或另一种生理用水溶液中的血纤维蛋白原。给用的抗表面活性剂的体积将，根据肺区的尺寸变化，该尺寸从胸部的计算机辅助的X射线体层照像扫描图像估算。例如，可以用10-100ml(例如，50ml)血纤维蛋白原溶液(10mg/ml)灌洗目标区。为促进肺萎陷，可将目标区与血纤维蛋白原的一种未聚合的溶液接触(例如，用该溶液冲洗或灌洗)，之后将目标区与第二血纤维蛋白原溶液接触，所述的血纤维蛋白原溶液随后用一种血纤维蛋白原激活剂(例如，凝血酶或一种凝血酶受体激动剂)聚合。

所述的抗表面活性剂可以含有血纤维蛋白原，该血纤维蛋白原在非外科性肺容减少手术开始之前从病人获得(即，该抗表面活性剂或粘合组合物可以含有自体同源的血纤维蛋白原)。一种自体同源物质的使用是优选的，原因是其消除了病人会感染某种形式的肝炎(乙型肝炎或非甲型、非乙型肝炎)、获得性免疫缺损综合症(AIDS)或其它的血液传播传染病的危险。当从汇聚的人类血浆中提取血纤维蛋白原成分时，更容易感染这些传染病(参见，例如，Silberstein等，输血(Transfusion) 28：319-321，1988)。人类血纤维蛋白原可以从本领域已知的供应商商购获得，或可以从血库或类似的贮存单位获得。

基于血纤维蛋白原的抗表面活性剂的聚合可以通过加入一种血纤维蛋白原激活剂来实现。这些激活剂在本领域是已知的，包括凝血酶、类凝血酶(如自B.Moojeni、B.Maranhao、B.atrox、B.Ancrod或A.Rhodostoma获得的那些)和凝血酶受体激动剂。当血纤维蛋白原与血纤维蛋白原激活剂混合时，它们以一种类似于自然凝血过程的最终阶段的方式发生反应，形成一种血纤维蛋白基质。更具体地，通过加入凝血酶(例如，1-10单位凝血酶/纳克(ng)血纤维蛋白原)实现聚合。如果需要，可以加入1-5％(例如，3％)的因子XIIIa转谷氨酰胺酶来促进交联。

另外，为促进萎陷的肺的一个区与另一个区粘连部位的纤维化(或瘢痕形成)，用来实现肺容量减少的一种或多种组合物(例如，含有血纤维蛋白原的组合物)可以含有一种多肽生长因子。可以包含多种因子。优选血小板衍生的生长因子(PDGF)和成纤维细胞生长因子和β-变异生长因子家族中的那些。

例如，含在一种用来减少肺容量的组合物中的多肽生长因子(例如，本文所述的基于血纤维蛋白原、血纤维蛋白原激活剂或血纤维的组合物)可以是碱性FGF(bFGF)、酸性FGF(aFGF)、hst/Kfgf基因产品、FGF-5、FGF-10或int-2。多肽生长因子领域的命名很复杂，这主要是因为不同的研究人员已独立分离出了多种因子，且在历史上这些因子是按照组织类型进行命名，所述的组织类型在因子的纯化过程中用作试样。可由碱性FGF来阐明这种复杂性，碱性FGF被命名有至少23个不同的名称(包括白血病生长因子、巨噬细胞生长因子、胚肾衍生的血管生成因子2、前列腺生长因子、星形胶质细胞生长因子2、内皮生长因子、肿瘤血管生成因子、肝细胞瘤生长因子、软骨肉瘤生长因子、软骨衍生的生长因子1、眼睛衍生的生长因子1、肝素结合生长因子类别II、肌原生长因子、人类胎盘纯化的因子、子宫衍生的生长因子、早期肿瘤衍生的生长因子、人类脑垂体生长因子、脑垂体衍生的软骨细胞生长因子、脂肪细胞生长因子、前列腺成骨细胞因子和哺乳动物肿瘤衍生的生长)。因此，任何称作前述名称的因子都在本发明的范围内。

该组合物还可以含有“功能性多肽生长因子，”即，尽管有突变存在(其为氨基酸残基的置换、缺失或增加)，但保持其促进在肺容量减少范围内的纤维化能力的生长因子。因此，待选的分子形式的多肽生长因子(如分子量为17.8、22.5、23.1和24.2kDa的bFGF形式)在本发明的范围内(更高的分子量形式为17.8kDa bFGF的同线N-末端伸出部分(Florkiewicz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  86：3978-3981，1989))。

不考虑影响多肽生长因子的氨基酸含量或大小，确定该多肽生长因子是否如全长、野生型多肽生长因子那样保持其促进纤维化的能力(即，是否一种突变多肽如相应的野生型生长因子那样有效地促进纤维化至少40％，优选至少50％，更优选至少70％，最优选至少90％)，完全在本领域的普通技术人员的能力范围之内。例如，在与全长生长因子和突变体生长因子接触之后，技术人员能够检测到培养成纤维细胞中的胶原蛋白沉积。当一个突变体生长因子促进胶原蛋白的沉积量是相应的野生型因子所促进的至少40％，优选至少50％，更优选70％，最优选90％时，其基本上保持了促进纤维化的能力。可以通过多种方法测量胶原蛋白的沉积量。例如，可以通过一种免疫测定法来测定胶原蛋白的表达。作为选择，可以通过从成纤维细胞(例如，培养成纤维细胞或在减容的肺组织附近的那些成纤维细胞)中提取胶原蛋白，并测量羟基脯氨酸，来测定胶原蛋白的表达。

用于本发明的多肽生长因子可以是天然存在的、合成的或重组的分子，并可以由一个杂交或嵌合多肽组成，该杂交或嵌合多肽带有一个例如为bFGF或TGFβ的部分，和一个为不同多肽的第二部分。这些因子可以自一个生物样品纯化、可以化学合成或可以通过标准重组技术制备(参见，例如，Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology，New York，John Wiley and Sons，1993；Pouwels等，CloningVectors：A Laboratory Manual，1985，Supp.1987)。

当然，可以结合使用各种各样的促纤维化生长因子。

本领域的普通技术人员能够轻松地确定促进BLVR范围内的纤维化所需的多肽生长因子的剂量。所需的剂量可以变化并可以在1-100nM的范围内。

此外，本文所述的用于肺容量减少的任何组合物或溶液(例如，上述的基于血纤维蛋白原的组合物)可以含有一种或多种抗生素(例如，氨苄青霉素、庆大霉素、氨噻肟头孢霉素、nebacetin、青霉素或紫苏霉素)。在药用的组合物中含有抗生素对本领域的普通技术人员来说是众所周知的。

基于血纤维蛋白的溶液

血纤维蛋白也可以充当抗表面活性剂或密封剂或粘合剂。但是，与血纤维蛋白原相反，不使用激活剂(如凝血酶或因子XIIIa)，血纤维蛋白就可被转化为一种聚合物。事实上，不管血纤维蛋白I单体是否被交联，也不管血纤维蛋白I是否被进一步转化为血纤维蛋白II聚合物，血纤维蛋白I单体都可以自发地形成作为凝块的血纤维蛋白I聚合物。不将本发明限于通过任何特殊的机理发挥功能的化合物，可以注意到当血纤维蛋白I单体与病人的血液接触时，病人自身的凝血酶和因子XIII可以将血纤维蛋白I聚合物转化为交联的血纤维蛋白II聚合物。

可被转化为血纤维蛋白聚合物的任何形式的血纤维蛋白单体都可被配制成溶液并用于肺容量减少。例如，基于血纤维蛋白的组合物可以含有血纤维蛋白I单体、血纤维蛋白II单体、des BB血纤维蛋白单体或这些单体的任何混合物或结合物。优选血纤维蛋白单体没有交联。

血纤维蛋白可以从任何来源获得，只要其可被转化为血纤维蛋白聚合物的形式获得即可(类似地，非交联的血纤维蛋白可以从任何来源获得，只要其可被转化为交联血纤维蛋白即可)。例如，血纤维蛋白可以从哺乳动物，如人的血液获得，并优选从以后将被给用血纤维蛋白的病人获得(即，该血纤维蛋白为自体同源的血纤维蛋白)。作为选择，血纤维蛋白可以从在培养物中分泌血纤维蛋白原的细胞获得。

基于血纤维蛋白的组合物可以按照美国专利5,739,288(该专利文献整体引为参考)的描述来制备，并可以含有血纤维蛋白单体，所述的血纤维蛋白单体的浓度不低于约10mg/ml。例如，所含的血纤维蛋白单体的浓度可以从约20mg/ml至约200mg/ml；从约20mg/ml至约100mg/ml；和从约25mg/ml至约50mg/ml。

通过将血纤维蛋白单体与钙离子(例如氯化钙中的钙离子，例如3-30mM CaCl₂溶液)接触，可以促进血纤维蛋白单体自发转化为血纤维蛋白聚合物。除了内源性血液凝固途径的前两步外，需要钙离子促进一种凝结因子转化为另一种。因此，在不存在钙离子的情况下，血液将不会凝固(但是，在活体内，钙离子浓度永远不会降低到足以显著影响血液凝固动力学的程度；一个人在钙离子降低到该水平之前就会死于肌肉强直)。含钙的溶液(例如，无菌10％CaCl₂)可以很容易地制备或从商业供应商处购买。

此处所述的基于血纤维蛋白的组合物也可以含有一种或多种多肽生长因子，所述的多肽生长因子能够促进萎陷的肺部的一部分与另一部分粘连部位的纤维化(或瘢痕形成)。也可以含有多种因子，并优选成纤维细胞生长因子和β-变异生长因子家族中的那些因子。适于包含在基于血纤维蛋白的组合物中的多肽生长因子包括所有适于包含在基于血纤维蛋白原的组合物中的那些(上述的)。

含有细胞外基质成分的溶液

如本文所述，实现安全的、非外科性组织容量减少的一种有效方法是使用含有起到机械地将组织的一个部分与另一个部分粘连和生物地调节容量减少的目标区域内的细胞应答的双重作用的试剂溶液。因此，上述的基于血纤维蛋白和血纤维蛋白原的溶液也可以含有一种或多种增强溶液的力学性能和生物性能的试剂。如上所述，这样的溶液可用来灌洗(即，冲洗)组织或将组织的一个部分与另一个部分粘连。

有用的试剂包括那些：(1)以自限和局限性方式促进成纤维细胞和单核细胞的趋化性和胶原蛋白沉积；(2)通过抑制肺泡上皮细胞表达表面活性剂的能力，这促进目标区域的重新打开，或通过促进上皮细胞的编程性细胞死亡，这引起炎症，来阻抑肺泡上皮细胞的活性；(3)促进上皮细胞构建，这减少了流向目标区域的血液，从而将通气和灌注之间的失配和任何所致的气体交换异常最小化。更具体地说，可以使用含有细胞外基质(ECM)成分、内皮素-1和/或前编程性细胞死亡(pro-apoptotic)试剂的溶液。合适的前编程性细胞死亡试剂包括Bcl-2家族蛋白质(例如，Bax、Bid、Bik、Bad和Bim，及其生物活性片段或变体)、胱天蛋白酶(caspase)家族蛋白质(例如，胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-9，及其生物活性片段或变体)和膜联蛋白家族蛋白质(例如，膜联蛋白V，或其生物活性片段或变体)。如下面的实施例所作的进一步描述，检测含有几种这些试剂的溶液。待测的第一试剂是基于其生物属性、其对凝胶行为的生物物理影响、其在水溶液中的溶解性(在生理条件下)和成本进行选择。本领域的普通技术人员不用求助于过多的实验，就将能够识别和使用类似的试剂。

首先选用的试剂为硫酸软骨素A、低分子量和高分子量的透明质酸、纤连蛋白、中等链长和长链的聚L-赖氨酸和胶原蛋白二肽脯氨酸-羟基脯氨酸。

硫酸软骨素(CS)是糖胺聚糖(GAG)家族的一种ECM成分。它是由通过一个β1-4碳键合连接到葡糖醛酸上的半乳糖胺的重复二糖单元组成的硫酸化的碳水化合物聚合物。CS不是在体内作为一种游离的碳水化合物部分，而是连接到多种类型的核心蛋白质上被发现的。因此，它是几种重要的ECM蛋白聚糖的一个成分，所述的ECM蛋白多糖包括多配体蛋白聚糖家族(多配体蛋白聚糖1-4)、富含亮氨酸的家族(核心蛋白聚糖(decortin)、双糖链蛋白聚糖)和透明质酸酯结合家族(CD44、聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、神经元蛋白聚糖)的成员。这些含有CS的蛋白聚糖在细胞表面整联蛋白和生长因子的结合发挥作用。含有CS的蛋白聚糖可以在肺内作为胶原蛋白沉积的脚手架发挥作用，所述的胶原蛋白沉积是由成纤维细胞引起的。因此，糖胺聚糖家族中的ECM成分，特别是碳水化合物聚合物，在实现组织的容量减少(例如，利用支气管镜进行的肺容量减少)中是有用的。例如，以0.05-3％的浓度范围添加硫酸软骨素A或C对血纤维蛋白凝胶的力学性能和生物性能都具有特殊和有益的效果。类似地，可用于灌洗和粘连组织的溶液可以含有可比量的一种或多种蛋白聚糖，如多配体蛋白聚糖1-4、核心蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、CD44、整联蛋白、多功能蛋白聚糖和神经元蛋白聚糖。在一个实施方案中，本发明的组合物含有乙醇(例如，1-20％)、血纤维蛋白原(例如，0.01-5.00％)、HA(例如，0.01-3.00％)、FN(例如，0.001-0.1％)和CS(例如，0.01-1.0％)。例如，可用于本发明的组合物含有10％乙醇、0.5％血纤维蛋白原、0.3％HA、0.01％FN和0.1％CS。

透明质酸(HA)，与CS一样，是一种多糖，由一个β1-3键连接的葡糖醛酸和N-乙酰基葡糖胺的重复单元组成。但是，与CS和其它GAG不同的是，HA在体内作为一种游离的碳水化合物，而不作为任何蛋白聚糖家族的一个成分起作用。HA是一种大的聚阴离子分子，其在溶液中具有一种随机盘绕的结构，并且由于其自聚集性能，使水溶液粘度很高。它支持细胞的附着和增殖。另外，HA被认为促进单核细胞/巨噬细胞的趋化性并刺激细胞因子和这些细胞的纤溶酶激活物抑制剂分泌。因此，含有例如葡糖醛酸和N-乙酰基葡糖胺的重复单元的多糖在实现组织的容量减少(例如，通过支气管镜进行肺容量减少)中是有用的。例如，以0.05-3.00％的浓度范围添加高分子量或低分子量的HA对血纤维蛋白凝胶的力学性能和特征性能都将具有特殊和有益的效果。

纤连蛋白(Fn)是一种存在于ECM中的广泛分布的糖蛋白。其作为一种杂二聚体存在于组织中，在该杂二聚体中子单元通过一对靠近羧基终点的二硫键共价连接。Fn分为几个区域，每个区域具有不同的功能。氨基末端区域具有与血纤蛋白、肝素、因子XIIIa和胶原蛋白结合的结合位。Fn具有一个中心细胞结合区域，该区域被巨噬细胞以及成纤维细胞、成肌纤维细胞和未分化的间质细胞的细胞表面整联蛋白所识别。Fn在体内的主要功能是作为创伤愈合、细胞生长和分化的调节剂。Fn能够促进成纤维细胞的结合和趋化性。当成纤维细胞暴露于适宜的“前进信号”时，它也能够充当细胞周期胜任因子，使得成纤维细胞能够更快速地复制。Fn在体外促使成纤维细胞迁移进入血浆凝块中。另外，Fn促进肺泡细胞显型中的变更，这种变更导致表面活性剂表面减少。因此，促进组织萎陷和瘢痕形成的Fn分子在实现组织容量减少(例如，通过支气管镜进行的肺容量减少)中是有用的。通过选择性的剪接产生的Fn的同种型是有用的，并且溶血磷脂酸或其一种盐的加成物可以添加到含Fn的溶液中以增强Fn的结合。例如，以0.05-3.00％的浓度范围添加Fn的加成物对例如用于BLVR中的血纤维蛋白凝胶的力学性能和生物性能都将具有特殊和有益的效果。

聚L-赖氨酸(PLL)通常用在细胞培养实验中，以促进细胞附着到表面上，其呈现很强的正电性。尽管它的尺寸很大，但其在阴离子的多糖，包括HA和CS存在的情况下能够很快地溶解。因此，PLL、HA和CS可以结合用于溶液中，以灌洗、去稳定组织的一个部分及将组织的一个部分粘合到另一个部分上。下述的研究探讨了在含有长链多糖的一个血纤维蛋白网络中的PLL产生离子相互作用的可能性，所述的离子相互作用使血纤维蛋白凝胶的弹性更高且在重复的伸展过程中更不易于断裂。一旦形成基质，PLL还能够促进水化和溶胀。因此，将含有PLL的溶液用于肺容量减少的一个特殊的优点是这样的溶液使所致的基质从气道上离位的可能性更小。分子量在3,000和10,000之间的PLL可以0.1-5.0％的浓度使用。

脯氨酸-羟基脯氨酸二肽(PHP)是间质胶原蛋白(类型I和类型III)的序列所共有的。胶原蛋白衍生的肽可以充当创伤愈合过程中促进成纤维细胞向内生长和修复的信号。浓度在2.5-10.0mM范围内的PHP二肽在体外促进成纤维细胞趋化性中与类型I和类型II的胶原蛋白片段同样有效。因此，PHP二肽在实现组织容量减少(例如，通过支气管镜进行的肺容量减少)中是有用的。例如，以0.05-3.00％的浓度范围添加PHP二肽对血纤维蛋白凝胶的力学性能和生物性能都将具有特殊和有益的效果。

向冲洗液和血纤维蛋白凝胶中添加ECM成分可以通过调节间质成纤维细胞和肺巨噬细胞的活性促进组织萎陷和瘢痕形成。完整的上皮细胞分裂倾向于促进永久性的肺膨胀不全和瘢痕形成。因此，其对于将肺泡上皮细胞与引起炎症和引起“类ARDS”应答的试剂接触可能是有用的。当然，给用这样的试剂必须小心控制和监控，以使产生的炎症的量没有危险。作为选择，可以通过添加促进上皮细胞的程序死亡，“编程性细胞死亡”的试剂来促进组织修复和容量减少，而不出现大范围的坏死和炎症。这些试剂将引起肺泡细胞功能丧失，而不引起炎症。产生这种应答的一种方法是通过给用鞘磷脂(SGM)，鞘磷脂是一种脂类化合物，其被某些细胞类型所吸收，并可被鞘磷脂酶和神经酰胺激酶酶促转化为神经酰胺-1-磷酸酯，神经酰胺-1-磷酸酯是编程性细胞死亡的一种关键调节剂。施用SGM也可能抑制表面活性剂，因为SGM在体外具有抗表面活性剂海活性。SGM可被施用在抗表面活性剂的冲洗溶液中，在该溶液中SGM可以特异地对上皮表面起作用而使局部表面膜失去稳定，且能够引起上皮细胞死亡而不会引起炎症。可用于修复肺组织的漏气并可用于施行BLVR的溶液可以含有SGM或其一种生物活性变体，浓度范围为0.05-15.00％(例如，0.1、0.5、1.0、2.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.0、13.0、14.0或14.5)。

BLVR的效率还可以通过调节内皮细胞应答得到增强。例如，暂时的血管收缩可以通过在冲洗溶液中引入肾上腺素或去甲肾上腺素来实现。持续的内皮调节可以通过引入一种内皮素来实现，所述的内皮素为一族促进血管收缩并充当原纤维化(profibrotic)试剂的细胞因子。内皮素-1、内皮素-2或内皮素-3可以单独使用或结合使用。因此，本发明的溶液也可以包含一种血管活性物质，如内皮素、肾上腺素或去甲肾上腺素(浓度范围为0.01-5.00％)或这些物质的结合物。包含一种或多种血管活性物质的优点是这些物质有利地调节目标组织中的血管应答，而这又减少了通气灌注失配、改善了气体交换，并同时促进了瘢痕形成。

肺萎陷后基于血纤维蛋白、血纤维蛋白原和含有ECM的组合物 的施用

尽管肺的一个目标区可以通过与一种上述的物质接触而萎陷，但当通过其它手段导致萎陷时，也可以施用这些物质以将肺的一个区域与另一个区域粘合(并促进纤维化)。例如，上述的物质可以在肺由于进出目标区域的气流阻塞而萎陷后施用。可以通过，例如将一个支气管镜插入被麻醉的病人的气管，穿过该支气管镜插入一气囊导管，并给气囊充气以致极少量或没有空气进入肺的目标区域，很容易地引起这样的阻塞。在用可吸收的气体充满肺后，根据被阻塞区域的尺寸大小，被阻塞区域的萎陷将发生大约5-15分钟。作为选择，可以在肺与另一种类型的抗表面活性剂(例如，一种无毒的清洗剂)接触后，施用基于血纤维蛋白原或血纤维蛋白的溶液(例如，含有一种多肽生长因子的基于血纤维蛋白原或血纤维蛋白的溶液)，以及含有ECM成分(如本文所述的那些)、类ECM试剂(如PLL和PHP)、血管活性物质(即，引起血管收缩的物质)和前编程性细胞死亡因子(例如，Bcl-2、胱天蛋白酶和膜联蛋白家族蛋白质)的溶液。

当然，本文所述的组合物不仅在施行BLVR的过程中是有用的，而且对密封肺的裂缝也是有用的，所述裂缝起因于创伤或在任何的外科手术过程中引起。

向肺施用物质的导管

参照图2a，任何上述的溶液都可以通过气囊导管50给用到肺部，气囊导管50具有多个端口52，可以使用相应的多个内腔通过这些端口将物质(如溶液或悬浮液)或气体(如空气)注射。

导管50的端口的排列如下。第一端口54具有一个适合与气体源(例如，一个含有空气的leur-lock注射器)连接的近端54a，与导管50的内腔56相通，内腔56在靠近导管50远端60的可膨胀的气囊58内终止。第二端口64具有一个适合与一种或多种物质的源(例如，下述的药筒80)连接的近端64a，与内腔66相通，内腔66在导管50的开放式远端60处终止。第三端口74具有一个适合与一种或多种物质的源(例如，药筒80)连接的近端74a，与内腔76相通，内腔76也终止在导管50的开放式远端60处。

这样，通过端口54注射的气体穿过内腔56使气囊58膨胀，而通过端口64和/或端口74注射的物质分别穿过内腔66和76到达导管的远端60。当到达导管50的远端60时，先前在内腔66和76中分离的物质便混合在一起。

参照图2b，示出了导管50的柄体51的内腔54、内腔64和内腔74的横截面图。在另一个实施方案中，内腔66和76的尺寸可以不同，用来施用基于血纤维蛋白原的溶液的内腔的直径大约为用来施用含有血纤维蛋白原激活剂的溶液的内腔直径的2倍。

参照图2c，可以使药筒80附着到导管50上以通过端口64、74和内腔66、76注射物质。药筒包含一个第一腔82和一个第二腔92，每一个腔或两个腔均可以装有可用于BLVR中的物质(例如，腔82可以装有血纤维蛋白原、TGF-β和庆大霉素的混合物，腔92可以装有凝血酶的钙缓冲溶液)。药筒80内的物质可以通过导管20施用给肺，如下所述。腔82的上壁84包含开孔84a，可以通过小孔84a施加压力，以压下柱塞86。压下柱塞86推动腔82内的物质向腔82的下壁88运动、穿过开口88a，并当药筒附着到导管50上时，进入导管50的端口64。同样地，腔92的上壁94包含开孔94a，可以通过小孔94a施加压力以压下柱塞96。压下柱塞96推动腔92内的物质向腔92的下壁98运动、穿过开口98a，并当药筒附着到导管50上时，进入导管50的端口74。

参照图2d，为帮助将物质从药筒80转移至导管50，可将药筒80置于框架形注射器40的凹槽45内。注射器40包含上壁42，上壁42上具有开孔42a和42b，臂形物44穿过开孔42a和42b插入。臂形物44的尖头44a穿过开孔42a进入注射器40，臂形物44的尖头44b穿过开孔42b进入注射器40。当药筒80置于注射器40中并压下臂形物44时，尖头44a和44b分别压紧柱塞86和96，从而将腔82和腔92中的物质分别通过药筒80的开口88a和98a压出，并分别通过注射器40的下壁46的开口46a和46b压出。

图2e图解了装配有药筒80、注射器40和一个leur-lock、充满空气的注射器30的导管50。

参照图13a至13c，任何上述的溶液都可以通过气囊导管100给用到肺部，气囊导管100具有多个端口101，可以使用相应的多个内腔将物质(如溶液或悬浮液)或气体(如空气)注射通过这些端口。导管100的特征是具有用于输送本发明的组合物的双重鞘。外鞘102围住内通道102a，内鞘110穿过内通道102a。外鞘102支承气囊105。通过近端充气端口105a注射的空气(或另一种气体或物质)流过内腔105b到达气囊105，从而密封区域112。当内鞘110驻留在内通道102a中且气囊105被充气时，就可以使组合物(例如，抗表面活性剂溶液)穿过远端口111直达密封的区域112来施用组合物。密封的区域112可以与一种溶液(例如，抗表面活性剂溶液或冲洗液)短暂接触(例如，60秒)。然后可以在持续的吸引下，通过远端口111移走该溶液。通常吸引将施加3-5分钟。之后，内鞘110就穿过外鞘102的内通道102a。基于内鞘110比外鞘102长这样一个事实，内鞘110的远端110a在密封的区域112内的、比外鞘102的远端102a的更深处停住。然后，通过多个端口101之一施用基于血纤维蛋白或血纤维蛋白原的溶液。作为选择，可以通过近端口101a施用基于血纤维蛋白的溶液，通过近端口101b施用聚合剂(例如，凝血酶)。图13a和13b所示的双重内腔导管系统的一个优点是当通过近端口101a和101b注射溶液时，可以通过内通道102a手动取出内鞘110。这样，溶液可以从远端110a的最远端分布(例如，展开)到通过远端末端102a取下内鞘110的点。如图13c，在点A穿过内鞘110的横截面图所示，双内腔107和108使注射通过近端口101a和101b的溶液在两溶液穿过远端110a进入密封的区域112之前保持分离。

因此，本发明的特征是一种呼吸导管系统，其包含一个限定第一内腔的外鞘和一个构造为可移动地容纳在所述的第一内腔中的内鞘，所述的外鞘包含一个固定构件(例如，一个气囊)，用于将所述的外鞘定位在支气管树中，所述的内鞘由一对内腔所限定，每个内腔容纳一种胶水的第一和第二成分之一。

参照图14a和14b，任何上述的溶液都可以通过双气囊导管120给用到肺部，双气囊导管120具有多个端口121，可以使用相应的多个导管将物质(如溶液或悬浮液)或气体(如空气)注射通过这些端口。导管120的特征是四个通道。这些通道以取自图14b的点A处的横截图示于图14a中。通道123连接气囊端口123a和气囊123b。通道124连接气囊端口124a和远端气囊124b。通道125连接注射端口125a和远端120b，通道126连接注射端口126a和远端120b。该导管的优点是通过使内科医生更快速地确定远端120b是否已到达肺的一个合适的区域(例如，一个漏气的区域)，减少了用来施行BLVR的时间长度。支气管和细支气管分枝广泛(参见图1)，并且需要将导管尽可能准确地定位于支气管树中。通常内科医生通过在BLVR之前监视来自置于病人的胸腔内的一根管子的气体的动力，会知道何时漏气被密封。如果导管120被插入(例如，通过一个支气管镜)支气管树的一个分枝并且如果当近端气囊123b被充气时，通过胸腔管的空气运动停止，内科医生会知道肺的受损区域位于远离气囊123b之处。如果气囊123b随后被放气，气囊124b被充气，通过胸腔管的空气运动停止，医生会知道远端120b也在肺的合适的区域中。但是，如果通过胸腔管的空气运动继续(当气囊123b被放气，气囊124b被充气时)，那么远端120b就没被推进正在漏气并需要修复的肺区。

因此，本发明的特征是呼吸导管系统，其包含一个限定四个内腔的鞘，其中第一和第二内腔容纳一种胶水的第一和第二成分并从导管的近端延伸至导管的远端，第三和第四内腔从导管的近端延伸至沿导管的柄体放置的固定构件(例如，气囊)，一个固定构件比另一个置于离导管的远端更近的位置。

以下将要描述的优选的方法、物质和实施例仅用于说明，并非出于限制；与本文所述的那些物质和方法类似或等价的物质和方法可以用于本发明的实践或试验中。

实施例1：在一个离体的小牛肺中施行的BLVR

离体的小牛肺是施行BLVR的绝佳模型，原因是其易于进行操作并与人肺在解剖学上类似。具有4-5升总容量的小牛肺从Arena andSons’Slaughter House(Hopkinton，MA)购得并在购得的3小时内置于冰中输运到实验室。用一个#22管道连接器在肺的气管上装上插管，并将肺从一个环形夹上悬吊下来，该环形夹上带有静置在一个大的特氟隆(Teflon)盘中的隔膜面，该特氟隆盘装有2-3mm的磷酸盐缓冲的盐水(PBS)。通过在有规则的间隔内用0.15M NaCl水雾喷洒内脏的侧面使其保持湿润。通过侧面上冒泡的外形，并通过评价肺保持恒定的20cm H₂O充气压力的能力来鉴别侧面漏洞。用自体同源的板状褶密封漏洞。将所有受到不利影响的肺区卷起并以一种类似于人类LVRS中使用的方式将其用U型钉固定(Swanson等，J.Am.Coll.Surg.185：25-32，1997)。

通过用氮气作为示踪气体进行气体稀释来测量肺的绝对容量(Conrad等，肺部功能检测-原理与实践(Pulmonary Function Testing-Principles and Practice)，Churchill Livingstone Publishers，New York，NY，1984)。测量按下述方法在0cm H₂O跨肺压下进行。用来自储气袋的1.5升100％氧气充填一个三升的注射器。然后，将装有未知体积的室内空气(79％氮气)的离体肺与装有0％氮气的注射器通过一个三通阀成直线连接。通过压下注射器的柱塞60-100次使气体充分混合，然后使用氮气计(Medtronics，830型氮气计)测定氮气的平衡浓度。然后，按照下面的质量守恒方程计算室内空气的未知起始肺容量：

           VL＝{F_N2f/(0.79-F_N2f)}·1.5L其中，F_N2f是与来自注射器的1.5升氧气混合之后，在稳态测量的氮气的分数。该测量限定了单一绝对肺容量，需要该肺容量来表征静态肺力学。

然后，在按下述步骤逐步将跨肺压从20cm H₂O放气至0cm H₂O的过程中，记录准静态放气压力容量曲线(QSPVC)。用空气充满肺至20cm H₂O跨肺压，然后用手阻塞气管。使用一台置于气道开口处的50cm H₂O压力传感器记录跨肺压。使用一台与气管插管串联连接的呼吸描记器(Hans Rudolf Inc，Kansas City，MO)测量呼气肺容量。通过间歇地阻塞气管测定作为呼气肺容量(以20cm H₂O时的起始容量为基准)函数的压力。保持阻塞足够长的时间，以使气管和肺泡压力达到平衡(在3秒内气管压力没有变化)。通过将在0跨肺压时由氮气稀释测得的单一绝对肺容量与QSPVC数据结合，确定完全的静态反冲压力容量关系。这些关系可被描述为按照Salazar等人提出的方程(J.Appl.Physiol. 19：97-104，1964)的指数函数：

               V(P)＝V_max-Ae^-kP

其中V是作为跨肺压函数的肺容量；P是跨肺压；V_max是在无穷大压力处的外推肺容量(大约等于TLC)；A是V_max与在0跨肺压时保存在肺中的气体体积(大约等于肺活量)之间的差值；k是描述压力与独立于肺的绝对容量的容量之间的指数关系的曲率的形状因子。参数V_max、A和k通过最佳拟合直线回归分析测定，在肺的总容量(PTLC)时的反冲压通过直接测量测定。

按照上述的参数表达压力容量关系是有用的，因为已知在肺气肿中，每个参数中都会以特性方式发生变化。因此，技术人员可以预测在设计用来产生肺气肿(例如，动物模型中的木瓜酶暴露)或矫正肺气肿异常(例如，容量减少；参见Gibson等，Am.Rev.Resp.Dis.120：799-811，1979)的干预之后的特异变化。例如，由于肺过度伸展，肺气肿的V_max增加(这反映了总的肺容量的上升)；由于在低的肺容量时压力容量关系的斜率减小，形状因子k也上升；由于保存的气体与总的肺容量不成比例地增加，因此最大肺容量与0跨肺压时保存在肺中的气体之间的差值A下降。在有效的肺容量减少后，这些异常将得到改善。

在完成肺容量和QSPVC测量后，评价模拟的定时通气过程中肺的功能。为此目的开发了一种由螺线管驱动的计算机控制的气动通风机。当监控并保持恒定的用户指定的平均气道压力时，该装置使得能够测量振荡通气过程中肺阻和动态弹回率。进出肺的流量(V)使用一台呼吸速率计测量，容量(V)通过对气流信号积分测定，跨肺压(P_tp)记录为以大气压力为基准的气道开口压力。

选择用于测定肺的功能的流动模式是由Lutchen等人开发的最优的通气波形(OVW)模式(J.Appl.Physiol. 75：478-488，1993)。该模式表示为选择用来提供定时通气，同时由于呼吸系统的非线性影响而将信号失真最小化的一系列正弦曲线的和(Suki等，J.Appl.Physiol.79(2)：660-671，1995)。通过测定阻抗来评价肺的功能，阻抗是通过傅立叶(Fourier)分析得到的在频域中压力与流量的比值。阻抗信号的真实部分的和虚拟部分分别表示肺阻和肺抗。肺阻等于组织阻(R_ti)与气道阻(R_aw)的和，而肺抗通过结合弹回率与气体惯性效果来测定。因此，与标准正弦或恒定流量的通气相反，OVW测量使得能够通过单次测量，在一个频率范围内测定气道阻、组织阻和动态弹回率(Edyn)。这种详细的信息之所以有用，有几个原因。容量减少是具有影响所有的三个肺功能参数的可能性的过程。在肺气肿中，容量减少将通过改进气道界限，从而使气道张开减小R_aw。因为容量减少增强组织伸展，但其将倾向于增加组织阻力。因此，根据LVR如何单独地影响R_aw和R_ti，总的肺阻，R_aw与R_ti之和可以受到可变的影响。在大多数情况下，应存在某个最佳的组织切除范围，该范围能够产生Raw的实质性下降，但仅微小地增大R_ti。OVW方法帮助限定了该最佳值。OVW方法的一个另外的好处是其对肺功能的不均匀性提供了非侵袭性评价。不均匀性的存在从生理上在肺弹回率中产生了正性频率依赖，可以通过OVW技术检测不均匀性的存在(Lutchen等，J.Appl.Physiol.75：478-488，1993)。在正常的肺中，由于大多数区域具有类似的产生均一的气体流动分布的力学性能，因此弹回率具有相对的频率依赖性。在一个病肺中，存在气体流动阻抗的区域性差值，且弹回率随频率增大而增大。在肺气肿中，弹回率的频率依赖性是一个特征性的发现，反映了罹病度的区域性差别。一个靶向患病区的成功的容量减少应该减少不均匀性和弹回率的频率依赖性。因此，弹回率的频率依赖性的减少可用作一次成功BLVR过程的指标，并且可以从OVW测量中容易地测定。预期在BLVR后立即进行的测量将会低估这种改进，而一旦形成瘢痕这种改进将变得很明显。在那时，可以观察到呼吸流速的25-50％的改进。因此，如果当按照BLVR过程施用上述的任何基于血纤维蛋白和血纤维蛋白原的组合物时，产生呼吸流速的25-50％的改进，则这些组合物都在本发明的范围内。

肺容量、准静态压力容量关系和作为频率函数的肺阻和动态弹回率的测量是在褶式容量减少之前和之后，在三个离体的、年幼的小牛肺中测定的。通过OVW技术，以测得的V_max的10％的定时体积，进行9-10cm H₂O平均跨肺扩张压力(PEEP＝5cm H₂O)时的动态记录。在用氰基丙烯酸酯粘合剂密封褶后出现小漏洞。在记录开始与减少后之间所估算的时间为60-90分钟。

容量减少前和后，离体的小牛肺中的肺的生理记录概括于下表1中。

表1：在褶式肺减容前和后在离体的小牛肺中测得的静态和动态肺力学
									肺	Raw(0.2Hz)(cm H2O/L/sec)		Rti(0.2Hz)(cm H2O/L/sec)		(cm H2O/L)		Edyn Vmax(升)
	前	后	前	后	前	后	前	后
									1	0.42	0.48	1.31	1.30	18.1	22.2	4.4	3.8
2	1.10	0.85	1.60	2.36	26.3	29.4	3.5	3.1
									3	0.82	0.88	3.08	2.92	40.1	36.2	2.9	2.7
									平均	0.78	0.74	2.00	2.19	28.2	29.2	3.6	3.2
标准偏差	0.34	0.22	0.49	0.82	11.1	7.0	0.75	0.56

这些结果说明在正常的小牛肺中，10-15％的容量减少(平均11.1％)没有产生显著的动态弹回率、气道阻力或组织阻力的变化。这些结果进一步说明可以使用本文所述的测量系统测量在离体的肺中的详细的功能，并说明可以在离体的肺上施行成功的褶式容量减少，离体的肺是作为BLVR实验的对照品。

实施例2：基于血纤维蛋白原的抗表面活性剂

肺泡和小的气道上的力学平衡通过扩张力和反冲力之间的差值测定，扩张力通过向外推动的跨肺气体压力施加，反冲力通过实质的组织结构和衬在气体液体界面里的表面膜来施加，该两者力向内拉并促进肺萎陷。至于要想在正常的呼吸过程中保持肺泡和小的气道很明显，则必须由内在稳定化力来平衡去稳定化力的微扰。肺的抵抗去稳定化和肺膨胀不全的倾向性可以按照两个生物力学性能表达：体积模量(K)和剪切模量(p)。K值与肺抵抗来自垂直指向(或法线方向)一个组织区域的力的能力成比例(Martinez等，Am.J.Resp.Crit.Care Med.155：1984-1990，1997)，而p值与肺的抵抗来自施加在一个组织区域上的剪切力的能力成比例(Stamenovic，Physiol Rev. 70：1117-1134，1990)。K值和p值越大，则肺内的内在力抵抗外来微扰和肺膨胀不全的倾向性越大。相反，任何减小K和p的因素倾向于促进肺泡的不稳定性和导致肺膨胀不全的萎陷。剪切模量和体积模量的值取决于组织和表面膜性能，可以定量表达为(Stamenovic，Physiol.Rev. 70：1117-1134，1990)：

K＝1/3{(B-2)·P_tis}+1/3{(3b-1)·P_γ}

μ＝(0.4+0.1B)·P_tis+0.4·P_γ

其中B是肺的组织成分(弹性蛋白、胶原蛋白和间质细胞)的归一化的弹回率；P_tis是在不存在表面膜反冲的情况下，组织成分的反冲压力；b是气-液界面上的表面膜的归一化弹回率；P_γ是在不存在组织反冲的情况下表面膜的反冲压力。在健康的肺中，表面力占肺反冲力的2/3到3/4，因此P_γ项对体积模量和剪切模量的贡献对确定稳定性起主要作用。在肺气肿中，其中组织的要素被破坏而施加更小的反冲，表面力在确定实质的稳定性方面的作用甚至更为重要。

这些实验的主要目的是开发一种生物适合的试剂，其可以通过支气管镜注入而在表面膜行为中产生位置特异性的变更，以致促进肺泡的不稳定性和萎陷(即，开发一种抗表面活性剂)。如果衬在肺泡和小的气道里面的液膜的体积模量或剪切模量由于化学变性而减小，则可以开发成功这种试剂。本质上说，这需要一种溶液，该溶液能够改变表面张力而不产生其它不需要的效果，所述的表面张力能够降低天然肺表面活性剂的性能。从生物医学观点来看，表面膜的特性参数是无量纲的膜弹回率参数b，所述的表面膜能够最容易地受到外来的化学处理的影响，b值等于b’·(δ_γ/δ_A)(V/A)，其中γ为膜的表面张力；A是膜铺展的表面的面积，b’为依赖所述区域的几何形状而变化的比例常数。对正常肺的表面活性剂，(δ_γ/δ_A)(V/A)(定义b^*＝b/b’)的值大约为100-110。当b在给定的范围内减小(即，δ_γ/δ_A变得更小或γ变得更大)时，局部的表面力对肺泡所起的去稳定作用比稳定作用更大。因此，具有低的弹回率(较平坦的表面张力对表面积的曲线)或高的表面张力的膜倾向于促进去稳定。

表现出这些行为方式的稳定的和不稳定的表面膜的例子示于图3a和3b。图3a显示了使用一台脉动鼓泡表面张力计(pulsating bubblesurfactometry)(PBS)测得的从一个正常豚鼠肺中分离的浓度为1mg/ml的正常表面活性剂的表面张力-表面积曲线。该曲线显示了正的膜弹回率(δ_γ/δ_A＞0)和低的最小表面张力(γ_min＜3dyne/cm)。这样的一个膜具有正值的生物物理参数b、K和p，并因此将在体内促进稳定性。与正常的表面活性剂相反，从一个在注射内霉素后患有急性肺损伤和肺膨胀不全的动物身上分离的一个样品显示弹回率几乎为0，且最小表面张力升高(图3b)。该膜的体积模量小于0，并因此将促进肺泡的不稳定性和萎陷。尽管这些生物物理特征在急性肺损伤的环境中是有害的，但在进行本实验时，明显需要将这些特征以一种受控的方式施加到一个膜上的能力。

因为以上观察到的机能障碍出现在体内，因此表征伴随该机能障碍的表面活性剂中的生物化学变化将提出对BLVR有用的生物适合的试剂。从用脂多糖(LPS)处理的动物身上分离的表面活性剂样品的功能障碍在很大程度上是由因与血清蛋白混合而引起的间质性能的变化引起，血清蛋白穿过受损的基膜进入肺泡的隔室中(Kennedy等，Exp.LungRes. 23：171-189，1997)。

为测定血纤维蛋白原溶液是否能被加入到天然的表面活性剂中以产生明显的表面膜机能障碍，通过灌洗和离心从小牛肺中分离小牛表面活性剂，小牛肺是由一个当地的屠宰场提供和新鲜品。牛血纤维蛋白原为商购获得(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo)。为每种试剂制备其生理盐水的备用溶液，并以0.1∶1、0.5∶1、1.0∶1、5.0∶1和10.0∶1的mg比(血纤维蛋白原比表面活性剂磷脂浓度)将备用溶液混合。该结果与小牛肺表面活性剂和牛血清白蛋白混合物进行比较。

通过脉动鼓泡表面张力计在37℃记录表面张力，振荡频率为20周/分钟，面积振幅比为72％，连续记录5分钟(Enhoming，J.Appl.Physiol. 43：198-203，1977)。根据对表面张力对表面积的测量，确定膜稳定性参数值(γδ/δA)/(A/γ)并将其表达为蛋白质与磷脂浓度比的函数。结果概括在图4a和4b中。这些结果说明血纤维蛋白原是比白蛋白更强的表面活性剂功能的抑制剂，能够产生显著的表面膜不稳定性(表达为膜稳定性标准b^*，蛋白质与脂类浓度比低于5∶1)。在体内使用浓血纤维蛋白原溶液很容易获得这些浓度比。

为检测离体的小牛肺中的血纤维蛋白原溶液，制备牛血纤维蛋白原(Sigma Chemical，St.Louis，Mo)的在5mM Tris-HCl(pH7.4)中的备用溶液和部分纯化的凝血酶在含有5mM CaCl₂的5mM Tris-HCl中的溶液。混合研究证明在10∶1至3∶1(mg∶mg)之间的血纤维蛋白原与凝血酶的比值导致聚合3-5分钟。选择10∶1的比值用于全肺检测。离体的小牛肺如上所述被插上管子、从一个环形夹子上悬吊下来并进行基线肺容量和QSPVC测量。在0跨肺压，直接用支气管镜观察的情况下，支气管镜被楔入一个直径约5mm的远端子段。然后，用通过一个P-240聚丙烯导管注射的50ml血纤维蛋白原溶液(10mg/ml)灌洗对向的表面，所述的聚丙烯导管穿过吸入口。用几滴浓的Evans蓝对血纤维蛋白原溶液染色以使得能够容易地识别目标区。之后移开导管，直接通过支气管镜上的吸入口进行吸气以完成冲洗过程。在进行的4次灌洗过程中灌洗回收平均为28ml(回收率56％)。然后再将导管置入受影响的区域并注入4ml凝血酶的含钙缓冲液。之后在一个不同的子段上施行第二次灌洗和聚合过程。然后记录重复的肺容量和准静态压力容量曲线。结果概括于表2中。

表2：血纤维蛋白原注入和聚合对肺容量的影响
			注入前容量(L)		注入后容量(L)
肺#1	3.4	2.9
			肺#2	3.1	2.8

这些数据说明即使不加入因子XIIIa来促进凝结稳定性，所取得的肺容量的减少显著地超过聚合溶液的保留体积，说明实现了持续的萎陷。

实施例3：含有生长因子的基于血纤维蛋白原和血纤维蛋白的溶液

任何潜在的抗表面活性剂都可以在上述的分析中得到评价，上述的分析说明血纤维蛋白原溶液具有一种抗表面活性剂所需的许多特征。除了上述的血纤维蛋白原溶液，一个技术人员还可以使用赋予组合物另外的特性的溶液，该组合物可用来在体内施行BLVR。例如，血纤维蛋白原溶液可被改性而支持成纤维细胞的生长，并用作抗生素的储器。任何改性的血纤维蛋白原溶液都可与促进纤维化的因子结合使用，只要血纤维蛋白原保持其抑制表面活性剂和发生聚合的能力即可。

碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和或β-变异生长因子(TGFβ)可以加到血纤维蛋白原溶液中，也可以加入一种氨苄青霉素和庆大霉素的抗生素混合物，抗生素混合物的加入量为足以超过对于大多数细菌来说的最小抑制浓度。

可以进行体外研究来确定因子XIIIa相对于血纤维蛋白原和凝血酶的合适的浓度，并评价生长因子和抗生素如何影响该最后的交联步骤。表面活性剂血纤维蛋白原混合物的表面张力可以使用一台商购的脉动鼓泡表面张力计(PBS)单元在体内测量。测量作为表面积函数的表面张力可在37℃下、振荡频率为20周/分钟且相对表面积变化与定时呼吸的变化类似(δA/A＝20-30％)的条件下进行。

也记录平衡和动态表面张力。记录可在30秒、5分钟和15分钟时进行，以确保在整个测量期间，最初观察到的任何表面膜机能障碍都能持续。每种膜制剂的稳定性都可以按照b^*表达，上述的无量纲的表面膜弹回率(δγ/dA·A/γ)归一化为对天然的小牛肺表面活性剂测得的b^*值。表现出＜0.2的归一化的b^*值的混合物将适合作为抗表面活性剂进行另外的检测。

小牛肺表面活性剂可以如上所述从全小牛肺中分离获得(Kennedy等，Exp.Lung Res. 23：171-189，1997)，牛血纤维蛋白原、bFGF、因子XIIIa转谷氨酰胺酶和TGFβ可以从商业供应商(例如，Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)处购得。

血纤维蛋白原：表面活性剂比值范围在0.01-10(mg蛋白∶mg脂)之间的样品的表面张力行为可以在磷酸盐缓冲盐水(0.15M，pH7.3)中得到。选择以下的六种混合物是因为它们是可在体内使用的混合物的代表，且其含有部分聚合的血纤维蛋白成分，所述的血纤维蛋白成分在聚合过程中可以存在于肺中。因此，这些混合物在体内表现出部分聚合的混合物的行为，并可对其进行评价以确定当血纤维蛋白原发生聚合时，血纤维蛋白原抑制表面活性剂功能的能力是否发生变化。

试验混合物将包含表面活性剂(浓度1mg/ml)和合适量的(1)仅血纤维蛋白单体；(2)血纤维蛋白单体与FGF和TGFβ；(3)血纤维蛋白单体与FGF、TGFβ、氨苄青霉素和庆大霉素；(4)血纤维蛋白原与FGF和TGFβ；(5)血纤维蛋白原与FGF、TGFβ、氨苄青霉素和庆大霉素；和(6)血纤维蛋白原与FGF、TGFβ、氨苄青霉素、庆大霉素和凝血酶。对在表面膜测量过程中发生聚合的样品进行的记录是不连续的(从而使得不可能测量γ对A)，并注意聚合的时间。

凝结稳定性可以在体外对含有抗生素和生长因子的表面活性剂-血纤维蛋白原混合物溶液中测试，通过PBS测量，该溶液的间质性能表现持续的异常。因子XIIIa可被加到这些样品中以促进凝块交联。在以几个浓度加入因子XIIIa时的凝结稳定性可以通过分析在8M尿素中凝块的溶解来测定(血浆凝块溶解时间)。

血纤维蛋白单体和血纤维蛋白原在蛋白质：磷脂比＞4时都应该引起表面膜行为的显著变化(归一化的b^*值＜0.2)。另外，加入凝血酶、抗生素或生长因子应该不会显著地改变血纤维蛋白化合物在需要这些试剂在体内发挥作用时的浓度下抑制表面活性剂功能的能力。如果这些添加剂显著地改变了表面活性剂与血纤维蛋白原/血纤维蛋白之间的相互作用的生物物理性质，可以容易地考虑另外的试剂(或另外的试剂浓度)。

目标区内的一个伴有瘢痕形成的稳定的长期状态的肺膨胀不全对防止BLVR之后的随后的部分或完全再伸展是必要的。这种状态可以通过使用促进成纤维细胞从肺内的相邻区域向内生长的生物聚合物来实现，且这种状态引起细胞外基质(ECM)成分的沉积。下述的过程可以用来测定含有不同浓度的生长因子的血纤维蛋白聚合物刺激成纤维细胞向内生长的能力。更具体地说，可以使用这些下述的过程测定具有不同浓度的生长因子的聚合物促进初始的细胞附着和随后的生长的能力。

用血纤维蛋白原、抗生素、FGF(含或不含TGFβ)的混合物涂覆细胞培养板，并通过加入少量的凝血酶使该混合物聚合。之后，用无菌的Eagle’s最低必需培养基洗涤板，以除去过量的试剂和凝血酶，并通过暴露于紫外照射之下过夜对板进行消毒。开始测定六种类型的板：第一和第二用血纤维蛋白聚合物、抗生素和低或高浓度的FGF涂覆；第三和第四用血纤维蛋白聚合物、抗生素和低或高浓度的TGFβ涂覆；第五和第六以类似的方式但都含有低或高浓度的生长因子的来涂覆。

在含有10％胎牛血清的最低组织必需培养基中培养株IMR-90(人类二倍体成纤维细胞，可以从American Type Culture Collection，Manassas，VA获得)。初始的涂覆后，将细胞放入80％的合流中，然后，收集细胞并将其两次放入不含血清的培养基(MCDB-104，Gibco82-5006EA，Grand Island，NY)中。然后，在密度为10⁴细胞/ml的被涂覆的6-孔板上再次培养已建立的培养物。在涂覆后4小时时，通过除去过量的培养基、冲洗不含培养物的培养基中的孔并用70％组织学级乙醇(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)固定每个孔，来评价每种涂覆混合物的附着效率(AE)。用光显微镜测定用Geimsa沾染的孔和每个高倍视野内(hpf)附着的细胞平均数。在一个盲检测试中，每个孔将评价20个区域。每次涂覆的六个孔取平均以确定最终的计数，并把结果与涂覆在组织培养塑料上的对照样品的结果进行比较。附着效率将被表达为一个与实验样品中的细胞数/hpf与对照样品中的细胞数/hpf的比值相等的指数(AEI)。所述六个生物聚合物的混合物的每一个上的细胞生长通过测定涂覆后48小时时总细胞数来评价。细胞生长表达为与归一化为在组织培养塑料上生长48小时时的细胞总数的每个样品在48小时时的细胞总数相等的生长效率指数(GEI)。通过从每个孔中除去培养基、用不含钙/镁的Hank’s溶液冲洗孔，收集细胞并计数。将保存该培养基以用于细胞的再悬浮。向每个孔中加入1ml 0.2％胰蛋白酶溶液，并温育细胞2分钟。然后除去胰蛋白酶，并使用先前采集的培养基从板上洗掉粘附的细胞，该步的作用是进一步抑制胰蛋白酶的活性。通过使用一台倒置显微镜直接观察评价残余细胞粘着程度。通过第二次胰蛋白酶洗涤除去残余的粘附细胞并使用一台血细胞计数器获得总细胞计数。

血纤维蛋白聚合物上的细胞附着应该与组织培养塑料上观察到的相等或优于后者。如果单独用血纤维蛋白所得的细胞附着不好，用3-5％的纤连蛋白与血纤维蛋白原混合并聚合血纤维蛋白原。纤连蛋白在其氨基和羧基末端处均具有血纤维蛋白结合位，并具有一个中央细胞结合域，该结合域被大多数表达β1整联蛋白的粘附细胞识别。加入血纤维蛋白原将改善细胞附着。

在含有低浓度和高浓度的bFGF的制剂中，GEI也将增加，但在含有TGFβ的制剂中GEI可能下降，原因是TGFβ对细胞增殖的抑制效果。但是，通过结合使用bFGF与TGFβ，也可能克服使用TGFβ所观察到的抑制效果。这种结合具有促进细胞向内生长及增加伴随瘢痕形成的胶原蛋白和纤连蛋白沉积的潜力。如果bFGF不能克服TGFβ的抗增殖效果，可以使用血小板衍生的生长因子(PDGF)。

实施例4：肺气肿的一个绵羊模型

在活体动物中进行的工作能够有助于确定BLVR的有效性、安全性和耐久性。此处描述的肺气肿的绵羊模型显示肺气肿的许多生理、组织学和射线照相术特征。在初步研究中，用吸入的雾化的木瓜蛋白酶处理六只成年母羊(重27-41kg)，木瓜蛋白酶是一种可商购的弹性蛋白酶和胶原酶的混合物，使用两台并联连接的高流量雾化系统经由鼻口面具(muzzle-mask)给用。该系统产生直径为1-5微米的粒子。每只动物在90分钟时间内，以0.3ml/分钟的速率接受7,000单位的在盐水中的酶。以这种方式给用的总剂量的约30-40％沉积在肺泡水平面上。将一只按照类似的程序接受盐水的动物作为对照。

在吸入治疗之前及在吸入治疗后每月间隔期，对所有的动物进行详细的测量。处理后评价持续3个月。在受控的通气过程中，给用麻醉剂后进行记录。使用一台压力传感器记录跨肺压，并使用一个食道气囊测量胸内压，所述的传感器记录气道开口之间的压差。使用一台连接到气管内导管的近端上的呼吸描记器测量嘴口处的流量。测量肺阻、静态肺顺应性和动态肺顺应性。3个月后，杀死所有的动物，并准备肺切片用于进行组织病理学评价。

在与木瓜蛋白酶接触之前和在用木瓜蛋白酶处理后3个月时测量的静态和动态肺顺应性的结果概括在图5a和5b中。静态肺顺应性从0.13±0.02显著上升至0.18±0.03L/cm H₂O(p＝0.012，n＝6)，指明了疾病的不均匀性和气体保存。

与肺气肿的半定量评价相互关联的生理学变化也进行了组织学评价。在一个盲检测试中，从每只动物获得的8个切片(每个肺叶一个)按下述标准打分：0＝无肺气肿；1＝弱度肺气肿；2＝中等程度肺气肿；3＝严重肺气肿。将从每只动物制备的8个切片取平均，定为总分数。总的肺阻倾向于随肺气肿的严重程度的分数而增加，尽管由于一个异常值的存在，及所研究的动物数量较少，这种关系并不具有统计显著性。动态顺应性确实显著地与肺气肿的严重程度反向相关(图6a和6b)。

实施例5：体内BLVR的应用

对上述的绵羊肺气肿进行归纳，提供了一个绝佳的模型，在该模型中测试BLVR的安全性和效能。在下述的研究中，分析了8只患有肺气肿的绵羊；4只没有接受治疗，4只用BLVR治疗。在(1)与木瓜蛋白酶接触前的基线处，(2)与木瓜蛋白酶接触后8星期时(此时，所有的动物都显现肺气肿)；和(3)不进行肺容量减少进行的假支气管镜检查(对照)，或用基于血纤维蛋白原的组合物施行BLVR(实验)后6星期时，进行测量。更具体地说，用一种含有5％血纤维蛋白原的基于血纤维蛋白原的溶液处理实验动物，随后用在5mM钙溶液中的1000单位凝血酶将血纤维蛋白原聚合。

所有的动物都显现了肺气肿的生理学迹象，同时伴有与弱度到中度肺气肿相符的肺阻上升、动态弹回率上升、总的肺容量上升和静态压力容量关系变化。因此，如上所述通过雾化器施行的木瓜蛋白酶治疗引起了肺气肿。

6星期后，患有木瓜蛋白酶诱导的肺气肿、且没有接受任何治疗的动物肺阻(在正常的呼吸频率下，比处理前基线高125％)和动态弹回率(在正常的呼吸频率下，比处理前基线高31％)持续上升。与基线相比，静态肺行为保持显著地异常，与处理前的基线相比，肺容量增加了33％。这些结果概括在下表3并显于图7中。

表3
				处理	f＝10b/min时的RL(cmH2O/L/sec)	f＝10b/min时的EL(cmH2O/L)	Raw(cmH2O/L/sec)
基线(n＝8)	1.71±0.36	10.85±2.78	0.50±0.23
				用木瓜蛋白酶处理前(n＝8)	3.03±0.47	13.51±3.81	1.17±0.39
统计显著度	p＝0.041	p＝0.20	p＝0.029

相反，6星期后，用BLVR治疗的动物其气道阻力、正常呼吸频率下的总肺阻、总的肺容量和安静肺容量显著下降。这些结果概括在表4中，说明了与容量减少前相比，肺的生理状况得到改善，且与未治疗的动物相比，有明显改善。

表4
					实验组	Raw(cmH2O/L/sec)	f＝10b/min时的RL(cmH2O/L/sec)	安静肺容量FRC(升)	最大肺容量TLC(升)
治疗前容量减少	0.61±0.31	3.47±1.14	1.27±0.31	3.31±0.62
					治疗后容量减少	0.82±0.31	1.85±0.57	0.97±0.21	2.85±0.71
假治疗后的对照	1.14±1.22	3.21±0.97	0.80±0.31	2.76±0.49

此外，所有用BLVR治疗的动物对该过程的忍受度都很好。在完成手术的一小时之内，没有通气器支持，它们都能呼吸，且所有的动物在24小时内都饮食正常。四只动物中的一只表现发热，其持续了两天，且发热用5天的肌肉内抗生素治疗很容易地得到控制。没有观察到其它的并发症。因此，对BLVR的生物应答是非常正性的。

实施例6：ECM成分对血纤维蛋白凝胶性能的影响

研究了CS、HA、Fn和PLL对促进组织萎陷或组织附着的溶液的力学性能；溶液聚合的速率；和这样的溶液支持成纤维细胞生长的能力的影响。为表征力学性能，在12-孔细胞培养盘中形成圆形凝胶，使用一个刀片切割凝胶带(4×4×10mm)，并当拉伸凝胶带时，用一台伺服控制的计算机化的长度调节器系统和耦合的力传感装置测定其耗散模量(G)。此外，测定每种制剂的屈服应力(Y_s)以评价在单轴拉伸条件下的强度和耐久性，并用含有CS和PLL的溶液测试疲劳(见下)。该溶液表现出理想的力学性能。使用一个停表估算聚合速率(K_p)并将聚合速率定义为抑制在聚合被引发时，一个小的、磁性混合杆在溶液中以4π弧度/秒的速度旋转所需的时间量的倒数。通过在预形成的凝胶上，以及在将血纤维蛋白原试剂与细胞悬浮液混合后聚合的凝胶内生长成纤维细胞进行细胞培养研究(WS-1变异的人类成纤维细胞线)。为评价细胞增殖，在以均一的细胞浓度涂覆后，计数每个10高倍视野内存在的细胞数量，并进行MTT细胞增殖分析。

受测的所有的ECM成分都可溶解于溶解在pH7.4的缓冲盐水中的血纤维蛋白原中，尽管需加热溶液以溶解HA。使用以最终浓度为3％、2.5mM CaCl₂和0.025mM二棕榈酰基卵磷脂(DPPC)的含水的牛血纤维蛋白原(片段VII，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)制备血纤维蛋白凝胶。钙和DPPC浓度在用来最优化血纤维蛋白原的聚合速率的初步的工作中测定。使用每ml血纤维蛋白原溶液100单位的凝血酶(3.3单位凝血酶/mg血纤维蛋白原)引发聚合。检测浓度为0.01、0.1和0.3重量％(相对于血纤维蛋白原)的CS、PLL和HA。检测浓度为0.001和0.01％的Fn。结果与不含添加剂的血纤维蛋白凝胶和以一种组织密封剂销售的可商购的血纤维蛋白胶水(Baxter Pharmaceutical，Tisseal^TM)进行比较。在凝胶形成的30分钟内，并在凝胶形成后和在室温下保持在水溶液中时的24、48和168小时时检测样品。

向血纤维蛋白凝胶中加入细胞外基质成分对力学性能的影响概括在图8a和8b中。加入低分子量的HA显著降低Kp(聚合减慢)，而CS、PLL和Fn对聚合速率没有影响。加入CS(浓度为0.1和0.3％)和PLL(0.05％)分别使凝胶弹回率(H)增加55％和50％，而加入HA没有此影响。凝胶带的耗散行为(G)的变化与弹性行为紧密平行，以致耗散模量与弹性模量的比值，η(η＝G/H)对所有的制剂都保持相对恒定(所有样品的η范围为0.1-0.15)。通过加入0.05％PLL显著提高凝胶屈服应力，但加入其它成分对凝胶屈服应力没有显著的影响。

含有单一添加剂的血纤维蛋白凝胶的聚合速率和力学性能用来开发含有理论上促进巨噬细胞和成纤维细胞趋化性和胶原蛋白沉积的试剂的凝胶结合物。一种含有0.1％CS、0.1％PLL、0.1％HA和0.01％Fn的最终凝胶结合物聚合快速，在盐水溶液中1星期后保持其力学性能，在重复的拉伸和扭曲变形过程中不发生断裂。此外，这些性能是由调节组织萎陷区内的细胞的行为的试剂赋予的。

图9概括了疲劳测试，在疲劳测试中一种标准的血纤维蛋白凝胶与一种含有0.05％PLL和0.1％CS的血纤维蛋白凝胶比较。当在重复的正弦循环过程中在一定范围的应变振幅中测试改性的血纤维蛋白凝胶时，其表现出更高的屈服应力和更强的抵抗与疲劳有关的破坏的能力。如图9所示，仅由血纤维蛋白组成的凝胶带在比含有PLL和CS的血纤维蛋白溶液低得多的百分比应变时表现出延展性断裂。改性的血纤维蛋白胶水制剂的“无限”寿命，由百分比应变表示，比标准的血纤维蛋白胶水(10％应变)显著地高(32％应变)，低于百分比应变则断裂不会发生。

也测试了血纤维蛋白凝胶制剂的支持成纤维细胞生长的能力，不仅在其表面测试，也在聚合时在聚合混合物内部测试。通过计数10高倍视野内的细胞数量，并通过进行MTT(3，4，5，二甲基-噻唑-2-基-2，5-二苯基溴化四唑)染料增殖分析，来分析细胞增殖。分析在培养以2×10⁶细胞/孔的起始涂覆密度开始后进行96小时。使用WS-1人类成纤维细胞以及从American Type Cell Culture Collection(ATCC；Manassas，VA)获得的3T3鼠科成纤维细胞进行分析。将计数归一化为在标准组织培养塑料上测得的那些计数。从两种分析(细胞计数和MTT)所获得的结果类似(图10a和10b)。与在组织培养塑料上的生长相比，当在血纤维蛋白凝胶的顶部生长时，WS-1和3T3生长的细胞增殖都被加速。CS(0.1％和0.3％)、Fn(0.001％和0.01％)和HA(0.1％和0.3％)对上述仅由血纤维蛋白凝胶观察到的细胞生长速率没有额外的影响(图10a，左条)。相反，不含这些添加剂对细胞增殖具有不利的效果。在凝胶中的研究(图10b)显示相对于不含添加剂的血纤维蛋白凝胶和含有HA的凝胶，CS(0.1％)和Fn(0.01％)两者均促进成纤维细胞增殖。CS与Fn的结合具有最强的影响。凝胶中的WS-1成纤维细胞的组织显微图说明CS和Fn一起能促进成纤维细胞增殖和器官型组织化。因此，加入这种ECM的结合物促进成纤维细胞增殖和细胞组织化为暗示器官型生长模式的线性的和交联的排列。因此，含有CS(0.1％)和Fn(0.01％)的血纤维蛋白凝胶促进成纤维细胞增殖和器官型组织化和生长模式。通过增加弹性和抗裂性，PLL显著地改进血纤维蛋白凝胶的力学性能。因为HA减慢聚合速率而不明显地改进基于血纤维蛋白的凝胶的力学性能或在体外促进巨噬细胞的趋化性，因此，HA可能是一种比血纤维蛋白胶水本身更好的“抗表面活性剂”冲洗液的添加剂。下面的体内研究支持该结论。

实施例7：“活的”生物-聚合物

上面进行的研究证明肺成纤维细胞可在改性的血纤维蛋白凝胶中培养，说明含有从一个病人的目标组织、该病人的另一个组织、一个不同的人(例如，一个亲戚或一个器官供体)或胎儿(例如，胎儿肺组织)中采集的细胞的凝胶可用来实现目标肺的容量减少。因此，对于患有肺气肿的病人来说，通过皮肤活体解剖、在体外与特异生长因子接触并使用本发明的基于血纤维蛋白的胶水(可以含有或不含有上述的试剂，如ECM的成分)给用到肺部而采集的成纤维细胞可用来有效地实现组织容量减少和促进集中的瘢痕形成。所使用的细胞类型可以根据要实现的目标而变化。例如，该病人的自体肺细胞和干细胞(可能从胎儿组织获得)的结合可用来减少肺容量并促进肺组织的生长和再生长。

实施例8：使用基于血纤维蛋白的溶液进行的体内研究

检测了本文所述的多种溶液的安全性、生物适应性和在完整的动物中进行的容量减少中的应用。安全性和生物适应性检测在不患有肺部疾病的绵羊(即，该绵羊不引起肺气肿类的疾病的木瓜蛋白酶接触)体内进行。在0点(即，在处理前)和在处理后的几星期内测量动物的基线肺功能(包括肺容量和静态压力容量膨胀曲线)。用氯胺酮和安定麻醉所有的动物，并通过静脉内注射丙泊酚(Propofol)维持。把一个食道气囊置入以测量胸内压。动物在测量期间用机械通气支持器维持。在检测之前，动物返回笼子并允许不受限制地饮食。

上述的全部动物实验具有下述的改进之处。先前，用50ml血纤维蛋白胶水来密封每个子段目标区域，但在本研究中在每个区域仅使用10ml血纤维蛋白溶液(焦点集中在生物学而非生物力学，目的是限制形成肿胀)。与未改性的血纤维蛋白胶水结合的盐水冲洗液(n＝2)与一种与含有0.1％CS、0.1％PLL和0.05％HA的血纤维蛋白胶水结合的改性的冲洗液(10％乙醇、0.5％血纤维蛋白原、0.3％低分子量的透明质酸和0.01％纤连蛋白)进行比较。结果概括在图11中，在图11中压力与容量之间的关系表达为下面的Salazaar和Knowles提出的指数拟合方程：

             V(P)＝V_max-(V_max-V_min)e^-kP

其中，V_max＝在最大扩张压时的总的肺容量；V_min＝在0扩张压时的残余肺容量；k为描述压力与容量之间的指数关系的形状的形状因子。示出了用盐水+血纤维蛋白胶水处理的动物，和用改性的冲洗液+改性的胶水处理的动物在处理前和处理后V_max、V_min和k的比较。在用盐水+血纤维蛋白胶水处理的动物中，没有观察到最大肺容量(V_max＝处理前的3.6±0.28L到处理后的3.49±0.62L)、最小肺容量(V_min＝处理前的1.22±0.18L到处理后的1.28±0.21L)或形状因子(k＝处理前的0.19±0.02到处理后的0.19±0.05)中的差别。在用如上所述用来促进成纤维细胞生长、趋化性和胶原蛋白沉积的冲洗液和胶水处理的动物中，观察到V_max减小(处理前的3.61±0.31L至处理后的3.15±0.22L；用成对t检测得p＝0.11)和V_min减小(处理前的1.69±0.31L至处理后的1.22±0.23L；p＝0.007)；但k保持不变(处理前的0.14±0.02至处理后的0.15±0.04)。

图12a和12b示出了从一只用盐水冲洗液+血纤维蛋白处理的动物和一只用改性的冲洗液+改性的胶水处理的动物获得的单准静态压力容量关系。仅用盐水+血纤维蛋白胶水处理的动物没有表现出作为治疗结果的肺容量的减少。相反，用改性的冲洗液+胶水处理的动物其V_max和V_min均表现出明显的下降，且在总的压力容量关系中出现的向下和向右的偏移说明肺容量的整体下降。

与其中用50ml血纤维蛋白胶水处理的所有动物均需要氧气后程序，及4只动物中的2只需要治疗发热的抗生素的研究相反，用盐水或用改性的冲洗液+胶水处理的动物组中的动物没有需要氧气或抗生素的。此外，对经处理的肺进行的尸体解剖研究显示没有形成肿胀的迹象。

这些数据说明本文所述的改性的表面活性剂冲洗液和血纤维蛋白胶水可用来实现安全的和有效的容量减少治疗。这些数据支持一些研究，这些研究显示在肺中进行有效的组织减少治疗可以不用使用生物适合的胶水的外科手术就能实现，这些数据还确立了使用调节肺成纤维细胞、肺泡细胞、巨噬细胞和内皮细胞的特殊生物学方面的试剂的方法的耐久性。

实施例9：改性的基于血纤维蛋白的胶水能够密封肺的漏气

下面的研究证明本发明的溶液能够有效地密封肺的漏气。本文所述的溶液的力学性能优于其它基于血纤维蛋白的制剂，这些力学性能使得本发明的新型溶液在重复的扭曲过程中抵抗断裂(图9)。接受胸部手术的病人将从使用改性的基于血纤维蛋白的胶水用于密封漏气中受益。胸部手术很常见。由于，例如，肺结核和癌症的切除术、用于确认一种未知的肺病的诊断的组织切除和难以进行常规医疗的慢性传染病切除术，每年接受这种类型手术的病人超过250,000。由于肺组织很复杂，因此在手术后由组织撕裂导致的漏气很常见。据报道发生率为25-40％。肺部的撕裂需要长时间来愈合，特别是患有严重的原发性肺病的病人，而长期的漏气显著地促进发病率和死亡率。

使用本文所述的血纤维蛋白胶水，特别是那些被改性含有ECM成分的胶水，可以作为初步治疗应用以防止在普通的气管外科手术中的泄漏，或作为次步治疗应用以密封现存的或持续的泄漏，无论泄漏是来源于先前的外科手术还是内在性疾病。

可以应用一种双气囊探测器-注射导管系统(图14a和14b)来识别泄漏区。一旦该区域被识别并被隔离，可以从远侧注射溶液以实现密封。这些溶液可以与那些用来实现容量减少的溶液相同，因为在两种情况中均需要相同的聚合、生物适应性、力学和生物学特性。

使用这种双气囊探测器-注射器和改性的血纤维蛋白胶水在离体的小牛肺中进行了研究，以识别、定位并密封侧漏。如上所述及如图8a、8b和9所示，在血纤维蛋白基质中加入生物适合的聚合物显著地增强了所得的凝胶-聚合物，并减少了循环疲劳过程(循环疲劳过程是模拟与气道有关的应力)中的凝胶断裂。这些制剂在体外明显地比常规的血纤维蛋白胶水更强、更持久。增加胶水的机械强度所需的改进不会相反地影响凝胶的聚合速率。因此，保持了准确而及时的输送。

在三个独立的离体的牛肺实验中，在通过探测器-注射器导管系统综合给用这些胶水后，胶水完全密封了17个漏气处中的13个。漏洞被密封到扩张压为50cm H₂O。当在固定的扩张压下(50cm H₂O)，通过漏洞的流量减小进行评价时，施用胶水减少了所有情况下的泄漏程度。

其它实施方案

尽管本发明的组合物和方法特别适用于人类，但其通常也可用来治疗任何哺乳动物(例如，家畜如马、牛和猪，和驯养动物如狗和猫)。

此外，上述的组合物可以有效地应用于肺以外的多种组织。例如，这些组合物可以用来密封脑脊髓液的泄漏；密封天然的和弥补性的血管移植(包括那些与移植人工瓣膜如二尖瓣有关的移植)的汇合处；用于涉及脉管壁的有意的或意外的穿孔的诊断或介入过程或内窥镜或整形外科过程；用于整形外科；及用于多脉管的切割组织(例如，肾、肝和脾)。上述的组合物也可以用来加速糖尿病的治愈及用来治疗长期与标准方法相抵的化脓性创伤，包括耐抗生素性的细菌感染。

Claims (37)

1.含有血纤维蛋白、血纤维蛋白原和/或血纤维蛋白原激活剂的至少一种的物质在制备用于促进减少病人的肺容量的药物中的应用。

2.权利要求1所述的应用，其中所述的物质为溶液或悬浮液。

3.权利要求2所述的应用，其中所述溶液为水溶液。

4.权利要求2所述的应用，其中所述的物质进一步含有一种多肽生长因子。

5.权利要求4所述的应用，其中所述的多肽生长因子为成纤维细胞生长因子或类β-变异生长因子(类TGFβ)多肽。

6.权利要求2所述的应用，其中所述的物质进一步含有细胞外基质(ECM)的一种成分或一种类ECM物质。

7.权利要求6所述的应用，其中ECM的所述的成分包括透明质酸(HA)、硫酸软骨素(CS)或纤连蛋白(Fn)。

8.权利要求6所述的应用，其中所述的类ECM物质包括聚L-赖氨酸或一种由脯氨酸和羟基脯氨酸组成的肽。

9.权利要求1所述的应用，其中所述物质用于：

(a)促进肺的一个区域萎陷；

(b)促进已萎陷的区域的一个部分与另一个部分粘合；和

(c)促进肺的已萎陷的区域内或该区域周围的纤维化。

10.权利要求9所述的应用，其中所述物质为溶液或悬浮液。

11.权利要求9所述的应用，其中所述物质进一步包括一种增加衬在肺泡里面的流体的表面张力的物质。

12.权利要求11所述的应用，其中所述的物质为血纤维蛋白原。

13.权利要求11所述的应用，其中所述的物质为血纤维蛋白。

14.权利要求9所述的应用，其中所述物质能阻止空气流入或流出所述的目标区域。

15.权利要求9所述的应用，其中所述物质进一步含有血纤维蛋白原和一种血纤维蛋白原激活剂。

16.权利要求15所述的应用，其中所述的血纤维蛋白原激活剂为凝血酶。

17.权利要求16所述的应用，其中所述物质含有3-12％血纤维蛋白原。

18.权利要求17所述的应用，其中所述物质含有10％血纤维蛋白原。

19.权利要求9所述的应用，其中所述物质包括用于将已萎陷的区域的一部分与另一部分粘合的血纤维蛋白。

20.权利要求9所述的应用，其中所述物质进一步包括用于促进所述肺的已萎陷的区域内或该区域周围的纤维化的多肽生长因子。

21.权利要求20所述的应用，其中所述的多肽生长因子为成纤维细胞生长因子(FGF)。

22.权利要求21所述的应用，其中所述的FGF为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。

23.权利要求20所述的应用，其中所述的多肽生长因子为β-变异生长因子(TGF-β)。

24.权利要求15所述的应用，其中所述物质进一步包括因子XIIIa转谷氨酰胺酶。

25.权利要求19所述的应用，其中所述物质进一步包括因子XIIIa转谷氨酰胺酶。

26.权利要求9所述的应用，其中所述物质进一步包括一种减少感染的危险的抗生素。

27.权利要求26所述的应用，其中可一起给用的血纤维蛋白原、血纤维蛋白或一种血纤维蛋白原激活剂中的至少一种与所述的抗生素。

28.一种用于促进肺容量减少的生理用组合物，其含有一种多肽生长因子，和蛋白聚糖、聚L-赖氨酸、硫酸软骨素、纤连蛋白或由脯氨酸和羟基脯氨酸组成的肽中的至少一种，以及

(a)血纤维蛋白原；或

(b)一种血纤维蛋白单体；或

(c)一种血纤维蛋白原激活剂，

或其组合。

29.权利要求28所述的组合物，其中所述的多肽生长因子为一种成纤维细胞生长因子(FGF)。

30.权利要求28所述的组合物，其中所述的FGF为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。

31.权利要求28所述的组合物，其中所述的多肽生长因子为β-变异生长因子(TGF-β)。

32.权利要求28所述的组合物，其中所述的血纤维蛋白单体为一种血纤维蛋白I单体、一种血纤维蛋白II单体、一种des BB血纤维蛋白单体或这些单体的任何混合物或结合物。

33.权利要求28所述的组合物，其中所述的血纤维蛋白原激活剂为凝血酶。

34.权利要求28所述的组合物，其进一步含有一种抗生素。

35.一种用于促进肺容量减少的生理用的组合物，其含有蛋白聚糖、聚L-赖氨酸、硫酸软骨素、纤连蛋白或由脯氨酸和羟基脯氨酸组成的肽中的至少一种，以及

(a)血纤维蛋白原；或

(b)一种血纤维蛋白单体；或

(c)一种血纤维蛋白原激活剂，

或其组合。

36.权利要求28或35所述的组合物，其包括聚L-赖氨酸、硫酸软骨素或其组合。

37.权利要求28或权利要求35所述的组合物在制备用于密封肺的漏气的药物中的应用。

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