DE69938306T2

DE69938306T2 - Pflanzen, samen und öle mit erhöhtem gesamtgehalt an einfach ungesättigten fettsäuren

Info

Publication number: DE69938306T2
Application number: DE69938306T
Authority: DE
Inventors: Dharma Plymouth KODALI; Zhegong Fort Collins FAN; Lorin R. Fort Collins DeBONTE
Original assignee: Cargill Inc
Current assignee: Cargill Inc
Priority date: 1998-08-03
Filing date: 1999-08-03
Publication date: 2009-03-12
Anticipated expiration: 2019-08-04
Also published as: CA2337984A1; BR9912710A; US6649782B2; AU5335399A; PL345974A1; AU772286B2; WO2000007433A1; EP1100310A4; US20040083503A1; EP1100310A1; ATE388234T1; US20020092038A1; JP2002528050A; US6414223B1; CN1315826A; DE69938306D1; CN1184878C; EP1100310B1

Description

Technisches Gebiet
Diese Erfindung betrifft Fettsäure-Desaturasen und Nukleinsäuren, welche die Desaturase-Proteine kodieren. Die Erfindung betrifft insbesondere Nukleinsäuren, welche Delta-12- und Delta-15-Fettsäure-Desaturaseproteine, welche die Fettsäurezusammensetzung in Pflanzen beeinflussen, kodieren, Polypeptide, welche von solchen Nukleinsäuren hergestellt werden, und Pflanzen, welche solche Nukleinsäuren exprimieren.
Hintergrund der Erfindung
Viele Züchtungsstudien wurden durchgeführt, um das Fettsäureprofil von Brassica-Varietäten zu verbessern. Pleines und Freidt, Fat Sci. Technol., 90(5), 167–171 (1988) berichten von Pflanzenlinien mit reduzierten C_18:3-Mengen (2,5–5,8%), kombiniert mit einem hohen Ölsäuregehalt (73–79%). Rakow und McGregor, J. Amer. Oil Chem. Soc., 50, 400–403 (Okt. 1973) diskutieren Probleme, welche mit dem Auswählen von Mutanten für Linol- und Linolensäuren verbunden sind. In Can. J. Plant Sci., 68, 509–511 (Apr. 1988) wird Stellar-Sommerraps offenbart, welcher Samenöl mit 3% Linolensäure und 28% Linolsäure herstellt. Roy und Tarr, Z. Pflanzenzuchtg, 95(3), 201–209 (1985) berichten von einem Transfer von Genen durch eine interspezifische Kreuzung von Brassica juncea in Brassica napus, was zu einer rekonstituierten Linie führt, welche einen hohen Linol- mit einem niedrigen Linolensäuregehalt vereinigt. Roy und Tarr, Plant Breeding, 98, 89–96 (1987) diskutieren Möglichkeiten für eine Entwicklung von B. napus L. mit verbessertem Linolen- und Linolensäuregehalt. Die europäische Patentanmeldung 323,753 , veröffentlicht am 12. Juli 1989, offenbart Samen und Öle mit weniger als 79% Ölsäure, kombiniert mit weniger als 3,5% Linolensäure. Canvin, Can. J. Botany, 43, 63–69 (1965) diskutiert die Wirkung von Temperatur auf die Fettsäurezusammensetzung von Ölen aus verschiedenen Samenkulturen, einschließlich von Rapssamen.
Mutationen werden typischerweise mit extrem hohen Dosen Strahlung und/oder chemischen Mutagenen induziert (Gaul, H., Radiation Botany (1964) 4: 155–232). Hohe Dosismengen, welche die LD₅₀ überschreiten und typischerweise die LD₉₀ erreichen, führen zu maximal erreichbaren Mutationsraten. In der Mutationszüchtung von Brassica-Varietäten haben große Mengen chemischer Mutagene alleine oder zusammen mit Strahlung eine begrenzte Anzahl von Fettsäuremutationen induziert (Rakow, G.Z. Pflanzenzuchtg (1973) 69: 62–82). Eine Mutation mit niedrigem α-Linolensäuregehalt, welche aus dem Rakow-Mutationszüchtungsprogramm abgeleitet wurde, wies aufgrund eines niedrigen Samenertrags keine direkte kommerzielle Anwendung auf. Die erste kommerzielle Sorte unter Verwendung der in 1973 abgeleiteten Mutation mit niedrigem α-Linolensäuregehalt wurde in 1988 als Varietät Stellar (Scarth, R. et al., Can. J. Plant Sci. (1988) 68: 509–511) freigegeben. Stellar wies zum Zeitpunkt seiner Freigabe einen 20% niedrigeren Ertrag als kommerzielle Sorten auf.
Veränderungen in der Fettsäurezusammensetzung von Pflanzenölen sind wünschenswert, um spezifischen Nahrungsmittel- und industriellen Verwendungen gerecht zu werden. Zum Beispiel würden Brassica-Canolavarietäten mit erhöhten einfach ungesättigten Mengen (Ölsäure) im Samenöl und Produkte, welche von einem solchen Öl abgeleitet wurden, die Fetternährung verbessern. Canolalinien, welche wenig mehrfach ungesättigte Fettsäuren und viel Ölsäure aufweisen, neigen dazu, eine höhere oxidative Stabilität aufzuweisen, was eine geeignete Eigenschaft für den Nahrungsmitteleinzelhandel darstellt. Geeignete Eigenschaften von Pflanzenölen für industrielle Verwendungen, wie Schmiermittelflüssigkeiten, schließen ein wünschenswertes Niedrigtemperatur-Verhalten, wie einen niedrigen Fließpunkt und einen niedrigen Trübungspunkt, zusammen mit einer sehr hohen oxidativen Stabilität ein.
Delta-12-Fettsäure-Desaturase (ebenfalls als Ölsäure-Desaturase bekannt) ist an der enzymatischen Umwandlung von Ölsäure zu Linolsäure beteiligt. Delta-15-Fettsäure-Desaturase (auch als Linolsäure-Desaturase bekannt) ist an der enzymatischen Umwandlung von Linolsäure zu α-Linolensäure beteiligt. Eine mikrosomale Delta-12-Desaturase wurde kloniert und unter Verwendung von T-DNA-Markierung (engl.: "tagging") charakterisiert. Okuley, et al., Plant Cell 6: 147–158 (1994). Die Nukleotidsequenzen der Gene höherer Pflanzen, welche mikrosomale Delta-12-Fettsäure-Desaturase kodieren, werden in Lightner et al., WO 94/11516 beschrieben. Sequenzen von Genen höherer Pflanzen, welche mikrosomale und plastidäre Delta-15-Fettsäure-Desaturasen kodieren, werden in Yadav, N., et al., Plant Physiol., 103: 467–476 (1993), der WO 93/11245 und Arondel, V. et al., Science, 258: 1353–1355 (1992) offenbart.
Zusammenfassung der Erfindung
Triacylglycerine, welche Fettsäuren mit heterogenen Kettenlängen und mit hohen Mengen einfach Ungesättigter enthalten, können geeignete Eigenschaften für industrielle Zwecke bereitstellen. Pflanzen mit Fettsäurezusammensetzungen, welche hohe Mengen einfach ungesättigter Fettsäuren und heterogene Kettenlängen aufweisen, würden eine Quelle für industrielle Öle für Verwendungen, wie Schmierung, bereitstellen.
In einem Aspekt wie in Anspruch 1 definiert, betrifft die Erfindung eine Brassica-Pflanze und den Nachwuchs davon, welche Samen mit einem Gehalt an langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren von mindestens 82% herstellt, wobei der Gehalt an langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren einen Erucasäuregehalt von mindestens 15%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung, und ein Gemisch aus anderen langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren umfasst. Der Gehalt an Ölsäure und Eicosensäure der Samen beträgt jeweils mindestens 37% und mindestens 14%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung. Der Gehalt an gesättigten Fettsäuren solcher Samen beträgt weniger als 7%, und der Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren beträgt weniger als 11%.
In einigen Ausführungsformen weisen die Pflanzen einen Gehalt an einfach ungesättigten Fettsäuren von 85% bis 90% und einen Erucasäuregehalt von mindestens 15%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung, auf. In solchen Pflanzen kann der Ölsäuregehalt mindestens 42% und insbesondere von 47% bis 56%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung, betragen. Der Erucasäuregehalt beträgt von 17% bis 31%, und der Eicosensäuregehalt beträgt von 15% bis 21%.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Brassica-Samenöl, welches einen Gehalt an langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren von mindestens 82% aufweist, wobei der Gehalt an langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren einen Erucasäuregehalt von mindestens 15%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung, und ein Gemisch aus anderen langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren umfasst. Solche Öle können einen Ölsäure- und Eicosensäuregehalt von jeweils mindestens 14% und 37%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung, aufweisen. Der Gehalt an gesättigten Fettsäuren kann weniger als 7%, z. B. weniger als 4% oder 2 bis 4% betragen. Der Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren beträgt weniger als 11% und in besonderen Ausführungsformen weniger als 9%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung. Der α-Linolensäuregehalt kann 1% bis 2% betragen.
In einigen Ausführungsformen enthält das Brassica-Samenöl einen Gehalt an langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren von 85% bis 90%. In solchen Ölen beträgt der Ölsäuregehalt mindestens 42% und in besonderen Ausführungsformen von 47% bis 56%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung. Der Erucasäure- und Eicosensäuregehalt beträgt jeweils von 17% bis 31% und von 15% bis 21%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung. Es wird ebenfalls ein Brassica-Samenöl geboten, welches einen Gehalt an langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren von mindestens 82% aufweist, wobei die Sum me der Gehalte an Nervonsäure, Erucasäure und Eicosensäure von 50% bis 66% beträgt, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung. Ein solches Samenöl kann einen Ölsäuregehalt von 25% bis 30% aufweisen.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zum Herstellen eines Pflanzenöls. Das Verfahren umfasst die Schritte des Zerdrückens von Brassica-Samen mit einem Gehalt an langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren von mindestens 82% und einem Erucasäuregehalt von mindestens 15%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung, und des Extrahierens des Pflanzenöls aus den zerdrückten Samen. Das Verfahren kann ebenfalls die Schritte des Veredelns und Bleichens des Öls und des Desodorieren des Öls einschließen.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Schmiermittel oder ein hydraulisches Fluid, welches ein Brassica-Öl mit einem Gehalt an langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren von mindestens 82% und einem Erucasäuregehalt von mindestens 15%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung, und einen Zusatz umfasst, wobei der Zusatz in einer Menge von 0,01 Gew.-% bis ungefähr 20 Gew.-% vorliegt. Der Zusatz kann ein Antioxidationsmittel, ein Rostinhibitor, ein Korrosionsinhibitor, ein Fließpunkterniedrigungsmittel, ein Anti-Schaumzusatz, ein Farbstoff und ein Detergens sein.
Kurzbeschreibung des Sequenzprotokolls

SEQ ID NR: 1 zeigt die DNA-Sequenz der kodierenden Region eines Wildtyp-Brassica-Fad2-D-Gens. SEQ ID NR: 2 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 1.
SEQ ID NR: 3 zeigt die DNA-Sequenz für die kodierende Region des mutierten IMC 129-Brassica-Fad2-D-Gens. SEQ ID NR: 4 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 3.
SEQ ID NR: 5 zeigt die DNA-Sequenz für die kodierende Region eines Wildtyp-Brassica-Fad2-F-Gens. SEQ ID NR: 6 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 5.
SEQ ID NR: 7 zeigt die DNA-Sequenz für die kodierende Region des mutierten Q508-Brassica-Fad2-F-Gens. SEQ ID NR: 8 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 7.
SEQ ID NR: 9 zeigt die DNA-Sequenz für die kodierende Region des mutierten Q4275-Brassica-Fad2-F-Gens. SEQ ID NR: 10 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 9.

Kurzbeschreibung der Figuren
1 stellt ein Säulendiagramm dar, welches die Häufigkeitsverteilung des Gehalts an Ölsäure (C_18:1) im Samenöl in einer segregierenden Population einer Q508 × Westar Kreuzung zeigt. Die WSGA 1A markierte Säule stellt den C_18:1-Gehalt des Westar-Elters bzw. Ausgangs-Westar dar. Die Q508 markierte Säule stellt den C_18:1-Gehalt des Q508-Elters bzw. Ausgangs-Q508 dar.
2 zeigt die Nukleotidsequenzen für ein Brassica-Fad2-D-Wiltyp-Gen (Fad2-D-wt), für ein mutiertes IMC129-Gen (Fad2-D GA316 IMC129), für ein Fad2-F-Wildtyp-Gen (Fad-2-F wt), für ein mutiertes Q508-Gen (Fad2-F TA515 Q508) und für ein mutiertes Q4275 Gen (Fad2-F GA908 Q4275).
3 zeigt die abgeleiteten Aminosäuresequenzen von den Polynukleotiden aus 2.
4 stellt ein Schema eines Züchtungsverfahrens dar, welches verwendet wurde, um Brassica-Pflanzen mit einem hohen Erucasäure- und einem hohen Ölsäuregehalt herzustellen.
Detaillierte Beschreibung
Alle hier angegebenen Fettsäureprozente sind Gewichtsprozente des Öls, von welchem die Fettsäure einen Bestandteil darstellt.
So wie hier verwendet, ist eine "Linie" eine Gruppe von Pflanzen, welche eine geringe oder keine genetische Variation zwischen den Individuen für mindestens eine Eigenschaft aufweisen. Solche Linien können durch mehrere Generationen der Selbstbestäubung und Selektion oder durch vegetative Vermehrung von einem einzelnen Eltern- bzw. Ausgangsteil unter Verwendung von Gewebe- oder Zellkulturtechniken erzeugt werden. So wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Varietät" eine Linie, welche für eine kommerzielle Herstellung verwendet wird.
Der Begriff "Mutagenese" betrifft die Verwendung eines mutagenen Mittels, um zufällige genetische Mutationen innerhalb einer Population von Individuen zu induzieren. Die behandelte Population oder eine nachfolgende Generation der Population wird anschließend auf (eine) geeignete Eigenschaft(en) gescreent, welche sich aus den Mutationen ergibt (ergeben). Eine "Population" stellt irgendeine Gruppe von Individuen dar, welche einen gemeinsamen Genpool teilen. So wie hier verwendet, stellt "M₀" unbehandelte Saat dar. So wie hier verwendet, stellt "M₁" die Saat (und die sich ergebenden Pflanzen) dar, welche einem mutagenen Mittel ausgesetzt war, während "M₂" die Nachkommenschaft (Samen und Pflanzen) von selbstbestäubten M₁-Pflanzen darstellt, "M₃" die Nachkommenschaft von selbstbestäubten M₂-Pflanzen darstellt und "M₄" die Nachkommenschaft von selbstbestäubten M₃-Pflanzen darstellt. "M₅" stellt die Nachkommenschaft von selbstbestäubten M₄-Pflanzen dar. "M₆", "M₇", usw. stellen jeweils die Nachkommenschaft von selbstbestäubten Pflanzen der vorigen Generation dar. Der Begriff "geselbst" bzw. "selbst" (engl. "selfed"), so wie hier verwendet, bedeutet selbstbestäubt.
So wie hier verwendet, bedeutet "Stabilität" oder "stabil", dass in Bezug auf einen gegebenen Fettsäurebestandteil der Bestandteil von Generation zu Generation für mindestens zwei Generationen und vorzugsweise mindestens drei Generationen im Wesentlichen in derselben Menge, z. B. vorzugsweise ±5%, erhalten bleibt. Das erfindungsgemäße Verfahren ist in der Lage zum Erzeugen von Linien mit verbesserten Fettsäurezusammensetzungen, welche bis zu ±5% von Generation zu Generation stabil sind. Die oben erwähnte Stabilität kann durch Temperatur, Standort, Stress und Zeit des Pflanzens beeinflusst werden. Daher sollte ein Vergleich der Fettsäureprofile von Samen vorgenommen werden, welche unter ähnlichen Wachstumsbedingungen hergestellt wurden. Die Stabilität kann basierend auf Erkenntnissen aus der vorigen Generation gemessen werden.
Eine intensive Zucht hat bestimmte Brassica-Pflanzen hervorgebracht, deren Samenöl weniger als 2% Erucasäure enthält. Dieselben Varietäten wurden ebenfalls so gezüchtet, dass das entfettete Mehl weniger als 30 μmol Glucosinolate/Gramm enthält. "Canola", so wie hier verwendet, betrifft Pflanzensamen oder Öle, welche weniger als 2% Erucasäure (C_22:1) enthalten, und zu einem entfetteten Mehl mit weniger als 30 μmol Glucosinolaten/Gramm führen.
Die Anmelder haben Pflanzen mit Mutationen in einem Delta-12-Fettsäure-Desaturasegen entdeckt. Solche Pflanzen weisen geeignete Veränderungen in den Fettsäurezusammensetzungen des Samenöls auf. Solche Mutationen verleihen zum Beispiel einen erhöhten Ölsäuregehalt, einen verminderten, stabilisierten Linolsäuregehalt oder sowohl einen erhöhten Ölsäure-, als auch einen verminderten, stabilisierten Linolsäuregehalt.
Die Anmelder haben weiterhin Pflanzen mit Mutationen in einem Delta-15-Fettsäure-Desaturasegen entdeckt. Solche Pflanzen weisen geeignete Veränderungen in der Fettsäurezusammensetzung des Samenöls auf, z. B. eine verminderte, stabilisierte Menge an α-Linolensäure.
Die Anmelder haben weiterhin isolierte Nukleinsäurefragmente (Polynukleotide) entdeckt, welche Sequenzen umfassen, die Mutationen innerhalb der kodierenden Sequenz der Delta-12- oder Delta-15-Fettsäure-Desaturasen tragen. Die Mutatio nen verleihen gewünschte Veränderungen in den Fettsäuremengen im Samenöl der Pflanzen, welche solche Mutationen tragen. Delta-12-Fettsäure-Desaturase ist ebenfalls als Omega-6-Fettsäure-Desaturase bekannt, und wird hier manchmal als Fad2- oder 12-DES bezeichnet. Delta-15-Fettsäure-Desaturase ist ebenfalls als Omega-3-Fettsäure-Desaturase bekannt, und wird hier manchmal als Fad3 oder 15-DES bezeichnet.
Solche Nukleinsäurefragmente können in Form von RNA oder in Form von DNA, einschließlich von cDNA, synthetischer DNA oder genomischer DNA vorliegen. Die DNA kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein, und kann, wenn sie einzelsträngig ist, entweder den kodierenden Strang oder den nicht kodierenden Strang darstellen. Ein RNA-Analog kann zum Beispiel eine mRNA oder eine Kombination aus Ribo- und Desoxyribonukleotiden darstellen. Darstellende Beispiele solcher Nukleinsäurefragmente sind die in 3 gezeigten Mutantensequenzen.
Diese Nukleinsäurefragmente enthalten eine Mutation in einer mikrosomalen Delta-12-Fettsäure-Desaturase kodierenden Sequenz oder eine Mutation in einer mikrosomalen Delta-15-Fettsäure-Desaturase kodierenden Sequenz. Eine solche Mutation macht das sich ergebende Desaturase-Genprodukt funktionsunfähig in Pflanzen, im Vergleich zu der Funktion des Genprodukts, welches von der Wildtyp-Sequenz kodiert wird. Die Funktionsunfähigkeit des Delta-12-Desaturase-Genprodukts kann aus der verminderten Menge des Reaktionsprodukts (Linolsäure) und der erhöhten Menge des Substrats (Ölsäure) in Pflanzengeweben abgeleitet werden, welche die mutierte Sequenz exprimieren, verglichen mit entsprechenden Mengen in Pflanzengeweben, welche die Wildtyp-Sequenz exprimieren. Die Funktionsunfähigkeit des Delta-15-Desaturase-Genprodukts kann aus der verminderten Menge des Reaktionsprodukts (α-Linolensäure) und der erhöhten Menge des Substrats (Linolsäure) in Pflanzengeweben abgeleitet werden, welche die mutierte Sequenz exprimieren, verglichen mit den entsprechenden Mengen in Pflanzengeweben, welche die Wildtyp-Sequenz exprimieren.
Solche Nukleinsäurefragmente können einen Abschnitt der kodierenden Sequenz umfassen, z. B. mindestens ungefähr 10 Nukleotide, vorausgesetzt, dass das Fragment mindestens eine Mutation in der kodierenden Sequenz enthält. Die Länge eines gewünschten Fragments hängt vom Zweck ab, für welchen das Fragment verwendet werden wird, z. B. PCR-Primer, stellengerichtete Mutagenese und desgleichen. In einer Ausführungsform umfasst ein solches Nukleinsäurefragment die vollständige kodierende Sequenz einer mutierten Delta-12- oder mutierten Delta-15-Fettsäure-Desaturase, z. B. die mutierten Sequenzen aus 3. In anderen Ausführungsformen ist ein Nukleinsäurefragment ungefähr 20 bis ungefähr 50 Nukleotide (oder Basenpaare, bp) oder ungefähr 50 bis ungefähr 500 Nukleotide oder ungefähr 500 bis ungefähr 1200 Nukleotide lang.
Gewünschte Veränderungen in den Fettsäuremengen im Samenöl von Pflanzen können unter Verwendung eines Ribozyms hergestellt werden. Ribozymmoleküle, welche entworfen wurden, um Delta-12- oder Delta-15-Desaturase-mRNA-Transkripte zu spalten, können verwendet werden, um eine Expression von Delta-12- oder Delta-15-Desaturasen zu verhindern. Während verschiedene Ribozyme, die mRNA an stellenspezifischen Erkennungssequenzen spalten, verwendet werden können, um Desaturase-mRNAs zu zerstören, sind insbesondere Hammerkopf (für engl.: Hammerhead)-Ribozyme geeignet. Hammerkopf-Ribozyme spalten mRNAs an Stellen, welche durch flankierende Regionen vorgegeben werden, welche komplementäre Basenpaare mit der Ziel-mRNA bilden. Die einzige Voraussetzung ist, dass die Ziel-RNA eine 5'-UG-3'-Nukleotidsequenz enthält. Die Konstruktion und Herstellung von Hammerkopf-Ribozymen ist im Stand der Technik gut bekannt. Siehe zum Beispiel das U.S. Patent Nr. 5,254,678 . Hammerkopf-Ribozymsequenzen können in eine stabile RNA eingebettet sein, wie eine Transfer-RNA (tRNA), um die Spaltungswirksamkeit in vivo zu erhöhen. Perriman, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92(13): 6175–6179 (1995), de Feyter, R. und Gaudron, J., Methods in Molecular Biologs, Band 74, Kapitel 43, "Expressing Ribozymes in Plants", herausgegeben von Turner, P.C., Humana Press Inc., Totowa, NJ. RNA-Endoribonukleasen, wie jene, die natürlich in Tetrahymena thermophila vor kommt, und welche ausführlich von Cech und Mitarbeitern beschrieben wurden, sind ebenfalls geeignet. Siehe zum Beispiel das U.S. Patent Nr. 4,987,071 .
Eine Mutation in einem Nukleinsäurefragment kann in irgendeinem Abschnitt der kodierenden Sequenz liegen, welche das sich ergebende Genprodukt funktionsunfähig macht. Geeignete Typen von Mutationen schließen ohne Beschränkung Insertionen von Nukleotiden, Deletionen von Nukleotiden oder Transitionen und Transversion in der kodierenden Wildtyp-Sequenz ein. Solche Mutationen führen zu Insertionen von einer oder mehreren Aminosäure/n, Deletionen von einer oder mehreren Aminosäure/n und zu nicht konservativen Aminosäure-Substitutionen im entsprechenden Genprodukt. In einigen Ausführungsformen kann die Sequenz eines Nukleinsäurefragments mehr als eine Mutation oder mehr als einen Typ einer Mutation umfassen.
Eine Insertion oder Deletion von Aminosäuren in einer kodierenden Sequenz kann zum Beispiel die Konformation von essentiellen alphahelikalen oder Beta-Faltblatt-Regionen des sich ergebenden Genprodukts zerstören. Aminosäureinsertionen oder -deletionen können ebenfalls Eindungs- oder katalytische Stellen zerstören, welche wichtig für die Aktivität des Genprodukts sind. Es ist im Stand der Technik bekannt, dass die Insertion der Deletion einer größeren Anzahl von zusammenhängenden Aminosäuren es wahrscheinlicher macht, dass das Genprodukt funktionsunfähig wird, verglichen mit einer kleineren Anzahl von inserierten oder deletierten Aminosäuren. Nicht konservative Aminosäuresubstitutionen können eine Aminosäure einer Klasse mit einer Aminosäure einer unterschiedlichen Klasse ersetzen. Nicht konservative Substitutionen können eine wesentliche Änderung in der Ladung oder Hydrophobizität des Genprodukts hervorrufen. Nicht konservative Aminosäuresubstitutionen können ebenfalls eine wesentliche Änderung in der Masse der Seitenkette hervorrufen, z. B. ein Substituieren eines Isoleucylrests durch einen Alanylrest.
Beispiele für nicht konservative Substitutionen schließen die Substitution einer nichtpolaren Aminosäure durch eine basische Aminosäure oder einer sauren Ami nosäure durch eine polare Aminosäure ein. Da nur 20 Aminosäuren in einem Gen kodiert werden, können Substitutionen, welche zu einem funktionsunfähigen Genprodukt führen, durch routinemäßiges Experimentieren bestimmt werden, wobei Aminosäuren einer unterschiedlichen Klasse in die Region des zur Mutation vorgesehenen Genprodukts eingeschlossen werden.
Bevorzugte Mutationen liegen in einer Region der Nukleinsäure, die ein Aminosäuresequenzmotiv kodiert, welches unter Delta-12-Fettsäure-Desaturasen oder Delta-15-Fettsäure-Desaturasen konserviert ist, wie ein His-Xaa-Xaa-Xaa-His-Motiv (Tabellen 1–3). Ein Beispiel einer geeigneten Region weist ein konserviertes HECGH-Motiv auf, welches zum Beispiel in den Nukleotiden, welche den Aminosäuren 105 bis 109 der Arabidopsis und Brassica Delta-12-Desaturase-Sequenzen entsprechen, in den Nukleotiden, welche den Aminosäuren 101 bis 105 der Sojabohnen Delta-12-Desaturase-Sequenz entsprechen, und in den Nukleotiden, welche den Aminosäuren 111 bis 115 der Mais Delta-12-Desaturase-Sequenz entsprechen, gefunden wird. Siehe z. B. die WO 94/115116 , Okuley et al., Plant Cell 6: 147–158 (1994). Die Einbuchstaben-Aminosäurebezeichnungen, die hier verwendet werden, sind in Alberts, B. et al., Molecular Biology of the Cell, 3. Auflage, Garland Publishing, New York, 1994, beschrieben. Die Aminosäuren, welche dieses Motiv flankieren, sind ebenfalls unter den Delta-12- und Delta-15-Desaturasen hoch konserviert und stellen ebenfalls geeignete Kandidaten für Mutationen in Fragmenten dar.
Eine beispielhafte Ausführungsform einer Mutation in einem solchen Nukleinsäurefragment stellt eine Glu zu Lys Substitution in dem HECGH-Motiv einer mikrosomalen Brassica Delta-12-Desaturase-Sequenz, entweder der D-Form oder der F-Form, dar. Diese Mutation führt dazu, dass die Sequenz HECGH in HKCGH geändert wird, wie durch Vergleichen der SEQ ID NR: 2 (Wildtyp D-Form) mit der SEQ ID NR: 4 (mutierte D-Form) gesehen wird. Von einer ähnlichen Mutation in anderen Fad-2-Sequenzen wird angenommen, dass sie zu einem funktionsunfähigen Genprodukt führt.
Ein ähnliches Motiv kann an den Aminosäuren 101 bis 105 der mikrosomalen Arabidopsis Delta-15-Fettsäure-Desaturase gefunden werden, sowie in den entsprechenden Raps- und Sojabohnen-Desaturasen (Tabelle 5). Siehe z. B. die WO 93/11245 , Arondel, V. et al., Science, 258: 1153–1155 (1992), Yadav, N. et al., Plant Physiol., 103: 467–476 (1993). Plastiden-Delta-15-Fettsäuren weisen ein ähnliches Motiv auf (Tabelle 5).
Unter den Typen der Mutationen in einem HECGH-Motiv, welche das sich ergebende Genprodukt funktionsunfähig machen, sind nicht konservative Substitutionen. Ein darstellendes Beispiel einer nicht konservativen Substitution stellt die Substitution entweder des ersten oder des zweiten Histidins durch ein Glycinrest dar. Eine solche Substitution ersetzt einen geladenen Rest (Histidin) durch einen nicht polaren Rest (Glycin). Einen anderen Typ der Mutation, welcher das sich ergebende Genprodukt funktionsunfähig macht, stellt eine Insertionsmutation dar, z. B. eine Insertion eines Glycins zwischen die Cystein- und Glutaminsäurereste im HECGH-Motiv.
Andere Regionen, welche geeignete konservierte Aminosäuremotive aufweisen, schließen das in Tabelle 2 gezeigte HRRHH-Motiv, das in Tabelle 6 gezeigte HRTHH-Motiv und das in Tabelle 3 gezeigte HVAHH-Motiv ein. Siehe z. B. die WO 94/115116 ; Hitz, W. et al., Plant Physiol., 105: 635–641 (1994), Okuley, J., et al., supra und Yadav, N. et al., supra. Ein darstellendes Beispiel einer Mutation in der in Tabelle 3 gezeigten Region stellt eine Mutation an den Nukleotiden dar, welche dem Kodon für Glycin entsprechen (Aminosäure 303 von B. napus). Eine nicht konservative Gly zu Glu Substitution führt dazu, dass die Aminosäuresequenz DRDYGILNKV in die Sequenz DRDYEILNKV geändert wird (vergleiche die Wildtyp F-Form SEQ ID NR: 6 mit der mutierten Q4275 SEQ ID NR: 10, 3).
Eine andere für eine Mutation geeignete Region in einer Delta-12-Desaturase-Sequenz enthält das Motiv KYLNNP an den Nukleotiden, welche den Aminosäuren 171 bis 175 der Brassica-Desaturase-Sequenz entsprechen. Ein darstellendes Beispiel einer Mutation in dieser Region stellt eine Leu zu His Substitution dar, welche zu der Aminosäuresequenz (Tabelle 4) KYHNN führt (vergleiche Wildtyp Fad2-F SEQ ID NR: 6 mit der mutierten SEQ ID NR: 8). Von einer ähnlichen Mutation in anderen Fad-2-Aminosäuresequenzen wird angenommen, dass sie zu einem funktionsunfähigen Genprodukt führt. TABELLE 1 Ausrichtung bzw. Alignment der Aminosäuresequenzen aus mikrosomalen Delta-12-Fettsäure-Desaturasen

^a aus Plasmid pRF2-1C

^a aus Plasmid pRF2-1C

^a aus Plasmid pRF2-1C

^a aus Plasmid pRF2-1C

^a Plastidensequenzen

^a Plastidensequenzen

Die Konserviertheit von Aminosäuremotiven und ihre relativen Positionen weisen darauf hin, dass Regionen einer Delta-12- oder Delta-15-Fettsäure-Desaturase, welche in einer Art mutiert werden können, um eine funktionsunfähige Desaturase zu erzeugen, in der entsprechenden Region einer anderen Art mutiert werden können, um ein funktionsunfähiges Delta-12-Desaturase- oder Delta-15-Desaturase-Genprodukt in dieser Art zu erzeugen.
Ein Nukleinsäurefragment, welches eine mutierte Sequenz enthält, kann mit Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, erzeugt werden. Solche Techniken schließen ohne Beschränkung stellengerichtete Mutagenese von Wildtyp-Sequenzen und direkte Synthese unter Verwendung von automatischen DNA-Synthesegeräten ein.
Ein Nukleinsäurefragment, welches eine mutierte Sequenz enthält, kann ebenfalls durch Mutagenese von Pflanzensamen oder von regenerierbarem Pflanzengewebe durch z. B. Ethylmethansulfonat, Röntgenstrahlen oder andere Mutagene erzeugt werden. Mit einer Mutagenese werden die mutierten Pflanzen, welche den gewünschten Fettsäure-Phänotyp in den Samen aufweisen mit bekannten Techniken identifiziert, und ein Nukleinsäurefragment, welches die gewünschte Mutation enthält, wird aus genomischer DNA oder RNA der mutierten Linie isoliert. Die Stelle der spezifischen Mutation wird anschließend durch Sequenzieren der kodierenden Region des Delta-12-Desaturase- oder Delta-15-Desaturase-Gens bestimmt. Alternativ können markierte Nukleinsäuresonden, welche spezifisch für gewünschte Mutationsereignisse sind, verwendet werden, um eine mutagenisierte Population schnell zu screenen.
Das offenbarte Verfahren kann auf alle Ölsamen Brassica-Arten angewendet werden und sowohl auf frühlings-, als auch auf winterreifende Typen innerhalb jeder Art. Physikalische Mutagene, einschließlich von, aber nicht beschränkt auf Röntgenstrahlen, UV-Strahlen und andere physikalische Behandlungen, welche einen Chromosomenschaden verursachen, und andere chemische Mutagene, einschließlich von, aber nicht beschränkt auf Ethidiumbromid, Nitrosoguanidin, Diepoxybutan usw. können ebenfalls verwendet werden, um Mutationen zu induzieren. Die Mutagenesebehandlung kann ebenfalls auf andere Stadien der Pflanzenentwicklung angewendet werden, einschließlich von, aber nicht beschränkt auf Zellkulturen, Embryonen, Mikrosporen und Sprossspitzen.
"Stabile Mutationen", so wie hier verwendet, werden als M₅ oder weiter fortgeschrittene Linien definiert, welche ein ausgewähltes verändertes Fettsäureprofil für ein Minimum von drei Generationen erhalten, einschließlich von einem Minimum von zwei Generationen unter Freilandbedingungen, und welche etablierte statisti sche Grenzwerte für ein Minimum von zwei Generationen überschreiten, wie durch eine gaschromatographische Analyse von einem Minimum von 10 zufällig ausgewählten Samen, welche zusammengefasst werden, bestimmt wird. Alternativ kann die Stabilität in derselben Weise durch Vergleichen mit nachfolgenden Generationen gemessen werden. In nachfolgenden Generationen wird die Stabilität so definiert, dass sie ähnliche Fettsäureprofile in der Saat aufweist, wie die der vorigen oder nachfolgenden Generation, wenn sie unter im Wesentlichen ähnlichen Bedingungen gezogen wird.
Die Mutationszüchtung hat traditionell Pflanzen hergestellt, welche zusätzlich zu der Eigenschaft von Interesse mehrfache schädliche Eigenschaften tragen, z. B. reduzierte Pflanzenvitalität und reduzierte Fertilität. Solche Eigenschaften können indirekt die Fettsäurezusammensetzung beeinflussen, was ein instabile Mutation herstellt, und/oder den Ertrag reduzieren, wodurch der kommerzielle Nutzen der Erfindung reduziert wird. Um das Auftreten von schädlichen Mutationen zu beseitigen und die von der Pflanze getragene Mutationslast zu reduzieren, wird eine niedrige Mutagen-Dosis in den Samenbehandlungen verwendet, um eine LD30-Population zu erzeugen. Dies erlaubt eine schnelle Selektion von Einzelgenmutationen auf Fettsäureeigenschaften unter agronomischen Hintergründen, welche akzeptable Erträge hervorbringen.
Die Samen von mehreren verschiedenen Fettsäurelinien wurden in der American Type Culture Collection hinterlegt und weisen die folgenden Zugangsnummern auf:

Linie Zugangsnr. Datum der Hinterlegung

A129.5 40811 25. Mai 1990

A133.1 40812 25. Mai 1990

M3062.8 75025 7. Juni 1991

IMC130 75446 16. April 1993

Q4275 97569 10. Mai 1996
In einigen Pflanzenarten oder -varietäten kann mehr als eine Form einer endogenen mikrosomalen Delta-12-Desaturase gefunden werden. In Amphidiploiden kann jede Form von einem der Elterngenome abgeleitet sein, welche die in Betracht stehende Art ausmachen. Pflanzen mit Mutationen in beiden Formen weisen ein Fettsäureprofil auf, welches sich von Pflanzen mit einer Mutation in nur einer Form unterscheidet. Ein Beispiel für eine solche Pflanze stellt die Brassica napus-Linie Q508 dar, eine doppelt mutagenisierte Linie, welche eine mutierte D-Form der Delta-5-Desaturase (SEQ ID NR: 3) und eine mutierte F-Form der Delta-12-Desaturase (SEQ ID NR: 7) enthält. Ein anderes Beispiel stellt die Linie Q4275 dar, welche eine mutierte D-Form der Delta-12-Desaturase (SEQ ID NR: 3) und eine mutierte F-Form der Delta-12-Desaturase (SEQ ID NR: 9) enthält. Siehe 2–3.
Bevorzugte Wirts- oder Empfängerorganismen für die Einführung eines erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragments sind die Öl herstellenden Arten, wie Sojabohne (Glycine max), Raps (z. B. Brassica napus, B. rapa und B. juncea), Sonnenblume (Helianthus annus), Rizinus (Ricinus communis), Mais (Zea mays) und Färberdistel (Carthamus tinctorius).
Ein solches Nukleinsäurefragment kann weiterhin zusätzliche Nukleinsäuren umfassen. Zum Beispiel kann eine Nukleinsäure, welche eine sekretorische oder Leader-Aminosäuresequenz kodiert, mit einem mutierten Desaturase-Nukleinsäurefragment verbunden sein, so dass die sekretorische oder Leader-Sequenz im Leserahmen mit dem aminoterminalen Ende eines mutierten Delta-12- oder Delta-15-Desaturase-Polypeptids fusioniert ist. Andere Nukleinsäurefragmente, welche Aminosäuresequenzen kodieren, die zum Fusionieren im Leserahmen an die hier offenbarten mutierten Desaturase-Polypeptide geeignet sind, sind im Stand der Technik bekannt. Siehe z. B. die U.S. 5,629,193 . Ein Nukleinsäurefragment kann ebenfalls ein oder mehrere regulatorische Elemente aufweisen, welche operabel damit verbunden sind.
Solche Nukleinsäurefragmente können selektiv mit mutierten Desaturase-Sequenzen hybridisieren. Ein solches Nukleinsäurefragment ist typischerweise mindestens 15 Nukleotide lang. Ein Hybridisierung umfasst typischerweise eine Southern-Analyse (Southern-Blot), ein Verfahren, durch welches die Anwesenheit von DNA-Sequenzen in einem Gemisch aus Ziel-Nukleinsäuren durch Hybridisierung an ein markiertes Oligonukleotid oder eine DNA-Fragmentsonde identifiziert wird. Eine Southern-Analyse umfasst typischerweise eine elektrophoretische Trennung von DNA-Spaltungen auf Agraosegelen, eine Denaturierung der DNA nach der elektrophoretischen Trennung und einen Transfer der DNA auf Nitrozellulose, Nylon oder einen anderen geeigneten Membranträger zur Analyse mit einer radioaktiv markierten, biotinylierten oder Enzym markierten Sonde, wie in den Abschnitten 9.37–9.52 von Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY beschrieben wird.
Ein Nukleinsäurefragment kann unter Bedingungen moderater Stringenz oder vorzugsweise unter Bedingungen hoher Stringenz mit einer mutierten Desaturase-Sequenz hybridisieren. Bedingungen hoher Stringenz werden verwendet, um Nukleinsäuren zu identifizieren, welche einen hohen Grad der Homologie mit der Sonde aufweisen. Bedingungen hoher Stringenz können die Verwendung von niedriger Ionenstärke und hoher Temperatur zum Waschen, zum Beispiel 0,015 M NaCl/0,0015 M Natriumcitrat (0,1 × SSC), 0,1% Natriumlaurylsulfat (SDS) bei 50–65°C einschließen. Alternativ kann ein Denaturierungsmittel, wie Formamid, während der Hybridisierung eingesetzt werden, z. B. 50% Formamid mit 0,1% bovinern Serumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH-Wert 6,5 mit 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C. Ein anderes Beispiel stellt die Verwendung von 50% Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH-Wert 6,8), 0,1% Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardt-Lösung, ultraschallbehandelte Lachsspermien-DNA (50 μg/ml), 0,1% SDS und 10% Dextransulfat bei 42°C, mit Waschschritten bei 42°C in 0,2 × SSC und 0,1% SDS dar.
Bedingungen moderater Stringenz betreffen Hybridisierungsbedingungen, welche verwendet werden, um Nukleinsäuren zu identifizieren, die einen niedrigeren Grad der Identität mit der Sonde aufweisen, als es Nukleinsäuren tun, die unter Bedingungen hoher Stringenz identifiziert wurden. Bedingungen moderater Stringenz können die Verwendung höherer Ionenstärke und/oder niedrigerer Temperaturen zum Waschen der Hybridisierungsmembran einschließen, verglichen mit der Ionenstärke und den Temperaturen, die zur Hochstringenz-Hybridisierung verwendet wurden. Zum Beispiel kann eine Waschlösung, welche 0,060 M NaCl/0,0060 M Natriumcitrat (4 × SSC) und 0,1% Natriumlaurylsulfat (SDS) umfasst, bei 50°C mit einem letzten Waschschritt in 1 × SSC bei 65°C verwendet werden. Alternativ kann ein Hybridisierungs-Waschschritt in 1 × SSC bei 37°C verwendet werden.
Eine Hybridisierung kann ebenfalls durch eine Northern-Analyse (Northern-Blot) durchgeführt werden, ein Verfahren, welches verwendet wird, um RNAs zu identifizieren, welche mit einer bekannten Sonde hybridisieren, wie einem Oligonukleotid, einem DNA-Fragment, einer cDNA oder einem Fragment davon oder einem RNA-Fragment. Die Sonde ist mit einem Radioisotop, wie ³²P, durch Biotinylierung oder mit einem Enzym markiert. Die zu analysierende RNA kann gewöhnlich elektrophoretisch auf einem Agarose- oder Polyacrylamidgel getrennt werden, auf Nitrozellulose, Nylon oder eine andere geeignete Membran übertragen werden und mit der Sonde hybridisiert werden, unter Verwendung von Standardtechniken, welche im Stand der Technik gut bekannt sind, wie jene, welche in den Abschnitten 7.39–7.52 von Sambrook et al., supra, beschrieben werden.
In einer Ausführungsform enthält eine Pflanze sowohl eine Delta-12-Desaturase-Mutation, als auch eine Delta-15-Desaturase-Mutation. Solche Pflanzen können eine Fettsäurezusammensetzung aufweisen, welche sehr hohe Ölsäure- und sehr niedrige Alpha-Linolensäure-Mengen umfasst. Mutationen in der Delta-12-Desaturase und der Delta-15-Desaturase können durch Herstellen einer genetischen Kreuzung zwischen einzeln mutierten Linien der Delta-12-Desaturase und der Delta-15-Desaturase in einer Pflanze vereinigt werden. Eine Pflanze mit einer Mutation in der Delta-12-Fettsäure-Desaturase wird mit einer zweiten Pflanze, mit einer Mutation in der Delta-15-Fettsäure-Desaturase gekreuzt oder verpaart. Die aus der Kreuzung hergestellten Samen werden angepflanzt, und die sich ergebenden Pflanzen werden selbstbestäubt, um Nachwuchssamen zu erhalten. Diese Nachwuchssamen werden anschließend gescreent, um jene Samen zu identifizieren, welche beide mutierten Gene tragen.
Alternativ kann eine Linie, welche entweder eine Delta-12-Desaturase- oder eine Delta-15-Desaturase-Mutation besitzt, einer Mutagenese unterzogen werden, um eine Pflanze oder Pflanzenlinie zu erzeugen, welche Mutationen sowohl in der Delta-12-Desaturase, als auch in der Delta-15-Desaturase aufweist. Zum Beispiel weist die IMC 129-Linie eine Mutation in der kodierenden Region (Glu₁₀₆ bis Lys₁₀₆) der D-Form des mikrosomalen Delta-12-Desaturase-Strukturgens auf. Zellen (z. B. Samen) dieser Linie können mutagenisiert werden, um eine Mutation in einem Delta-15-Desaturase-Gen zu induzieren, was zu einer Pflanze oder Pflanzenlinie führt, welche eine Mutation in einem Delta-12-Fettsäure-Desaturase-Gen und eine Mutation in einem Delta-15-Fettsäure-Desaturase-Gen trägt.
Der Nachwuchs schließt die Nachkommen einer bestimmten Pflanze oder Pflanzenlinie ein, z. B. sind Samen, welche sich an einer Instant-Pflanze entwickelt haben, Nachkommen. Der Nachwuchs einer Instant-Pflanze schließt Samen ein, welche von der F₁, F₂, F₃ und Pflanzen der nachfolgenden Generation gebildet wurden, oder Samen, welche von der BC₁, BC₂, BC₃ und Pflanzen der nachfolgenden Generation gebildet wurden.
Erfindungsgemäße Pflanzen enthalten vorzugsweise eine veränderte Fettsäurezusammensetzung. Zum Beispiel kann Öl, welches von Samen solcher Pflanzen erhalten wurde, von 69 bis 90% Ölsäure, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung des Samens, aufweisen. Ein solches Öl weist vorzugsweise von 74 bis 90% Ölsäure, weiter bevorzugt von 80 bis 90% Ölsäure auf. In einigen Ausführungsformen kann Öl, welches von Samen, welche von erfindungsgemäßen Pflanzen hergestellt wurden, erhalten wurde, von 2,0% bis 5,0% gesättigte Fettsäuren aufweisen, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung der Samen. In einigen Ausführungsformen kann Öl, welches von erfindungsgemäßen Samen erhalten wurde, von 1,0% bis 14,0% Linolsäure oder von 0,5% bis 10,0% α-Linolensäure aufweisen.
Die Ölzusammensetzung wird typischerweise durch Zerdrücken und Extrahieren der Fettsäuren aus Sammelsamenproben (z. B. 10 Samen) analysiert. Die Fettsäuretriglyceride im Samen werden hydrolysiert und in Fettsäure-Methylester umgewandelt. Jene Samen, welche eine veränderte Fettsäurezusammensetzung aufweisen, können durch Techniken identifiziert werden, die dem Fachmann bekannt sind, z. B. eine Gas-Flüssig-Chromatographie-(GLC)-Analyse einer zusammengefassten Samenprobe, eines Einzelsamens oder einer einzelnen Samenhälfte. Eine Samenhälftenanalyse ist im Stand der Technik gut bekannt dafür, dass sie geeignet ist, da die Lebensfähigkeit des Embryos erhalten wird und so jene Samen mit einem gewünschten Fettsäureprofil angepflanzt werden können, um die nächste Generation zu bilden. Von der Samenhälftenanalyse ist jedoch ebenfalls bekannt, dass sie eine ungenaue Darstellung des Genotyps des zu analysierenden Samens darstellt. Eine Sammelsamenanalyse ergibt typischerweise eine genauere Darstellung des Fettsäureprofils eines gegebenen Genotyps. Eine Samenhälftenanalyse einer Population von Samen stellt jedoch einen verlässlichen Indikator der Wahrscheinlichkeit dar, ein gewünschtes Fettsäureprofil zu erhalten. Die Fettsäurezusammensetzung kann ebenfalls von größeren Proben bestimmt werden, z. B. von Öl, welches durch Veredeln, Bleichen und Desodorisieren in Versuchanlagen oder in kommerziellem Maßstab von endogenem Öl in den Samen erhalten wurde.
Nukleinsäurefragmente können als Marker in der genetischen Kartierung von Pflanzen und in Pflanzenzuchtprogrammen verwendet werden. Solche Marker können zum Beispiel Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP), Nachweis zufällig amplifzierter Polymorphismen (RAPD für engl.: random amplification polymorphism detection), Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder selbstunterhaltene Sequenzreplikation (3SR)-Marker einschließen. Markerunterstützte Zuchttechniken können verwendet werden, um eine gewünschte Fettsäurezusammensetzung während des Zuchtverfahrens zu identifizieren und nachzuverfol gen. Markerunterstützte Zuchttechniken können zusätzlich zu oder als Alternative zu anderen Formen der Identifikationstechniken verwendet werden. Ein Beispiel einer markerunterstützten Zucht stellt die Verwendung von PCR-Primern dar, welche spezifisch eine Sequenz amplifizieren, die eine gewünschte Mutation in der Delta-12-Desaturase oder der Delta-15-Desaturase enthält.
Die erfindungsgemäße/n Pflanze und Pflanzenlinien weisen gewünschte Samen-Fettsäurezusammensetzungen, sowie bessere agronomische Eigenschaften auf, verglichen mit bekannten Linien, welche eine veränderte Samen-Fettsäurezusammensetzung aufweisen. Bessere agronomische Eigenschaften schließen zum Beispiel einen erhöhten prozentualen Anteil der Samenkeimung, erhöhte Keimlingsvitalität, erhöhte Resistenz gegenüber Keimlings-Pilzerkrankungen (Abfaulen, Wurzelfäule und desgleichen), gesteigerten Ertrag und verbesserte Standfähigkeit ein.
Daher stellt die Erfindung Brassica-Pflanzen bereit, welche Samen herstellen, die einen Gehalt an langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren von mindestens 82% und einen Erucasäuregehalt von mindestens 15%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung, aufweisen. So wie hier verwendet, betrifft "langkettig" Kohlenstoffketten von 16 und mehr, z. B. Ketten mit 16 bis 24 Kohlenstoffen. Der Gehalt an langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren ist hauptsächlich zwischen Ölsäure, Eicosensäure und Erucasäure verteilt. Die heterogene Natur der langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren in den Samenöl-Triacylglycerinen verleiht dem Öl gewünschte Eigenschaften. Die Mengen der gesamten gesättigten Fettsäuren und/oder der gesamten mehrfach ungesättigten Fettsäuren können vermindert sein, um den Gehalt der langkettigen einfach Ungesättigten zu erhöhen, d. h. der Ölsäure, Eicosensäure, Erucasäure und Nervonsäure.
Hier beschriebene Linien mit hohem Ölsäuregehalt können mit Linien mit hohem Erucasäuregehalt gekreuzt werden, um Brassica-Pflanzen herzustellen, welche einen hohen Gehalt an langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren innerhalb ihrer Samen aufweisen. Geeignete Linien mit hohem Ölsäuregehalt werden zum Beispiel in Beispiel 5 und Tabelle 17 beschrieben, und weisen einen Ölsäuregehalt von 82% bis 85%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung auf. Geeignete Linien mit hohem Erucasäuregehalt weisen einen Erucasäuregehalt von 45% oder mehr auf, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung. Die Brassica-Pflanzenlinie HEC01 ist ein Linie mit hohem Erucasäuregehalt, welche insbesondere geeignet ist und unter dem Handelsnamen Hero verkauft wird. Andere Varietäten mit hohem Erucasäuregehalt sind ebenfalls bekannt, wie die Venus, Mercury, Neptune, S89–3673, Dwarf Essex, Reston, Bridger oder R-500 bezeichneten Varietäten. McVetty, P.B.E. et al., Can. J. Plant. Sci. 76(2): 341–342 (1996), Scarth, R. et al., Can. J. Plant. Sci., 75(1): 205–206 (1995) und McVetty, P.B.E. et al., Can. J. Plant. Sci., 76(2): 343–344 (1996).
Erfindungsgemäße Samen können einen Ölsäure- und Eicosensäuregehalt von jeweils mindestens 37% und 14%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung aufweisen. Der Gesamtgehalt an gesättigten Fettsäuren beträgt weniger als 7%. So wie hier verwendet, betrifft "Gesamtgehalt an gesättigten Fettsäuren" die Gesamtheit von Myristat (14:0), Palmitat (16:0), Stearat (18:0), Arachidat (20:0), Behenat (22:0) und Lignocerat (24:0). Der Gesamtgehalt der mehrfach Ungesättigten beträgt weniger als 11%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung. So wie hier verwendet, betrifft "Gesamtgehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren" die Summe der Linol-(18:2), α-Linolen-(18:3) und Eicosadien-(20:2) Fettsäuren als Prozentanteil des Gesamtfettsäuregehalts.
In einigen Ausführungsformen beträgt der Gehalt an langkettigen einfach Ungesättigten in Samen von 85% bis 90%. Der Ölsäuregehalt innerhalb dieser Samen beträgt 42% oder mehr, vorzugsweise von 47% bis 56%. Der Erucasäure- und Eicosensäuregehalt beträgt jeweils von 17% bis 31% und von 15% bis 21%.
In einigen Ausführungsformen beträgt der Gehalt an langkettigen einfach Ungesättigten in Samen von 82% bis 90%. Der Ölsäuregehalt innerhalb dieser Samen beträgt 25% bis 33%. Der Erucasäure- und Eicosensäuregehalt beträgt jeweils von 44% bis 50% und von 10% bis 13%.
Samenöle mit einem Gehalt an langkettigen einfach Ungesättigten von mindestens 82% und einem Erucasäuregehalt von mindestens 15%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung, werden ebenfalls bereitgestellt. Diese Öle können zum Beispiel aus einer einzelnen Linie Brassica-Samen, welche eine geeignete Fettsäurezusammensetzung aufweisen, wie hier beschrieben, extrahiert werden. Der Ölsäure- und Eicosensäuregehalt dieser Öle beträgt jeweils mindestens 37% und 14%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung. Der Gesamtgehalt an Gesättigten und mehrfach Ungesättigten dieser Öle beträgt jeweils weniger als 7% und 11%. Vorzugsweise beträgt der Gehalt an mehrfach Ungesättigten weniger als 9%. In einigen Ausführungsformen weisen die Öle einen Gehalt an einfach Ungesättigten von 85% bis 90% auf. Der Ölsäuregehalt dieser Öle beträgt mindestens 42% und weiter bevorzugt von 47% bis 56%. Die Öle weisen einen Erucasäuregehalt von 17% bis 31% und einen Eicosensäuregehalt von 15% bis 21% auf.
In einigen Ausführungsformen beträgt der Gehalt an langkettigen einfach Ungesättigten in solchen Ölen von 82% bis 90%, umfassend einen Ölsäuregehalt von 25% bis 33%, einen Erucasäure- von 44% bis 50% und einen Eicosensäuregehalt von 10% bis 13%. Die Summe der Neronsäure-, Erucasäure- und Eicosensäuregehalte in solchen Ölen kann von 50% bis 66% betragen.
Alternativ wird angenommen, dass erfindungsgemäße Öle durch Mischen von Rapsöl mit hohem Erucasäuregehalt (HERR) und einem Öl mit mindestens 87% Ölsäure, vorzugsweise von 90% bis 95% Ölsäure, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung, erhalten werden können. HERR-Öl weist einen Erucasäuregehalt von 49% und einen Ölsäuregehalt von 16% auf.
Öle mit einem Gehalt an langkettigen einfach Ungesättigten von mindestens 82% weisen überraschenderweise Niedrigtemperatureigenschaften auf, welche für industrielle Anwendungen, wie Schmierung, gewünscht sind. Die Grundlage für diese Eigenschaften ist nicht bekannt, aber es ist möglich, dass die heterogenen Ket tenlängen der Triacylglycerine in den erfindungsgemäßen Ölen eine korrekte Anordnung verhindern, da die Methylendgruppen ein Ungleichgewicht im Molekularvolumen aufweisen, was die Van der Waals-Interaktionen reduziert. Die Doppelbindung in jedem Fettsäurerest liegt an verschiedenen Kohlenstoffpositionen entlang der Acylkette vor, was die Anordnung unterbrechen und ebenfalls elektronische π-π-Interaktionen zwischen benachbarten Fettsäureketten reduzieren kann. Von dem hohen Gehalt an einfach Ungesättigten wird angenommen, dass er eine verbesserte oxidative Stabilität zusammen mit hohen Fluiditätseigenschaften bereitstellt. Die niedrigen Mengen der mehrfach Ungesättigten in den erfindungsgemäßen Ölen fördern ebenfalls eine hohe oxidiative Stabilität, da die Oxidationsgeschwindigkeiten von Linolsäure und Linolensäure bei 20°C jeweils 12- bis 20-mal und 25-mal größer sind, als die Oxidationsgeschwindigkeit von Ölsäure.
Die oxidative Stabilität kann mit einem oxidativen Stabilitätsindex-Instrument, Omnion, Inc., Rockland, MA, gemäß dem AOCS Offiziellen Verfahren Cd 12b-92 (überarbeitet 1993) gemessen werden. Das Verfahren stellt eine automatisierte Ersetzung des aktiven Sauerstoffverfahrens (AOM für engl.: Active Oxygen Method), AOCS Offizielles Verfahren CD 12–57, dar. Die oxidative Stabilität von Ölen mit einem Gehalt an langkettigen einfach Ungesättigten von mindestens 82% beträgt von ungefähr 40 AOM-Stunden bis ungefähr 100 AOM-Stunden in der Abwesenheit von hinzugefügten Antioxidantien. Im Vergleich dazu weisen Canolaöl mit mittlerem Ölsäuregehalt (76% Ölsäure) und Rapsöl mit hohem Erucasäuregehalt oxidative Stabilitäten von jeweils ungefähr 38 und 16 AOM-Stunden in der Abwesenheit von hinzugefügten Antioxidantien auf.
Die erfindungsgemäßen Öle weisen gewünschte funktionelle Eigenschaften auf, z. B. Niedrigtemperaturverhalten und einen hohen Viskositätsindex, zusammen mit hoher oxidativer Stabilität. Die Anwesenheit von Fettsäuren mit höherem Molekulargewicht erhöht das Molekulargewicht der Triacylglycerine, was das Öl mit einem höheren Flammpunkt und einem höheren Brennpunkt ausstattet. Das erhöhte Molekulargewicht verbessert ebenfalls den Viskositätsindex der Öle. Der Viskositätsindex ist eine willkürliche Zahl, welche die Viskositätsänderung mit der Temperatur eines Schmiermittels angibt. Der Dean-und-Davis-Viskositätsindex kann aus beobachteten Viskositäten eines Schmiermittels bei 40°C und 100°C berechnet werden, und kann Werte hervorbringen, welche von 0 bis zu Werten größer als 200 reichen. Ein höherer Wert des Viskositätsindex weist darauf hin, dass sich die Viskosität des Öls bei einer Temperaturänderung weniger ändert. Mit anderen Worten, je höher der Viskositätsindex, desto kleiner der Unterschied in der Viskosität zwischen hohen und niedrigen Temperaturen.
Ein erfindungsgemäßes Öl kann für industrielle Anwendungen formuliert werden, wie Maschinenschmiermittel oder wie hydraulische Fluide, durch Hinzufügen von einem oder mehreren Zusätzen zu einem Öl mit einem Gehalt an langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren von mindestens 82% und einem Erucasäuregehalt von mindestens 15%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung. Zum Beispiel kann ein Getriebeöl für Dieselmotoren hergestellt werden, welches Antioxidantien, Anti-Schaumzusätze, Anti-Abnutzungszusätze, Korrosionsinhibitoren, Dispergiermittel, Detergenzien und Säureneutralisierer oder Kombinationen davon einschließt. Hydraulische Ölzusammensetzungen können Antioxidantien, Anti-Rostzusätze, Anti-Abnutzungszusätze, Fließpunkterniedrigungsmittel, Viskositätsindex-Verbesserer und Anti-Schaumzusätze oder Kombinationen davon einschließen. Spezifische Formulierungen werden abhängig von der Endnutzung des Öls variieren, die Eignung einer Formulierung für eine spezifische Endnutzung kann unter Verwendung von Standardtechniken untersucht werden.
Typische Antioxidantien schließen Zinkdithiophosphate, Methyldithiocarbamate, behinderte Phenole, Phenolsulfide, Metallphenolsulfide, Metallsalicylate, aromatische Amine, phosphorgeschwefelte Fette und Olefine, geschwefelte Olefine, geschwefelte Fette und Fettderivate, geschwefelte Paraffine, geschwefelte Karbonsäuren, Disalieylal-1,2-propandiamin, 2,4-Bis(alkyldithio-1,3,4-thiadiazole) und Dilaurylselenid ein. Antioxidantien sind typischerweise in Mengen von 0,01% bis 5%, basierend auf dem Gewicht der Zusammensetzung, anwesend. Insbesondere werden 0,01% bis 1,0% eines Antioxidans zu einem erfindungsgemäßen Öl hinzugefügt. Siehe das U.S. Patent Nr. 5,451,334 für weitere Antioxidantien.
Rostinhibitoren schützen Oberflächen gegen Rost und schließen zum Beispiel organische Säuren vom Alkylsuccinattyp und Derivate davon, Alkylthioessigsäuren und Derivate davon, organische Amine, organische Phosphate, mehrwertige Alkohole und Natrium- und Calciumsulfonate ein. Antiabnutzungszusätze lagern sich auf Metallen an, und stellen einen Film bereit, welcher einen Metall-zu-Metall-Kontakt reduziert. Im Allgemeinen schließen Anti-Abnutzungszusätze Zinkdialkyldithiophosphate, Tricresylphosphat, Didodecyiphosphit, geschwefeltes Walratöl, geschwefelte Terpene und Zinkdialkyldithiocarbamat ein, und werden in Mengen von 0,05% bis 4,5% verwendet.
Korrosionsinhibitoren schließen Dithiophosphate und insbesondere Zinkdithiophosphate, Metallsulfonate, Metallphenatsulfide, Fettsäuren, Säurephosphatester und Alkylsuccinsäuren ein.
Fließpunkterniedrigungsmittel erlauben ein Fließen der Ölzusammensetzung unterhalb des Fließpunkts des unmodifizierten Schmiermittels. Gängige Fließpunkterniedrigungsmittel schließen Polymethacrylate, wachsalkylierte Naphthalenpolymere, wachsalkylierte Phenolpolymere und chlorierte Polymere ein, und sind typischerweise in Mengen von 1% oder weniger anwesend. Siehe zum Beispiel die U.S. Patent Nr. 5,451,334 und 5,413,725 . Der Viskositätsindex kann durch Hinzufügen von Polyisobutylenen, Polymethyacrylaten, Polyacrylaten, Ethylen-Propylen-Copolymeren, Styrol-Isopren-Copolymeren, Styrolbutadien-Copolymeren und Styrol-Maleinsäureester-Copolymeren erhöht werden.
Anti-Schaumzusätze reduzieren oder verhindern die Bildung eines stabilen Oberflächenschaums, und sind typischerweise in Mengen von 0,00003% bis 0,05% anwesend. Polymethylsiloxane, Polymethacrylate, Salze von Alkylalkylendithiophosphaten, Amylacrylattelomer und Poly(2-ethylhexylacrylatcoethylacrylat stellen nicht beschränkende Beispiele für Anti-Schaumzusätze dar.
Detergenzien und Dispergiermittel stellen polare Materialien dar, welche eine Reinigungsfunktion bereitstellen. Detergenzien schließen Metallsulfonate, Metallsalicylate und Metallthiophosphonate ein. Dispergiermittel schließen Polyaminsuccinimide, Hydroxybenzylpolyamine, Polyaminsuccinamide, Polyhydroxysuccinester und Polyaminamidimidazoline ein.
Obwohl die Erfindung Modifikationen und alternative Formen zugänglich ist, werden bestimmte spezifische Ausführungsformen davon in den unten dargestellten allgemeinen Verfahren und Beispielen beschrieben. Zum Beispiel kann die Erfindung auf alle Brassica-Arten angewandt werden, einschließlich von B. rapa, B. juncea und B. hirta, um im Wesentlichen ähnliche Ergebnisse hervorzubringen. Es sollte jedoch verstanden werden, dass diese Beispiele nicht beabsichtigen, die Erfindung auf die besonderen offenbarten Formen zu beschränken, sondern dass die Erfindung stattdessen alle Modifikationen, Äquivalente und Alternativen abdeckt, die in den Schutzumfang der Erfindung fallen. Dieses schließt die Verwendung von somaklonaler Variation, physikalischer oder chemischer Mutagenese von Pflanzenteilen, Antheren-, Mikrosporen- oder Ovarkultur, gefolgt von einer Chromosomenverdopplung oder Eigen- oder Kreuzbestäubung ein, um die Fettsäureeigenschaft alleine oder in Kombination mit anderen Eigenschaften zu übertragen, um neue Brassica-Linien zu entwickeln.
BEISPIEL 1
Mutagenese
Samen von Westar, einer kanadischen (Brassica napus) Frühlingscanolavarietät wurden einer chemischen Mutagenese ausgesetzt. Westar stellt eine eingetragene kanadische Frühlingsvarietät mit Canolaqualität dar. Die Fettsäurezusammensetzung von Freiland-Westar, 3,9% C_16:0, 1,9% C_18:0, 67,5% C_18:1, 17,6% C_18:2, 7,4% C_18:3, < 2% C_20:1 + C_22:1, ist unter kommerzieller Herstellung seit 1982 mit < ± 10% Abweichung stabil geblieben.
Vor der Mutagenese wurden 30.000 Samen von B. napus cv. Westar Samen in Chargen aus 300 Samen für zwei Stunden auf nassem Filterpapier vorhydratiert, um die Samenhülle aufzuweichen. Die vorhydratierten Samen wurden in 80 mM Ethylmethansulfonat (EMS) für vier Stunden gebracht. Nach der Mutagenese wurden die Samen dreimal in destilliertem Wasser gespült. Die Samen wurden in 48-Vertiefungsplatten, welche Pro-Mix enthielten, ausgesät. Achtundsechzig Prozent der mutagenisierten Samen keimten. Die Pflanzen wurden bei 25°C/15°C, 14/10 Std. Tag/Nacht-Bedingungen im Gewächshaus gehalten. Zur Blütezeit wurde jede Pflanze einzeln selbstbestäubt.
Die M₂-Saat von einzelnen Pflanzen wurde individuell katalogisiert und gelagert, ungefähr 15.000 M₂-Linien wurden in einer Sommergärtnerei in Carman, Manitoba gepflanzt. Die Saat von jeder selbstbestäubten Pflanze wurde in 3 Meter-Reihen mit einem Reihenabstand von 6 Inch gepflanzt. Westar wurde als Vergleichsvarietät gepflanzt. Ausgewählte Linien im Feld wurden durch Umhüllen des Hauptblütenstands von jeder Pflanze mit einem Sack selbstbestäubt. Bei Reife wurden die selbstbestäubten Pflanzen einzeln geerntet, und die Samen wurden katalogisiert und gelagert, um sicherzustellen, dass die Quelle der Saat bekannt war.
Selbstbestäubte M₃-Saat und Westar-Kontrollen wurden in 10-Samen-Sammelproben auf die Fettsäurezusammensetzung durch eine Gaschromatographie analysiert. Statistische Grenzwerte für jeden Fettsäurebestandteil wurden unter Verwendung einer Z-Verteilung mit einem Stringenzlevel von 1 in 10.000 etabliert. Mittelwerte und Standardabweichungswerte wurden aus der nicht mutagenisierten Westar-Kontrollpopulation im Feld bestimmt. Die oberen und unteren statistischen Grenzwerte für jede Fettsäure wurden aus dem Mittelwert der Population ± der Standardabweichung, multipliziert mit der Z-Verteilung, bestimmt. Basierend auf einer Populationsgröße von 10.000 beträgt das Konfidenzintervall 99,99%.
Die ausgewählten M₃-Samen wurden im Gewächshaus zusammen mit Westar-Kontrollen gepflanzt. Die Samen wurden in 4-Inch-Töpfen ausgesät, welche Pro- Mix-Erde enthielten, und die Pflanzen wurden bei einem 25°C/15°C, 14/10 Std. Tag/Nacht-Zyklus im Gewächshaus gehalten. Zur Blütezeit wurde der terminale Blütenstand durch Umhüllen mit einem Sack selbstbestäubt. Bei Reife wurde die selbst befruchete M₄-Saat einzeln von jeder Pflanze geerntet, markiert und gelagert, um sicherzustellen, dass die Quelle der Saat bekannt war.
Die M₄-Saat wurde in 10-Samen-Sammelproben analysiert. Die statistischen Grenzwerte für jeden Fettsäurebestandteil wurden aus 259 Kontrollproben unter Verwendung einer Z-Verteilung von 1 in 800 etabliert. Ausgewählte M₄-Linien wurden in einem Feldversuch in Carman, Manitoba in 3 Meter-Reihen mit einem Abstand von 6 Inch gepflanzt. Zehn M₄-Pflanzen in jeder Reihe wurden zur Selbstbestäubung mit einem Sack umhüllt. Bei Reife wurden die selbstbestäubten Pflanzen einzeln geerntet, und die offen bestäubten Pflanzen in der Reihe wurden zusammen geerntet. Die M₅-Saat von einzelnen Pflanzenauswahlen wurde in 10-Samen-Sammelproben und die Sammelreihenernte und 50-Samen-Sammelproben analysiert.
Ausgewählte M₅-Linien wurden im Gewächshaus zusammen mit Westar-Kontrollen gepflanzt. Die Saat wurde wie zuvor beschrieben gezogen. Zur Blütezeit wurde der terminale Blütenstand durch Umhüllen mit einem Sack selbstbestäubt. Bei Reife wurde selbstbestäubte M₆-Saat einzeln von jeder Pflanze geerntet und in 10-Samen-Sammelproben auf die Fettsäurezusammensetzung analysiert.

Ausgewählte M₆-Linien wurden in Feldversuche in Ost-Idaho eingebracht. Die vier Versuchsstandorte wurden aufgrund der breiten Variabilität der Wachstumsbedingungen ausgewählt. Die Standorte schlossen Burley, Tetonia, Lamont und Shelley (Tabelle 7) ein. Die Linien wurden in vier 3 Meter-Reihen mit einem Abstand von 8 Inch gepflanzt, jede Fläche wurde viermal wiederholt. Das Pflanzdesign wurde unter Verwendung eines randomisierten vollständigen Blockdesigns bestimmt. Die kommerzielle Sorte Westar wurde als eine Vergleichssorte verwendet. Bei Reife wurden die Flächen geerntet, um den Ertrag zu bestimmen. Der Ertrag der Zu gänge in dem Versuch wurde durch den statistischen Mittelwert der vier Wiederholungen bestimmt. Der "Least Significant Difference Test" wurde verwendet, um die Zugänge in dem randomisierten vollständigen Blockdesign einzuordnen. TABELLE 7 Versuchsstandorte für ausgewählte Fettsäuremutanten

STANDORT	STELLENEIGENSCHAFTEN
BURLEY	Bewässert. Lange Vegetationszeit. Hohe Temperaturen während der Blütezeit.
TETONIA	Trockenland. Kurze Vegetationszeit. Kalte Temperaturen.
LAMONT	Trockenland. Kurze Vegetationszeit. Kalte Temperaturen.
SHELLEY	Bewässert. Mittlere Vegetationszeit. Hohe Temperaturen während der Blütezeit.

Um das Fettsäureprofil der Zugänge zu bestimmen, wurden die Pflanzen in jeder Fläche zur Selbstbestäubung mit einem Sack umhüllt. Die M₇-Saat von einzelnen Pflanzen wurde auf die Fettsäuren in Zehn-Samen-Sammelproben analysiert.
Um die genetischen Beziehungen der ausgewählten Fettsäuremutanten zu bestimmen, wurden Kreuzungen vorgenommen. Blüten der M₆ oder Mutationen späterer Generationen wurden in der Kreuzung verwendet. Die F₁-Saat wurde geerntet und auf die Fettsäurezusammensetzung analysiert, um die Weise der Genwirkung zu bestimmen. Der F₁-Nachwuchs wurde im Gewächshaus gepflanzt. Die sich ergebenden Pflanzen wurden selbst bestäubt, die F₂-Saat wurde geerntet und auf die Fettsäurezusammensetzung für Allelstudien analysiert. Die F₂-Saat und Elternliniensaat wurden im Gewächshaus gepflanzt, einzelne Pflanzen wurden selbst bestäubt. Die F₃-Saat von einzelnen Pflanzen wurde, wie zuvor beschrieben, auf die Fettsäurezusammensetzung unter Verwendung von 10-Samen-Sammelproben getestet.
Bei der Analyse einiger genetischer Beziehungen wurden dihaploide Populationen aus den Mikrosporen der F₁-Hybride hergestellt. Selbstbestäubte Saat aus dihaploiden Pflanzen wurde auf eine Fettsäureanalyse unter Verwendung der zuvor beschriebenen Verfahren analysiert.
Für eine chemische Analyse wurden 10-Samen-Sammelproben per Hand mit einem Glasstab in einem 15 ml Polypropylenröhrchen zermahlen und in 1,2 ml 0,25 N KOH in 1:1 Ether/Methanol extrahiert. Die Probe wurde für 30 Sek. gevortext und für 60 Sek. in einem 60°C Wasserbad erhitzt. Vier ml gesättigtes NaCl und 2,4 ml Isooctan wurden hinzugefügt, und das Gemisch wurde wiederum gevortext. Nach der Phasentrennung wurden 600 μl der oberen organischen Phase in einzelne Röhrchen pipettiert und unter Stickstoff bei –5°C gelagert. Ein μl-Proben wurden in eine Supelco SP-2330 "fused silica"-Kapillarsäule (0,25 mm Innendurchmesser, 30 M Länge, 0,20 μm df) injiziert.
Der Gaschromatograph wurde auf 180°C für 5,5 Minuten gebracht, anschließend für einen Anstieg von 2°C/Minute auf 212°C programmiert und bei dieser Temperatur für 1,5 Minuten gehalten. Die Gesamtlaufzeit betrug 23 Minuten. Die Chromatographieeinstellungen waren: Säulenkopfdruck – 15 psi, Säulenfluss (He) – 0,7 ml/min, Hilfs- und Säulenfluss – 33 ml/min, Wasserstofffluss – 33 ml/min, Luftfluss – 400 ml/min, Injektortemperatur – 250°C, Detektortemperatur – 300°C, Splitöffnung – 1/15.

Tabelle 8 beschreibt die oberen und unteren statistischen Grenzwerte für jede Fettsäure von Interesse. TABELLE 8 Statistische Grenzwerte für spezifische Fettsäuren, die von Westar-Kontrollpflanzungen abgeleitet sind Prozent Fettsäuren

Genotyp	C_16:0	C_18:0	C_18:1	C_18:2	C_18:3	Sats*
M₃-Generation (Rückweisungsquote 1 von 10.000)
oberen	3,3	1,4	-	13,2	5,3	6,0
unteren	4,3	2,5	71,0	21,6	9,9	8,3
M₄-Generation (Rückweisungsquote 1 von 800)
oberen	3,6	0,8	-	12,2	3,2	5,3
unteren	6,3	3,1	76,0	32,4	9,9	11,2
M₅-Generation (Rückweisungsquote 1 von 755)
oberen	2,7	0,9	-	9,6	2,6	4,5
unteren	5,7	2,7	80,3	26,7	9,6	10,0

* Stats = Gesamtgehalt an Gesättigten

BEISPIEL 2
Canola-Linien mit hohem Ölsäuregehalt
In den Studien aus Beispiel 1 überschritten 31 Linien in der M₃-Generation den oberen statistischen Grenzwert für Ölsäure (≥ 71,0%). Die Linie W7608.3 wies 71,2% Ölsäure auf. In der M₄-Generation fuhr ihr selbstbestäubter Nachwuchs (W7608.3.5, seitdem A129.5 bezeichnet) fort, den oberen statistischen Grenzwert für C_18:1 mit 78,8% Ölsäure zu überschreiten. Die M₅-Saat von fünf selbstbestäubten Pflanzen der Linie A129.5 (ATCC 40811) wies durchschnittlich 75,0% Ölsäure auf. Eine einzelne Pflanzenauswahl, A129.5.3 wies 75,6% Ölsäure auf. Die Fettsäurezusammensetzung dieser Mutante mit hohem Ölsäuregehalt, welche sowohl unter Freiland-, als auch unter Gewächshausbedingungen bis zur M₇-Generation stabil war, ist in Tabelle 9 zusammengefasst. Diese Linie erhielt ebenfalls ihre mutierte Fettsäurezusammensetzung bis zur M₇-Generation in Feldversuchen an mehreren Stnadorten stabil bei. Über alle Standorte verteilt, wiesen die selbstbestäubten Pflanzen (A129) durchschnittlich 78,3% Ölsäure auf. Die Fettsäurezusammensetzung der A129 für jeden Versuchsstandort in Idaho ist in Tabelle 10 zusammengefasst. In den an mehreren Standorten wiederholten Ertragsversuchen unterschied sich A129 nicht wesentlich im Ertrag von der Elternsorte Westar.

Für das Canolaöl von A129 wurde nach einer kommerziellen Verarbeitung gefunden, dass es eine bessere oxidative Stabilität verglichen mit Westar aufwies, wenn es mit dem beschleunigten Sauerstoffverfahren (AOM für engl.: Accelerated Oxygen Method), offizielles Verfahren der Amerikanischen Öl-Chemikergesellschaft Cd 12–57 für Fettstabilität, aktives Sauerstoffverfahren (überarbeitet 1989) gemessen wurde. Der AOM von Westar betrug 18 AOM-Stunden, und für A129 betrug er 30 AOM-Stunden. TABELLE 9 Fettsäurezusammensetzung einer Canola-Linie mit hohem Ölsäuregehalt, welche durch Samenmutagenese hergestellt wurde Prozent Fettsäuren

Genotyp	C_16:0	C_18:0	C_18:1	C_18:2	C_18:3	Sats
Westar	3,9	1,9	67,5	17,6	7,4	7,0
W7608.3 (M₃)	3,9	2,4	71,2	12,7	6,1	7,6
W7608.3.5 (M₄)	3,9	2,0	78,8	7,7	3,9	7,3
A129.5.3 (M₅)	3,8	2,3	75,6	9,5	4,9	7,6

Sats = Gesamtgehalt an Gesättigten

Standort	C_16:0	C_18:0	C_18:1	C_18:2	C_18:3	Sats
Burley	3,3	2,1	77,5	8,1	6,0	6,5
Tetonia	3,5	3,4	77,8	6,5	4,7	8,5
Lamont	3,4	1,9	77,8	7,4	6,5	6,3
Shelley	3,3	2,6	80,0	5,7	4,5	7,7

Sats = Gesamtgehalt an Gesättigten

Die genetische Beziehung der Mutation A129 mit hohem Ölsäuregehalt zu anderen Ölsäuredesaturasen wurde in Kreuzungen gezeigt, welche mit kommerziellen Canolasorten und einer Mutation mit niedrigem Linolensäuregehalt durchgeführt wurden. A129 wurde mit der kommerziellen Sorte Global (C_16:0 – 4,5%, C_18:0 – 1,5%, C_18:1 – 62,9%, C_18:2 – 20,0%, C_18:3 – 7,3%) gekreuzt. Ungefähr 200 F₂-Individuen wurden auf die Fettsäurezusammensetzung analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 zusammengefasst. Die Aufspaltung entspricht einem 1:2:1 Verhältnis, was nahe legt, dass ein einzelnes kodominantes Gen die Vererbung des hohen Ölsäuregehalt-Phänotyps vererbt. TABELLE 11 Genetische Studien von A129 X Global Häufigkeit

Genotyp C_18:1 Gehalt (%) Beobachtet Erwartet

od–od– 77,3 43 47

od–od+ 71,7 106 94

od+od+ 66,1 49 47

Eine Kreuzung zwischen A129 und IMC01, einer Varietät mit niedrigem Linolensäuregehalt (C_16:0 – 4,1%, C_18:0 – 1,9%, C_18:1 – 66,4%, C_18:2 – 18,1%, C_18:3 – 5,7%), wurde hergestellt, um die Vererbung der Ölsäuredesaturase und der Linolsäuredesaturase zu bestimmen. In den F₁-Hybriden erreichten sowohl die Ölsäure-, als auch die Linolsäure-Desaturasegene die mittleren Elternwerte, was auf eine kodominante Genwirkung hinweist. Die Fettsäureanalyse der F₂-Individuen bestätigte eine 1:2:1:2:4:2:1:2:1-Aufspaltung von zwei unabhängigen, kodominanten Genen (Tabelle 12). Eine Linie wurde aus der Kreuzung A129 mit IMC01 ausgewählt und als IMC130 (ATCC Hinterlegungsnr. 75446) bezeichnet, wie in der U.S. Patentanmeldung Nr. 08/425,108 beschrieben. TABELLE 12 Genetische Studien von A129 X IMC01 Häufigkeit

Genotyp	Verhältnis	Beobachtet	Erwartet
od–od–ld–ld–	1	11	12
od–od–ld–ld+	2	30	24
od–od–ld+–ld+	1	10	12
od–od+ld–ld–	2	25	24
od–od+ld–ld+	4	54	47
od–od+ld+ld+	2	18	24
od+od+ld–ld–	1	7	12
od+od+ld–ld+	2	25	24
od+od+ld+ld+	1	8	12

Eine zusätzliche Linie mit hohem Ölsäuregehalt, welche A128.3 bezeichnet wurde, wurde ebenfalls durch das offenbarte Verfahren hergestellt. Eine 50-Samen-Sammelanalyse dieser Linie zeigte die folgende Fettsäurezusammensetzung: C_16:0 – 3,5%, C_18:0 – 1,8%, C_18:1 – 77,3%, C_18:2 – 9,0%, C_18:3 – 5,6%, FDA Sats – 5,3%, Gesamt Sats – 6,4%. Diese Linie behielt ebenfalls ihre mutierte Fettsäurezusammensetzung bis zur M₇-Generation stabil bei. In den an mehreren Standorten wiederholten Ertragsversuchen war A128 nicht wesentlich unterschiedlich im Ertrag zu der Elternsorte Westar.
A129 wurde mit A128.3 für Allelstudien gekreuzt. Die Fettsäurezusammensetzung der F₂-Saat zeigte, dass die zwei Linien allelisch sind. Obwohl die Mutationsereignisse in A129 und A128.3 einen unterschiedlichen Ursprung aufwiesen, lagen sie auf demselben Gen.
Eine zusätzliche Linie mit hohem Ölsäuregehalt, M3028.-10 bezeichnet (ATCC 75026), wurde ebenfalls durch das in Beispiel 1 offenbarte Verfahren hergestellt. Eine 10-Samen-Sammelanalyse dieser Linie zeigte die folgende Fettsäurezusammensetzung: C_16:0 – 3,5%, C_18:0 – 1,8%, C_18:1 – 77,3%, C_18:2 – 9,0%, C_18:3 – 5,6%, FDA Gesättigte – 5,3%, Gesamt Gesättigte – 6,4%. In einem an einem einzelnen Standort wiederholten Ertragsversuch war M3028.10 nicht wesentlich unterschiedlich im Ertrag zu der Elternsorte Westar.
BEISPIEL 3
Canola mit niedrigem Linolsäuregehalt

In den Studien aus Beispiel 1 überschritten 80 Linien in der M₃-Generation den unteren statistischen Grenzwert für Linolsäure (≤ 13,2%). Die Linie W12638.8 wies 9,4% Linolsäure auf. In den M₄- und M₅-Generationen fuhren ihre selbstbestäubten Nachkommen [W12638.8, seitdem A133.1 bezeichnet (ATCC 40812)] fort, den statistischen Grenzwert für einen niedrigen C_18:2-Gehalt zu überschreiten, mit Linolsäuremengen von jeweils 10,2% und 8,4%. Die Fettsäurezusammensetzung dieser Mutante mit niedrigem Linolsäuregehalt, welche bis zur M₇-Generation sowohl unter Freiland-, als auch unter Gewächshausbedingungen stabil war, ist in Tabelle 13 zusammengefasst. In den an mehreren Standorten wiederholten Ertragsversuchen war A133 nicht wesentlich unterschiedlich im Ertrag zu der Elternsorte Westar. Eine zusätzliche Linie mit niedrigem Linolsäuregehalt, M3062.8 (ATCC 75025) bezeichnet, wurde ebenfalls durch das offenbarte Verfahren hergestellt. Eine 10-Samen-Sammelanalyse dieser Linie zeigte die folgende Fettsäurezusammensetzung: C_16:0 – 3,8%, C_18:0 – 2,3%, C_18:1 – 77,1%, C_18:2 – 8,9%, C_18:3 – 4,3%, FDA Sats – 6,1%. Diese Linie behielt ebenfalls ihre mutierte Fettsäurezusammensetzung im Freiland und Gewächshaus stabil bei. TABELLE 13 Fettsäurezusammensetzung einer Canola-Linie mit niedrigem Linolsäuregehalt, welche durch Samenmutagenese hergestellt wurde Prozent Fettsäuren

Genotyp	C_16:0	C_18:0	C_18:1	C_18:2	C_18:3	Sats^b
Westar	3,9	1,9	67,5	17,6	7,4	7,0
W12638.8 (M₃)	3,9	2,3	75,0	9,4	6,1	7,5
W12638.8.1 (M₄)	4,1	1,7	74,6	10,2	5,9	7,1
A133.1.8 (M₅)	3,8	2,0	77,7	8,4	5,0	7,0

^a Buchstabe und Zahlen bis zum zweiten Dezimalpunkt geben die Pflanzenlinie an. Die Zahl nach dem zweiten Dezimalpunkt gibt eine individuelle Pflanze an.
^b Sats = Gesamtgehalt Gesättigte

BEISPIEL 4
Canola mit niedrigem Linolen- und Linolsäuregehalt

In den Studien aus Beispiel 1 überschritten 57 Linien in der M₃-Generation den unteren statistischen Grenzwert für Linolensäure (≤ 5,3%). Die Linie W14749.8 wies 5,3% Linolensäure und 15,0% Linolsäure auf. In den M₄- und M₅-Generationen fuhren ihre selbstbestäubten Nachkommen [W14749.8, seitdem M3032 bezeichnet (ATCC 75021)] fort, den statistischen Grenzwert für niedrigen C_18:3-Gehalt zu überschreiten, mit Linolensäuremengen von jeweils 2,7% und 2,3%, und für eine niedrige Summe der Linolen- und Linolsäuren, mit Gesamtwerten von jeweils 11,8% und 12,5%. Die Fettsäurezusammensetzung dieser Mutante mit niedrigem Linolensäure- plus Linolsäuregehalt, welche bis zur M₅-Generation sowohl unter Freiland-, als auch unter Gewächshausbedingungen stabil war, ist in Tabelle 14 zusammengefasst. In einem an einem einzelnen Standort wiederholten Ertragsversuch war M3032 nicht wesentlich unterschiedlich im Ertrag zu der Elternsorte (Westar). TABELLE 14 Fettsäurezusammensetzung einer Canola-Linie mit niedrigem Linolensäuregehalt, welche durch Samenmutagenese hergestellt wurde Prozent Fettsäuren

Genotyp	C_16:0	C_18:0	C_18:1	C_18:2	C_18:3	Sats
Westar	3,9	1,9	67,5	17,6	7,4	7,0
W14749.8 (M₃)	4,0	2,5	69,4	15,0	5,3	6,5
W3032.8 (M₄)	3,9	2,4	77,9	9,1	2,7	6,4
M3032.1 (M₅)	3,5	2,8	80,0	10,2	2,3	6,5

Sats = Gesamtgehalt Gesättigte

BEISPIEL 5
Canola-Linien Q508 und Q4275
Samen der B. napus-Linie IMC-129 wurden mit Methyl-N-nitrosoguanidin (MNNG) mutagenisiert. Die MNNG-Behandlung bestand aus drei Teilen: Voreinweichen, Mutagenanwendung und Waschschritt. Ein 0,05 M Sörenson-Phosphatpuffer wurde verwendet, um den pH-Wert der Einweichungs- und Mutagenbehandlung bei 6,1 zu halten. Zweihundert Samen wurden gleichzeitig auf Filterpapier (Whatman #3M) in einer Petrischale (100 mm × 15 mm) behandelt. Die Samen wurden in 15 ml 0,05 M Sörenson-Puffer, pH-Wert 6,1, unter dauerhafter Bewegung für zwei Stunden voreingeweicht. Am Ende des Einweichungszeitraums wurde der Puffer aus der Schale entfernt.
Eine 10 mM-Konzentration von MNNG in 0,05 M Sorenson's Puffer, pH-Wert 6,1, wurde vor der Verwendung hergestellt. Fünfzehn ml des 10 mM MNNG wurden zu den Samen in jeder Schale hinzugefügt. Die Samen wurden bei 22°C ± 3°C im Dunkeln unter konstanter Bewegung für vier (4) Stunden inkubiert. Am Ende des Inkubationszeitraums wurde die Mutagen-Lösung entfernt.
Die Samen wurden mit drei Wechseln destilliertem Wasser in 10 Minuten Intervallen gewaschen. Der vierte Waschschritt betrug dreißig Minuten. Dieser Behandlungsplan stellte eine LD60-Population her.
Die behandelten Samen wurden in Standardgewächshaus-Blumenerde gepflanzt und in ein Gewächshaus mit kontrollierter Umgebung gebracht. Die Pflanzen wurden unter sechzehn Stunden Licht gezogen. Zur Blütezeit wurden die Blütenstände mit einem Sack umhüllt, um selbstbestäubte Saat zu erzeugen. Bei Reife wurde die M2-Saat geerntet. Jeder M2-Linie wurde eine Identifikationsnummer gegeben. Die gesamte MNNG behandelte Samenpopulation wurde als die Q-Serie bezeichnet.
Geerntete M2-Samen wurden im Gewächshaus gepflanzt. Die Wachstumsbedingungen wurden wie zuvor beschrieben beibehalten. Die Blütenstände wurden zur Blütezeit zur Selbstbestäubung mit einem Sack umhüllt. Bei Reife wurde die selbstbestäubte M3-Saat geerntet und auf die Fettsäurezusammensetzung analysiert. Für jede M3-Samenlinie wurden ungefähr 10–15 Samen gesammelt analysiert, wie in Beispiel 1 beschrieben wurde.
M3-Linien mit hohem Ölsäure-niedrigem Linolsäuregehalt wurden aus der M3-Population unter Verwendung eines Grenzwerts von > 82% Ölsäure und < 5,0% Linolsäure ausgewählt. Aus den ersten 1600 M3-Linien, welche auf die Fettsäurezusammensetzung gescreent wurden, wurde Q508 identifiziert. Die Q508 M3 Generation wurde im Gewächshaus zur M4-Generation fortgeführt. Tabelle 15 zeigt die Fettsäurezusammensetzung von Q508 und IMC 129. Die selbstbestäubte M4-Saat behielt den ausgewählten Phänotyp mit hohem Ölsäure-niedrigem Linolsäuregehalt bei (Tabelle 16). TABELLE 15 Fettsäurezusammensetzung von A129 und der M3-Mutante Q508 mit hohem Ölsäuregehalt

Linie # 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3

A129* 4,0 2,4 77,7 7,8 4,2

Q508 3,9 2,1 84,9 2,4 2,9

* Die Fettsäurezusammensetzung von A129 stellt den Durchschnitt von 50 selbstbestäubten Pflanzen dar, welche mit der M3-Population gezogen wurden

Q508-Pflanzen der M₄-Generation wiesen schlechte agronomische Qualitäten im Freiland verglichen mit Westar auf. Typische Pflanzen waren langsam wachsend im Vergleich zu Westar, es fehlte ihnen eine frühe vegetative Vitalität, sie waren kurz von Statur, neigten dazu, chlorotisch zu sein und wiesen kurze Hülsen auf. Der Ertrag von Q508 war sehr niedrig, verglichen mit Westar.
Die Q508-Pflanzen der M₄-Generation im Gewächshaus neigten dazu, in der Vitalität im Vergleich zu Westar reduziert zu sein. Die Q508-Erträge im Gewächshaus waren jedoch größer als die Q508-Erträge im Freiland. TABELLE 16 Fettsäurezusammensetzung des Samenöls von im Gewächshaus gezogenen Q508, IMC 129 und Westar

Linie 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 FDA Sats

IMC 129^a 4,0 2,4 77,7 7,8 4,2 6,4

Westar^b 3,9 1,9 67,5 17,6 7,4 > 5,8

Q508^c 3,9 2,1 84,9 2,4 2,9 6,0

^a Durchschnitt von 50 selbstbestäubten Pflanzen
^b Daten aus Beispiel 1
^c Durchschnitt von 50 selbstbestäubten Pflanzen

Neun andere M4-Linien mit hohem Ölsäure-niedrigem Linolsäuregehalt wurden ebenfalls identifiziert: Q3603, Q3733, Q4249, Q6284, Q6601, Q6761, Q7415, Q4275 und Q6676. Einige dieser Linien wiesen gute agronomische Eigenschaften und eine erhöhte Ölsäuremenge in den Samen von ungefähr 80% bis ungefähr 84% auf.
Q4275 wurde mit der Varietät Cyclon gekreuzt. Nach einer Selbstbestäubung für sieben Generationen wurde reife Saat von 93GS34-179 geerntet, einer Nachkommenlinie der Q4275xCyclon-Kreuzung. Bezug nehmend auf Tabelle 17, zeigt die Fettsäurezusammensetzung einer Sammel-Samenprobe, dass 93GS34 die Samen-Fettsäurezusammensetzung von Q4275 beibehielt. 93GS34-179 behielt ebenfalls agronomisch gewünschte Eigenschaften bei.
Nach mehr als sieben Generationen der Selbstbestäubung von Q4275 wurden Pflanzen von Q4275, IMC 129 und 93GS34 während der Sommersaison im Freiland gezogen. Die Auswahlen wurden in vier wiederholten Flächen (5 Fuß × 20 Fuß) in einem randomisierten Blockdesign getestet. Die Pflanzen wurden offen bestäubt. Es wurde keine selbstbestäubte Saat hergestellt. Jede Fläche wurde bei Reife geerntet, und eine Probe der zusammen geernteten Saat von jeder Linie wurde wie oben beschrieben auf die Fettsäurezusammensetzung analysiert. Die Fettsäurezusammensetzungen der ausgewählten Linien sind in Tabelle 17 gezeigt. TABELLE 17 Fettsäurezusammensetzung von im Freiland gezogenen IMC 129-, Q4275- und 93GS34-Samen

Linie Fettsäurezusammensetzung (%)

C_16:0 C18:0 C_18:1 C_18:2 C_18:3 FDA Sats

IMC 129 3,3 2,4 76,7 8,7 5,2 5,7

Q4275 3,7 3,1 82,1 4,0 3,5 6,8

93GS34-179 2,6 2,7 85,0 2,8 3,3 5,3
Die in Tabelle 17 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass Q4275 den ausgewählten Phänotyp mit hohem Ölsäure-niedrigem Linolsäuregehalt unter Freilandbedingungen beibehielt. Die agronomischen Eigenschaften der Q4275-Pflanzen waren besser als jene von Q508.
Q508-Pflanzen der M₄-Generation wurden mit einer dihaploiden Auswahl von Westar gekreuzt, wobei Westar als weiblicher Elter diente. Die sich ergebende F1-Saat wurde die 92EF-Population genannt. Ungefähr 126 F1-Individuen, welche bessere agronomische Eigenschaften als der Q508-Elter aufzuweisen schienen, wurden zur Selbstbestäubung ausgewählt. Ein Anteil der F₂-Saat von solchen Individuen wurde wiederum im Freiland gepflanzt. Jede F2-Pflanze wurde selbstbestäubt, und ein Anteil der sich ergebenden F3-Saat wurde auf die Fettsäurezusammensetzung analysiert. Der Gehalt an Ölsäure in der F₃-Saat reichte von 59 bis 79%. Es wurden keine Individuen mit hohem Ölsäuregehalt (> 80%) mit gutem agronomischen Typ gewonnen.
Ein Anteil der F₂-Saat der 92EF-Population wurde im Gewächshaus gepflanzt, um die Genetik der Q508-Linie zu analysieren. Die F₃-Saat wurde von 380 F2-Individuen analysiert. Die C_18:1-Mengen der F₃-Saat aus dem Gewächshausexperiment sind in 1 dargestellt. Die Daten wurden auf die Hypothese getestet, dass Q508 zwei mutierte Gene enthält, welche semidominant und additiv sind: die ursprüngliche IMC 129-Mutation, sowie eine zusätzliche Mutation. Die Hypothese nimmt ebenfalls an, dass homozygoter Q508 mehr als 85% Ölsäure aufweist und homozygoter Westar 62–67% Ölsäure aufweist. Die möglichen Genotypen von jedem Gen in einer Kreuzung von Q508 mit Westar können bezeichnet werden als:
AA = Westar Fad2^a
BB = Westar Fad2^b
aa = Q508 Fad2^a–
bb = Q508 Fad2^b–
Unter Annahme einer unabhängigen Aufspaltung wird ein 1:4:6:4:1-Verhältnis der Phänotypen erwartet. Von den Phänotypen der heterozygoten Pflanzen wird angenommen, dass sie nicht unterscheidbar sind, und daher wurden die Daten auf eine Passung mit einem 1:14:1-Verhältnis von homozygotem Westar:heterozygoten Pflanzen: homozygotem Q508 getestet.

Phänotypisches Verhältnis # der Westar-Allele Genotyp

1 4 AABB (Westar)

4 3 AABb, AaBB, AABb, AaBB

6 2 AaBb, AAbb, AaBb, AaBb, aaBB, AaBb

4 1 Aabb, aaBbk Aabb, aaBb

1 0 aabb (Q508)
Unter Verwendung einer Chi-Quadratanalyse passen die Ölsäuredaten zu einem 1:14:1-Verhältnis. Es wurde gefolgert, dass sich Q508 von Westar durch zwei Hauptgene unterscheidet, welche semidominant und additiv sind, und welche sich unabhängig aufspalten. Durch Vergleich ist der Genotyp von IMC 129 aaBB.

Die Fettsäurezusammensetzung von repräsentativen F3-Individuen, welche mehr als 85% Ölsäure im Samenöl aufweisen, ist in Tabelle 18 gezeigt. Es kann erkannt werden, dass die Mengen der gesättigten Fettsäuren in solchen Pflanzen erniedrigt sind, verglichen mit Westar. TABELLE 18 92EF F₃-Individuen mit > 85% C_18:1 im Samenöl

F3 Pflanzen-Identifikationsnummer	Fettsäurezusammensetzung (%)
F3 Pflanzen-Identifikationsnummer	C16:0	C18:0	C18:1	C18:2	C18:3	FDASA
+38068	3,401	1,582	85,452	2,134	3,615	4,983
+38156	3,388	1,379	85,434	2,143	3,701	4,767
+38171	3,588	1,511	85,289	2,367	3,425	5,099
+38181	3,75	1,16	85,312	2,968	3,819	4,977
+38182	3,529	0,985	85,905	2,614	3,926	4,56
+38191	3,364	1,039	85,737	2,869	4,039	4,459
+38196	3,557	1,182	85,054	2,962	4,252	4,739
+38202	3,554	1,105	86,091	2,651	3,721	4,713
+38220	3,093	1,16	86,421	1,931	3,514	4,314
+38236	3,308	1,349	85,425	2,37	3,605	4,718
+38408	3,617	1,607	85,34	2,33	3,562	5,224
+38427	3,494	1,454	85,924	2,206	3,289	4,948
+38533	3,64	1,319	85,962	2,715	3,516	4,959

BEISPIEL 6
Blatt- und Wurzel-Fettsäureprofile der Canola-Linien
IMC-129, Q508 und Westar
Pflanzen von Q508, IMC 129 und Westar wurden im Gewächshaus gezogen. Reife Blätter, sich primär ausbreitende Blätter, Blattstiele und Wurzeln wurden im 6–8 Blattstadium geerntet, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –70°C gelagert. Lipidextrakte wurden durch eine GLC, wie in Beispiel 1 beschrieben, analysiert. Die Fettsäureprofildaten sind in Tabelle 19 gezeigt. Die Daten in Tabelle 19 zeigen, dass die Gesamtblattlipide in Q508 einen höheren C_18:1-Gehalt aufweisen, als der C_18:2 plus C_18:3-Gehalt. Das Gegenteil trifft für Westar und IMC129 zu. Der Unterschied in den Gesamt-Blattlipiden zwischen Q508 und IMC 129 stimmt mit der Hypothese überein, dass ein zweites Fad2-Gen in Q508 mutiert ist.
Der C_16:3-Gehalt in der Gesamtlipidfraktion betrug ungefähr dasselbe in allen drei Linien, was nahe legt, dass das Plastiden-FadC-Genprodukt nicht durch die Q508-Mutationen beeinträchtigt war. Um zu bestätigen, dass das FadC-Gen nicht mutiert war, wurden Chloroplastenlipide getrennt und analysiert. Es wurden keine Änderungen in den Chloroplasten-C_16:1-, -C_16:2- oder -C_16:3-Fettsäuren in den drei Linien nachgewiesen. Die Ähnlichkeit der Plastiden-Blattlipide zwischen Q508, Westar und IMC 129 stimmt mit der Hypothese überein, dass die zweite Mutation in Q508 ein mikrosomales Fad2-Gen beeinflusst, und nicht ein Plastiden-FadC-Gen.
BEISPIEL 7
Sequenzen der mutierten und Wildtyp-Delta-12-Fettsäure-Desaturasen aus B. napus
Für das FAD2-Strukturgen spezifische Primer wurden verwendet, um den vollständigen offenen Leserahmen (ORF für engl.: open reading frame) der D- und F-Delta-12-Desaturase-Gene durch eine reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zu klonieren. RNA aus Samen von IMC 129-, Q508- und Westar-Pflanzen wurde durch Standardverfahren isoliert und wurde als Matrize verwendet. Die RT-amplifizierten Fragmente wurden für die Nukleotidsequenzbestimmung verwendet. Die DNA-Sequenz für jedes Gen aus jeder Linie wurde von beiden Strängen durch Standard-Didesoxy-Sequenzierverfahren bestimmt.
Die Sequenzanalyse ergab eine Transversion von G zu A an Nukleotid 316 (vom Translations-Initiationskodon) des D-Gens sowohl in IMC 129, als auch in Q508, verglichen mit der Sequenz von Westar. Die Transversion ändert das Kodon an dieser Position von GAG zu AAG und führt zu einer nicht konservativen Substitution von Lysin, einem basischen Rest, zu Glutaminsäure, einem sauren Rest. Die Anwesenheit derselben Mutation in beiden Linien wurde erwartet, da die Q508-Linie von IMC 129 abgeleitet war. Dieselbe Basenänderung wurde ebenfalls in Q508 und IMC 129 nachgewiesen, wenn RNA aus Blattgewebe als Matrize verwendet wurde.
Die G zu A Mutation an Nukleotid 316 wurde durch Sequenzieren mehrerer unabhängiger Klone bestätigt, welche Fragmente enthielten, die direkt aus genomischer DNA von IMC 129 und Westar amplifiziert wurden. Diese Ergebnisse schlossen die Möglichkeit einer seltenen Mutation aus, die während der reversen Transkription und der PCR im RT-PCR-Protokoll eingeführt wurde. Es wurde gefolgert, dass die IMC 129-Mutante auf einer einzelnen Basentransversion an Nukleotid 316 in der kodierenden Region des D-Gens der mikrosomalen Delta-12-Raps-Desaturase beruht.
Eine einzelne Basentransition von T zu A an Nukleotid 515 des F-Gens wurde in Q508 verglichen mit der Westar-Sequenz nachgewiesen. Die Mutation verändert das Kodon an dieser Position von CTC zu CAC, was zu einer nicht konservativen Substitution von einem polaren Rest, Histidin, durch einen nicht polaren Rest, Leucin im sich ergebenden Genprodukt führt. In der F-Gensequenz von IMC 129 wurden keine Mutationen gefunden, verglichen mit der F-Gensequenz von Westar.
Diese Daten unterstützen die Schlussfolgerung, dass eine Mutation in einer Delta-12-Desaturase-Gensequenz zu Veränderungen im Fettsäureprofil von Pflanzen führt, welche ein solches mutiertes Gen enthalten. Darüber hinaus zeigen die Daten, dass sich, wenn eine Pflanzenlinie oder -art zwei Delta-12-Desaturase-Loci enthält, das Fettsäureprofil eines Individuums mit zwei mutierten Loci von dem Fettsäureprofil eines Individuums mit einem mutierten Locus unterscheidet.

Die Mutation im D-Gen von IMC 129 und Q508 passt zu einer Region, welche ein konserviertes Aminosäuremotiv (His-Xaa-Xaa-Xaa-His) aufweist, welches in klonierten membrangebundenen Delta-12- und Delta-15-Desaturasen gefunden wird (Tabelle 20). TABELLE 20 Alignment von Aminiosäuresequenzen von klonierten membrangebundenen Canola-Desaturasen

Desaturase-Gen	Sequenz^a	Position
Canola-fad2-D (Mutante)	AHKCGH	109–114
Canola-Fad2-D	AHECGH	109–114
Canola-Fad2-F	AHECGH	109–114
Canola-FadC	GHDCAH	170–175

Canola-fad3 (Mutante)	GHKCGH	94–99
Canola-Fad3	GHDCGH	94–99
Canola-FadD	GHDCGH	125–130

(FadD = Plastiden-Delta-15, Fad3 = mikrosomale Delta-15),
(FadC = Plastiden-Delta-12, Fad2 = mikrosomale Delta-12)
^a Einbuchstaben-Aminosäurecode, konservative Substitutionen sind unterstrichen, nicht konservative Substitutionen sind in Fettdruck.

BEISPIEL 8
Transkription und Translation von mikrosomalen
Delta-12-Fettsäure-Desaturasen
Die Transkription in vivo wurde durch eine RT-PCR-Analyse von sich entwickelnden Samen im Stadium II und Stadium III und Blattgewebe analysiert. Die verwendeten Primer, um spezifisch die Delta-12-Desaturase F-Gen-RNA aus den angegebenen Geweben zu amplifizieren, waren der Sense-Primer 5'-GGATATGATGATGGTGAAAGA-3' und der Antisense-Primer 5'-TCTTTCACCATCATCATATCC-3'. Die verwendeten Primer, um spezifisch die Delta-12-Desaturase D-Gen-RNA aus den angegebenen Geweben zu amplifizieren, waren der Sense-Primer 5'-GTTATGAAGCAAAGAAGAAAC-3' und der Antisense-Primer 5'-GTTTCTTCTTTGCTTCATAAC-3'. Die Ergebnisse wiesen darauf hin, dass mRNA von sowohl dem D-, als auch dem F-Gen in Samen und Blattgeweben von IMC 129, Q508 und Wildtyp-Westar-Pflanzen exprimiert wurde.
Eine in vitro Transkriptions- und Translationsanalyse zeigte, dass ein Peptid von ungefähr 46 kD hergestellt wurde. Dies ist die erwartete Größe sowohl des D-Genprodukts, als auch des F-Genprodukts, basierend auf der Summe der abgeleiteten Aminosäuresequenz von jedem Gen und dem kotranslationalen Hinzufügen eines mikrosomalen Membranpeptids.
Diese Ergebnisse schließen die Möglichkeit aus, dass Nonsense- oder Leserahmenverschiebungsmutationen, welche zu einem verkürzten Polypeptid-Genprodukt führen, in entweder dem mutierten D-Gen oder dem mutierten F-Gen anwesend sind. Die Daten, zusammen mit den Daten aus Beispiel 7 unterstützen die Schlussfolgerung, dass die Mutationen in Q508 und IMC 129 eher in Delta-12-Fettsäure-Desaturase-Strukturgenen liegen, welche die Desaturase-Enzyme kodieren, als in regulatorischen Genen.
BEISPIEL 9
Entwicklung von genspezifischen PCR-Markern
Basierend auf der einzelnen Basenänderung in dem mutierten D-Gen von IMC 129, welche oben beschrieben wurde, wurden zwei 5'-PCR-Primer entworfen. Die Nukleotidsequenz der Primer unterschied sich nur in der Base (G für Westar und A für IMC 129) am 3'-Ende. Die Primer erlauben es, zwischen mutierten fad2-D- und Wildtyp-Fad2-D-Allelen in einem DNA-basierten PCR-Assay zu unterscheiden. Da nur ein Unterschied von einer einzelnen Base in den 5'-PCR-Primern vorliegt, ist der PCR-Assay sehr empfindlich für die PCR-Bedingungen, wie Anlagerungstemperatur, Zyklusanzahl, Menge und Reinheit der verwendeten DNA-Matrizen. Es wurden Assaybedingungen etabliert, welche zwischen dem mutierten Gen und dem Wildtyp-Gen unter Verwendung genomischer DNA aus IMC 129- und Wildtyp-Pflanzen als Matrizen unterscheiden. Die Bedingungen können weiter durch Variieren der PCR-Parameter optimiert werden, insbesondere mit den variablen DNA-Rohproben. Ein PCR-Assay, welcher eine einzelne Basenmutation in IMC 129 vom Wildtyp-Gen unterscheidet, zusammen mit einer Fettsäurezusammensetzungs-Analyse stellt ein Hilfsmittel bereit, um die Segregations- und Selektionsanalyse von genetischen Kreuzungen zu vereinfachen, welche Pflanzen umfassen, die eine Delta-12-Fettsäure-Desaturase-Mutation aufweisen.
BEISPIEL 10
Transformation mit mutierten und Wildtyp-Fad3-Genen
Die B. napus-Sorte Westar wurde mit mutierten und Wildtyp-Fad3-Genen transformiert, um zu zeigen, dass das mutierte Fad3-Gen für zytoplasmatische Canola-Linolsäure-Desaturase Delta 15-Desaturase funktionsunfähig ist. Die Transformation und Regeneration wurde unter Verwendung von "entwaffnetem" Agrobacteri um tumefaciens im Wesentlichen dem in der WO 94/11516 beschriebenen Verfahren folgend durchgeführt.
Zwei entschärfte Agrobacterium-Stämme wurden gentechnisch hergestellt, wobei jeder ein Ti-Plasmid mit dem geeigneten Gen, verbunden mit einem samenspezifischen Promotor und einer entsprechenden Terminationssequenz enthielt. Das erste Plasmid, pIMC110, wurde durch Inserieren des vollständigen Wildtyp-Fad3-Gens in Sense-Orientierung (Nukleotide 208 bis 1336 der SEQ ID NR: 6 in der WO 93/11245 ), flankiert von einer Napin-Promotorsequenz, welche in 5'-Position zu dem Fad3-Gen liegt, und von einer Napin-Terminationssequenz, welche in 3'-Position zum Fad3-Gen liegt, in einen entwaffneten Ti-Vektor, hergestellt. Der Raps-Napin-Promotor wird in der EP 0255378 beschrieben.
Das zweite Plasmid, pIMC205, wurde durch Inserieren eines mutierten Fad3-Gens in Sense-Orientierung in einen entwaffneten Ti-Vektor hergestellt. Die mutierte Sequenz enthielt Mutationen an den Nukleotiden 411 und 413 des mikrosomalen Fad3-Gens, welches in der WO 93/11245 beschrieben wird, was die Sequenz an Kodon 96 von GAC zu AAG ändert. Die Aminosäure an Kodon 96 des Genprodukts wurde dadurch von Asparaginsäure zu Lysin geändert. Siehe Tabelle 20. Ein Bohnen (Phaseolus vulgaris)-Phaseolin (7S-Samenspeicherprotein)-Promotorfragment mit 495 Basenpaaren wurde 5' von dem mutierten Fad3-Gen platziert, und eine Phaseolin-Terminationssequenz wurde 3' von dem mutierten Fad3-Gen platziert. Die Phaseolin-Sequenz wird in Doyle et al., (1986) J. Biol. Chem. 261: 9228–9238 und Slightom et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1897–1901 beschrieben.
Die geeigneten Plasmide wurden gentechnisch hergestellt und getrennt in den Agrobacterium-Stamm LBA4404 transferiert. Jeder gentechnisch hergestellte Stamm wurde verwendet, um 5 mm-Segmente von Hypocotyl-Explantaten aus Westar-Samen durch Kokultivierung zu infizieren. Infizierte Hypocotyle wurden in Callusmedium übertragen und nachfolgend in Regenerationsmedium. Sobald sich erkennbare Stiele aus dem Callus bildeten, wurde die Sprosse herausgeschnitten und in Verlängerungsmedium übertragen. Die verlängerten Sprosse wurde abgeschnitten, in Rootone^TM getaucht, man ließ sie auf einem Agarmedium wurzeln, und sie wurden in Blumenerde transplantiert, um fertile T1-Pflanzen zu erhalten. T2-Samen wurden durch Selbstbestäubung der sich ergebenden T1-Pflanzen erhalten.
Die Fettsäureanalyse der T2-Samen wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 21 zusammengefasst. Von den 40 unter Verwendung des pIMC110-Plasmids erhaltenen Transformanten, zeigten 17 Pflanzen Wildtyp-Fettsäureprofile und 16 zeigten eine Überexpression. Von einem Anteil der Transformanten wird erwartet, dass sie einen Überexpressionsphänotyp zeigen, wenn ein funktionsfähiges Gen in Sense-Orientierung in Pflanzen transformiert wird.
Von den 307 transformierten Pflanzen mit dem pIMC205-Gen wies keine eine Fettsäurezusammensetzung auf, welche auf eine Überexpression hinwies. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass das mutierte fad3-Genprodukt funktionsunfähig ist, da einige der Transformanten einen Überexpressionsphänotyp aufgewiesen hätten, wenn das Genprodukt funktionsfähig gewesen wäre.

Die Fettsäurezusammensetzungen von repräsentativen transformierten Pflanzen sind in Tabelle 22 dargestellt. Die Linien 652-09 und 663-40 sind repräsentativ für Pflanzen, welche pIMC110 enthalten und jeweils einen Überexpressions- und einen Kosuppressionsphänotyp aufweisen. Die Linie 205-284 ist repräsentativ für Pflanzen, welche pIMC 205 enthalten und das mutierte fad3-Gen aufweisen. TABELLE 22 Fettsäurezusammensetzung von T2-Saat aus Westar, welcher mit pIMC205 oder pIMC110 transformiert wurde

Linie	Fettsäurezusammensetzung (%)
Linie	C16:0	C18:0	C18:1	C18:2	C18:3
652-09 pIMC110 Überexpression	4,7	3,3	65,6	8,1	14,8
663-40 pIMC110 Kosuppression	4,9	2,1	62,5	23,2	3,6
205-284 pIMC205	3,7	1,8	68,8	15,9	6,7

BEISPIEL 11
Sequenzen des Wildtyp- und mutierten Fad2-D und Fad2-F
Genomische DNA mit hohem Molekulargewicht wurde aus Blättern von Q4275-Pflanzen isoliert (Beispiel 5). Diese DNA wurde als Matrize für eine Amplifikation der Fad2-D- und Fad2-F-Gene durch eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet. Die PCR-Amplifikationen wurden in einem Gesamtvolumen von 100 μl durchgeführt und enthielten 0,3 μg genomische DNA, 200 μM Desoxyribonukleosidtriphosphate, 3 mM MgSO₄, 1–2 Einheiten DNA-Polymerase und 1 × Puffer (vom Hersteller der DNA-Polymerase bereitgestellt). Die Zyklusbedingungen waren: 1 Zyklus für 1 min bei 95°C, gefolgt von 30 Zyklen mit 1 min bei 94°C, 2 min bei 55°C und 3 min bei 73°C.
Das Fad2-D-Gen wurde einmal unter Verwendung von Elongase^® (Gibco-BRL) amplifiziert. Die PCR-Primer waren: CAUCAUCAUCAUCTTCTTCGTAGGGTTCATCG und CUACUACUACUATCATAGAAGAGAAAGGTTCAG jeweils für die 5'- und 3'-Enden des Gens.
Das Fad2-F-Gen wurde unabhängig viermal amplifiziert, zweimal mit Elongase^® und zweimal mit Taq-Polymerase (Boehringer Mannheim). Die verwendeten PCR-Primer waren: 5'CAUCAUCAUCAUCATGGGTGCACGTGGAAGAA3' und 5'CUACUACUACUATCTTTCACCATCATCATATCC3' jeweils für die 5'- und 3'-Enden des Gens.
Die amplifizierten DNA-Produkte wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt, mit JetSorb^® gereinigt und anschließend über die (CAU)₄- und (CUA)₄-Sequenzen an den Enden der Primer in pAMP1 (Gibco-BRL) eingefügt und in E. coli-DH5α transformiert.
Die Fad2-D- und Fad2-F-Inserts wurden auf beiden Strängen mit einem ABI PRISM 310 Sequenzierautomaten (Perkin-Elmer) nach den Herstelleranweisungen unter Verwendung synthetischer Primer, AmpliTaq^® DNA-Polymerase und Farbstoffterminator sequenziert.
Für das Fad2-Gen wurde gefunden, dass es ein Intron strangaufwärts vom ATG-Startkodon aufweist. Wie erwartet enthielt die kodierende Sequenz des Gens eine G zu A-Mutation an Nukleotid 316, welche von IMC 129 abgeleitet wurde (2).
Eine einzelne Basentransversion von G zu A an Nukleotid 908 wurde in der F-Gensequenz der amplifizierten Q4275-Produkte, verglichen mit der Wildtyp-F-Gensequenz (2) nachgewiesen. Diese Mutation ändert das Kodon an Aminosäure 303 von GGA zu GAA, was zu einer nicht konservativen Substitution eines Glycinrestes durch einen Glutaminsäurerest führt (Tabelle 3 und 3). Eine Ex- Pression des mutierten Q4275-Fad2-F-Delta-12-Desaturase-Gens in Pflanzen verändert die Fettsäurezusammensetzung, wie hier oben beschrieben wurde.
BEISPIEL 12
Raps mit hohem Eruca-, hohem Ölsäuregehalt

Das Züchtungsverfahren, welches entworfen wurde, um neue Fettsäurezusammensetzungen in Raps herzustellen, ist in 4 dargestellt. Im Allgemeinen wurden Kreuzungen zwischen einer Linie mit hohem Erucasäuregehalt und einer Linie mit hohem Ölsäuregehalt durchgeführt. Die Linie mit hohem Erucasäuregehalt, HEC01 bezeichnet (unter dem Handelsnamen Hero vertrieben), enthält ungefähr 45,5% Erucasäure (Tabelle 23). Die Linien mit hohem Ölsäuregehalt wurden 93GS66A-130 und 93GS34A-179 bezeichnet und wurden von 93GS abgeleitet. Siehe zum Beispiel Beispiel 5 und Tabelle 17. Diese Linien enthalten ungefähr 84% Ölsäure in ihrem Samenöl (Tabelle 24). TABELLE 23 Fettsäurezusammensetzung von HEC01

Fettsäure	Gewicht (%)
C_14:0	0,05
C_16:0	3,60
C_16:1	0,36
C_18:0	1,66
C_18:1	14,72
C_18:2	10,67
C_18:3	9,71
C_20:0	1,36
C_20:1	9,04
C_20:2	0,48
C_22:0	1,74
C_22:1	45,45
C_24:0	0,49
C_24:1	0,81

TABELLE 24 Fettsäurezusammensetzung von 93GS66A-130 und 93GS34A-179

Fettsäure	Gewicht (%) von 93GS66A-130	Gewicht (%) von 93GS34A-179
C_14:0	0,04	0,05
C_16:0	3,25	3,23
C_16:1	0,25	0,25
C_18:0	1,60	1,94
C_18:1	84,38	83,71
C_18:2	2,58	3,14
C_18:3	4,86	4,76
C_20:0	0,56	0,65
C_20:1	1,57	1,41
C_20:2	0,05	0,04
C_22:0	0,37	0,39
C_22:1	0,06	0,03
C_24:0	0,20	0,18
C_24:1	0,21	0,18

Die F₁-Generationen der Kreuzungen zwischen HEC01 × 93GS66A-130 und HEC01 × 93GS34A-179 wurden jeweils 96.801 und 96.804 bezeichnet. 96.801- und 96.804-F₁-Pflanzen wurden selbstbestäubt, um F₂-Saat herzustellen. Insgesamt wurden 622 zufällige, einzelne F₂-Samen auf ihre Fettsäurezusammensetzung analysiert. Tabelle 25 fasst die durchschnittlichen Prozente und die Standardabweichung für den Gesamtgehalt an einfach Ungesättigten, an Ölsäure, Ei cosensäure, Erucasäure, den Gesamtgehalt mehrfach ungesättigter und den Gesamtgehalt gesättigter Fettsäuren dieser 622 Samen zusammen. TABELLE 25

Fettsäure	%
Gesamtgehalt langkettiger einfach Ungesättigter	78,90 ± 4,07
Palmitoleat	0,28 ± 0,06
Ölsäure	45,33 ± 9,91
Eicosensäure	14,84 ± 2,84
Erucasäure	17,97 ± 8,9
Nervonsäure	0,48 ± 0,21
Gesamtgehalt mehrfach Ungesättigter	7,10 ± 1,05
Gesamtgehalt Gesättigter	13,99 ± 3,83

Eine Analyse dieser Daten weist darauf hin, dass die Häufigkeitsverteilungen von einer Normalverteilung abweichen. Die Häufigkeitsverteilung des Gesamtgehalts langkettiger einfach Ungesättigter ist leicht nach rechts verschoben (–0,0513), und die Verteilung des Eicosensäuregehalts ist stark nach rechts verschoben (–1,715). Die Häufigkeitsverteilungen für den Ölsäure- und Erucasäuregehalt sind stark nach links verschoben (jeweils 0,397 und 0,177). Die Schiefe wurde unter Verwendung von Lotus 1-2-3 für Windows (Ausgabe 5.0) berechnet.
Tabelle 26 beschreibt Eigenschaften von ausgewählten Populationen innerhalb der Gesamtpopulation der Samen. Zum Beispiel wiesen 151 Samen einen Gehalt an langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren von mehr 82% auf (Tabelle 26, Spalte B). Innerhalb dieser Population betrug der mittlere Öl-, Eicosen- und Erucasäuregehalt jeweils ungefähr 48%, 16% und 19%. Der Gesamtgehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren (C18:2, C18:3 und C20:2) betrug ungefähr 9%, und der Gesamtgehalt an gesättigten Fettsäuren betrug weniger als 7%.
Siebenundvierzig der 622 Samen wiesen einen Gehalt an langkettigen einfach Ungesättigten von mehr als 85% auf (Tabelle 26, Spalte C). Der durchschnittliche Öl-, Eicosen- und Erucasäuregehalt innerhalb dieser Samen betrug jeweils 51%, 17% und 17%. Der Gesamtgehalt an gesättigten und merfach ungesättigten Fettsäuren betrug jeweils weniger als 7%.
Dreiundzwanzig der Samen wiesen einen Eicosensäuregehalt von mehr als 19% auf (Tabelle 26, Spalte F). Innerhalb dieser Samen betrug der durchschnittliche Ölsäure-, Erucasäure-Gehalt jeweils ungefähr 44% und 19%. Der Gesamtgehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren betrug weniger als 10%, und der Gesamtgehalt an gesättigten Fettsäuren betrug weniger als 7%.
Die Fettsäurezusammensetzung ausgewählter einzelner Samen ist in Tabelle 27 dargestellt. V800655.334 war ein einzelner Samen, welcher einen Gehalt an langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren von ungefähr 84% aufwies. Der Ölsäure-, Eicosensäure- und Erucasäuregehalt betrug jeweils 33,48%, 17,14% und 32,23%. Der Gesamtgehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren betrug ungefähr 10%. Der Linol-, α-Linolen- und Erucasäuregehalt betrug jeweils 3,54%, 6,01% und 0,15%.
V800655.126 war ein einzelner Samen, welcher einen Gehalt an langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren von ungefähr 85% aufwies (42,67% Ölsäure, 16,21% Eicosensäure und 25,37% Erucasäure). Der Gesamtgehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren betrug ungefähr 8% (4,87% Linolsäure, 3,05% α-Linolensäure und 0,13% Eicosadiensäure).
V800654.9 war ein einzelner Samen, welcher einen Gehalt an langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren von 89% aufwies (51,53% Ölsäure, 16,94% Eicosensäure und 19,24% Erucasäure). Der Gesamtgehalt an mehrfach ungesättigten betrug ungefähr 8% (4,87% Linolsäure, 3,05% α-Linolensäure und 0,13% Eicosadiensäure).

Einzelne Samen mit einem Gehalt an langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren von mindestens 82% und einem Erucasäuregehalt von mindestens 15% wurden in einem Gewächshaus gepflanzt, bis zur Reife gezogen und selbstbestäubt. Die Saat (F₃-Generation) von jeder Pflanze wurde geerntet. Eine Sammelsamen-Probe von jeder F₂-Pflanze wird auf die Fettsäurezusammensetzung analysiert. TABELLE 27 Fettsäurezusammensetzung von ausgewählten einzelnen Samen

Fettsäure	V800655.334 Gewicht (%)	V800655.126 Gewicht (%)	V800654.9 Gewicht (%)
C_14:0	0,07	0,05	0,03
C_16:0	3,49	3,52	2,98
C_16:1	0,34	0,28	0,28
C_18:0	1,64	1,89	1,65
C_18:1	33,48	42,67	51,53
C_18:2	3,54	4,87	2,09
C_18:3	6,01	3,05	3,53
C_20:0	0,86	0,87	0,68
C_20:1	17,14	16,21	16,94
C_20:2	0,15	0,13	0,10
C_22:0	0,41	0,35	0,24
C_22:1	32,23	25,37	19,24
C_24:0	0,12	0,13	0,14
C_24:1	0,52	0,61	0,59

BEISPIEL 13
Zusätzliche Kreuzungen wurden zwischen Hero und mehreren Linien mit hohem Ölsäuregehalt (Tabelle 28) durchgeführt, um den Erucasäuregehalt des Samens durch eine Reduktion des Gehalts an mehrfach Ungesättigten und einen Anstieg des Gesamtgehalts der einfach Ungesättigten zu erhöhen. Die Linien mit hohem Ölsäuregehalt schlossen 048X058 und Q4275X663-40 ein. Die 048X058-Linie ergab sich aus einer Kreuzung von zwei getrennt transformierten Linien. Die 048X058-Linie enthält ein Kosuppressionsereignis, welches sich aus der Einführung des 663-40 Transgens, welches oben beschrieben wurde, ergibt, und ein zweites Kosuppressionsereignis, welches sich aus einem Transgen ergibt, wel ches einen Oleosinpromotor einschließt, der mit einem Ölsäure-Desaturase-Gen verbunden ist. Die Q4275X663-40-Linie wurde aus einer Kreuzung von Q4275 (Beispiel 5 und Tabelle 17) mit 663-40 abgeleitet. Die 663-40 Linie enthält ein Kosuppressionsereignis, welches sich aus einem Transgen ergibt, welches einen Napinpromotor einschließt, der mit einem Linolsäure-Desaturase-Gen verbunden ist. Die Pflanzen von jeder Linie wurden in Wachstumskammern unter 16 Std. Licht bei 23/17°C Tag/Nacht-Temperatur gezogen. Die Blüten wurden vor dem Öffnen kastriert und bedeckt, um eine Kreuzbestäubung zu verhindern. Am folgenden Tag wurden die Narben der kastrierten Blüten mit dem gewünschten Pollenspender bestäubt. Bei Hülsenreife wurde die F1-Saat geerntet.
Die aus den Kreuzungen in Tabelle 28 erzeugte F1-Saat wurde zur F2-Samengeneration in der Wachstumskammer fortgeführt. Zehn Samen wurden für jede Kreuzung einzeln gepflanzt. Zur Blütezeit wurden die Pflanzen mit Säcken bedeckt, um eine Selbstbestäubung sicherzustellen. Die F2-Samen wurden bei Reife geerntet.
Die Samen wurden auf Filterpapier bei Raumtemperatur im Dunkeln zur Keimung gebracht. 18 bis 24 Stunden nach dem Beginn der Keimung wurde ein Keimblatt aus dem Samen zur Extraktion der Fettsäuren entfernt. Die Fettsäurezusammensetzungen wurden unter Verwendung einer Gaschromatographie bestimmt. Ausgewählte F2-Samenhälften mit einem hohen Erucasäuregehalt sind in den Tabellen 29 und 30 gezeigt.
F₂-Samenhälften wurden in Erde gepflanzt und unter den oben beschriebenen Wachstumskammerbedingungen gezogen. Zur Blütezeit wurden die Pflanzen zur Selbstbestäubung mit Säcken bedeckt. Nach der Reife wurde die F₃-Saat geerntet und auf die Fettsäurezusammensetzung analysiert. Die Samen wurden unter Verwendung einer Probengröße von 10–15 Samen analysiert. Die Ergebnisse der Analyse befinden sich in den Tabellen 31 und 32.
HEHOC-214-F₃-Samen wurden wie oben beschrieben gepflanzt und unter Wachstumskammerbedingungen gezogen und selbstbestäubt. Bei Reife wurden die F₄-Samen geerntet und auf die Fettsäurezusammensetzung analysiert, wobei Sammelproben von 10–15 Samen verwendet wurden Die Fettsäurezusammensetzung der Samen der drei F₄-Linien ist in Tabelle 33 gezeigt. Alle drei Proben wiesen einen Gehalt an langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren von mehr als 82% und einen Erucasäuregehalt von mehr als 37%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung auf. Die Gene, welche die Fettsäurezusammensetzung beeinflussen, werden in diesem F₄-Generationsmaterial noch aufgespalten. Eine Selektion in nachfolgenden Generationen wird die genetische Ausstattung fixieren und zu Linien führen, welche eine Fettsäurezusammensetzung von 25–30% Ölsäure, 3–4% Linolsäure, 1–2% α-Linolensäure, 45–50% Erucasäure und 10–13% Eicosensäure aufweisen.
BEISPIEL 14

Die Samen aus den Linien aus Tabelle 31 wurden auf zwei getrennten Flächen gepflanzt. Den Pflanzen in jeder Fläche wurde erlaubt, offen bestäubt zu werden. Das Öl wurde aus den Samen, welche auf jeder Fläche hergestellt wurden, extrahiert, die Fettsäurezusammensetzungen von jedem Öl sind in Tabelle 34 gezeigt. Eine Probe von jedem Öl wurde veredelt und gebleicht (Fläche 1 mit hohem Gehalt an langkettigen einfach Ungesättigten) oder veredelt, gebleicht und desodoriert (Fläche 2 mit hohem Gehalt an langkettigen einfach Ungesättigten). Das Öl von Fläche 1 wies einen Gesamtgehalt an gesättigten Fettsäuren von 5,55%, einen Gehalt an langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren von 85,23% und einen Gesamtgehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren von 6,80% auf. Das Öl von Fläche 2 wies einen Gesamtgehalt an gesättigten Fettsäuren von 5,22%, einen Gehalt an langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren von 82,90% und einen Gesamtgehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren von 9,56% auf. Die Iodwerte des Öls von den Flächen 1 und 2 betrugen jeweils 79 und 81,7. Das Öl von Fläche 1, welches nicht desodoriert wurde, enthielt 420 ppm Tocopherol. Das Öl von Fläche 2 enthielt 280 ppm Tocopherol. Das Öl von den Flächen 1 und 2 wies durchschnittliche oxidative Stabilitäten von jeweils 70 AOM-Stunden (n = 2, 69 und 71 AOM-Stunden) und 49,5 AOM-Stunden (n = 2, 48 und 51 AOM-Stunden) auf. TABELLE 34 Fettsäurezusammensetzung von Rapsöl mit hohem Gehalt an langkettigen einfach Ungesättigten

Flächen-Nr.	Fettsäurezusammensetzung (%)
Flächen-Nr.	C16:0	C18:0	C18:1	C18:2	C18:3	C20:0	C20:1	C22:0	C22:1
Fläche 1	2,45	1,50	31,50	3,68	2,45	0,90	13,20	0,39	39,3
Fläche 2	2,55	1,30	29,70	6,35	2,46	0,76	12,50	0,36	39,50

Tabelle 35 stellt die Eigenschaften der Öle von den Flächen 1 und 2 bereit, welche durch eine Differenzialscanningkalorimetrie unter Verwendung eines Perkin Elmer Modell 7 Differenzialscanningkalorimeters bestimmt wurden. Proben von 7–12 mg wurden in Probenbehälter gebracht, versiegelt und in einen automatischen Probengeber geladen. Die Proben wurden von einer Ausgangstemperatur von 20°C, welche für 1 Minute beibehalten wurde, auf –30°C mit einer Geschwindigkeit von 40°C pro Minute gekühlt. Die Proben wurden bei –30°C für 10 Minuten gehalten, anschließend auf 75°C mit einer Geschwindigkeit von 5°C pro Minute erhitzt, um eine Schmelzkurve zu erhalten. Die Proben wurden bei 75°C für 10 Minuten gehalten, anschließend auf –30°C mit einer Geschwindigkeit von 5°C pro Minute abgekühlt, um eine Kühlkurve zu erhalten. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Öle mit einem Gehalt an langkettigen einfach Ungesättigten von mehr als 82% und einem Erucasäuregehalt von mehr als 15% Schmelzpunkte von ungefähr 2–3°C aufweisen. Zum Vergleich, Trierucin ist bei Raumtemperatur ein Feststoff. TABELLE 35 Eigenschaften von Rapsöl mit hohem Gehalt an langkettigen einfach Ungesättigten

Fläche Schmelzpunkt (°C) Beginn der Kristallisation (°C) ΔH (j/g)

1 3,2 –24 88,5

2 2,2 –27 92,6
BEISPIEL 15
Samen der Brassica napus-Varietät IMC 129 wurden mit MNNG, wie in Beispiel 5 beschrieben, mutagenisiert. Die behandelten Samen wurden, wie in Beispiel 5 beschrieben, gezogen, und eine Selektion auf verminderten Gehalt an Stearinsäure oder Palmitinsäure im Samen wurde in der M3-Generation durchgeführt. Pflanzen aus zwei ausgewählten Linien, ZW1441 (verminderte Palmitinsäure) und Y30137 (verminderte Stearinsäure) bezeichnet, wurden mit HE101 gekreuzt. Der ZW1441XHE101-Nachwuchs, welcher Samen mit verminderter Palmitinsäure und erhöhter Erucasäure herstellte, wurde ausgewählt. Der Y30137XHE101-Nachwuchs, welcher Samen mit verminderter Stearinsäure und erhöhter Erucasäure herstellte, wurde ausgewählt. Die Fettsäurezusammensetzung der Samen von repräsentativen ausgewählten Linien der F₄-Generation ist in Tabelle 36 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass Samen mit einem Gehalt an langkettigen einfach Ungesättigten von ungefähr 82% oder mehr, einem Erucasäuregehalt von 15% oder mehr und einem Gesamtgehalt an Gesättigten von weniger als 4% (z. B. ungefähr 2,0 bis ungefähr 4,0%) erreicht werden können.
Soweit nicht bereits darauf hingewiesen ist, wird es vom Fachmann verstanden werden, dass jede der hier beschriebenen und dargestellten verschiedenen spezifischen Ausführungsformen weiterhin modifiziert werden kann, um Eigenschaften einzuschließen, die in anderen der spezifischen Ausführungsformen gezeigt sind.
Die voranstehende detaillierte Beschreibung wurde nur für, ein besseres Verständnis der Erfindung bereitgestellt, und es sollte verstanden werden, dass sich daraus keine unnötige Beschränkung ergibt, da einige Modifikationen dem Fachmann offensichtlich sein werden, ohne vom Schutzumfang der beigefügten Ansprüche abzuweichen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Brassica-Pflanze, erhalten durch ein Verfahren, umfassend die Schritte des Kreuzens einer ersten Pfanzenlinie mit einer zweiten Pflanzenlinie und Auswählen des Nachwuchses dieser Kreuzung, wobei die erste Pflanzenlinie Samen mit einem Erucasäuregehalt von mindestens 45 Gew.-%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung, herstellt, und die zweite Pflanzenlinie Samen mit einem Ölsäuregehalt von mindestens 84 Gew.-%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung, herstellt, wobei der Nachwuchs Samen mit einem Gehalt an langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren von mindestens 82 Gew.-%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung, herstellt, wobei der Gehalt an langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren einen Erucasäuregehalt von mindestens 15 Gew.-%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung, und ein Gemisch von anderen langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren umfaßt.
Pflanze nach Anspruch 1, wobei die Samen einen Ölsäuregehalt von mindestens 37 Gew.-%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung, aufweisen.
Pflanze nach Anspruch 1, wobei die Samen einen Eicosensäuregehalt von mindestens 14 Gew.-%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung, aufweisen.
Pflanze nach Anspruch 1, wobei der Gehalt an einfach ungesättigten Fettsäuren 85 Gew.-% bis 90 Gew.-% ist.
Pflanze nach Anspruch 4, wobei die Samen einen Ölsäuregehalt von mindestens 42 Gew.-%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung, auf weisen.
Pflanze nach Anspruch 5, wobei der Ölsäuregehalt von 47 Gew.-% bis 56 Gew.-% ist.
Pflanze nach Anspruch 4, wobei die Samen einen Erucasäuregehalt von 17 Gew.-% bis 31 Gew.-%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung, aufweisen.
Pflanze nach Anspruch 4, wobei die Samen einen Eiconsensäuregehalt von 15 Gew.-% bis 21 Gew.-%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung, aufweisen.
Pflanze nach Anspruch 1, wobei die Samen einen Gehalt an gesättigten Fettsäuren von weniger als 7 Gew.-%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung, aufweisen.
Pflanze nach Anspruch 9, wobei die Samen einen Gehalt an gesättigten Fettsäuren von weniger als 4 Gew.-%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung, aufweisen.
Pflanze nach Anspruch 10, wobei die Samen einen Gehalt an gesättigten Fettsäuren von 2 Gew.-% bis 4 Gew.-%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung, aufweisen.
Pflanze nach Anspruch 1, wobei die Samen einen Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren von weniger als 11 Gew.-%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung, aufweisen.
Pflanze nach Anspruch 12, wobei die Samen einen Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren von 6 Gew.-% bis 11 Gew.-%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung, aufweisen.
Pflanze nach Anspruch 1, wobei die Samen einen c-Linolensäuregehalt von 1 Gew.-% bis 2 Gew.-%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung, aufweisen.
Nachwuchs der Pflanze nach Anspruch 1, wobei der Nachwuchs Samen mit einem Gehalt an langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren von mindestens 82 Gew.-%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung, herstellt, wobei der Gehalt an langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren einen Erucasäuregehalt von mindestens 15 Gew.-%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung, und ein Gemisch von anderen langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren umfaßt.
Öl, hergestellt aus der Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 15, welches einen Gehalt an langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren von mindestens 82 Gew.-% aufweist, wobei der Gehalt an langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren einen Erucasäuregehalt von mindestens 15 Gew.-%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung, und ein Gemisch von anderen langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren umfaßt.
Öl nach Anspruch 16, wobei der Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren weniger als 9 Gew.-% ist.
Brassica-Samenöl, welches einen Gehalt an langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren von mindestens 82 Gew.-% aufweist, wobei der Gehalt an langkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren einen Erucasäuregehalt von mindestens 15 Gew.-%, basierend auf der Gesamtfettsäurezusammensetzung, umfaßt und eine Summe der Gehalte von Nervonsäure, Erucasäure und Eiconsensäure von 50 Gew.-% bis 66 Gew.-%, basierend an der Gesamtfettsäurezusammensetzung, beträgt, wobei das Brassica-Samenöl von der Brassica-Pflanze nach Anspruch 1 erhalten ist.
Samenöl nach Anspruch 18, wobei der Ölsäuregehalt von 25 Gew.-% bis 30 Gew.-% ist.
Verfahren zur Herstellung eines Pflanzenöls, wobei das Verfahren die Schritte des Zerdrückens der Brassica-Samen, die von einer Pflanze nach Anspruch 1 erhalten wurden, und das Extrahieren des Pflanzenöls aus den zerdrückten Samen umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 20, weiter umfassend die Schritte des Veredelns und Bleichens des Öls.
Verfahren nach Anspruch 20, weiter umfassend den Schritt des Desodorierens des Öls.
Schmiermittel, bestehend aus dem Öl nach Anspruch 16 und einem Zusatz, wobei der Zusatz in einer Menge von 0,01 Gew.-% bis 20 Gew.-% vorhanden ist.
Schmiermittel nach Anspruch 23, wobei der Zusatz aus der Gruppe, bestehend aus einem Antioxidationsmittel, einem Rostinhibitor, einem Korrosionsinhibitor, einem Fließpunkterniedrigungsmittel, einem Anti-Schaumzusatz, einem Farbmittel und einem Detergens, ausgewählt ist.
Schmiermittel nach Anspruch 23 oder Anspruch 24, wobei das Schmiermittel ein hydraulisches Fluid ist.