WO2017104723A1 - 止血用組成物、および、止血用組成物を用いた止血方法 - Google Patents

止血用組成物、および、止血用組成物を用いた止血方法 Download PDF

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恵嗣 永野
小林　智
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Definitions

  • the present invention relates to a hemostatic spray containing a self-assembling peptide.
  • Biogels such as fibrin glue are used for intraoperative / postoperative hemostatic agents, surgical base materials such as wound healing sheets, drug delivery systems (DDS), and the like.
  • fibrin glue is highly useful as a hemostatic agent at the time of surgery, but since the raw material is derived from human blood, when it is actually used at the time of surgery, the patient is infected with the hepatitis virus mixed in the fibrin glue Has become a major social problem. Therefore, development of a safe hemostatic agent free from the risk of microbial contamination by chemical synthesis of raw materials is required.
  • Patent Document 1 a composition containing a purified amphiphilic self-assembling peptide for promoting wound healing.
  • the self-assembling peptide composition as described in Patent Document 1 can be applied to a wound site (or surgical site) to promote tissue regeneration, and there is no risk of microbial contamination, It is a very useful composition.
  • the inventors of the present invention have been engaged in applied research of the self-assembling peptides as described above.
  • the self-assembling peptides as described above are used for hemostasis (for example, use as a hemostatic agent used during surgery).
  • hemostasis for example, use as a hemostatic agent used during surgery.
  • the peptide concentration in the composition applied to the bleeding site is increased, the hemostatic effect is improved, but on the other hand, the viscosity of the applied composition also increases, so that the applied composition is less likely to spread at the bleeding site, It becomes difficult to exert a uniform hemostatic effect at the application site (in other words, the peptide concentration in the composition applied to the bleeding site is lowered, the applied composition tends to spread at the bleeding site, but high hemostasis) I realized that there is a technical dilemma.
  • the inventor has intensively studied a method for solving the above technical dilemma, and surprisingly, by using a composition containing a self-assembling peptide as a “spray agent”, a composition containing the self-assembling peptide. It has been found that a product can be uniformly applied to a bleeding site, and that a high hemostatic effect can be obtained as compared with the case where it is applied by a conventional method, and the present invention has been completed.
  • the present invention in one embodiment, is a composition applied to a subject as a spray, wherein the spray is for hemostasis, the composition includes a self-assembling peptide, and the self-assembling property.
  • the peptide is a substance that gels by self-assembling when the composition is applied to the bleeding site of the subject, and the self-assembling peptide has improved hemostatic ability compared to the case where it is applied directly. It is related with the composition characterized by being contained in the said composition in the density
  • the concentration of the self-assembling peptide in the composition is at least 1.5% by weight or more.
  • the self-assembling peptide is (A) a peptide comprising an amino acid sequence consisting of 4 to 34 amino acid residues in which polar amino acid residues and nonpolar amino acid residues are alternately arranged, or (B) 13 amino acid residues in which nonpolar amino acids and polar amino acids are arranged alternately and symmetrically in the N-terminal direction and the C-terminal direction around the 7-position nonpolar amino acid residue A peptide comprising an amino acid sequence comprising a group.
  • the polar amino acid residue is an aspartic acid residue, a glutamic acid residue, an arginine residue, a lysine residue, a histidine residue, a tyrosine residue, a serine residue, or a threonine residue.
  • the nonpolar amino acid residue is an alanine residue, valine residue, leucine residue, isoleucine residue, methionine residue, phenylalanine residue, tryptophan residue, proline residue.
  • the polar amino acid residue is an aspartic acid residue, a glutamic acid residue, an arginine residue, a lysine residue, a histidine residue, a tyrosine residue, a serine residue, or a threonine residue.
  • An asparagine residue, a glutamine residue, and a cysteine residue, and the nonpolar amino acid residue is an alanine residue, valine residue, leucine residue, isoleucine It is an amino acid residue selected from the group consisting of a residue, a methionine residue, a phenylalanine residue, a tryptophan residue, a proline residue, and a glycine residue.
  • the self-assembling peptide is a peptide containing RADARADARADARADA (SEQ ID NO: 1), a peptide containing IEIKIEIKIEIKI (SEQ ID NO: 2), or a peptide containing RLDLRLALRLDLR (SEQ ID NO: 3). It is characterized by being.
  • the self-assembling peptide is a peptide consisting of RADARADARADARADA (SEQ ID NO: 1), a peptide consisting of IEIKIEIKIEIKI (SEQ ID NO: 2), or a peptide consisting of RLDLRLALRLDLR (SEQ ID NO: 3). It is characterized by being.
  • the bleeding site of the subject is a non-surgically formed wound site, or a surgically formed incision site or excision site.
  • Another embodiment of the present invention is a method for hemostasis in a subject, comprising the step of applying a composition containing the self-assembling peptide to the bleeding site of the subject by spraying the self-assembling peptide,
  • the composition When the composition is applied to the bleeding site of the subject, it is gelled by self-assembling, and the self-assembling peptide is at a concentration having an improved hemostatic ability compared to the case where it is applied directly, It is contained in the said composition, It is related with the method characterized by the above-mentioned.
  • the subject is an animal other than a human.
  • FIG. 1 shows a syringe filled with a peptide solution used in an example of the present invention.
  • FIG. 2 shows Peptide No. 1 is a photograph after applying 1 (1.0% or 1.5%) to the bleeding site of pig liver by normal application or spray application.
  • FIG. 3 shows Peptide No. It is a photograph after applying 1 (2.0% or 2.5%) to the bleeding site of pig liver by normal application or spray application.
  • FIG. 4 shows Peptide No. 2 is a photograph after 2 (1.0% or 1.5%) is applied to the bleeding site of pig liver by normal application or spray application.
  • FIG. 5 shows Peptide No. 3 (1.5%) is a photograph after application to the bleeding site of pig liver by normal application or spray application.
  • FIG. 6 shows Peptide No.
  • FIG. 7 shows Peptide No. 2 shows the results of measuring the amount of composition applied until hemostasis was completed when 2 (1.0% or 1.5%) was applied to the bleeding site of pig liver by normal application or spray application.
  • FIG. 8 shows Peptide No. 2 shows the result of measuring the hemostasis completion time when 2 (1.0% or 1.5%) is applied to the bleeding site of pig liver by normal application or spray application.
  • FIG. 9 shows Peptide No. 3 shows the results of measuring the hemostasis completion time and the application amount of the composition until hemostasis completion when 3 (1.5%) is applied to the bleeding site of pig liver by normal application or spray application.
  • the present invention relates to a composition applied to a subject as a spray.
  • the “spray agent” means an agent applied in a spray form to an application target.
  • the method, apparatus or device for applying the composition in spray form is not limited, and can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • it can be applied in the form of a spray by spraying the liquid composition in the form of a mist or foam using compressed air or high-pressure gas. More specifically, for example, can spray using high pressure gas in the can, electric spray using an electric pump, etc., air spray using external air pressure (for example, spray gun, air brush, etc.) Can be applied.
  • the present invention also relates to a hemostatic agent.
  • the “hemostatic” agent broadly means an agent used for stopping bleeding from a living body, and includes not only an agent for completely stopping bleeding but also an agent for reducing bleeding.
  • any hemorrhage site subject to hemostasis may be used.
  • the present invention may be applied to a non-surgically formed wound site, or a surgically formed incision site or excision site.
  • non-surgically formed wound sites include wounds on body surface tissues (eg, skin) or body tissues (eg, organs, muscles, bones) due to accidents or the like.
  • surgically formed incision sites or excision sites include, for example, surgical surface incision or excision with a scalpel or other body tissue or body tissue site, surgical instrument, peeling, anastomosis, suture, etc.
  • the present invention is applied to an object by spraying, the application operation is easier than the conventional product in that the composition can be applied uniformly over a wide range in one operation. Therefore, it can also be suitably used for bleeding sites that occur in endoscopic surgery.
  • the application target of the present invention may be a human or a non-human.
  • the non-human subject can be, for example, a non-human animal, such as a non-human mammal, a bird, a reptile, an amphibian, or a fish.
  • Examples of the non-human mammals include rodents (eg, mice, rats), dogs, cats, horses, pigs, cows, sheep, goats, primates and the like.
  • the composition of the present invention contains a self-assembling peptide.
  • a peptide “self-assembles” in a solution means that peptides interact with each other in a solution (for example, electrostatic interaction, hydrogen bond, van der Waals force, hydrophobic interaction, etc.). ) Means to spontaneously gather, and should not be interpreted in a limited sense.
  • the self-assembling peptide means a peptide having a characteristic of forming a self-assembly in which a large number of peptide molecules are regularly arranged according to the amino acid sequence. And when the composition containing a self-assembling peptide is applied to the bleeding site of an object by the property, a self-assembling peptide self-assembles and forms a gel in the applied site.
  • the self-assembling peptide used in the present invention may have a certain viscosity in the aqueous solution before application to the subject (that is, the aqueous peptide solution before the self-assembling peptide self-assembles) itself.
  • the aqueous peptide solution before the self-assembling peptide self-assembles itself.
  • it may be referred to as a “peptide solution (or aqueous peptide solution)”.
  • the self-assembling peptide used in the present invention is, for example, a peptide comprising an amino acid sequence consisting of 4 to 34 amino acid residues in which polar amino acid residues and nonpolar amino acid residues are alternately arranged, or position 7
  • the self-assembling peptide used in the present invention includes the peptide structure as described above, when a ⁇ sheet structure is formed in an aqueous solution, only polar amino acid residues are arranged on one side of the ⁇ sheet structure. Only non-polar amino acid residues can be placed on the other side. Therefore, such a ⁇ sheet structure can be aggregated so as to hide a hydrophobic surface (a surface on which only nonpolar amino acid residues are arranged) to form a two-layer structure. Then, as the molecular self-assembly proceeds, the layer structure of the ⁇ sheet expands, and a three-dimensional structure (for example, hydrogel) can be formed.
  • the “self-assembling peptide” used in the present invention is sometimes referred to as “self-assembling peptide”.
  • the self-assembling peptide used in the present invention may include “an amino acid sequence in which polar amino acid residues and nonpolar amino acid residues are alternately arranged”, and in that case, the amino acid sequence has 4 to 34 amino acid sequences. It may be an amino acid sequence consisting of amino acid residues, more preferably an amino acid sequence consisting of 8 to 30 amino acid residues, and even more preferably an amino acid sequence consisting of 12 to 26 amino acid residues. Most preferably, it may be an amino acid sequence consisting of 13 to 20 amino acid residues.
  • amino acid is used in the broadest sense and includes not only protein-constituting amino acids but also protein non-constituent amino acids such as amino acid variants and derivatives.
  • amino acids in the present invention include, for example, protein-modified L-amino acids; D-amino acids; chemically modified amino acids such as amino acid variants and derivatives; norleucine, ⁇ -alanine It will be appreciated that non-proteinogenic amino acids such as ornithine; and chemically synthesized compounds having properties known in the art that are characteristic of amino acids.
  • protein non-constituent amino acids include ⁇ -methyl amino acids (such as ⁇ -methylalanine), D-amino acids, histidine-like amino acids (2-amino-histidine, ⁇ -hydroxy-histidine, homohistidine, ⁇ -fluoromethyl-histidine and ⁇ -methyl-histidine etc.), amino acids with extra methylene in the side chain (“homo” amino acids) and amino acids in which the carboxylic acid functional amino acids in the side chain are replaced with sulfonic acid groups (eg cysteic acid) .
  • the amino acid used in the present invention may be a protein-constituting amino acid.
  • the polar amino acid residue is not particularly limited as long as the side chain can have polarity, and includes, for example, an acidic amino acid residue and a basic amino acid residue.
  • acidic amino acid residues include, for example, aspartic acid (Asp: D) residues, glutamic acid (Glu: E), etc.
  • basic amino acids include, for example, arginine (Arg: R), Includes lysine (Lys: K), histidine (His: H) and the like.
  • aspartic acid (Asp: D) or the like may be expressed as “Asp” in three letters or “D” in one letter as an abbreviation for aspartic acid. means.
  • amino acid residues containing a hydroxyl group, an acid amide group, a thiol group, and the like are assumed to be polar and are included in polar amino acid residues.
  • tyrosine (Tyr: Y), serine (Ser: S), threonine (Thr: T), asparagine (Asn: N), glutamine (Gln: Q), and cysteine (Cys: C) are polar. Included in amino acid residues.
  • the nonpolar amino acid residue is not particularly limited as long as the side chain has no polarity.
  • alanine Al: A
  • valine Val: V
  • leucine Leu: L
  • Isoleucine I
  • methionine Metal: M
  • phenylalanine Phe: F
  • tryptophan Trp: W
  • glycine Gly: G
  • proline Pro: P
  • the peptide contains a repetitive sequence of “RADA” (repeat is 2 to 8 times, preferably 3 to 6 repeats), or a repeat sequence of “IEIK” (1 to 4 repeats, preferably 2 to 3 repeats), more preferably RADARADARADARADA (sequence It may be a peptide comprising number 1) or a peptide comprising IEIKIEIKIEIKI (SEQ ID NO: 2).
  • the self-assembling peptide used in the present invention may be a peptide consisting of RADARADARADARADA (SEQ ID NO: 1) or a peptide consisting of IEIKIEIKIEIKI (SEQ ID NO: 2).
  • the self-assembling peptide used in the present invention is “a position where a nonpolar amino acid and a polar amino acid are alternately and symmetrically in the N-terminal direction and the C-terminal direction around the nonpolar amino acid residue at position 7.
  • the “nonpolar amino acid residue at position 7” of the peptide is alanine (Ala: A).
  • the peptide may be a peptide containing RLDLRLALRLLDLR (SEQ ID NO: 3), and more preferably a peptide consisting of RLDLRLALRLLDLR (SEQ ID NO: 3).
  • examples of other self-assembling peptides that can be used in the present invention include peptides disclosed in WO2006 / 014570.
  • the self-assembling peptide used in the present invention may be modified (or labeled) as long as the main properties of the peptide intended by the present invention are not lost, and such modified (or labeled) peptide It is included in the “self-assembling peptide” in the present invention.
  • the method of modifying (or labeling) the self-assembling peptide used in the present invention can be arbitrarily selected by those skilled in the art. For example, addition of a functional group or the like, addition of a chemical substance, or further protein or peptide It may be an addition.
  • Examples of the addition of the functional group include acylation, acetylation, alkylation, amidation, biotinylation, formylation, carboxylation, glutamylation, glycosylation (glycosylation), glycylation, hydroxylation, Examples include isoprenylation, lipoylation, addition of nucleotides or derivatives thereof, polyethylene glycol (PEG) formation, and addition of lipid chains.
  • Examples of addition of chemical substances include appropriate labeling agents such as radioisotopes (eg, 125 I, 131 I, 3 H, 14 C, etc.), enzymes (eg, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, Alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase, etc.), fluorescent substances (eg, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate, etc.), luminescent substances (eg, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin, etc.), affinity tags (eg, : Biotin and the like).
  • labeling agents such as radioisotopes (eg, 125 I, 131 I, 3 H, 14 C, etc.), enzymes (eg, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, Alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase, etc.
  • the concentration of the self-assembling peptide in the composition of the present invention is at least about 0.5%, at least about 1%, at least about 1.5%, at least about 2%, at least about 2.5% by weight. At least about 3%, at least about 3.5%, at least about 4%, at least about 4.5%, at least about 5%, at least about 5.5%, at least about 6%, at least It may be about 6.5%, at least about 7%, at least about 7.5%, at least about 8% by weight.
  • the concentration of self-assembling peptides in the composition of the present invention may be at least about 1.5% by weight.
  • composition of the present invention may further comprise one or more biologically active substances (eg, substances useful for hemostasis) as long as they do not substantially affect the self-assembling ability of the self-assembling peptides in the composition. , Substances useful for promoting wound healing). Examples of such substances include synthetic or natural organic molecules, nucleic acid molecules, various cytokines, various chemokines and the like. Growth factors may also be included in the compositions of the present invention alone or in combination with other biologically active substances.
  • biologically active substances eg, substances useful for hemostasis
  • substances useful for promoting wound healing include synthetic or natural organic molecules, nucleic acid molecules, various cytokines, various chemokines and the like.
  • Growth factors may also be included in the compositions of the present invention alone or in combination with other biologically active substances.
  • growth factors include epidermal growth factor, nerve growth factor, transforming growth factor-alpha and beta, platelet-derived growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor, hematopoietic cell growth factor, heparin-binding growth factor, acidic fiber
  • growth factors include epidermal growth factor, nerve growth factor, transforming growth factor-alpha and beta, platelet-derived growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor, hematopoietic cell growth factor, heparin-binding growth factor, acidic fiber
  • growth factors include, but are not limited to, blast growth factor, basic fibroblast growth factor, hepatocyte growth factor, brain-induced neurotrophic factor, keratinocyte growth factor, bone morphogenetic protein, and cartilage-derived growth factor.
  • first, second, etc. may be used to represent various elements, but these elements should not be limited by those terms. These terms are only used to distinguish one element from another, for example, the first element is referred to as the second element, and similarly, the second element is the first element. Can be made without departing from the scope of the present invention.
  • ⁇ Raising conditions> (1) Breeding environment Each test animal is individually kept in a stainless steel cage (W: 690 x D: 960 x H: 740 mm) in a breeding room where temperature and humidity are set. The temperature was controlled by an air conditioner set at 25 ⁇ 3 ° C. and humidity at 60 ⁇ 10%. The light and dark periods were 12 hours each (light period: 7:00 to 19:00). In addition, cages, feeders and breeding rooms were cleaned and disinfected daily.
  • Feed type, feed amount and feed method The feed used was “Bleed 74” (JA East Nippon Kumiai Feed Co., Ltd.), and 250 g was given twice a day in the morning and afternoon. However, on the day of the experiment, feeding was not performed to avoid aspiration due to vomiting during anesthesia.
  • ⁇ Individual identification and test group configuration Individual identification of animals was performed using ear tag numbers. The test number and test period were labeled at the entrance of the breeding room, and the test number, test group, and animal number were displayed on the cage.
  • ⁇ Pretreatment and anesthetic administration methods Atropine sulfate 0.05 mg / kg (administration volume: 0.1 mL / kg) was administered intramuscularly. About 30 minutes later, ketamine hydrochloride 20 mg / kg (dose volume: 0.4 mL / kg) and xylazine hydrochloride 4 mg / kg (dose volume: 0.2 mL / kg) were mixed and administered intramuscularly. Using disposable syringes (Terumo Corp.) each equipped with an 18G injection needle (Terumo Corp.), anesthesia was introduced by intramuscular administration.
  • the tracheal tube (Top Endotracheal Tube Co., Ltd.) was intubated and maintained with isoflurane using an inhalation anesthesia machine SUBARRU-KJ02 (Mikasa Kanto Shokai Co., Ltd.) and ventilator (Composite ⁇ -EV Metran Co., Ltd.) Anesthesia was performed.
  • the concentration of isoflurane during the operation was 1 to 3%, and the oxygen amount was 2 L / min.
  • the intrapulmonary pressure of the ventilator was set to 15 cmH 2 O, and the respiratory rate was set to 15 times / minute. It was held in a supine position on the operating table and covered with sterile drape.
  • ⁇ Intraoperative monitoring> An electrocardiogram, a pulse oximeter, and a thermometer were installed, and intraoperative monitoring was performed. The blood pressure was measured noninvasively by installing a blood pressure measurement cuff. The blood pressure was maintained at an average blood pressure of 60 mmHg or higher.
  • Test substance The following table shows the peptide solution (test substance) used in this experiment and its storage modulus.
  • Peptide No. 1 RADARADARADARADA (SEQ ID NO: 1)
  • Peptide No. 2 IEIKIEIKIEIKI (SEQ ID NO: 2)
  • Peptide No. 3 RLDLRLALRLLDLR (SEQ ID NO: 3)
  • the raw powder is synthesized by CPC Scientific, Inc. All peptides are acetylated at the N-terminus and amidated at the C-terminus.
  • purified water from the Japanese Pharmacopoeia was used as the peptide solvent.
  • a frequency sweep test (Frequency sweep tests) was performed from 1 rad / sec to 10 rad / sec at a shear stress of 1 Pa, and the storage elastic modulus at 10 rad / sec was selected as data.
  • the peptide solution was placed between 20 mm plates with a gap distance of 500 ⁇ m, and the test was carried out with a soaking time of 2 min.
  • ⁇ Test method> 1 The anesthetized pig was laparotomized through a midline abdominal incision using a scalpel and an electric scalpel to expose the liver. 2. The liver was abraded with a file to create exudative bleeding. 3. The test substance was applied to the bleeding slope by normal application (* 1) or spray application (* 2). 4). The time from the end of application to the end of hemostasis determination was measured with a stopwatch (* 3). The amount used until the end of the test was recorded for each test substance.
  • * 1 Applied to the subject by filling the syringe with the peptide solution (test substance) and extruding the peptide solution from the nozzle at the tip of the syringe (see the syringe in Fig. 1)
  • * 2 A syringe filled with peptide solution (test substance) (equivalent to that shown in Fig. 1) is set in a spray gun, and compressed air is blown from the nozzle at the tip of the syringe using a compressor.
  • the peptide solution was sprayed onto the subject.
  • the spray pressure was approximately 0.5 to 1.5 [kgf / cm 2] although it depends on the viscosity of each test substance, the bleeding status, and the distance to the application site.
  • FIG. 2 to FIG. 5 show how the peptide solution was applied to the bleeding site of the liver in the above test. As can be seen in the figure, with normal administration, the peptide solution spreads unevenly over the bleeding site, whereas with spray application, the peptide solution spreads more uniformly over the bleeding site.
  • the peptide solution containing 1 was significantly significant at a concentration of 1.0%, although the spray application group tended to have a shorter hemostasis completion time and the solution application amount until hemostasis was lower than the normal application group. There was no significant difference. On the other hand, at a concentration of 1.5% or more, the spray application group clearly had a shorter hemostasis completion time than the normal application group, and the amount of solution applied until hemostasis was small.
  • Peptide No. Peptide No. 2 is also used for peptide solutions containing 2. As with the peptide solution containing 1, no significant difference was observed between the spray application group and the normal application group at the concentration of 1.0%, but at the concentration of 1.5%, the spray application group was better. The hemostasis completion time was clearly shorter than in the normal application group, and the amount of solution applied until hemostasis was small.

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Abstract

【課題】　出血部位に均一に適用することができ、高い止血効果を奏する止血用の組成物を提供する、　【解決手段】　スプレー剤として対象に適用される組成物であって、前記スプレー剤は、止血用であり、前記組成物は、自己集合性ペプチドを含み、前記自己集合性ペプチドは、前記組成物が前記対象の出血部位に適用された際に、自己集合することによりゲル化するものであり、前記自己集合性ペプチドは、直接塗布される場合と比べ向上した止血能を有する濃度において、前記組成物に含まれることを特徴とする、組成物を提供する。

Description

止血用組成物、および、止血用組成物を用いた止血方法
　本発明は、自己集合性ペプチドを含む止血用スプレー剤に関する。
　フィブリン糊などのバイオゲルは、術中／術後の止血剤や創傷治癒シート等の外科用基材、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）などに利用されている。
　しかし、これらの多くは生物由来材料を用いたものであることから、使用の際には、ウイルス等の微生物の感染、免疫原性、疾患の伝搬等のリスクが存在する。例えば、フィブリン糊は手術時の止血剤として利用価値が高いが、原料がヒト血液由来であるため、実際に手術時に使用した際に、患者がフィブリン糊に混入していた肝炎ウイルスに感染する事故が多発し、大きな社会問題となっている。そこで、原料の化学合成による、微生物混入のリスクのない安全な止血剤の開発が求められている。
　例えば、これまで、精製された両親媒性の自己集合性ペプチドを含む組成物を、創傷治癒の促進等に利用することが提案されている（特許文献１）。
特表２００８－５０５９１９
　上記特許文献１に記載のような自己集合性ペプチド組成物は、創傷部位（あるいは手術部位）に適用されることにより、組織の再生を促進することができ、また、微生物混入リスクもないため、非常に有用な組成物である。
　本発明者らは、上記のような自己集合性ペプチドの応用研究に取り組んでいたところ、上記のような自己集合性ペプチドを止血用（例えば外科手術中に用いる止血剤としての使用）に用いる場合、出血部位へ適用する組成物中のペプチド濃度を高くすると、止血効果は向上するが、その一方で、適用する組成物の粘度も上昇するため、適用した組成物が出血部位で広がりにくくなり、適用部位で均一な止血効果を発揮させることが難しくなる（逆に言えば、出血部位へ適用する組成物中のペプチド濃度を低くする、適用した組成物が出血部位で広がりやすくなるが、高い止血効果が得られない）、という技術的なジレンマが存在することに気付いた。
　本発明者は、上記の技術的ジレンマを解消する方法を鋭意検討したところ、驚くべきことに、自己集合性ペプチドを含む組成物を“スプレー剤”として用いることにより、自己集合性ペプチドを含む組成物を出血部位に均一に適用することでき、従来の方法で塗布した場合と比較して、高い止血効果を得られることを見出し、本発明を完成させるに到った。
　すなわち本発明は、一実施形態において、スプレー剤として対象に適用される組成物であって、前記スプレー剤は、止血用であり、前記組成物は、自己集合性ペプチドを含み、前記自己集合性ペプチドは、前記組成物が前記対象の出血部位に適用された際に、自己集合することによりゲル化するものであり、前記自己集合性ペプチドは、直接塗布される場合と比べ向上した止血能を有する濃度において、前記組成物に含まれることを特徴とする、組成物に関する。
　また、本発明は、一実施形態において、前記組成物中の前記自己集合性ペプチドの濃度が、少なくとも１．５重量％以上であることを特徴とする。
　また、本発明は、一実施形態において、前記自己集合性ペプチドが、
　（ａ）極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基が交互に配置された、４～３４個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むペプチド、または、
　（ｂ）７位の非極性アミノ酸残基を中心として、Ｎ末端方向およびＣ末端方向に、非極性アミノ酸と極性アミノ酸とが交互に、且つ、対称の位置に配置される、１３個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むペプチド、であることを特徴とする。
　また、本発明は、一実施形態において、前記極性アミノ酸残基が、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、アルギニン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、チロシン残基、セリン残基、トレオニン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、および、システイン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であることを特徴とする。
　また、本発明は、一実施形態において、前記非極性アミノ酸残基が、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、プロリン残基、および、グリシン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であることを特徴とする。
　また、本発明は、一実施形態において、前記極性アミノ酸残基が、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、アルギニン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、チロシン残基、セリン残基、トレオニン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、および、システイン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、かつ、前記非極性アミノ酸残基が、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、プロリン残基、および、グリシン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であることを特徴とする。
　また、本発明は、一実施形態において、前記自己集合性ペプチドが、RADARADARADARADA（配列番号１）を含むペプチド、IEIKIEIKIEIKI（配列番号２）を含むペプチド、または、RLDLRLALRLDLR（配列番号３）を含むペプチドであることを特徴とする。
　また、本発明は、一実施形態において、前記自己集合性ペプチドが、RADARADARADARADA（配列番号１）からなるペプチド、IEIKIEIKIEIKI（配列番号２）からなるペプチド、または、RLDLRLALRLDLR（配列番号３）からなるペプチドであることを特徴とする。
　また、本発明は、一実施形態において、前記対象の出血部位が、非外科的に形成された創傷部位、または、外科的に形成された切開部位または切除部位であることを特徴とする。
　本発明の他の実施形態は、止血用スプレー剤の製造のための、上記のいずれかの組成物の使用に関する。
　本発明の他の実施形態は、上記のいずれかに記載の組成物を含むスプレー剤に関する。
　本発明の他の実施態様は、対象における止血方法であって、対象の出血部位に、自己集合性ペプチドを含む組成物を噴霧することにより適用する工程を含み、前記自己集合性ペプチドは、前記組成物が前記対象の出血部位に適用された際に、自己集合することによりゲル化するものであり、前記自己集合性ペプチドは、直接塗布される場合と比べ向上した止血能を有する濃度において、前記組成物に含まれることを特徴とする、方法に関する。
　また、本発明は、一実施態様において、前記対象がヒト以外の動物であることを特徴とする。
　なお、上記に挙げた本発明の一または複数の特徴を任意に組み合わせた発明も、本発明の範囲に含まれる。
図１は、本発明の実施例において用いた、ペプチド溶液が充填されたシリンジである。 図２は、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｏ．１（１．０％または１．５％）を、通常塗布またはスプレー塗布にてブタ肝臓の出血部位へ適用した後の写真である。 図３は、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｏ．１（２．０％または２．５％）を、通常塗布またはスプレー塗布にてブタ肝臓の出血部位へ適用した後の写真である。 図４は、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｏ．２（１．０％または１．５％）を、通常塗布またはスプレー塗布にてブタ肝臓の出血部位へ適用した後の写真である。 図５は、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｏ．３（１．５％）を、通常塗布またはスプレー塗布にてブタ肝臓の出血部位へ適用した後の写真である。 図６は、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｏ．１（１．０％、１．５％、２．０％、または２．５％）を通常塗布またはスプレー塗布にてブタ肝臓の出血部位へ適用した場合の、止血完了時間と止血完了までの組成物の適用量を測定した結果を示す。 図７は、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｏ．２（１．０％または１．５％）を通常塗布またはスプレー塗布にてブタ肝臓の出血部位へ適用した場合の、止血完了までの組成物の適用量を測定した結果を示す。 図８は、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｏ．２（１．０％または１．５％）を通常塗布またはスプレー塗布にてブタ肝臓の出血部位へ適用した場合の、止血完了時間を測定した結果を示す。 図９は、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｏ．３（１．５％）を通常塗布またはスプレー塗布にてブタ肝臓の出血部位へ適用した場合の、止血完了時間と止血完了までの組成物の適用量を測定した結果を示す。
　本発明は、スプレー剤として対象に適用される組成物に関する。本発明において、「スプレー剤」とは、適用対象に対してスプレー形態で適用される剤を意味する。本発明において、組成物をスプレー形態で適用するための方法、器具または装置は限定されず、当業者が適宜選択することができる。例えば、圧縮した空気や高圧ガスを用いて、液状の組成物を霧状、泡状などの状態で噴霧することにより、スプレー形態で適用することができる。より具体的には、例えば、缶内の高圧ガスを利用した缶スプレー、電動ポンプなどによる電動スプレー、外部の空気圧を利用したエアスプレー（例えば、スプレーガン、エアブラシ等）を利用して、スプレー形態で適用することができる。
　また、本発明は、止血用の剤に関する。本発明において、「止血用」の剤とは、生体からの出血を止めるために用いる剤を広く意味し、出血を完全に停止させる剤だけでなく、出血を軽減させる剤をも含む。
　本発明による止血の対象となる出血部位はどのようなものであってもよく、例えば、本発明を、非外科的に形成された創傷部位、または、外科的に形成された切開部位または切除部位の止血に利用することできる。非外科的に形成された創傷部位の例としては、事故等による体表組織（例えば、皮膚）または体内組織（例えば、臓器、筋肉、骨）の創傷部位を挙げることができる。また、外科的に形成された切開部位または切除部位の例としては、外科的処置において、メス等で切開または切除した体表組織の部位または体内組織の部位、手術器具によって剥離、吻合、縫合等を行った体表組織の部位または体内組織の部位を挙げることができる。また、本発明は噴霧により対象に適用するものであるため、一操作で、広範囲へ均一に組成物を適用可能である点において、従来品よりも適用操作が容易であり、例えば、緻密な操作が求められる内視鏡手術において生じた出血部位にも好適に用いることができる。
　本発明の適用対象は、ヒトまたは非ヒトであってよい。前記非ヒト対象は、例えば非ヒト動物であってよく、例えば非ヒト哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、または魚類であってよい。前記非ヒト哺乳類の例としては、齧歯類（例えばマウス、ラット）、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、霊長類等が挙げられる。
　本発明の組成物は、自己集合性ペプチドを含む。本明細書において、ペプチドが溶液中で「自己集合する」とは、溶液中においてペプチド同士が、何らかの相互作用（例えば、静電的相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用等）を介して、自発的に集合することを意味し、限定的な意味で解釈されてはならない。本発明において、自己集合性ペプチドとは、そのアミノ酸配列により、多数のペプチド分子が規則正しく並んだ自己集合体を形成する特性を有するペプチドを意味する。そして、その性質により、自己集合性ペプチドを含む組成物が対象の出血部位に適用されると、自己集合性ペプチドが自己集合することにより、適用された部位にゲルを形成する。
　なお、本発明に用いられる自己集合性ペプチドは、対象への適用前の水溶液（すなわち、自己集合ペプチドが自己集合する前のペプチド水溶液）自体が一定の粘性を有する場合がある。しかし、本明細書においては、説明の便宜のため、対象への適用前のペプチド水溶液が一定の粘性を有する場合であっても、「ペプチド溶液（またはペプチド水溶液）」と呼ぶことがある。また、対象への適用前のペプチド水溶液が一定の粘性を有する場合であっても、当該水溶液の対象への適用後に自己集合性ペプチドの自己集合が起こり、組成物の粘性がさらに上昇することを「ゲル化（あるいはゲル形成）」と呼ぶことがある。
　本発明に用いられる自己集合性ペプチドは、例えば、極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基が交互に配置された、４～３４個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むペプチド、または、７位の非極性アミノ酸残基を中心として、Ｎ末端方向およびＣ末端方向に、非極性アミノ酸と極性アミノ酸とが交互に、且つ、対称の位置に配置される、１３個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むペプチド、であってよい。
　本発明に用いられる自己集合性ペプチドは、上記のようなペプチド構造を含むことにより、水溶液中においてβシート構造を形成した際に、βシート構造の一方の面には極性アミノ酸残基のみが配置され得、他方の面に非極性アミノ酸残基のみが配置されうる。したがって、かかるβシート構造は、疎水面（非極性アミノ酸残基のみが配置された面）を隠すように集合して二層構造を形成しうる。そして、分子の自己集合が進むにつれてこのβシートの層構造が伸長してゆき、三次元の立体構造（例えば、ヒドロゲル）を形成しうる。なお、本発明に用いられる「自己集合性ペプチド」は、場合により「自己組織化ペプチド」と呼ばれることもある。
　本発明に用いられる自己集合性ペプチドは、「極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基とが交互に配置されたアミノ酸配列」を含むことあるが、その場合、当該アミノ酸配列は、４～３４個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であってよく、より好ましくは８～３０個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であってよく、さらに好ましくは１２～２６個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であってよく、最も好ましくは１３～２０個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であってよい。
　本発明において、「アミノ酸」とは、その最も広い意味で用いられ、タンパク質構成アミノ酸のみならずアミノ酸変異体および誘導体といったようなタンパク質非構成アミノ酸を含む。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本発明におけるアミノ酸として、例えば、タンパク質構成Ｌ－アミノ酸；Ｄ－アミノ酸；アミノ酸変異体および誘導体などの化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β－アラニン、オルニチンなどのタンパク質非構成アミノ酸；およびアミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられることを理解するであろう。タンパク質非構成アミノ酸の例として、α－メチルアミノ酸（α－メチルアラニンなど）、Ｄ－アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（２－アミノ－ヒスチジン、β－ヒドロキシ－ヒスチジン、ホモヒスチジン、α－フルオロメチル－ヒスチジンおよびα－メチル－ヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）および側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられる。本発明の好ましい態様において、本発明において用いられるアミノ酸は、タンパク質構成アミノ酸であってよい。
　本発明において、極性アミノ酸残基は、側鎖が極性を有しうるアミノ酸残基であれば特に限定されないが、例えば、酸性アミノ酸残基と塩基性アミノ酸残基が含まれる。本明細書において、酸性アミノ酸残基は、例えば、アスパラギン酸（Ａｓｐ：Ｄ）残基、および、グルタミン酸（Ｇｌｕ：Ｅ）などを含み、塩基性アミノ酸とは、例えば、アルギニン（Ａｒｇ：Ｒ）、リジン（Ｌｙｓ：Ｋ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ：Ｈ）などを含む。
　なお、本明細書中において、例えば「アスパラギン酸（Ａｓｐ：Ｄ）」などの表記は、アスパラギン酸の略号として、三文字表記で「Ａｓｐ」、一文字表記で「Ｄ」を用いることがあることを意味する。
　また、本明細書において、中性アミノ酸残基のうち、水酸基、酸アミド基、チオール基等を含むアミノ酸残基は、極性を有するものとして、極性アミノ酸残基に含まれるものとする。例えば、本明細書において、チロシン（Ｔｙｒ：Ｙ）、セリン（Ｓｅｒ：Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ：Ｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ：Ｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ：Ｑ）、システイン（Ｃｙｓ：Ｃ）は極性アミノ酸残基に含まれる。
　本明細書において、非極性アミノ酸残基は、側鎖が極性を有しないアミノ酸であれば特に限定されないが、例えば、アラニン（Ａｌａ：Ａ）、バリン（Ｖａｌ：Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ：Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ：Ｉ）、メチオニン（Ｍｅｔ：Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ：Ｆ）、トリプトファン（Ｔｒｐ：Ｗ）、グリシン（Ｇｌｙ：Ｇ）、プロリン（Ｐｒｏ：Ｐ）などを含む。
　本発明に用いられる自己集合性ペプチドが「極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基とが交互に配置されたアミノ酸配列」を含む場合、当該ペプチドは、「ＲＡＤＡ」の繰り返し配列（繰り返しが２～８回、好ましくは繰り返しが３～６回）、または、「ＩＥＩＫ」の繰り返し配列（繰り返しが１～４回、好ましくは繰り返しが２～３回）であってよく、より好ましくは、ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ（配列番号１）を含むペプチド、または、ＩＥＩＫＩＥＩＫＩＥＩＫＩ（配列番号２）を含むペプチドであってよい。さらに好ましくは、本発明に用いられる自己集合性ペプチドは、ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ（配列番号１）からなるペプチド、または、ＩＥＩＫＩＥＩＫＩＥＩＫＩ（配列番号２）からなるペプチドであってよい。
　また、本発明に用いられる自己集合性ペプチドが「７位の非極性アミノ酸残基を中心として、Ｎ末端方向およびＣ末端方向に、非極性アミノ酸と極性アミノ酸とが交互に、且つ、対称の位置に配置される、１３個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むペプチド」である場合、好ましくは、当該ペプチドの前記「７位の非極性アミノ酸残基」はアラニン（Ａｌａ：Ａ）であってよい。より好ましくは、当該ペプチドは、ＲＬＤＬＲＬＡＬＲＬＤＬＲ（配列番号３）を含むペプチドであってよく、さらに好ましくは、ＲＬＤＬＲＬＡＬＲＬＤＬＲ（配列番号３）からなるペプチドであってよい。
　また、本発明に用いられ得る他の自己集合性ペプチドの例示として、ＷＯ２００６／０１４５７０に開示されたペプチドを挙げることができる。
　本発明に用いられる自己集合性ペプチドは、本発明が意図するペプチドの主な性質を失わない限りにおいて、修飾（または標識）されていてもよく、そのような修飾（または標識）されたペプチドも本発明における「自己集合性ペプチド」に含まれる。本発明に用いられる自己集合性ペプチドの修飾（または標識）方法は、当業者が任意に選択することができるが、例えば、官能基等の付加、化学物質の付加、または、さらなるタンパク質またはペプチドの付加であってよい。前記官能基等の付加の例示としては、アシル化、アセチル化、アルキル化、アミド化、ビオチニル化、ホルミル化、カルボキシル化、グルタミル化、グリコシル化（糖鎖の付加）、グリシル化、ヒドロキシル化、イソプレニル化、リポイル化、ヌクレオチドまたはその誘導体の付加、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化、脂質鎖の付加を挙げることができる。また、化学物質の付加の例示としては、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素（例：１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ等）、酵素（例：β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等）、アフィニティタグ（例：ビオチン等）などの付加を挙げることができる。また、さらなるタンパク質またはペプチドの付加の例示としては、ＩＳＧ化、ＳＵＭＯ化、ユビキチン化を挙げることができる。
　本発明の組成物中の自己集合性ペプチドの濃度は、少なくとも約０．５重量％、少なくとも約１重量％、少なくとも約１．５重量％、少なくとも約２重量％、少なくとも約２．５重量％、少なくとも約３重量％、少なくとも約３．５重量％、少なくとも約４重量％、少なくとも約４．５重量％、少なくとも約５重量％、少なくとも約５．５重量％、少なくとも約６重量％、少なくとも約６．５重量％、少なくとも約７重量％、少なくとも約７．５重量％、少なくとも約８重量％であってよい。好ましくは、本発明の組成物中の自己集合性ペプチドの濃度は、少なくとも約１．５重量％であってよい。
　本発明の組成物は、組成物中の自己集合性ペプチドの自己集合能に実質的な影響を与えない限りにおいて、更に１つ以上の生物学的に活性な物質（例えば、止血に有用な物質、創傷治癒の促進に有用な物質）を含んでよい。このような物質の例として、合成または天然の有機分子、核酸分子、各種サイトカイン、各種ケモカイン等が挙げられる。成長因子もまた単独または他の生物学的に活性な物質と組み合わせて、本発明の組成物に含まれてよい。成長因子の例として、表皮成長因子、神経成長因子、トランスフォーミング増殖因子－アルファおよびベータ、血小板誘導成長因子、インスリン様成長因子、血管内皮成長因子、造血細胞成長因子、ヘパリン結合成長因子、酸性線維芽細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、肝細胞成長因子、脳誘導神経栄養因子、ケラチノサイト成長因子、骨形態発生タンパク質、および、軟骨誘導成長因子が挙げられるが、これらに限定されない。
　なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施形態を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
　また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
　異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
　第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられる場合があるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、しかしながら、本発明はいろいろな形態により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
＜試験目的＞
　ブタ肝臓を金やすりにて擦過することにより滲出性出血を作成した。その出血に対して自己組織化ペプチド溶液を通常適用又はスプレー適用し止血効果及び適用量について評価した。
＜試験実施基準＞
　Ｎｏｎ－ＧＬＰ試験として実施した。
＜動物愛護＞
　この試験は、「動物の愛護及び管理に関する法律（昭和４８年法律第１０５号）」、「実験動物の飼養及び保管並びに苦痛の軽減に関する基準（平成１８年環境省告示第８８号）」、農林水産省及び厚生労働省の「動物実験等の実施に関する基本指針」、及び「動物実験の適正な実施に向けたガイドライン（２００６年６月１日　日本学術会議）」に基づき、動物実験を科学的観点及び倫理的な配慮の下に実施すべき事項を定めた株式会社ＮＡＳ研究所における「動物実験に関する実施規則」に従い、動物実験委員会の承認を得て実施した。
＜供試動物＞
動物種：ブタ
品種：　ＬＷＤ
性別：♀
導入頭数：　２頭
導入時日齢：不問
導入時体重：　５０ｋｇ
導入先：株式会社ＮＡＳ研究所成田試験場
動物購入元：石毛畜産
馴化期間：導入後７日間程度実施した。
検疫：導入時及び馴化期間中の臨床観察により検疫し、異常のないことを確認した。
個体識別：耳標
＜飼育条件＞
（１）飼育環境
　供試動物は、温湿度設定がされた飼育室のステンレス製ケージ（Ｗ：６９０×Ｄ：９６０×Ｈ：７４０ｍｍ）で１頭ずつ単飼する。温度は２５±３℃、湿度は６０±１０％に設定した空調機で制御した。照明は、明暗期を各１２時間（明期：７：００～１９：００）とした。また、ケージ、給餌器の洗浄及び飼育室の清掃・消毒は毎日実施した。
（２）飼料の種類、給与量及び給与方法
飼料は、「ブリード７４」（ＪＡ東日本くみあい飼料（株））を使用し、１回２５０ｇを午前、午後の１日２回与えた。ただし、実験日当日は、麻酔時の嘔吐による誤嚥等を避けるため、給餌を行わなかった。
（３）飲水
給水は自動給水装置により、井水を自由摂取させた。なお、飲料水中の物質濃度及び細菌数を一年に一度分析し、分析値が水道法の水質基準に適合していることを確認した。
＜個体識別及び試験群の構成＞
　動物の個体識別は、耳標番号を用いて行った。飼育室入り口には試験番号及び試験期間を標識し、ケージには試験番号、試験群、動物番号を表示した。
＜前処置および麻酔薬投与方法＞
　アトロピン硫酸塩０．０５ｍｇ／ｋｇ（投与容量：０．１ｍＬ／ｋｇ）を筋肉内投与した。約３０分後に塩酸ケタミン２０ｍｇ／ｋｇ（投与容量：０．４ｍＬ／ｋｇ）と塩酸キシラジン４ｍｇ／ｋｇ（投与容量：０．２ｍＬ／ｋｇ）を混合して、筋肉内に投与した。各々１８Ｇ注射針（テルモ株式会社）を取り付けたディスポーザブル注射筒（テルモ株式会社）を用いて、耳根部筋肉内に投与し麻酔導入した。その後、気管チューブ（トップ気管内チューブ　株式会社トップ）を挿管して、吸入麻酔器　ＳＵＢＡＲＵ－ＫＪ０２（株式会社ミカサ関東商会）及び人工呼吸器（コンポースβ－ＥＶ　株式会社メトラン）を用い、イソフルランで維持麻酔を行った。術中のイソフルラン濃度は１～３％、酸素量は２Ｌ／分とした。人工呼吸器の肺内圧は１５ｃｍＨ２Ｏ、呼吸回数は１５回／分に設定した。手術台に仰臥位で保定し、滅菌ドレープで覆った。
＜術中モニタリング＞
　心電図、パルスオキシメータ―、体温計を設置し術中モニタリングを実施した。血圧測定は血圧測定用カフを設置し非観血的に血圧を測定した。血圧は平均血圧６０ｍｍＨｇ以上で維持した。
＜被験物質＞
　本実験に使用したペプチド溶液（被験物質）とその貯蔵弾性率を以下の表に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｏ．１：ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ　（配列番号１）
Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｏ．２：ＩＥＩＫＩＥＩＫＩＥＩＫＩ　（配列番号２）
Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｏ．３：ＲＬＤＬＲＬＡＬＲＬＤＬＲ　（配列番号３）
　上記のいずれのペプチドも、原末はＣＰＣ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　Ｉｎｃ社によって合成され、いずれのペプチドもＮ末端はアセチル化、Ｃ末端はアミド化されている。また、ペプチドの溶媒は日本薬局方の精製水を用いた。
　１Ｐａのせん断応力（ｓｈｅａｒ　ｓｔｒｅｓｓ）において、１ｒａｄ／ｓｅｃから１０ｒａｄ／ｓｅｃまで周波数スイープ試験（Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｓｗｅｅｐ　ｔｅｓｔｓ）を実施し、１０ｒａｄ／ｓｅｃにおける貯蔵弾性率をデータとして選択した。ゲル化前の粘度について、ペプチド溶液を５００ｕｍの間隙距離で２０ｍｍプレート間に設置し、２ｍｉｎの均熱時間（ｓｏａｋｉｎｇ　ｔｉｍｅ）で試験を実施した。
＜試験方法＞
１．麻酔が完了したブタをメス及び電気メスを用いて腹部正中切開にて開腹し肝臓を露出させた。
２．肝臓を金やすりにて擦過し滲出性の出血を作成した。
３．被験物質を通常適用（※１）又はスプレー適用（※２）にて出血斜面に適用した。
４．適用終了後から止血完了判定終了までの時間をストップウォッチにて測定した（※３）。各被験物質について、試験終了までの使用量を記録した。
※１：シリンジにペプチド溶液（被験物質）を充填し、シリンジ先端のノズルからペプチド溶液を押し出すことによって対象へ適用した（図１の注射筒を参照のこと）
※２：ペプチド溶液（被験物質）が充填されたシリンジ（図１と同等のもの）をスプレーガンにセットし、コンプレッサーを用いて、シリンジ先端のノズルへ圧縮空気を吹き付けることにより、ノズルから押し出されるペプチド溶液を対象へ噴霧した。噴霧圧は各被験物質の粘性や出血状況、適用部位までの距離にもよるが概ね０．５～１．５［ｋｇｆ／ｃｍ２］であった。
※３：初回塗布後に出血が弱まらなかった場合（このまま放置しても止血されないと判断した場合）に適宜追加塗布を行った。初回塗布完了時を測定開始とし、止血判定完了時を測定終了とした。
＜結果＞
　上記の試験において、ペプチド溶液を肝臓の出血部位に適用した様子を、図２～図５に示した。図に見られるように、通常投与では、ペプチド溶液が出血部位上に不均一に広がっているのに対し、スプレー適用では、ペプチド溶液が出血部位上により均一に広がっている。
　図６に示すとおり、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｏ．１を含むペプチド溶液は、１．０％の濃度では、スプレー適用群のほうが通常適用群よりも、止血完了時間が短い傾向、および、止血までの溶液適用量が少ない傾向があったものの、有意な差は見られなかった。一方、１．５％以上の濃度では、スプレー適用群のほうが通常適用群よりも、明確に止血完了時間が短く、止血までの溶液適用量が少なかった。
　図７および図８に示すとおり、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｏ．２を含むペプチド溶液についても、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｏ．１を含むペプチド溶液の結果と同様、１．０％の濃度ではスプレー適用群と通常適用群において有意な結果の差は認められなかったが、１．５％の濃度では、スプレー適用群のほうが通常適用群よりも、明確に止血完了時間が短く、止血までの溶液適用量が少なかった。
　図９に示すとおり、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｏ．３を含むペプチド溶液においても、スプレー適用群では止血に成功したが、通常適用では止血不能であった。
　すなわち、自己集合性ペプチドを含む溶液をスプレー剤として用いることにより、驚くべきことに、通常投与の場合と比較して、向上された止血能を発揮することが示された。
 

 

Claims (15)

  1. 　スプレー剤として対象に適用される組成物であって、
    　前記スプレー剤は、止血用であり、
    　前記組成物は、自己集合性ペプチドを含み、
    　前記自己集合性ペプチドは、前記組成物が前記対象の出血部位に適用された際に、自己集合することによりゲル化するものであり、
    　前記自己集合性ペプチドは、直接塗布される場合と比べ向上した止血能を有する濃度において、前記組成物に含まれる、
    ことを特徴とする、
    組成物。
  2. 　請求項１に記載の組成物であって、
    　前記組成物中の前記自己集合性ペプチドの濃度が、少なくとも１．５重量％以上であることを特徴とする、
    組成物。
  3. 　請求項１または２に記載の組成物であって、
    　前記自己集合性ペプチドは、
    　（ａ）極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基が交互に配置された、４～３４個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むペプチド、または、
    　（ｂ）７位の非極性アミノ酸残基を中心として、Ｎ末端方向およびＣ末端方向に、非極性アミノ酸と極性アミノ酸とが交互に、且つ、対称の位置に配置される、１３個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むペプチド、であることを特徴とする、
    組成物。
  4. 　請求項３に記載の組成物であって、
    　前記極性アミノ酸残基が、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、アルギニン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、チロシン残基、セリン残基、トレオニン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、および、システイン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であることを特徴とする、
    組成物。
  5. 　請求項３に記載の組成物であって、
    　前記非極性アミノ酸残基が、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、プロリン残基、および、グリシン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であることを特徴とする、
    組成物。
  6. 　請求項３に記載の組成物であって、
    　前記極性アミノ酸残基が、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、アルギニン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、チロシン残基、セリン残基、トレオニン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、および、システイン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、かつ、
    　前記非極性アミノ酸残基が、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、プロリン残基、および、グリシン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であることを特徴とする、
    組成物。
  7. 　請求項６に記載の組成物であって、
    　前記自己集合性ペプチドが、RADARADARADARADA（配列番号１）を含むペプチド、IEIKIEIKIEIKI（配列番号２）を含むペプチド、または、RLDLRLALRLDLR（配列番号３）を含むペプチドであることを特徴とする、
    組成物。
  8. 　請求項７に記載の組成物であって、
    　前記自己集合性ペプチドが、RADARADARADARADA（配列番号１）からなるペプチド、IEIKIEIKIEIKI（配列番号２）からなるペプチド、または、RLDLRLALRLDLR（配列番号３）からなるペプチドであることを特徴とする、
    組成物。
  9. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の組成物であって、
    　前記対象の出血部位が、非外科的に形成された創傷部位、または、外科的に形成された切開部位または切除部位であることを特徴とする、
    組成物。
  10. 　止血用スプレー剤の製造のための、請求項１～９のいずれか１項に記載の組成物の使用。
  11. 　請求項１～９のいずれか１項に記載の組成物を含むスプレー剤。
  12. 　対象における止血方法であって、
    　対象の出血部位に、自己集合性ペプチドを含む組成物を噴霧することにより適用する工程を含み、
    　前記自己集合性ペプチドは、前記組成物が前記対象の出血部位に適用された際に、自己集合することによりゲル化するものであり、
    　前記自己集合性ペプチドは、直接塗布される場合と比べ向上した止血能を有する濃度において、前記組成物に含まれる、
    ことを特徴とする、
    方法。
  13. 　請求項１２に記載の組成物であって、
    　前記組成物中の前記自己集合性ペプチドの濃度が、少なくとも１．５重量％以上であることを特徴とする、
    方法。
  14. 　請求項１２または１３に記載の方法であって、
    　前記対象の出血部位が、非外科的に形成された創傷部位、または、外科的に形成された切開部位または切除部位であることを特徴とする
    方法。
  15. 　請求項１２～１４のいずれか１項に記載の方法であって、
    　前記対象がヒト以外の動物であることを特徴とする、
    方法。

     
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