5、具体实施方式:
大量的文献资料报道,实验结果和临床证明,锌是存在于人体内不可缺少的微量元素之一。青年或成年人缺锌就会出现性机能低下,第二性征发育不完全,乳房和阴毛不发育。男性会出现睾丸和前列腺重量减轻,精子数量减少,畸形精子增加,血清睾丸酮水平明显下降。锌元素是人体中七十多种合成酶的重要成份,并与两百多种酶的活性直接关联,特别是直接地广泛参与男性生殖生理过程,维持助长性机能,提高精子的数量和质量,并参与睾丸酮的合成,还能充养生精上皮和精子的活动,以及参与人体蛋白的组合。
锌对人体的健康影响十分重大,无论是婴儿、儿童、青少年、成年人还是老年人,都不能缺锌或失锌,尤其是对性发育方面,更为突出。而在男性不育中,锌对精子的数量、活力、活动率、精子畸形及精液的液化等问题上,都起着极大的影响。
人类精浆中游离氨基酸参与精子的代谢,是精子能量补充源,能促进精子的活性。氨基酸又具有螯合作用,能结合有毒的金属离子,对精子起保护作用。氨基酸还参与激素酶和其他活性物质的合成。若氨基酸不足影响上述物质的合成和更新,势必导致精子生成障碍。最近有研究证实,精氨酸具有刺激垂体释放促性腺激素的作用,口服精氨酸不仅可以改善精子的数量,而且可以提高精子的质量,故可以作为治疗精液量不足和少、弱、畸形精子症所致的男性不育。
本发明的制备方法如下:
1、依处方量称取硫酸锌及淀粉,两者混合后进行研磨,并过80目筛。
2、将精氨酸、磷酸氢钙、微粉硅胶分别过60目筛,备用。
3、称取磷酸氢钙并分二次与步骤(1)的得到物质充分混合均匀。
4、按处方量称取精氨酸,并与步骤(3)得到的物质充分混合均匀,最后加微粉硅胶混匀,过20目筛。
5、依理论粒重按胶囊生产工艺进行操作即行。
用硫酸锌加精氨酸组成的复方,用于治疗男性不育症患者,以提高精子数量和精子质量。经一系列的药理、药效、毒理等试验和临床应用后,证明疗效比较理想,且复方优于单方。因此,复方精氨酸胶囊的组方有充分的科学依据,应用于男性不育治疗有肯定的疗效,且毒副作用非常小,对病患者是一个福音,将会生产巨大的经济效益和社会效益。
实验1:
1.精氨酸、硫酸锌单方和精安原方对正常雄性小鼠及CTX模型雄性小鼠的生精和提高精子质量的影响精氨原方是由220mgD精氨酸和20mg的硫酸锌组成的复方组合物。
1.1目的
在精安复方原方的基础上探索不同剂量的精氨酸及硫酸锌对雄性小鼠(包括正常小鼠和环磷酰胺引起的精子减少模型的小鼠)的生精作用、提高精子质量及对雄性性器官的影响,寻找单方最佳剂量,为设计精安复方最佳配方提供实验依据。同时设“精安胶囊”原复方与单比较,从而获取复方是否优于单方的信息。
1.2动物与药物
1.2.1实验动物
雄性NIH种小鼠,体重18~25g,合格证号98A030,由广东省医用实验动物中心提供。
1.3试验方法
1.3.1实验对照组和病理模型
正常对照组:1%羧甲基纤维素钠组(0.4ml/10g体重);阳性对照组:(用甲基睾丸酮作阳性对照药物依据:甲基睾丸酮属雄激素,能促进男性性器官发育,可提高精子数量和活力[2、14、15],文献报道可见剂量为20mg/kg体重甲基睾丸酮作生精作用动物实验的阳性对照药物是成功的[7]。);病理模型:用环磷酰胺(简称CTX)
1.2.2实验药物
精氨酸(批号980701),上海康达氨基酸厂产品。硫酸锌(批号980103-1),广州化学试剂厂产品。精安胶囊(批号980701;精氨酸220mg和硫酸锌20mg/胶囊;11∶1组合;以下称精安原方),中山市三才医药集团提供。甲基睾丸酮片(批号980701甲),上海中国信谊药厂产品。临用前把药物研磨成粉末,用1%羧甲基纤维素钠(用蒸馏水配制)配成所需其药物浓度混悬液,上述灌胃的各药在小鼠每次灌胃容量为0.4ml/10g体重。环磷酰胺(CTX;批号980607),上海华联制药有限公司的产品。临用前用注射用水配成2mg/ml的注射液。
建立病理模型,依据是:Schilhy等发现,当环磷酰胺的累计剂量达6~10g时可致无精,而较低剂量时可使生精功能降低[12、13]。附:CTX模型建立方法:预试的结果表明,CTX 20mg/kg ip,Qd,连续5天,可造成小鼠精子减少。但停止用药后的21天,小鼠睾丸生精功能已有所恢复。与正常小鼠相比精子减少不明显。为此,每天ip CTX 20mg/kg,连续用5天,以后每隔6天ip CTX 20mg/kg一次,连续给药3次,可成功地建立小鼠精子减少模型。
1.3.2分组、给药和解剖
雄性小鼠180只,18~22g,随机分18组。
1.3.2.1对正常雄性小鼠的影响
第1组~第9组为正常小鼠,按表1.1的分组和剂量ig给药,Qd×21d,在末次给药后的第二天解剖各组实验小鼠。
表1.1正常小鼠分组和给药剂量
组别 |
剂量(mg/kg) |
第1组:1%羧甲基纤维素钠 |
0.4ml/10g |
第2组:精氨酸 |
280mg/kg |
第3组:精氨酸 |
430mg/kg |
第4组:精氨酸 |
660mg/kg |
第5组:硫酸锌 |
46mg/kg |
第6组:硫酸锌 |
70mg/kg |
第7组:硫酸锌 |
108mg/kg |
第8组:甲基睾丸酮 |
20mg/kg |
第9组:精安原方 |
240mg/kg |
1.3.2.2对CTX模型小鼠的影响
第10组~第18组为CTX引起精子减少和质量下降的模型小鼠(建立模型的方法见1.3.1),每组分别ip(CTX)20mg/kg,Qd×5d,(各组在连续ip CTX 5天后,以后每隔6天ip CTX 20mg/kg一次,连续三次。)实验的第六天开始按表1.2的组别和剂量ig给药,Qd×21d,在末次给药后的第二天解剖各组实验小鼠。
表1.2 CTX模型小鼠分组和给药剂量
组别 |
剂量(mg/kg) |
第10组:1%羧甲基纤维素钠 |
0.4ml/10g |
第11组:精氨酸 |
280mg/kg |
第12组:精氨酸 |
430mg/kg |
第13组:精氨酸 |
660mg/kg |
第14组:硫酸锌 |
46mg/kg |
第15组:硫酸锌 |
70mg/kg |
第16组:硫酸锌 |
108mg/kg |
第17组:甲基睾丸酮 |
20mg/kg |
第18组:精安原方 |
240mg/kg |
1.3.3精子数、精子活动率和精子活动为及畸形率检测方法[13,16~18]:
在末次给药后的第二天将实验的雄性小鼠处死,取左侧附睾称重,参照Ficsor等人方法[16],取左侧附睾在含2ml磷酸缓冲生理盐水的直径5cm平皿中,剪碎制成精子悬液,置37±1℃水浴中15分钟使其充分游离,然后将精子悬液一滴滴于玻片上,在室温(20~25℃)下,高倍镜下观察200个精子数,计算精子活动百分率。另取0.1ml精液放入含1.9ml5%碳酸氢钠试管内,摇匀,于计数板上计数精子数。另取1滴精液于玻片上涂片,观察精子形态并统计精子畸形百分率。
1.3.4数据处理方法
动物体重、精子数和器官系数用t检验,精子活动率、精子活动力、精子畸形率用x2检验。实验结果中比较各组的各项指标,增加数或减少数的百分数的计算方法是增加或减少的数占被比较数的百分数。
1.4实验结果
各组小鼠进食、行为、体态均正常。
第1~9组(包括对照组及正常小鼠各给药组)的小鼠体重增长正常(见表1-A);毛色有光泽;睾丸大小正常(睾丸与附睾系数见表1-E);精子数、活动率、活动力和精子畸形率(见表1-C)。
第10~18组(CTX模型组)小鼠体重增长情况(见表1-B)、睾丸大小均与对照组相似(睾丸与附睾系数见表1-F),但毛色缺光泽,精子数、活动率、活动力和精子畸形率(见表1-D)。
1.4.1对正常组实验小鼠精子和睾丸与附睾的影响
(1)精安原方组(第9组)与对照组(第1组)相比,小鼠精子数增加35.4%(P<0.05),精子活动率升高15.0%(P<0.05),3级精子活动力升高5.0%(P>0.05)。
(2)小鼠分别给予精氨酸280mg/kg(第2组)、430mg/kg(第3组)及660mg/kg(第4组),小鼠精子数分别较对照组(第1组)增加3.0%、9.2%及16.9%。但与对照组相比,差异不显著(P>0.05)。各组精子活动率及3级精子活动力与对照组相似。提示单独服用精氨酸对小鼠有生精作用,但其效果不如精安原方好。
(3)小鼠分别给予硫酸锌46mg/kg(第5组)、70mg/kg(第6组)、108mg/kg(第7组)。与对照组(第1组)相比,各组精子数分别增加29.2%(P<0.05)、30.8%(P<0.05)、32.2%(P<0.05)。各组精子活动率及3级精子活动力与对照组相似。提示单用硫酸锌能明显地剂量依赖性地促进精子的生成,但其效果仍较精安原方略低。
(4)小鼠给予甲基睾丸酮(第8组),与对照组(第1组)相比,小鼠精子数增加27.7%(P<0.05),精子活动率升高10%(P>0.05),3级精子活动力与对照组相似。
(5)给予不同剂量精氨酸,硫酸锌或甲基睾丸酮能降低精子畸形率,但因对照组小鼠畸形率很低(1.2±0.3%),故意义不大。
(6)对正常小鼠,给予不同剂量精氨酸,硫酸锌及精安原方、甲基睾丸酮对小鼠睾丸系数及附睾系数均无影响(P>0.05)。
1.4.2对CTX模型组损伤小鼠精子和睾丸与附睾的影响
(1)1%羧甲基纤维素钠+CTX组(第10组)与正常对照组(第1组)相比,小鼠精子数降低32.3%(P<0.05),精子活动率降低30.2%(P<0.01),3级精子活动率降低31.7%(P<0.01),精子畸形率增加66.7%(P<0.01)。
(2)精安原方组(第18组)与CTX组(第10组)相比,精子数增加56.8%(P<0.01),精子活动率升高53.5%(P<0.01),3级精子活动率升高60.0%(P<0.01)。
(3)小鼠分别给予精氨酸280mg/kg(第11组)、430mg/kg(第12组)及660mg/kg(第13组)后,精子数分别增加36.4%(P<0.05)、40.9%(P<0.05)、47.7%(P<0.05),精子活动率升高12.2%(P>0.05)、15.7%(P>0.05)、20.5%(P>0.05),3级精子活动力亦分别增加6.4%(P>0.05)、11.4%(P>0.05)、29.6%(P>0.05)。
(4)小鼠分别给予硫酸锌46mg/kg(第14组)、70mg/kg(第15组)、108mg/kg(第16组)后,精子数分别增加50.0%(P<0.05)、52.3%(P<0.05)、50.0%(P<0.05),精子活动率升高27.2%(P<0.05)、20.5%(P>0.05)、15.4%(P>0.05)。
(5)小鼠给予甲基睾丸酮(第16组),精子数增加95.5%(P<0.01),精子活动率升高52.3%(P<0.01)。
(6)给予不同剂量精氨酸、硫酸锌、精安原方、甲基睾丸酮后,小鼠精子畸形率均有所降低。各用药组与CTX模型组即第10组比较,精子畸形率降低55.0%~80.0%(P<0.01)。
(7)在小鼠CTX模型组(第10~18组)与对照组(第1组)相比,小鼠睾丸系数及附睾系数两组相似(P>0.05)。
1.5小结
(1)小鼠分别ig给予精氨酸280、430及660mg/kg对CTX引起精子减少模型小鼠有较明显的促进精子生成作用,基本呈现量效关系。分别使精子数增加36.4%(P<0.05)、40.9%(P<0.05)、47.7%(P<0.05)。上述3个剂量精氨酸对正常雄性小鼠也有一定促进精子生成作用,但其效果远远不如对CTX模型小鼠好。对正常小鼠和CTX模型小鼠生精作用和提高精子质量,精氨酸660mg/kg剂量的效果较其他的剂量为优。
(2)雄性小鼠分别给予硫酸锌46、70、108mg/kg后,显示出生精作用和提高精子质量,使正常小鼠精子数增加29.2~32.2%。使给CTX后小鼠精子数增加50.0~52.3%,对正常小鼠或给CTX小鼠精子活动率亦有所增加。其中硫酸锌46mg/kg的生精作用和提高精子质量作用较其他较大剂量组相似,各组间差异不显著(P>0.05)。因此,硫酸锌的剂量超过46mg/kg,未能进一步增加个鼠精子数及精子活力。
(3)给予精安原方240mg/kg,能使正常小鼠及CTX模型小鼠的精子数分别增加35.4%(P<0.05)及56.8%(P<0.01),精子活动率亦分别增加15.0%(P<0.05)及53.5%(P<0.01),3级精子活动力分别增加5.0%(P>0.05)及60.0%(P<0.01)。此作用较单独应用精氨酸(280、430、660mg/kg)或硫酸锌(46、70、108mg/kg)的效果更优,但不一定是最佳效果。
(4)给予甲基睾丸酮20mg/kg体重后,对正常雄性小鼠及CTX模型小鼠均有明显生精作用和提高精子质量,精子数分别增加27.7%(P<0.05)及95.5%(P<0.01),精子活动率分别升高10.0%(P>0.05)及52.3%(P<0.01)。
(5)给予精氨酸、硫酸锌、精安原方、甲基睾丸酮后,均能降低CTX所产生小鼠精子畸形率(P<0.01)。
(6)精安原方、甲基睾丸酮对雄性小鼠的睾丸系数与副睾系数无影响。
本研究结果显示,在生精和提高精子质量方面,精氨酸和硫酸锌单方对雄性小鼠有一定作用,对CTX模型小鼠生精和提高精子质量更显著。精氨酸最佳有效量为660mg/kg,硫酸锌最佳有效量为46mg/kg。精安复方原方(精氨酸与硫酸锌的组合)的生精作用和提高精子质量作用较单独应用不同剂量的精氨酸或硫酸锌强。精氨酸及硫酸锌单方、精安原方和甲基睾丸酮对雄性小鼠的睾丸和副睾系数均无影响。
表1-A ig精氨酸、硫酸锌和精安原方对正常组实验小鼠体重的影响(
x±SD;n=10)
组别 0周 1周 2周 3周 4周
1.1%羧甲基纤维素钠 22.3±1.2 31.4±2.4 33.1±2.9 34.3±2.2 35.6±2.3
2.精氨酸280mg/kg 22.2±1.3 31.1±2.2 33.2±2.3 33.9±2.4 34.6±2.4*
3.精氨酸430mg/kg 21.7±1.6 28.9±1.6 31.1±1.8 34.0±1.9 35.2±2.2*
4.精氨酸660mg/kg 21.9±1.1 31.1±1.4 31.9±2.5 32.6±3.2 33.7±3.2*
5.硫酸锌46mg/kg 22.2±1.9 29.5±2.2 32.6±2.5 34.0±2.5 33.9±3.3*
6.硫酸锌70mg/kg 22.5±2.1 28.3±.3.1 30.9±3.1 33.9±3.1 35.3±1.5*
7.硫酸锌108mg/kg 22.8±1.3 32.2±2.1 34.4±2.7 35.0±2.4 34.7±2.7*
8.甲基睾丸酮20mg/kg 22.1±1.2 31.7±1.5 34.2±1.2 36.0±2.1 36.8±2.7*
9.精安原方240mg/kg 22.2±1.2 30.7±2.2 32.8±3.7 31.1±3.5 34.4±3.4*
*P>0.05,与正常对照组相比
表1-B ig 精氨酸、硫酸锌和精安原方对CTX模型组损伤小鼠体重的影响(
x±SD;n=10)
组别 0周 1周 2周 3周 4周
10.CTX 20mg/kg+1%羧甲基纤维素钠 22.1±1.7 28.7±2.6 30.6±4.6 33.7±3.7 35.2±3.6*
11.CTX 20mg/kg+精氨酸280mg/kg 22.0±1.2 27.7±1.2 30.2±2.7 32.3±2.4 33.2±2.9*
12.CTX 20mg/kg+精氨酸430mg/kg 21.2±1.0 29.1±2.4 30.5±3.0 32.9±3.0 34.0±3.3*
13.CTX 20mg/kg+精氨酸660mg/kg 21.8±1.6 28.6±1.1 21.4±1.4 33.0±1.8 34.5±2.7*
14.CTX 20mg/kg+硫酸锌46mg/kg 21.9±1.3 29.0±1.8 31.0±1.8 32.1±3.6 34.0±2.9*
15.CTX 20mg/kg+硫酸锌70mg/kg 22.0±1.5 28.7±2.5 31.0±2.3 31.0±2.3 32.9±1.9*
16.CTX 20mg/kg+硫酸锌108mg/kg 21.7±1.1 29.4±1.3 33.1±1.4 34.8±1.7 34.6±2.2*
17.CTX 20mg/kg+甲基睾丸酮20mg/kg 21.6±2.2 29.0±2.3 31.1±2.1 33.7±2.5 34.2±2.3*
18.CTX 20mg/kg+精安原方240mg/kg 21.9±1.2 29.3±2.1 31.9±3.2 32.6±2.3 32.6±3.2*
*P>0.05,与表1-1的正常对照组相比
表1-C ig 精氨酸、硫酸锌和精安原方对正常组实验小鼠精子的影响(
x±SD;n=10)
精子数 活动率 精子活动力(%) 畸形率
组别
(×106/ml) (%) 3级(%) 2级(%) 1级(%) (%)
1 6.5±2.3 62.2±10.3 32.2±5.1 21.1±6.6 8.9±5.0 1.2±0.6
2 6.7±1.9* 60.3±7.6* 31.7±4.7* 18.8±4.3* 9.8±4.4* 1.1±1.0*
3 7.1±1.9* 63.4±12.2* 32.5±6.1* 20.3±9.9* 1.0±7.0* 1.6±3.7*
4 7.6±1.8* 64.7±11.3* 30.6±4.2* 22.2±7.3* 11.9±6.3* 0.6±0.5**
5 8.4±1.6** 61.5±4.8* 33.2±3.8* 18.8±2.9* 9.5±4.0* 0.6±0.7**
6 8.5±2.3* 62.0±11.3* 33.1±5.2* 19.3±6.9* 9.6±4.8* 0.7±1.2**
7 8.6±2.2* 63.0±16.8* 32.4±4.8* 20.0±10.9* 10.6±8.0* 0.9±0.5**
8 8.3±2.2** 68.4±12.6* 32.4±5.1* 23.2±8.7* 12.8±6.3* 0.6±0.6**
9 8.8±2.0* 71.5±9.1* 33.7±4.4* 24.9±4.0* 12.9±5.2* 1.5±0.6*
与1组比较,*:P>0.05;**:P<0.05:1组:1%羧甲基纤维素钠;2组:精氨酸280mg/kg;3组:精氨酸430mg/kg;4组:精氨酸660mg/kg;5组:硫酸锌46mg/kg;6组:硫酸锌70mg/kg;7组:硫酸锌108mg/kg;8组:甲睾酮20mg/kg;9组:精安原方240mg/kg
表1-D ig 精氨酸、硫酸锌和精安原方对CTX模型组损伤小鼠精子的影响(
x±SD;n=10)
精子数 活动率 精子活动力(%) 畸形率
组别
(×106/ml) (%) 3级(%) 2级(%) 1级(%) (%)
10 4.4±1.7 43.4±11.9 22.0±6.7 14.9±5.5 6.5±3.4 2.0±0.6
11 6.0±1.4* 48.7±10.7* 23.4±6.9* 16.0±3.6* 9.3±4.2* 0.8±0.6***
12 6.2±1.9* 50.2±9.7* 24.5±7.6* 17.8±1.8* 7.9±3.4* 0.8±0.5***
13 6.5±1.6* 52.3±11.6* 28.5±7.0* 15.4±6.6* 8.4±5.8* 0.6±0.6***
14 6.6±1.6** 55.2±9.8* 28.6±6.3* 17.1±6.5* 9.5±3.3* 0.9±1.0***
15 6.7±2.3* 52.3±10.7* 27.8±5.2* 16.4±6.1* 8.1±4.0* 0.5±0.6***
16 6.6±2.0* 50.1±12.3* 27.8±6.3* 14.1±6.0* 8.2±3.8* 0.7±0.7***
17 8.6±1.3*** 66.1±10.4*** 32.5±2.7** 21.8±3.3*** 11.9±6.7** 0.4±0.4***
18 6.9±2.0** 66.6±11.1*** 35.2±5.6** 20.5±5.1** 10.9±4.4** 0.6±0.8***
与1组比较,*:P>0.05;**:P<0.05;***:P<0.01
10组:CTX 20mg/kg+1%羧甲基纤维素钠:11组:CTX 20mg/kg+精氨酸280mg/kg;12组:CTX20mg/kg+精氨酸430mg/kg;
13组:CTX 20mg/kg+精氨酸660mg/kg:14组:CTX 20mg/kg+硫酸锌16mg/kg;15组:CTX20mg/kg+硫酸锌70mg/kg:
16组:CTX 20mg/kg+硫酸锌108mg/kg:17组:CTX 20mg/kg+甲基睾丸酮20mg/kg;18组:CTX20mg/kg+精安复
方240mg/kg
表1-E ig 精氨酸、硫酸锌和精安原方对正常组实验小鼠睾丸与附睾系数的影响(
x±SD;n=10)
组别 睾丸系数 附睾系数
1.1%羧甲基纤维素钠 0.00273±0.00038 0.00098±0.00023
2.精氨酸280mg/kg 0.00279±0.00040* 0.00095±0.00017*
3.精氨酸430mg/kg 0.00263±0.00037* 0.00088±0.00014*
4.精氨酸660mg/kg 0.00291±0.00048* 0.00103±0.00019*
5.硫酸锌46mg/kg 0.00279±0.00036* 0.00097±0.00010*
6.硫酸锌70mg/kg 0.00262±0.00029* 0.00089±0.00011*
7.硫酸锌108mg/kg 0.00283±0.00028* 0.00096±0.00012*
8.甲基睾丸酮20mg/kg 0.00275±0.000378* 0.00092±0.00009*
9.精安原方240mg/kg 0.00273±0.00038* 0.00094±0.00007*
*P>0.05,与正常对照组相比
表1-F ig 精氨酸、硫酸锌和精安原方对CTX模型组损伤小鼠睾丸与附睾系数的影响(
x±SD;n=10)
组别 睾丸系数 附睾系数
10.CTX 20mg/kg+1%羧甲基纤维素钠 0.00292±0.00064* 0.00097±0.00016*
11.CTX 20mg/kg+精氨酸280mg/kg 0.00279±0.00035* 0.00101±0.00011*
12.CTX 20mg/kg+精氨酸430mg/kg 0.00270±0.00031* 0.00096±0.00013*
13.CTX 20mg/kg+精氨酸660mg/kg 0.00273±0.00078* 0.00098±0.00011*
14.CTX 20mg/kg+硫酸锌46mg/kg 0.00281±0.00028* 0.00097±0.00022*
15.CTX 20mg/kg+硫酸锌70mg/kg 0.00273±0.00044* 0.00101±0.00015*
16.CTX 20mg/kg+硫酸锌108mg/kg 0.00266±0.00025* 0.00092±0.00013*
17.CTX 20mg/kg+甲基睾丸酮20mg/kg 0.00266±0.00031* 0.00104±0.00017*
18.CTX 20mg/kg+精安原方240mg/kg 0.00273±0.00057* 0.00101±0.00017*
*P>0.05,与表1-5的正常对照组相比
实验2:
2.不同剂量配比的精氨酸与硫酸锌及精安原方对正常雄性小鼠及CTX模型小鼠的生精作用和提高精子质量的影响
2.1目的
基于单方实验的基础,在正常雄性小鼠及CTX引起精子减少和质量下降模型的雄性小鼠中,通过固定精氨酸的剂量并改变硫酸锌的剂量及固定硫酸锌的剂量并改变精氨酸的剂量,筛选出此两药生精作用和提高精子质量的最佳配比,以确定生精作用和提高精子质量最强的新精安复方组方。
2.2动物与药物
2.2.1实验动物
雄性NIH种小鼠,体重18~25g,合格证号98A030,由广东省医用实验动物中心提供。
2.2.2实验药物
精氨酸(批号980701),上海康达氨基酸厂产品。硫酸锌(批号980103-1),广州化学试剂厂产品。精安胶囊(批号980701;精氨酸220mg和硫酸锌20mg/胶囊;11∶1组合;以下称精安原方),中山市三才医药集团提供。甲基睾丸酮片(批号980701甲),上海中国信谊药厂产品。临用前把药物研磨成粉末,用1%羧甲基纤维素钠(用蒸馏水配制)配成所需其药物浓度混悬液,上述灌胃的各药在小鼠每次灌胃容量为0.4ml/10g体重。环磷酰胺(CTX;批号980607),上海华联制药有限公司的产品。
临用前用注射用水配成2mg/ml的注射液。
2.3实验方法
2.3.1设计精安剂量的依据
单方实验结果提示,分别ig精氨酸和硫酸锌可在正常雄性小鼠和CTX模型小鼠在本实验条件下获得不同程度的生精作用和提高精子质量的作用,但单方的生精作用和提高精子质量均弱于精安原方。本实验拟采用固定精氨酸剂量(660mg/kg)改变硫酸锌剂量或固定硫酸锌剂量(49mg/kg)改变精氨酸剂量组成多个复方,筛选出生精作用和提高精子质量最强的最佳组合。
2.3.2不同剂量的精氨酸与硫酸锌组成的精安复方
基于单方实验的基础,精氨酸与硫酸锌相互组合成5个精安复方剂量组(组距0.7),各组用药剂量见表2-1,同时设精安原方组参予组方筛选。
表2-1 不同剂量的精氨酸与硫酸锌组成的精安复方
组别 精氨酸(mg/kg) 硫酸锌(mg/kg) |
比例 |
精安原方组 220.0 20.0精安复方1组 660.0 70.0精安复方2组 462.0 70.0精安复方3组 323.4 70.0精安复方4组 660.0 49.0精安复方5组 660.0 34.3 |
11∶19.43∶16.6∶14.62∶113.47∶119.24∶1 |
2.3.3实验对照组及模型
正常对照组:1%羧甲基纤维素钠组(0.4ml/10g);阳性对照组:甲基睾丸酮组(20mg/kg体重);病理模型:用CTX建立病理模型。附:CTX引起的雄性小鼠精子减少和质量下降病理模型的建立(按1.3.1节方法建立模型)
2.3.4分组、给药和解剖
NIH种雄性小鼠192只,20~25g,随机均分16组,每组12只,各组体重分布大致相近。第1组~第8组为正常小鼠,第9~16组为CTX模型小鼠组,见表2-2。
第1组~第8组按表2-1剂量给药,每天ig一次,连续21天。第9组~第16组按2.3.3节方法建立模型,各组ip CTX 20mg/kg,Qd,连续5天,实验的第六天开始按表2-1剂量给药,每天ig一次,连续21天。每组每次灌胃给药容量为0.4ml/10g体重。
在末次给药后的第二天,处死各组小鼠,取出小鼠左侧睾丸及附睾称重,计算其脏器系数,并并取出左侧附睾检测各鼠精子数、精子活动率和活动力及畸形精子数。
2.3.5精子数、精子活动率和活动力及畸形精子数检测方法按1.3.3节方法。
表2-2 正常小鼠和CTX模型小鼠的分组
组号 正常小鼠 组号 CTX模型小鼠
1 1%羧甲基纤维素组 9 1%羧甲基纤维素组
2 精安原方 10 精安原方
3 精安复方1组 11 精安复方1组
4 精安复方2组 12 精安复方2组
5 精安复方3组 13 精安复方3组
6 精安复方4组 14 精安复方4组
7 精安复方5组 15 精安复方5组
8 甲基睾丸酮组 16 甲基睾丸酮组
2.3.6数据处理方法
动物体重、精子数和器官系数用t检验,精子活动率、精子活动力、精子畸形率用x2检验。实验结果中比较各组的各项指标,增加数或减少数的百分数的计算方法是增加或减少的数占被比较数的百分数。
2.4实验结果
各组实验小鼠进食、行为、体态均正常。
第1组~第8组(包括正常对照组和各给药组)的小鼠体重(见表2-3)增长正常;毛色有光泽;睾丸大小正常(睾丸与附睾系数见表2-7);精子数、活动率、活动力和精子畸形率见表2-5。
第9组~第16组(CTX模型组)的小鼠体重(见表2-4)增长正常;毛色缺乏光泽;睾丸大小正常(睾丸与附睾系数见表2-8);精子数、活动率、活动力和精子畸形率见表2-6。
2.4.1对正常组实验小鼠精子的影响
(1)第1组小鼠仅给1%羧甲基纤维素钠,作为正常对照。精子数为7.4±1.0×106/ml,精子活动率为58.0±5.7%,精子畸型率为0.6±0.3%。
(2)第2组(精安原方240mg/kg)小鼠给药厂推荐精安原方,与对照组相比,精子数增加32.4%(P>0.05)精子活动率增加13.6%(P>0.05),提示精安原方对正常小鼠有生精作用和提高精子质量。
(3)第3~7组(3组:精氨酸660mg/kg硫酸锌70mg/kg;4组:精氨酸462mg/kg硫酸锌70mg/kg;5组:精氨酸305.4mg/kg硫酸锌70mg/kg;6组:精氨酸660mg/kg硫酸锌49mg/kg;7组:精氨酸660mg/kg硫酸锌34.3mg/kg)小鼠分别给予不同剂量配比的精氨酸加硫酸锌。与对照组相比,各组小鼠精子数增加18.9~40.5%,精子活动率升高1.0~18.3%。其中第6组(给精氨酸660mg/kg及硫酸锌49mg/kg)的精子数与精子活动率增加得最多,与对照组比较分别增加40.5%(P<0.05)及18.3%(P>0.05),高于精安原方组,其他组(3、4、5、7组)小鼠所给予的精氨酸或硫酸锌的剂量均不同于第6组,但它们的生精效果都不如第6组好。第6组小鼠的精子数较甲基睾丸酮组略高(P>0.05)。由此可见,对正常小鼠,精安组方以精氨酸660mg/kg配以硫酸锌49mg/kg,促进精子生成和提高精子质量作用最强,这是精安最佳的生精组方。
(4)第8组(甲基睾丸酮20mg/kg)小鼠给甲基睾丸酮,与对照组相比,精子数增加31.1%(P<0.01),精子活动率增加13.5%(P>0.05),提示甲基睾丸酮能促进正常小鼠精子的生成和改善精子质量。
(5)给不同配方精安复方或甲基睾丸酮的小鼠畸形率与对照组相似。
2.4.2对CTX模型组损伤小鼠精子的影响
(1)第9组(CTX模型)每天灌予1%羧甲基纤维素钠。与对照组相比,该组小鼠精子数降低35.1%(P<0.05),精子活动率降低32.1%(P<0.05),精子畸形率增加866.7%(P<0.01),提示用CTX制作雄性小鼠睾丸生精功能受抑制的模型成功。
(2)第10组(CTX模型;精安原方240mg/kg)ig精安原方,与第9组(CTX模型)相比,精子数增加70.8%(P<0.01),精子活动率增加40.9%(P<0.05),精子畸形率降低24.1%(P<0.05)提示有明显的促进精子生成并提高精子质量的作用。在用CTX抑制小鼠睾丸后,精安原方能使其功能恢复正常。
(3)第11~15组(CTX模型;11组:CTX 20mg/kg精氨酸660mg/kg+硫酸锌70mg/kg;12组:CTX 20mg/kg+精氨酸462mg/kg+硫酸锌70mg/kg;13组:CTX 20mg/kg+精氨酸305.4mg/kg+硫酸锌70mg/kg;14组:CTX 20mg/kg+精氨酸660mg/kg+酸锌49mg/kg;15组:CTX 20mg/kg+精氨酸660mg/kg+硫酸锌34.3mg/kg;)小鼠,分别给予不同剂量配比的精氨酸和硫酸锌。与第9组相比,各组小鼠精子数增加31.3~104.2%,精子活动率升高48.5~69.0%,3级精子活动力增加44.2%~62.2%(P<0.01),精子畸形率降低25.9~34.5%(P<0.05),其中第14组(给精氨酸660mg/kg及硫酸锌49mg/kg)的精子数与精子活动率增加得最多,分别增加104.2%(P<0.01)及69.0%(P<0.01),较精安原方组的精子数与精子活动率分别高19.5%(P<0.05)与20.0%(P<0.01)。其中精子数的增加甚至比正常对照组还高32.4%(P<0.05)比甲基睾丸酮组还高22.5%(P<0.05)。其他组(11、12、13、15组)小鼠所给予的精氨酸或硫酸锌的剂量不同于第14组,但它们的生精效果都不如第14组好。第14组小鼠精子畸形率的降低(34.5%)亦较其他组更显著。由此可见,精安组方中以精氨酸660mg/kg配以硫酸锌49mg/kg(精氨酸∶硫酸锌=13.47∶1)的生精作用和提高精子质量最强,降低精子畸形率效果最好,这是精安最佳的生精组方。
(4)第16组(CTX 20mg/kg+甲基睾丸酮20mg/kg)小鼠与第9组相比,精子数增加66.7%(P<0.01),精子活动率增加51.8%(P<0.05),精子畸形率降低25.9%(P<0.05)提示CTX抑制小鼠睾丸后,甲基睾丸酮能使其生精功能恢复正常。
2.4.3对正常组和CTX模型组实验小鼠睾丸与附睾的影响
分别给予正常小鼠及CTX模型小鼠予各种配方的精安复方或甲基睾丸酮,各组小鼠睾丸及附睾系数与对照组相比并无差别(P>0.05)(见表2-7和表2-8)。
2.5小结
(1)给正常小鼠予不同剂量配比的精氨酸与硫酸锌灌胃,能增加精子数18.9~40.5%。其中精氨酸660mg/kg加硫酸锌49mg/kg组使小鼠精子数增加40.5%(P<0.05)。提示该配方(精氨酸∶硫酸锌=13.47∶1)的精安复方能促进小鼠精子的生成。其他组虽亦使小鼠精子数有所增加,但与对照组差异不显著(P>0.05)。各种配方精安复方对正常小鼠精子活动率与畸形率无明显影响(P>0.05)。
(2)不同剂量配比的精氨酸及硫酸锌的精安复方均能恢复由于给予CTX而抑制的小鼠睾丸生精功能。其中精氨酸660mg/kg加硫酸锌49mg/kg的配方效果最佳。与仅给CTX组(第9组)相比,它使精子数增加104.2%(P<0.01),较正常对照组高32.4%(P<0.05),较甲基睾丸酮组高22.5%(P<0.05)。本组精子活动率亦增加69.0%(P<0.01)。其他组的生精作用和提高精子质量不如本组。本组精子畸形率亦降低得最多(34.5%,P<0.05)提示精氨酸660mg/kg加硫酸锌49mg/kg是促使CTX精子减少模型小鼠生精作用和提高精子质量的最佳组方。
(3)甲基睾丸酮20mg/kg/天使正常小鼠精子数增加31.1%(P<0.01),精子活动率升高13.5%(P>0.05)。甲基睾丸酮亦能恢复由于给予CTX而抑制的小鼠睾丸生精功能,与仅给CTX组相比,它使精子数增加66.7%(P<0.01),精子活动率增加51.8%(P<0.05),精子畸形率亦降低25.9%(P<0.05)。
(4)各种剂量配比不同的精安复方及甲基睾丸酮对正常小鼠及CTX模型小鼠的睾丸及附睾系数均无影响。
(5)精安各复方对小鼠体重及生殖器官系数无影响。
本研究结果显示,对正常雄性小鼠及用CTX制作的精子减少模型的雄性小鼠,通过固定精氨酸的剂量并改变硫酸锌剂量及固定硫酸锌的剂量并改变精氨酸的剂量,确定了精安复方生精作用和提高精子质量最强的新组方为:精氨酸660mg/kg及硫酸锌49mg/kg。两药生精作用和提高精子质量的最佳剂量配比为13.47∶1。这新组方优于精安原方。
表2-3.ig不同剂量配比的精氨酸、硫酸锌对正常组小鼠体重(g)的影响(
x±SD;n=12)
组别 0周 1周 2周 3周 4周
1.羧甲基纤维素钠 27.8±2.2 29.7±2.4 30.9±2.1 30.4±3.0 30.4±3.4
2.精安原方(240mg/kg) 28.4±1.3 30.2±1.3 30.5±0.9 31.0±1.4 30.9±2.3*
3.精氨酸660mg/kg硫酸锌70mg/kg 27.6±2.3 31.1±2.1 32.3±1.9 33.6±2.7 33.8±3.5*
4.精氨酸462mg/kg硫酸锌70mg/kg 28.0±1.8 31.1±1.8 31.4±1.8 32.3±2.4 32.7±2.9*
5.精氨酸305.4mg/kg硫酸锌70mg/kg 27.3±2.0 29.2±3.7 29.4±4.2 28.7±4.6 27.8±4.4*
6.精氨酸660mg/kg硫酸锌49mg/kg 27.6±2.8 29.6±2.6 29.9±4.1 31.6±4.5 32.3±3.6*
7.精氨酸660mg/kg硫酸锌34.3mg/kg 26.5±2.4 29.1±2.3 29.7±3.2 31.2±4.1 32.2±4.0*
8.甲基睾丸酮20mg/kg 27.9±1.6 30.7±2.0 31.5±2.4 33.6±2.4 34.0±2.6*
*P>0.05,与正常对照组相比
表2-4.ig不同剂量配比的精氨酸、硫酸锌对CTX模型组小鼠体重(g)的影响(
x±SD;n=12)
组别 0周 1周 2周 3周 4周
9.CTX 20mg/kg羧甲基纤维素钠 27.2±2.3 27.8±2.9 28.6±4.0 31.0±4.7 29.3±3.6*
10.CTX 20mg/kg精安原方240mg/kg 27.1±1.9 29.0±2.2 29.8±2.2 30.9±2.9 30.2±2.8*
11.CTX 20mg/kg精氨酸660mg/kg硫酸锌70mg/kg 27.8±1.6 28.9±2.5 29.1±3.1 31.6±3.2 31.8±2.9*
12.CTX 20mg/kg精氨酸462mg/kg硫酸锌70mg/kg 26.8±2.4 26.4±2.3 25.7±3.3 27.4±3.9 28.9±3.1*
13.CTX 20mg/kg精氨酸305.4mg/kg硫酸锌70mg/kg 27.4±1.1 28.3±1.9 28.5±1.6 30.7±2.0 30.3±2.5*
14 CTX 20mg/kg精氨酸660mg/kg硫酸锌49mg/kg 27.5±1.2 27.1±1.3 29.4±1.6 28.9±2.5 27.6±2.4*
15.CTX 20mg/kg精氨酸660mg/kg硫酸锌34.3mg/kg 27.0±1.8 26.2±1.4 27.7±1.3 29.0±2.0 29.2±2.8*
16.CTX 20mg/kg甲基睾丸酮20mg/kg 28.0±2.3 28.6±2.0 30.8±2.7 32.7±2.4 32.6±3.3*
*P>0.05,与正常对照组相比
表2-5.ig不同剂量配比的精氨酸、硫酸锌对正常组小鼠精子的影响(
x±SD;n=12)
精子活动力
组
别 精子数(×106/ml) 活动率(%) 精子畸形率(%)
3级 2级 1级
1 7.4±1.0 58.0±5.7 33.8±8.8 17.4±5.5 6.9±4.0 0.6±0.3
2 9.8±1.3** 65.9±5.4* 36.9±5.9* 20.1±4.3 8.9±2.8 0.6±0.2*
3 9.6±1.3** 58.4±11.8* 31.8±6.5* 18.6±3.8 8.0±3.7 0.6±0.1*
4 9.8±1.8** 61.4±9.1* 33.0±9.4* 21.5±5.7 6.9±3.2 1.0±1.3*
5 8.8±1.7* 62.5±6.9* 34.4±5.3* 19.8±2.8 8.3±2.3 0.8±0.5*
6 10.4±2.6** 68.6±9.1*** 37.4±5.9** 21.4±3.6 9.8±3.7 0.5±0.1*
7 9.6±1.6* 59.4±10.8* 32.3±6.9* 18.1±3.2 9.1±2.7 0.6±0.2*
8 9.7±1.8*** 65.8±6.9** 37.9±5.2** 20.0±3.1 7.9±3.0 0.7±0.2*
与1组比较,*:P>0.05;**:P<0.05;***:P<0.01;1组:1%羧甲基纤维素钠0.5ml/10g;2组:精安原方(240mg/kg);3组:精氨酸660mg/kg硫酸锌70mg/kg;4组:精氨酸462mg/kg硫酸锌70mg/kg;5组:精氨酸305.4mg/kg硫酸锌70mg/kg;6组:精氨酸660mg/kg硫酸锌49mg/kg:7组:精氨酸660mg/kg硫酸锌34.3mg/kg;
8组:甲基睾丸酮20mg/kg。
表2-6.ig不同剂量配比的精氨酸、硫酸锌对CTX模型组小鼠精子的影响(
x±SD;n=12)
精子活动力
组
别 精子数(×106/ml) 活动率(%) 3级 2级 1级 精子畸形率(%)
9 4.8±2.3 39.4±8.3 21.7±5.3 12.1±4.0 5.7±3.2 5.8±1.7
10 8.2±2.0*** 55.5±7.8** 29.3±5.9* 16.9±3.2 9.0±4.0 4.4±1.2**
11 7.3±1.2*** 62.6±6.8* 32.0±4.7* 20.5±3.0 10.1±3.0 4.0±1.7**
12 7.4±2.2** 63.5±7.1* 33.5±5.7* 18.8±2.9 11.5±3.5 4.2±1.9**
13 6.3±1.3* 62.0±7.8* 35.2±3.0* 19.5±4.3 9.0±3.1 4.3±1.7**
14 9.8±1.5*** 66.6±7.2*** 35.2±3.0* 21.0±3.0 10.4±4.5 3.8±1.7**
15 8.5±2.9*** 58.5±9.5* 31.3±6.7* 18.2±4.4 9.0±3.9 4.1±2.1**
16 8.0±2.2*** 59.8±5.0** 33.8±5.4* 19.7±3.5 6.3±3.8 4.3±1.1**
与1组比较,*P>0.05;**:P<0.05;***:P<0.01;与9组比较,*:P>0.05;**:P<0.05;***:P<0.019组:CTX 20mg/kg+1%羧甲基纤维素钠:10组:CTX 20mg/kg+精安原方240mg/kg;11组:CTX20mg/kg精氨酸660mg/kg硫酸锌70mg/kg;12组:CTX 20mg/kg精氨酸462mg/kg硫酸锌70mg/kg;13组:CTX 20mg/kg精氨酸305.4mg/kg硫酸锌70mg/kg;14组:CTX 20mg/kg精氨酸660mg/kg硫酸锌49mg/kg;15组:CTX 20mg/kg精氨酸660mg/kg硫酸锌34.3mg/kg;16组:CTX 20mg/kg甲基睾丸酮20mg/kg
表2-7 ig不同剂量配比的精氨酸和硫酸锌对正常组小鼠睾丸、附睾系数的影响(
x±SD;n=12)
组别 睾丸系数 附睾系数
1.1%羧甲基纤维素钠 0.00313±0.00052 0.00111±0.00021
2.精安原方(240mg/kg) 0.00302±0.00028* 0.00099±0.00011*
3.精氨酸660mg/kg硫酸锌70mg/kg 0.00299±0.00044* 0.00093±0.00014*
4.精氨酸462mg/kg硫酸锌70mg/kg 0.00306±0.00039* 0.00102±0.00012*
5.精氨酸305.4mg/kg硫酸锌70mg/kg 0.00324±0.00065* 0.00100±0.00019*
6.精氨酸660mg/kg硫酸锌49mg/kg 0.00296±0.00038* 0.00102±0.00012*
7.精氨酸660mg/kg硫酸锌34.3mg/kg 0.00290±0.00026* 0.00101±0.00014*
8.甲基睾丸酮20mg/kg 0.00293±0.00034* 0.00102±0.00008*
*P>0.05,与正常对照组相比
表2-8 ig不同剂量配比的精氨酸和硫酸锌对CTX模型组小鼠睾丸、附睾系数的影响(
x±SD;n=12)
组别 睾丸系数 附睾系数
9.CTX 20mg/kg1%羧甲基纤维素钠 0.00298±0.00049* 0.00110±0.00020*
10.CTX 20mg/kg精安原方240mg/kg 0.00287±0.00026* 0.00100±0.00017*
11.CTX 20mg/kg精氨酸660mg/kg硫酸锌70mg/kg 0.00277±0.00029* 0.00101±0.00013*
12.CTX 20mg/kg精氨酸462mg/kg硫酸锌70mg/kg 0.00313±0.00035* 0.00116±0.00022*
13.CTX 20mg/kg精氨酸305.4mg/kg硫酸锌70mg/kg 0.00272±0.00024* 0.00106±0.00011*
14.CTX 20mg/kg精氨酸660mg/kg硫酸锌49mg/kg 0.00319±0.00050* 0.00112±0.00015*
15.CTX 20mg/kg精氨酸660mg/kg硫酸锌34.3mg/kg 0.00308±0.00053* 0.00106±0.00016*
16.CTX 20mg/kg甲基睾丸酮20mg/kg 0.00279±0.00030* 0.00099±0.00010*
*P>0.05,与正常对照组相比
实验3:毒性试验
14.1摘要:精安胶囊由精氨酸和硫酸锌(ZnSO2.7H2O)组成,是白色粉末,溶于水。本实验用NIH小鼠经口作急性毒性试验,结果其LD50为6268.9mg/kg,95%可信限为5758.2~6825.0mg/kg。
14.2试验目的:观察NIH小鼠经口灌胃给予精氨酸和硫酸锌(ZnSO2.7H2O)原料粉所产性毒性反应和死亡情况,为进一步的毒性试验提供依据。
14.3受试物:
14.3.1名称:精安胶囊原料粉由精氨酸和硫酸锌(ZnSO2.7H2O)按13.47∶1配成由中山市三才医药集团公司提供。
硫酸锌:批号:990601药用级,广东台山新宁制药厂出品
精氨酸:批号:991011,药用级,上海康达氨基酸厂出品
14.4动物:
14.4.1来源,种属:由广东省医学实验动物中心提供的NIH小鼠(合格证号:99A030)
14.4.2体重:18~22克
14.4.3性别:雌雄各半
14.4.4动物数:50只
14.4.5禁食时间:实验前禁食12小时
14.5剂量:
14.5.1组距:0.85
14.5.2剂量设计:根据预试验结果,设计8479.6mg/kg,7207.5mg/kg,6126.6mg/kg,5207.6mg/kg,4426.4mg/kg为试验的5个剂量组进行测试。
14.5.3途径:经口灌胃
14.6实验方法:
按(13.47∶1)比例称取精氨酸和硫酸锌(ZnSO2.7H2O)混合,用37℃温水溶解,配成所需浓度,按体重0.4ml/10g经口一次灌胃给予。
14.7观察指标:
14.7.1观察期:14天
14.7.2毒性反应:NIH小鼠经口给予精氨酸和硫酸锌(ZnSO2.7H2O)溶液后,8479.6mg/kg,7207.5mg/kg,6126.6mg/kg三个剂量组的动物出现活动减慢,1小时后出现伏卧,呼吸缓慢的症状,4~5个小时后大部分动物死亡。5207.6mg/kg,4426.4mg/kg二个剂量组经口给予精氨酸和硫酸锌(ZnSO4.7H2O)溶液后,活动稍微减慢,部分动物在给药后的48小时内死亡,所有存活动物大部分在给药后第三天恢复正常饮食及活动,观察期内见个别动物死亡(见表3),动物无异常症状出现。
表3 精安胶囊原料粉小鼠LD50试验动物死亡情况
组别 动物数 每天死亡动物数(只) 动物死亡总数
(mg/kg) (只) 1 2 3 6-14(天) (只)
8476.6 10 9 9
7207.5 10 8 1 9
6126.6 10 4 1 5
5207.6 10 1 1
4426.4 10 0
14.8结果:
按经口灌胃给予精氨胶囊原料粉计算,LD50为6268.9mg/kg,95%可信限为5758.2~6825.0mg/kg,根据化学物质的急性毒性分级标准,属实际无毒级。(见LD50计算报告)
LD50计算报告 01-3-20
试验药物:精安胶囊 给药方式:灌胃 剂量组数:5 算法:Bliss法
试验动物:NIH小鼠 剂量单位:mg/kg 自然死亡率:0.0 精度:0.001
LD50计算列表(第3轮)
动 死 死 实验 预期 预期 工作 回归
分 给药 对数 物 亡 亡 机率 机率 死亡 机率 权重 机率 回归
组 剂量 剂量 数 数 率 单位 单位 率 单位 系数 单位 误差
X Y
E
1 8476.6 3.928 10 9 0.900 6.282 6.844 0.967 5.918 0.168 6.844 0.00036
2 7207.5 3.858 10 9 0.900 6.282 5.856 0.804 6.203 0.486 5.855 0.00044
3 6126.6 3.787 10 5 0.500 5.000 4.865 0.448 5.001 0.632 4.865 0.00051
4 5207.8 3.717 10 1 0.100 3.718 3.874 0.130 3.732 0.396 3.874 0.00059
5 4426.4 3.646 10 0 0.000 - 2.883 0.017 2.480 0.107 2.883 0.00066
如图1所示,将不同剂量与实验动物死亡率对应描绘成曲线图。
加权回归方程:第1轮
(r=0.962,Emax=0.173)
第2轮
(r=0.945,Emax=0.0201)
第3轮
(r=0.943,Emax=0.000663)
数据异质性检验:x2=2.401
p=0.494(p>0.05,异质性无显著意义)
回归系数标准误:Sb=3.203
回归显著性系数:g=0.200(g>0.10,应采用经Feiller精确校正的结果)
各种死亡率的LD值及其95%可信限(mg/kg)
死亡率 未作Feiller校正 Feiller精确校正
% X Sx LD 95%CL X Sx LD 95%CL
1 3.631 0.041 4277.2 3552.7~5149.4 3.590 0.051 3890.8 3097.3~4887.6
5 3.680 0.031 4783.0 4152.0~5509.9 3.651 0.038 4474.3 3768.5~5312.3
10 3.706 0.027 5076.7 4503.3~5723.1 3.683 0.032 4820.3 4175.2~5565.1
50 3.797 0.017 6264.3 5805.7~6759.0 3.797 0.019 8268.9 5758.2~8825.0
90 3.888 0.027 7729.6 6842.3~8732.0 3.911 0.032 8152.9 7042.7~9438.1
95 3.914 0.032 8204.2 7105.8~9472.5 3.944 0.039 8783.4 7378.3~10458.8
99 3.963 0.042 9174.5 7601.8~11072.5 4.004 0.051 10100.5 8015.7~12727.7
如图2所示,将经过FEILLER精确校正后不同剂量与机率单位对应描绘成曲线图。
[LD50CALC 2.0版] 第1页(共2页)