CN118530362A - 一种赫赛汀抗体突变体及与其偶联的nk细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种赫赛汀抗体突变体，所述赫赛汀抗体突变体为在野生型轻链可变区（VL）及重链可变区（VH）的基础上的VH‑R50G、VH‑R50A、VH‑R50V、VH‑R50L、VH‑R50I、VL‑F53L、VL‑R66G、VL‑H91Q、VH‑R59T、VH‑G103R、VH‑F104L、VH‑R50G/G103R、VH‑G103R/F104L、VH‑R50G/R59T/G103R或VL‑H91Q/VH‑R50G突变体，所述突变体具有较低的抗原亲和力，保证了效应细胞在发挥杀伤作用后能及时与靶细胞抗原分离从而减少自身凋亡，从而具有增强的抑制和/或杀伤肿瘤活性和较长的体内半衰期。
Description
技术领域
本发明涉及抗体突变体与细胞的偶联及应用，属于多肽及细胞学领域。
背景技术
Trastuzumab Deruxtecan，德喜曲妥珠单抗（以下简称DS-8201），是一款靶向HER2的抗体偶联药物（ADC药物），由抗体（赫赛汀，Herceptin）和德卢替康（伊立替康类化疗药）构成，用于治疗不可切除或转移性的HER2阳性实体瘤， 公认是迄今HER2阳性肿瘤的最重磅的突破性药物。基于DESTINY-PanTumor 02的临床数据， DS-8201对于多种HER2阳性实体瘤都表现出优异疗效，267例HER2 IHC 3+（强阳性）患者覆盖子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、胆管癌等多个瘤种，客观缓解率(ORR，Objective response rate)为37.1%，中位缓解持续时间(mDOR, median duration of response)为11.3个月。但即便是针对HER2强阳性患者，也有近63%的患者无法从该治疗中获益。此外，药物的副作用问题不能忽视，有84.6%的患者发生了药物相关不良事件，其中40.8%的患者发生了3级或更高级别的药物相关不良事件，28.8%的患者因此停药或减少剂量（J Clin Oncol, 2023, 42:47-58.）。因此生物制药领域一直在寻找靶向HER2的新型疗法。其中Herceptin与细胞免疫治疗相结合成为被关注的热点之一。Herceptin在体内可以通过抗体介导的细胞毒性作用（ADCC）诱导NK细胞发挥杀伤作用（Br J Cancer, 2006, 94: 0.），以此为基础，Herceptin与NK细胞免疫的联合治疗得到国内外细胞治疗公司的广泛研究。例如，NantKwest公司生产的haNK cell（high-affinity Natural Killer cell）与Herceptin联合使用后展现出了对HER2阳性肿瘤细胞系更加强效的杀伤（Blood, 2020, 135: 399-410.）。因此NK细胞相关的免疫疗法在肿瘤治疗领域发展迅速，国内30家NK相关企业已有近30%进入临床，全球已进行和在进行的NK临床实验超过2000项，其中有相当一部分的临床实验是靶向HER2阳性肿瘤。但是由于抗体分子和NK细胞在体内有各自的组织分布特点，NK细胞本身并没有靶向性，因此联合使用后并未见到显著的临床获益。对于缺乏靶向性的问题，通过构建靶向肿瘤抗原的CAR-NK能使NK细胞获得一定程度的靶向性。Artiva biotherapeutics的AB-102、Catamaran Bio的CAT-179均为靶向HER2的CAR-NK产品。此外，NKarta，Fate therapeutics等知名NK治疗公司也开发了多款针对不同靶点的CAR-NK产品，但CAR-NK产品目前普遍存在转染效率低、制备周期长、费用昂贵等问题，且病毒载体具有一定的安全隐患。
有研究指出，如果NK细胞杀伤后不与靶细胞分离，会导致NK细胞的大量死亡，且大多数NK细胞的死亡发生在NK细胞未能脱离其靶标时（J Cell Biol, 2018, 217: 0.）。此外，Misty R. Jenkins等发现NK细胞与靶细胞的接触时间延长可引起过度炎症（J ExpMed, 2015, 212: 0.），而抑制NK细胞的活性。这些发现表明，NK细胞发挥细胞杀伤效应后，与靶细胞迅速分离对于NK细胞的存活非常重要。未能及时与靶细胞分离的NK细胞更有可能发生凋亡。
本发明的目的就是提供一种低亲和力抗HER2抗体，所述抗体不仅能通过共价键偶联在NK细胞上，形成细胞抗体偶联药物，赋予NK细胞靶向性以增强NK细胞对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤能力，还能通过其低亲和力的特性使NK细胞发挥杀伤作用后更易于与靶细胞分离，进而提升NK细胞在肿瘤微环境中的生存能力。
发明内容
基于上述目的，本发明首先提供了一种赫赛汀抗体突变体，所述赫赛汀抗体突变体为在氨基酸序列如SEQ ID NO.1第1-107位氨基酸所示的轻链可变区，以及氨基酸序列如SEQ ID NO.2第1-120位氨基酸所示的重链可变区的基础上的轻链可变区F53L突变体（简称VL-F53L，Mutant1），或
轻链可变区R66G突变体（简称VL-R66G，Mutant2）、或
轻链可变区H91Q突变体（简称VL-H91Q，Mutant3）、或
重链可变区R50G突变体（简称VH-R50G，Mutant4）、或
重链可变区R50A突变体（简称VH-R50A，Mutant4-1）、或
重链可变区R50V突变体（简称VH-R50V，Mutant4-2）、或
重链可变区R50L突变体（简称VH-R50L，Mutant4-3）、或
重链可变区R50I突变体（简称VH-R50I，Mutant4-4）、或
重链可变区R59T突变体（简称VH-R59T，Mutant5）、或
重链可变区G103R突变体（简称VH-G103R，Mutant7）、或
重链可变区F104L突变体（简称VH-F104L，Mutant8）、或
轻链可变区H91Q及重链可变区R50G突变体（简称VL-H91Q/VH-R50G，Mutant9）、或
重链可变区R50G及G103R突变体（简称VH-R50G/G103R，Mutant12）、或
重链可变区G103R及F104L突变体（简称VH-G103R/F104L，Mutant13）、或
重链可变区VH-R50G、R59T及G103R突变体（简称VH-VH-R50G/R59T/G103R，Mutant15）。
在一个优选的实施方案中，所述赫赛汀抗体突变体的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1第108-214位氨基酸所示，重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2第121-450位氨基酸所示。
其次，本发明提供了一种编码上述赫赛汀抗体突变体的多核苷酸。基于本领域技术人员的常识，遵循蛋白质编码的三联体密码规则，同一个氨基酸具有不同的三联体核苷酸编码，因此任何能够编码上述赫赛汀抗体突变体的重链可变区的氨基酸序列和轻链可变区的氨基酸序列均为本发明所限定的编码所述赫赛汀抗体突变体的多核苷酸的范围之内。
在一个优选的实施方案中，编码所述赫赛汀抗体重链可变区R50G突变体（Mutant4）重链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，轻链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.3第49-369所示，或
编码所述赫赛汀抗体重链可变区R50A突变体（Mutant4-1）重链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.3第49-369所示，或
编码所述赫赛汀抗体重链可变区R50V突变体（Mutant4-2）重链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，轻链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.3第49-369所示，或
编码所述赫赛汀抗体重链可变区R50L突变体（Mutant4-3）重链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，轻链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.3第49-369所示，或
编码所述赫赛汀抗体重链可变区R50I突变体（Mutant4-4）重链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，轻链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.3第49-369所示，或
编码所述赫赛汀抗体轻链可变区H91Q及重链可变区R50G突变体（Mutant9）重链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，轻链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，或
编码所述赫赛汀抗体重链可变区R50G及G103R突变体（Mutant12）重链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，轻链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.3第49-369所示。
在另一个优选的实施方案中，编码所述赫赛汀抗体突变体的重链恒定区的多核苷酸的序列如SEQ ID NO.3第1690-2679位所示，编码所述赫赛汀抗体突变体的轻链恒定区的多核苷酸的序列如SEQ ID NO.3第第370-690所示。
第三，本发明提供了表达所述赫赛汀抗体突变体的载体，所述载体含有编码上述赫赛汀抗体突变体的多核苷酸。在本发明的一个具体实施方案中，所述载体为可以商业化获得的pTT5载体，基因工程领域的其它常规表达载体也可以应用于本发明。
第四，本发明提供了一种所述赫赛汀抗体突变体的宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的表达所述赫赛汀抗体突变体的载体。在本发明的一个具体实施方案中，所述宿主细胞为HEK293细胞，基因工程领域的其它常规宿主细胞也可以应用于本发明。
第五，本发明提供了所述赫赛汀抗体突变体在制备肿瘤疾病治疗药物中的应用。所述肿瘤疾病为表达HER2抗原肿瘤细胞引起的疾病。
第六，本发明提供了一种偶联了所述赫赛汀抗体突变体的具有抑制和/或杀伤肿瘤活性的效应细胞。
在一个优选的实施方案中，所述效应细胞为NK细胞。在本发明的一个具体实施方案中，所述细胞为NK92细胞。
第七，本发明提供了所述的效应细胞在制备肿瘤疾病治疗药物中的应用。所述肿瘤疾病为表达HER2抗原肿瘤细胞引起的疾病。
最后，本发明提供了一种将赫赛汀抗体或赫赛汀抗体突变体与效应细胞偶联的制备方法，所述方法包括以下步骤：
（1）对所述赫赛汀抗体或其突变体进行修饰，获得连接TCO-PEG4的赫赛汀抗体突变体；
（2）将步骤（1）获得的连接TCO-PEG4的赫赛汀抗体突变体与GDP-Fucose-PEG4-Methyltetrazine（鸟苷5′-二磷酸-岩藻糖-三氮唑-四聚乙二醇-甲基四嗪）反应获得偶联GDP-Fucose的赫赛汀抗体突变体；
（3）使用岩藻糖基转移酶将步骤（2）获得的偶联GDP-Fucose的赫赛汀抗体突变体偶联到NK细胞膜表面的N-GlcNac上。
本发明通过AICD突变筛选平台获得了相较于赫赛汀抗体更低的HER抗原亲和力的赫赛汀抗体突变体。并且通过本发明提供的方法，将所述赫赛汀抗体突变体与NK细胞偶联，偶联抗原低亲和力的赫赛汀突变体的NK92细胞具有比偶联赫赛汀抗体的NK92细胞更高的杀伤效率，4小时内的杀伤效率由37.7%提高到40.5%，16小时内的杀伤效率由53%提高到60.6%，抗原低亲和力的抗体保证了与其偶联的NK92细胞在发挥杀伤作用后能及时与靶细胞抗原分离从而减少自身凋亡。流式细胞术检测结果表明偶联低亲和力赫赛汀的NK细胞中的凋亡细胞数量比偶联野生型赫赛汀的NK细胞更少，接近新鲜NK细胞中的凋亡细胞数量。小鼠体内肿瘤抑制实验显示，偶联低亲和力赫赛汀突变体的NK细胞显示出了比偶联赫赛汀抗体的NK细胞具有更持久的杀伤能力。而且偶联低亲和力赫赛汀突变体的NK细胞在小鼠体内具有更长的半衰期。结果显示本发明提供的抗原低亲和力的赫赛汀突变体以及偶联了所述赫赛汀抗体突变体的具有抑制和/或杀伤肿瘤活性的诸如NK细胞一样的效应细胞在制备肿瘤疾病治疗药物中的应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例4中野生型赫赛汀或其突变体与NK92细胞联用的体外杀伤结果；
图2是本发明实施例5中偶联野生型赫赛汀或其突变体的NK92细胞的体外杀伤结果；
图3 是本发明实施例5中与靶细胞孵育4h后偶联野生型赫赛汀或其突变体的NK92细胞活性检测结果；
图4 是本发明实施例6中小鼠肿瘤模型的抗肿瘤试验荧光成像图；
图5是本发明实施例6中肿瘤负荷的生物发光强度随时间的变化曲线；
图6 是本发明实施例7中偶联赫赛汀突变体的NK92在小鼠肿瘤内的半衰期评价实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。
实施例1. 赫赛汀突变体的筛选
在体液免疫中，抗体的多样性依赖于生发中心中进行的体细胞高频突变（SHM）和类别转换重组（CSR）。活化诱导性胞苷脱氨酶（activation induced cytidine deaminase,AICD）作为迄今唯一可诱导人类基因组中 DNA 发生突变的酶，在这一过程中发挥关键作用。AICD 可将单链 DNA 的胞嘧啶（C）脱氨基而转换为尿嘧啶（U），从而产生C:U误配。在之后的DNA复制过程中，通过错误配对修复（MMR），短补丁碱基切除修复（short-patch BER）或长补丁碱基切除修复（long-patch BER）机制进而产生丰富多样的点突变或者片段的缺失、插入和重组。基于AICD对DNA的诱变特性，已有多个团队利用AICD介导的诱变在哺乳动物细胞中进行抗体的筛选（Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108: 0.）和荧光蛋白的定向进化（Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101: 0.）。
赫赛汀（Herceptin）是一款人源化单克隆抗体，来源于鼠源抗HER2单克隆抗体4D5，其人源化过程由抗体工程师Paul Carter开展。Paul Carter制造出8株4D5抗体的人源化版本，其中被命名为humAb4D5-8的抗体因其对HER2更高的亲和力和对HER2阳性肿瘤细胞更好的抑制作用而成为赫赛汀的前身和基础（Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89: 0.）。本发明使用humAb4D5-8氨基酸序列（light chain GI:1685823435；heavy chain GI:442924）作为野生型赫赛汀。
本发明首先构建野生型赫赛汀表达质粒，将野生型赫赛汀的轻链和重链多核苷酸序列克隆到带有Zeocin（博来霉素）基因的pcDNA3.1载体的多克隆位点，轻链和重链序列之间加入内部核糖体进入位点（intrinsic ribosomal entry site，IRES）以实现在单个载体上同时表达抗体轻链和重链。其中轻链序列位于IRES序列5’端前，重链序列位于IRES序列3’端后。并在重链Fc的末端融合PGDFR的跨膜区域（TM），以使表达的抗体能够展示在真核细胞膜表面。所述的抗体在本发明中命名为“Herceptin-wt-TM”，所述Herceptin-wt-TM的DNA编码序列如SEQ ID NO.3所示（SEQ ID NO.3中，第1~48：CD33信号肽；第49~369：Herceptin-wt轻链可变区， 第370-693为轻链恒定区+终止密码子；第694~1281：IRES序列；第1282~1329：CD33信号肽；第1330~1689：Herceptin-wt重链可变区， 1690-2679为重链恒定区；第2680~2826：PGDFR跨膜区序列）。
其次，构建人AICD表达质粒，将人AICD的编码区DNA克隆到pEE14.4（Transientgene expression levels from multigene expression vectors. Biotechnol Prog.2007 Mar-Apr;23(2):435-43.）的多克隆位点（DNA编码序列如SEQ ID NO.4所示）。
第三，本发明构建了HER2蛋白表达质粒，将HER2胞外段DNA序列克隆到pTT5通用载体的多克隆位点，并在其C末端依次融合HIS×6标签和Twin-Strep标签。所述的HER2融合蛋白在本发明中命名为“HER2-Twin-Strep”，所述HER2-Twin-Strep的DNA编码序列如SEQ IDNO. 5所示。在CHO细胞中同时转染AICD表达质粒和Herceptin-wt-TM表达质粒，通过HER2-Twin-Strep检测表达在细胞膜表面的Herceptin-wt-TM，并通过流式分选仪逐步分选出对HER2亲和力减弱的细胞群。用PCR和TA克隆测序鉴定出Herceptin-wt-TM的突变体。
在具体实施中，首先使用电转仪（Gene Pulser Xcell™，BIO-RAD）将pcDNA3.1-Herceptin-wt-TM导入CHO细胞中，用工作浓度300 μg/mL Zeocin筛选2周；随后电转染导入pEE14.4-AICD质粒DNA，pEE14.4质粒上携带谷氨酰胺合成酶基因，用工作浓度为50 μg/mL的L-Methionine-DL-sulfoximine (MSX)谷氨酰胺合成酶抑制剂筛选2周，得到同时表达Herceptin-wt-TM和AICD的细胞库。AICD介导的DNA突变会随着双转染细胞的增殖而逐渐积累。
其次，将pTT5- HER2-Twin-Strep瞬时转染入HEK293中进行分泌表达，获取细胞培养上清，并使用HIS纯化柱进行纯化，制备HER2-Twin-Strep融合蛋白。该融合蛋白带有Twin-Strep-Tag，可以使用荧光标记的链霉亲和素（如Streptavidin-PE）检测。
Herceptin-wt-TM在CHO细胞膜表面的表达情况使用anti-human IgG抗体染色并通过流式细胞仪检测（NovoSampler Pro NS200，安捷伦）；使用HER2-Twin-Strep融合蛋白检测抗体与HER2的结合，以便进行后续赫赛汀突变体的筛选。CHO细胞双转染后，AICD开始在细胞中表达，并逐渐在Herceptin基因上引入突变，此突变为随机突变，有几率造成抗体亲和力的改变。双转染CHO细胞培养1周后，使用HER2-Twin-Strep融合蛋白与Streptavidin-PE对细胞染色并通过流式细胞分选仪（CytoFLEX SRT 细胞分选仪，贝克曼）筛选与HER2结合减弱的细胞继续培养，直至出现显著差异。
将与HER2结合减弱得细胞群分离出来，制成细胞沉淀并提取染色体DNA，此时赫赛汀序列已稳定整合进CHO细胞的基因组中。通过以下引物进行PCR扩增，所得产物为可能包含突变的赫赛汀轻链和重链DNA产物。
F: 5’-AGGGAGACCCAAGCTGGCTAG-3’；
R: 5’-CAGTGGGAGTGGCACCTTCCAGG-3’；
PCR反应体系：10 μL；
PCR反应程序： 第一步：94℃，5 min；第二步：94℃，30 s；第三步：55℃，30 s；第四步：72℃，1 min；第五步：72℃，5 min；其中，第二步与第四步进行30次循环。
PCR完成后用琼脂糖凝胶电泳进行产物验证，胶回收后利用TA克隆策略对PCR产物进行克隆和测序（苏州泓迅生物科技股份有限公司）。根据测序结果共筛选到16个赫赛汀突变体，各个突变体与野生型赫赛汀的序列对比如表1所示，氨基酸序列编号均使用Kabat编号系统。
表1. 16个赫赛汀突变体突变位点列表（VL表示轻链可变区；VH表示重链可变区）
将野生型赫赛汀及突变体序列克隆至pTT5载体中，使用哺乳动物细胞（HEK293或CHO）作为宿主细胞，通过瞬时转染进行分泌表达，获得的细胞上清进行ProteinA亲和纯化。赫赛汀突变体的表达水平和纯度如表2所示。
表2.赫赛汀突变体在HEK293细胞中瞬时表达水平和纯度列表
实施例2. 通过生物膜干涉技术（biolayer interferometry， BLI）测定赫赛汀及其突变体与HER2的亲和力
实验所用野生型赫赛汀及赫赛汀突变体为哺乳动物细胞HEK293瞬时表达所得，HER2抗原（胞外段）为上海百英生物科技股份有限公司生产。利用HER2抗原通过用生物膜干涉技术（biolayer interferomeory， BLI）测试与赫赛汀突变体的亲和力，进一步筛选与验证对HER2亲和力减弱的赫赛汀突变体。缓冲液配方：10mM HEPES，150mM 氯化钠，3 mMEDTA，0.1% BSA 和0.05% 吐温20；Octet® AHC2 生物传感器（赛多利斯，货号#18-5142）；BLI设备为赛多利斯公司生产的Octet R8；数据获取和分析工作分别采用Dataacquisition 12.0和 Data analysis 12.2软件进行。过程简述如下：
1. 野生型赫赛汀及赫赛汀突变体样本准备
用缓冲液稀释野生型赫赛汀及赫赛汀突变体至浓度10ug/ml，加入96孔测定板第2列，控制程序中设为Loading，600s。每一行均为一个独立的赫赛汀突变体，野生型赫赛汀位于第1行。
2. HER2抗原样本准备
用缓冲液将HER2抗原稀释到100nM，然后向下系列稀释使分析物HER2分析浓度为100、20、5、2.5、1.25 nM以及0浓度，分别加入96孔测定板4-9列，控制程序中设定为Association，200s。在96孔测定板第1，3，10，11列加入缓冲液，12列加入pH1.7的甘氨酸，上述样品和溶液的加样量均为200μL。
3. 检测抗体与HER2的亲和力
取8个Octet® AHC2 生物传感器（赛多利斯，货号#18-5142）分别置于传感器支架第1列的A-H，在Data acquisition 12.0 软件中将检测条件设置如下：1预湿：Baseline,60s, 位置：第1列。2循环检测：第2列：loading，600s；第3列：Baseline1，60s；样品4-9列：Association，200s，第10列：Dissociation，600s；第11列：中和；第12列：再生。
4. 数据分析
使用Data analysis 12.2软件对数据进行分析。以0浓度为对照扣减背景，通过Fitting curve计算KD值。
各赫赛汀突变体与HER2的亲和力如表3所示。结果显示，野生型赫赛汀与HER2的结合力为3.79 × 10-9M，所得的16个突变体中，3个突变体Mutant4，Mutant9，Mutant12结合力降至10-7M水平；8个突变体结合力降至10-8M~10-9M水平；其余突变体的结合力低于检测范围无法检出。本实施例表明，本发明通过AICD突变筛选平台获得了预想中的低亲和力赫赛汀突变体。
表3. 赫赛汀突变体与HER2亲和力列表(N.B. no binding, 不结合)
实施例3. 赫赛汀突变体的制备及表达量优化
本实施例中选择赫赛汀突变体Mutant4进行表达量优化，Mutant4的重链N端第50位氨基酸精氨酸R突变为甘氨酸G，与HER2的亲和力降低至3.9 × 10-7M，但表达量较低仅有8.9 mg/L。为尽可能在不影响抗体亲和力的情况下获得表达量较高的低亲和力突变体，依次将Mutant4重链第50位氨基酸甘氨酸G点突变为与甘氨酸具有相同性质的不带电非极性脂肪族氨基酸丙氨酸A，缬氨酸V，亮氨酸L，异亮氨酸I。并依次命名为Mutant4-1（Herceptin-VH-R50A），Mutant4-2（Herceptin-VH-R50V），Mutant4-3（Herceptin-VH-R50L），Mutant4-4（Herceptin-VH-R50I）。蛋白生产流程简述如下：
1. 委托苏州君跻生物科技有限公司合成质粒DNA，将上述赫赛汀抗体及其突变体轻链及重链DNA序列分别克隆至pTT5通用载体，按照《Qiagen Mini-prep Kit》和《QiagenEndofree Maxi-prep Kit》提到的操作方法，进行质粒的制备。野生型赫赛汀（Herceptin-wt）及赫赛汀突变体（Mutant）序列如下：野生型赫赛汀核酸序列如SEQ ID NO.3第49~2679所示：其中，第49~369：Herceptin-wt轻链可变区， 第370-693为轻链恒定区+终止密码子；第1330~1689为Herceptin-wt重链可变区，第1690-2679为重链恒定区；Mutant4重链可变区核酸序列如SEQ ID NO.6所示，Mutant4-1重链可变区核酸序列如SEQ ID NO.7， Mutant4-2重链可变区核酸序列如SEQ ID NO.8，Mutant4-3重链可变区核酸序列如SEQ ID NO.9，Mutant4-4重链可变区核酸序列如SEQ ID NO.10，Mutant9轻链可变区核酸序列如SEQ IDNO.11，重链可变区核酸序列如SEQ ID NO.12，Mutant12重链可变区核酸序列如SEQ IDNO.13。
2. 在哺乳动物细胞HEK293中进行瞬时表达。转染当天调整细胞密度至2 × 106cells/ml，取30 μg质粒（轻链质粒和重链质粒各15 μg）加入1.5 mL Opti-MEM (ThermoFisher，货号11058021)，涡旋混匀，常温静置5 min；同时将150 μg PEI (Thermo Fisher，货号919012)中加入1.5 mL Opti-MEM 中混匀，合并上述溶液并混匀，常温静置20min后，加入30 mL HEK293细胞中。转染96小时后离心并收集细胞上清液。
3. 蛋白纯化：使用Ezfast AT protein A 1 mL (博格隆)对上清中的抗体蛋白进行亲和纯化。
纯化后获得的新赫赛汀突变体使用生物膜干涉技术（biolayer interferomeory，BLI）测试其与HER2的亲和力强弱。操作流程同实施例2。
本实施例中各赫赛汀突变体瞬时表达水平、纯度及与HER2结合力如表4所示。其中Mutant4-1（Herceptin-VH-R50A）与HER2的结合力为3.88 × 10-7M，产量约为56.4 mg/LProteinA亲和纯化后的纯度为99%。在保持了与HER2有较低亲和力的情况下，大幅提高了表达量和纯度。
表4.表达量优化后赫赛汀突变体瞬时表达水平、纯度及与HER2结合力列表
实施例4. 赫赛汀突变体与NK92联用的体外杀伤实验
MC38-HER2为HER2基因人源化的MC38结肠癌细胞系(购自南模生物，目录号# NM-S13-TM13)，可在细胞膜表面表达HER2。在本实施例中，MC38-HER2作为靶细胞用于分析赫赛汀突变体与NK92联用后对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤效果。Cell Counting Kit-8简称CCK-8试剂盒（购自索莱宝生物技术有限公司，货号#CA1210），是一种基于WST-8的广泛应用于细胞毒性分析的快速高灵敏度检测试剂盒。WST-8的工作原理为在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan）。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450nm波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。本实施例中使用CCK-8检测杀伤效果，具体实验流程如下：
1. 靶细胞的准备
在96孔板中加入100 µL完全培养基（DMEM （Gibco, C11995500BT）+ 10%FBS（sigma,F8687）），将MC38-HER2以每孔20000个细胞的密度种入96孔板，在，37℃ 5％ CO2培养箱中培养6小时使细胞贴壁。
2. 加入赫赛汀突变体及NK92
实验设计分组如下，每组包含5个复孔：
A组：对照组，只加入NK92细胞，效靶比为5：1；
B组：实验组，加入野生型赫赛汀与NK92细胞，赫赛汀终浓度为10 µg/mL，效靶比为5：1；
C组：实验组，加入赫赛汀突变体（本实施例中使用的赫赛汀突变体为Mutant4-1）与NK92细胞，赫赛汀突变体终浓度为10 µg/mL，效靶比为5：1。
按照实验分组依次在96孔板中加入赫赛汀突变体及NK92细胞，使用完全培养基调整每孔体积至200 µL。
3. 共培养及检测
上述接种完毕后混匀，37℃ 5％ CO2培养箱中分别共培养4h和16h。共培养结束后向每孔中加入20 μL CCK8，37℃孵育2h。使用酶标仪在450nm处测定吸光度。
4. 结果计算
杀伤效率(％)=[A (实测值) -A (背景值)] / [A (无杀伤值) - A (背景值)]×100
A (实测值)：对照组和实验组测得的吸光度
A (背景值)：只具有培养基和CCK-8溶液的孔的吸光度
A (无杀伤值)：只具有靶细胞和CCK-8溶液的孔的吸光度
杀伤结果如图1所示，赫赛汀与NK细胞联用后能有效提升NK细胞对肿瘤细胞的杀伤效率，4小时由10.5%提升到31.1%，16小时由16.6%提升到46.7%，这依赖于赫赛汀介导的NK细胞ADCC效应。而当使用与HER2亲和力下降的赫赛汀突变体时，其介导的ADCC效应显著下降，4小时由31.1%下降到18.9%，16小时由46.7%下降到33.9%，与NK细胞联用杀伤肿瘤细胞的效率仅为野生型赫赛汀的60%。
实施例5. 赫赛汀突变体偶联NK92后的体外杀伤实验
本实施例中赫赛汀及其突变体（Mutant4-1）与NK92细胞进行共价偶联。偶联前抗体需经过修饰，在其上的若干个Lys上连接带有二磷酸鸟苷—岩藻糖（GDP-Fucose）的Linker。然后通过α-1 ,3-岩藻糖基转移酶的重组截短体(FucTd)的酶促反应将抗体偶联至NK92细胞膜表面的N-GlcNac上 ，并形成稳定的糖苷键，进而产生结构稳定、对抗体功能无影响、对细胞活性及功能无影响的细胞抗体偶联物。具体的偶联过程如下：
首先，利用TCO-PEG4-NHS上的NHS活性酯与抗体蛋白的伯胺反应，形成稳定的酰胺键。在100 μL的反应体系中，加入1mg纯化后的赫赛汀或其突变体蛋白和15 μg TCO-PEG4-NHS (上海派瑞医药科技有限公司，产品编号A34125)，使用20 mM HEPES buffer（pH 7 .0~7 .5，赛默飞世尔科技（中国）有限公司，产品编号15630）调整体积至100 μL，室温孵育30min。加入5 μL 1 M Tris buffer（pH8.0，）终止反应，室温孵育5 min。反应产物加入PDSpinTrap G-25脱盐柱（Cytiva公司，产品编号28918004），800×g离心，去除未反应的以及反应生成的小分子，获得纯的连有TCO-PEG4的赫赛汀或其突变体。
其次，利于反式环辛烯（TCO）和四嗪（Tetrazine）之间逆电子需求的Diels-Alder环加成反应，将连有TCO-PEG4的赫赛汀或其突变体与GDP-Fucose-PEG4-Methyltetrazine（岩唐生物科技有限责任公司合成，产品编号YT-HJP-3-29）偶联在一起。将上一步得到的连有TCO-PEG4的赫赛汀或其突变体与30 μg GDP-Fucose-PEG4-Methyltetrazine反应，室温孵育30 min后，将反应产物加入PD SpinTrap G-25脱盐柱，800×g离心，去除未反应的以及反应生成的小分子，获得纯的偶联GDP-Fucose的赫赛汀或其突变体。
最后，使用岩藻糖基转移酶（本发明中使用的为CN114369585A公开的一种幽门螺杆菌的α-1 ,3-岩藻糖基转移酶的重组截短体(FucTd)）将带有GDP-Fucose的赫赛汀或其突变体偶联到NK92细胞膜表面的N-GlcNac上。在5×107/mL NK92细胞中分别加入50 μg/mL岩藻糖基转移酶以及200 μg/mL 带有GDP-Fucose的赫赛汀或其突变体，室温孵育30 min。反应结束后，用pH7.4 PBS清洗，500×g离心5 min，去除上清。偶联赫赛汀或其突变体的NK92细胞重悬于PBS 中， 用于随后的杀伤实验。
本实施例中，使用MC38-HER2细胞作为靶细胞分析偶联赫赛汀或其突变体的NK92细胞对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤效果，杀伤实验具体实验流程及数据分析同实施例5，实验分组如下，每组5个复孔：
A组：对照组，加入未偶联的NK92细胞，效靶比为5：1；
B组：实验组，加入偶联野生型赫赛汀的NK92细胞，效靶比为5：1；
C组：实验组，加入偶联赫赛汀突变体（本实施例中使用的赫赛汀突变体为Mutant4-1）的NK92细胞，效靶比为5：1。
杀伤结果如图2所示，与单独使用NK92细胞相比，偶联赫赛汀的NK92细胞在4小时内的杀伤效率提高3倍多（11.9% vs 37.7%），16小时内的杀伤效率提高3倍多（16.2% vs53%）。并且偶联低亲和力赫赛汀突变体的NK92细胞有更高的杀伤效率，4小时内的杀伤效率由37.7%提高到40.5%，16小时内的杀伤效率由53%提高到60.6%，这与NK92细胞在发挥杀伤作用后能及时与靶细胞分离从而减少自身凋亡有关。
接下来我们使用7-ADD（7-Aminoactinomycin D）荧光DNA染料（北京百奥莱博科技有限公司，产品编号#KFS190）标记与靶细胞孵育4小时后的NK92细胞抗体偶联物中的凋亡细胞，并通过流式细胞仪检测。染色结果如图3所示，结果表明偶联低亲和力赫赛汀的NK细胞中的凋亡细胞数量比偶联野生型赫赛汀的NK细胞更少（7% vs 11%），接近新鲜NK细胞（该组NK细胞并未进行杀伤实验，直接从培养基中取出检测）中的凋亡细胞数量（7% vs 5%）。
实施例6. 赫赛汀突变体偶联NK92后的小鼠体内肿瘤抑制实验
按照实施例5制备偶联赫赛汀或其突变体的NK92细胞（本实施例中使用的赫赛汀突变体为Mutant4-1）。
12只6~8周龄NOG小鼠，随机分成4组，每组3只小鼠，实验分组如下：
A组：对照组，腹腔注射200 μL PBS；
B组：赫赛汀与NK92联用组，同时腹腔注射野生型赫赛汀（20 μg/只/剂）和NK92细胞（5×106 Cells/只/剂），使用PBS调整注射液体体积至200 μL；
C组：偶联野生型赫赛汀的NK92实验组，腹腔注射偶联野生型赫赛汀的NK92细胞（5×106 Cells/只/剂；NK92细胞上共偶联有20 μg野生型赫赛汀），使用PBS调整注射液体体积至200 μL；
D组：偶联低亲和力赫赛汀突变体的NK92实验组，腹腔注射偶联低亲和力赫赛汀突变体的NK92细胞（5×106 Cells/只/剂；NK92细胞上共偶联有20 μg低亲和力赫赛汀突变体），使用PBS调整注射液体体积至200 μL；
NOG小鼠由北京维通达生物技术有限公司购入，并饲养于维通达生物。本实施例中使用的靶细胞为可以稳定表达萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）的MC38-HER2-luc细胞，该细胞通过包装有Luciferase表达基因的慢病毒（购自重庆英茂盛业生物科技有限公司）转染MC38-HER2细胞获得。接种小鼠体内后可以以荧光素（Luciferin）为底物来检测萤火虫荧光素酶的含量，并通过活体成像技术分析小鼠体内肿瘤细胞的分布和大小。在给药前3天，每只小鼠通过腹腔注射3×105的MC38-HER2-luc细胞。接种肿瘤后第3天，按照实验分组通过腹腔注射的方式进行给药，给药频率为一周2次，共计给药4次。每周使用活体成像仪（PerkinElmer IVIS）进行成像，记录肿瘤变化情况。每次成像前10 min，通过腹腔注射的方式按照150 mg/kg的剂量注射荧光素底物（MedChemExpress，货号#HY-12591A）。
实验结果如图4、图5和表5所示，在相同的赫赛汀用量下，偶联赫赛汀的NK92实验组相比赫赛汀与NK92联用组在体内对HER2阳性细胞有更好的杀伤效果。偶联低亲和力赫赛汀突变体的NK92显示出了更持久的杀伤能力。
表5. 各实验组NOG小鼠用药后荧光素活体成像数据统计表（荧光强度单位：photons/sec）
实施例7. 赫赛汀突变体偶联NK92后的半衰期评价实验
按照实施例5制备偶联赫赛汀或其突变体的NK92细胞（本实施例中使用的赫赛汀突变体为Mutant4-1）。
24只6~8周龄SCID Beige小鼠，随机分成2组，每组12只小鼠。实验分组如下：
A组：瘤内注射偶联野生型赫赛汀的NK92细胞，使用PBS调整注射液体体积至50 μL；
B组：瘤内注射偶联低亲和力赫赛汀突变体的NK92细胞，使用PBS调整注射液体体积至50 μL。
本实施例中SCID Beige小鼠由北京维通利华实验动物有限公司，并饲养于巢生源科动物实验室。使用MC38-HER2作为靶细胞，取1×106的MC38-HER2在小鼠肩胛右侧皮下注射，沿着三个正交轴（a、b和c）测量肿瘤体积，并计算为肿瘤体积=abc/2。当肿瘤生长至100~150 mm2时（约7~9天），按照实验分组通过瘤内注射的方式在小鼠肿瘤内注射入偶联赫赛汀或其突变体的NK92细胞。并分别在第0、1、3、7天取出小鼠肿瘤，每次每组取3只。取出的肿瘤剪碎后使用II型胶原酶在37℃的条件下消化2小时，制成单细胞悬液。所得细胞使用PE-anti-hCD45抗体（Biolegend，货号#368510，1：200稀释）、FITC-anti-hCD3抗体（Elabscience，货号# E-AB-F1230C，1：200稀释）和APC-anti-hCD56抗体（Elabscience，货号# E-AB-F1239E，1：200稀释）染色标记。通过流式细胞仪检测并分析其中的NK细胞（humanCD45阳性，human CD3阴性，human CD56阳性为NK细胞）数量。
检测结果如图6所示，瘤内注射后第7天，与低亲和力赫赛汀突变体偶联的NK细胞相比与野生型赫赛汀偶联的NK细胞在肿瘤微环境中的数量多一倍。用非线性回归的方法，计算出在肿瘤微环境中偶联野生型赫赛汀的NK92细胞半衰期约2.5天，偶联低亲和力赫赛汀突变体的NK92细胞半衰期约4.2天。这说明偶联低亲和力抗体的NK细胞可以通过其偶联抗体低亲和力的特点使NK细胞更易于与靶细胞分离，从而提高了NK细胞在肿瘤微环境中的生存能力。
Claims (12)
1.一种赫赛汀抗体突变体，其特征在于，所述赫赛汀抗体突变体为在氨基酸序列如SEQID NO.1第1-107位氨基酸所示的轻链可变区，以及氨基酸序列如SEQ ID NO.2第1-120位氨基酸所示的重链可变区的基础上的轻链可变区F53L突变体、轻链可变区R66G突变体、轻链可变区H91Q突变体、重链可变区R50G突变体、重链可变区R50A突变体、重链可变区R50V突变体、重链可变区R50L突变体、重链可变区R50I突变体、重链可变区R59T突变体、重链可变区G103R突变体、重链可变区F104L突变体、轻链可变区H91Q及重链可变区R50G突变体、重链可变区R50G及G103R突变体、重链可变区G103R及F104L突变体、或重链可变区VH-R50G、R59T及G103R突变体。
2.根据权利要求1所述的赫赛汀抗体突变体，其特征在于，所述赫赛汀抗体突变体的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1第108-214位氨基酸所示，重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2第121-450位氨基酸所示。
3. 一种编码权利要求1或2所述赫赛汀抗体突变体的多核苷酸。
4. 根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，编码所述赫赛汀抗体重链可变区R50G突变体重链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，轻链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.3第49-369所示，或
编码所述赫赛汀抗体重链可变区R50A突变体重链可变区的多核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示，轻链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.3第49-369所示，或
编码所述赫赛汀抗体重链可变区R50V突变体重链可变区的多核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示，轻链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.3第49-369所示，或
编码所述赫赛汀抗体重链可变区R50L突变体重链可变区的多核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示，轻链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.3第49-369所示，或
编码所述赫赛汀抗体重链可变区R50I突变体重链可变区的多核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示，轻链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.3第49-369所示，或
编码所述赫赛汀抗体轻链可变区H91Q及重链可变区R50G突变体重链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，轻链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，或
编码所述赫赛汀抗体重链可变区R50G及G103R突变体重链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，轻链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.3第49-369所示。
5.根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，编码所述赫赛汀抗体突变体的重链恒定区的多核苷酸的序列如SEQ ID NO.3第1690-2679位所示，编码所述赫赛汀抗体突变体的轻链恒定区的多核苷酸的序列如SEQ ID NO.3第370-690所示。
6.一种表达权利要求1或2所述赫赛汀抗体突变体的载体，其特征在于，所述载体含有权利要求3-5任一所述的多核苷酸。
7.一种表达权利要求1或2所述赫赛汀抗体突变体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求6所述的载体。
8.权利要求1或2所述赫赛汀抗体突变体在制备肿瘤治疗药物中的应用。
9.一种偶联了权利要求1或2所述赫赛汀抗体突变体的具有抑制和/或杀伤肿瘤活性的效应细胞。
10.根据权利要求9所述的效应细胞，其特征在于，所述效应细胞为NK细胞。
11.权利要求9或10所述的效应细胞在制备肿瘤治疗药物中的应用。
12.一种将赫赛汀抗体或权利要求1或2所述赫赛汀抗体突变体与效应细胞偶联的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）对所述赫赛汀抗体或其突变体进行修饰，获得连接TCO-PEG4的赫赛汀抗体突变体；
（2）将步骤（1）获得的连接TCO-PEG4的赫赛汀抗体突变体与鸟苷5′-二磷酸-岩藻糖-三氮唑-四聚乙二醇-甲基四嗪反应获得偶联GDP-Fucose的赫赛汀抗体突变体；
（3）使用岩藻糖基转移酶将步骤（2）获得的偶联GDP-Fucose的赫赛汀抗体突变体偶联到NK细胞膜表面的N-GlcNac上。
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