CN108697755A - 止血组合物和使用止血组合物的止血方法 - Google Patents

Abstract

提供可均一地施用于出血部位并发挥高止血作用的用于止血的组合物。提供了待作为喷雾剂施用于对象的组合物，其中所述组合物的特征在于所述喷雾剂用于止血，并且所述组合物包含自组装肽，当所述组合物施用于所述对象的出血部位时，所述自组装肽由于自组装而凝胶化，并且所述自组装肽以与直接施用相比具有改善的止血能力的浓度包含在所述组合物中。

Description

止血组合物和使用止血组合物的止血方法

技术领域

本发明涉及包含自组装肽的用于止血的喷雾剂。

背景技术

生物凝胶(例如纤维蛋白胶)用于围手术期或术后止血剂、外科用基材(例如伤口愈合片)、药物递送系统(DDS)等。

然而，这些生物凝胶中的大部分采用生物来源的材料，并因此在使用时具有微生物(例如病毒)感染、免疫原性、疾病传播等风险。例如，尽管纤维蛋白胶作为围手术期止血剂非常有用，但由于其原材料来源于人血液，在手术中实际使用时由纤维蛋白胶中的肝炎病毒污染物造成患者感染的频繁事故使得其成为重大的社会问题。因此，需要开发安全的止血剂，其没有因其原料的化学合成而受到微生物污染的风险。

例如，迄今为止已经提出了包含纯化的两亲性自组装肽的组合物在促进伤口愈合等中的用途(专利文献1)。

引文列表

专利文献

专利文献1：国际专利申请No.2008-505919的国家公布

发明内容

技术问题

如专利文献1中所述的自组装肽组合物是非常有用的组合物，因为该组合物可通过施用于伤口部位(或手术部位)而促进组织再生，并且没有微生物污染的风险。

本发明人已经对如上所述的自组装肽进行了应用研究，且结果发现，在使用如上所述的自组装肽用于止血(例如，对于用于外科手术的止血剂)的情况下，具有技术难题，即待施用于出血部位的组合物中较高浓度的肽改善了止血作用，但提高了待施用组合物的黏度，使得所施用组合物难以在出血部位散布并因此难以在施用部位发挥均一的止血作用(换句话说，待施用于出血部位的组合物中较低浓度的肽有助于所施用组合物在出血部位的散布，但不产生高止血作用)。

本发明人对用于克服上述技术难题的方法进行了坚持不懈的研究，且结果通过出人意料地发现以下而完成了本发明：与当通过常规方法施用时相比，通过作为“喷雾剂”使用包含自组装肽的组合物，包含自组装肽的组合物可均一地施用于出血部位并产生高止血作用。

问题的解决方案

具体而言，在一个实施方案中，本发明涉及待作为喷雾剂施用于对象的组合物，所述喷雾剂用于止血，并且所述组合物包含自组装肽，其中当所述组合物施用于所述对象的出血部位时，所述自组装肽自组装并因此凝胶化，并且所述自组装肽以这样的浓度包含在所述组合物中：与直接施用时相比，所述组合物具有改善的止血能力。

在本发明的一个实施方案中，所述组合物中所述自组装肽的浓度为按重量计至少1.5％或更高。

在本发明的一个实施方案中，所述自组装肽是

(a)包含由4至34个氨基酸残基组成的氨基酸序列的肽，其中极性氨基酸残基和非极性氨基酸残基交替排列，或

(b)包含由13个氨基酸残基组成的氨基酸序列的肽，其中非极性氨基酸和极性氨基酸在以第7位的非极性氨基酸残基为中心朝向N端和C端的方向上呈对称位置交替地排列。

在本发明的一个实施方案中，所述极性氨基酸残基是选自以下的氨基酸残基：天冬氨酸残基、谷氨酸残基、精氨酸残基、赖氨酸残基、组氨酸残基、酪氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基和半胱氨酸残基。

在本发明的一个实施方案中，所述非极性氨基酸残基是选自以下的氨基酸残基：丙氨酸残基、缬氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基、甲硫氨酸残基、苯丙氨酸残基、色氨酸残基、脯氨酸残基和甘氨酸残基。

在本发明的一个实施方案中，所述极性氨基酸残基是选自以下的氨基酸残基：天冬氨酸残基、谷氨酸残基、精氨酸残基、赖氨酸残基、组氨酸残基、酪氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基和半胱氨酸残基，并且所述非极性氨基酸残基是选自以下的氨基酸残基：丙氨酸残基、缬氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基、甲硫氨酸残基、苯丙氨酸残基、色氨酸残基、脯氨酸残基和甘氨酸残基。

在本发明的一个实施方案中，所述自组装肽是包含RADARADARADARADA(SEQ IDNO：1)的肽、包含IEIKIEIKIEIKI(SEQ ID NO：2)的肽或包含RLDLRLALRLDLR(SEQ ID NO：3)的肽。

在本发明的一个实施方案中，所述自组装肽是由RADARADARADARADA(SEQ ID NO：1)组成的肽、由IEIKIEIKIEIKI(SEQ ID NO：2)组成的肽或由RLDLRLALRLDLR(SEQ ID NO：3)组成的肽。

在本发明的一个实施方案中，所述对象的所述出血部位是非手术形成的伤口部位或者手术形成的切口部位或切除部位。

在一个替选的实施方案中，本发明涉及上述任何组合物用于制备用于止血的喷雾剂的用途。

在一个替选的实施方案中，本发明涉及包含上述任何组合物的喷雾剂。

在一个替选的实施方案中，本发明涉及用于在对象中止血的方法，其包括以下步骤：通过喷雾将包含自组装肽的组合物施用于所述对象的出血部位，其中当所述组合物施用于所述对象的所述出血部位时，所述自组装肽自组装并因此凝胶化，并且所述自组装肽以这样的浓度包含在所述组合物中：与直接施用时相比，所述组合物具有改善的止血能力。

在本发明的一个实施方案中，所述对象是非人动物。

本发明的一个或多个上述特征的任意组合也包括在本发明的范围内。

附图说明

图1示出了本发明实施例中使用的装有肽溶液的注射器。

图2示出了在通过常规施用或喷雾施用将肽No.1(1.0％或1.5％)施用于猪肝的出血部位之后拍摄的照片。

图3示出了在通过常规施用或喷雾施用将肽No.1(2.0％或2.5％)施用于猪肝的出血部位之后拍摄的照片。

图4示出了在通过常规施用或喷雾施用将肽No.2(1.0％或1.5％)施用于猪肝的出血部位之后拍摄的照片。

图5示出了在通过常规施用或喷雾施用将肽No.3(1.5％)施用于猪肝的出血部位之后拍摄的照片。

图6示出了当通过常规施用或喷雾施用将肽No.1(1.0％、1.5％、2.0％或2.5％)施用于猪肝的出血部位时，测量止血完成时间和直至止血完成时施用的组合物的量的结果。

图7示出了当通过常规施用或喷雾施用将肽No.2(1.0％或1.5％)施用于猪肝的出血部位时，测量直至止血完成时施用的组合物的量的结果。

图8示出了当通过常规施用或喷雾施用将肽No.2(1.0％或1.5％)施用于猪肝的出血部位时，测量止血完成时间的结果。

图9示出了当通过常规施用或喷雾施用将肽No.3(1.5％)施用于猪肝的出血部位时，测量止血完成时间和直至止血完成时施用的组合物的量的结果。

具体实施方式

本发明涉及待作为喷雾剂施用于对象的组合物。在本发明中，“喷雾剂”是指以喷雾形式施用于接受对象的药剂。在本发明中，用于以喷雾形式施用组合物的方法、仪器或设备不受限制，并且可由本领域技术人员适当选择。例如，可通过使用压缩空气或高压气体以例如雾状或泡沫状态喷雾液体组合物来以喷雾形式施用组合物。更特别地，例如通过使用基于内部高压气体的罐式喷雾、基于电动泵等的电喷雾、或基于外部气压的空气喷雾(例如，喷枪或喷笔(エアブラシ))，可以以喷雾形式施用组合物。

本发明还涉及用于止血的药剂。在本发明中，“用于止血”的药剂广泛地意指用于阻止活体出血的药剂，并且不仅包括完全阻止出血的药剂，而且还包括减轻出血的药剂。

根据本发明进行止血的出血部位可以是任何部位。本发明可用于例如非手术形成的伤口部位或者手术形成的切口部位或切除部位的止血。非手术形成的伤口部位的实例可包括由意外等引起的身体表面组织(例如，皮肤)或身体组织(例如，器官、肌肉和骨)的伤口部位。手术形成的切口部位或切除部位的实例可包括在手术过程中用手术刀等切开或切除的身体表面组织或身体组织的部位，以及用手术器械剥离、吻合、缝合等的身体表面组织或身体组织的部位。本发明通过喷雾施用于对象，并因此使施用操作比常规产品更容易，使得组合物通过单次操作均一地可施用于宽范围。因此，本发明也可适用于需要仔细操作的由于例如内窥镜手术而导致的出血部位。

本发明的接受对象可以是人或非人对象。非人对象可以是例如非人动物，并且可以是例如非人哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物或鱼类。非人类哺乳动物的实例包括啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)、狗、猫、马、猪、牛、绵羊、山羊和灵长类。

本发明的组合物包含自组装肽。在本说明书中，短语“肽在溶液中“自组装””意指肽的分子在溶液中通过任何相互作用(例如，静电相互作用、氢键、范德华力或疏水相互作用)自发组装，并且不得以限制的含义进行解释。在本发明中，自组装肽意指具有形成其中许多肽分子根据其氨基酸序列有规律地排列的自组装形式的性质的肽。由于这种性质，当包含自组装肽的组合物施用于对象的出血部位时，自组装肽在施用部位自组装并由此形成凝胶。

本发明中使用的自组装肽在施用于对象之前其水溶液(即，自组装肽在自组装之前的肽水溶液)本身可具有给定的黏度。但是，在本说明书中，为了便于说明，即使在具有给定黏度时，施用于对象之前的这种肽水溶液也称为“肽溶液(或肽水溶液)”。另外，即使在施用于对象之前肽水溶液具有给定黏度时，在水溶液施用于对象之后通过自组装肽的自组装来进一步提高组合物的黏度也被称为“凝胶化(或凝胶形成)”。

用于本发明的自组装肽可以是例如包含由4至34个氨基酸残基组成的氨基酸序列的肽，其中极性氨基酸残基和非极性氨基酸残基交替排列，或包含由13个氨基酸残基组成的氨基酸序列的肽，其中非极性氨基酸和极性氨基酸在以第7位的非极性氨基酸残基为中心朝向N端和C端的方向上呈对称位置交替地排列。

通过具有如上所述的肽结构，本发明中使用的自组装肽在水溶液中形成“β片层结构”，使得只有极性氨基酸残基可排列在“β片层结构”的一个表面上，而只有非极性氨基酸残基可排列在另一个表面上。因此，此类β片层结构能够通过组装形成双层结构以隐藏它们的疏水表面(仅非极性氨基酸残基排列在其上的表面)。此外，随着分子的自组装进行，β片层的这种层结构能够延伸以形成三维构象结构(例如，水凝胶)。在一些情况下，本发明中使用的“自组装肽”也称为“自组织肽”。

本发明中使用的自组装肽可包含“其中极性氨基酸残基和非极性氨基酸残基交替排列的氨基酸序列”。在这种情况下，氨基酸序列可以是由4至34个氨基酸残基组成的氨基酸序列，更优选由8至30个氨基酸残基组成的氨基酸序列，更优选由12至26个氨基酸残基组成的氨基酸序列，最优选由13至20个氨基酸残基组成的氨基酸序列。

在本发明中，“氨基酸”以最广泛的含义使用，并且不仅包括构成蛋白质的氨基酸，而且包括非构成蛋白质的氨基酸，例如氨基酸变体和衍生物。考虑到这一广泛的定义，本领域技术人员应该理解，根据本发明的氨基酸的实例包括：构成蛋白质的L-氨基酸；D-氨基酸；经化学修饰的氨基酸，例如氨基酸变体和衍生物；非构成蛋白质的氨基酸，例如正亮氨酸、β-丙氨酸和鸟氨酸；以及具有本领域中已知为氨基酸特征之性质的化学合成的化合物。非构成蛋白质的氨基酸的实例包括α-甲基氨基酸(α-甲基丙氨酸等)、D-氨基酸、组氨酸样氨基酸(2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、α-氟甲基-组氨酸和α-甲基-组氨酸等)、在侧链中具有额外亚甲基的氨基酸(“高”氨基酸)和侧链中的羧基官能团氨基酸被磺酸基团取代的氨基酸(磺基丙酸等)。在本发明的一个优选方面，用于本发明的氨基酸可以是构成蛋白质的氨基酸。

在本发明中，极性氨基酸残基不受特别地限制，只要极性氨基酸残基是其侧链可具有极性的氨基酸残基即可。极性氨基酸残基包括例如酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基。在本说明书中，酸性氨基酸残基包括例如天冬氨酸(Asp：D)残基和谷氨酸(Glu：E)。碱性氨基酸包括例如精氨酸(Arg：R)、赖氨酸(Lys：K)和组氨酸(His：H)。

在本说明书中，例如，术语“天冬氨酸(Asp：D)”意指可使用三字母代码“Asp”和单字母代码“D”作为天冬氨酸的缩写。

在本说明书中，在中性氨基酸残基中，含有羟基、酰胺基团、巯基等的氨基酸残基由于具有极性而包括在极性氨基酸残基中。在本说明书中，例如，酪氨酸(Tyr：Y)、丝氨酸(Ser：S)、苏氨酸(Thr：T)、天冬酰胺(Asn：N)、谷氨酰胺(Gln：Q)和半胱氨酸(Cys：C)包括在极性氨基酸残基中。

在本说明书中，非极性氨基酸残基不受特别地限制，只要非极性氨基酸残基是其侧链不具有极性的氨基酸即可。非极性氨基酸残基包括例如丙氨酸(Ala：A)、缬氨酸(Val：V)、亮氨酸(Leu：L)、异亮氨酸(Ile：I)、甲硫氨酸(Met：M)、苯丙氨酸(Phe：F)、色氨酸(Trp：W)、甘氨酸(Gly：G)和脯氨酸(Pro：P)。

当本发明中使用的自组装肽包含“其中极性氨基酸残基和非极性氨基酸残基交替排列的氨基酸序列”时，该肽可具有“RADA”重复序列(2至8个重复，优选3至6个重复)或“IEIK”重复序列(1至4个重复，优选2至3个重复)，并且可更优选地是包含RADARADARADARADA(SEQ ID NO：1)的肽或包含IEIKIEIKIEIKI(SEQ ID NO：2)的肽。进一步优选地，本发明中使用的自组装肽可以是由RADARADARADARADA(SEQ ID NO：1)组成的肽或由IEIKIEIKIEIKI(SEQ ID NO：2)组成的肽。

当本发明中使用的自组装肽是“包含由13个氨基酸残基组成的氨基酸序列的肽，其中非极性氨基酸和极性氨基酸在以第7位的非极性氨基酸残基为中心朝向N端和C端的方向上呈对称位置交替地排列”时，优选地，该肽的“第7位的非极性氨基酸”可以是丙氨酸(Ala：A)。更优选地，肽可以是包含RLDLRLALRLDLR(SEQ ID NO：3)的肽，进一步优选地，由RLDLRLALRLDLR(SEQ ID NO：3)组成的肽。

可用于本发明的自组装肽的其他实例可包括WO2006/014570中公开的肽。

本发明中使用的自组装肽可被修饰(或标记)，只要肽不损失本发明预期的主要性质即可。这样的经修饰(或经标记)的肽也包括在本发明的“自组装肽”中。本领域技术人员可任意选择用于修饰(或标记)本发明中使用的自组装肽的方法。例如，可进行连接官能团等、连接化学物质或连接额外的蛋白质或肽。连接官能团等的实例可包括酰化、乙酰化、烷基化、酰胺化、生物素化、甲酰化、羧基化、谷氨酰化、糖基化(连接糖链)、甘氨酰化、羟基化、异戊二烯化、硫辛酰化、连接核苷酸或其衍生物、聚乙二醇化(PEG化)和连接脂质链。连接化学物质的实例可包括连接适当的标记剂，例如放射性同位素(例如，¹²⁵I、¹³¹I、³H和¹⁴C)、酶(例如，β-半乳糖苷酶、β-糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶和苹果酸脱氢酶)、荧光材料(例如，荧光胺和异硫氰酸荧光素)、发光材料(例如，鲁米诺、鲁米诺衍生物、萤光素和光泽精)和亲和标签(例如，生物素)。连接额外的蛋白质或肽的实例可以包括ISG化、SUMO化和泛素化。

本发明组合物中自组装肽的浓度可以是按重量计至少约0.5％、按重量计至少约1％、按重量计至少约1.5％、按重量计至少约2％、按重量计至少约2.5％、按重量计至少约3％、按重量计至少约3.5％、按重量计至少约4％、按重量计至少约4.5％、按重量计至少约5％、按重量计至少约5.5％、按重量计至少约6％、按重量计至少约6.5％、按重量计至少约7％、按重量计至少约7.5％、或按重量计至少约8％。优选地，本发明组合物中自组装肽的浓度可以是按重量计至少约1.5％。

本发明的组合物可进一步含有一种或更多种生物活性物质(例如，可用于止血的物质和可用于促进伤口愈合的物质)，而基本上不影响组合物中自组装肽自组装的能力。此类物质的实例包括合成或天然的有机分子、核酸分子、多种细胞因子和多种趋化因子。在本发明的组合物中，还可单独地或与不同的生物活性物质组合地包含生长因子。生长因子的实例包括但不限于表皮生长因子、神经生长因子、转化生长因子α和β、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子、造血细胞生长因子、肝素结合生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、脑源性神经营养因子、角质细胞生长因子、骨形态发生蛋白和软骨衍生生长因子。

给出了本说明书中使用的术语用于举例说明特定的实施方案，而不是旨在限制本发明。

在本说明书中使用的术语“包括/包含”意指存在所描述的项目(成员、步骤、因素、数字等)，并且不排除其他项目(成员、步骤、因素、数字等)的存在，除非上下文中明显需要不同的解释。

除非另外定义，否则本文中使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域的技术人员在广义上理解的含义相同的含义。除非另有定义，本文中使用的术语应该被解释为具有与本说明书和相关技术领域中的含义相一致的含义，并且不应理解为理想化或过度形式化的意思。

诸如“第一”或“第二”的术语可用于表达多种因素。但是，应理解，这些因素不应受这些术语的限制。这些术语仅用于将一个因素与其他因素区分开来。例如，第一因素可描述为第二因素，反之亦然，而不偏离本发明的范围。

在下文中，将参考实施例更具体地描述本发明。然而，本发明可以以多种形式来体现，并且不得被解释为限于本文中描述的实施例。

实施例

<测试对象>

通过使用金属锉刀擦伤猪肝来产生渗血性出血。通过常规施用或喷雾施用将自组织肽溶液施用于出血处，并评价其止血作用和施用量。

<测试实践指导>

该测试作为非GLP测试进行。

<动物保护>

该测试基于“动物福利和管理法”(1973年第105号法)、“关于实验动物护理和管理及疼痛缓解的标准(2006年环境省公告第88号)、农林水产省和厚生劳动省的“进行动物实验基本准则”、以及“正确进行动物实验的指南”(日本科学理事会，2006年6月1日)，根据由NAS实验室有限公司提供的“动物实验接触规则和条例”关于从科学观点并且在伦理考虑下实施动物实验的条款，在机构动物护理和使用委员会的批准下进行。

<测试动物>

动物物种：猪

品种：LWD

性别：雌性

引入动物的数量：2

引入时的日龄：任意

引入时的体重：50kg

接收动物的研究所：NAS实验室有限公司的成田实验室

动物的经销商：石毛畜产

适应期：引入之后约7天

检疫：在引入时和适应期间通过临床观察检疫证实不存在异常。

个体辨识：耳标

<饲养条件>

(1)饲养环境

将受试动物单独饲养在设定温度和湿度的饲养室的不锈钢笼(W：690×D：960×H：740mm)中。温度和湿度分别使用设定为25±3℃和60±10％的空调进行控制。照明设定为12小时光照期和12小时黑暗期(光照期：7：00至19：00)。每天进行笼子和喂食器的清洁以及饲养室的清洁和消毒。

(2)饲料类型、饲料量和饲喂方法

所用的饲料是“Breed 74”(J A東日本くみあぃ飼料(株))，并以每餐250g的量每天两次(AM和PM)给予动物。但是，在实验当天，为避免因麻醉期间呕吐引起的误吸等，未饲喂动物。

(3)饮水

对于饮水，使用自动给水装置使动物能够自由饮用井水。饮用水中的物质浓度和细菌计数每年分析一次，并确认分析值符合供水法案的水质标准。

<个体辨识和测试组的构成>

使用耳标编号进行动物的个体辨识。饲养室的入口标有测试编号和测试期，且笼子指明了测试编号、测试组和动物编号。

<预处理和麻醉剂施用方法>

向每只动物以0.05mg/kg(给药体积：0.1mL/kg)肌内施用硫酸阿托品。约30分钟后，将20mg/kg(给药体积：0.4mL/kg)的盐酸氯胺酮和4mg/kg(给药体积：0.2mL/kg)的盐酸甲苯噻嗪混合，并向其肌内施用。使用连接有18G注射针(テルモ株式会社)的一次性注射器(テルモ株式会社)通过肌内施用将每种麻醉剂引入耳根部。然后，插入气管导管(トツプ気管内チユ一ブ，株式会社トップ)，并使用吸入麻醉装置SUBARU-KJ02(株式会社ミ力サ関東商会)和机械呼吸机(コンポ一スβ-E V，株式会社メトラン)利用异氟醚维持麻醉。围手术期异氟醚浓度设定为1％至3％，且氧气量设定为2L/分钟。机械通气机的肺内压力设定为15cmH2O，且呼吸频率设定为15次/分钟。将每只动物仰卧放在手术台上并用消毒盖布覆盖。

<围手术期监测>

设置心电图、脉搏氧饱和度仪和温度计，并进行围手术期监测。通过设置用于测量血压的袖带来无血地测量血压。血压保持在60mmHg或更高的平均血压。

<受试物质>

本实验中使用的肽溶液(受试物质)及其储存弹性模量如下表所示。

(肽浓度：按重量计％)

肽No.1：RADARADARADARADA(SEQ ID NO：1)

肽No.2：IEIKIEIKIEIKI(SEQ ID NO：2)

肽No.3：RLDLRLALRLDLR(SEQ ID NO：3)

对于上述所有的肽，由CPC Scientific，Inc合成原粉末。所有肽都N-末端乙酰化且C-末端酰胺化。使用日本药典的纯化水作为肽的溶剂。

在1Pa的剪切应力下从1弧度/秒至10弧度/秒进行扫频测试，并选择10弧度/秒的储存弹性模量作为数据。至于凝胶化之前的黏度，通过将每种肽溶液加载到间隔距离为500μm的20mm板之间进行2分钟浸泡时间的测试。

<测试方法>

1.使用手术刀和电动手术刀通过腹部正中切口将每只完全麻醉的猪剖腹以暴露肝。

2.通过使用金属锉刀擦伤肝来产生渗血性出血。

3.通过常规施用(*1)或喷雾施用(*2)将每种受试物质施用于出血斜面。

4.使用秒表测量从施用结束之后至止血完成的评估结束时的时间(*3)。记录直至测试结束时使用的每种受试物质的量。

*1：用肽溶液(受试物质)填充注射器，并将肽溶液从注射器尖端的喷嘴推出并因此施用于对象(参见图1的注射器)。

*2：将装有肽溶液(受试物质)的注射器(相当于图1的注射器)装入喷枪中，并使用压缩机将压缩空气吹至注射器顶端的喷嘴处，使从喷嘴推出的肽溶液被喷雾于对象。喷雾压通常为0.5至1.5[kgf/cm2]，但取决于每种受试物质的黏度、出血状况以及与施用部位的距离而不同。

*3：如果初始施用之后出血没有减弱(如果判断这种情况不会导致止血)，则适当地进行额外的施用。初始施用完成时间定义为测量开始时，并且完成止血评估的时间定义为测量结束时。

<结果>

在上述测试中，将每种肽溶液施用于肝出血部位的方式在图2至图5中示出。如图中所示，通过常规施用的肽溶液不均匀地散布在出血部位，而通过喷雾施用的肽溶液均一地散布在出血部位。

如图6中所示，虽然没有显着差异，但是与常规施用组相比，在喷雾施用组中，含有浓度为1.0％的肽No.1的肽溶液具有更短的止血完成时间和直至止血时施用更少量溶液的趋势。另一方面，与常规施用组相比，在喷雾施用组中，1.5％或更高的浓度明显导致更短的止血完成时间和直至止血时施用更少量的溶液。

如图7和8中所示，与关于含有肽No.1的肽溶液的结果一样，含有浓度为1.0％的肽No.2的肽溶液在喷雾施用组与常规施用组之间也未表现出显著差异。相比之下，与常规施用组相比，在喷雾施用组中，1.5％或更高的浓度明显导致更短的止血完成时间和直至止血时施用更少量的溶液。

如图9中所示，含有肽No.3的肽溶液在喷雾施用组中也成功止血，但通过常规施用止血失败。

这些结果表明，与常规施用时相比，含有自组装肽的溶液在用作喷雾剂时出人意料地发挥出改善的止血能力。

序列表

<110> 3-D Matrix, Ltd.

<120> 止血组合物和使用止血组合物的止血方法

<130> TDMP1501F

<150> JP2015-247334

<151> 2015/12/18

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的肽

<400> 1

Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala

1 5 10 15

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的肽

<400> 2

Ile Glu Ile Lys Ile Glu Ile Lys Ile Glu Ile Lys Ile

1 5 10

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的肽

<400> 3

Arg Leu Asp Leu Arg Leu Ala Leu Arg Leu Asp Leu Arg

1 5 10

Claims (15)

1.待作为喷雾剂施用于对象的组合物，

所述喷雾剂用于止血，并且

所述组合物包含自组装肽，其中

当所述组合物施用于所述对象的出血部位时，所述自组装肽自组装并因此凝胶化，并且

所述自组装肽以这样的浓度包含在所述组合物中：与直接施用时相比，所述组合物具有改善的止血能力。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中

所述组合物中所述自组装肽的浓度为按重量计至少1.5％或更高。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中

所述自组装肽是

(a)包含由4至34个氨基酸残基组成的氨基酸序列的肽，其中极性氨基酸残基和非极性氨基酸残基交替排列，或

(b)包含由13个氨基酸残基组成的氨基酸序列的肽，其中非极性氨基酸和极性氨基酸在以第7位的非极性氨基酸残基为中心朝向N端和C端的方向上呈对称位置交替地排列。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中

所述极性氨基酸残基是选自以下的氨基酸残基：天冬氨酸残基、谷氨酸残基、精氨酸残基、赖氨酸残基、组氨酸残基、酪氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基和半胱氨酸残基。

5.根据权利要求3所述的组合物，其中

所述非极性氨基酸残基是选自以下的氨基酸残基：丙氨酸残基、缬氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基、甲硫氨酸残基、苯丙氨酸残基、色氨酸残基、脯氨酸残基和甘氨酸残基。

6.根据权利要求3所述的组合物，其中

所述极性氨基酸残基是选自以下的氨基酸残基：天冬氨酸残基、谷氨酸残基、精氨酸残基、赖氨酸残基、组氨酸残基、酪氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基和半胱氨酸残基，并且

所述非极性氨基酸残基是选自以下的氨基酸残基：丙氨酸残基、缬氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基、甲硫氨酸残基、苯丙氨酸残基、色氨酸残基、脯氨酸残基和甘氨酸残基。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中

所述自组装肽是包含RADARADARADARADA(SEQ ID NO：1)的肽、包含IEIKIEIKIEIKI(SEQID NO：2)的肽或包含RLDLRLALRLDLR(SEQ ID NO：3)的肽。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中

所述自组装肽是由RADARADARADARADA(SEQ ID NO：1)组成的肽、由IEIKIEIKIEIKI(SEQID NO：2)组成的肽或由RLDLRLALRLDLR(SEQ ID NO：3)组成的肽。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中

所述对象的所述出血部位是非手术形成的伤口部位或者手术形成的切口部位或切除部位。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物用于制备用于止血的喷雾剂的用途。

11.喷雾剂，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的组合物。

12.用于在对象中止血的方法，其包括以下步骤：

通过喷雾将包含自组装肽的组合物施用于所述对象的出血部位，其中

当所述组合物施用于所述对象的所述出血部位时，所述自组装肽自组装并因此凝胶化，并且

所述自组装肽以这样的浓度包含在所述组合物中：与直接施用时相比，所述组合物具有改善的止血能力。

13.根据权利要求12所述的方法，其中

所述组合物中所述自组装肽的浓度为按重量计至少1.5％或更高。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中

所述对象的所述出血部位是非手术形成的伤口部位或者手术形成的切口部位或切除部位。

15.根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其中

所述对象是非人动物。