DE60015152T2

DE60015152T2 - Reduktion des gewebe-volumens

Info

Publication number: DE60015152T2
Application number: DE60015152T
Authority: DE
Inventors: Edward P. Ingenito
Original assignee: Aeris Therapeutics LLC
Current assignee: Aeris Therapeutics LLC
Priority date: 1999-08-23
Filing date: 2000-08-23
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2020-08-24
Also published as: US20050239685A1; CN1373670A; CN1236816C; AU783750B2; JP2003507130A; EP1206276B1; HK1048586B; US6610043B1; CA2382817A1; EP1206276A2; CA2382817C; WO2001013908A9; ATE279938T1; HK1048586A1; EP1527786A1; WO2001013908A2; WO2001013908A3; DE60015152D1; AU6799300A; US20010051799A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Das Gebiet der Erfindung ist Gewebereparatur und -volumenreduktion, zum Beispiel Lungenreparatur und -volumenreduktion.
Endphasen-Emphysem kann durch Lungenvolumenreduktions-Chirurgie (LVRS) behandelt werden (siehe z.B. Cooper et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 109:106–116, 1995). Obwohl es contra-intuitiv erscheinen mag, dass die Respirationsfunktion durch Entfernen eines Teils der Lunge verbessert wird, ermöglicht die Exzision von überdehntem Gewebe (wie es bei Patienten mit heterogenem Emphysem zu sehen ist) benachbarten Regionen der Lunge, die normaler sind, sich auszudehnen. Im Gegenzug ermöglicht diese Expansion verbesserte Zusammenziehung und Gasaustausch. Sogar Patienten mit homogenem Emphysem profitieren von LVRS, da die Resektion von abnormaler Lunge zu einer Gesamtreduktion der Lungenvolumina, einer Steigerung der elastischen Zusammenziehungs-Drücke und einer Verschiebung der statischen Compliance-Kurve gegen normal führt (Hoppin, Am. J. Resp. Crit. Care Med. 155:520–525, 1997).
Obwohl viele Patienten, die sich LVRS unterzogen haben, signifikante Verbesserung erfahren (Cooper et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 112:1319–1329, 1996), haben sie ein beträchtliches Risiko auf sich genommen. LVRS wird durch chirurgisches Entfernen eines Teils der erkrankten Lunge ausgeführt, die entweder durch Insertion eines Thorakoskopes durch die Brustwand oder durch eine radikalere Inzision entlang des Sternums (Katloff et al., Chest 110:1399–1406, 1996) erreicht wurde. Daher ist das Anlegen eines Zugangs zu der Lunge traumatisch, und die folgenden Verfahren, die das Klammern des fragilen Lungengewebes umfassen können, können schwere post-operative Komplikationen hervorrufen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung umfasst Vorrichtungen und Zusammensetzungen zur Reparatur von Gewebe und zum Erreichen einer nicht-chirurgischen Gewebe (z.B. Lungen)-Volumenreduktion. Die Verfahren werden an Lungengewebe unter Verwendung eines Bronchoskops ausgeführt. Dieses Verfahren eliminiert die Notwendigkeit zur Operation völlig, da sie ermöglicht, das Gewebereduktionsverfahren durch die Trachea und kleineren Luftwege des Patienten durchzuführen. Bei dieser Vorgehensweise wird die bronchoskopische Lungenvolumenreduktion (BLVR) durch Kollabierenlassen eines Teils der Lunge, Ankleben eines Teils der kollabierten Region an einen anderen und Förderung von Fibrose in oder um das angeklebte Gewebe durchgeführt. Die Zusammensetzung, die verwendet wird, um Lungenkollabierung zu erreichen, kann, muss aber nicht unbedingt die gleiche sein wie jene, die verwendet wird, um Verklebungen innerhalb des Gewebes zu bilden. Bevorzugte Ausführungsformen können eine oder mehrere der folgenden Merkmale einschließen.
Es gibt viele Wege, um eine Lungenkollabierung zu induzieren. Zum Beispiel kann ein Material, das die Oberflächenspannung von Flüssigkeiten, die die Alveolen auskleiden, erhöht (d.h. ein Material, das als ein Anti-Surfactant wirken kann), durch das Bronchoskop (vorzugsweise durch einen Katheter, der innerhalb des Bronschoskops liegt) eingebracht werden. Das Material kann Fibrinogen, Fibrin oder biologisch aktive Fragmente davon einschließen. Lungenkollabierung kann auch durch Blockieren des Luftflusses in und aus der Region der Lunge, die zum Kollabieren angezielt wird, induziert werden. Dies wird durch Insertion eines Ballonkatheters durch das Bronchoskop und Aufblasen des Ballons in einer Weise erzielt, dass er den Bronchus oder die Bronchiole, in die er platziert wurde, verschließt. Bevor die Lungenkollabierung induziert wird, kann die Lunge mit Sauerstoff gefüllt werden, so dass das verbleibende Gas in das Blut absorbiert werden kann.
In ähnlicher Weise gibt es viele Wege, um Verkleben zwischen einem Teil der kollabierten Lunge und einem anderen zu fördern. Wenn Fibrinogen als das Anti-Surfactant ausgewählt wird, wird Verkleben durch Aussetzen des Fibrinogens gegenüber einen Fibrinogenaktivator wie Thrombin gefördert, der Fibrinogen spaltet und das resultierende Fibrin polymerisiert. Andere Substanzen, einschießlich Thrombinrezeptor-Agonisten und Batroxobin, können auch verwendet werden, um Fibrinogen zu aktivieren. Wenn Fibrin als das Anti-Surfactant ausgewählt wird, muss keine zusätzliche Substanz oder Verbindung verabreicht werden; Fibrin kann spontan polymerisieren, und dabei einen Teil des kollabierten Gewebes mit einem anderen verkleben.
Fibrose wird durch Liefern von einem oder mehreren Polypeptid-Wachstumsfaktoren zusammen mit einem oder mehreren der Anti-Surfactant- oder Aktivator-Substanzen, die oben beschrieben wurden, gefördert. Die Wachstumsfaktoren können aus der Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF)-Familie ausgewählt werden, oder können transformierender Wachstumsfaktor beta-ähnliche (TGFβ-ähnliche) Polypeptide sein.
Die oben beschriebenen Zusammensetzungen können auch ein oder mehrere Antibiotika enthalten, um Infektionen vorzubeugen zu helfen. Alternativ oder zusätzlich können Antibiotika auf anderen Wegen verabreicht werden (z.B. können sie oral oder intramuskulär verabreicht werden).
Andere Aspekte der Erfindung schließen die oben beschriebenen Zusammensetzungen zum Fördern von Kollabieren und/oder Verkleben, sowie Vorrichtungen zum Einbringen der Zusammensetzungen in den Körper ein. Zum Beispiel betrifft die Erfindung in einem Aspekt physiologisch akzeptable Zusammensetzungen, die einen Polypeptid-Wachstumsfaktor oder ein biologisch aktives Fragment davon (z.B. einen Blutplättchen-abstammenden Wachstumsfaktor, einen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), oder ein transformierender Wachstumsfaktor β-ähnliches Polypeptid) einschließen und Fibrinogen oder ein Fibrinmonomer (z.B. ein Fibrin-I-Monomer, ein Fibrin-II-Monomer, ein Des-BB-Fibrinmonomer oder jegliche Mischung oder Kombination davon), oder einen Fibrinogenaktivator (z.B. Thrombin) enthalten. Das Fibrinogen, Fibrinmonomere und Fibrin-Aktivatoren, die nützlich sind in BLVR, können biologisch aktive Mutanten (z.B. Fragmente) von diesen Polypeptiden sein.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung Vorrichtungen zum Durchführen von nicht-chirurgischer Lungenvolumenreduktion. Zum Beispiel betrifft die Erfindung eine Vorrichtung, die ein Bronchoskop einschließt, das einen Arbeitskanal und einen Katheter hat, der in den Arbeitskanal eingeführt werden kann. Der Katheter kann mehrere Lumina enthalten und kann einen aufblasbaren Ballon einschließen. Eine andere Vorrichtung zur Durchführung einer Lungenvolumenreduktion schließt einen Katheter ein, der eine Vielzahl von Lumina (z.B. zwei oder mehr) aufweist, und einen Behälter für Material, der eine Vielzahl von Kammern (z.B. zwei oder mehr) hat, wobei die Kammern des Behälters verbindbar sind mit den Lumina des Katheters. Diese Vorrichtungen können auch einen Injektor einschließen, um den Transport von Material aus dem Behälter zu dem Katheter zu erleichtern.
BLVR hat einige Vorteile gegenüber Standard-chirurgischer Lungenvolumenreduktion (LVRS). BLVR sollte die Morbidität und Mortalität reduzieren, von denen bekannt ist, dass sie mit LVRS assoziiert sind (Swanson et al., J. Am. Coll. Surg. 185:25–32, 1997). Es ist weniger wahrscheinlich, dass atriale Arrhythmien und anhaltende Luftundichtigkeiten, die die am häufigsten berichteten Komplikationen von LVRS darstellen, mit BLVR auftreten, weil BLVR kein Klammern von fragilem Lungengewebe oder chirurgische Manipulationen benötigt, die das Perikard irritieren. BLVR kann auch wesentlich weniger teuer sein als SLVR, die momentan zwischen zirka $18.000 und $26.000 pro Fall kostet. Die Ersparnisse würden wesentlich sein unter der gegebenen Tatsache, dass Emphyseme zwischen zwei und sechs Millionen Patienten allein in Amerika betreffen. Zusätzlich können sich manche Patienten, die keine Kandidaten für LVRS sein würden (auf Grund z.B. deren fortgeschrittenen Alters), BLVR unterziehen. Darüber hinaus, sollte es nötig werden, bietet BLVR Patienten eine Möglichkeit, sich mehr als einem Volumenreduktionsverfahren zu unterziehen. Während wiederholte chirurgische Intervention keine realisierbare Option für die meisten Patienten darstellt (auf Grund von pleuralen Verklebungen, die sich in Folge der ursprünglichen Behandlung bilden), sollten keine solchen Limitationen für Patienten existieren, die sich BLVR unterzogen haben.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden deutlich aus der folgenden, detaillierten Beschreibung und aus den Ansprüchen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung von BLVR.
2a zeigt einen Katheter, der durch ein Bronchoskop inseriert werden kann.
2b ist eine Querschnittsansicht durch den Schaft des in 2a dargestellten Katheters.
2c zeigt eine Patrone, die an den in 2a dargestellten Katheter angehängt werden kann.
2d zeigt einen Injektor, der verwendet werden kann, um Material aus der in 2c dargestellten Patrone auszustoßen
2e zeigt den Katheter von 2a, zusammengesetzt mit der Patrone von 2c, dem Injektor von 2d und einer luftgefüllten Spritze mit Luer-Verschluss.
3a und 3b sind Diagramme, die die Oberflächenspannung gegen das Oberflächenareal von Surfactant-Filmen eines Kontroll-Meerschweinchens (3a) und eines Meerschweinchens, das LPS ausgesetzt wurde (3b), verbildlichen.
4a und 4b sind Säulen-Diagramme, die den Surfactant-Film-Stabilitätsparameter (Gy/dA)1(A/y) als Funktion von Protein/Lipid-Konzentration für Fibrinogen- und Albumin-Surfactant-Mischungen verbildlichen.
5a und 5b sind Säulen-Diagramme, die die dynamische (5a) und quasi-statische (5b)-Compliance 3 Monate nachdem Schafe Papain ausgesetzt wurden, verbildlichen. n=6.
6a und 6b sind Diagramme, die das Verhältnis zwischen Physiologie (Cdyn, als eine % Grundlinie wird in 6a gezeigt, und R_L, auch als eine % Grundlinie wird in 6b gezeigt) und Emphysem-Schweregrad graphisch darstellen.
7 ist ein Diagramm, das die statische Lungen-Compliance (Volumen in Litern vs. Ptp in cm H₂O) als Grundlinie (d.h. vor der Behandlung) und acht Wochen nach der Papain-Therapie in Schafen illustriert.
8a und 8b sind Säulen-Diagramme, die die elastischen Module von Gelstreifen, enthaltend verschiedene ECM-Komponenten (8a), und Gelpolymerisations-Raten (8b) zusammenfassen.
9 ist ein Linien-Diagramm, das Prozent Belastung vs. Zyklen gegen Fehler für Gelstreifen, zusammengestellt aus Fibrin allein oder Fibrin + PLL + CS, graphisch darstellt
10a und 10b sind Säulen-Diagramme von menschlicher Fibroblasten-Proliferation auf Fibringelen, enthaltend ECM-Komponenten.
11 ist ein Säulen-Diagramm, das die Effekte von modifizierten Auswaschungslösungen und Klebstoffen auf die Lungenphysiologie in Schafen verbildlicht.
12a und 12b sind Linien-Diagramme, die quasi-statische Druck-Volumen-Verhältnisse für ein Schaf zeigen, das mit 4 × 10 ml subsegmentaler Auswaschung plus Fibrin-Klebstoff (die Ergebnisse nach zwei Wochen sind in 12a gezeigt) und für ein Schaf, das mit Auswaschlösung, enthaltend ECM-Komponenten (12b) behandelt wurde.
13a, 13b und 13c sind Schemata eines Dual-Lumen-Kathetersystems.
14a und 14b sind Schemata eines Kathetersystems, das verwendet werden kann, um broncho-pleurale Fisteln abzudichten.
Detaillierte Beschreibung
Die Vorrichtungen und Zusammensetzungen, die hierin beschrieben werden, können verwendet werden, um Verletzungen von oder Undichtigkeiten in Geweben wie der Lunge zu reparieren, die verursacht werden können durch Trauma, Erkrankung oder chirurgische Verfahren, sowie, um das Volumen von inhärent kollabierbarem Gewebe zu reduzieren. Zum Beispiel kann ein Lungenvolumen unter Verwendung eines Bronchoskops reduziert werden (bronchoskopische Lungenvolumenreduktion wird hierin mit BLVR abgekürzt). Bezugnehmend auf 1 wird ein flexibles Bronchoskop 10 durch die Trachea eines Patienten 12 in eine Zielregion 20a der Lunge 20 inseriert, und ein Ballonkatheter 50 mit einer distalen Lumenöffnung 60 (2) wird durch einen Kanal in dem Bronchoskop inseriert. Zielregion 20a wird kollabieren, entweder wenn die Luftpassage 14 zu Zielregion 20a verschlossen ist, oder wenn ein Anti-Surfactant durch Ballonkatheter 50 an die Zielregion 20a verabreicht wird. Unabhängig von dem Grund für das Kollabieren, wird ein Teil der kollabierten Zielregion an eine andere anhaften, wenn er einer oder mehren der unten beschriebenen Zusammensetzungen ausgesetzt wird. Diese Zusammensetzungen schließen Substanzen ein, die entweder spontan (z.B. Fibrin) oder als Antwort auf einen Aktivator (z.B. Fibrinogen) polymerisieren können. Zusätzlich enthalten eine oder mehrere der Zusammensetzungen einen Polypeptid-Wachstumsfaktor, der Fibrose fördert, und können ein Antibiotikum enthalten, um Infektion vorbeugen zu helfen oder einen zusätzlichen Faktor (wie Faktor XIIIa- Transglutaminase), um Polymerisation zu fördern. Im Anschluss an die Verabreichung der Zusammensetzungen) wird das Bronchoskop entfernt.
Patienten, die eine chronisch obstruktive Lungenkrankheit haben, können von BLVR profitieren. Diese Patienten schließen jene ein, aber sind nicht darauf beschränkt, die Emphyseme, chronisches Asthma, chronische Bronchitis und Bronchiektasie haben. BLVR kann auch durchgeführt werden, wenn die Lunge eines Patienten durch Trauma oder im Fall eines spontanen Pneumothorax geschädigt ist. Während die Zusammensetzungen der Erfindung (die hierin unterschiedlich als Lösungen, Klebstoffe und Gele bezeichnet werden können) mit neuen Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung angewendet werden können, können sie auch unabhängig angewendet werden. Zum Beispiel können die Zusammensetzungen während chirurgischer LVR oder während jeglichem chirurgischen Verfahren angewendet werden, das einen Patienten in das Risiko versetzt, eine Schädigung der Lunge oder von Geweben innerhalb des Respirationstraktes, anderer Organe oder anderer Organsysteme zu erfahren. Manche der Verwendungen für die Zusammensetzungen der Erfindung sind spezifischer unter der Überschrift „Andere Ausführungsformen" beschrieben.
Identifizieren und Zugang erhalten zu einer Zielregion der Lunge
Sobald ein Patient bestimmt wird, ein Kandidat für BLVR zu sein, kann die Zielregion 20a der Lunge unter Verwendung von radiologischen Studien (z.B. Brustkorb-Röntgen) und Computertomographie-Untersuchungen identifiziert werden. Wenn das Verfahren in der Folge durchgeführt wird, wird der Patient anästhesiert und intubiert, und kann für einen bestimmten Zeitraum (z.B. ungefähr 30 Minuten) auf ein absorbierbares Gas (z.B. mindestens 90% Sauerstoff und bis zu 100% Sauerstoff) gesetzt werden. Die Regionen) der Lunge, die zuerst radiologisch identifiziert wurden, werden dann bronchoskopisch identifiziert.
Geeignete Bronchoskope schließen jene ein, die von Pentax, Olympus und Fujinon hergestellt werden, die eine Visualisierung eines erleuchteten Bereiches ermöglichen. Der Arzt führt das Bronchoskop 10 in die Trachea 12 und durch den Bronchialbaum so, dass die offene Spitze 60 des Bronchoskops 10 am Eingang zu der Zielregion 20a positioniert ist (d.h. zu der Region der Lunge, die im Lumen reduziert wird). Das Bronchoskop 10 kann durch fortschreitend engere Zweige des Bronchialbaumes geführt werden, um verschiedene Subsegmente jeder Lunge 20 zu erreichen. Zum Beispiel, wie in 1 gezeigt, kann das Bronchoskop in ein Subsegment in dem oberen Lappen der linken Lunge des Patienten geführt werden.
Der oben erwähnte (und unten genauer beschriebene) Ballonkatheter 50 wird dann durch das Bronchoskop 10 in die Zielregion 20a der Lunge 20 geführt. Wenn der Katheter 50 im Bronchoskop 10 positioniert ist, wird der Ballon 58 aufgeblasen, so dass Material, das durch den Katheter gebracht wird, in den Regionen der Lunge distal vom Ballon enthalten sein wird. Die Zielregion kann mit Kochsalzlösung gewaschen werden, um die Menge an Surfactant, die natürlich vorhanden ist, zu reduzieren, und eine physiologisch kompatible Zusammensetzung, enthaltend ein Anti-Surfactant (d.h. ein Agens, das die Oberflächenspannung der Flüssigkeiten, die die Alveolen auskleiden, erhöht), wird an die Zielregion der Lunge durch den Katheter verabreicht. Vorzugsweise ist die Zusammensetzung als eine Lösung oder Suspension gestaltet, die Fibrin oder Fibrinogen einschließt. Ein Vorteil der Verabreichung dieser Substanzen ist, dass sie alle nicht nur als Anti-Surfactants wirken können, sondern auch am adhäsiven Prozess teilnehmen können.
Fibrinogen-basierende Lösungen
Fibrinogen kann als ein Anti-Surfactant wirken, da es die Oberflächenspannung von Flüssigkeiten, die die Alveolen auskleiden, erhöht, und es kann als eine Abdichtung oder ein Kleber wirken, weil es an einer Koagulations-Kaskade teilnehmen kann, in der es in ein Fibrinmonomer umgewandelt wird, das dann polymerisiert und vernetzt wird, um ein stabiles Netz zu bilden. Fibrinogen, das auch Faktor I genannt wurde, stellt etwa 2–4 g/L Blutplasma-Protein dar, und ist ein Monomer, das aus drei Paaren von Disulfid-verbundenen Polypeptid-Ketten, benannt (Aα)₂, (Bβ)₂ und γ₂, besteht. Die „A"- und „B"-Ketten repräsentieren die zwei kleinen N-terminalen Peptide und sind auch als Fibrinopeptide A beziehungsweise B bekannt. Die Spaltung von Fibrinogen durch Thrombin resultiert in einer Verbindung, genannt Fibrin I, und die folgende Spaltung von Fibrinopeptid B resultiert in Fibrin II. Obwohl diese Spaltungen das Molekulargewicht von Fibrinogen nur leicht reduzieren, exponieren sie nichts desto trotz die Polymerisationsstellen. In dem Vorgang der normalen Gerinnsel-Bildung wird die Kaskade eingeleitet, wenn Fibrinogen dem Thrombin ausgesetzt wird, und dieser Vorgang kann im Zusammenhang der Lungenvolumenreduktion wiederholt werden, wenn Fibrinogen einem Aktivator wie Thrombin, oder einem Agonisten des Thrombin-Rezeptors in einer wässrigen Lösung, die Calcium (z.B. 1,5 bis 5,0 mM Calcium) enthält, ausgesetzt wird.
Die Fibrinogen enthaltende Zusammensetzung kann 3–12% Fibrinogen einschließen, und schließt vorzugsweise ungefähr 10% Fibrinogen in Kochsalzlösung (z.B. 0,9%ige Kochsalzlösung) oder einer anderen physiologisch akzeptablen wässrigen Lösung ein. Das Volumen des Anti-Surfactant, der verabreicht wird, wird variieren, abhängig von der Größe der Region der Lunge, und wird basierend auf der Computertomographie-Untersuchung des Brustkorbs abgeschätzt. Zum Beispiel kann die Zielregion mit 10–100 ml (z.B. 50 ml) einer Fibrinogen-Lösung (10 mg/ml) gewaschen werden. Um die Lungenkollabierung zu erleichtern, kann die Zielregion einer unpolymerisierten Lösung von Fibrinogen ausgesetzt (z.B. gespült oder gewaschen) und dann einer zweiten Fibrinogen-Lösung ausgesetzt werden, die in der Folge mit einem Fibrinogen-Aktivator (z.B. Thrombin oder einem Thrombin-Rezeptor-Agonist) polymerisiert wird.
Das Anti-Surfactant kann Fibrinogen enthalten, das von dem Patienten erhalten wurde, bevor das nicht-chirurgische Lungenreduktionsverfahren begonnen wurde (d.h. das Anti-Surfactant oder die adhäsive Zusammensetzung kann autologes Fibrinogen einschließen). Die Verwendung einer autologen Substanz ist wünschenswert, weil sie das Risiko eliminiert, dass der Patient sich irgendeine Form von Hepatitis (z.B. Hepatitis B oder nicht-A-, nicht-B-Hepatitis), ein erworbenes Immundefizienz-Syndrom (AIDS) oder eine andere durch Blut übertragene Infektion zuzieht. Es ist viel wahrscheinlicher, sich diese Infektionen zuzuziehen, wenn die Fibrinogen-Komponente aus gepooltem menschlichen Plasma extrahiert wird (siehe z.B. Silberstein et al., Transfusion 28:319–321, 1988). Menschliches Fibrinogen ist kommerziell erhältlich durch Händler, die Fachleuten bekannt sind, oder kann aus Blutbanken oder ähnlichen Sammelstellen bezogen werden.
Polymerisierung von Fibrinogen-basierenden Anti-Surfactants kann durch Zugabe eines Fibrinogen-Aktivators erzielt werden. Diese Aktivatoren sind in dem Fachgebiet bekannt und schließen Thrombin, Batroxobin (wie das von B. Moojeni, B. Maranhao, B. atrox, B. Ancrod oder A. rhodostoma) und Thrombin-Rezeptor-Agonisten ein. Wenn sie kombiniert werden, reagieren Fibrinogen und Fibrinogen-Aktivatoren in einer Weise, die ähnlich ist zu den finalen Stadien des natürlichen Blutgerinnungs-Vorganges, um eine Fibrin-Matrix zu bilden. Spezifischer, die Polymerisierung kann durch Zugabe von Thrombin (z.B. 1–10 Einheiten von Thrombin pro ng Fibrinogen) erzielt werden. Wenn es gewünscht wird, kann 1–5% (z.B. 3%) Faktor XIIIa-Transglutaminase zugefügt werden, um Vernetzung zu fördern.
Zusätzlich, um Fibrose (oder Vernarbung) an der Stelle zu fördern, wo ein Bereich der kollabierten Lunge an einen anderen anklebt, können eine oder mehrere der Zusammensetzungen, die angewendet werden, um Lungenvolumenreduktion zu erzielen (z.B. die Zusammensetzung, die Fibrinogen enthält), einen Polypeptid-Wachstumsfaktor enthalten. Zahlreiche Faktoren können eingeschlossen werden. Blutplättchen-abstammender Wachstumsfaktor (PDGF) und jene in den Fibroblasten-Wachstumsfaktor- und transformierenden Wachstumsfaktor-β-Familien sind bevorzugt.
Zum Beispiel kann der Polypeptid-Wachstumsfaktor, der in einer Zusammensetzung enthalten ist, die verabreicht wird, um Lungenvolumen zu reduzieren (z.B. die Fibrinogen-, Fibrinogen-Aktivator- oder Fibrin-basierenden Zusammensetzungen, die hierin beschrieben sind) basischer FGF (bFGF), saurer FGF (aFGF), das hst/Kfgf Genprodukt, FGF-5, FGF-10 oder int-2 sein. Die Nomenklatur in dem Bereich von Polypeptid-Wachstumsfaktoren ist komplex, vor allem weil viele Faktoren unabhängig von unterschiedlichen Forschern isoliert wurden, und historisch nach dem Gewebetyp benannt wurden, der als ein Test während der Aufreinigung des Faktors verwendet wurde. Diese Komplexität ist durch basischen FGF illustriert, der durch mindestens 23 unterschiedliche Namen bezeichnet wird (einschließlich leukämischer Wachstumsfaktor, Makrophagen-Wachstumsfaktor, embryonaler von Nieren stammender Angiogenese-Faktor-2, prostatischer Wachstumsfaktor, Astroglia-Wachstumsfaktor-2, endothelialer Wachstumsfaktor, Tumor-Angiogenese-Faktor, Hepatom-Wachstumsfaktor, Chondrosarkom-Wachstumsfaktor, Knorpel-abstammender Wachstumsfaktor-1, Augen-abstammender Wachstumsfaktor-1, Heparin-bindende Wachstumsfaktoren Klasse II, myogener Wachstumsfaktor, menschliche Plazenta-aufgereinigter Faktor, Uterus-abstammender Wachstumsfaktor, embryonales Karzinom-abstammender Wachstumsfaktor, menschlicher Hypophysen-Wachstumsfaktor, Hypophysen-abstammender Chondrozyten-Wachstumsfaktor, Adipozyten-Wachstumsfaktor, prostatischer osteoplastischer Faktor und Brustdrüsentumor-abstammender Wachstumsfaktor). Daher liegt jeder Faktor, der durch einen der vorher erwähnten Namen bezeichnet wird, innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung.
Die Zusammensetzungen können auch „funktionelle Polypeptid-Wachstumsfaktoren" einschließen, d.h. Wachstumsfaktoren, die trotz der Anwesenheit einer Mutation (sei es eine Substitution, Deletion oder Addition von Aminosäureresten) die Fähigkeit beibehalten, Fibrose im Zusammenhang mit Lungenvolumenreduktion zu fördern. Dementsprechend liegen alternative molekulare Formen von Polypeptid-Wachstumsfaktoren (wie die Formen von bFGF mit Molekulargewichten von 17,8, 22,5, 23,1 und 24,2 kDa) innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung (die Formen mit höherem Molekulargewicht sind colinear N-terminale Verlängerungen des 17,8 kDa-bFGF (Florkiewicz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3978–3981, 1989)).
Es liegt innerhalb der Fähigkeiten einer Fachperson, zu bestimmen, ob ein Polypeptid-Wachstumsfaktor, unabhängig von Mutationen, die seinen Aminosäuregehalt oder seine Größe beeinflussen, im wesentlichen die Fähigkeit beibehält, Fibrose zu fördern, wie es der Voll-Längen-Wildtyp-Polypeptid-Wachstumsfaktor (d.h. ob ein mutiertes-Polypeptid Fibrose zu mindestens 40%, vorzugsweise mindestens 50%, mehr bevorzugt mindestens 70% und am meisten bevorzugt mindestens 90% so effektiv fördert, wie der entsprechende Wildtyp-Wachstumsfaktor) würde. Zum Beispiel könnte jemand Kollagen-Ablagerung in gezüchteten Fibroblasten untersuchen, nachdem sie Voll-Längen-Wachstumsfaktoren und mutierten Wachstumsfaktoren ausgesetzt wurden. Ein mutierter Wachstumsfaktor behält im wesentlichen die Fähigkeit, Fibrose zu fördern, wenn er mindestens 40%, vorzugsweise mindestens 50%, mehr bevorzugt mindestens 70% und am meisten bevorzugt mindestens 90% so viel Kollagen-Ablagerung fördert, wie es der entsprechende Wildtyp-Faktor tut. Die Menge der Kollagen-Ablagerung kann auf viele Arten gemessen werden. Zum Beispiel kann die Kollagen-Expression durch einen Immuntest bestimmt werden. Alternativ kann Kollagen-Expression durch Extraktion von Kollagen aus Fibroblasten (z.B. gezüchteten Fibroblasten oder jenen in der Nachbarschaft des reduzierten Lungengewebes) und Messen von Hydroxyprolin bestimmt werden.
Die Polypeptid-Wachstumsfaktoren, die für die Erfindung nützlich sind, können natürlich vorkommende, synthetische oder rekombinante Moleküle sein, und können aus einem Hybrid- oder chimären Polypeptid mit einem Teil, zum Beispiel bFGF oder TGFβ, und einem zweiten Teil, der ein eigenes Polypeptid ist, bestehen. Diese Faktoren können aus einer biologischen Probe aufgereinigt, chemisch synthetisiert oder rekombinant durch Standard-Verfahren (siehe z.B. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, New York, John Wiley und Söhne, 1993; Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, Supp. 1987) erzeugt werden.
Natürlich können verschiedene Fibrose-fördernde Wachstumsfaktoren in Kombination verwendet werden.
Ein Fachmann ist leicht in der Lage, die Dosierung eines Polypeptid-Wachstumsfaktors zu bestimmen, die nötig ist, um Fibrose im Zusammenhang mit BLVR zu fördern. Die benötigte Dosierung kann variieren, und kann im Bereich von 1–100 nM liegen.
Zusätzlich kann jede der Zusammensetzungen und Lösungen, die hierin für Lungenvolumenreduktion beschrieben sind (z.B. die oben beschriebene Fibrinogen-basierende Zusammensetzung), ein oder mehrere Antibiotika (z.B. Ampicillin, Gentamycin, Cefotaxim, Nebacetin, Penicillin oder Sisomicin) enthalten. Das Einbeziehen von Antibiotika in therapeutisch angewendete Zusammensetzungen ist Fachleuten wohlbekannt.
Fibrin-basierende Lösungen
Fibrin kann auch als ein Anti-Surfactant sowie als ein Dichtungsmittel oder Klebstoff wirken. Im Gegensatz zu Fibrinogen kann Fibrin jedoch ohne die Verabreichung eines Aktivators (wie Thrombin oder Faktor XIIIa) in ein Polymer umgewandelt werden. Tatsächlich können Fibrin-I-Monomere spontan ein Fibrin-I-Polymer bilden, das als ein Gerinnsel wirkt, egal ob sie vernetzt sind, und egal ob Fibrin-I weiter zu Fibrin-II-Polymer umgewandelt wird. Ohne die Erfindung auf Verbindungen zu beschränken, die durch irgendeinen speziellen Mechanismus funktionieren, kann erwähnt werden, dass, wenn Fibrin-I-Monomere mit Blut eines Patienten in Kontakt kommen, das eigene Thrombin und Faktor XIII des Patienten das Fibrin-I-Polymer in vernetztes Fibrin-II-Polymer umwandeln können.
Jegliche Form von Fibrinmonomer, die in ein Fibrinpolymer umgewandelt werden kann, kann als eine Lösung gebildet werden, und für Lungenvolumenreduktion verwendet werden. Zum Beispiel können Fibrin-basierende Zusammensetzungen Fibrin-I-Monomere, Fibrin-II-Monomere, Des-BB-Fibrinmonomere oder jegliche Mischungen oder Kombinationen davon enthalten. Vorzugsweise sind die Fibrinmonomere nicht vernetzt.
Fibrin kann aus jeglicher Quelle erhalten werden, solange es in einer Form erhalten wird, die in ein Fibrinpolymer umgewandelt werden kann (in ähnlicher Weise kann nicht-vernetztes Fibrin aus jeglicher Quelle erhalten werden, solange es in vernetztes Fibrin umgewandelt werden kann). Zum Beispiel kann Fibrin aus dem Blut eines Säugers, wie eines Menschen, erhalten werden, und wird vorzugsweise von dem Patienten erhalten, an den es später verabreicht wird (d.h. das Fibrin ist autologes Fibrin). Alternativ kann Fibrin von Zellen erhalten werden, die in Kultur Fibrinogen absondern.
Fibrin-basierende Zusammensetzungen können, wie in U.S. Patent 5,739,288 beschrieben (das hierin durch Referenz in seiner Gänze enthalten ist), hergestellt werden, und können Fibrinmonomere enthalten, die eine Konzentration von nicht weniger als etwa 10 mg/ml aufweisen. Zum Beispiel können die Fibrinmonomere in Konzentrationen von etwa 20 mg/ml bis etwa 200 mg/ml vorhanden sein; von etwa 20 mg/ml bis etwa 100 mg/ml; und von 25 mg/ml bis etwa 50 mg/ml.
Die spontane Umwandlung eines Fibrinmonomers in ein Fibrinpolymer kann durch Kontaktieren des Fibrinmonomers mit Calcium-Ionen (wie z.B. in Calciumchlorid gefunden, z.B. eine 3–30 mM CaCl₂-Lösung) erleichtert werden. Außer für die ersten zwei Schritte im intrinsischen Blutgerinnungs-Weg sind Calcium-Ionen nötig, um die Umwandlung eines Gerinnungsfaktors in einen anderen zu fördern. Daher wird Blut in der Abwesenheit von Calcium-Ionen nicht gerinnen (aber in einem lebenden Körper sinken die Calcium-Ionen-Konzentrationen nie weit genug, um die Kinetik der Blutgerinnung signifikant zu beeinflussen; eine Person würde durch Muskel-Tetanie sterben, bevor Calcium auf diesen Wert gesunken ist). Calcium-enthaltende Lösungen (z.B. steriles 10%iges CaCl₂) kann leicht hergestellt oder von einem kommerziellen Vertreiber gekauft werden.
Die hierin beschriebenen Fibrin-basierenden Zusammensetzungen können auch einen oder mehrere Polypeptid-Wachstumsfaktoren einschließen, die Fibrose (oder Vernarbung) an der Stelle fördern, wo eine Region der kollabierten Lunge an eine andere klebt. Viele Faktoren können eingeschlossen sein, und jene in den Fibroblasten-Wachstumsfaktor- und transformierenden-Wachstumsfaktor-β-Familien sind bevorzugt. Die Polypeptid-Wachstumsfaktoren, die für Einschluss mit Fibrin-basierenden Zusammensetzungen geeignet sind, schließen all jene (oben beschriebenen) ein, die geeignet sind zum Einschluss mit Fibrinogen-basierenden Zusammensetzungen.
Lösungen, die Komponenten der extrazellulären Matrix einschließen
Wie hierin beschrieben ist ein effektiver Weg zum Erzielen einer sicheren, nicht-chirurgischen Gewebevolumenreduktion die Verwendung von Lösungen, die Agentien enthalten, die mechanisch wirken, nicht nur, um einen Teil eines Gewebes an einen anderen zu kleben, sondern auch biologisch, um Antworten der Zellen innerhalb der Areale, die für die Volumenreduktion angezielt werden, zu modulieren. Daher können die Fibrin- und Fibrinogen-basierenden Lösungen, die oben beschrieben wurden, auch ein oder mehrere Agentien enthalten, die die mechanischen und biologischen Eigenschaften der Lösungen verstärken. Wie oben beschrieben können solche Lösungen verwendet werden, um das Gewebe zu spülen (d.h. auszuwaschen), oder um einen Teil des Gewebes an einen anderen zu kleben.
Geeignete Agentien schließen jene ein, die: (1) Fibroblast- und mononucleare Zell-Chemotaxis und Kollagen-Ablagerung in einer selbst-limitierenden und lokalisieren Weise fördern; (2) die Aktivität von alveolaren Epithelzellen drosseln entweder durch Inhibieren ihrer Fähigkeit, Surfactant zu exprimieren, das das Wiederöffnen von Zielregionen fördert, oder durch Fördern der Epithelzell-Apoptose, die Entzündung bewirkt, (3) Epithelzell-Konstriktion fördern, die den Blutfluss in Zielregionen senkt, und dabei das Ungleichgewicht zwischen Ventilation und Durchfluss und jegliche resultierenden Gasaustausch-Abnormalitäten minimiert. Spezifischer, es können Lösungen, die Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM), Endothelin-1 und/oder pro-apoptotische Reagenzien enthalten, verwendet werden. Geeignete pro-apoptotische Agentien umfassen Proteine in der Bcl-2-Familie (z.B. Bax, Bid, Bik, Bad und Bim und biologisch aktive Fragmente oder Varianten davon), Proteine in der Caspase-Familie (z.B. Caspase-3, Caspase-8, Caspase-9 und biologisch aktive Fragmente oder Varianten davon) und Proteine der Annexin-Familie (z.B. Annexin V oder biologisch aktive Fragmente oder Variante davon). Wie in den Beispielen unten weiter beschrieben, wurden Lösungen, die einige dieser Agentien enthalten, getestet. Die ersten Agentien, die getestet werden sollen, wurden basierend auf deren biologischen Attributen, deren biophysikalischen Effekten auf Gelverhalten, deren Löslichkeit in wässrigen Lösungen (unter physiologischen Bedingungen) und Kosten selektiert. Fachleute werden in der Lage sein, vergleichbare Agentien zu erkennen und zu verwenden, ohne dass unzumutbare Experimentierung notwendig sein wird.
Die Agentien, die für die Verwendung selektiert wurden, waren zuerst Chondroitinsulfat A, Hyaluronsäure mit niedrigem und hohem Molekulargewicht, Fibronectin, mittel- und langkettiges Poly-L-Lysin und das Kollagen-Dipeptid Prolin-Hydroxyprolin.
Chondroitinsulfat (CS) ist eine ECM-Komponente der Glycosaminglykan (GAG)-Familie. Es ist ein sulfatiertes Kohlenhydratpolymer, zusammengesetzt aus wiederholten Disaccharid-Einheiten von Galactosamin, verbunden mit Glucuronsäure über eine beta-1-4 Kohlenstoff-Bindung. CS wird in vivo nicht als eine freie Kohlenhydrat-Einheit gefunden, sondern ist an Kernproteine verschiedener Art gebunden. Als solches ist es eine Komponente von einigen wichtigen ECM-Proteoglycanen, einschließlich Mitgliedern der Syndecan-Familie (Syndecan 1–4), Leucin-reichen Familie (Decortin, Biglycan) und der Hyaluronat-bindenden Familie (CD44, Aggrecan, Versican, Neuroncan). Diese CS-enthaltenden Proteoglycane agieren in der Bindung von Zelloberflächen-Integrinen und Wachstumsfaktoren. CS-enthaltende Proteoglycane können innerhalb der Lunge als Gerüst für Kollagen-Ablagerung durch Fibroblasten agieren. Daher sind ECM-Komponenten innerhalb der Glycosaminoglycan-Familie, besonders Kohlenhydrat-Polymere, nützlich für die Erzielung einer Gewebevolumenreduktion (z.B. bronchoskopisch ausgeführte Lungenvolumenreduktion). Zum Beispiel hat die Zugabe von Chondroitinsulfat A oder C in Konzentrationen im Bereich von 0,05–3,00% einen spezifischen und günstigen Effekt auf sowohl die mechanischen als auch biologischen Eigenschaften von Fibringelen. In ähnlicher Weise können Lösungen, brauchbar zum Waschen und Ankleben von Gewebe, vergleichbare Mengen von einem oder mehreren Proteoglycanen wie Syndecan 1–4, Decortin, Biglycan, CD44, Aggrecan, Versican und Neuroncan enthalten. In einer Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung der Erfindung Ethanol (z.B. 1–20%), Fibrinogen (z.B. 0,01–5,00%), HA (z.B. 0,01-3,00%), FN (z.B. 0,001–0,1%) und CS (z.B. 0,01–1,0%). Zum Beispiel umfasst eine brauchbare Zusammensetzung der Erfindung 10% Ethanol, 0,5% Fibrinogen, 0,3% HA, 0,01 % FN und 0,1 % CS.
Hyaluronsäure (HA) ist wie CS ein Polysaccharid, bestehend aus wiederholten Einheiten von Glucuronsäure und N-Acetylglucosamin, verbunden durch eine beta-1-3-Bindung. Anders als CS und andere GAGs agiert HA jedoch in vivo als ein freies Kohlenhydrat und ist nicht eine Komponente irgendeiner Proteoglycan-Familie. HA ist ein großes poly-anionisches Molekül, das eine Zufallsknäuel-Struktur in Lösung einnimmt, und wegen seiner selbst-aggregierenden Eigenschaften hohe Viskosität an wässrige Lösungen verleiht. Sie fördert sowohl Zellanhaftung als auch – proliferation. Zusätzlich nimmt man von HA an, dass sie Monozyten/Makrophagen-Chemotaxis fördert, und Cytokine und Plasmin-Aktivator-Inhibitor-Sekretion von diesen Zellen stimuliert. Daher sind Polysaccharide, die wiederholte Einheiten von zum Beispiel Glucuronsäure und N-Acetylglucosamin einschließen, nützlich für das Erzielen einer Gewebevolumenreduktion (z.B. bronchoskopisch ausgeführte Lungenvolumenreduktion). Zum Beispiel wird die Zugabe von entweder hoher oder niedriger MW-HA in Konzentrationen im Bereich von 0,05–3,00% einen spezifischen und günstigen Effekt auf sowohl die mechanischen als auch biologischen Eigenschaften von Fibringelen haben.
Fibronectin (Fn) ist ein weit verbreitetes Glycoprotein, das innerhalb der ECM vorhanden ist. Es ist innerhalb von Geweben als ein Heterodimer vorhanden, in dem die Untereinheiten kovalent durch ein Paar von Disulfid-Bindungen nahe dem Carboxyl-Terminus verbunden sind. Fn ist in einige Domänen unterteilt, von denen jede eine ausgeprägte Funktion hat. Die Amino-terminale Region hat Bindungsstellen für Fibrin, Heparin, Faktor XIIIa und Kollagen. Fn hat eine zentrale Zell-Bindungs-Domäne, die durch die Zell-Oberflächen-Integrine von Makrophagen sowie Fibroblasten, Myofibroblasten und undifferenzierten interstitiellen Zellen erkannt wird. Die primäre Funktion von Fn in vivo ist als ein Regulator von Wundheilung, Zellwachstum und Differenzierung. Fn kann die Bindung und Chemotaxis von Fibroblasten fördern. Es kann auch als ein Zellzyklus-Kompetenzfaktor wirken, der Fibroblasten ermöglicht, sich schneller zu replizieren, wenn sie geeigneten ,Progressions-Signalen' ausgesetzt werden. in vitro fördert Fn Fibroblasten-Migration in Plasma-Gerinnsel. Zusätzlich fördert Fn Veränderungen in einem alveolären Zellphänotyp, die in einer Erniedrigung von Surfactant-Expression resultieren. Daher sind Fn-Moleküle, die Gewebekollaps und Narbenbildung fördern, nützlich für die Erzielung von Gewebevolumenreduktion (z.B. bronchoskopisch ausgeführte Lungenvolumenreduktion). Fn-Isoformen, die durch alternative Spleißung hergestellt wurden, sind nützlich, und Zugabe von Lysophosphatidsäure oder einem Salz davon kann zu Fn-enthaltenden Lösungen zugefügt werden, um Fn-Bindung zu verstärken. Zum Beispiel wird die Zugabe eines Fn in einer Konzentration im Bereich von 0,05-3,00% einen spezifischen und günstigen Effekt auf sowohl die mechanischen als auch biologischen Eigenschaften von Fibringelen haben, die zum Beispiel für BLVR verwendet werden.
Poly-L-Lysin (PLL) wird häufig in Zellkultur-Versuchen verwendet, um Zell-Anhaftung an Oberflächen zu fördern, und es ist stark positiv geladen. Trotz seiner großen Größe, löst es sich leicht in der Anwesenheit von anionischen Polysachariden, einschließlich HA und CS. Daher können PLL, HA und CS in Kombination in Lösungen zum Waschen, Destabilisieren und Ankleben eines Teils eines Gewebes an einen anderen verwendet werden. Die unten beschriebenen Studien untersuchen die Möglichkeit, dass PLL in einem Fibrin-Netzwerk, enthaltend langkettige Polysaccharide, ionische Interaktionen erzeugt, die Fibringele elastischer und weniger anfällig für Bruch während wiederholter Streckung machen. PLL kann auch Hydratation und Quellen fördern, sobald Matrizen gebildet sind. Daher ist ein spezieller Vorteil der Verwendung von Lösungen, enthaltend PLL, zur Lungenvolumenreduktion, dass solche Lösungen es noch unwahrscheinlicher machen, dass die resultierenden Matrizen aus dem Luftweg disloziert werden. PLL hat ein Molekulargewicht zwischen 3.000 und 10.000, und kann in Konzentrationen von 0,1 bis 5,0% verwendet werden.
Das Dipeptid Prolin-Hydroxyprolin (PHP) kommt in der Sequenz von interstitiellen Kollagenen (Typ I und Typ III) vor. Kollagen-abstammende Peptide können als Signale zum Fördern von Fibroblast-Einwachsen und Reparatur während des Wundheilungs-Prozesses wirken. Das PHP-Dipeptid ist in Konzentrationen im Bereich von 2,5–10,0 mM gleich effektiv wie Typ I-und Typ II-Kollagen-Fragmente in der Förderung der Fibroblast-Chemotaxis in vitro. Daher sind PHP-Dipeptide nützlich für die Erzielung von Gewebevolumenreduktion (z.B. bronchoskpisch ausgeführte Lungenvolumenreduktion). Zum Beispiel wird die Zugabe von PHP-Dipeptiden in Konzentrationen im Bereich von 0,05–3,00% einen spezifischen und günstigen Effekt auf sowohl die mechanischen als auch die biologischen Eigenschaften von Fibringelen haben.
Die Zugabe von ECM-Komponenten zum Auswaschen von Lösungen und Fibringelen kann Gewebekollaps und Vernarbung durch Modulierung der Aktivität von interstitiellen Fibroblasten und Lungenmakrophagen fördern. Zerreißen von intaktem Epithel tendiert dazu, permanente Atelektase und Vernarbung zu fördern. Daher kann es nützlich sein, das alveolare Epithel Agentien auszusetzen, die Entzündung verursachen und eine „ARDS-ähnliche" Antwort auslösen. Natürlich muss die Verabreichung von solchen Agentien vorsichtig kontrolliert und beobachtet werden, so dass die Menge an Entzündung, die produziert wird, nicht schädlich ist. Alternativ kann Gewebereparatur und Volumenreduktion durch die Zugabe von Agentien erleichtert werden, die Epithelzell-Apoptose, „programmierten Zelltod", ohne extensive Nekrose und Entzündung fördern. Diese Agentien würden einen Verlust der alveolaren Zellfunktion ohne Entzündung verursachen. Ein Weg um eine solche Antwort zu erzeugen, ist durch Verabreichung von Sphingomyelin (SGM), einer Lipid-Komponente, die durch bestimmte Zelltypen aufgenommen wird, und enzymatisch durch Sphingomyelinase und Ceramid-Kinase in Ceramid-1-phosphat, einen Schlüssel-Modulator von programmiertem Zelltod, umgewandelt wird. Es ist auch wahrscheinlich, dass die Verabreichung von SGM Surfactant hemmt, da SGM Anti-Surfactant-Aktivität in vitro hat. SGM könnte in der Anti-Surfactant-Auswasch-Lösung verabreicht werden, wo es spezifisch auf die Epitheloberfläche wirken könnte, um den lokalen Oberflächenfilm zu destabilisieren und Epithelzelltod ohne Entzündung zu verursachen. Lösungen, die nützlich sind zur Reparatur von Luft-Undichtigkeiten in Lungengewebe oder zur Durchführung von BLVR, können SGM enthalten oder eine biologisch aktive Variante davon, in Konzentrationen im Bereich von 0,05–15,00% (z.B. 0,1, 0,5, 1,0, 2,0, 2,5, 5,0, 7,5, 10,0, 12,0, 13,0, 14,0 oder 14,5).
Die Wirksamkeit von BLVR kann auch durch Modulierung der Endothelzell-Antwort verstärkt werden. Zum Beispiel kann transiente Vasokonstriktion durch Einbringen von Epinephrin oder Norepinephrin in die Auswaschlösung erzielt werden. Anhaltende Endothel-Modulation könnte durch Einschluss von einem der Endotheline, einer Familie von Cytokinen, die Vasokonstriktion fördert und als ein profibrotisches Agens wirkt, erzielt werden. Endothelin-1, Endothelin-2 oder Endothelin-3 können allein oder in Kombination verwendet werden. Daher können Lösungen der Erfindung auch eine vasoaktive Substanz wie Endothelin, Epinephrin oder Norepinephrin (in Konzentrationen im Bereich von 0,01–5,00%) oder Kombinationen davon einschließen. Der Vorteil des Einschlusses von einer oder mehreren vasoaktiven Substanzen ist, dass sie bevorzugt die vaskuläre Antwort im Zielgewebe modulieren und dies reduziert im Gegenzug Ventilations-Perfusions-Ungleichgewicht, verbessert Gasaustausch und fördert gleichzeitig Narbenbildung.
Verabreichung von Fibrin-basierenden, Fibrinogen-basierenden und ECM-enthaltenden Zusammensetzungen nach einem Lungenkollaps
Während eine Zielregion der Lunge durch Aussetzen an eine der oben beschriebenen Substanzen kollabiert werden kann, können diese Substanzen auch angewendet werden, um eine Region der Lunge an eine andere zu kleben (und um Fibrose zu fördern), wenn der Kollaps durch andere Mittel induziert wurde. Zum Beispiel können die oben beschriebenen Substanzen, nachdem die Lunge kollabiert ist, durch Blockade des Luftflusses in die oder aus der Zielregion verabreicht werden. Eine solche Blockade kann leicht durch zum Beispiel Insertion eines Bronchoskops in die Trachea eines anästhesierten Patienten, Insertion eines Ballonkatheters durch das Bronchoskop und Aufblasen des Ballons, so dass wenig oder keine Luft in die Zielregion der Lunge übergeht, induziert werden. Ein Kollabieren der verschlossenen Region, nachdem die Lunge mit absorbierbarem Gas gefüllt wurde, würde über ungefähr 5–15 Minuten geschehen, abhängig von der Größe der verschlossenen Region. Alternativ können eine Fibrinogen- oder Fibrin-basierende Lösung (z.B. eine Fibrinogen- oder Fibrin-basierende Lösung, die einen Polypeptid-Wachstumsfaktor enthält), sowie Lösungen, die Komponenten der ECM enthalten (wie jene, die hierin beschrieben sind), ECM-ähnliche Agentien (wie PLL und PHP), vasoaktive Substanzen (d.h. Substanzen, die Vasokonstriktion verursachen) und pro-apoptotische Faktoren (z.B. Proteine in den Bcl-2-, Caspase- und Annexin-Familien) verabreicht werden, nachdem die Lunge einem anderen Typ von Anti-Surfactant (z.B. einem nicht-toxischen Detergens) ausgesetzt worden war.
Natürlich sind die hierin beschriebenen Zusammensetzungen nützlich, nicht nur im Verlauf der Durchführung von BLVR, sondern auch zum Abdichten von Rissen in der Lunge, die durch Traumata oder im Verlauf eines chirurgischen Verfahrens auftreten.
Katheter zur Verabreichung von Material an die Lunge
Bezug nehmend auf 2a, kann jede der oben beschriebenen Lösungen an die Lunge durch einen Ballonkatheter 50 verabreicht werden, der multiple Öffnungen 52 hat, durch die Materialen (wie Lösungen oder Suspensionen) oder Gase (wie Luft) via einer entsprechenden Anzahl von Lumina injiziert werden können.
Die Öffnungen von Kathether 50 sind wie folgt angeordnet. Eine erste Öffnung 54 mit einem proximalen Ende 54a, adaptiert zum Verbinden mit einer Gas-Versorgung (z.B. eine Spritze mit Luer-Verschluss, die Luft enthält), kommuniziert mit innerem Lumen 56 von Katheter 50, das innerhalb des aufblasbaren Ballons 58 nahe der distalen Spitze 60 von Katheter 50 endet. Eine zweite Öffnung 64 mit einem proximalen Ende 64a, adaptiert zur Verbindung mit einer Quelle für ein oder mehrere Materialien (z.B. Medikations-Patrone 80, unten beschrieben), kommuniziert mit innerem Lumen 66, das an der offenen distalen Spitze 60 von Katheter 50 endet. Eine dritte Öffnung 74, mit einem proximalen Ende 74a, adaptiert zur Verbindung mit einer Quelle von einem oder mehreren Materialien (z.B. Medikations-Patrone 80), kommuniziert mit innerem Lumen 76, das auch an der offenen distalen Spitze 60 von Katheter 50 endet.
Daher strömt Gas, das durch Öffnung 54 injiziert wird, durch inneres Lumen 56, um Ballon 58 aufzublasen, und Material, das durch Öffnung 64 und/oder Öffnung 74 injiziert wurde, strömt durch innere Lumina 66 beziehungsweise 76 zur distalen Spitze 60 von Katheter 50. Bei Erreichen der distalen Spitze 60 von Katheter 50 würden Materialen, die vorher innerhalb der Lumina 66 und 76 separiert waren, zusammen gemischt.
Bezug nehmend auf 2b sind inneres Lumen 54, inneres Lumen 64 und inneres Lumen 74 in einer Querschnitts-Ansicht des Schafts 51 von Katheter 50 gezeigt. In einer anderen Ausführungsform können sich Lumina 66 und 76 in der Größe unterscheiden, wobei der Durchmesser des Lumens, durch den die Fibrinogen-basierende Lösung verabreicht wird, ungefähr zwei mal so groß ist wie der Durchmesser des Lumens, durch den die Lösung, enthaltend den Fibrinogen-Aktivator, verabreicht wird.
Bezug nehmend auf 2c kann Patrone 80 an Katheter 50 angehängt werden, um Material durch Öffnungen 64, 74 und Lumina 66, 76 zu injizieren. Patrone 80 schließt eine erste Kammer 82 und eine zweite Kammer 92 ein, wobei jede oder beide Material, das nützlich für BLVR ist, enthalten kann (z.B. kann Kammer 82 eine Mischung von Fibrinogen, TGF-β und Gentamycin enthalten, und Kammer 92 kann Thrombin in einer Calcium-gepufferten Lösung enthalten). Material in Patrone 80 kann an die Lunge durch den Katheter 20, wie folgt, verabreicht werden. Obere Wand 84 von Kammer 82 schließt Öffnung 84a ein, durch die Druck angewendet werden kann, um Ventilkolben 86 hinunter zu drücken. Hinunterdrücken von Ventilkolben 86 zwingt Material in Kammer 82 gegen die untere Wand 88 der Kammer 82, durch Öffnung 88a und, wenn die Patrone 80 an Katheter 50 angehängt ist, in Öffnung 64 von Katheter 50. In ähnlicher Weise schließt die obere Wand 94 von Kammer 92 Öffnung 94a ein, durch die Druck verabreicht werden kann, um Ventilkolben 96 hinunter zu drücken. Hinunterdrücken von Ventilkolben 96 zwingt Material in Kammer 92 gegen die untere Wand 98 von Kammer 92, durch Öffnung 98a und, wenn die Patrone 80 an Katheter 50 angehängt ist, in Öffnung 74 von Katheter 50.
Bezugnehmend auf 2d, kann Patrone 80 in Nische 45 eines Rahmenförmigen Injektors 40 platziert werden, um dem Transfer von Material von Patrone 80 an Katheter 50 zu unterstützen. Injektor 40 schließt die obere Wand 42 ein, die Öffnungen 42a und 42b hat, durch die Arm 44 inseriert wird. Spitze 44a von Arm 44 tritt in Injektor 40 durch Öffnung 42a ein, und Spitze 44b von Arm 44 tritt in Injektor 40 durch Öffnung 42b ein. Wenn Patrone 80 innerhalb von Injektor 40 platziert wird, und Arm 44 nach unten gedrückt wird, werden Spitzen 44a und 44b gegen Ventilkolben 86 beziehungsweise 96 gezwungen, dadurch werden Materialien in Kammern 82 und 92 durch Öffnungen 88a, beziehungsweise 98a von Patrone 80 und Öffnungen 46a beziehungsweise 46b der unteren Wand 46 von Injektor 40 ausgestoßen.
2e zeigt Katheter 50, zusammengesetzt mit Patrone 80, Injektor 40 und einer Luft-gefüllten Spritze 30 mit Luer-Verschluss.
Bezug nehmend auf 13a bis 13c können alle hierin beschriebenen Lösungen an die Lunge durch einen Ballonkatheter 100, mit multiplen Öffnungen 101, durch die Materialien (wie Lösungen oder Suspensionen) oder Gase (wie Luft) durch eine entsprechende Anzahl von Lumina injiziert werden können, verabreicht werden. Katheter 100 zeigt eine duale Hülle zur Abgabe der Zusammensetzungen der Erfindung. Äußere Hülle 102 umschließt inneren Kanal 102a, durch den innere Hülle 110 geführt wird. Äußere Hülle 102 unterstützt Ballon 105. Luft (oder ein anderes Gas oder eine Substanz), die durch proximale Inflationsöffnung 105a injiziert wird, strömt durch Lumen 105b zu Ballon 105, wobei Region 112 verschlossen wird. Wenn innere Hülle 110 im inneren Kanal 102a liegt und Ballon 105 aufgeblasen wird, können dann Zusammensetzungen (z.B. Anti-Surfactant-Lösungen) durch distale Öffnung 111 verabreicht werden, um Region 112 abzudichten. Abgedichtete Region 112 kann einer Lösung (z.B. einem Anti-Surfactant oder einer Auswaschlösung) für eine kurze Zeit (z.B. 60 Sekunden) ausgesetzt werden. Die Lösung kann dann durch distale Öffnung 111 unter kontinuierlichem Saugen entfernt werden. Typischerweise wird für 3–5 Minuten gesaugt. Innere Hülle 110 wird dann durch inneren Kanal 102a der äußeren Hülle 102 geführt. Auf Grund der Tatsache, dass innere Hülle 110 länger ist als äußere Hülle 102, kommt distale Spitze 110a der inneren Hülle 110 tiefer in der abgedichteten Region 112 zu liegen, als distale Spitze 102a der äußeren Hülle 102. Eine Fibrin- oder Fibrinogen-basierende Lösung kann dann durch eine der multiplen Öffnungen 101 verabreicht werden. Alternativ kann eine Fibrin-basierende Lösung durch proximale Öffnung 101a verabreicht werden, und ein polymerisierendes Agens (z.B. Thrombin) kann durch proximale Öffnung 101b verabreicht werden. Ein Vorteil des Duales-Lumen-Kathetersystems, dargestellt in 13a und 13b ist, dass innere Hülle 110 manuell durch inneren Kanal 102a zurück gezogen werden kann, wenn Flüssigkeiten durch proximale Öffnungen 101a und 101b injiziert werden. Daher kann (können) Lösungen) aus den am weitesten entferten Bereichen der distalen Spitze 110a an den Punkt verteilt (d.h. ausgebreitet) werden, wo innere Hülle 110 durch distale Spitze 102a zurück gezogen wird. Wie in 13c gezeigt, einer Querschnitts-Ansicht durch innere Hülle 110 am Punkt A, halten duale Lumina 107 und 108 die durch proximale Öffnungen 101a und 101b injizierten Lösungen getrennt, bis sie durch distale Spitze 110a in abgedichtete Region 112 austreten.
Entsprechend zeigt die Erfindung ein respiratorisches Kathetersystem, das eine äußere Hülle einschließt, die das erste Lumen definiert, die äußere Hülle, einschließlich eines Fixierungs-Mitglieds (z.B. einen Ballon) zum Lokalisieren der äußeren Hülle im Bronchialbaum, und eine innere Hülle, gestaltet, um beweglich im ersten Lumen aufgenommen zu werden, wobei die innere Hülle durch ein Paar von Lumina definiert ist, jedes um eine der ersten und zweiten Komponenten eines Klebstoffs aufzunehmen.
Bezug nehmend auf 14a und 14b kann jede der hierin beschriebenen Lösungen an die Lunge durch einen Dual-Ballonkatheter 120 verabreicht werden, der multiple Öffnungen 121 hat, durch die Materialien (wie Lösungen oder Suspensionen) oder Gase (wie Luft) via einer entsprechenden Anzahl von Lumina injiziert werden können. Katheter 120 zeigt vier Kanäle. Diese Kanäle sind in 14a im Querschnitt gezeigt, aufgenommen am Punkt A von 14b. Kanal 123 verbindet Ballonöffnung 123a mit Ballon 123. Kanal 124 verbindet Ballonöffnung 124a mit distalem Ballon 124b. Kanal 125 verbindet Injektionsöffnung 125a mit distaler Spitze 120b, und Kanal 126 verbindet Injektionsöffnung 126a mit distaler Spitze 120b. Der Vorteil dieses Katheters ist, dass er die Länge der Zeit reduziert, die es zur Durchführung von BLVR braucht, indem es dem Arzt ermöglicht, schneller zu beurteilen, ob distale Spitze 120b eine geeignete Region der Lunge (z.B. eine Region, aus der Luft austritt) erreicht hat. Die Bronchien und Bronchiolen verzweigen sich sehr stark (siehe 1), und es ist wünschenswert, den Katheter so genau wie möglich innerhalb des Bronchialbaums zu platzieren. Typischerweise wird der Arzt durch Beobachten der Bewegung von Luft aus einer Sonde, die vor der BLVR in die Brusthöhle des Patienten platziert wurde, wissen, wenn eine Luft-Undichtigkeit abgedichtet worden ist. Wenn Katheter 120 in einen der Zweige des Bronchialbaums inseriert ist (z.B. durch ein Bronchoskop), und wenn die Luftbewegung durch die Brustsonde stoppt, wenn der proximale Ballon 123b aufgeblasen ist, wird der Arzt wissen, dass die geschädigte Region der Lunge distal von Ballon 123b liegt. Wenn die Luft aus Ballon 123b in der Folge ausgelassen wird, Ballon 124b aufgeblasen wird, und die Luftbewegung durch die Brustsonde stoppt, wird der Arzt wissen, dass distale Spitze 120b auch in der geeigneten Region der Lunge liegt. Wenn jedoch Bewegung durch die Brustsonde fortgesetzt wird (wenn Luft aus Ballon 123b ausgelassen wurde und Ballon 124b aufgeblasen ist), dann wurde distale Spitze 120b nicht in die Region der Lunge vorgeführt, die undicht ist und Reparatur benötigt.
Dementsprechend zeigt die Erfindung ein Respirationskathetersystem, das einen Schaft, definierend vier Lumina, einschließt, wobei die ersten und zweiten Lumina die ersten und zweiten Komponenten eines Klebstoffes erhalten, und sich vom proximalen Ende des Katheters zur distalen Spitze des Katheters erstrecken, und die vierten und fünften Lumina sich vom proximalen Ende des Katheters zu Fixierungs-Mitgliedern (z.B. Ballonen) erstrecken, die entlang der Hülle des Katheters positioniert sind, wobei ein Fixierungs-Mitglied näher an der distalen Spitze des Katheters positioniert ist als das andere.
Die bevorzugten Verfahren, Materialen und Beispiele, die jetzt beschrieben werden, sind nur illustrativ, und sollen nicht limitierend sein; Materialien und Verfahren, ähnlich oder gleich jenen, die hierin beschrieben werden, können in der Praxis oder Testen der Erfindung verwendet werden.
Beispiel 1: BLVR in einer isolierten Kälberlunge
Isolierte Kälberlungen sind exzellente Modelle für BLVR, weil mal leicht mit ihnen arbeiten kann, und sie anatomisch ähnlich zu menschlichen Lungen sind. Kälberlungen, die eine Gesamtlungenkapazität von 4–5 Litern haben, wurden vom Arena and Sons'-Schlachthof (Hopkinton, MA) gekauft, und auf Eis innerhalb von 3 Stunden nach Gewinnung in das Labor geliefert. Die Lungen wurden tracheal mit einem #22-Sonden-Verbinder kannuliert und mit einer Ringklammer so aufgehängt, dass die Zwerchfell-Oberfläche in einer großen Teflonschüssel, enthaltend 2–3 mm von Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), liegt. Die viszerale Pleuraoberfläche wurde durch Besprühen mit einem Nebel von 0,15 M NaCl in regelmäßigen Intervallen feucht gehalten. Pleura-Undichtheiten wurden durch Auftreten von Blasen auf der Pleuraoberfläche und durch Bestimmen der Fähigkeit der Lunge, einen konstanten Druck von 20 cm H₂O-Aufblasdruck zu halten, identifiziert. Undichtigkeiten wurden durch autologe Strebe-Fältelung abgedichtet. Jegliche nachteilig betroffenen Sektionen der Lungen wurden aufgerollt und in einer Weise geklammert, die ähnlich ist zu der, die bei LVRS in Menschen verwendet wird (Swanson et al., J. Am. Coll. Surg. 185:25–32, 1997).
Absolute Lungenvolumina werden durch Gasverdünnung unter Verwendung von Stickstoff als das Aufspürgas gemessen (Conrad et al., Pulmonary Function Testing – Principles and Practice, Churchill Livingston Publishers, New York, NY, 1984). Messungen wurden bei 0 cm H₂O transpulmonarem Druck wie folgt durchgeführt. Eine Drei-Liter Spritze wurde mit 1,5 Litern 100%igem Sauerstoff aus einem Reservoirbeutel gefüllt. Die isolierte Lunge, enthaltend ein unbekanntes Volumen von Raumluft (79% Stickstoff), wurde dann in Reihe mit der Spritze, enthaltend 0% Stickstoff, durch ein Dreiwegeventil verbunden. Das Gas wurde durch 60–100-maliges Niederdrücken des Stempels der Spritze gut gemischt, und die Gleichgewichtskonzentration von Stickstoff wurde dann unter Verwendung eines Stickstoff-Meters (Medtronics, Modell 830 Nitrogen-Meter) bestimmt. Das unbekannte Startlungenvolumen von Raumluft wurde dann gemäß der folgender Massen-Erhaltungsgleichung berechnet: VL = {FN2f/(0,79–Fn2f} · 1,5 Lwobei F_N2f die Fraktion an Stickstoff ist, die bei Fließgleichgewicht nach dem Mischen mit 1,5 Litern von Sauerstoff aus der Spritze gemessen wurde. Diese Messung definiert das einzelne absolute Lungenvolumen, das benötigt wird, um statische Lungenmechanik zu charakterisieren.
Quasi-statische Deflations-Druck-Volumen-Kurven (QSPVC) wurden dann während stufenweiser Deflation von 20 cm H₂O zu 0 cm H₂O transpulmonaren Druck wie folgt aufgezeichnet. Lungen wurden mit Luft bis 20 cm H₂O transpulmonarem Druck gefüllt, und die Trachea wurde dann manuell verschlossen. Transpulmonarer Druck wurde unter Verwendung eines 50 cm H₂O-Druck-Umwandlers, der an der Luftwegöffnung positioniert wurde, aufgezeichnet. Ausgestoßenes Lungenvolumen wurde unter Verwendung eines Pneumotachographen (Hans Rudolf Inc, Kansas City, MO), verbunden in Serie mit der trachealen Sonde, gemessen. Druck als eine Funktion von ausgestoßenem Lungenvolumen (Bezug genommen auf das Startvolumen bei 20 cm H₂O) wurde durch periodisches Verschließen der Trachea bestimmt. Verschlüsse wurden lange genug aufrecht erhalten, um Equilibrierung von trachealen und alveolaren Drücken zu ermöglichen (keine Veränderung des trachealen Druckes über drei Sekunden). Durch Kombination der einzelnen absoluten Lungenvolumen-Messung, durchgeführt durch Stickstoff-Verdünnung bei Null-transpulmonarem-Druck mit QSPVC-Daten, wurden komplette statische Zusammenziehungs-Druck-Volumen-Verhältnisse bestimmt. Diese Verhältnisse können als eine Exponentialfunktion gemäß der Gleichung von Salazar et al. (J. Appl. Physiol. 19:97–104, 1964) beschrieben werden: V(P) = Vmax – Ae–kP wobei V das Lungenvolumen als eine Funktion von transpulmonarem Druck ist; P der transpulmonare Druck ist; V_max das extrapolierte Lungenvolumen bei unendlichem Druck (ungefähr gleich zu TLC) ist; A die Differenz zwischen V_max und dem Volumen an Gas, das in der Lunge bei Null-transpulmonarem Druck (ungefähr gleich der Vital-Kapazität) gefangen bleibt, ist; und k der Formfaktor ist, der die Kurvatur des exponentiellen Verhältnisses zwischen Druck und Volumen, unabhängig vom absoluten Volumen der Lunge, beschreibt. Die Parameter V_max, A und k wurden aus einer Ausgleichs-Linear-Regressionsanalyse bestimmt, und Zusammenziehungs-Druck bei totaler Lungenkapazität (PTLC) durch direkte Messung bestimmt.
Es ist nützlich, das Druck-Volumen-Verhältnis in Ausdrücken der oben beschriebenen Parameter auszudrücken, da von jedem Parameter bekannt ist, dass er sich in einer charakteristischen Weise im Emphysem verändert. Daher kann man spezifische Veränderungen nach Eingriffen erwarten, die gestaltet sind, um entweder ein Emphysem zu produzieren (z.B. Papain-Exposition im Tiermodell), oder die Abnormalitäten eines Emphysems zu korrigieren (z.B. Volumenreduktion; siehe Gibson et al., Am. Rev. Resp. Dis. 120:799–811, 1979). Zum Beispiel erhöht sich V_max in einem Emphysem auf Grund der Lungen-Hyperexpansion (das reflektiert eine Steigerung der totalen Lungen-Kapazität); k, der Form-Faktor erhöht sich auch auf Grund einer Reduzierung des Abfalls des Druck-Volumen-Verhältnisses bei niedrigen Lungevolumina; und A, die Differenz zwischen maximalem Lungenvolumen und zurückgehaltenem Lungengas bei Null-transpulmonarem-Druck, sinkt, weil zurückgehaltenes Gas unverhältnismäßig zu der totalen Lungen-Kapazität steigt. Diese Abnormalitäten werden sich in Folge einer effektiven Lungenvolumenreduktion verbessern.
Nach der Komplettierung von Lungenvolumen- und QSPVC-Messungen, wurde die Lungenfunktion während einer simulierten periodischen Atmung festgestellt. Ein solar-angetriebenes, Computer-kontrolliertes pneumatisches Beatmungsgerät wurde zu diesem Zweck entwickelt. Diese Vorrichtung ermöglicht Messungen von Lungenwiderstand und dynamischer Elastanz während oszillierender Beatmung, während der Beobachtung und Beibehaltung eines konstanten Benutzer-festgelegten mittleren Luftweg-Druckes. Strömung (V) in und aus der Lunge wurde unter Verwendung eines Pneumotachometers gemessen, Volumen (V) wurde durch Integration des Strömungssignals bestimmt, und transpulmonarer Druck (Ptp) wurde als Luftwegöffnungsdruck, im Bezug auf den atmosphärischen Druck, aufgezeichnet.
Das Strömungsmuster, das zum Messen der Lungenfunktion gewählt wurde, war eine optimales Ventilations-Wellenform (OVW)-Muster, entwickelt von Lutchen et al. (J. Appl. Physiol. 75:478–488, 1993). Dieses Muster stellt die Summe einer Serie von Sinusoiden dar, ausgewählt um periodische Atmung zu liefern, während simultan die Signal-Verzerrung auf Grund von nicht-linearen Effekten des Respirationssystems minimiert wird (Suki et al., J. Appl. Physiol. 79(2):660–671, 1995). Lungenfunktion wurde durch Bestimmung der Impedanz, des Verhältnisses von Druck, der die Frequenz-Domäne fließen soll, durch Fourier-Analyse festgestellt. Die realen und imaginären Teile des Impedanz-Signals repräsentieren Lungenwiderstand, beziehungsweise Lungenreaktanz. Lungenwiderstand ist im Gegenzug gleich der Summe des Gewebewiderstandes (R_ti) und Luftwegwiderstandes (R_aw), während Lungenreaktanz durch eine Kombination von Elastanz und Gas-Trägheits-Effekten bestimmt wird. Daher ermöglichen OVW-Messungen im Gegensatz zu Standard-sinusoidal- oder konstanter Fluss-Ventilation die Bestimmung des Luftwegwiderstandes, Gewebewiderstandes und der dynamischen Elastanz (Edyn) über einen Bereich von Frequenzen aus einer einzelnen Messung. Diese detaillierte Information ist aus mehreren Gründen nützlich. Volumenreduktion ist ein Verfahren, das das Potential hat, alle drei dieser Lungenfunktionsparameter zu beeinflussen. Bei einem Emphysem sollte Volumenreduktion R_aw durch Verbesserung der Luftwegsanbindung reduzieren, dadurch Luftwege offen strecken. Da Volumenreduktion Gewebestreckung erhöht, wird sie dennoch dazu tendieren, Gewebewiderstand zu erhöhen. Totaler Lungenwiderstand, die Summe aus R_aw und R_ti kann daher unterschiedlich beeinflusst werden, abhängig davon, wie LVR individuell R_aw und R_ti beeinflusst. In den meisten Fällen sollte es einen optimalen Bereich von Geweberesektion geben, der eine wesentliche Verminderung in R_aw, aber nur einen kleinen Anstieg in R_ti hervorrufen kann. Die OVW-Vorgehensweise hilft, dieses Optimum zu definieren. Ein zusätzlicher Vorzug der OVW-Vorgehensweise ist, dass sie eine nicht-invasive Feststellung einer Lungenfunktions-Heterogenität liefert. Die Anwesenheit einer Heterogenität, die physiologisch eine positive Frequenzabhängigkeit in der Lungen-Elastanz erzeugt, kann durch die OVW-Methode bestimmt werden (Lutchen et al., J. Appl. Physiol. 75:478–488, 1993). In der normalen Lunge ist die Elastanz relativ Frequenz-unabhängig, da die meisten Regionen ähnliche mechanische Eigenschaften aufweisen, was zu gleichmäßiger Gasflussverteilung führt. In einer kranken Lunge existieren regionale Unterschiede in der Impedanz zum Gasfluss, und die Elastanz steigt mit steigender Frequenz. In einem Emphysem ist Frequenz-Abhängigkeit der Elastanz ein charakteristisches Merkmal und reflektiert regionale Unterschiede in der Schwere der Krankheit. Eine erfolgreiche Volumenreduktion, die eine erkrankte Region anzielt, sollte Heterogenität und Frequenzabhängigkeit der Elastanz reduzieren. Daher kann Reduktion der Frequenzabhängigkeit der Elastanz als ein Index für ein erfolgreiches BLVR-Verfahren verwendet werden, und kann leicht aus der OVW-Messung bestimmt werden. Es wird erwartet, dass jede Messung, die unmittelbar nach BLVR gemacht wird, die Verbesserung unterschätzen würde, die deutlich wird, sobald sich eine reife Narbe gebildet hat. Zu dieser Zeit konnte eine 25–50%ige Verbesserung in expiratorischen Strömungsraten beobachtet werden. Daher liegt jegliche Fibrin- oder Fibrinogen-basierende Zusammensetzung, die oben beschrieben wurde, im Schutzbereich der Erfindung, wenn sie eine 25-50%ige Verbesserung der expiratorischen Strömungsraten erzeugt, wenn sie gemäß einem BLVR-Verfahren angewendet wird.
Messungen von Lungenvolumina, quasi-statischen Druck-Volumen-Verhältnissen und Lungenwiderstand und dynamischer Elastanz als Funktionen der Frequenz wurden in drei isolierten, nativen Kälberlungen vor und nach Fältelungs-Volumenreduktion bestimmt. Dynamische Aufzeichnungen wurden bei 9–10 cm H₂O durchschnittlichem transpulmonaren Dehnungsdruck (PEEP = 5 cm H₂O) durch das OVW-Verfahren bei Atemvolumina von 10% der gemessenen V_max gemacht. Vorhandene kleine Undichtigkeiten in Folge der Fältelung wurden mit Cyanoacrylat-Klebstoff abgedichtet. Die geschätzte Zeit zwischen ursprünglichen und post-Reduktions-Aufzeichnungen betrug zwischen 60 und 90 Minuten.
Lungenphysiologie-Aufzeichnungen vor und nach Volumenreduktion in der isolierten Kälberlunge sind unten in Tabelle 1 zusammengefasst.
Diese Ergebnisse zeigen an, dass in normalen Kälberlungen eine 10–15%ige Volumenreduktion (Mittelwert: 11,1 %) keine signifikante Änderung in dynamischer Elastanz, Luftwegwiderstand oder Gewebewiderstand hervorruft. Sie zeigen weiter, dass detaillierte Funktion in isolierten Lungen unter Verwendung des hierin beschriebenen Messungssystems gemessen werden kann, und dass erfolgreiche Fältelungs-Volumenreduktion an isolierten Lungen, die als Kontrollen für BLVR-Versuche dienen, durchgeführt werden kann.
Beispiel 2: Fibrinogen-basierende Anti-Surfactants
Mechanisches Gleichgewicht bei den Alveolen und kleinen Luftwegen wird bestimmt durch einen Ausgleich zwischen Dehnungskräften, die durch transpulmonaren Gasdruck nach außen drückend ausgeübt werden, und Zusammenziehungskräften, die ausgeübt werden durch parenchymale Gewebestrukturen und den Oberflächenfilm, der die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche überzieht, wobei beide nach innen ziehen und einen Lungenkollaps fördern. Damit die Alveolen und kleinen Luftwege während normaler Atmung offenliegend bleiben, müssen Destabilisierungskraft-Störungen durch intrinsische Stabilisierungskräfte ausgeglichen werden. Die Tendenz der Lunge, Destabilisierung und Atelektase zu widerstehen, kann durch zwei biomechanische Eigenschaften ausgedrückt werden: das Kompressionsmodul (K) und das Schermodul (p). Der Wert von K ist proportional zu der Fähigkeit der Lunge, Distorsion zu widerstehen, die aus Kräften resultiert, die senkrecht (oder normal) auf eine Region eines Gewebes wirken (Martinez et al., Am. J. Resp. Crit. Care Med. 155:1984–1990, 1997), und der Wert p ist proportional zu der Fähigkeit der Lunge, Distorsionen, verursacht durch Scherkräfte, die auf eine Region eines Gewebes wirken, zu widerstehen (Stamenovic, Physiol. Rev. 70:1117-1134, 1990). Je größer die Werte von K und p, desto größer die Tendenz der intrinsischen Kräfte innerhalb der Lunge, externen Störungen und Atelektasen zu widerstehen. Umgekehrt tendieren jegliche Faktoren, die K und p erniedrigen, dazu, alveoläre Instabilität und Kollaps, resultierend in Atelektase, zu fördern. Die Werte der Scher- und Kompressionsmodule sind abhängig von sowohl Gewebe- als auch Oberflächenfilm-Eigenschaften und können quantitativ ausgedrückt werden als (Stamenovic, Physiol. Rev. 70:1117–1134, 1990): K = 1/3{(B–2)·Ptis} + 1/3{(3b–1)·Pγ} μ = (0,4 + 0,1 B)·Ptis + 0,4·Pγ wobei B eine normalisierte Elastanz für die Gewebekomponenten (Elastin, Kollagen und interstitielle Zellen) der Lunge ist; P_tis der Zusammenziehungsdruck von Gewebekomponenten in der Abwesenheit von Oberflächenfilm-Zusammenziehung ist; b eine normalisierte Elastanz für den Oberflächenfilm an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche ist; und P_γ der Zusammenziehungsdruck des Oberflächenfilms in der Abwesenheit von Gewebe-Zusammenziehung ist. In der gesunden Lunge stellen Oberflächenkräfte zwei Drittel bis drei Viertel der Lungenzusammenziehung dar, und daher ist der Beitrag der P_γ-Bedingungen an den Kompressions- und Schermodule vorwiegend verantwortlich für die Bestimmung der Stabilität. In einem Emphysem, wo Gewebe-Elemente zerstört sind und weniger Zusammenziehung ausgeübt wird, ist die Rolle der Oberflächenkräfte zur Bestimmung der parenchymalen Stabilität von noch größerer Wichtigkeit.
Das primäre Ziel dieser Versuche war, ein biokompatibles Reagens zu entwickeln, das bronchoskopisch instilliert werden könnte, um ortsspezifische Veränderungen des Oberflächenfilm-Verhaltens hervorzurufen, so dass alveolare Instabilität und Kollaps gefördert werden (d.h. ein Anti-Surfactant zu entwickeln). Dies kann erzielt werden, wenn der Flüssigkeitsfilm, der Alveolen und kleine Luftwege auskleidet, einer Reduktion der Kompressions- oder Schermodule als eine Folge einer chemischen Modifikation unterzogen wird. Im Wesentlichen erfordert dies eine Lösung, die die Oberflächenspannungs-erniedrigenden Eigenschaften eines nativen Lungensurtactants ohne Erzeugung anderer unerwünschter Effekte verändert. Aus biomedizinischer Sicht ist der charakteristische Parameter des Oberflächenfilms, der sehr leicht durch solche externe, chemische Manipulation beeinflusst werden kann, der dimensionslose Filmelastanz-Parameter b, der gleich b'·(δγ/δA)(V/A) ist, wobei γ die Oberflächenspannung des Films ist; A das Areal der Oberfläche ist, über das der Film ausgebreitet ist, und b' eine Proportionalitäts-Konstante ist, die abhängig von der Geometrie der gefragten Region variiert. Für normales Lungensurfactant (δγ/δA)(V/A) (definiert als b* = b/b') setzt man Werte von ungefähr 100–110 voraus. Wenn b innerhalb einer gegebenen Region sinkt (d.h. δγ/δA wird kleiner oder γ wird größer), wirken die lokalen Oberflächenkräfte mehr, die Alveolen zu destabilisieren als zu stabilisieren. Daher tendieren Filme mit niedriger Elastanz (relativ flache Oberflächenspannung gegen Oberflächenareal-Profilen) oder erhöhte Oberflächenspannungen dazu, Destabilisierung zu fördern.
Beispiele von stabilen und unstabilen Oberflächenfilmen, die diese Verhaltensmuster zeigen, sind in 3a und 3b gezeigt. 3a zeigt ein Oberflächenspannungs-Obertlächenareal-Profil, gemessen durch pulsierende Blasen-Surfactometrie (PBS), für normales Surfactant bei einer Konzentration von 1 mg/ml, isoliert aus der Lunge eines normalen Meerschweinchens. Es zeigt sowohl eine positive Filmelastanz (δγ/δA > 0) als auch eine niedrige minimale Oberflächenspannung (γ_min < 3 dyne/cm). Solch ein Film besitzt positive Werte für die biophysikalischen Parameter b, K und p, und würde daher Stabilität in vivo fördern. Im Gegensatz zu normalem Surfactant zeigt eine Probe, die von einem Tier mit akuter Lungenverletzung und Atelektase in Folge einer Endotoxin-Infusion isoliert wurde, beinahe Null Elastanz und eine erhöhte minimale Oberflächenspannung (3b). Dieser Film hat eine Kompressionsmodul von weniger als Null, und würde daher alveoläre Instabilität und Kollaps fördern. Während diese biophysikalischen Eigenschaften schädlich sind bei einer akuten Lungenverletzung, ist die Fähigkeit, solche Eigenschaften auf einen Film in einer kontrollierten Weise zu verleihen, offensichtlich wünschenswert für die Durchführung der vorliegenden Versuche.
Weil die oben beobachtete Dysfunktion in vivo vorkommt, wird die Charakterisierung biochemischer Veränderungen des Surfactants, die diese Dysfunktion begleiten, biokompatible Reagenzien nahe legen, die nützlich sind für BLVR. Surfactant-Proben, die von Tieren isoliert wurden, die mit Lipopolysacharid (LPS) behandelt wurden, sind zu einem großen Teil dysfunktionell, als eine Folge von Veränderungen der Grenzflächen-Eigenschaften auf Grund der Mischung mit Serumproteinen, die in das alveolare Kompartiment über die geschädigte Basalmembran eingedrungen sind (Kennedy et al., Exp. Lung Res. 23:171–189, 1997).
Um festzustellen, ob Fibrinogen-Lösungen zu nativem Surfactant hinzugefügt werden könnten, um signifikante Oberflächenfilm-Dysfunktion zu erzeugen, wurde Kälber-Surfactant durch Auswaschen und Zentrifugation von Kälberlungen isoliert, die frisch von einem lokalen Schlachthof zur Verfügung gestellt wurden. Rinder-Fibrinogen wurde kommerziell gekauft (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Vorrats-Lösungen von jedem Reagenz wurden in normaler Kochsalzlösung hergestellt, und in mg-Anteilen (Fibrinogen zu Surfactant-Phospholipid-Gehalt) von 0,1:1, 5,0:1, 1,0:1, 0,5:1 und 10,0:1 gemischt. Die Ergebnisse wurden mit Mischungen von Kälberlungen-Surfactant und Rinderserumalbumin verglichen.
Oberflächenspannungs-Aufzeichungen wurden durch pulsierende Blasen-Surfactometrie bei 37°C, Oszillationsfrequenz von 20 Zyklen/min und Areal-Amplituden-Anteil von 72% kontinuierlich für 5 Minuten gemacht (Enhorning, J. Appl. Physiol. 43:198–203, 1977). Basierend auf Messungen der Oberflächenspannung gegen Oberflächen-Areal wurden die Werte für den Film-Stabilitäts-Parameter (γδ/δA)/(A/γ) bestimmt und als eine Funktion von Protein- zu Phospholipid-Konzentrations-Verhältnis ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in 4a und 4b zusammengefasst. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Fibrinogen ein potenterer Inhibitor der Surfactant-Funktion ist als Albumin, und in der Lage ist, eine erhebliche Oberflächenfilm-Instabilität hervorzurufen (ausgedrückt in dem Filmstabilitäts-Kriterium b*, bei Protein- zu Lipid-Konzentrations-Verhältnissen von weniger als 5:1). Diese Konzentrations-Verhältnisse sind in vivo unter Verwendung konzentrierter Fibrinogen-Lösungen leicht erzielbar.
Um Fibrinogen-Lösungen in isolierten Kälberlungen zu testen, wurden Vorrats-Lösungen von Rinder-Fibrinogen (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in 5 mM Tris-HCl (pH 7,4) und teilweise aufgereinigtem Thrombin in 5 mM Tris-HCl, enthaltend 5 mM CaCl₂, hergestellt. Mischungs-Untersuchungen zeigten, dass Verhältnisse von Fibrinogen zu Thrombin von zwischen 10:1 und 3:1 (mg:mg) in Polymerisation innerhalb von 3–5 Minuten resultierten. Ein Verhältnis von 10:1 wurde zum Testen einer ganzen Lunge selektiert. Isolierte Kälberlungen wurden kannuliert, an einer Ringklammer aufgehängt und Grundlinien-Lungenvolumen- und QSPVC-Messungen, wie oben beschrieben, unterzogen. Bei Null-transpulmonarem Druck unter direkter bronchoskopischer Betrachtung wurde das Bronchoskop in ein distales Subsegment, ungefähr 5 mm im Durchmesser, festgeklammert. Die entgegengesetzte Oberfläche wurde dann mit 50 ml einer Fibrinogen-Lösung (10 mg/ml), injiziert durch einen P-240 Polypropylen-Katheter, der durch die Ansaugöffnung eingeführt wurde, ausgewaschen. Die Fibrinogen-Lösung wurde mit einigen Tropfen konzentriertem Evans-Blau gefärbt, um eine leichte Identifikation der Zielregion zu ermöglichen. Der Katheter wurde dann entfernt, und Sog wurde direkt durch die Ansaugöffnung des Gebiets angewendet, um den Spülungsprozess zu komplettieren. Spülungs-Wiedergewinnung war durchschnittlich 28 ml in den 4 durchgeführten Spülprozessen (56% Wiedergewinnung). Der Katheter wurde dann wieder in die betroffene Region eingebracht, und 4 ml Thrombin in Calcium-enthaltendem Puffer wurden instilliert. Ein zweiter Spülungs- und Polymerisations-Vorgang wurde dann in einem unterschiedlichen Subsegment durchgeführt. Wiederholte Lungenvolumen- und quasi-statische Druck-Volumen-Profile wurden dann aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Diese Daten zeigen an, dass sogar ohne den Zusatz von Faktor XIIIa, zur Förderung der Gerinnungs-Stabilisierung Reduzierungen im Lungenvolumen erzielt wurden, die signifikant das zurückgehaltene Volumen der Polymerisationslösung überstiegen, was darauf hinweist, dass ein anhaltender Kollaps erzielt wurde.
Beispiel 3: Fibrinogen- und Fibrin-basierende Lösungen, enthaltend Wachstumsfaktoren
Jegliches potentielle Anti-Surfactant kann in dem oben beschriebenen Test bewertet werden, der gezeigt hat, dass Fibrinogen-Lösungen viele der Eigenschaften besitzen, die für ein Anti-Surfactant erwünscht sind. Zusätzlich zu der oben beschriebenen Fibrinogen-Lösung, kann man Lösungen verwenden, die zusätzliche Charakteristika an Zusammensetzungen vermitteln, die verwendet werden können, um BLVR in vivo durchzuführen. Zum Beispiel kann die Fibrinogen-Lösung modifiziert werden, um Fibroblasten-Wachstum zu unterstützen und um als ein Reservoir für Antibiotika zu dienen. Jegliche modifizierte Fibrinogen-Lösung kann in Verbindung mit Faktoren verwendet werden, die Fibrose fördern, solange das Fibrinogen die Fähigkeit beibehält, Surfactant zu hemmen, und polymerisiert werden kann.
Basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) und/oder transformierender Wachstumsfaktor-beta (TGFβ) können zu Lösungen von Fibrinogen hinzugefügt werden, das kann auch eine antibiotische Mischung von Ampicillin und Gentamycin, die in Mengen zugefügt werden kann, die ausreichen, um die minimale Hemmkonzentration für die meisten Bakterien zu übersteigen.
In vitro-Studien können durchgeführt werden, um geeignete Konzentrationen von Faktor XIIIa relativ zu Fibrinogen und Thrombin zu bestimmen, und um abzuschätzen, wie Wachstumsfaktoren und Antibiotika diesen finalen Vernetzungs-Schritt beeinflussen. Die Oberflächenspannung von Surfactant-Fibrinogen-Mischungen kann in vitro unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen pulsierenden Blasen-Surfactometer (PBS)-Einheit gemessen werden. Messungen der Oberflächenspannung als Funktion des Oberflächenareals können bei 37°C, einer Oszillationsfrequenz von 20 Zyklen/min und einer relativen Oberflächen-Areal-Änderung, die sich der von periodischer Atmung annähert (δA/A = 20–30%), durchgeführt werden.
Gleichgewichts- und dynamische Oberflächenspannungs-Aufzeichnungen können auch gemacht werden. Aufzeichnungen können bei 30 Sekunden, 5 Minuten und 15 Minuten durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass jede Oberflächenfilm-Dysfunktion, die zu Beginn beobachtet wurde, während der Mess-Periode anhält. Die Stabilität von jeder Film-Präparation kann als b*, der oben beschriebenen dimensionslosen Film-Elastanz (δγ/dA·A/γ), beschrieben werden, normalisiert zu b*-Werten, die für natives Kälberlungen-Surfactant gemessen wurden. Mischungen, die normalisierte b*-Werte von < 0,2 zeigen, wären akzeptabel für zusätzliche Tests als Anti-Surfactants.
Kälberlungen-Surfactant kann aus ganzen Kälberlungen isoliert werden, wie kürzlich beschrieben (Kennedy et al., Exp. Lung Res. 23:171–189, 1997), und Rinder-Fibrinogen, bFGF, Faktor XIIIa-Transglutaminase und TGFβ können von kommerziellen Vertreibern gekauft werden (z.B. Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).
Oberflächenspannungsverhalten für Proben mit Fibrinogen:Surfactant-Verhältnissen im Bereich von 0,01 bis 10 (mg Protein:mg Lipid) können in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (0,15 M, pH 7,3) hergestellt werden. Die folgenden sechs Mischungen wurden gewählt, weil sie repräsentativ sind für Mischungen, die in vivo nützlich sein können, und sie enthalten Komponenten von teilweise polymerisiertem Fibrin, das in der Lunge während der Vorgangs der Polymerisation vorhanden sein kann. Daher repräsentieren sie das Verhalten von teilweise polymerisierten Mischungen in vivo und können bewertet werden, um festzustellen, ob sich die Fähigkeit von Fibrinogen, Surfactant-Funktionen zu hemmen, ändert, während es polymerisiert wird.
Test-Mischungen umfassen Surfactant (1 mg/ml) mit geeigneten Mengen von: (1) Fibrinmonomer allein; (2) Fibrinmonomer mit FGF und TGFβ; (3) Fibrinmonomer mit FGF, TGFβ, Ampicillin und Gentamycin; (4) Fibrinogen mit FGF und TGFβ; (5) Fibrinogen mit FGF, TGFβ, Ampicillin und Gentamycin; und (6) Fibrinogen mit FGF, TGFβ, Ampicillin, Gentamycin und Thrombin. Aufzeichnungen werden abgebrochen für die Proben, die während der Oberflächenfilm-Messungen polymerisieren (wodurch Messungen von γ vs. A unmöglich werden), und die Zeit für die Polymerisation wird notiert.
Gerinnselstabilität kann in vitro an Antibiotika und Wachstumsfaktoren enthaltenden Lösungen von Surfactant-Fibrinogen-Mischungen getestet werden, die anhaltende Abnormalitäten der Grenzflächen-Eigenschaften durch PBS-Messungen zeigen. Faktor XIIIa kann zu diesen Proben zugefügt werden, um Gerinnsel-Vernetzung zu fördern. Gerinnselstabilität bei einigen Konzentrationen von zugefügtem Faktor XIIIa kann durch Testen auf Gerinnsel-Auflösung in 8 M Harnstoff (Plasma-Gerinnsel-Lysezeit) untersucht werden.
Sowohl Fibrinmonomere als auch Fibrinogen sollten signifikante Änderungen des Oberflächenfilm-Verhaltens (normalisierte b*-Werte < 0,2) bei Protein:Phospholipid-Verhältnissen > 4 bewirken. Darüber hinaus sollte die Zugabe von Thrombin, Antibiotika oder Wachstumsfaktoren die Fähigkeit von Fibrin-Verbindungen nicht merklich ändern, Surfactant-Funktion bei den Konzentrationen zu hemmen, die für diese Reagenzien nötig sind, um in vivo zu funktionieren. Wenn diese Zusätze die Biophysik der Interaktion zwischen Surfactant und Fibrinogen/Fibrin merklich ändern, können einfach alternative Reagenzien (oder alternative Reagenzkonzentrationen) in Betracht gezogen werden.
Ein stabiler Langzeit-Zustand von Atelektase mit Vernarbung innerhalb der Zielregion ist nötig, um folgende teilweise oder komplette Wiederausdehnung nach BLVR vorzubeugen. Dieser Zustand kann durch Verwendung eines Biopolymers erzielt werden, das Einwachsen von Fibroblasten aus benachbarten Regionen innerhalb der Lunge fördert, und Ablagerung von extrazellulären Matrix (ECM)-Verbindungen bewirkt. Die unten beschriebenen Verfahren können verwendet werden, um die Fähigkeit von Fibrinpolymeren, die variierende Konzentrationen von Wachstumsfaktoren enthalten, zur Stimulation von Fibroblast-Einwachsen zu untersuchen. Spezifischer, sie können verwendet werden, um die Fähigkeit von Polymeren mit variierenden Konzentrationen von Wachstumsfaktoren zu untersuchen, sowohl anfängliche Zell-Anhaftung als auch folgendes Wachstum zu fördern.
Zellkultur-Platten sind mit einer Mischung von Fibrinogen, Antibiotika, FGF (sowohl mit als auch ohne TGFβ) beschichtet, und die Mischung wird durch Zugabe einer kleinen Menge von Thrombin polymerisiert. Die Platten werden dann mit sterilem Eagle's minimal-essentiellem Medium gewaschen, um überschüssige Reagenzien und Thrombin zu entfernen, und durch Aussetzen einer Ultraviolett-Bestrahlung über Nacht sterilisiert. Zu Beginn werden sechs Arten von Platten untersucht: die erste und zweite sind mit Fibrinpolymer, Antibiotika und FGF in entweder niedriger oder hoher Konzentration beschichtet; die dritte und vierte sind mit Fibrinpolymer, Antibiotika und TGFβ in entweder niedriger oder hoher Konzentration beschichtet; und die fünfte und sechste sind in ähnlicher Weise beschichtet, aber enhalten beide Wachstumsfaktoren in entweder niedrigen oder hohen Konzentrationen.
Stamm IMR-90 (menschliche diploide Fibroblasten, erhältlich von der American Type Culture Collection, Manassas, VA) wird in minimal essentiellem Gewebekultur-Medium, enthaltend 10% fetales Kälberserum, gezüchtet. Zellen werden nach der anfänglichen Plattierung zu 80% Konfluenz gebracht, dann geerntet und zwei mal in Serum-freies Medium (MCDB-104, Gibco 82-5006EA, Grand Island, NY) übergeführt. Etablierte Kulturen werden dann auf beschichtete Platten mit sechs Vertiefungen in einer anfänglichen Dichte von 10⁴ Zellen/ml sub-kultiviert. Anhaftungs-Effizienz (AE) für jede Beschichtungs-Mischung wird 4 Stunden nach der Plattierung durch Entfernen des überschüssigen Mediums, Spülen der Vertiefungen mit Kultur-freiem Medium und Fixierung jeder Vertiefung mit 70% Ethanol von histologischem Grad (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) beurteilt. Die Vertiefungen werden mit Giemsa gefärbt, und die durchschnittliche Anzahl von anhaftenden Zellen pro Hochleistungs-Feld (hpf) wird durch Lichtmikroskopie bestimmt. Zwanzig Felder pro Vertiefung werden in einer Blind-Studie beurteilt. Der Durchschnitt von sechs Vertiefungen pro Beschichtung wird berechnet, um die finale Zählung zu bestimmen, und die Ergebnisse werden mit jenen von Kontroll-Proben, die auf Gewebekultur-Plastik plattiert wurden, verglichen. Anhaftungs-Effizienz wird als ein Index (AEI) ausgedrückt, der gleich ist zu dem Verhältnis der Anzahl von Zellen/hpf in Versuchsproben zu der Anzahl von Zellen/hpf in Kontrollproben. Zellwachstum auf jeder der sechs Biopolymer-Mischungen wird durch Bestimmen der Gesamtzahl von Zellen, die 48 Stunden nach Plattierung vorhanden sind, beurteilt. Zellwachstum wird als Wachstums-Effizienz-Index (GEI) ausgedrückt, der gleich ist der Gesamtzahl von Zellen nach 48 Stunden für jede Probe, normalisiert zu der Gesamtzahl von Zellen nach 48 Stunden Wachstum auf Gewebekultur-Plastik. Zellen werden durch Entfernen des Mediums aus jeder Vertiefung und Spülen der Vertiefung mit Calcium/Magnesium-freier Hank's Lösung geerntet und gezählt. Das Medium wird für Zell-Resuspension aufgehoben. Ein ml einer 0,2%igen Trypsin-Lösung wird in jede Vertiefung gegeben, und die Zellen werden für 2 Minuten inkubiert. Trypsin wird dann entfernt, und die anhaftenden Zellen von der Platte unter Verwendung des vorher geernteten Mediums, das weitere Trypsin-Aktivität hemmt, gewaschen. Das Ausmaß von verbleibender Zell-Anhaftung wird durch direkte Betrachtung unter Verwendung eines inversen Mikroskops beurteilt. Verbleibende anhaftende Zellen werden durch einen zweiten Trypsin-Waschschritt entfernt, und die Gesamtzahl der Zellen wird unter Verwendung eines Hämozytometers erhalten.
Zellanhaftung an ein Fibrinpolymer sollte equivalent oder besser sein als die auf Gewebekultur-Plastik beobachtete. Wenn Zellanhaftung bei Verwendung von Fibrin alleine schwach ist, wird das Fibrinogen mit 3–5% Fibronectin gemischt und polymerisiert. Fibronectin hat Fibrin-Bindungsstellen an beiden seinen Amino- und Carboxyl-Termini, mit einer zentralen Zellbindungs-Domäne, die durch die meisten anhaftenden Zellen, die β1-Integrine exprimieren, erkannt wird. Zusatz von Fibrinogen sollte in verbesserter Zell-Anhaftung resultieren.
GEI sollte auch erhöht sein in Präparationen, enthaltend bFGF in niedrigen und hohen Konzentrationen, aber kann erniedrigt sein in Präparationen, enthaltend TGFβ, auf Grund der unterdrückenden Effekte von TGFβ auf die Zellproliferation. Es sollte durch Verwendung einer Kombination von bFGF und TGFβ dennoch möglich sein, jegliche unterdrückenden Effekte, die bei Verwendung von TGFβ beobachtet werden, zu überwinden. Diese Kombination hat das Potential, sowohl zelluläres Einwachsen zu fördern, als auch Kollagen- und Fibronectin-Ablagerung mit Narbenbildung zu erhöhen. Wenn bFGF nicht in der Lage ist, die anti-proliferativen Effekte von TGFβ zu überwinden, kann Blutplättchen-abstammender Wachstumfaktor (PDGF) verwendet werden.
Beispiel 4: Ein Schaf-Modell für Emphyseme
Arbeit an lebenden Tieren kann helfen, die Effektivität, Sicherheit und Dauerhaftigkeit von BLVR zu etablieren. Das hier beschriebene Schaf-Modell für Emphyseme zeigt viele der physiologischen, histologischen und radiographischen Eigenschaften von Emphysemen. In Voruntersuchungen wurden sechs erwachsene Schafe (mit Gewichten von 27–41 kg) mit inhaliertem, zerstäubten Papain, einer kommerziell erhältlichen Mischung von Elastase und Kollagenase, behandelt, verabreicht durch eine Maul-Maske unter Verwendung von zwei Hochfluss Zerstäuber-Systemen, die parallel verbunden wurden. Das System erzeugt Partikel von 1–5 Mikron im Durchmesser. Jedes Tier erhielt 7000 Einheiten des Enzyms in physiologischer Kochsalzlösung über einen Zeitraum von 90 Minuten bei 0,3 ml/min. Ungefähr 30–40% der gesamten Dosis, die in dieser Weise verabreicht wurde, wurde im alveolaren Bereich abgelagert. Ein Tier, das physiologische Kochsalzlösung entsprechend einem ähnlichen Protokoll erhielt, diente als Kontrolle.
Alle Tiere wurden detaillieren Messungen der Lungenfunktion vor und in monatlichen Intervallen nach den Inhalations-Behandlungen unterzogen. Die Post-Behandlungs-Beurteilung wurde für 3 Monate weitergeführt. Aufzeichnungen wurden nach der Verabreichung einer Anästhesie während kontrollierter Ventilation gemacht. Transpulmonarer Druck wurde unter Verwendung eines Druck-Umwandlers aufgezeichnet, der den Druckunterschied zwischen der Luftweg-Öffnung und dem intrathorakalen Druck, gemessen unter Verwendung eines Ösophagus-Ballons, aufzeichnete. Ein- und Ausströmen am Maul wurde unter Verwendung eines Pneumotachographen, angehängt and das proximale Ende der endotrachealen Sonde, gemessen. Messungen des Lungenwiderstands, statischer Lungen-Compliance und dynamischer Lungen-Compliance wurden durchgeführt. Nach 3 Monaten wurden alle Tiere getötet, und Lungenschnitte wurden für histopathologische Beurteilungen angefertigt.
Die Ergebnisse von statischer und dynamischer Lungen-Compliance, gemessen vor dem Ausgesetztsein gegen Papain und 3 Monate nach der Papain-Behandlung sind in 5a und 5b zusammengefasst. Die statische Lungen-Compliance stieg signifikant von 0,13 ± 0,02 auf 0,18 ± 0,03 L/cm H₂O (p = 0,012, n = 6), was auf Krankheits-Heterogenität und Gaseinschluss hinweist.
Physiologische Änderungen, korreliert mit einer semi-quantitativen Beurteilung von Emphysemen wurden auch histologisch beurteilt. In einer Blind-Studie wurden acht Schnitte (einer pro Lappen) von jedem Tier wie folgt bewertet: 0 = kein Emphysem; 1 = mildes Emphysem; 2 = moderates Emphysem; 3 = schweres Emphysem. Eine gesamte Bewertung wurde als der Durchschnitt von acht Schnitten, die von jedem Tier hergestellt wurden, bestimmt. Der Gesamt-Lungenwiderstand tendierte dazu, mit dem Emphysem-Schweregrad zu steigen, obwohl diese Korrelation auf Grund des Auftretens eines Ausreißers und der kleinen Anzahl von untersuchten Tieren nicht statistisch signifikant war. Die dynamische Compliance korrelierte umgekehrt mit dem Emphysem-Schweregrad in signifikanter Weise (6a und 6b).
Beispiel 5: In vivo-Anwendung von BLVR
Die Induktion von Emphysem in Schafen, wie oben beschrieben, liefert ein exzellentes Modell, um darin sowohl die Sicherheit als auch die Wirksamkeit von BLVR zu testen. In den unten beschriebenen Studien wurden acht Schafe, die Emphyseme hatten, analysiert; vier erhielten keine Behandlung, und vier wurden mit BLVR behandelt. Messungen wurden durchgeführt: (1) an der Grundlinie vor dem Verabreichung von Papain; (2) acht Wochen nach der Papain-Verabreichung (zu der Zeit hatten alle Tiere ein Emphyem entwickelt) und; (3) sechs Wochen nach entweder Schein-Bronchoskopie ohne Lungenvolumenreduktion (Kontrolle) oder BLVR, durchgeführt mit einer Fibrinogen-basierenden Zusammensetzung (Versuch). Spezifischer, die Versuchstiere wurden mit einer Fibrinogen-basierenden Lösung, enthaltend 5% Fibrinogen, das in der Folge mit 1000 Einheiten Thrombin in einer 5 mM Calcium-Lösung polymerisiert wurde, behandelt.
Alle Tiere zeigten ein physiologisches Anzeichen von Emphysem mit erhöhtem Lungenwiderstand, erhöhter dynamischer Elastanz, erhöhten totalen Lungenvolumina und Veränderungen in statischen Druck-Volumen-Verhältnissen, die konsistent sind mit mildem bis moderatem Emphysem. Daher verursachte die Papain-Therapie, verabreicht mittels Zerstäuber, wie oben beschrieben, ein Emphysem.
Nach sechs Wochen hatten Tiere mit Papain-induzierem Emphysem, die keine Therapie erhielten, persistente Steigerung des Lungenwiderstand (125% bei normaler Atmungsfrequenz, verglichen mit der Grundlinie vor der Behandlung) und der dynamische Elastanz (31 % bei normaler Atmungsfrequenz, verglichen mit der Grundlinie vor der Behandlung). Statisches Lungenverhalten blieb merklich abnormal verglichen mit der Grundlinie, mit Lungenvolumen, die 33% stiegen, verglichen mit der Grundlinie vor der Behandlung. Diese Ergebnisse sind unten in Tabelle 3 zusammengefasst und in 7 gezeigt.
Im Gegensatz dazu erfuhren Tiere, behandelt mit BLVR, nach sechs Wochen eine signifikante Reduktion des Luftwegswiderstands, des totalen Lungenwiderstands bei normaler Atemfrequenz, der totalen Lungenkapazität und des Ruhe-Lungenvolumens. Diese Ergebnisse, die in Tabelle 4 zusammengefasst sind, weisen auf eine signifikante Verbesserung der Lungenphysiologie, verglichen zu prä-Volumenreduktion, und eine signifikante Verbesserung relativ zu unbehandelten Tieren hin.
Darüber hinaus tolerierten alle mit BLVR behandelten Tiere das Verfahren gut. Sie waren fähig, innerhalb von einer Stunde nach Komplettierung des Verfahrens ohne Ventilator-Unterstützung zu atmen, und alle Tiere aßen und tranken normal innerhalb von 24 Stunden. Eines von vier Tieren entwickelte ein Fieber, das zwei Tage andauerte und erfolgreich mit fünftägiger intramuskulärer Antibiotika-Therapie bewältigt wurde. Es wurden keine anderen Komplikationen festgestellt. Daher war die physiologische Antwort auf BLVR sehr positiv.
Beispiel 6: Der Effekt von ECM-Komponenten auf die Eigenschaften von Fibrin-Gelen
Die Effekte von CS, HA, Fn und PLL auf: die mechanischen Eigenschaften von Lösungen, die Gewebekollaps oder Gewebeanhaftung fördern; die Rate, mit der Lösungen polymerisieren; und die Fähigkeit von solchen Lösungen, Fibroblasten-Wachstum zu unterstützen, wurden untersucht. Um die mechanischen Eigenschaften zu charakterisieren, wurden zirkuläre Gels in Zellkulturschalen mit 12 Vertiefungen gebildet, Gel-Streifen (4×4×10 mm) wurden unter Verwendung einer Rasierklinge ausgeschnitten, und die elastischen (H) und dissipativen Module (G) der Streifen wurden gemessen, während sie unter Verwendung eines servo-kontrollierten, computerisieren Längen-Aktuator-Systems und gekoppelten Kraft-Umwandler-Instruments gestreckt wurden. Zusätzlich wurde die Streckspannung (Y_S) für jede Präparation gemessen, um Stärke und Dauerhaftigkeit unter Bedingungen einer uniaxialen Streckung zu beurteilen, und Ermüdung wurde mit einer Lösung, enthaltend CS und PLL, gemessen (siehe unten). Diese Lösung wies wünschenswerte mechanische Eigenschaften auf. Polymerisationsraten (k_P) wurden unter Verwendung einer Stoppuhr geschätzt und als der Reziprokwert der Menge an Zeit definiert, die nötig ist, um die Rotation eines kleinen, magnetischen Mixstabes in der Lösung bei 4π Radianten/Sekunde zur der Zeit, als die Polymerisation eingeleitet wurde, zu hemmen. Zellkultur-Studien wurden durch wachsende Fibroblasten (WS-1 transformierte menschliche Fibroblasten-Zell-Linie) auf vorgeformten Gelen, sowie in Gelen, polymerisiert nach Mischung der Fibrinogen-Reagenzien mit frischen Zell-Suspensionen, durchgeführt. Um die Zellproliferation zu beurteilen, wurde die Zahl von Zellen, die pro 10 Hochleistungs-Feldern gezählt wurde, nach Plattieren in einer uniformen Zellkonzentration gezählt, und der MTT-Zellproliferations-Test wurde durchgeführt.
Alle getesteten ECM-Komponenten waren in Fibrinogen, aufgelöst in gepufferter Kochsalzlösung bei pH 7,4, löslich, obwohl die Lösung Aufwärmen benötigte, um HA aufzulösen. Fibrin-Gele wurden unter Verwendung von wässrigem Rinder-Fibrinogen (Fraktion VII, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in einer Endkonzentration von 3%, 2,5 mM CaCl₂ und 0,025 mM Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) hergestellt. Calcium- und DPPC-Konzentrationen wurden im Vorversuch, durchgeführt, um Polymerisationsraten von Fibrinogen zu optimieren, bestimmt. Polymerisation wurde unter Verwendung von Thrombin in 100 Einheiten/ml einer Fibrinogen-Lösung (3,3 Einheiten von Thrombin/mg Fibrinogen) bewirkt. CS, PLL und HA wurden bei 0,01, 0,1 und 0,3 Gewichts-% (relativ zu Fibrinogen) getestet. Fn wurde bei 0,001 und 0,01 % getestet. Ergebnisse wurden mit Fibrin-Gelen ohne Zusätze und mit kommerziell erhältlichem Fibrin-Kleber, vermarktet als ein Gewebe-Dichtungsmittel (Baxter Pharmaceutical, Tisseal^TM), verglichen. Proben wurden innerhalb von 30 Minuten von der Gel-Bildung und 24, 48 und 168 Stunden nach der Gel-Bildung getestet, während es in wässriger Lösung bei Raumtemperatur gehalten wurde.
Die Effekte vom Zusatz extrazellulärer Matrix-Komponenten zu Fibrin-Gelen auf mechanische Eigenschaften sind in 8a und 8b zusammengefasst.
Der Zusatz von Niedrig-Molekulargewichts-HA senkte k_P (verlangsamte Polymerisation) signifikant, während CS, PLL und Fn keinen Effekt auf Polymerisationsraten hatten. Der Zusatz von CS (in 0,1 und 0,3%) und PLL (0,05%) erhöhte die Gel-Elastanz (H) etwa 55%, beziehungsweise 50%, während die Zugabe von HA keinen Effekt hatte. Änderungen im dissipativen Verhalten (G) der Gel-Streifen verliefen nahezu parallel zum elastischen Verhalten, so dass das Verhältnis von dissipativen zu elastischen Modulen, eta (η = G/H) relativ konstant blieb für alle Präparationen (im Bereich von η 0,1 bis 0,15 für alle Proben). Gel-Streckspannung wurde merklich verbessert durch Zugabe von 0,05% PLL, aber wurde nicht signifikant durch Zugabe anderer Komponenten beeinflusst.
Polymerisationsraten und mechanische Eigenschaften von Fibrin-Gelen, enthaltend einzelne Zusätze, wurden verwendet, um Gel-Kombinationen zu entwickeln, die Agentien enthielten, über die theoretisiert wurde, dass sie Makrophagen- und Fibroblasten-Chemotaxis und Kollagen-Ablagerung fördern. Eine finale Gelkombination, enthaltend 0,1 % CS, 0,1 % PLL, 0,1 % HA und 0,01 % Fn polymerisierte schnell, behielt seine mechanischen Eigenschaften nach einer Woche in Salzlösung, widerstand Zerreißung während wiederholter Streckung und Verformung. Darüber hinaus waren dies Eigenschaften von Agentien, die das Verhalten von Zellen in dem Bereich des Gewebekollaps modulieren.
9 fasst Tests über die Ermüdung zusammen, in denen ein Standard-Fibringel mit einem Fibringel, enthaltend 0,05% PLL und 0,1 % CS, verglichen wurde. Das modifizierte Fibringel zeigt eine höhere Streckspannung und einer größere Fähigkeit, Ermüdungs-bedingte Defekten zu widerstehen, wenn es während wiederholtem sinusoidalen Durchlaufen über einen Bereich einer Belastungs-Amplitude getestet wurde. Wie in 9 gezeigt, zeigten Gelstreifen, zusammengesetzt aus Fibrin allein, dehnbare Ruptur bei viel niedrigeren Prozent-Belastungen als eine Fibrinlösung, enthaltend PLL und CS. Die ,unbegrenzte' Lebensdauer der modifizierten Fibrin-Klebstoff-Präparation, repräsentiert durch die Prozent-Belastung unten, wo kein Defekt vorkommt, ist signifikant größer (32% Belastung) als die von Standard-Fibrin-Klebstoff (10% Belastung).
Fibringel-Präparationen wurden auch auf deren Fähigkeit getestet, Fibroblasten-Wachstum nicht nur auf deren Oberfläche, sondern auch innerhalb der Polymer-Mischung zum Zeitpunkt der Polymerisation zu unterstützen. Zellproliferation wurde durch Zählen der Anzahl von Zellen in 10 Hochleistungs-Feldern und durch Durchführung eines MTT (3, 4, 5, Dimethyl-thiazol-2-yl-2,5, diphenyltetrazolium-bromid)-Farbstoff-Proliferations-Tests beurteilt. Tests wurden 96 Stunden nach Kultur-Beginn bei einer anfänglichen Plattierungs-Dichte von 2 × 10⁶ Zellen/Vertiefung durchgeführt. Tests wurden unter Verwendung menschlicher WS-1 Fibroblasten, sowie 3T3 Maus-Fibroblasten, erhalten von der American Type Cell Culture Collection (ATCC; Manassas, VA), durchgeführt. Zählungen wurden zu jenen normalisiert, die auf Standard-Gewebekultur-Plastik gemessen wurden. Die Ergebnisse, die durch die zwei Tests (Zell-Zählung und MTT) erhalten wurden, waren ähnlich (10a und 10b). Verglichen mit Wachstum auf Gewebekultur-Plastik war die Zellproliferation für sowohl WS-1 als auch 3T3 beschleunigt gewachsen, wenn sie auf Fibringels gezogen wurden. CS (0,1 % und 0,3%), Fn (0,001 und 0,01 %) und HA (0,1 und 0,3%) hatten keinen zusätzlichen Effekt auf Zellwachstums-Raten über dem für Fibringele alleine beobachteten (10a, linkes Feld). Umgekehrt hatte keiner dieser Zusätze einen nachteiligen Effekt auf die Zellproliferation. Studien an Gelen (10b) zeigten, dass sowohl CS (0,1%) als auch Fn (0,01 %) Fibroblastenproliferation relativ zu Fibringelen ohne Zusätze und relativ zu jenen, die HA enthalten, fördert. Die Kombination von CS und Fn hatte den dramatischsten Effekt. Histomikrographien von WS-1-Fibroblasten in Gelen zeigten, dass CS und Fn zusammen Fibroblastenproliferation und organotypische Organisation fördern. Daher fördert die Zugabe von dieser Kombination von ECM-Komponenten sowohl Fibroblastenproliferation als auch zelluläre Organisation in linearen und vernetzten Anordnungen, was ein organotypisches Wachstumsmuster nahelegt. Daher fördern Fibringele, enthaltend CS (0,1 %) und Fn (0,01 %) Fibroblastenproliferation und organotypische Organisation und Wachstumsmuster. PLL verbessert signifikant die mechanischen Eigenschaften von Fibringelen durch Erhöhung der Elastizität und Widerstandskraft gegen Bruch. Da HA Polymerisationsraten verlangsamt, ohne die mechanischen Eigenschaften von Fibrin-basierenden Gelen deutlich zu verbessern oder Makrophagen-Chemotaxis in vitro zu fördern, kann HA ein besserer Zusatz für die ,Anti-Surfactant'-Auswasch-Lösung sein, als der Fibrin-Klebstoff selbst. Unten gezeigte in vivo Studien unterstützen diese Schlussfolgerung.
Beispiel 7: ,Lebende' Biopolymere
Die oben beschriebenen Studien, die zeigen, dass Lungenfibroblasten in modifizierten Fibringelen gezüchtet werden können, weisen darauf hin, dass Gele, enthaltend Zellen, die vom Zielgewebe eines Patienten, einem anderen der Gewebe des Patienten, einem unterschiedlichen Menschen (z.B. einem Verwandten oder einem Organspender) oder einem Fetus (z.B. fetales Lungengewebe) geerntet wurden, verwendet werden können, um gezielte Lungenvolumenreduktion zu erzielen. Daher könnten für einen menschlichen Patienten mit Emphysem Fibroblasten, geerntet von einer Hautbiopsie, die in vitro spezifischen Wachstumsfaktoren ausgesetzt und an die Lunge unter Verwendung der Fibrin-basierenden Klebstoffe der Erfindung (die die oben beschriebenen Agentien, wie Komponenten der ECM enthalten können oder nicht) verabreicht wurden, verwendet werden, um effektiv Gewebevolumenreduktion zu erzielen und punktförmige Vernarbung zu fördern. Der Typ von Zellen, die verwendet werden, kann abhängig von dem Ziel, das erreicht werden soll, variieren. Zum Beispiel könnte eine Kombination der eigenen Lungenzellen des Patienten und Stammzellen (vielleicht von fetalem Gewebe erhalten) verwendet werden, um Lungenvolumen zu reduzieren und das Wachstum oder Wiederwachsen von pulmonarem Geweben zu fördern.
Beispiel 8: In vivo-Studien unter Verwendung von Fibrin-basierenden Lösungen, enthaltend
Viele der hierin beschriebenen Lösungen wurden auf Sicherheit, Biokompatibilität und Nützlichkeit für die Lungenvolumenreduktion in intakten Tieren getestet. Sicherheit und Biokompatibilität wurden in Schafen getestet, die keine Lungenkrankheit hatten (d.h. die Schafe wurden nicht Papain ausgesetzt, das einen Zustand ähnlich dem Emphysem hervorruft). Die Grundlinien-Lungenfunktion des Tieres (einschließlich Lungenvolumina und statische Druck-Volumen-Aufblähungs-Kurven) wurde zum Zeitpunkt Null (d.h. vor der Behandlung) und während den Wochen nach der Behandlung gemessen. Alle Tiere wurden mit Ketamin und Valium anästhesiert, und wurden mit intravenösem Propofol gehalten. Ein Ösophagus-Ballon wurde platziert, um intrathorakalen Druck zu messen. Tiere wurden während der Mess-Perioden mechanisch beatmet. Zwischen den Tests wurden die Tiere in ihre Käfige zurück gebracht, und es wurde ihnen erlaubt, ohne Einschränkung zu essen und zu trinken.
Die oben beschriebenen Ganz-Tier-Versuche wurden wie folgt modifiziert. Zuvor wurden 50 ml Fibrin-Klebstoff verwendet, um jede subsegmentale Zielregion abzudichten, aber in der vorliegenden Studie wurden nur 10 ml Fibrin-Lösung in jeder Region verwendet (der Fokus lag mehr auf der Biologie als auf Biomechanik, und das Ziel war, Abszess-Bildung zu limitieren). Salzlösungs-Auswaschung kombiniert mit unmodifiziertem Fibrin-Klebstoff (n = 2) wurde verglichen mit einer modifizierten Auswasch-Lösung (10% Ethanol, 0,5% Fibrinogen, 0,3% Nieder-Molekulargewichts-Hyaluronsäure und 0,01 % Fibronectin), kombiniert mit einem Fibrin-Klebstoff, enthaltend 0,1 % CS, 0,1 % PLL und 0,05% HA (n = 4). Die Ergebnisse sind in 11 zusammengefasst, wo das Verhältnis zwischen Druck und Volumen gemäß der exponentiellen Anpassungs-Gleichung nach Salazaar und Knowles ausgedrückt wird: V(P) = Vmax – (Vmax–Vmin)e–kp wo V_max = totale Lungenkapazität bei maximalem Dehnungsdruck; V_min = Rest-Lungenvolumen bei Null-Dehnungsdruck; und k ist der Form-Faktor, beschreibend die Form des exponentiellen Verhältnisses zwischen Druck und Volumen. Vergleiche von V_max, V_min und k vor und nach Behandlung für Salzlösung- + Fibrinklebstoff-behandelte Tiere und modifizierte Auswasch- + modifizierte Klebstoff-behandelte Tiere sind gezeigt. Bei Salzlösung- + Fibrinklebstoff-behandelten Tieren wurden keine Unterschiede in maximalen Lungenvolumina (V_max = 3,6±0,28 L vor zu 3,49±0,62 L nach), minimalen Lungenvolumina (V_min = 1,22±0,18 L vor zu 1,28±0,21 L nach) oder Form-Faktor (k = 0,19±0,02 vor zu 0,19±0,05 nach) festgestellt. Bei Tieren, die mit Auswasch-Lösungen und Klebstoff wie oben beschrieben behandelt wurden, um Fibroblasten-Wachstum, Chemotaxis und Kollagen-Ablagerung zu fördern, wurden Verminderungen in V_max (3,61±0,31 L vor zu 3,15±0,22 L nach; p=0,11 durch gepaarten T-Test) und V_min (1,69±0,31 L vor zu 1,22±0,23 L nach; p=0,007) bemerkt, aber k (0,14±0,02 vor zu 0,15±0,04 nach) blieb unverändert.
Beispiele von individuellen quasi-statischen Druck-Volumen-Verhältnissen eines Salzlösungs-Auswasch- + Fibrin-Tieres und eines modifizierten Auswasch- + modifizierten Klebstoff-Tieres sind in 12a und 12b gezeigt. Tiere, die mit Salzlösung + Fibrin-Klebstoff alleine behandelt wurden, zeigten keine Verminderung der Lungenvolumina als ein Ergebnis der Therapie. Im Gegensatz dazu zeigten Tiere, behandelt mit modifiziertem Auswasch + Klebstoff eine merkliche Reduktion sowohl in V_max als auch in V_min und eine Verschiebung nach unten und rechts im gesamten Druck-Volumen-Verhältnis, was auf eine allgemeine Verminderung im Lungenvolumen hinweist. Im Gegensatz zu der Studie, in der alle Tiere, die mit 50 ml Fibrinklebstoff behandelt wurden, nach dem Verfahren Sauerstoff benötigten, und 2 von 4 Tieren Antibiotika gegen Fieber benötigten, benötigte keines der Tiere in entweder den Salzlösungs- oder den modifizierten Auswasch- + Klebstoff-Behandlungsgruppen Sauerstoff oder Antibiotika. Darüber hinaus zeigten Autopsie-Studien an behandelten Lungen keinen Hinweis auf Abszessbildung.
Diese Daten weisen darauf hin, dass die hierin beschriebenen modifizierten Surfactant-Auswasch-Lösungen und Fibrin-Klebstoffe verwendet werden können, um sichere und effektive Volumenreduktionstherapie zu erzielen. Sie unterstützen die Studien, die zeigen, dass effektive Gewebereduktionstherapie in der Lunge ohne Chirurgie unter Verwendung biokompatibler Klebstoffe erzielt werden kann, und etablieren auch die Realisierbarkeit von Vorgehensweisen, die Agentien verwenden, die spezifische Aspekte der Biologie von Lungenfibroblasten, alveolären Zellen, Makrophagen und Endothelzellen modulieren.
Beispiel 9: Modifizierte Fibrin-basierende Klebstoffe können Luft-Undichtigkeiten in der Lunge abdichten
Die Untersuchungen, die folgen, zeigen, dass die Lösungen der Erfindung effektiv Luft-Undichtigkeiten in der Lunge abdichten können. Die mechanischen Eigenschaften der hierin beschriebenen Lösungen sind überlegen gegenüber anderen Fibrin-basierenden Präparationen und ermöglichen den neuen Lösungen der vorliegenden Erfindung, Bruch während wiederholter Verformung zu widerstehen (9). Patienten, die sich Brustkorb-Chirurgie unterziehen, werden von der Verwendung von modifizierten Fibrin-basierenden Klebstoffen zum Abdichten von Luft-Undichtigkeiten profitieren. Brustkorb-Chirurgie ist häufig. Mehr als eine Viertelmillion Patienten unterziehen sich jedes Jahr dieser Art von Chirurgie, auf Grund von zum Beispiel Resektion von Lungen-Knötchen und Krebsen, Resektion von Gewebe zur Bestätigung einer Diagnose einer unbekannten Lungenerkrankung und Resektion von chronischen Infektionen, die refraktär sind gegenüber konventionellen medizinischen Therapien. Weil Lungengewebe empfindlich ist, sind Undichtigkeiten, resultierend von Gewebezerreißung in Folge von Chirurgie häufig. Das berichteten Auftreten liegt bei 25–40%. Risse in der Lunge erfordern lange Heilungsperioden, besonders bei Patienten mit schwerer zu Grunde liegender Lungenkrankheit, und verlängerte Luft-Undichtigkeiten tragen signifikant zur Morbidität und Mortalität bei.
Die Verabreichung der hierin beschriebenen Fibrin-Klebstoffe, besonders jener, die modifiziert sind, um Komponenten der ECM einzuschließen, kann entweder als Primär-Therapie zum Vorbeugen von Undichtigkeiten bei allgemeinen Thorax-Chirurgie-Fällen, oder sekundär zum Abdichten von existierenden oder persistierenden Undichtigkeiten, ob sie von vor der Chirurgie oder intrinsischer Krankheit ausgegangen sind, angewendet werden.
Die undichte Region kann mit einem dualen Ballon-Finder-Injektionskatheter-System (14a und 14b) identifiziert werden. Sobald eine Region identifiziert und isoliert worden ist, können Lösungen distal injiziert werden, um Abdichtung zu bewirken. Diese Lösungen können identisch sein zu jenen, die zum Bewirken von Volumenreduktion verwendet werden, da die gleichen Polymerisations-, Biokompatibilitäts-, mechanischen und biologischen Charakteristika in beiden Fällen erwünscht sind.
Studien wurden an isolierten Kälberlungen unter Verwendung des dualen Ballon-Finder-Injektors und modifizierten Fibrin-Klebstoffen durchgeführt, um pleurale Undichtigkeiten zu identifizieren, lokalisieren und abzudichten. Wie oben beschrieben und in 8a, 8b und 9 gezeigt, stärkt die Zugabe von biokompatiblen Polymeren innerhalb von Fibrin-Matrizen merklich das resultierende Gelpolymer, und reduziert Gelfraktur während zyklischer Ermüdung (die Luftweg-bedingten Stress simuliert). Diese Präparationen sind signifikant stärker und dauerhafter in vitro als konventionelle Fibrin-Klebstoffe. Die Modifikationen, die nötig sind, um die mechanische Stärke der Klebstoffe zu erhöhen, beeinflusste die Polymerisationsraten der Gele nicht ungünstig. Daher ist eine akkurate und zeitgerechte Abgabe erhalten.
In drei separat isolierten Rinderlungen-Versuchen dichteten diese Klebstoffe 13 von 17 Luft-Undichtigkeiten nach der Verabreichung durch das Finder-Injektor-Katheter-System vollkommen ab. Die Undichtigkeiten wurden bis zu Dehnungsdrucken von 50 cm H₂O abgedichtet. Klebstoff-Verabreichung reduzierte den Grad der Undichtigkeit in allen Fällen, was durch eine Senkung des Flusses durch die Undichtigkeit bei einem fixierten Dehnungsdruck (von 50 cm H₂O) beurteilt wurde.
Andere Ausführungsformen
Während die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung im besonderen geeignet sind für die Anwendung bei Menschen, können sie allgemein verwendet werden, um jedes Säugetier zu behandeln (z.B. Nutztiere wie Pferde, Rinder und Schweine und Haustiere wie Hunde und Katzen).
Zusätzlich können die oben beschriebenen Zusammensetzungen brauchbar an einer Vielzahl von Geweben anders als die Lunge angewendet werden. Zum Beispiel können sie angewendet werden, um Undichtigkeiten von cerebrospinaler Flüssigkeit abzudichten; um Anastomosen von nativen und prosthetischen vaskulären Transplantaten (einschließlich jenen in Verbindung mit der Implantation von prosthetischen Klappen wie den Mitral-Klappen) abzudichten; in diagnostischen oder vermittelnden Verfahren oder endoskopischen oder orthopädischen Verfahren, einschließlich gewollter oder unbeabsichtigter Punktion einer Gefäßwand; in plastischer Chirurgie; und in hoch-vaskularisiertem Gewebeschnitt (z.B. Nieren, Leber und Milz). Die oben beschriebenen Zusammensetzungen können auch angewendet werden, um Heilung bei Diabetikern zu beschleunigen, und um septische Wunden mit langanhaltende Resistenz gegen Standard-Vorgehensweisen, einschließlich Antibiotika-resistente bakterielle Infektionen, zu behandeln.

Claims

Verwendung einer physiologisch akzeptablen Zusammensetzung, umfassend Fibrin, Fibrinmonomer oder Fibrinogen und einen Fibrinogenaktivator zur Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung beim Ankleben eines Teils einer kollabierten Lungenregion an einen anderen im Laufe eines nicht operativen Lungenvolumenreduktionsverfahrens.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung 3–12 % Fibrinogen umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Zusammensetzung 10 % Fibrinogen umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung Fibrin oder ein Fibrinmonomer umfasst.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei das Fibrinmonomer ein Fibrin-I-Monomer, ein Fibrin-II-Monomer, ein des-BB-Fibrinmonomer oder eine Mischung oder Kombination davon ist.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Zusammensetzung ferner Hyaluronsäure (HA) umfasst.
Physiologisch akzeptable Zusammensetzung, umfassend Chondroitinsulfat (CS), Fibronektin (Fn), Poly-L-Lysin oder ein Peptid, bestehend aus Prolin und Hydroxyprolin, und a. Fibrinogen oder b. ein Fibrinmonomer oder c. einen Fibrinogenaktivator.
Physiologisch akzeptable Zusammensetzung, umfassend eine vasoaktive Substanz und a. Fibrinogen oder b. ein Fibrinmonomer oder c. einen Fibrinogenaktivator.
Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei die vasoaktive Substanz Endothelin, Epinephrin oder Norepinephrin ist.
Physiologisch akzeptable Zusammensetzung, umfassend ein pro-apoptotisches Mittel und a. Fibrinogen oder b. ein Fibrinmonomer oder c. einen Fibrinogenaktivator.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das pro-apoptotische Mittel Sphingomyelin, Bax, Bid, Bik, Bod, Bim, Caspase-3, Caspase-8, Caspase-9 oder Annexin V ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 bis 11, umfassend 3–12 % Fibrinogen.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 bis 12, umfassend 10 % Fibrinogen.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 bis 11, wobei das Fibrinmonomer ein Fibrin-I-Monomer, ein Fibrin-II-Monomer, ein des BB Fibrinmonomer oder eine beliebige Mischung oder Kombination davon ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 bis 11, wobei der Fibrinogenaktivator Thrombin ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 bis 15, ferner umfassend ein Antibiotikum.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 bis 16, ferner umfassend Faktor-XIIIa-Transglutaminase.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 bis 17 zur Verwendung bei der Reduzierung des Lungenvolumens eines Patienten.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 bis 17 zur Herstellung eines Medikamentes zur Reduzierung des Lungenvolumens eines Patienten.
Vorrichtung zur Durchführung einer Lungenvolumenreduktion, wobei die Vorrichtung ein Bronchoskop mit einem Arbeitskanal und einen Katheter umfasst, der in den Arbeitskanal eingeführt werden kann, wobei der Katheter eine erste Öffnung mit einem proximalen Ende umfasst, das für den Anschluss an eine Gaszufuhr vorgesehen ist, und in Verbindung mit einem Innenlumen, das in einem aufblähbaren Ballon endet, und eine zweite und dritte Öffnung umfasst, die jeweils ein proximales Ende haben, das für einen Anschluss an eine Materialquelle vorgesehen ist, und mit einem Innenlumen verbunden sind, das an einer offenen distalen Spitze des Katheters endet.
Vorrichtung nach Anspruch 20, ferner umfassend einen Materialbehälter mit einer Mehrzahl von Kammern, wobei die Kammern des Behälters mit den Lumen des Katheters verbunden werden können.
Vorrichtung nach Anspruch 21, wobei das Material eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 bis 15 ist.
Vorrichtung nach Anspruch 21 oder Anspruch 22, wobei der Katheter zwei Lumen umfasst und der Behälter zwei Kammern umfasst.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 20 bis 23, ferner umfassend einen Injektor.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 20 bis 29, wobei das Bronchoskop eine Arbeitskammer hat, die im Hinblick auf Größe und Gestalt mit der Größe und Gestalt des Katheters vergleichbar ist.
Respiratorisches Kathetersystem, das Folgendes umfasst: eine Außenhülle, die das erste Lumen definiert, wobei die Außenhülle ein Fixierungselement beinhaltet, um die Außenhülle im Bronchialbaum zu platzieren, und eine Innenhülle, die so konfiguriert ist, dass sie beweglich in dem ersten Lumen aufgenommen werden kann, wobei die Innenhülle durch ein Lumenpaar definiert ist, die jeweils eine aus einer ersten und einer zweiten Klebstoffkomponente aufnehmen.
Respiratorisches Kathetersystem, das eine Hülle umfasst, die vier Lumen definiert, wobei das erste und das zweite Lumen die erste und die zweite Komponente eines Klebstoffs aufnehmen und sich von dem proximalen Ende des Katheters zur distalen Spitze des Katheters erstrecken, und das dritte und das vierte Lumen von dem proximalen Ende des Katheters zu Fixierungselementen verlaufen, die entlang dem Schaft des Katheters positioniert sind, wobei ein Fixierungselement näher zur distalen Spitze des Katheters als das andere gelegen ist.