CN1184878C - 单不饱和脂肪酸总含量增加的植物、种子和油 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了长链单不饱和脂肪酸含量至少约为82%和芥酸含量至少约为15%的植物、种子和油。还描述了产生具有脂肪酸含量组成特性植物的方法。

Description

单不饱和脂肪酸总含量增加的植物、种子和油
技术背景
本发明涉及脂肪酸去饱和酶和编码去饱和酶蛋白的核酸。具体地说，本发明涉及编码δ-12和δ-15脂肪酸去饱和酶蛋白的核酸，这些去饱和酶蛋白影响植物中的脂肪酸组成，这些核酸产生的多肽和表达这些核酸的植物。
发明背景
已进行许多繁殖研究着力改善芸苔属中的脂肪酸组成(分布图)。Pleines和Freidt，Fat Sci.Technol.，90(5)，167-171(1988)报道了C18:3水平降低(2.5-5.8％)且含高油酸(73-79％)的植物品系。Rakow和McGregor，J.Amer.OilChem.Soc.，50,400-403(Oct.1973)讨论了与选择亚油酸和亚麻酸突变体相关的问题。在Can.J.Plant Sci.，68,509-511(Apr.1988)公开了所产种子油含3％亚麻酸和28％亚油酸的星形夏季油菜(Stellar summer rape)。Roy和Tarr，Z.Pflanzerzuchtg，95(3)，201-209(1985)报道了通过种间杂交将基因从蔓芥子转移到欧洲油菜，产生了结合高亚麻酸和低亚油酸含量的重建品系。Roy和Tarr，PlantBreeding，98，89-96(1987)讨论了开发具有改良的亚麻酸和亚油酸含量的蔓芥子的前景。1989年7月12日出版的欧洲专利申请323,753中公开了油酸含量大于79％且亚麻酸含量小于3.5％的油和种子。Canvin，Can.J.Botany，43，63-69(1965)讨论了温度对几种种子作物(包括油菜籽)的油中脂肪酸组成的作用。
突变的诱导通常采用极高剂量的辐射和/或化学诱变剂(Gaul，H.RadiationBotany(1964)4：155-232)。超过LD50(通常达到LD90)的高剂量将产生最大的突变率。在芸苔属繁殖突变中，单用高剂量的化学诱变剂或与辐射联合，诱导了有限数量的脂肪酸突变体(Rakow，G.Z.Pflanzenzuchtg(1973)69：62-82)。从Rakow突变繁殖程序中衍生的低α-亚麻酸突变体没有直接的商业用途，因为种子产量太低。第一个用低α-亚麻酸突变体(1973年衍生的)栽培的商业品种在1988年作为Stellar品种投放市场(Scarth，R等人，Can.J.Plant Sci.(1988)68：509-511)。在投放市场时，Stellar的产量比商品栽培品种低20％。
另外，期望植物油脂肪酸组成能满足特殊食品和工业用途。例如，种子油和这些油的制成品中单不饱和脂肪酸水平(油酸)增加的芸苔属canola低芥酸油菜籽突变体，能改善脂类营养。多不饱和脂肪酸低含量和油酸高含量的Canola品系，具有较高抗氧化稳定性，这是应用于零售食品业的有用性状。应用于工业的植物油(如润滑油)的有用性状包括理想的低温性状，如低流动点和低混浊点，以及非常好的抗氧化稳定性。
δ-12脂肪酸去饱和酶(也称为油酸去饱和酶)参与油酸酶促转化成亚油酸。δ-15脂肪酸去饱和酶(也称为亚油酸去饱和酶)参与亚油酸酶促转化成α-亚麻酸。已克隆了微粒体δ-12去饱和酶，并用T-DNA标记鉴定。Okuley等人，Plant Cell6：147-158(1994)。Lightner等人在WO94/11516中描述了高等植物中编码微粒体δ-12脂肪酸去饱和酶的基因的核苷酸序列。Yadav，N等人，Plant Physiol.，103：467-476(1993)，WO93/11245和Arondel，V等人，Science，258：1353-1355(1992)中公开了编码微粒体和质体6-15脂肪酸去饱和酶的高等植物基因的序列。
发明概述
含具有异源长链和高单不饱和水平脂肪酸的三酰甘油，可为工业应用提供有用的特性。含具有高单不饱和水平和异源长链的脂肪酸组成的植物，是工业用油的来源(如润滑油)。
本发明一方面涉及芸苔属植物及其后代，它们产生的种子含有的长链单不饱和脂肪酸至少为82％，芥酸含量至少为15％(总脂肪酸组成中)。种子中油酸和二十碳烯酸在总脂肪酸组成中分别占至少37％和14％。这些种子的饱和脂肪酸含量小于7％，多不饱和脂肪酸含量小于11％。
在一些实施例中，植物的单不饱和脂肪酸含量约为85％-90％，芥酸含量至少为15％(总脂肪酸组成中)。在这些植物中，油酸的含量至少约为42％，具体地说约为47％-56％(总脂肪酸组成中)。芥酸的含量约为17％-31％，二十碳烯酸的含量约为15％-21％。
本发明还涉及芸苔属种子油，其所含的长链单不饱和脂肪酸含量至少为82％，芥酸含量至少约为15％(总脂肪酸组成中)。这些油中油酸和二十碳烯酸的含量分别至少为14％和37％(总脂肪酸组成中)。饱和脂肪酸含量可能小于约7％，如小于4％或约2-4％。多不饱和脂肪酸含量小于约11％，在一些实施例中小于9％(总脂肪酸组成中)。α-亚麻酸的含量可以为约1％-2％。
在一些实施例中，芸苔属种子油中所含的长链单不饱和脂肪酸含量约为85％-90％。在这些油中，油酸的含量植物约为42％，在一些实施例中约为47％-56％(总脂肪酸组成中)。芥酸和二十碳烯酸含量分别约为17％-31％和15％-21％(总脂肪酸组成中)。还涉及的芸苔属种子油所含的长链单不饱和脂肪酸含量至少为82％，其中神经酸、芥酸和二十碳烯酸含量的总和约为50％-66％(总脂肪酸组成中)。这种种子油的油酸含量约为25％-30％。
本发明涉及产生长链单不饱和脂肪酸含量至少约为82％和芥酸含量至少约为15％(总脂肪酸组成中)的植物的方法。该方法包括将一种植物品系与第二种植物品系杂交，并挑选具有理想脂肪酸组成的后代。所述的第一种植物品系芥酸的含量至少约为45％。所述的第二种植物品系油酸的含量至少约为84％。
本发明还涉及制造植物油的方法。该方法包括碾碎芸苔属种子，所述的芸苔属种子所含的长链单不饱和脂肪酸至少约为82％，芥酸含量至少约为15％(总脂肪酸组成中)，并从碾碎的种子中提取植物油。该方法还包括油的精炼、漂白和脱臭步骤。
本发明还涉及含芸苔属油的润滑油和液压液，所述的芸苔属油含有含量至少约为82％的长链单不饱和脂肪酸、含量至少约为15％的芥酸(总脂肪酸组成中)和添加剂。所述的添加剂可以是抗氧化剂、防锈剂、防腐剂、降凝剂、消泡剂、着色剂、脱垢剂。添加剂的量约为0.01％-20％(重量)。
序列表简述
SEQ ID NO：1显示了野生型芸苔属Fad2-D基因编码区域的DNA序列。SEQ IDNO：2是SEQ ID NO：1演绎出的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3显示了IMC 129突变体芸苔属Fad-2D基因编码区域的DNA序列。SEQ ID NO：4是SEQ ID NO：3演绎出的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5显示了野生型芸苔属Fad2-F基因编码区域的DNA序列。SEQ IDNO：6是SEQ ID NO：5演绎出的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7显示了Q508突变体芸苔属Fad-2F基因编码区域的DNA序列。SEQ ID NO：8是SEQ ID NO：7演绎出的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9显示了Q4275突变体芸苔属Fad-2F基因编码区域的DNA序列。SEQ ID NO：10是SEQ ID NO：9演绎出的氨基酸序列。
附图简述
图1显示了在Q508 X Westar杂交的分离种类中，种子油油酸(C18:1)含量的频率分布图。标记为WSGA 1A的条柱代表Westar亲代的C18:1的含量。标记为Q508的条柱代表Q508亲代C18:1的含量。
图2显示了芸苔属Fad2-D野生型基因(Fad2-D wt)、IMC129突变体基因(Fad2-D GA316 IMC129)、Fad2-F野生型基因(Fad2-F wt)、Q508突变体基因(Fad2-FTA515 Q508)和Q4275突变体基因(Fad2-F GA908 Q4275)的核苷酸序列。
图3显示了图2的多核苷酸演绎的氨基酸序列。
图4显示了用于产生高芥酸和高油酸含量芸苔属植物的繁殖流程图。
发明详述
本文所用的所有脂肪酸百分比都是油(其中脂肪酸作为一种成分)的重量百分比。
本文所用的“品系”是指诸个体之间至少一种性状表现出极少变异或没有变异的一类植物。可通过几代自花授粉传代和挑选，或用组织或细胞培养技术从一个亲代进行营养繁殖产生这些品系。本文所用的“品种”是指用于商业生产的品系。
术语“诱变”是指用诱变剂在个体群中诱导随机基因突变。然后筛选处理过的群体或该群体的后代，以得到突变的有效性状。“群体”是指一群具有相同基因库的个体。本文所用的“M0”指未处理的种子。本文所用的“M1”是指接触过诱变剂的种子(及其生长出的植物)，而“M2”指M1植物自花授粉的后代(种子和植物)，“M3”指M2植物自花授粉的后代，和“M4”指M3植物自花授粉的后代。“M5”指M4植物自花授粉的后代。“M6”、“M7”等均是前一代植物自花授粉的后代。术语“自交”指自花授粉。
本文所用的“稳定性”或“稳定”是指对某给定脂肪酸成分而言，代与代之间(至少两代，较佳地为至少三代)该成分基本保存在同一水平，如较佳地±5％。本发明的方法产生的品系，代与代之间保持改良的脂肪酸组成稳定在±5％。上述稳定性可能受温度、地理位置、应力(环境)和栽培时间的影响。因此，脂肪酸组成分布的比较应在类似的生长环境中产生的种子间进行。根据前一代的数据确定稳定性。
集约培养产生的某些芸苔属植物，其种子油所含的芥酸少于2％。已繁殖了相同的品种，其脱脂粉至多含有30μmol芥子油甙/克。本文所用的“Canola”是指含至多2％芥酸(C22:1)的植物种子或植物油，其脱脂粉中至多有30μmol芥子油甙/克。
申请者发现了δ-12脂肪酸去饱和酶基因突变的植物。这种植物的种子油中脂肪酸组成有有利的变化。这些突变是指，例如油酸含量增加、亚油酸含量的降低和稳定，或既增加油酸含量又降低和稳定亚油酸含量。
申请者还发现了δ-15脂肪酸去饱和酶基因突变的植物。这种植物的种子油中脂肪酸组成有有利的变化，如α-亚麻酸水平的降低和稳定。
申请者还发现分离的核酸片段(多核苷酸)，其含有在δ-12或δ-15脂肪酸去饱和酶编码序列中携带突变的序列。突变赋予了携带这种突变的植物种子油中脂肪酸水平的理想改变。已知δ-12脂肪酸去饱和酶是ω-6脂肪酸去饱和酶，有时也称为Fad2或12-DSE。已知δ-15脂肪酸去饱和酶是ω-3脂肪酸去饱和酶，有时也称为Fad3或15-DSE。
本发明的核酸片段可能以RNA的形式或DNA的形式，包括cDNA、合成的DNA或基因组DNA。DNA可以是双链的或单链的，若为单链可以是编码链也可以是非编码链。RNA类似物可以是，例如mRNA或和核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。本发明核酸片段的说明实施例是图3所示的突变体序列。
本发明的核酸片段在微粒体δ-12脂肪酸去饱和酶编码序列中含有突变或在微粒体δ-15脂肪酸去饱和酶编码序列中含有突变。这种突变使得所产生的去饱和酶基因产物在植物中无功能(相对于野生型序列编码的基因产物的功能)。δ-12去饱和酶基因产物的非功能性可从表达该突变序列的植物组织中反应产物(亚油酸)水平的降低和底物(油酸)水平的增加(与表达野生型序列的植物组织中相应的水平相比)推断出。δ-15去饱和酶基因产物的非功能性可从表达该突变序列的植物组织中反应产物(α-亚麻酸)水平的降低和底物(亚油酸)水平的增加(与表达野生型序列的植物组织中相应的水平相比)推断出。
本发明的核酸片段可以含有该编码序列的一部分，如至少约10个核苷酸，只要该片段在编码序列中至少含有一个突变。所需片段的长度取决于该片段待用的目的，如PCR引物、定点诱变等。在一实例中，本发明的核酸片段含有突变体δ-12或突变体δ-15脂肪酸去饱和酶的全长编码序列，如图3的突变体序列。在另一实例中，核酸片段的长度约为20-50个核苷酸(或碱基对，bp)，或约50-500个核苷酸，或约500-1200个核苷酸。
可用核酶在植物种子油的脂肪酸水平中产生理想的变化。可采用设计成能切割δ-12或δ-15去饱和酶mRNA转录物的核酶分子，来防止δ-12或δ-15去饱和酶的表达。虽然可用各种核酶(在特异性位点识别序列处切割mRNA)来破坏去饱和酶mRNA，但锤头核酶是特别有用的。锤头核酶在(与靶mRNA形成互补碱基对)的侧翼区域所辖部位切割mRNA。唯一的要求就是靶RNA含有5’-UG-3’核苷酸序列。锤头核酶的构建和生成是本领域熟知的。见如美国专利No.5,254,678。可将锤头核酶序列包埋到稳定的RNA中(如转运RNA，tRNA)，以增加体内切割效率。Perriman，R等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92(13)：6175-6179(1995)；deFeyter，R.和Gaudron，J.. Methods in Molecular Biology，Vol.74，第43章，“植物中核酶的表达”，Turner P.C，编辑，Humana Press Inc.，Totowa，NJ。也可用RNA内切核糖核酸酶，如在噬热四膜虫(Tetrahymena thermophila)中天然产生的，Cech和其合作者对其有广泛描述。见美国专利No.4,987,071。
本发明核酸片段中的突变可以在该编码序列中的任何一个部位(导致得到的基因产物无功能)。适合的突变类型包括(但并不限于)核苷酸的插入、核苷酸的缺失、或野生型编码序列的转换或颠换。这些突变将导致相应基因产物中一个或多个氨基酸的插入、一个或多个氨基酸的缺失、和保守性氨基酸取代。在一些实例中，核酸片段的序列可以含有多个突变或多种类型的突变。
编码序列中氨基酸的插入或缺失可能，例如破坏产生的基因产物的基本α-螺旋或β-折叠片层区域的构象。氨基酸的插入或缺失也可能破坏对基因产物活性而言非常重要的结合或催化位点。本领域已知大量毗邻氨基酸的插入或缺失非常可能导致基因产物无功能(与较小数量插入的或缺失的氨基酸相比)。非保守性氨基酸的取代可能用不同类型的氨基酸取代某类型的氨基酸。非保守性取代将基本改变基因产物的电荷或疏水性。非保持性氨基酸取代也可能基本改变残基侧链的体积大小，如异亮氨酸残基被丙氨酸残基取代。
非保守性取代的例子包括碱性氨基酸替代非极性氨基酸、极性氨基酸替代酸性氨基酸。因为基因中只有20种编码氨基酸，可用突变的常规试验(将不同类型的氨基酸加入到目标基因产物的该区域中)，确定导致无功能基因产物的取代。
优选的突变是在编码氨基酸序列基序(在δ-12脂肪酸去饱和酶或δ-15脂肪酸去饱和酶中保守的基序)，如His-Xaa-Xaa-Xaa-His基序(表1-3))的核酸域中。适合的区域的例子是：在相应于拟南芥属和芸苔属δ-12去饱和酶序列氨基酸105-109的核苷酸中，在相应于大豆δ-12去饱和酶序列的氨基酸101-105的核苷酸中和相应于玉米δ-12去饱和酶序列氨基酸111-115的核苷酸中的保守HECGH基序。如见WO 94/115116；Okuley等人，Plant Cell 6：147-158(1994)。本文所用的单字母氨基酸命名见Alberts，B等人，Molecular Biology of the Cell，第三版，Garland Publishing，New York，1994。侧接该基序的氨基酸在δ-12和δ-15去饱和酶中也是高度保守的，也是本发明片段突变的适合候选。
本发明核酸片段突变的说明性实例是在芸苔属微粒体δ-12去饱和酶序列的HECGH基序中Lys取代Glu(D型或F型)。该突变导致序列HECGH改变成HKCGH，见SEQ ID NO：2(野生型D)与SEQ ID NO：4(突变型D)的比较可考虑。在其它Fad-2序列中作类似突变，产生无功能的基因产物。
可在拟南芥属微粒体δ-15脂肪酸去饱和酶的氨基酸101-105中，以及在相应的油菜和大豆去饱和酶中发现类似的基序(表5)。如见WO 93/11245；Arondel，V等人，Science，258：1153-1155(1992)；Yadav，N等人，Plant Physiol.，103：467-476(1993)。质体δ-15脂肪酸含有类似的基序(表5)。使得到的基因产物无功能的HECGH基序突变类型是非保守性替代。非保守替代的说明性例子是甘氨酸残基替代第一或第二组氨酸。这种替代用非极性残基(甘氨酸)替代了带电的残基(组氨酸)。另一使得到的基因产物无功能的突变类型是插入突变，如在HECGH基序的半胱氨酸和谷氨酸残基中插入甘氨酸。
其它具有适合的保守的氨基酸基序的区域包括表2所示的HRRHH基序、表6所示的HRTHH基序和表3所示的HVAHH基序。如见WO 94/115116；Hitz，W等人，Plant Physiol，105：635-641(1994)；Okuley，J等人，同上；和Yadav，N等人，同上。表3所示区域中突变的说明性例子是在相应于甘氨酸密码子(欧洲油菜氨基酸303)的核苷酸的突变。非保守性Glu替代Gly导致氨基酸序列DRDYGILNKV变化成DRDYEILNKV(将SEQ ID NO：6的野生型F与SEQ ID NO：10的突变体Q4275相比，图3)。
另一适于在δ-12去饱和酶序列中突变的区域在相应于芸苔属去饱和酶序列氨基酸171-175的核苷酸中含有基序KYLNNP。突变的说明性例子是该区域His替换Leu，产生氨基酸序列(表4)KYHNN(将SEQ ID NO：6的野生型Fad2-F与SEQ IDNO：8的突变体相比)。可考虑在其它Fad-2氨基酸序列中作类似的突变，产生无功能的基因产物。
                   表1
微粒体δ-12脂肪酸去饱和酶氨基酸序列的对比
    品种     位点     氨基酸序列
    鼠耳芥     100-129     IWVIAHECGH HAFSDYQWLD DTVGLIFHSF
    大豆     96-125     VWVIAHECGHHAFSKYQWVDDVVGLTLHST
    玉米     106-135     VWVIAHECGHHAFSDYSLLD DVVGLVLHSS
    蓖麻a     1-29     WVMAHDCGH HAFSDYQLLD DVVGLILHSC
  欧洲油菜D   100-128     VWVIAHECGH HAFSDYQWLD DTVGLIFHS
  欧洲油菜F   100-128     VWVIAHECGH HAFSDYQWLD DTVGLIFHS
a从质粒pRF2-1C采样
                    表2
微粒体δ-12脂肪酸去饱和酶氨基酸序列的对比
    品种   位点     氨基酸序列
    鼠耳芥   130-158     LLVPYFSWKY SHRRHHSNTG SLERDEVFV
    大豆   126-154     LLVPYFSWKI SHRRHHSNTG SLDRDEVFV
    玉米   136-164     LMVPYFSWKY SHRRHHSNTG SLERDEVFV
    蓖麻a   30-58     LLVPYFSWKH SHRRHHSNTG SLERDEVFV
    欧洲油菜D   130-158     LLVPYFSWKY SHRRHHSNTG SLERDEVFV
    欧洲油菜F   130-158     LLVPYFSWKY SHRRHHSNTG SLERDEVFV
a从质粒pRF2-1C采样
                    表3
微粒体δ-12脂肪酸去饱和酶氨基酸序列的对比
品种   位点     氨基酸序列
鼠耳芥   298-333     DRDYGI LNKVFHNITDTHVAHHLFSTMPHYNAMEAT
大豆   294-329     DRDYGILNKVFHHITDTHVAHHLFSTMPHYHAMEAT
玉米   305-340     DRDYGILNRVFHNITDTHVAHHLFSTMPHY AMEAT
蓖麻a   198-224     DRDYGILNKV GHNITDTQVA HHLF TMP
欧洲油菜D   299-334     DRDYGILNKVFHNITDTHVAHHLFSTMPHYAMEAT
欧洲油菜F   299-334     DRDYGILNKVFHNITDTHVAHHLFSTMPHYHAMEAT
a从质粒pRF2-1C采样
                    表4
微粒体δ-12脂肪酸去饱和酶氨基酸序列的对比
    品种   位点     氨基酸序列
    鼠耳芥   165-184     IKWYGKYLNN PLGRIM
    大豆   161-176     VAWFSLYLNN PLGRAV
    玉米   172-187     PWYTPYVYNN PVGRVV
    蓖麻a   65-80     IRWYSKYLNN PPGRIM
    欧洲油菜D   165-180     IKWYGKYLNN PLGRTV
    欧洲油菜F   165-180     IKWYGKYLNN PLGRTV
a从质粒pRF2-1C采样
                        表5
质粒和微粒体δ-15脂肪酸去饱和酶的保守氨基酸的对比
    品种   位点     氨基酸序列
    鼠耳芥a   156-177     WALFVLGHD CGHGSFSNDP KLN
    欧洲油菜a   114-135     WALFVLGHD CGHGSFSNDP RLN
    大豆   164-185     WALFVLGHD CGHGSFSNNS KLN
    鼠耳芥   94-115     WAIFVLGHD CGHGSFSDIP LLN
    欧洲油菜   87-109     WALFVLGHD CGHGSFSNDP RLN
    大豆   93-114     WALFVLGHD CGHGSFSDSP PLN
a质粒的序列
                       表6
质粒和微粒体δ-15脂肪酸去饱和酶的保守氨基酸的对比
    品种   位点     氨基酸序列
    鼠耳芥a   188-216     ILVPYHGWRI SHRTHHQNHG HVENDESWH
    欧洲油菜a   146-174     ILVPYHGWRI SHRTHHQNHG HVENDESWH
    大豆   196-224     ILVPYHGWRI SHRTHHQHHG HAENDESWH
    鼠耳芥   126-154     ILVPYHGWRI SHRTHHQNHG HVENDESWV
    欧洲油菜   117-145     ILVPYHGWRI SHRTHHQNHG HVENDESWV
    大豆   125-153     ILVPYHGWRI SHRTHHQNHG HIEKDESWV
a质粒的序列
氨基酸基序及其相关位点的保守表明，可能在其它品种的相应区域中突变的δ-12或δ-15脂肪酸去饱和酶区域(能在某一品种中突变产生无功能的去饱和酶)，在该品种中产生无功能的δ-12去饱和酶或δ-15去饱和酶基因产物。
表1-6中任一区域的具体突变以及那些与本文所列举突变基本相同的突变(如上所述，只要这些突变使得到的去饱和酶基因产物无功能)都包括在本发明的范围中。
可用本领域技术人员已知的方法产生含突变序列的核酸片段。这些技术包括(但并不限于)野生型序列的定点诱变和用自动DNA合成仪直接合成。
也可通过诱导植物种子或再生的植物种子突变(如用乙基磺酰甲烷、X-射线或其它诱变剂)，产生含突变序列的核酸片段。诱变后，用已知的方法鉴定种子中具有所需脂肪酸表型的突变植物，从突变品系的基因组DNA或RNA分离出含所需突变的核酸片段。然后通过δ-12去饱和酶或δ-15去饱和酶基因编码区域的测序，确定特异性突变的部位。另外，可用对所需突变有特异性的标记的核酸探针迅速筛选诱变的群体。
本文公开的方法可用于所有芸苔属油菜籽和各品种春季和冬季成熟的类型。诱导突变可用物理诱变剂，包括(但并不限于)X-射线、UV射线和其它导致染色体损伤的物理处理，和其它化学诱变剂，包括(但并不限于)溴化乙锭、亚硝基胍、双环氧丁烷等。也可在植物发育的其它阶段进行诱变处理，包括(但并不限于)细胞培养、胚芽、小芽胞和根尖。
本文所用的“稳定的突变”是指在最少三代内维持所选的改变的脂肪酸组成的M5或其更后代品种，包括最少在田地条件下的两代，而且最少两代超过设定的统计域值(用气相层析分析测定最少10个随机选择的种子批)。另外，可用相同的方法与后代作比较衡量稳定性。对于后代，稳定性的定义是在基本类似的条件下生长时，种子中脂肪酸组成与前代或后代的组成相似。
突变繁殖通常产生的植物除具有感兴趣的性状外，还具有多种有害的性状，如植物活力和繁殖力的降低。这些性状将直接影响脂肪酸组成，产生不稳定的突变；和/或降低产量，并因此降低本发明的商业价值。为了消除有害突变的发生和降低植物携带的突变负荷，用低诱变剂剂量进行种子处理产生LD30群体。从而可以在农业背景中进行脂肪酸性状单基因突变的快速选择(产生可接受的产量)。
以下为美国典型培养物保藏中心保藏的一些不同脂肪酸品系的种子，以及它们的登录号。
    品系     登录号     保藏日期
    A129.5     40811     1990年5月25日
    A133.1     40812     1990年5月25日
    M3032.1     75021     1991年6月7日
    M3062.8     75025     1991年6月7日
    M3028.10     75026     1991年6月7日
    IMC130     75446     1993年4月16日
    Q4275     97569     1996年3月10日
在一些植物种类或品种中，可以发现多种形式的内源性微粒体δ-12去饱和酶。在双二倍体中，每种形式都是从亲代基因组(组成研究的种类)的一个形式衍生的。含有两种形式突变的植物与仅含有一种形式突变的植物脂肪酸特性不同。这类植物的例子是欧洲油菜品系Q508，它是一种含有D型突变的δ-12去饱和酶(SEQ ID NO：3)和F型突变的δ-12去饱和酶(SEQ ID NO：7)的双诱变品系。另一例子是品系Q4275，其含有D型突变的δ-12去饱和酶(SEQ ID NO：3)和F型突变的δ-12去饱和酶(SEQ ID NO：9)。见图2-3。
引入本发明核酸片段的优选宿主或受体生物是产油的品种，如大豆(Glycinemax)、油菜籽(如欧洲油菜、蔓芥子和芜菁(B.juncea))、向日葵(Helianthusannus)、蓖麻子(Ricinus communis)、玉米(Zea mays)和红花(Carthamustinctorius)。
本发明的核酸片段还包括其它核酸。例如，可将编码一分泌或前导氨基酸序列的核酸连接于突变去饱和酶核酸片段上，这样该分泌或前导序列以读框融合于突变δ-12或δ-15去饱和酶多肽的氨基端。本领域还知道编码用于以读框融合于本文所公开的突变去饱和酶多肽的氨基酸序列的其它核酸片段。见美国专利No.5,629,193，本文纳入作为参考。核酸片段也可含有一个或多个与其可操作性连接的调节元件。
本发明还包括与突变去饱和酶序列选择性杂交的核酸片段。这种核酸片段通常长度最少为15个核苷酸。杂交通常包括Southern分析(Southern印迹)，该方法通过与标记的寡核苷酸或DNA片段探针杂交来鉴定靶核酸混合物中某DNA序列的存在。Southern分析通常包括在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA消化物，电泳分离后DNA的变性，和将DNA转移到硝酸纤维、尼龙或其它合适的膜支持物上以用放射标记的、生物素标记的或酶标记的探针(见Sambrook等人，(1989)MolecularCloning，9.37-9.52章节，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview；NY)。
在中等严谨条件下或较佳地在高度严谨条件下，将核酸片段与突变的去饱和酶序列杂交。用高度严谨条件鉴定与探针高度同源的核酸。高度严谨条件包括，用低电离离子强度和高温洗涤，例如0.015M NaCl/0.0015 M柠檬酸钠(0.1X SSC)、0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)，50-65℃。另外，在杂交时可用变性剂如甲酰胺，例如含0.1％牛血清白蛋白的50％甲酰胺/0.1％聚蔗糖/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠(pH6.5)和750mM NaCl、75mM柠檬酸钠(42℃)。另一例子是用50％甲酰胺、5XSSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5XDenhardt溶液、超声处理过的鲑鱼精子DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％葡聚糖硫酸酯(42℃)，用0.2X SSC和0.1％SDS洗涤(42℃)。
中等严谨条件是指用于鉴定与探针相同性程度较低(与在高度严谨条件下鉴定的核酸相比)的核酸的杂交条件。中等严谨条件包括用较高离子强度和/或较低温度(与高度严谨条件的离子强度和温度相比)洗涤杂交膜。例如，50℃用包含0.060M Nacl/0.0060 M柠檬酸钠(4X SSC)和0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)的洗涤液，最后一次洗涤用1X SSC(65℃)。另外，可用37℃ 1X SSC洗涤杂交物。
也可用Northern分析(Northern印迹)进行杂交，该方法用于鉴定与已知探针(如寡核苷酸、DNA片段、cDNA或其片段、或RNA片段)杂交的RNA。探针可用放射线同位素如32P标记，或用生物素或酶标记。待分析的RNA通常在琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，转移到硝酸纤维、尼龙或其它适合的膜上，再与探针杂交(用本领域熟知的标准方法，如Sambrook等人，同上，7.39-7.52章节所述)。
本发明的多肽包含具有突变氨基酸序列的分离的多肽以及其衍生物和类似物。如见，图3中的突变氨基酸序列。“分离的”指在天然表达和产生多肽的环境以外的环境表达和产生的多肽。例如，在细菌或真菌中表达和产生时，所分离的植物多肽。本发明的多肽还包括本文所公开的突变去饱和酶多肽(上述)的变体。
在本发明的一个实施例中，一种植物同时含有δ-12去饱和酶突变和δ-15去饱和酶突变。这种植物的脂肪酸组成包含高水平的油酸和低水平的α-亚麻酸。通过在δ-12去饱和酶和δ-15去饱和酶单突变品系之间进行基因杂交，可以将δ-12去饱和酶和δ-15去饱和酶突变联合在一植物中。将含有δ-12脂肪酸去饱和酶突变的一种植物与含有δ-15脂肪酸去饱和酶突变的第二种植物杂交或匹配。栽培这种杂交产生的种子，并将得到的植物自交，以获得其后代的种子。然后筛选这些后代种子，以鉴定出同时携带两种突变基因的那些种子。
另外，也可诱变携带δ-12去饱和酶或δ-15去饱和酶突变的品系，以产生同时含有δ-12去饱和酶和δ-15去饱和酶突变的植物成植物品系。例如，IMC 129品系在D型微粒体δ-12去饱和酶结构基因的编码区域(Glu106变为Lys106)具有一个突变。可诱变该品系的细胞(如种子)，以在δ-15去饱和酶基因中诱导一个突变，产生携带δ-12脂肪酸去饱和酶基因突变又携带δ-15脂肪酸去饱和酶基因突变的植物或植物品系。
后代包括特定植物或植物品系的后代，例如直接从植物得到的种子。植物的后代也包括F1、F2、F3形成的种子和其后代植物或BC1、BC2、BC3形成的种子及其后代植物。
本发明的植物较佳地含有改变的脂肪酸组成。例如，从这种植物种子得到的油可含有约69-90％油酸(总脂肪酸组成中)。这种油较佳地含有约74-90％油酸，更佳的是含有约80-90％油酸。在一些实施例中，从本发明的植物种子得到的油含有约2.0％-5.0％饱和脂肪酸(总脂肪酸组成中)。在一些实施例中，从本发明种子得到的油含有约1.0-14.0％亚油酸或约0.5％-10.0％α-亚麻酸。
通常通过碾碎批量种子样品(如，10个种子)并从中提取脂肪酸来分析油的组合成。水解种子中的脂肪酸甘油三酯，并将其转化成脂肪酸甲酯。可用本领域技术人员已知的方法鉴定含改变的脂肪酸组成的那些种子，如气液层析(GLC)分析批量种子样品、单粒种子或半粒种子。半粒种子分析是本领域熟知的，因为保留了种子胚胎的活力，因此可种植那些含有所需脂肪酸组成的种子以产生下一代。但已知半粒种子分析不是被分析种子基因型的精确代表。而批量种子分析通常得到某给定基因型脂肪酸组成的更精确的代表。然而，一群种子的半粒种子分析是获得所需脂肪酸组成可能性的可靠指示方法。也可测定较大样品，如中试或商业规模提炼、漂白和脱臭种子中内源性油时得到的油的脂肪酸组成。
可用本发明的核酸片段作为植物基因图和植物繁殖程序中的标记。这些标记可能包括如限制片段长度的多态性(RFLP)、随机扩增多态性测定(RAPD)、聚合酶链式反应(PCR)或自身维持的序列复制(3SR)标记。在繁殖过程中可用标记辅助的繁殖技术鉴定和跟踪所需的脂肪酸组成。此外标记辅助的繁殖技术可用作鉴定方法的一种替代法、或其它分类法。标记辅助的繁殖例子是用PCR引物，其能特异性扩增含有所需δ-12去饱和酶或δ-15去饱和酶突变的序列。
本发明的方法可用于产生具有所需的脂肪酸组成以及优良农业性能的植物或植物品系(与具有改变的种子脂肪酸组合物的品系相比)。优良的农业特性包括，种子发芽率提高、幼苗活力增加、对幼苗真菌疾病(猝倒病、根腐病等)抗性的增加、产量的增加和稳定性的改善。
另一方面，涉及的芸苔属植物产的种子含有的长链单不饱和脂肪酸含量约为82％，油酸含量至少约为15％(总脂肪酸组成中)。本文所用的“长链”是指16个碳原子或更长的链，如16-24个的链。长链单不饱和脂肪酸主要是油酸、二十碳烯酸和芥酸。种子油三酰甘油中长链单不饱和脂肪酸的异源性质赋予该油所需性能。可降低总饱和脂肪酸和/或总多不饱和脂肪酸的水平，以增加长链单不饱和脂肪酸的含量，即油酸、二十碳烯酸、芥酸和神经酸。
将本文所述的高油酸品系与高芥酸品系杂交，产生含长链单不饱和脂肪酸含量高(种子中)的芸苔属植物。在实施例5和表17中描述了适合的高油酸品系，含有约82-85％油酸(总脂肪酸组成中)。适合的高芥酸品系含有约45％芥酸或更多(总脂肪酸组成中)。芸苔属植物HEC01是特别有用的高芥酸品系，并以Hero商标名出售。也已知其它高芥酸品种，如命名为Venus、Mercury、Neptune、S89-3673、Dwarf Essex、Reston、Bridger或R-500的品种。McVetty，P.B.E.等人，Can.J.Plant Sci.，76(2)：341-342(1996)；Scarth，R.等人，Can.J.Plant Sci.，75(1)：205-206(1995)；和McVetty，P.B.E.等人，Can J.Plant Sci.，76(2)：343-344(1996)。
本发明种子所含的油酸和二十碳烯酸的含量分别至少为37％和14％(总脂肪酸组成中)。总饱和脂肪酸含量至少约为7％。本文所用的“总饱和脂肪酸含量”是指总豆蔻酸(14:0)、棕榈酸(16:0)、硬脂酸(18:0)、花生酸(20:0)、三萮酸(22:0)和木蜡酸(24:0)。总多不饱和脂肪酸的含量不到11％(总脂肪酸组成中)。本文所用的“总多不饱和脂肪酸含量”是指亚油酸(18:2)、α-亚麻酸(18:2)和二十碳二烯酸(20:2)之和占总脂肪酸含量的百分比。
在一些实施例中，种子中长链单不饱和脂肪酸的含量约为85％-90％。这些种子中油酸的含量约为42％或更多，较佳地约为47％-56％。芥酸和二十碳烯酸的含量分别约为17-31％和15-21％。
在一些实施例中，种子中长链单不饱和脂肪酸的含量至少约为82-90％。这些种子中油酸的含量至少约为25-33％。芥酸和二十碳烯酸的含量分别约为44-50％和10-13％。
种子油中长链单不饱和的含量至少约为82％，芥酸的含量至少约为15％(总脂肪酸组成中)。可提取这些油，例如从上述含有合适的脂肪酸组成的芸苔属种子的一个品系中提取。这些油的油酸和二十碳烯酸的含量分别至少约为37％和14％(根据总脂肪酸组成)。这些油的饱和和多不饱和脂肪酸总含量分别至多约为7％和11％。较佳地，多不饱和脂肪酸含量至多约为9％。在一些实施例中，油的单不饱和脂肪酸含量约为85％-90％。这些油的油酸含量至少约为42％或更多，更佳的是约47％-56％。这些油的芥酸含量约为17％-31％，二十碳烯酸的含量约为15％-21％。
在一些实施例中，这些油中长链单不饱和脂肪酸含量约为82％-90％，其中油酸含量约为25％-30％，芥酸含量约为44％-50％，二十碳烯酸含量约为10％-13％。这些油中神经酸、芥酸和二十碳烯酸含量的总和约为50％-66％。
另外，设想可将高芥酸菜籽油(HEAR)和含至少约87％油酸(较佳地是约90％-95％油酸)(总脂肪酸组成中)的油混合获得本发明的油。HEAR油的芥酸含量约为49％，油酸含量约为16％。
含长链单不饱和脂肪酸含量至少约为82％的油出乎意料地具有低温特性，这对工业应用而言是非常理想的，如可作润滑油。尚不知道这些特性的基础，但可能是本发明油中三酰甘油的异源链长度阻止顺次堆积，因为未端的甲基在分子体积错配，诱导了范德华相互作用。每种脂肪酸的双键位于酰链的不同碳位置，可能破坏了堆积，也诱导了毗邻脂肪酸链之间的π-π电子相互作用。认为高单不饱和脂肪酸含量提供了改善的抗氧化稳定性以及高流动性。本发明油中多不饱和脂肪酸的低水平也增进高抗氧化稳定性，因为20℃亚油酸和亚麻酸的氧化速率分别是油酸氧化速率的12-20倍和25倍。
按AOCS Official Method Cd 12b-92(1993年颁布)，用抗氧化稳定性指数装置(Omnion，Inc.，Rockland，MA)测定抗氧化稳定性。这种方法是活性氧法(AOM)流程(AOCS Official Method Cd12-57)自动化的替代。含长链单不饱和脂肪酸含量至少约为82％的油的氧化稳定性约为40AOM小时-100AOM小时(不添加抗氧化化剂时)。与其相比，半油酸canola油(约76％油酸)和高芥酸菜籽油的抗氧化稳定性分别约为38AOM小时和16AOM小时(不添加抗氧化剂时)。
本发明的油具有理想的功能特性，如低温特性和高粘度指数以及高抗氧化稳定性。高分子量脂肪酸的存在增加了三酰甘油的分子量，使油具有较高的闪点和较高的燃烧点。分子量的增加也改善了油的粘度指数。粘度指数是表明润滑油粘度随温度变化的一任意数。可从40℃和100℃观察到的润滑油的粘度计算Dean和Danis粘度指数；可得到的粘度指数值的范围在0-200以上。较高的粘度指数值表明油的粘度随温度改变的变化较小。换言之，粘度指数越高，润滑油在低温和高温之间粘度的差异越小。
通过向含长链单不饱和脂肪酸含量至少约为82％和芥酸含量至少约为15％(总脂肪酸组成中)的油中加入一种或多种添加剂，可将本发明的油配制成工业应用的油，如发动机润滑油或液压液。例如，可制造用于柴油机的传输液，其包括抗氧化剂、消泡剂、抗磨剂、防腐剂、分散剂、脱垢剂、和酸中和剂，或它们的组合。液压油组合物可包括抗氧化剂、防锈剂、抗磨剂、降凝剂、粘度指数改善剂、和消泡剂，或它们的组合。特殊的油配方根据该油的最终用途而不同，最终用途特殊的适合配方可用标准方法评估。
抗氧化剂通常包括二硫代磷酸锌、二硫代氨基甲酸甲酯、受阻酚、硫化酚、金属酚硫化物、水杨酸金属、芳香胺、磷-硫化脂肪和烯烃、硫化烯烃、硫化脂肪和脂肪衍生物、硫化煤油、硫化羧酸、双水杨醛(disalieylal)-1，2-丙二酰胺、2，4-二(烷基二硫代-1，3，4-thiadiazole)和二月桂基硒化物。抗氧化剂通常存在的量为约0.01％-5％(组合物重量)。具体地说，在本发明的油中加入约0.01-1.0％抗氧化剂。见美国专利No.5,451,334中可添加的抗氧化剂。
防锈剂保护表面抗锈，包括烷基丁二酸类型的有机酸及其衍生物、烷基硫代乙酸及其衍生物、有机胺、有机磷酸盐、多元醇、磺酸钠和磺酸钙。抗磨剂吸附在金属上，提供一层膜生减少金属与金属的接触。通常，抗磨剂包括二烷基二硫代磷酸锌、磷酸三(甲苯酯)、二月桂基亚磷酸、硫化鲸油、硫化萜和二烷基二硫代氨基甲酸锌，使用的量为约0.05％-4.5％。
防腐剂包括二硫代磷酸盐，具体地说是二硫代磷酸锌、金属磺酸盐、金属酚盐硫化物、脂肪酸、酸式磷酸脂和烷基丁二酸。
降凝剂使油组合物在低于未修饰润滑油的凝固点流动。普通降凝剂包括聚甲基丙烯酸酯、蜡烷基化萘聚合物、蜡烷基化酚聚合物和氯化聚合物，存在的量约为1％或更低。见美国专利No.4,451,334和No.5,413,725。加入聚异丁烯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、乙烯-丙烯共聚物、苯乙烯-异戊二烯共聚物、苯乙烯-丁二烯共聚物和苯乙烯-马来酸酯共聚物，能增加粘度指数。
消泡剂可减少或预防稳定性表面泡沫的形成，通常存在的量约为0.00003％-0.05％。消泡剂的非限制性例子为聚甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸酯、烷基亚烷基二硫代磷酸盐、戊基丙烯酸盐调聚物、和聚(2-乙基己基丙烯酸酯)-丙烯酸乙酯共聚物。
脱垢剂和分散剂是提供清洗功能的极性物质。脱垢剂包括金属磺酸盐、金属水杨酸盐和金属硫代磷酸酯。分散剂包括聚胺琥珀酰亚胺、羟基苄基聚胺、聚胺琥珀酸胺、聚羟基琥珀酸酯和聚胺酰胺咪唑啉。
本发明可以有各种改进和变化形式，其中一些特殊的实例见以下常规方法和实施例的描述。例如本发明可用于所有芸苔属，包括芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea)和白芥(B.hirta)，产生基本类似的结果。应理解这些实施例不是将本发明限制在某一公开形式，相反本发明包括在本发明范围内的所有改进、等效和替代。包括所有的体细胞克隆变体；植物部分的物理或化学诱变；染色体倍增后的花药、小孢子或子房培养；或自花或异花授粉传递脂肪酸性状，或与其它性状联合，产生的新的芸苔属品系。
实施例1
诱变
用Westar的种子(一种加拿大欧洲油菜春季canola品种)作化学诱变。Westar是一种带canola性质的登记过的加拿大春季品种。自1982年以来，田间栽培的Westar脂肪酸组成为，3.9％C16:0、1.9％C18:0、67.5％C18:1、17.6％G18:2、7.4％C18:3、＜2％C20:1+C22:1在商品中保持稳定，有＜±10％偏差。
诱变前，将30,000粒欧洲油菜cv.Wester种子，以300粒种子/批在湿润的滤纸上预浸润2小时，以软化种皮。将预浸润的种子置于80mM甲磺酸乙酯(EMS)中4小时。诱变后，用蒸馏水淋洗种子三次将这些种子播种到含Pro-Mix的48孔板上。68％诱变的种子萌芽。在温室中将植物保持在25℃/15℃，14/10小时(白天/黑夜)的条件下。开花后，单独自花授粉每株植物。
分别分类和保藏每株植物的M2种子，将约15,000个M2品系种植在日光苗圃(Carman，Manitoba)中。以3米(列)6英寸(行)播种每个自花授粉植物的种子。种植Westar作为核对品种。用袋子照住每株植物的主要总状花序，使田间选定的品系自花授粉。成熟时，分别收获自花授粉植物，分类并保藏种子以确保知道每个种子的来源。
用气相层析分析自花授粉M3种子和Westar对照种子的(以10粒种子为一样品)脂肪酸组成。用以1/10,000的严谨水平的Z-分布建立每种脂肪酸成分的统计学阈值。测定田间未诱变的Westar对照群体的平均值和标准差。群体的平均值±标准差，乘以Z-分布确定每种脂肪酸统计学的上和下阈值。按10,000群体量，置信区间为99.99％。
将选定的M3种子以及Westar对照种植温室中。将这些种子播种到含Pro-Mix泥土的4英寸罐中，在温室中植物保持在25℃/15℃，14/10小时(白天/黑夜)循环条件下。开花后，套袋进行顶生总状花序自花授粉。成熟时，分别收获每株自花授粉植物的种子M4，标记并保藏以确保知道每个种子的来源。
分析10粒种子为一样品的M4种子。用以1/800的Z-分布从259个对照样品建立每种脂肪酸成分的统计学阈值。在Carman，Manitoba田间以3米(列)6英寸(行)间距种植选定的M4品系。每一列选10个M4植物进行套袋自花授粉。成熟时，单独收获自花授粉的植物，分列批量收获自然授粉的植物。对单株选定植物的种子M5以10粒种子一批样品进行分析，分列批量收获的种子以50粒种子一批样品进行分析。
将选定的M5品系以及Westar对照种植在温室中。种子的培养如上述。开花后，用袋子套住顶生总状花序进行自花授粉。成熟时，从每株植物单独收获自花授粉的M6种子，以10粒种子一批样品分析脂肪酸组成。
将选定的M6品系种植到Eastern爱达荷州的试验田。选择生长条件大不相同的4个试验位置。地理位置包括Burley、Tetonia、Lamont和shelley(表7)。以3米每列8英寸间距种植这些品系，每个苗圃重复4次。用Randomized CompleteBlock Design确定种植方案。用商业栽培品系Westar作为对照栽培品系。成熟时，收获每个苗圃确定产量。取四次重复的统计平均值确定试验田的产量。用最小显著差数检验(Least Significant Difference Test)对试验田从随机化完整区组设计评级。
                             表7
                所选脂肪酸突变株的试验田位置
  地理位置     位置特征
  BURLEY     灌溉地、长季节、开花时为高温
  TETONIA     旱地、短季节、低温
  LAMONT     旱地、短季节、低温
  SHELLEY     灌溉地、中等季节、开花时为高温
为了确定试验田培养品种的脂肪酸组成，对每个苗圃的植物套袋进行自花授粉。以10粒种子一批样品分析单株植物的M7种子的脂肪酸。
为了确定所选脂肪酸突变株的遗传关系进行了杂交。杂交中采用M6或后来产生的突变的花。收获F1种子，并分析其脂肪酸组成，以确定基因作用的模式。在温室中种植F1后代。将得到的植物自花授粉，收获F2种子，分析其脂肪酸组成，进行等位性研究。在温室中种植F2种子和亲代品系的种子，每株植物进行自花授粉。如上所述，用10粒种子一批的样品测试每株植物的F3种子的脂肪酸组成。
在分析某些遗传关系时从F1杂交的小孢子制备了双单倍体群体。用如上所述的方法分析双单倍体植物自花授粉种子的脂肪酸。
对于化学分析，用玻棒在15ml聚丙烯管中手工研磨10粒种子一批的样品，以1.2ml用1∶1醚/甲醇配制的0.25N KOH提取。将样品涡流搅拌30秒，加热60秒(在60℃水浴锅中)。加入4ml饱和的NaCl和2.4ml异辛烷，再次涡流搅拌混合物。分相后，将上层有机相移液入单独的小瓶中，在-5℃氮气中保存。将1μl样品注入Supelco SP-2330熔融石英毛细管柱(0.25mm ID，30M长，0.20μm df)。
在180℃进行气相层析5.5分钟，然后以2℃/分钟程序加温至212℃，并保持此温度1.5分钟。总跑样时间共23分钟。层析设置为：柱头压-15psi，柱流速(He)-0.7ml/分钟，辅助流速-33ml/分钟，氢气流速-33ml/分钟，空气流速-400ml/分钟，注射器温度-250℃，探测器温度-330℃，分流通风率-1/15。
表8列出了每个感兴趣脂肪酸的统计域值的上限和下限。
                              表8
              对照Westar植物的特定脂肪酸的统计域值
                         脂肪酸百分比
   基因型   C16:0   C18:0   C18:1    C18:2   C18:3   Sats*
                            M3代(1/10,000排斥率)
   下限   3.3   1.4    -    13.2    5.3    6.0
   上限    4.3    2.5    71.0    21.6    9.9    8.3
                             M4代(1/800排斥率)
   下限    3.6    0.8    -    12.2    3.2    5.3
   上限    6.3    3.1    76.0    32.4    9.9    11.2
                             M5代(1/755排斥率)
   下限    2.7    0.9    -    9.6    2.6    4.5
   上限    5.7    2.7    80.3    26.7    9.6    10.0
*Sats＝总饱和含量
实施例2
高油酸Canola品系
在实施例1的研究中，M3代有31个品系超出了油酸统计域值的上限(≥71.0％)。品系W7608.3含有71.2％油酸。在M4代，其自交的后代(W7608.3.5，命名为A129.5)持续超出C18:1的统计学域值的上限(78.8％油酸)。品系A129.5(ATCC40811)的五个自花授粉植物的M5代平均含75.0％油酸。单株植物选择，A129.3含有75.6％油酸。表9总结了这种高油酸突变的脂肪酸组成，无论在田地还是温室条件下，能稳定持续到M7代。该品系也稳定地保留了其突变脂肪酸组成物至多处地理位置试验田的M7代。所有地理位置自花授粉植物(A129)平均含78.3％油酸。每个爱达荷州试验田位置A129的脂肪酸组成总结于表10。在多处地理位置重复试验田中，田地中A129与亲代栽培品种Westar的差异不明显。
商品加工后，发现A129的canola油与Westar相比具有优良的抗氧化稳定性(用加速氧法(AOM)，脂肪稳定性的American Oil Chemists’Society OfficialMethod Cd 12-57；Active Oxygen Method(1989颁布))。Westar的AOM为18AOM小时，A129为30AOM小时。
                          表9
    通过种子诱变产生的高油酸Canola品系的脂肪酸组成
                              脂肪酸百分比
基因型      C16:0    C18:0    C18:1   C18:2   C18:3    Sats
Westar      3.9      1.9      67.5     17.6     7.4      7.0
W7608.3     3.9      2.4      71.2     12.7     6.1      7.6
(M3)
W7608.3.5   3.9      2.0      78.8     7.7      3.9      7.3
(M4)
A129.5.3    3.8      2.3      75.6     9.5      4.9      7.6
(M5)
Sats＝总饱和含量
                         表10
    在爱达荷州的不同试验田高油酸品系的脂肪酸组成
                     脂肪酸百分比
地理位置    C16:0     C18:0    C18:1   C18:2   C18:3    Sats
Burley      3.3       2.1      77.5     8.1      6.0      6.5
Tetonia     3.5       3.4      77.8     6.5      4.7      8.5
Lamont      3.4       1.9      77.8     7.4      6.5      6.3
Shelley     3.3       2.6      80.0     5.7      4.5      7.7
Sats＝总饱和含量
高油酸突变体A129与其它油酸去饱和酶的遗传关系，通过将商品canola栽培品种和低亚麻酸突变株杂交证明。将A129与商品栽培品种Global(C16:0-4.5％、C18:0-1.5％、C18:1-62.9％、C18:2-20.0％、C18:3-7.3％)杂交。分析了约200个F2个体的脂肪酸组成。表11归纳了结果。1∶2∶1比率的分离度表明单共显性基因了高油酸上表型的遗传。
                             表11
                    A129X Global的遗传研究
                    频率
    C18:1
    基因型     含量(％)     观察值     期望值
    od-od-     77.3     43     47
    od-od+     71.7     106     94
    od+od+     66.1     49     47
进行了低亚麻酸品种的A129与IMC01的杂交(C16:0-4.1％、C18:0-1.9％、C18:1-66.4％、C18:2-18.1％、C18:3-5.7％)，以确定油酸去饱和酶和亚油酸去饱和酶的遗传。在F1杂交中，油酸和亚油酸去饱和酶基因都达到亲代中位值，表明共显性基因有作用。F2个体的脂肪酸分析证明两个独立共显性基因的分离度1∶2∶1∶2∶4∶2∶1∶2∶1(表12)。从A129和IMC 01杂交选择一品系，命名为IMC130(ATCC登录号为No.75446)，如美国专利申请No.08/425,108所述，本文纳入作为参考。
                    表12
            A129 X IMC01的遗传研究
                  频  率
基因型          比例    观察值    期望值
od-od-ld-ld-    1       11        12
od-od-ld-ld+    2       30        24
od-od-ld+ld+    1       10        12
od-od+ld-ld-    2       25        24
od-od+ld-ld+    4       54        47
od-od+ld+ld+    2       18        24
od+od+ld-ld-    1       7         12
od+od+ld+ld+    2       25        24
od+od+ld+ld+    1       8         12
用本文公开的方法产生了另一高油酸品系，命名为A128.3。该品系50个种子的分析显示以下脂肪酸组成：C16:0-3.5％、C18:0-1.8％、C18:1-77.3％、C18:2-9.0％、C18:3-5.6％、FDA Sats-5.3％、总Sats-6.4％。该品系将其突变脂肪酸组成稳定地保持到M7代。在多处地理位置的重复试验田中，田地中的A128与亲代栽培品种Westar没有明显差异。
将A129与A128.3杂交用于等位性研究。F2种子脂肪酸组成显示有两个品系是等位的。虽然起源不同，但A129和A128.3的突变在同一基因中。
用实施例1公开的方法还产生另一高油酸品系，命名为M3028-10(ATCC75026)。该品系100粒种子的分析显示以下脂肪酸组成：C16:0-3.5％、C18:0-1.8％、C18:1-77.3％、C18:2-9.0％、C18:3-5.6％、FDA Sats-5.3％、总Sats-6.4％。在一处重复试验田中M3028.1的产量与亲代栽培品种Westar没有明显差异。
实施例3
低亚油酸Canola
在实施例1的研究中，M3代有80个品系超出了亚油酸统计域值的下限(≤13.2％)。品系W12638.8含9.4％亚油酸。M4和M5代(自交后代)[W12638.8命名为A133.1(ATCC 40812)]持续超出低C18:2的统计域值，分别含10.2％和8.4％亚油酸水平。表13中总结了该低亚油酸突变体的脂肪酸组成，其在田地以及温室条件下稳定至M7代。在多处位置的重复试验田里，田地中A133与亲代栽培品种Westar没有明显差异。用所公开的方法还产生了另一低亚油酸品系，命名为M3062.8(ATCC75025)。该品系10粒种子的分析显示以下脂肪酸组成：C16:0-3.8％、C18:0-2.3％、C18:1-77.1％、C18:2-8.9％、C18:3-4.3％、FAD Sats-6.1％。该品系在田地和温室中也稳定维持其突变脂肪酸组成。
                                     表13
               通过种子诱变产生的低亚油酸Canola品系的脂肪酸组成
                              脂肪酸百分比
基因型        C16:0   Cl8:0    C18:1    C18:2   C183    Satsb
Westar        3.9      1.9      67.5     17.6     7.4     7.0
W12638.82    3.9      2.3      75.0     9.4      6.1     7.5
(M3)
W12638.8.1    4.1      1.7      74.6     10.2     5.9     7.1
(M4)
A133.1.8      3.8      2.0      77.7     8.4      5.0     7.0
(M5)
a第二位十进位小数点前的数字和字母表示植物的品系。第二个十进位小数点后的数字表示一个体植物。
bSats＝总饱和含量
实施例4
低亚油酸和亚麻酸的Canola
在实施例1的研究中M3代有57个品系超出了亚麻酸统计域值的下限(≤7.3％)。品系W14749.8含5.3％亚麻酸和15.0％亚油酸。M4和M5代(自交后代)[W14749.8命名为M3032(ATCC 75021)]持续超出低C18:3的统计域值，分别含2.7％和2.3％亚麻酸水平，亚麻酸和亚油酸的总和分别为11.8％和12.5％。表14中总结了该低亚麻酸加亚油酸突变体的脂肪酸组成，其在田地以及温室条件下稳定至M5代。在多处位置的重复试验田里，田地中M3023与亲代栽培品种Westar没有明显差异。
                         表14
   通过种子诱变产生的低亚麻酸Canola品系的脂肪酸组成
                     脂肪酸百分比
基因型    C16:0   C18:0    C18:1    C18:2   C18:3    Sats
Westar    3.9      1.9      67.5     17.6     7.4      7.0
W14749.8  4.0      2.5      69.4     15.0     5.3      6.5
(M3)
M3032.8    3.9     2.4      77.9     9.1      2.7      6.4
(M4)
M3032.1    3.5     2.8      80.0     10.2     2.3      6.5
(M5)
Sats＝总饱和含量
实施例5
Canola品系Q508和Q4275
用甲基N-亚硝基胍(MNNG)诱变欧洲油菜品系IMC129的种子。MNNG处理包括三个部分：预浸泡、加诱变剂和洗涤。用0.05M Sorenson磷酸缓冲液维持预浸泡和诱变剂处理(pH6.1)。在培养皿(100mm×15mm)中滤纸(Whatman #3M)上一次处理200粒种子。将种子在15ml 0.05M Sorenson缓冲液中预浸泡，pH6.1，持续搅拌2小时。在预浸泡结束时，除去平板中的缓冲液。
事先用0.05MSorenson缓冲液配制好10mM浓度的MNNG(pH6.1)。将15ml 10mMMNNG加入到每个平板中的种子上。在22℃±3℃黑暗处培养种子4小时(持续搅拌)。培养结束时，除去诱变剂溶液。
用蒸馏水以10分钟为间隔洗涤种子3次。第四次为30分钟。如此处理产生LD60群体。
将处理过的种子置于标准温室盆栽土中，并将它们种植到控制环境的温室中。植物在16小时光照下生长。开花时，用袋子套住总状花序，以产生自交种子。成熟时，收获M2种子。给每个M2品系一个鉴定号码。将整个MNNG处理的种子群体命名为Q系。
将收获得到的M2种子种植在温室中。生长条件如上述控制。用袋子套住总状花序进行自交。成熟时，收获自交的M3种子，分析脂肪酸组成。如实施例1所述批量分析每个M3种子品系(约10-15粒种子)。
以＞82％油酸和＜5.0％亚油酸为截断值，从M3群体中选出高油酸-低亚油酸的M3品系。从第一批1600个M3品系筛选(脂肪酸组成)中鉴定出了Q508。在温室中培养Q508 M3代，产生M4代。表15列出了Q508和IMC129的脂肪酸组成。M4自交种子保持了所选的高油酸-低亚油酸表型(表16)。
                             表15
            A129和高油酸M3突变体Q508的脂肪酸组成
          品系    16:0  18:0  18:1  18:2  18:3
          A129*  4.0   2.4   77.7  7.8   4.2
          O508    3.9   2.1   84.9  2.4   2.9
*A129的脂肪酸组成是50个由M3代自花授粉生长植物的平均值。
与Westar相比，M4代Q508植物的农艺学品质较差。与Westar相比这些植物通常生长得较慢、缺乏早期营养活力，成熟时较矮，易萎黄，而且荚果也短小。Q508的产量比Westar低许多。
温室中M4代Q508植物与Westar相比活力有降低趋势。但温室中生长的Q508比田地中生长的Q508产量高。
                          表16
    温室生长的Q508、IMC129和Westar的种子油中脂肪酸组成
品系 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3  FDASats
 IMC 129a 4.0  2.4  77.7  7.8  4.2  6.4
 Westarb 3.9  1.9  67.5  17.6  7.4  ＞5.8
 Q508c 3.9  2.1  84.9  2.4  2.9  6.0
a50粒自花授粉植物的平均值
b实施例1的数据
c50粒自花授粉植物的平均值
还鉴定了九种其它M4高油酸低亚油酸品系：Q3603、Q3733、Q4249、Q6284、Q6601、Q6761、Q7415、Q4275和Q6676。这些品系中有些具有很好的农艺学性状，种子中油酸水平提高到约80％-84％。
将Q4275与品种Cyclone杂交。自交七代后，从93GS34-179，Q4275×Cyclone杂交的后代品系收获成熟的种子。如表17所示，批量的种子样品的脂肪酸组成显示93GS34保留了Q4275的种子脂肪酸组成。93GS34-179还保持了理想的农业特性。
在Q4275自交7代后，将Q4275、IMC129和93GS34植物在田地中生长(夏季)。在随机分组设计的4个重复苗圃(5英尺×20英尺)中进行选择。自然授粉植物。没有产生自花授粉的种子。成熟时收获每个苗圃，分析每个品系批量收获种子的样品的脂肪酸组成(如上述)。表17显示了所选品系的脂肪酸组成。
                             表17
       田地生长的IMC129、Q4275和93GS34种子的脂肪酸组成
  品系                           脂肪酸组合物(％)
  C16:0   C18:0   C8:1   C18:2   C18:3   FDA Sats
  IMC 129   3.3   2.4   76.7   8.7   5.2   5.7
  Q4275   3.7   3.1   82.1   4.0   3.5   6.8
  93GS34-179   2.6   2.7   85.0   2.8   3.3   5.3
表17显示的结果表明在田地环境下，Q4275保持了所选的高油酸-低亚油酸表型。Q4275植物的农艺学性状也优于Q508的。
用Westar作为母本，将M4代Q508植物与Westar双单倍体杂交。得到的F1种子命名为92EF群体。选出约126个F1个体(比Q508亲本表现出更好的农艺学性状)进行自交。将单个植物的一部分F2种子再种入田地。让每个F2植物自交，分析部分得到的F3种子的脂肪酸组成。F3种子中油酸的含量范围为59％-79％。没有回收到高油酸(＞80％)的有良好农艺学性状的单个植物。
将92EF群体的部分F2种子种植在温室中，分析Q508品系的遗传学。分析380F2个体的F3种子。图1显示了温室试验中F3种子的C18:1水平。测试得到的数据与假设(Q508含有两个半显性和加成性的突变基因：起源的IMC129突变以及另一突变)相反。该假设还猜测纯合Q508含有85％以上的油酸，纯合Westar含有62-67％油酸。如下命名Q508和Westar杂交中每个基因的可能有的基因型：
AA＝Westar Fad2a
BB＝Westar Fad2b
aa＝Q508 Fad2a-
bb＝Q508 Fad2b-
假设独自分离，预计表型比例为1∶4∶6∶4∶1。假设杂合植物的表型是不能分辨的，因此测试的数据纯合Westar：杂合植物：纯合Q508为1∶14∶1。
                        表型         #
  比例 Westar等位基因  基因型
  1 4  AABB(Westar)
  4 3  AABb，AaBB，AABb，AaBB
  6 2  AaBa，AAbb，AaBb，AaBb，aaBB，AaBb
  4 1  Aabb，aaBb，Aabb，aaBb
  1 0  aabb(Q508)
用卡方(X2)分析，油酸数据为1∶14∶1比例。结论是：Q508与Westar的不同在于两个主要基因上，它们是半显性和加成性的，且独自分开。通过比较，IMC129的基因型为aaBB。
表18显示了种子油中油酸含量85％以上的代表性F3个体的脂肪酸组成。可以看出与Westar相比，这些植物中饱和脂肪酸的水平降低。
                           表18
             种子油中C18:1＞85％的92EF F3个体
F3植物名称 脂肪酸组成(％)
C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 FDASA
+38068 3.401 1.582 85.452 2.134 3.615 4.983
+38156 3.388 1.379 85.434 2.143 3.701 4.767
+38171 3.588 1.511 85.289 2.367 3.425 5.099
+38181 3.75 1.16 85.312 2.968 3.819 4.977
+38182 3.529 0.985 85.905 2.614 3.926 4.56
+38191 3.364 1.039 85.737 2.869 4.039 4.459
+38196 3.557 1.182 85.054 2.962 4.252 4.739
+38202 3.554 1.105 86.091 2.651 3.721 4.713
+38220 3.093 1.16 86.421 1.931 3.514 4.314
+38236 3.308 1.349 85.425 2.37 3.605 4.718
+38408 3.617 1.607 85.34 2.33 3.562 5.224
+38427 3.494 1.454 85.924 2.206 3.289 4.948
+38533 3.64 1.319 85.962 2.715 3.516 4.959
实施例6
Canola品系IMC-129、Q508和Westar叶子和根的脂肪酸组成
在温室中培养Q508、IMC129和Westar植物。在6-8叶片发育阶段收获成熟的叶子、主要展开叶片(primary expanding leaf)、叶柄和根，在液氮中冷冻，-70℃保藏。如实施例1所述，用GLC分析脂类提取物。表19显示了脂肪酸组成数据。表19中的数据表明Q508总叶子脂质的C18:1含量比C18:2加C18:3高。而Westar和IMC129则是相反的情况。Q508和IMC129之间总叶子脂质的差异与Q508中第二个Fad2基因突变了的假设相一致。
所有三个品系的总脂质组分中C16:3的含量几乎相同，表明质体FadC基因产物不受Q508突变的影响。为了证明FadC基因没有突变，分离出叶绿体脂质作分析。在这三个品系中没有检测到叶绿体C16:1、C16:2或C16:3脂肪酸的变化。Q508、Westar和IMC129质体叶子脂质相类似，这与Q508中第二个突变影响微粒体Fad2基因但不影响质体FadC基因的假设相一致。
                             表19
成熟叶子 展开叶片 叶柄 根
West. 129 3Q508 West. 129  3Q508 West. 129 3Q508 West. 129 3Q508
16:0 12.1 11.9 10.1 16.4 16.1 11.3 21.7 23.5 11.9 21.1 21.9 12.0
16:1 0.8 0.6 1.1 0.6 1.1 1.0 1.3 1.4 - - -
16:2 2.3 2.2 2.0 2.8 3.1 2.8 1.8 2.2 1.8 - - -
16:3 14.7 15.0 14.0 6.3 5.4 6.9 5.7 4.6 5.7 - - -
18:0 2.2 1.6 1.2 2.5 2.8 1.5 3.7 4.0 1.6 3.6 2.9 2.5
18:1 2.8 4.9 16.7 3.8 8.3 38.0 4.9 12.9 46.9 3.5 6.1 68.8
18:2 12.6 11.5 6.8 13.3 13.8 4.9 20.7 18.3 5.2 28.0 30.4 4.4
18:3 50.6 50.3 46.0 54.2 50.0 33.5 40.4 33.2 25.3 43.8 38.7 12.3
实施例7
欧洲油菜的突变型和野生型δ-12脂肪酸去饱和酶的序列
以逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)，用FAD2结构基因的特异性引物来克隆D和F δ-12去饱和酶基因的整个开放读框(ORE)。用标准方法分离IMC129、Q508和Westar植物种子的RNA，用作模板。RT-扩增的片段用于核苷酸测序。用标准双脱氧测序方法，测定每个品系的每个基因DNA序列(双链)。
测序分析显示：与Westar序列相比，IMC129和Q508中的D基因在316核苷酸(翻译起始密码子)G被颠换成A。这种颠换使该位点的密码子从GAG变化成AAG，导致谷氨酸(一种酸性残基)非保守性取代了碱性残基赖氨酸。由于Q508品系是从IMC 129衍生的，可以期望在这两个品系中存在相同的突变。当将叶组织的RNA用作模板时，在Q508和IMC129中还检测到相同的碱基变化。
通过测定含有直接从IMC129和Westar基因组DNA扩增的片段的几个独立克隆的序列，证明了在316核苷酸的G-A突变。这些结果消除了在RT-PVR过程的逆转录和PCR中引入稀有突变的可能性。可以得到以下结论：IMC129的突变是因为在油菜籽微粒体δ-12去饱和酶的D基因编码区域的316核苷酸上发生了单个碱基的颠换。
与Westar的序列相比，在Q508中检测到F基因的515核苷酸上单个碱基转换(T到A)。这种突变改变了该位点的密码子(CTC到CAC)，导致在产生的基因产物中非极性残基(亮氨酸)非保守性取代了成极性残基(组氨酸)。与Westar的F基因序列相比，IMC129的F基因序列中没有发现突变。
这些数据支持以下结论：δ-12去饱和酶基因序列中的突变导致含该突变基因的植物的脂肪酸组成改变。另外，数据显示：当一植物品系或属含有两个δ-12去饱和酶基因座时，含有两个突变基因座的个体的脂肪酸组成与含有一个突变基因座个体的脂肪酸组成不同。
基因图中29和Q508 D基因中突变位于含有在克隆的δ-12和δ-15膜结合去饱和酶中发现的保守氨基酸基序(His-Xaa-Xaa-Xaa-His)的区域中(表20)。
                         表20
       克隆的Canola膜结合去饱和酶的氨基酸序列的对比
 去饱和酚基因  序列a  位点
 Canola-fad2-D(突变)  AHKCGH  109-114
 Canola-Fad2-D  AHECGH  109-114
 Canola-Fad2-F  AHECGH  109-114
 Canola-FadC  GHDCAH  170-175
 Canola-fad3(突变)  GHKCGH  94-99
 Canola-Fad3  GHDCGH  94-99
 Canola-FadD  GHDCGH  125-130
(FadD＝质体δ-15，Fad3＝微粒体δ-15)，
(FadC＝质体δ-12，Fad2＝微粒体δ-12)
a单字母氨基酸码；保守性取代加下划线；非保守性取代为粗体字。
实施例8
微粒体δ-12脂肪酸去饱和酶的转录和翻译
用RT-PCR分析了发育II期和III期种子和叶组织的体内转录。用于特异性扩增上述组织RNA的δ-12去饱和酶F基因RNA的引物是有义引物5’-GGATATGATGATGGTGAAAGA-3’和反义引物5’-TCTTTCACCAT CATCATATCC-3’。用于特异性扩增上述组织的δ-12去饱和酶D基因RNA的引物是有义引物5’-GTTATGAAGCAAAGAAGAAAC-3’和反义引物5’-GTTTCTTCTTTGCTTCATAAC-3’。结果表明在IMC129、Q508和野生型Westar植物的种子和叶组织中均表达D和F基因的mRNA。
体外转录和翻译分析显示产生了一个约46kD的肽。根据每个基因推导的氨基酸序列的和以及加上微粒体膜肽的共翻译，这46KD是D基因产物和F基因产物二者的预计尺寸。
这些结果排除了无义或移码突变，从而在突变D基因或突变F基因中存在截短的多肽基因产物的可能性。将这些数据与实施例7的数据结合，支持以下结论：Q508和IMC129中的突变是在编码去饱和酶的δ-12脂肪酸去饱和酶结构基因中的，而不是在调节基因中的突变。
实施例9
开发基因特异性PCR标记
根据上述IMC129的突变D基因中单个碱基的改变，设计了两种5’PCR引物。这两种引物的核苷酸序列只在3’端的碱基(Westar为G，IMC129为A)有差异。这种引物使得可以在DNA为基础的PCR试验中，区别突变体fad2-D和野生型Fad2-D等位基因。由于5’PCR引物中只有一个碱基差异，PCR试验对PCR条件(如退火温度、循环次数、用量和所用DNA模板的纯度)非常敏感。所建立的试验条件是用IMC129和野生型植物的基因组DNA作为模板，区分突变基因和野生型基因。还可通过改变PCR参数，尤其是用可变化的粗DNA样品进一步最佳化条件。将野生型基因与IMC129单碱基突变区分开来的PCR试验以及脂肪酸组成分析，提供了简单分离和选择分析基因杂交(涉及具有δ-12脂肪酸去饱和酶突变植物)的方法。
实施例10
突变型和野生型Fad3基因的转化
用突变型和野生型Fad3基因来转化欧洲油菜栽培品种Westar，以证明canola胞质亚油酸去饱和酶δ-15去饱和酶的突变Fad3基因是没有功能的。按WO94/11516所描述的方法，用根癌土壤杆菌进行转化和再生。
工程改造两种无能(disarm)的土壤杆菌菌株，每种都含有Ti质粒，该质粒具有连接于种子特异性启动子的适当基因和相应的终止序列。第一种质粒pIMC110，是将全长野生型Fad3基因插入到(以有义方向)无能的Ti载体中制备的(WO 93/11245公开的SEQ ID NO：6的208-1336核苷酸)，并将napin启动子序列侧接于Fad3基因的5’位点，napin终止子序列侧接于Fad3基因的3’位点。欧洲专利0255378中描述了油菜籽napin启动子。
第二种质粒pIMC205是通过将突变的Fad3基因插入到(以有义方向)无能的Ti载体中制备的。这种突变的序列含有微粒体Fad3基因的411和413核苷酸上的突变(见WO93/11245)，从而将密码子96的序列从GAC改变成AAG。因此密码子96的基因产物氨基酸也从天冬氨酸变成赖氨酸。见表20。将菜豆(菜豆Phaseolus vulgaris)云扁豆蛋白(7S种子储藏蛋白)启动子片段(495个碱基对)置于突变Fad3基因的5’，云扁豆蛋白终止子序列置于突变Fad3基因的3’。Doyle等人，(1986)J.Biol.Chem.261：9228-9238和Slightom等人，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80：1897-1901中描述了云扁豆蛋白的序列。
工程改造适合的质粒并分别转移到土壤杆菌LBA4404菌株中。用每种改造的菌株感染5mm Westar种子下胚轴外植体节段(共培养)。将感染的下胚轴转移到胼胝体培养基中，然后再转移到再生培养基中。一旦从胼胝体长出看得见的茎，就切下芽，将其转移到延伸培养基中。切下延伸的嫩枝，浸泡在RootoneTM中，在琼脂培养基中生根，移植到盆栽土中，到的能育的植物T1。将得到的T1植物自交得到T2种子。
如上所述，进行T2种子的脂肪酸分析。表21列出了结果。用pIMC110质粒得到的40个转化体中，有17个植物证明具有野生型脂肪酸组成，16个证明为过量表达。当将功能基因转化到植物(以有义方向)中时，期望一部分转化体表现出过量表达的表型。
具有pIMC205基因的307个转化植物中，没有一个表现出脂肪酸组成过量表达。这一结果表明突变型fad3基因产物是没有功能的，因为如果基因产物具有功能的话，某些转化体将表现出过量表达的表型。
                            表21
    用pIMC205或pIMC110转化的Westar群体中的过量表达和共抑制
构建物 转化体的数量 α-亚麻酸含量范围(％) 过量表达(＞10％亚麻酸) 共抑制(＜4.0％亚麻酸) 野生型
pIMC110 40 2.4-20.6 16 7 17
pIMC205 307 4.6-10.4 0 0 307
表22列出了典型转化植物的脂肪酸组成。品系652-09和663-40是含pIMC110植物的代表，而且分别表现出过量表达和共抑制表型。品系205-284是含pIMC205的植物的代表，含有突变fad3基因。
                           表22
    用pIMC205或pIMC110转化的Westar的T2种子的脂肪酸组成
        品系                 脂肪酸组合物(％)
 C16:0  C18:0  C18:1  C18:2  C18:3
 652-09 pIMC110过量表达  4.7  3.3  65.6  8.1  14.8
 663-40pIMC110共抑制  4.9  2.1  62.5  23.2  3.6
 205-284pIMC205  3.7  1.8  68.8  15.9  6.7
实施例11
野生型和突变型Fad2-D和Fad2-F的序列
从Q4275(实施例5)的叶子中分离出高分子量的基因组DNA。将这种DNA用于聚合酶链式反应(PCR)扩增Fad2-D和Fad2-F基因的模板。PCR扩增的总体积为100μl，其中含有0.3μg基因组DNA、200μM脱氧核糖核苷三磷酸、3mMMgSO4、1-2单位的DNA聚合酶和1X缓冲液(由DNA聚合酶供应商提供)。循环条件为：95℃1分钟一轮，然后94℃1分钟、55℃2分钟、73℃3分钟30轮。
用Elongase(Gibco-BRL)扩增Fad2-D基因一次。该基因5’和3’端的PCR引物分别为：CAUCAUCAUCAUCTTCTTCGTAGGGTTCATCG和CUACUACUACUATCATAGAA GAGAAAGGTTCAG。
单独扩增Fad-2F基因四次，两次用Elongase，两次用Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)。用于该基因5’和3’端的PCR引物分别为：5’CAUCAUCAUCAUCATGGGTGCACGTGGAAGAA3’和5’CUACUACUACUA TCTTTCACCATCATCATATCC3’。
在琼脂糖凝胶中溶解扩增的DNA产物，用Jet Sort纯化然后通过在引物两端的(CAU)4和(CAU)4序列退火入pAMP1(Gibco-BRL)，转化到大肠杆菌DH5α中。
按制造商的说明书，以合成引物AmpliTaqDNA聚合酶和染料终止子，用ABI PRISM 310自动测序仪(Perkin-Elmer)测定Fad2-D和Fad2-F插入片段在两条链上的序列。
发现Fad2-D基因具有一个在ATG起始密码子上游的内含子。如所预计的，该基因的编码序列在316核苷酸上含有突变，A变成G(从IMC129衍生的)(图2)。
与野生型F基因序列相比(图2)，在Q4275扩增产物的F基因序列中检测到在908核苷酸上单个碱基的颠换(从G变化成A)。这一突变使303氨基酸的密码子从GGA变成GAA，导致谷氨酸残基非保守性取代了甘氨酸(表3和图3)。植物中突变Q4275 Fad2-Fδ-12去饱和酶基因的表达，改变了脂肪酸组成(如本文所述)。
实施例12
高芥酸、高油酸油菜籽
图4列出了为在油菜籽中产生新脂肪酸组成所设计的繁殖程序。通常，将高芥酸品系和高油酸品系杂交。命名为HEC01(以商品名Hero出售)的高芥酸品系含有约45.5％芥酸(表23)。高油酸品系命名为93GS66A-130和93GS34A-179，它们是从93GS衍生的。见实施例5和表17。这些品系的种子油中含有约84％油酸(表24)。
         表23
  HEC01的脂肪酸组成
    脂肪酸     重量(％)
    C14:0     0.05
    C16:0     3.60
    C16:1     0.36
    C18:0     1.66
    C18:1     14.72
    C18:2     10.67
    C18:3     9.71
    C20:0     1.36
    C20:1     9.04
    C20:2     0.48
    C22:0     1.74
    C22:1     45.45
    C24:0     0.49
    C24:1     0.81
                            表24
           93GS66A-130和93GS34A-179的脂肪酸组成
脂肪酸 占93GS66A-130重量的百分比 占93GS34A-179重量的百分比
C14:0 0.04 0.05
C16:0 3.25 3.23
C16:1 0.25 0.25
C18:0 1.60 1.94
C18:1 84.38 83.71
C18:2 2.58 3.14
C18:3 4.86 4.76
C20:0 0.56 0.65
C20:1 1.57 1.41
C20:2 0.05 0.04
C22:0 0.37 0.39
C22:1 0.06 0.03
C24:0 0.20 0.18
C24:1 0.21 0.18
分别将HEC01×93GS66A-130和HEC01×93GS34A-179杂交的F1代命名为96.801和96.804。让F196.801和96.804植物自交产生F2种子。随机分析总共622粒F2种子的脂肪酸组成。表25列出了这622粒种子的单不饱和脂肪酸总含量、油酸、二十碳烯酸、芥酸、多不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸总含量的平均百分比以及标准偏差。
                   表25
脂肪酸 ％
总长链单不饱和脂肪酸 78.90±4.07
棕榈酸(palmitoleate) 0.28±0.06
油酸 45.33±9.91
二十碳烯酸 14.84±2.84
芥酸 17.97±8.9
神经酸 0.48±0.21
总多不饱和脂肪酸 7.01±1.05
总饱和脂肪酸 13.99±3.83
这些数据的分析表明正态分布中频率分布偏离。长链单不饱和脂肪酸含量的频率分布略偏向右(-0.0513)，二十碳烯酸含量的频率分布严重偏向右(1.715)。油酸和芥酸含量的频率分布严重偏向左(分别为0.397和0.177)。用Windows的Lotusl-2-3(5.0版本)计算偏斜度。
表26显示了种子总群中所选群体的特征。例如，151种种子的长链单不饱和脂肪酸含量大于82％(表26，B列)。该群体中，平均油酸、二十碳烯酸和芥酸含量分别为48％、16％和19％。总多不饱和脂肪酸含量(C18:2、C18:3和C20:2)约为9％，总饱和脂肪酸含量至多为7％。
622种种子中有47种的长链单不饱和脂肪酸含量大于85％(表26，C列)。这些种子的平均油酸、二十碳烯酸和芥酸的含量分别为51％、17％和17％。总饱和和总多不饱和脂肪酸分别至多为7％。
23种种子二十碳烯酸的含量大于19％(表26，列F)。这些种子的平均油酸和芥酸含量分别约为44％和19％。总多不饱和脂肪酸小于10％，总饱和脂肪酸小于7％。
                                                  表26
A B C D E F
总饱和 6.76±0.72 6.65±0.07 6.68±0.61 6.85±0.98 6.85±0.93 6.66±0.78
C14:0 0.04±0.04 0.07±0.05 0.06±0.03 0.07±0.04 0.06±0.64 0.07±0.05
C16:0 3.42±0.37 3.35±0.34 328±0.32 3.45±0.40 3.51±0.42 3.31±0.33
C18:0 1.92±0.33 1.93±0.32 2.06±0.32 1.83±0.30 1.90±0.30 1.93±0.23
C20:0 0.77±0.14 0.76±0.14 0.76±0.13 0.80±0.13 0.76±0.12 0.79±0.16
C22:0 0.38±0.14 0.36±0.12 0.37±0.11 0.42±0.15 0.35±0.12 0.35±0.29
C24:0 0.21±0.19 0.19±0.14 0.20±0.17 0.28±0.76 0.26±0.71 0.19±0.24
总单不饱和 82.91±2.11 84.21±1.64 86.21±1.00 79.49±4.00 80.36±3.75 83.92±2.43
C16:1 0.28±0.05 0.27±0.05 0.27±0.04 0.27±0.05 0.27±0.05 0.26±0.05
C18:1 46.45±9.47 47.66±9.22 51.33±8.96 39.29±6.21 43.55±6.91 44.08±2.89
C20:1 16.91±2.57 16.41±2.47 16.72±2.40 15.56±2.22 16.78±1.30 19.97±0.63
C22:1 19.69±8.45 19.38±8.25 1739±12.26 23.81±5.89 19.27±6.39 19.09±2.32
C24:1 0.49±0.19 0.48±0.17 0.50±0.18 0.56±0.19 0.49±0.21 0.52±0.29
总多不饱和 10.33±2.10 9.14±1.71 7.11±0.98 13.66±3.87 12.80±3.60 9.43±2.43
C18:2 5.16±1.5 4.36±1.24 3.17±0.82 7.25±2.62 6.58±2.40 3.96±1.39
C18:3 5.02±1.18 4.65±1.07 3.84±0.69 6.19±1.61 6.02±1.52 5.27±1.25
C20:2 0.15±0.10 0.13±0.04 0.10±0.04 0.22±0.11 0.19±0.10  0.20±0.28
A＝长链单不饱和含量＞80％，n＝247；B＝＞82％总长链单不饱和含量，n＝151；C＝＞85％总长链单不饱和含量，n＝47；D＝＞15％芥酸，n＝318；E＝＞15％二十碳烯酸；F＝＞19％二十碳烯酸，n＝23
表27列出了所选的单种种子的脂肪酸组成。V800655.334是一长链单不饱和脂肪酸含量约为84％的单粒种子。油酸、二十碳烯酸和芥酸的含量分别为33.48％、17.14％和32.23％。总多不饱和脂肪酸的含量约为10％。亚油酸、α-亚麻酸和芥酸的含量分别为3.54％、6.01％和0.15％。
V800655.126是一长链单不饱和脂肪酸含量约为85％的单种种子(油酸为42.67％，二十碳烯酸为16.21％，芥酸为25.37％)。总多不饱和脂肪酸含量约为8％(亚油酸为4.87％，α-亚麻酸为3.05％，和二十碳二烯酸为0.13％)。
V800654.9是一长链单不饱和脂肪酸含量约为89％的单种种子(油酸为51.53％，二十碳烯酸为16.94％，芥酸为19.24％)。总多不饱和脂肪酸含量约为8％(亚油酸为4.87％，α-亚麻酸为3.05％，和二十碳二烯酸为0.13％)。
将长链单不饱和脂肪酸含量至少约为82、芥酸含量至少约为15％的单个种子种植在温室中，长至成熟，进行自花授粉。收获每株植物的种子(F3代)。分析了每个F2植物的批量种子样品的脂肪酸组成。
                           表27
                所选的单种种子的脂肪酸组成
    脂肪酸   V800655.334重量(％)   V800655.12 6重量(％)   V800654.9重量(％)
    C14:0   0.07   0.05   0.03
    C16:0   3.49   3.52   2.98
    C16:1   0.34   0.28   0.28
    C18:0   1.64   1.89   1.65
    C18:1   33.48   42.67   51.53
    C18:2   3.54   4.87   2.09
    C18:2   6.01   3.05   3.53
    C20:0   0.86   0.87   0.68
    C20:1   17.14   16.21   16.94
    C20:2   0.15   0.13    0.10
    C22:0   0.41   0.35    0.24
    C22:1   32.23   25.37    19.24
    C24:0   0.12   0.13    0.14
    C24:1   0.52   0.61    0.59
实施例13
用Hero和若干高油酸品系(表28)进行另一杂交，从而通过降低多不饱和脂肪酸含量增加种子芥酸的含量和总单不饱和脂肪酸含量。高油酸品系包括048X058和Q4275X663-40。048X058品系是从两个分开转化的品系杂交产生的。048X058品系包含因663-40转基因(上述)的导入而产生的共抑制子，以及由转基因产生的另一共抑制子，包括连接于油酸去饱和酶基因的油质蛋白启动子。从Q4275(实施例5和表17)与663-40杂交产生了Q4275X663-40品系。663-40品系含有因转基因产生的共抑制子，包括连接于亚油酸去饱和酶基因的napin启动子。使每个品系的植物在生长室生长，16小时光照，温度为23℃/17℃(白天/晚上)。开花前先将花朵去雄，盖住以防止异花授粉。第二天，用选定的花粉供体对去雄花朵的柱头授粉。收获荚果中成熟的F1种子。
                            表28
                          杂交分组
杂交编号 母本 母本表型 父本 父本表型 父本表型来源
HEHOA HEC101 高22:1 048X058 高18:1/低18:3 转基因
HEHOB HEC101 高22:1 Q4275X663-40 高18:1/低18:3 突变/转基因
HEHOC HEC101 高22:1 Q4275X663-40 高18:1/低18:3 突变/转基因
在生长室中培养表28杂交产生的F1种子，得到F2种子。每种杂交各种10粒种子。开花后，用袋子盖住植物，以确保自花授粉。成熟时收获F2种子。
室温暗处使种子在滤纸上萌芽。萌芽开始后的18-24小时，从种子取一片子叶，来提取脂肪酸。用气相层析确定脂肪酸组成。表29和30显示了所选的F2一半种子的高芥酸含量。
将F2一半种子种于土中，在生长室条件下培养(如上所述)。开花后，用袋子套住植物进行自花授粉。成熟后，收获F3种子，并作脂肪酸组成分析。用10-15粒种子样品进行种子的分析。表31和32显示了分析结果。
                                     表29
              HEHOA[HE101X(048X052)]的F2一半种子的脂肪酸组成
 样品编号                                                            脂肪酸组成(％)
 C16:0  C18:0  C18:1  C18:2  C18:3  C20:0  C20:1  C22:0  C22:1  C24:0  C24:1
 VL10186-1  3.34  1.83  49.7  3.32  1.59  0.87  19.62  0.30  18.10  0.39  0.35
 VL10186-5  2.61  1.07  29.14  5.81  2.42  0.71  14.99  0.31  40.90  0.93  0.60
 VL10186-33  3.47  1.32  29.73  4.38  2.98  0.86  12.22  0.44  41.21  1.50  1.28
 VL10186-59  4.01  1.68  41.38  2.96  1.69  1.08  19.72  0.43  26.05  0  0.55
 VL10186-67  3.90  1.29  29.10  3.65  2.89  0.88  13.79  0.52  40.96  1.31  1.09
 VL10186-74  2.76  1.25  34.04  2.63  1.45  0.75  16.64  0.38  3 8.67  0.14  0.95
 VL10186-88  3.23  1.39  48.97  3.27  1.50  0.60  19.71  0.17  20.48  0  0.36
                                  表30
            HEHOC[HE101X(Q4275X663-40)]的一半种子的脂肪酸组成
 样品编号                                               脂肪酸组成(％)
 C16:0  C18:0  C18:1  C18:2  C18:3  C20:0  C20:1  C22:0  C22:1  C24:0  C24:1
 VL10200-214  2.24  0.74  31.66  3.01  6.24  0.46  11.79  0.41  40.60  0.86  1.57
 VL10200-231  3.89  1.03  31.51  12.50  2.41  0.54  14.17  0.29 32.23  0  0.75
 VL10200-238  3.36  0.95  33.19  8.99  1.66  0.55  14.35  0.21  33.61  0.83  1.02
 VL10200-267  3.12  1.02  30.18  7.61  1.52  0.59  14.53  0.19  39.41  0.24  1.013
 VL10203-50  2.63  0.97  31.79  8.47  1.99  0.58  14.58  0.25  37.41  0.13  0.59
 VL10200-293  2.71  0.78  32.83  6.85  1.88  0.46  13.11  0.32  39.18  0.82  0.67
                                   表31
              97 HEHOA[HE101X(048X052)]的F3品系的脂肪酸组成
 样品编号     脂肪酸组成(％)
 C16:0  C18:0  C18:1  C18:2  C18:3  C20:0  C20:1  C22:0  C22:1  C24:0  C24:1
 HEHOA-74  2.51  1.03  27.44  3.72  3.55  0.65  13.60  0.30  45.57  0.14  1.03
 HEHOA-01  3.66  1.40  47.79  6.47  2.97  0.62  19.23  0.25  16.11  0.14  0.76
 HEHOA-67  2.47  0.84  20.43  7.25  3.89  0.69  10.33  0.47  52.09  0.16  0.86
 HEHOA-59  2.81  1.08  27.01  7.88  2.82  0.69  16.15  0.32  39.68  0.15  0.86
 HEHOA-88  3.16  1.21  44.85  9.21  2.31  0.49  16.30  0.21  21.00  0.12  0.58
 HEHOA-33  2.53  0.79  21.90  9.52  3.55  0.53  11.51  0.31  47.59  0.13  1.08
 HEHOA-5  2.93  1.01  23.67  10.26  2.00  0.63  14.34  0.38  42.98  0.15  1.06
                                    表32
               HEHOC[HE101X(Q4275X663-40)]F3品系的脂肪酸组成
 样品编号                                                   脂肪酸组成(％)
 C16:0  C18:0  C18:1  C18:2  C18:3  C20:0  C20:1  C22:0  C22:1  C24:0  C24:1
 HEHOC-214  2.47  1.12  31.15  3.77  3.84  0.77  13.78  0.43  41.15  0.17  0.97
 HEHOC-267  2.62  1.42  31.64  6.44  1.30  0.84  15.64  0.39  38.15  0.16  0.95
 HEHOC-293  2.73  1.13  32.08  7.23  2.18  0.72  14.88  0.41  37.17  0.17  0.81
 HEHOC-238  2.90  1.05  35.20  9.37  1.76  0.66  14.88  0.38  32.05  0.1  1.01
 HEHOC(2)-50  2.60  0.93  31.16  5.66  2.09  0.61  14.93  0.31  40.30  0.11  0.88
 HEHOC(2)-156  3.19  1.71  46.56  3.05  1.59  0.94  16.41  0.40  24.67  0.19  0.83
如上所述，种植HEHOC-214F3种子，在生长室条件下生长，进行自花授粉。成熟时，收获F4种子，用10-15粒种子量的样品作脂肪酸组成分析。表33显示了三个F4品系的种子脂肪酸组成。这三个样品的长链单不饱和脂肪酸含量都大于82％，芥酸含量都大于37％(总脂肪酸组成中)。这些F4代物质中影响脂肪酸组成的基因依旧是分开的。选择后代将固定遗传组合，产生的品系所含的种子脂肪酸组成中有约25-30％油酸、约3-4％亚油酸、约1-2％α-亚麻酸、约45-50％芥酸和约10-13％二十碳烯酸。
                                                     表33
                                         HEHOC 214的F4品系的脂肪酸组成
  样品编号                                             脂肪酸组成(％)
C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1 C22:0 C22:1 C24:0 C24:1 TotalSats
  1  1.91  1.33  35.9  3.17  1.21  0.97  16.57  0.52  37.1  0.23  0.76  4.9
  2  1.86  0.87  24.26  8.49  1.01  0.7  12.41  0.4  48.56  0.18  0.90  4.0
  3  1.94  0.83  26.67  8.31  1.02  0.64  14.17  0.34  44.71  0.14  0.82  3.9
实施例14
将表31诸品系的种子种在两个分开的苗圃中。让每个苗圃中的植物自然授粉。从每个苗圃产生的种子中提取油，表34列出了油的脂肪酸组成。将每种油的样品精炼、漂白(长链高单不饱和苗圃1)或精炼、漂白和脱臭(长链高单不饱和苗圃2)。苗圃1油的总饱和脂肪酸含量为5.55％，长链单不饱和脂肪酸含量为85.23％，总多不饱和脂肪酸含量为6.80％。苗圃2油的总饱和脂肪酸含量为5.22％，长链单不饱和脂肪酸含量为82.90％，总多不饱和脂肪酸含量为9.56％。苗圃1和2油的碘值分别为79和81.7。未脱臭的苗圃1油含有420ppm生育酚。苗圃2油含有280ppm生育酚。苗圃1和2油的平均抗氧化稳定性分别为70AOM小时(n＝2、69和71AOM小时)和49.5AOM小时(n＝2、48和51AOM小时)。
                                                                 表34
                                                  高长链单不饱和菜籽油的脂肪酸组成
苗圃编号                                                    脂肪酸组成(％)
 C16:0  C18:0  C18:1  C18:2  C18:3  C20:0  C20:1  C22:0 C22:1
Plot1  2.45  1.50  31.50  3.68  2.45  0.90  13.20  0.39  39.3
Plot2  2.55  1.50  29.70  6.35  2.46  0.76  1.250  036  39.50
表35列出了苗圃1和2油的特征，是用Perkin Elmer型号7差式扫描量热计通过差式扫描量热确定的。将7-12mg样品置于样品盘中，密封，加到自动取样器中。维持样品的初始温度20℃1分钟，以40℃/分钟的速度将温度降至-30℃。维持样品-30℃10分钟，然后以5℃/分钟速度加热到75℃，得到熔化曲线。保持样品75℃10分钟，然后冷却到-30℃(以5℃/分钟)得到冷却曲线。结果显示这些长链单不饱和脂肪酸含量大于82％、芥酸含量大于15％的油，融点约为2-3℃。与其相比，三芥酸精在室温下是为固体。
                      表35
           长链高单不饱和菜籽油的特征
  苗圃   MP(℃)融点   结晶点   △H(j/g)
  1   3.2   -24   88.5
  2   2.2   -27   92.6
实施例15
如实施例5所述，用MNNG诱变欧洲油菜品种IMC129的种子。如实施例5所述，培养处理过的种子，在M3代选择硬脂酸或棕榈酸含量降低的种子。将两个选出的分别命名为ZW1441(棕榈酸含量降低)和Y30137(硬脂酸含量降低)的品系植株与HE101杂交。选择种子棕榈酸含量降低、芥酸含量升高的ZW1441XHE101后代。选择种子硬脂酸含量降低、芥酸含量升高的Y30137XHE101后代。表36显示了所选的代表性F4代种子的脂肪酸组成。结果表明可产生长链单不饱和脂肪酸含量约为82％或更多、芥酸含量为15％或更多和总饱和脂肪酸含量小于4％(如约2.0％-4.0％)的种子。
                                                     表36
                                             F4品系的脂肪酸组成
 样品编号                                        脂肪酸组成(％)
 C16:0  C18:0  C18:1  C18:2  C18:3  C20:0  C20:1  C22:0  C22:1
 ZW1441  2.73  1.74  73.46  11.46  7.52  0.67  1.47  0.34  0
 ZW1441 xHE101
 1  1.99  0.97  14.89  10.66  6.77  0.97  8.57  0.78  52.4
 2  2.15  0.90  14.89  12.09  7.01  0.80  8.84  0.58  50.7
 3  2.18  1.02  13.86  11.24  6.64  0.97  8.89  0.65  52.33
 Y30137  3.44  1.14  78.08  7.41  6.23  0.71  1.70  0.46  0.04
 HE101 x Y30137
 1  2.26  0.77  17.17  9.31  6.32  0.69  10.44  0.50  50.99
 2  1.99  0.75  26.42  8.48  7.47  0.58  12.97  0.39  39.5
 3  1.99  0.79  24.62  5.22  6.32  0.64  13.84  0.35  44.86
对于上述未表明的范围而言，本领域普通技术人员将会理解本文所描述和说明的各种具体实施例可加入其它实施例的特点进行进一步改进。本文所引用的所有专利、出版物和其它参考文献，本文全部纳为参考。
上述发明详述仅是为了提供对本发明更好的理解，对本发明无任何限制作用，以及对本领域技术人员而言，某些改进显然也是在以下权利要求书的精神和范围内的。
                         序列表
    <110>Kodali，Dharma R.
    Fan，Zhegong
    DeBonte，Lorin R.
    <120>总单不饱和脂肪酸含量提高的植物、种子和油
    <130>07148/097WO1
    <156>09/128602
    <151>1998-08-03
    <160>18
    <170>FastSEQ for Windows Version 3.0
    <210>1
    <211>1155
    <212>DNA
    <213>欧洲油菜
    <220>
    <221>CDS
    <222>(1)...(1152)
    <221>未知
    <222>(133)...(133)
    <222>Xaa＝Pro或Leu
    <221>未知
    <222>(194)...(194)
    <223>Xaa＝Leu
    <221>未知
    <222>(246)...(246)
    <223>Xaa＝Ile或Val
    <221>未知
    <222>(262)...(262)
    <223>Xaa＝Ile或Val
    <221>未知
    <222>(345)...(345)
    <223>Xaa＝Tyr
    <400>1
atg ggt gca ggt gga aga atg caa gtg tct cct ccc tcc aag aag tct    48
Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser
 1               5                   10                  15
gaa acc gac acc atc aag cgc gta ccc tgc gag aca ccg ccc ttc act    96
Glu Thr Asp Thr Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr
             20                  25                  30
gtc gga gaa ctc aag aaa gca atc cca ccg cac tgt ttc aaa cgc tcg      144
Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser
         35                  40                  45
atc cct cgc tct ttc tcc tac ctc atc tgg gac atc atc ata gcc tcc      192
Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser
     50                  55                  60
tgc ttc tac tac ntc gcc acc act tac ttc cct ctc ctc cct cac cct      240
Cys Phe Tyr Tyr Xaa Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro
 65                  70                  75                  80
ctc tcc tac ttc gcc tgg cct ctc tac tgg gcc tgc caa ggg tgc gtc      288
Leu Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val
                 85                  90                  95
cta acc ggc gtc tgg gtc ata gcc cac gaa tgc ggc cac cac gcc ttc      336
Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe
            100                 105                 110
agc gac tac cag tgg ctt gac gac acc gtc ggt ctc atc ttc cac tcc      384
Ser Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His Ser
        115             120                     125
ttc ctc ctc gtc cct tacttc tcc tgg aag tac agt cat cgc agc cac      432
Phe Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Ser His
    130                 135                 140
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His Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys
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aag aag tca gac atc aag tgg tac ggc aag tac ctc aac aac cct ttg      528
Lys Lys Ser Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu
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Gly Arg Thr Val Met Leu Thr Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu
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Val Lys Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro
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Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser
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Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser
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Cys Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro
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Glu Thr Asp Asn Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr
             20                  25                  30
 gtc gga gaa ctc aag aaa gca atc cca ccg cac tgt ttc aaa cgc tcg       144
Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser
         35                   40                  45
 atc cct cgc tct ttc tcc tac ctc atc tgg gac atc atc ata gcc tcc       192
Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser
     50                  55                  60
 tgc ttc tac tac gtc gcc acc act tac ttc cct ctc ctc cct cac cct      240
Cys Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro
 65                  70                  75                  80
 ctc tcc tac ttc gcc tgg cct ctc tac tgg gcc tgc cag ggc tgc gtc      288
Leu Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val
                 85                  90                  95
 cta acc ggc gtc tgg gtc ata gcc cac gag tgc ggc cac cac gcc ttc      336
Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe
            100                 105                 110
 agc gac tac cag tgg ctg gac gac acc gtc ggc ctc atc ttc cac tcc      384
Ser Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His Ser
        115             120                 125
 ttc ctc ctc gtc cyt tacttc tcc tgg aag tac agt cat cga cgc cac      432
Phe Leu Leu Val Xaa Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His
    130                 135                 140
 cat tcc aac act ggc tcc ctc gag aga gac gaa gtg ttt gtc ccc aag      480
His Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys
145                 150                 155                 160
 aag aag tca gac atc aag tgg tac ggc aag tac ctc aac aac cct ttg      528
Lys Lys Ser Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu
                165                 170                 175
 gga cgc acc gtg atg tta acg gtt cag ttc act ctc ggc tgg cct ttg      576
Gly Arg Thr Val Met Leu Thr Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu
            180                 185                 190
 tac ttr gcc ttc aac gtc tcg ggg aga cct tac gac ggc ggc ttc gct      624
Tyr Xaa Ala Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Gly Gly Phe Ala
        195                 200                 205
 tgc cat ttc cac ccc aac gct ccc atc tac aac gac cgt gag cgt ctc      672
Cys His Phe His Pro Asn Ala Pro Ile Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu
    210                 215                 220
 cag ata tac atc tcc gac gct ggc atc ctc gcc gtc tgc tac ggt ctc      720
Gln Ile Tyr Ile Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Cys Tyr Gly Leu
225                 230                 235                 240
 tac cgc tac gct gct rtc caa gga gtt gcc tcg atg gtc tgc ttc tac      768
Tyr Arg Tyr Ala Ala Xaa Gln Gly Val Ala Ser Met Val Cys Phc Tyr
                245                 250                 255
 gga gtt cct ctt ctg rtt gtc aac ggg ttc tta gtt ttg atc act tac      816
Gly Val Pro Leu Leu Xaa Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr
            260                 265                 270
 ttg cag cac acg cat cct tcc ctg cct cac tat gac tcg tct gag tgg      864
Leu Gln His Thr His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp
    275                 280                 285
 gat tgg ttg agg gga gct ttg gcc acc gtt gac aga gac tac gga atc      912
Asp Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile
    290                 295                 300
 ttg aac aag gtc ttc cac aat atc acg gac acg cac gtg gcg cat cac      960
Leu Asn Lys Val Phe His Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His
305                 310                 315                 320
 ctg ttc tcg acc atg ccg cat tat cat gcg atg gaa gct acg aag gcg     1008
Leu Phe Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala
                325                 330                 335
 ata aag ccg ata ctg gga gag tat tay cag ttc gat ggg acg ccg gtg     1056
Ile Lys Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Xaa Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val
            340                 345                 350
 gtt aag gcg atg tgg agg gag gcg aag gag tgt atc tat gtg gaa ccg     1104
Val Lys Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro
        355                 360                 365
 gac agg caa ggt gag aag aaa ggt gtg ttc tgg tac aac aat aag tta     1152
Asp Arg Gln Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu
    370                 375                 380
 tga                                                         1155
    <210>10
    <211>384
    <212>PRT
    <213>欧洲油菜
    <400>10
Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser
 1           5                       10             15
Glu Thr Asp Asn Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr
         20                 25                  30
Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser
        35                  40                  45
Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser
    50                  55                  60
Cys Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro
65                  70                  75                  80
Leu Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val
                85                  90                  95
Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe
            100                 105             110
Ser Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His Ser
        115                 120                 125
Phe Leu Leu Val Xaa Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His
    130                 135                 140
His Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys
145                 150                 155                 160
Lys Lys Ser Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu
                165                 170                 175
Gly Arg Thr Val Met Leu Thr Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu
            180                 185                 190
Tyr Xaa Ala Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Gly Gly Phe Ala
        195                 200                 205
Cys His Phe His Pro Asn Ala Pro Ile Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu
    210                 215                 220
Gln Ile Tyr Ile Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Cys Tyr Gly Leu
225                 230                 235                 240
Tyr Arg Tyr Ala Ala Xaa Gln Gly Val Ala Ser Met Val Cys Phe Tyr
                245                 250                 255
Gly Val Pro Leu Leu Xaa Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr
            260                 265                 270
Leu Gln His Thr His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp
        275                 280                 285
Asp Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile
    290                 295                 300
Leu Asn Lys Val Phe His Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His
305                 310                 315                 320
Leu Phe Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala
                325                 330                 335
Ile Lys Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Xaa Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val
            340                 345                 350
Val Lys Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro
        355                 360                 365
Asp Arg Gln Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu
    370                 375                 380
    <210>11
    <211>21
    <212>DNA
    <213>其它核酸
    <400>11
ggatatgatg atggtgaaag a                          21
    <210>12
    <211>21
    <212>DNA
    <213>其它核酸
    <400>12
tctttcacca tcatcatatc c                         21
    <210>13
    <211>21
    <212>DNA
    <213>其它核酸
    <400>13
gttatgaagc aaagaagaaa c                         21
    <210>14
    <211>21
    <212>DNA
    <213>其它核酸
    <400>14
gtttcttctt tgcttcataa c                         21
    <210>15
    <211>32
    <212>DNA
    <213>其它核酸
    <400>15
caucaucauc aucttcttcg tagggttcat cg             32
    <210>16
    <211>33
    <212>DNA
    <213>其它核酸
    <400>16
cuacuacuac uatcatagaa gagaaaggtt cag            33
    <210>17
    <211>32
    <212>DNA
    <213>其它
    <400>17
caucaucauc aucatgggtg cacgtggaag aa             32
    <210>18
    <211>33
    <212>DNA
    <213>其它
    <400>18
cuacuacuac uatctttcac catcatcata tcc               33

Claims (36)

1.一种产生芸苔属植物的方法，其特征在于，所述的方法包括将第一种植物品系与第二种植物品系杂交，筛选所述杂交的后代，其中所述的第一种植物品系产生芥酸含量至少占总脂肪酸组成的45％的种子，所述的第二种植物品系产生油酸含量至少占总脂肪酸组成的84％的种子，所述的后代产生的种子的长链单不饱和脂肪酸含量至少占总脂肪酸组成的82％，芥酸含量至少占15％。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述后代的种子中油酸含量至少占总脂肪酸组成的37％。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的后代种子中二十碳烯酸的含量至少占总脂肪酸组成的14％。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单不饱和脂肪酸含量为85％-90％。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述后代的种子中油酸至少占总脂肪酸组成的42％。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的油酸含量为47％-56％。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述后代的种子中芥酸的含量占总脂肪酸组成的17％-31％。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述后代的种子中二十碳烯酸的含量占总脂肪酸组成的15％-21％。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述后代的种子中饱和脂肪酸含量至多占总脂肪酸组成的7％。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述后代的种子中饱和脂肪酸含量占脂肪酸组成的4％。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述后代的种子中饱和脂肪酸含量占总脂肪酸组成的2％-4％。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述后代的种子中多不饱和脂肪酸含量至多占总脂肪酸组成的11％。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述后代的种子中多不饱和脂肪酸含量占总脂肪酸组成的6％-11％。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述后代的种子中α-亚麻酸含量占总脂肪酸组成的1％-2％。
15.一种芸苔属种子油，其特征在于，其总脂肪酸组成中长链单不饱和脂肪酸含量至少为82％，芥酸含量至少为15％。
16.如权利要求15所述的油，其特征在于，所述的油中油酸的含量占总脂肪酸组成的至少37％。
17.如权利要求15所述的油，其特征在于，所述的油中二十碳烯酸的含量至少占总脂肪酸组成的14％。
18.如权利要求15所述的油，其特征在于，所述的单不饱和脂肪酸含量为85％-90％。
19.如权利要求18所述的油，其特征在于，所述的油中油酸的含量至少占总脂肪酸组成的42％。
20.如权利要求19所述的油，其特征在于，所述的芥酸含量为47％-56％。
21.如权利要求18所述的油，其特征在于，所述的油中芥酸的含量占总脂肪酸组成的17％-31％。
22.如权利要求18所述的油，其特征在于，所述的油中二十碳烯酸的含量占总脂肪酸组成的15％-21％。
23.如权利要求15所述的油，其特征在于，所述的油中饱和脂肪酸含量至多占总脂肪酸组成的7％。
24.如权利要求15所述的油，其特征在于，所述的油中多不饱和脂肪酸的含量至多占总脂肪酸组成的11％。
25.如权利要求24所述的油，其特征在于，油中所述的多不饱和脂肪酸的含量不到9％。
26.如权利要求15所述的油，其特征在于，所述的油中神经酸、芥酸和二十碳烯酸的含量总和为50％-66％。
27.如权利要求26所述的种子油，其特征在于，其中油酸含量为25％-30％。
28.一种制造植物油的方法，其特征在于，所述的方法包括压榨芸苔属种子，所述的种子的总脂肪酸组成中长链单不饱和脂肪酸含量至少为82％，芥酸含量至少为15％，并从所述的压榨过的种子中提取所述的植物油。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括精炼和漂白所述的油。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括将所述的油脱臭。
31.一种润滑油，其特征在于，所述的润滑油包含权利要求15所述的芸苔属油和添加剂。
32.如权利要求31所述的润滑油，其特征在于，所述的添加剂选自：抗氧化剂、防锈剂、防腐剂、降凝剂、消泡剂、着色剂和脱垢剂。
33.如权利要求31所述的润滑剂，其特征在于，所述的添加剂存在的量为0.01％-20％重量。
34.一种液压液，其特征在于，所述的液压液包括权利要求15所述的芸苔属油和添加剂。
35.如权利要求34所述的液压液，其特征在于，所述的添加剂选自：抗氧化剂、防锈剂、防腐剂、降凝剂、消泡剂、着色剂和脱垢剂。
36.如权利要求34所述的液压液，其特征在于，所述的添加剂存在的量为0.01％-20％重量。
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